Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды

Парфёнова, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды"

На правах рукописи

Парфёнова Наталья Владимировна

гГ

РОЛЬ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В АДАПТАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ К ФАКТОРАМ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

03.00.04.-Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВОРОНЕЖ-2004

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор ЕПРИНЦЕВ Александр Трофимович

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор КОРНЕЕВА Ольга Сергеевна

доктор биологических наук, профессор КОВАЛЕВА Тамара Андреевна

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита состоится 19 ноября 2004 года в Щ часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1, с^^с/к/и-н^-^си.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского госуниверситета.

Автореферат разослан октября 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент Грабович М.Ю.

ент

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Молекулярные основы адаптации организмов к выживанию в экстремальных условиях среды определяются образованием внутри клетки ферментных систем, устойчивых к их воздействию и поддерживающих протекание важнейших метаболических процессов. При адаптации клеточного метаболизма к изменениям условий внешней среды организм использует стратегию регуляции активности ферментного аппарата клетки. Важная роль в осуществлении адаптивной реакции принадлежит малатдегидрогеназной системе, представленной в клетках эукариот различно локализованными изоферментами (Епринцев, Игамбердиев, 1995; Епринцев и др., 1996). Поскольку для бактерий, отличающихся большой вариабельностью метаболических потоков, изоферментный полиморфизм не характерен, участие малатдегидрогеназы (МДГ) в разных метаболических процессах может обеспечиваться перестройкой субъединичной структуры молекулы, определяющей функциональную роль фермента (Степанова и др., 2000; Епринцев и др., 2002). МДГ (КФ 1.1.1.37.), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание конструктивного и энергетического метаболизма (Gietl, 1992). Известно, что в клетках бактерий встречаются как димерные (Charnock et. al., 1992; Labrou, Clonis, 1997), так и тетрамерные формы этого фермента (Wynne et. al., 1996; Madern, Zaccai, 2004). У фототрофных анаэробов (Rodobacter capsulatus, Rodospirillum ruubrum) МДГ, функционирующая преимущественно в конструктивном обмене, имеет тетрамерное строение. У аэробных микроорганизмов с органотрофным типом питания (Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri) фермент является димером и участвует в протекании конструктивного и энергетического метаболизма.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА ]

термофильной зеленой серной бактерии Chloгoflexus auгantiacus. Тетрамерная форма фермента из этих микроорганизмов обладает функциональной активностью только при 55°С. Снижение температуры приводит к распаду МДГ на неактивные димеры и тримеры. Следовательно, структурные перестройки молекулы малатдегидрогеназы являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к высокой температуре.

Изучение особенностей структуры и свойств МДГ у бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitifoгmis и Leucothгix mucoг и термофильных бактерий Vulcanitheгmus medioatlanticus представляет определённый интерес. Бактерии родов Beggiatoa и Leucothгix, в зависимости от наличия в среде культивирования восстановленных соединений серы, и, в частности, тиосульфата, могут изменять тип метаболизма и расти как хемоорганогетеротрофно, так и хемолитогетеротрофно, используя в качестве источника энергии органические или неорганические доноры электронов. V. medioatlanticus, являясь термофильными организмами, растут при экстремальных температурах, значительно превышающих оптимальную температуру роста мезофильных бактерий В. leptomitifoгmis и L. mucoг.

В связи с этим интересно исследование роли структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов, отличающихся не только типом питания, но и отношением к температуре.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы у микроорганизмов разных экологических групп. Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:

1. выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты МДГ из исследуемых бактерий;

2. изучить на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические, каталитические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы;

3. исследовать четвертичную структуру МДГ из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 и Leucothrix mucor DSM 2157 в условиях органо-, лито-и миксотрофного культивирования;

4. изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus, культивируемых при разной температуре;

5. методом ингибиторного анализа выявить функциональную роль димерной и тетрамерной изоформ МДГ у Beggiatoa leptomitiformis Д-402 в условиях разного типа питания;

6. исследовать в модельных опытах воздействие тиосульфата на структуру очищенного препарата фермента;

7. изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ.

Научная новизна. Получение гомогенных препаратов малатдегидрогеназы из микроорганизмов, принадлежащих к разным экологическим группам, позволило показать функциональную роль тетрамерной и димерной изоформ МДГ в метаболизме бесцветных серобактерий родов Beggiatoa и Leucothrix. В условиях органотрофного роста у бактерий функционирует димерная форма МДГ, участвующая в работе цикла Кребса. При литотрофном культивировании МДГ представляет собой тетрамер, обеспечивающий протекание глиоксилатного цикла (ГЦ). Установлена динамика перехода тетрамера в димер при миксотрофном росте, обусловленная скоростью окисления тиосульфата. Выявлена важная структурная особенность являющейся термоэнзимом димерной МДГ из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus - большая молекулярная масса субъединиц (58 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента (энергия активации 32,6 кДж/моль), необходимую для его функционирования в экстремальном температурном режиме. Показана важная роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к действию различных факторов внешней среды.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы помогают глубже понять современные представления о механизмах переключения метаболических потоков при разных условиях культивирования микроорганизмов. Практическая значимость настоящей работы состоит в расширении и углублении знаний о роли структурно-функциональных изменений МДГ в механизмах адаптации к изменяющимся факторам внешней среды. Полученные гомогенные препараты малатдегидрогеназы могут быть использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента, термодинамических параметров реакций, катализируемых МДГ. Выделение из термофильных организмов ферментов, отличающихся высокой термостабильностью, может иметь большое значение для биотехнологии, химической промышленности. Прикладные аспекты изучения бесцветных серобактерий определяются их использованием для удаления токсичных соединений серы из промышленных и бытовых сточных вод, воздушной среды производственных помещений и других объектов.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на восьмой международной конференции по химии и физикохимии олигомеров "Олигомеры - 2002" (Москва - Черноголовка, 2002); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2002, 2003, 2004); 6-ой Пущинской конференции молодых учёных "Биология - наука 21-ого века" (Пущино, 2002); второй межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой»

(Саратов, 2004); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2002,2003,2004).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 7 статьях и 5 тезисах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (248 источников). Иллюстрационный материал включает 35 рисунков и 10 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В качестве объектов исследования служили пресноводные нитчатые бесцветные серобактерии Beggiatoa leptomitiformis штамм Д-402, морские скользящие нитчатые серобактерии Leucothrix mucor штамм DSM 2157, а также термофильные бактерии Vulcanithermus

medioatlanticus штамм DSM 14978T. Чистые культуры были получены из коллекции микроорганизмов лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов Института микробиологии РАН.

Определение активности ферментов. Активность малатдегидрогеназы определяли спектрофотометрически при 340 нм по изменению оптической плотности реакционных смесей, определяемой скоростью образования или расходования НАДН. За единицу активности (Ё) принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкМ субстрата за 1 минуту при 25°С.

Определение количества белка. Определение общего количества белка проводили по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Содержание белка в высокоочищенных препаратах определяли также по поглощению при 280 и 260 нм (Мешкова, Северин, 1979).

Выделение и очистка фермента. Очистку осуществляли по схеме, включающей 5 стадий: получение экстракта фермента; фракционирование белков сульфатом аммония (45-80%); гель-фильтрацию на колонке с сефадексом G-25; ионообменную хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой или ДЭАЭ-Toyopearl (элюцию осуществляли ступенчатым градиентом КС1 (40-50 мМ) с шагом ступени 2 мМ); гель-хроматографию на колонке с сефадексом G-150 или G-200.

Аналитический электрофорез. Электрофорез нативного фермента проводили по методике Девиса (Davis, Ornstein, 1959). Для специфического проявления применяли тетразолиевый метод (Гааль и др., 1982). Универсальное окрашивание белков осуществляли, используя методику с нитратом серебра (Nesterenko et al., 1994; Shevchenko et al., 1996).

Исследование кинетических параметров. Кинетические и регуляторные свойства МДГ изучали на электрофоретически гомогенных препаратах. Определение констант Михаэлиса, констант ингибирования, субстратного ингибирования, расчет термодинамических параметров осуществляли с использованием программ линейной аппроксимации по методу наименьших квадратов (Диксон, Уэбб, 1982).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводили в 8-10 биологических повторностях, аналитические определения для каждой пробы осуществляли в трех повторностях. В таблицах и на рисунках приводятся данные типичных опытов, причем каждое значение есть среднее арифметическое из трех определений. Для определения достоверности результатов исследований применяли метод вариационной статистики. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных статистических методов с помощью критерия Стьюдента. Обсуждаются статистически достоверные различия при р < 0,05 (Ллойд, Ледерман, 1989, Лакин, 1990, Чернышев, Стариков, 1998). Для построения графиков использовали данные, обработанные с помощью программ линейной и параболической аппроксимации.

ПОЛУЧЕНИЕ ГОМОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ МДГ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДОВ ВЕООГАТОА, LEUCOTHRIX, У^САШТНЕИМШ Для изучения физико-химических и регуляторных свойств МДГ из исследуемых бактерий, культивируемых в различных условиях, была проведена очистка фермента. Результаты типичной очистки приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Очистка малатдегидрогеназы из Leucothrix mucor, культивируемых

органотрофно (п = 3, р < 0,05)

Стадии очистки Общий объем, мл Общая активность, Е Белок, мг/мл Удельная активность, Е/мг Степень очистки Выход, %

Гомогенат 3,6 5,971± 0,179 270,5 ± 8,115 0,022 ± 0,001 1,0 100

Супернатант 3,0 4,314± 0,129 189,1 ± 5,673 0,023 ± 0,001 1,05 72,2

Гель-фильтрация через сефадекс С-25 3,9 3,3 82± 0,101 139,3 ± 4,179 0,024± 0,001 1,09 56,6

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Тоуореаг1 2,0 0,246± 0,007 0,279 ± 0,008 0,082 ± 0,002 40,09 4,1

Гель-хроматография на сефадексе 0-200 1,2 0,129± 0,004 0,108± 0,003 1,194± 0,035 54,37 2,2

Использование многостадийной очистки позволило получить ферментные препараты МДГ из В. leptomitiformis штамм Д-402 и L. mucor штамм DSM 2157,

культивируемых органотрофно, с удельной активностью 24,4±0,73 и 1,19+0,035 Е/мг белка (степень очистки 131 и 54), соответственно; и литотрофно - с удельной активностью 20,4+0,61 и 0,56+0,017 Е/мг белка (степень очистки 123 и 62). МДГ из V. те&оаНапИсш была очищена в ПО раз с удельной активностью 6,9±0,2 Е/мг белка (табл.2).

Таблица 2.

Основные параметры очищенных препаратов МДГ из микроорганизмов

Объект Удельная активность, Е/мг белка Степень очистки Выход, %

Beggiatoa 1ер1отШРэгт18 (органотрофный рост) 24,49+0,734 131 20,9

Beggiatoa Ieptomitifoгmis (литотрофный рост) 20,43+0,613 123 10,1

ЬеисоШпх тисог (органотрофный рост) 1,194 +0,035 54 2,2

ЬеисоШпх тисог (литотрофный рост) 0,561+0,017 62 3,7

^д1сашШегтш теёюаОапйсш 6,941+0,208 110 3,6

Проведенный электрофоретический анализ очищенных препаратов показал, что в полиакриламидном геле, окрашенном нитратом серебра, проявляется одна белковая полоса с М=0,82 для МДГ из В. 1ерйэтШВэгт18, выращенных в среде без тиосульфата натрия и с И=0,74 для МДГ из бактерий, выращенных с тиосульфатом, что свидетельствует о гомогенности полученных препаратов малатдегидрогеназы. При специфическом проявлении также обнаружена только одна полоса, обладающая малатдегидрогеназной активностью.

Электрофоретические исследования МДГ из Ь. тисог и V. шоНоаНапИсш также свидетельствуют о гомогенности полученных образцов фермента (рис.1). Значение КХсоставило 0,77; 0,71 и 0,68 для Ь. тисог, культивируемых органо- и литотрофно, и V. тоНоаЙапИсш, соответственно.

Рис.1. Электрофореграмма МДГ из Leucothгix mucoг:

1- органотрофный рост;

2- литотрофный рост;

I- специфическое проявление; П-окрашивание нитратом серебра; Р- белковая полоса; F- фронт красителя бромфенолового синего.

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ Получение препаратов МДГ из бактерий разных экологических групп в электрофоретически гомогенном состоянии позволило изучить физико-химические, кинетические и регуляторные свойства фермента и выявить роль структурно-функциональных изменений МДГ в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды.

Определенная гель-хроматографией на сефадексе G-200 молекулярная масса нативной малатдегидрогеназы из В. leptomitifoгmis и Ь. mucoг составляет 84±1,5 и 74,1 ±1,2 кДа для бактерий, выращенных органотрофно, и 165±3 и 158±3,5 кДа - для бактерий, культивируемых литотрофно. Значение молекулярной массы нативной МДГ из V. теёюаАаШсш, определённое с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-150, равняется 128 ±2 кДа (табл.3).

Дополнительные исследования по определению молекулярной массы фермента из термофилов при 50°С и 70°С, а также из бактерий, выращенных при более низкой температуре (40°С), не выявили изменений в четвертичной структуре фермента.

Электрофоретическое исследование в присутствии додецилсульфата натрия позволило определить величину молекулярной массы субъединиц

малатдегидрогеназы из изучаемых бактерий, которая составляет 40±1,5 кДа, 39±1 кДа и 58±2 кДа для МДГ из В. 1ер1ошШ1Ьгш18, Ь. тисог и V. шеё1оа11ап11си8, соответственно (рис.2).

Таблица 3.

Сравнительная характеристика молекулярной массы и субъединичного строения МДГ у исследуемых микроорганизмов

Объект Молекулярная масса, кДа Количество субъединиц Молекулярная масса субъединиц, кДа

Beggiatoa 1ер1ошШРэгш18 (органотрофный рост) 84 2 40

Beggiatoa 1eptoшitifoгшis (литотрофный рост) 165 2 40

Leucothгix шисог (органотрофный рост) 74 2 39

Leucothгix шисог (литотрофный рост) 158 4 39

^д1сашШегшш Medioat1anticus 128 2 58

Рис.2. Электрофорез в Ов-Ка-ПААГ очищенной МДГ из ЬеисоШпх шисог:

1-целлюлаза (94,6 кДа); 2-бычий сывороточный альбумин (66,2 кДа); 3- карбоангидраза (31 кДа); 4-лизоцим (14,4 кДа); 5-МДГ.

Сравнение результатов гель-хроматографии и Ов-Ка-электрофореза показывает, что ферменты из В. 1ер1;от1Шогтв и Ь. шисог, выращенных органотрофно, а также из V. шеёюаНапИсш являются изологическими димерами, тогда как в условиях литотрофного роста серобактерий МДГ представляет собой гомотетрамер.

КИНЕТИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МДГ

На гомогенных препаратах фермента выявлены различия в кинетических и регуляторных характеристиках димерной и тетрамерной изоформ МДГ, что подтверждает их участие в разных метаболических процессах. При сравнении кинетических параметров МДГ из изучаемых микроорганизмов было показано, что сродство фермента к оксалоацетату выше, чем к малату. Установлено, что Км по оксалоацетату для МДГ из серобактерий при органотрофном росте выше, чем при литотрофном. Обратная картина наблюдается при окислении малата (табл.4). Для тетрамерной формы МДГ из В. 1ер1ътйМъгтв выявлена отрицательная кооперативность по оксалоацетату при высоких концентрациях фермента.

Таблица 4.

Кинетические и регуляторные характеристики МДГ из исследуемых

бактерий

Свойства В.1ер1»тШ- Югтв (димер) В.1ер1»тМ- Югтв (тетрамер) L. тисъг (димер) L. тисъг (тетрамер) V.mediъ-аНапИсш (димер)

рН-оптимум (оксалоацетат) 8,0 8,8 8,0 8,4 6,7

рН-оптимум (малат) 10,3 10,2 10,5 10,3 8,5

Кмоксало-ацетат, мкМ 56±3,3 20±1,4 32,7±1,8 17,8±0,9 47,6±2,9

^АБН, мкМ 48±2,5 17± 1,1 27,8±1,4 14,3±0,07 42±2,1

Кммалат, мкМ 320±18,9 670±21,2 1250±25,3 1300±27,1 1б70±31,4

КмКАБ\ мкМ 120±6,4 530±18,5 170±8,5 210,9,5± 400±17,8

При исследовании влияния ряда субстратов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) на активность МДГ из изучаемых бактерий было установлено, что цитрат является конкурентным ингибитором малатдегидрогеназы из В. кр^тШЪгтв (Ю= 140±9,1 мкМ) и L. тисъг (К = 37,5±1,8 мкМ), выращенных органотрофно, и V. теёюаНапИсш (К = 20,5 ± 0,8 мкМ) в концентрациях 0,005-0,5 мМ. На

тетрамерные формы МДГ из культивируемых литотрофно серобактерий цитрат в изученных концентрациях не оказывает влияния, что объясняется, возможно, незначительной ролью ЦТК в окислительном метаболизме этих организмов. Фумарат, сукцинат, изоцитрат в концентрациях 0,005-5 мМ не влияют на активность МДГ из исследуемых бактерий.

Показано, что ионы в концентрациях 2-40 мМ активируют

МДГ из V. теёюаНаШсш по бесконкурентному типу; МДГ из В. leptomitioгmis-по неконкурентному. На активность МДГ из Ь. тисог ионы этих металлов не влиют. Ионы Мп2+ в пределах концентраций 2-40 мМ и 05-0,5 мМ) оказывают ингибирующее действие на фермент из ^теёюаАаШсш и Ь. тисог, выращенных органотрофно, по конкурентному типу.

ИЗМЕНЕНИЕ СУБЪЕДИНИЧНОЙ СТРУКТУРЫ МДГ У БАКТЕРИЙ В РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Серобактерии В. leptomiffiЪгmis Д-402, обладая мобильным типом метаболизма, способны переходить от хемооргано- к хемолитогетеротрофному росту. Адаптируясь к неравновесным условиям сероводородных биотопов, В. leptъmitifъгmis в первую очередь используют электроны, полученные от сероводорода, а не от органического вещества, т. к. в этом случае исключается образование перекиси водорода, губительной для каталазоотрицательного организма (Чеканова, Дубинина, 1990). Кроме того, при миксотрофном росте бактерий окисление тиосульфата происходит наиболеее интенсивно на начальных этапах культивирования (Грабович и др., 1998).

Было выявлено изменение изоферментного состава МДГ из В. leptъmitifъгmis Д-402 по мере потребления тиосульфата в процессе миксотрофного культивирования этих бактерий (рис.3).

В условиях миксотрофного роста у В. leptъmitifъгmis Д-402 по мере уменьшения количества тиосульфата в питательной среде поставщиком электронов становятся органические субстраты (в данном опыте лактат). Переключение метаболических путей, обусловленное снижением роли ведет к уменьшению значения глиоксилатного цикла, функционирование

которого обеспечивает тетрамерная малатдегидрогеназа. Использование лактата в качестве основного донора электронов обусловливает интенсификацию ЦТК, в котором работает димерная форма МДГ.

Рис.3. Динамика соотношения димерной и тетрамерной форм МДГ из В. leptomiШbгmis в условиях миксотрофного роста: ■-тетрамер; а-димер; 1-кривая скорости окисления тиосульфата

В опытах по влиянию повторного внесения тиосульфата в питательную среду в процессе культивирования серобактерий было установлено, что дополнительное внесение тиосульфата через 48 и 72 ч приводит к исчезновению димера и функционированию в бактериях только тетрамерной формы фермента.

Гель-хроматография димерной формы МДГ на колонке с сефадексом G-200, уравновешенной буфером, содержащим 12 мМ тиосульфата (что соответствует его концентрации в среде культивирования), также приводит к структурным изменениям молекулы и превращению димерной формы малатдегидрогеназы в тетрамерную.

При изучении влияния тиосульфата на активность тетрамерной формы МДГ, очищенной из В. leptomitiformis, было показано, что данное вещество является конкурентным активатором с константой активации Ка=14,2 мМ, что свидетельствует о влиянии тиосульфата на активный центр фермента.

L. mucor штамм DSM 2157, в отличие от бактерий рода Beggiatoa, способен использовать соединения серы в энергетическом метаболизме только при низких концентрациях органики (Grabovich et. al., 1999). Исследование четвертичной структуры МДГ из L. mucor, культивируемых миксотрофно, показало, что в этих

условиях у бактерий рода Leucъthгix функционирует только димерная форма изучаемого фермента, о чём свидетельствуют результаты гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-200. Следовательно, тиосульфат является фактором, регулирующим соотношение димерных и тетрамерных изоформ малатдегидрогеназы.

Использование итаконата, специфического ингибитора изоцитратлиазы -ключевого фермента глиоксилатного цикла (Досон и др., 1991) и ротенона (ингибитора первого комплекса ЭТЦ) (Sculachev, 1988) позволило получить результаты, свидетельствующие о разной функциональной роли димерной и тетрамерной форм малатдегидрогеназы. Культивирование бактерий в присутствии итаконата приводит к ингибированию глиоксилатного цикла, и в этих условиях у В. leptъmitifъгmis обнаруживается исключительно димерная форма исследуемого фермента, обеспечивающая функционирование ЦТК. При добавлении ротенона в среду культивирования в присутствии тиосульфата выявлена только тетрамерная форма МДГ, функционирующая в ГЦ.

Исследование МДГ из термофильных бактерий V. mediъatlanticus показало, что важной структурной особенностью фермента являются "большие" субъединицы с молекулярной массой 58 кДа. Вероятно, высокое значение молекулярной массы является адаптацией к функционированию при высоких температурах. Установлено, что для МДГ из термофильных бактерий характерно большее значение энергии активации (32,6 кДж/моль) по сравнению с этой характеристикой из мезофильных организмов (5,4 кДж/моль). Изучение устойчивости к необратимой температурной инактивации гомогенного препарата фермента из V.гaediъatlanticus показывает его большую термостабильность по сравнению с МДГ из серобактерий.

По-видимому, МДГ из V.mediъatlanticus, обладая "тяжелыми" субъединицами, приобретает потенциальную возможность к образованию дополнительных электростатических и гидрофобных взаимодействий, которые обеспечивают повышенную жесткость молекулы ^саМшта et. а1., 1998; БаШш at.

а1., 2002), необходимую для функционирования фермента в экстремальном температурном режиме.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получение препаратов МДГ из бактерий в электрофоретически гомогенном состоянии позволило исследовать её физико-химические и регуляторные свойства, выявившие важные структурно-функциональные изменения фермента при адаптации микроорганизмов к разным условиям внешней среды.

Использование бактерий родов Beggia1oa и ЬеисоШгк, для которых характерен мобильный тип метаболизма, определяемый условиями культивирования, а также применение различных методов (гель-хроматография, нативный электрофорез, Бв-Ка-электрофорез) дало возможность установить, что при органотрофном росте Beggia1oa 1ep1oшi1ifoгmis и Ьеисо&гк шисог функционирует димерная форма МДГ, тогда как при литотрофном -индуцируется тетрамерная изоформа.

В модельных опытах с использованием специфических ингибиторов получены результаты, показывающие разную функциональную роль димерной и тетрамерной изоформ малатдегидрогеназы. При росте бактерий в присутствии ротенона (ингибитор ЦТК) в клетках обнаруживали только тетрамерную форму фермента, а в присутствии итаконата (ингибитор ГЦ) - выявлен гомодимер МДГ.

В условиях миксотрофного культивирования В. 1ep1oшi1ifoгшis по мере потребления тиосульфата и снижения его концентрации в питательной среде обнаружена трансформация тетрамерной формы МДГ в димерную. Исчерпав неорганический донор электронов, бактерии переходят к органотрофному росту, и относительный вклад ЦТК в энергетический метаболизм миксотрофов увеличивается. Переключение метаболических путей, обусловленное снижением роли ведет к уменьшению значения глиоксилатного цикла,

функционирование которого обеспечивает тетрамерная малатдегидрогеназа. Использование лактата в качестве основного донора электронов обусловливает интенсификацию ЦТК, в котором работает димерная форма МДГ (рис.4).

Внесение новых дополнительных порций тиосульфата в среду культивирования индуцирует быструю перестройку структуры МДГ и функционирование в бактериях только тетрамерной формы фермента.

Рис 4. Гипотетическая схема участия малатдегидрогеназной системы в регуляции и переключении основных метаболических путей у серобактерий Ве§£1ак>а Ьрйпиййипш в разных условиях роста.

ингибирование процессов; активация процессов

Интересно отметить, что у другого вида серобактерий обнаружены некоторые особенности функционирования МДГ при миксотрофном культивировании У L mucoг, которые в отличие от В leptomitifoгmis используют соединения серы лишь при низкой концентрации органических веществ ^гаЬоиА et. а1., 1999), при миксотрофном росте показано преобладание гомодимера МДГ, что подтверждает наличие универсального механизма

(взаимопревращение изоформ данного фермента) при адаптации серобактерий к изменению типа питания.

Следовательно, тиосульфат служит фактором, регулирующим соотношение димерной и тетрамерной изоформ малатдегидрогеназы у микроорганизмов данной экологической группы.

В определенной степени об этом свидетельствуют результаты исследований прямого влияния тиосульфата на гомогенный препарат МДГ. С помощью гель-хроматографии установлено, что ЫагБгОз, соответствующий его концентрации в среде культивирования, индуцирует структурные изменения молекулы и превращение димерной формы МДГ в тетрамерную.

Выявлены различия в кинетических и регуляторных характеристиках димерной и тетрамерной изоформ МДГ из серобактерий, что подтверждает их участие в разных метаболических процессах. Особый интерес представляет высокая устойчивость тетрамера МДГ к цитрату, ингибирующему димерную форму фермента.

При изучении структурной организации фермента из термофильных бактерий, характеризующихся значительно большей устойчивостью к температуре, чем серобактерии, установлено, что МДГ из Vulcanithermus medioatlanticus представляет собой димер, важной особенностью которого являются "тяжелые" субъединицы (Mr = 58 кДа), обеспечивающие, по-видимому, жесткость структуры фермента (Vogt et. al., 1997). Повышенная жесткость молекулы, проявляющаяся в более высокой энергии активации по сравнению с мезофильными бактериями, обычно достигается большей компактностью и образованием дополнительных электростатических и гидрофобных связей, что является необходимым условием для функционирования МДГ в экстремальном температурном режиме. Кинетические и регуляторные характеристики фермента из термофилов имеют сходство с димерной формой МДГ из серобактерий.

Т. о., показано, что молекулярная трансформация малатдегидрогеназной системы играет важную роль в адаптации бактерий разных экологических групп (рис.5).

Рис.5. Влияние некоторых факторов внешней среды на структуру МДГ из бактерий разных экологических групп.

Структурно-функциональные изменения фермента (взаимопревращение димер-тетрамер) обеспечивают переключение и регуляцию метаболизма у серобактерий в зависимости от типа питания. МДГ из термофильных бактерий обладает большой массой субъединиц и приобретает за счет этого потенциальную возможность к образованию дополнительных электростатических и гидрофобных взаимодействий, обеспечивающих жесткость её структуры, необходимую для функционирования термоэнзима при высоких температурах.

ВЫВОДЫ

1. С помощью модифицированной многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты МДГ из бактерий разных экологических групп. Установлено, что значения удельной активности исследуемого фермента зависят от источника выделения. При органотрофном культивировании В. leptomitiformis Д-402 и L. mucor DSM 2157 удельная активность составляет 24,4±О,73 и 1,19+0,035 Е/мг белка (степень очистки 131 и 54, соответственно), при литотрофном - 20,4+0,61 и 0,56+0,017 Е/мг белка (степень очистки 123 и 62). Препарат МДГ из термофильных бактерий

V. medioatlanticus DSM 14978T имеет величину удельной активности 6,9±0,2 Е/мг белка, степень очистки -110.

2. МДГ из исследуемых микроорганизмов имеет сложную четвертичную структуру, представляя собой олигомер. Выявлено, что в условиях органотрофного роста у серобактерий В. leptomitiformis и L. mucor формируется димерная форма фермента (Mr = 84 и 74 кДа), тогда как при литотрофном культивировании индуцируется гомотетрамер (Mr = 165 и 158 кДа для В. leptomitiformis и L. mucor, соответственно). Молекулярная масса субъединиц МДГ составляет 40 и 39 кДа.

3. Показано, что МДГ из термофильных бактерий представляет собой димер с "тяжелыми" субъединицами, молекулярная масса которого, определённая гель-хроматографией на сефадексе G-150, составляет 128 кДа. Методом Ds-Na-электрофореза установлено значение молекулярной массы субъединиц МДГ из V. medioatlanticus - 58 кДа. Культивирование и очистка термофильных бактерий V. medioatlanticus при различных температурах не приводит к изменению четвертичной структуры фермента.

4. Выявлена важная роль структурных изменений малатдегидрогеназы в адаптации изучаемых микроорганизмов к условиям среды обитания. Установлена динамика перехода тетрамера в димер при миксотрофном культивировании В. leptomitiformis, обусловленная скоростью окисления тиосульфата.

5. С использованием специфических ингибиторов установлена функциональная роль изоформ МДГ. Показано, что димерная форма фермента обеспечивает работу ЦТК, а тетрамерная - глиоксилатного цикла.

6. Анализ термодинамических параметров (термостабильности, температурного оптимума и энергии активации) МДГ из исследуемых бактерий показывает, что МДГ из V. medioatlanticus обладает высокой термостабильностью. Установлено большее значение энергии активации для МДГ из термофильных организмов (32,6 кДж/моль) по сравнению с мезофильными (5,4 кДж/моль),

свидетельствующее о повышенной жесткости молекулы фермента, необходимой для его функционирования в экстремальном температурном режиме.

7. Выявлено разное сродство фермента к субстратам. Значения Км для МДГ из исследуемых бактерий свидетельствуют о высоком сродстве фермента к оксалоацетату и более низком - к малату. Установлено, что Км по оксалоацетату для МДГ из серобактерий при органотрофном росте выше, чем при литотрофном. Обратная картина наблюдается при окислении малата. Для тетрамерной формы МДГ из В. 1ep1oшi1ifoгшis выявлена отрицательная . кооперативность по оксалоацетату при высоких концентрациях фермента.

8. Показано, что ионы в концентрациях 2-40 мМ активируют МДГ из V. medioat1anticus по бесконкурентному типу, МДГ из В. 1ep1oшi1ifoгшis - по неконкурентному. На активность МДГ из Ь. шисог ионы этих металлов не влияют. Ионы Ми2+ (2-40 мМ ) и ЪиИ'* (0,05-0,5 мМ) являются конкурентными ингибиторами малатдегидрогеназы из V. medioat1anticus и Ь. шисог, выращенных органотрофно. Димерные формы МДГ из серобактерий, а также МДГ из термофилов конкурентно ингибируются цитратом, тогда как на тетрамерные формы фермента цитрат не оказывает влияния.

9. В модельных опытах на ферментном препарате МДГ, очищенной из В. 1ep1oшi1ifoгmis, установлено, что тиосульфат является фактором, регулирующим соотношение димерной и тетрамерной изоформ малатдегидрогеназы. Изучены механизмы структурных изменений МДГ при воздействии физиологических концентраций тиосульфата. Показано, что данное вещество является конкурентным активатором тетрамерной формы фермента

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ 1. Епринцев А.Т. Структурно-функциональные изменения малатдегидрогеназы у бактерий рода Beggia1oa / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, И.Ю. Степанова, Н.В. Парфёнова // Материалы 3 съезда биохимического общества. - Санкт-Петербург. - 2002 г. - С. 578.

2. Парфёнова Н.В. Активность различных изоформ малатдегидрогеназы у Beggiatoa leptomitiformis в условиях миксотрофного роста / Н.В. Парфёнова // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. - Воронеж. - 2002 г. - Вып. 4. - С. 84-87.

3. Степанова И.Ю. Молекулярная масса и субъединичное строение малатдегидрогеназы из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402, культивируемых в разных условиях / И.Ю. Степанова, Н.В. Парфёнова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. - Воронеж. - 2002 г. - Вып. 4. - С. 97-101.

4. Парфёнова Н.В. Субъединичная структура и регуляторные свойства МДГ из бактерий Beggiatoa штамм Д-402, культивируемых в разных условиях / Н.В. Парфёнова, Н.Н. Каширская // 6-ая Путинская конференция молодых учёных "Биология - наука 21-ого века". - Пущино (20-24 мая). - 2002. - С.ЗЗО.

5. Степанова И.Ю. Молекулярная масса и трансформация субъединичного строения малатдегидрогеназы из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402, культивируемых в разных условиях / И.Ю. Степанова, Н.В. Парфёнова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Тезисы докладов восьмой международной конференции по химии и физикохимии олигомеров "Олигомеры - 2002". -Москва - Черноголовка, 9-14 сентября 2002 г. - С. 334.

6. Епринцев А.Т. Очистка и физико-химические свойства малатдегидрогеназы из бактерий рода Beggiatoa / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, И.Ю. Степанова, Н.В. Парфёнова // Биохимия. - 2003. - Т. 68, вып. 2. - С. 207-211

7. Епринцев А.Т. Выделение, очистка и свойства малатдегидрогеназы из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, И.Ю. Степанова, Н.В. Парфёнова, М. Зузу // Известия АН. Серия биологическая. -2003.- №3.- С.301-305.

8. Парфёнова Н.В. Выделение малатдегидрогеназы из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus и изучение её субъединичного строения / Н.В.

4 ИИ9 6 15

Парфёнова, Н.С. Смольянинова, М.И. Фалалеева, ЕА. Бонч-Осмоловская, М.Л. Мирошниченко, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. - Воронеж. - 2003 г. - Вып. 5. - С. 117-122.

9. Епринцев А.Т. Роль изоформ малатдегидрогеназы в регуляции анаболических и катаболических процессов у бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 / А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева, М.Ю. Грабович, Н.В. Парфёнова, Н.Н. Каширская, ГА. Дубинина // Микробиология. - 2004. - Т.73, № 4. - С. 437-442.

10. Парфёнова Н.В. Выделение, очистка и некоторые свойства малатдегидрогеназы из бактерий рода Leucothrix / Н.В. Парфёнова, М.И. Фалалеева, А.Т. Епринцев // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов : межрегион, сб. науч. работ, посвященный памяти А.А. Землянухина. - Воронеж. - 2004г. - Вып. 6. - С.116-121.

11. Епринцев А.Т. Роль структурных изменений малатдегидрогеназы в трансформации метаболизма бактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 / А.Т. Епринцев, М.Ю. Грабович, М.И. Фалалеева, Н.В. Парфёнова, К.С. Лавриненко // Тезисы докладов 3 съезда биофизиков России. - Воронеж (24-29 июня). - 2004. - С. 29-30.

12. Парфёнова Н.В. Роль структурных изменений малатдегидрогеназы в адаптации серобактерий родов Beggiatoa и Leucothrix к условиям питания / Н.В. Парфёнова, А.Т. Епринцев, М.И. Фалалеева // Тезисы докладов второй региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». - Саратов (26-28 октября). - 2004.-С.75-76.

Заказ № 657 от15.10.2004 г. Тираж 100 экз. Лаборатория оперативной полиграфии ВГУ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Парфёнова, Наталья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиолого-биохимические особенности жизнедеятельности микроорганизмов родов Beggiatoa, Leucothrix, Vulcanithermus

1.1.1. Разнообразие типов метаболизма бактерий

1Л .2. Органотрофный и литотрофный рост бактерий рода Beggiatoa

1.1.3. Эколого-биохимическая характеристика рода Leucothrix

1.1.4. Особенности метаболизма термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus

1.2. Трансформация метаболизма бактерий в различных условиях внешней среды

1.2.1. Влияние химического состава среды

1.2.1.1. Роль серных соединений

1.2.2. Действие физических факторов

1.2.2.1. Влияние кислорода

1.2.2.2. Значение давления

1.2.2.3. Влияние температуры

1.2.3. Адаптивные изменения ферментных систем

1.3. Физико-химические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы

1.3.1. Способы получения высокоочищенных препаратов МДГ

1.3.2. Общая характеристика каталитического действия

1.3.3. Кинетические параметры

1.3.4. Влияние концентрации ионов водорода

1.3.5. Влияние интермедиатов и ионов

1.3.6. Аллостерическая регуляция

1.4. Различные уровни организации МДГ

1.5. Влияние температуры на активность фермента

1.5.1. Температурный оптимум

1.5.2. Термостабильность малатдегидрогеназы

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Цель и задачи исследования

2.2. Объекты и методы исследования

2.2.1. Объекты исследования

2.2.2. Методы исследования

2.2.2.1. Состав питательных сред для культивирования микроорганизмов

2.2.2.2. Определение активности фермента

2.2.2.3. Определение количества белка

2.2.2.4. Выделение и очистка малатдегидрогеназы

2.2.2.5. Электрофоретические исследования

2.2.2.5.1. Аналитический электрофорез

2.2.2.5.2. Определение гомогенности ферментных препаратов

2.2.2.5.3. Специфическое проявление малатдегидрогеназы

2.2.2.5.4. Определение молекулярной массы субъединиц МДГ

2.2.2.6. Определение молекулярной массы нативного фермента

2.2.2.7. Ингибиторный анализ

2.2.2.8. Исследование кинетических характеристик и регуляции активности активности ферментов

2.2.3. Статистическая обработка экспериментальных данных

2.3. Полученные результаты и их обсуждение

2.3.1. Получение гомогенных препаратов МДГ из бактерий родов Beggiatoa,

Leucothrix, Vulcanithermus

2.3.1.1. Очистка малатдегидрогеназы 2.3.1.2. Определение гомогенности ферментных препаратов

2.3.2. Четвертичная структура малатдегидрогеназы из изучаемых бактерий

2.3.2.1. Определение молекулярной массы нативного фермента

2.3.2.2. Молекулярная масса субъединиц МДГ

2.3.3. Кинетические и регуляторные характеристики МДГ

2.3.3.1. Влияние концентрации ионов водорода

2.3.3.2. Определение константы Михаэлиса

2.3.3.3. Кооперативные свойства тетрамерной формы малатдегидрогеназы из Beggiatoa leptomitiformis Д

2.3.3.4. Определение константы субстратного ингибирования

2.3.3.5. Влияние интермедиатов и ионов на активность МДГ

2.3.4. Изменение субъединичной структуры малатдегидрогеназы у бактерий в различных условиях культивирования

2.3.4.1. Четвертичная структура МДГ из Beggiatoa leptomitiformis в условиях разного типа питания

2.3.4.2. Влияние типа питания на четвертичную структуру МДГ из бактерий Leucothrix mucor

2.3.4.3. Влияние ротенона и итаконата на соотношение димерной и тетрамерной форм МДГ

2.3.4.4. Механизм структурных изменений малатдегидрогеназы при воздействии тиосульфата

2.3.4.5. Хранение димерных\и тетрамерных форм МДГ в присутствии стабилизирующих веществ

2.3.4.5. Влияние температуры

2.3.4.5.1. Температурный оптимум

2.3.4.5.2.Термостабильность

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды"

Актуальность проблемы. Молекулярные основы адаптации организмов к выживанию в экстремальных условиях среды определяются образованием внутри клетки ферментных систем, устойчивых к их воздействию и поддерживающих протекание важнейших метаболических процессов. При адаптации клеточного метаболизма к изменениям условий внешней среды организм использует стратегию регуляции активности ферментного аппарата клетки. Важная роль в осуществлении адаптивной реакции принадлежит малатдегидрогеназной системе, представленной в клетках эукариот различно локализованными изоферментами (Епринцев, Игамбердиев, 1995; Епринцев и др., 1996). Поскольку для бактерий, отличающихся большой вариабельностью метаболических потоков, изоферментный полиморфизм не характерен, участие малатдегидрогеназы (МДГ) в разных метаболических процессах может обеспечиваться перестройкой субъединичной структуры молекулы, определяющей функциональную роль фермента (Степанова и др., 2000; Епринцев и др., 2002). МДГ (КФ 1.1.1.37.), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание конструктивного и энергетического метаболизма (Gietl, 1992). Известно, что в клетках бактерий встречаются как димерные (Charnock et. al., 1992; Labrou, Clonis, 1997), так и тетрамерные формы этого фермента (Wynne et. al., 1996; Madern, Zaccai, 2004). У фототрофных aHa3po6oB(Rhodobacter capsulatusjlhodospirillum i rubrum) МДГ, функционирующая преимущественно в конструктивном обмене, имеет тетрамерное строение. У аэробных микроорганизмов с органотрофным типом питания (Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri) фермент является димером и участвует в протекании конструктивного и энергетического метаболизма.

В ряде работ (Rolstad et al., 1988; Irimia et. al., 2004) показано, что не только тип питания может влиять на структуру и свойства МДГ. Важным фактором, регулирующим активность малатдегидрогеназной системы путём изменения изоферментного состава или каталитической эффективности её белков, является температура. Изменения четвертичной структуры МДГ обнаружены у термофильной зеленой серной бактерии Chloroflexus aurantiacus. Тетрамерная форма фермента из этих микроорганизмов обладает функциональной активностью только при 55°С. Снижение температуры приводит к распаду МДГ на неактивные димеры и тримеры. Следовательно, структурные перестройки молекулы малатдегидрогеназы являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к высокой температуре.

Изучение особенностей структуры и свойств МДГ у бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis и Leucothrix mucor и термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus представляет определённый интерес. Бактерии родов Beggiatoa и Leucothrix, в зависимости от наличия в среде культивирования восстановленных соединений серы, и, в частности, тиосульфата, могут изменять тип метаболизма и расти как хемоорганогетеротрофно, так и хемолитогетеротрофно, используя в качестве источника энергии органические или неорганические доноры электронов. V. medioatlanticus, являясь термофильными организмами, растут при экстремальных температурах, значительно превышающих оптимальную температуру роста мезофильных бактерий В. leptomitiformis и L. mucor.

1. выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты МДГ из исследуемых бактерий;

3. исследовать четвертичную структуру МДГ из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 и Leucothrix mucor DSM 2157 в условиях органо-, лито- и миксотрофного культивирования;

6. исследовать в модельных опытах воздействие тиосульфата на структуру очищенного препарата фермента;

7. изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ.

Научная новизна. Получение гомогенных препаратов малатдегидрогеназы из микроорганизмов, принадлежащих к разным экологическим группам, позволило показать функциональную роль тетрамерной и димерной изоформ МДГ в метаболизме бесцветных серобактерий родов Beggiatoa и Leucothrix. В условиях органотрофного роста у бактерий функционирует димерная форма МДГ, участвующая в работе цикла Кребса. При литотрофном культивировании МДГ представляет собой тетрамер, обеспечивающий протекание глиоксилатного цикла (ГЦ). Установлена динамика перехода тетрамера в димер при миксотрофном росте, обусловленная скоростью окисления тиосульфата. Выявлена важная структурная особенность являющейся термоэнзимом димерной МДГ из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus — большая молекулярная масса субъединиц (58 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента (энергия активации 32,6 кДж/моль), необходимую для его функционирования в экстремальном температурном режиме. Показана важная роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к действию различных факторов внешней среды.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались, и обсуждались на международных, региональных и университетских конференциях. Они были представлены на восьмой международной конференции по химии и физикохимии олигомеров "Олигомеры — 2002" (Москва — Черноголовка, 2002); межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2002, 2003, 2004); 6-ой Пущинской конференции молодых учёных "Биология - наука 21-ого века" (Пущино, 2002); второй межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2002, 2003, 2004).

Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях — 7 статьях и 5 тезисах.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Парфёнова, Наталья Владимировна

ВЫВОДЫ

1. С помощью модифицированной многостадийной очистки получены электрофоретически гомогенные препараты МДГ из бактерий разных экологических групп. Установлено, что значения удельной активности исследуемого фермента зависят от источника выделения. При органотрофном культивировании В. leptomitiformis Д-402 и L. mucor DSM 2157 удельная активность составляет 24,4±0,73 и 1,19±0,035 Е/мг белка (степень очистки 131 и 54, соответственно), при литотрофном - 20,4±0,61 и 0,56±0,017 Е/мг белка (степень очистки 123 и 62). Препарат МДГ из термофильных бактерий V. medioatlanticus DSM 14978 имеет величину удельной активности 6,9±0,2 Е/мг белка, степень очистки — 110.

3. Показано, что МДГ из термофильных бактерий представляет собой димер с "тяжелыми" субъединицами, молекулярная масса которого, определённая гель-хроматографией на сефадексе G-150, составляет 128 кДа. Методом Ds-Na-электрофореза установлено значение молекулярной массы субъединиц МДГ из V. medioatlanticus — 58 к Да. Культивирование и очистка термофильных бактерий V. medioatlanticus при различных температурах не приводит к изменению четвертичной структуры фермента.

4. Выявлена важная роль структурных изменений малатдегидрогеназы в адаптации изучаемых микроорганизмов к условиям среды обитания.

Установлена динамика перехода тетрамера в димер при миксотрофном культивировании В. leptomitiformis, обусловленная скоростью окисления тиосульфата.

7. Выявлено разное сродство фермента к субстратам. Значения Км для МДГ из исследуемых бактерий свидетельствуют о высоком сродстве фермента к оксалоацетату и более низком — к малату. Установлено, что Км по оксалоацетату для МДГ из серобактерий при органотрофном росте выше, чем при литотрофном. Обратная картина наблюдается при окислении малата. Для тетрамерной формы МДГ из В. leptomitiformis выявлена отрицательная кооперативность по оксалоацетату при высоких концентрациях фермента. I 'У I ^ I

8. Показано, что ионы Mg , Са, Ва в концентрациях 2-40 мМ активируют МДГ из V. medioatlanticus по бесконкурентному типу, МДГ из В. leptomitiformis - по неконкурентному. На активность МДГ из L. mucor ионы этих металлов не влияют. Ионы Мп (2-40 мМ ) и Zn (0,05-0,5 мМ) являются конкурентными ингибиторами малатдегидрогеназы из V. medioatlanticus и L. mucor, выращенных органотрофно. Димерные формы МДГ из серобактерий, а также МДГ из термофилов конкурентно ингибируются цитратом, тогда как на тетрамерные формы фермента цитрат не оказывает влияния.

9. В модельных опытах на ферментном препарате МДГ, очищенной из В. leptomitiformis, установлено, что тиосульфат является фактором, регулирующим соотношение димерной и тетрамерной изоформ малатдегидрогеназы. Изучены механизмы структурных изменений МДГ при воздействии физиологических концентраций тиосульфата. Показано, что данное вещество является конкурентным активатором тетрамерной формы фермента (Ка=14,2 мМ).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование бактерий родов Beggiatoa и Leucothrix, для которых характерен мобильный тип метаболизма, определяемый условиями культивирования, а также применение различных методов (гель-хроматография, нативный электрофорез, Ds-Na-электрофорез) дало возможность установить, что при органотрофном росте Beggiatoa leptomitiformis и Leucothrix mucor функционирует димерная форма МДГ, тогда как при литотрофном — индуцируется тетрамерная изоформа.

В условиях миксотрофного культивирования В. leptomitiformis по мере потребления тиосульфата и снижения его концентрации в питательной среде обнаружена трансформация тетрамерной формы МДГ в димерную. Исчерпав неорганический донор электронов, бактерии переходят к органотрофному росту, и относительный вклад ЦТК в энергетический метаболизм миксотрофов увеличивается. Переключение метаболических путей, обусловленное снижением роли Na2S2C>3, ведет к уменьшению значения глиоксилатного цикла, функционирование которого обеспечивает тетрамерная малатдегидрогеназа. Использование лактата в качестве основного донора электронов обусловливает интенсификацию ЦТК, в котором работает димерная форма МДГ (рис.34).

OA ротенон

NADH I

W комплекс

Литотрофный рост

Na2S203)липиды ГЦ

МДГ тетрамер сукцинат биосинтез углеводов и белков

IV комплекс —► о2

Рис.34. Гипотетическая схема участия малатдегидрогеназной системы в регуляции и переключении основных метаболических путей у серобактерий Beggiatoa leptomitiformis в разных условиях роста. ингибирование процессов; 1 ^ активация процессов

Интересно отметить, что у другого вида серобактерий обнаружены некоторые особенности функционирования МДГ при миксотрофном культивировании. У L. mucor, которые в отличие от В. leptomitiformis используют соединения серы лишь при низкой концентрации органических веществ (Grabovich et. al., 1999), при миксотрофном росте показано преобладание гомодимера МДГ, что подтверждает наличие универсального механизма (взаимопревращение изоформ данного фермента) при адаптации серобактерий к изменению типа питания.

Т.о., показано, что молекулярная трансформация малатдегидрогеназной системы играет важную роль в адаптации бактерий разных экологических групп (рис.35).

Рис.35. Влияние некоторых факторов внешней среды на структуру МДГ из бактерий разных экологических групп.

Структурно-функциональные изменения фермента взаимопревращение димер-тетрамер) обеспечивают переключение и регуляцию метаболизма у серобактерий в зависимости от типа питания. МДГ из термофильных бактерий обладает большой массой субъединиц и приобретает за счет этого потенциальную возможность к образованию дополнительных электростатических и гидрофобных взаимодействий, обеспечивающих жесткость её структуры, необходимую для функционирования термоэнзима при высоких температурах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парфёнова, Наталья Владимировна, Воронеж

1. Александров В.Я. Реактивность клеток и белки / В .Я. Александров. -Л. : Наука, 1985. -318 с.

2. Блюменфельд Л.А. Единичные циклы прямой ферментативной реакции на примере МДГ/ Л.А. Блюменфельд, П.Г. Плешанов // Биофизика. 1986. - Т.ЗО, вып.5. - С. 760-763.

3. Варфоломеев С.Д. Биокинетика / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. -М. : ФАИР-ПРЕСС, 1999. 720 с.

4. Влияние взаимодействий между аминокислотными остатками 43 и 61 на термостабильность бактериальных формиатдегидрогеназ / В.В. Федорчук и др.. // Биохимия. 2002. - Т. 67, вып. 10. - С. 1385-1393.

5. Волвенкин С.В. Субклеточная локализация и свойства ферментов глиоксилатного цикла в печени крыс с аллоксановым диабетом / С.В. Волвенкин, В.Н. Попов, А.Т. Епринцев // Биохимия. 1999. - Т. 64, вып. 9.-С. 1185-1191.

6. Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / Э. Гааль, Г. Медьеши, Л. Верецкеи. М.: Мир, 1982. - 446 с.

7. Гильманов М.К. Методы очистки и изучения ферментов растений / М.К. Гильманов, О.В. Фурсов, А.П. Францев. Алма-Ата : Наука, 1981.-92 с.

8. Глиоксилатный цикл растений / А.А. Землянухин и др.. Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1986. - 148 с.

9. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий / Г. Готтшалк. М. : Мир, 1982. -310 с.

10. Грабович М.Ю. Сравнительная характеристика углеродного и серного метаболизма у представителей двух кластеров бактерий рода Leucothrix / М.Ю. Грабович, Н.М. Дульцева, Г.А. Дубинина // Микробиология. 2002. - Т. 70, № 3. - С. 301-307.

11. Гусев М.В. Микробиология / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. М. : Изд. центр "Академия", 2003. - 464 с.

12. Давранов К. Влияние некоторых органических кислот на активность малатдегидрогеназы семян хлопчатника / К. Давранов, М.А. Кученкова, П.Х. Юлдашев // Химия природных соединений. 1972. -№ 2. - С.75-79.

13. Детерман, Г. Гель-хроматография / Г. Детерман. М. : Мир, 1970. -173 с.

14. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. - Т. 3. -216 с.

15. Дубинина Г.А. Микроорганизмы, окисляющие серу / Г.А.Дубинина // Хемосинтез. М., 1989. - С. 87-91.

16. Дульцева Н.М. Выделение галофильных нитчатых серобактерий и описание нового вида Leucothrix thiophila sp. nov. / Н.М. Дульцева, Г.А. Дубинина, A.M. Лысенко // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 1. -С. 89-98.

17. Дэвени Т. Аминокислоты, пептиды и белки / Т. Дэвени, Я. Гергей. -М.: Мир, 1976. 364 с.

18. Епринцев А.Т. Малатдегидрогеназная и аконитазная системы высших растений: физиолого-биохимическая характеристика, регуляция и роль в адаптации к факторам внешней среды . Дис. д-ра биол. наук / А.Т. Епринцев. Воронеж, 1995. - 457 с.

19. Епринцев А.Т. Активность и изоформы малатдегидрогеназы в высоко- и низкомасличных линиях кукурузы / А.Т. Епринцев, А.У. Игамбердиев // Физиология растений. 1995. - Т. 42, № 5. - С. 760767.

20. Епринцев А.Т. Малатдегидрогеназная система Wolfla arrhiza: характеристика и роль в адаптации к свету и темноте / А.Т. Епринцев, А.У. Игамбердиев, JI. Ашнин // Физиология растений. 1996. - Т. 43, № 1. - С. 36-42.

21. Епринцев А.Т. Ферментативная регуляция метаболизма ди- и трикарбоновых кислот в растениях / А.Т. Епринцев, В.Н. Попов. -Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та. 1999. - 192 с.

22. Задворный О.А. Влияние ионов металлов на гидрогеназу пурпурной серобактерии Thiocapsa roseopersicina / О.А. Задворный, Н.А. Зорин, И.Н. Гоготов // Биохимия. 2000. - Т. 65, вып. 11. - С. 1525-1529.

23. Землянухин А.А. Большой практикум по физиологии и биохимии растений: учеб. пособие / А.А. Землянухин, JI.A. Землянухин // -Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1996. 188 с.

24. Иванищев В.В. Ферменты метаболизма малата: характеристика, регуляция активности и биологическая роль / В.В. Иванищев, Б.И. Курганов// Биохимия. 1992. - Т. 57, вып. 5. - С. 653-661.

25. Изучение углеродного метаболизма у Beggiatoa leptomitiformis при хемоорганогетеротрофном росте / М.Ю. Грабович и др.. // Микробиология. 1993. - Т. 62, № 3. - С. 430-435.

26. Индукция пероксисомальной изоформы малатдегидрогеназы в печени крыс при пищевой депривации / В.Н. Попов и др.. // Биохимия. -2001. Т.66, вып. 5. -С.617-623.

27. Келети Т. Основы ферментативной кинетики / Т. Келети. М.: Мир, 1990.-350 с.

28. Кинетические различия лактатдегидрогеназы из мышц рыб при температурной адаптации / О.С. Клячко и др.. // Биофизика. 1995. -Т. 40.-С. 513-518.

29. Клячко О.С. Температура вызывает структурные и функциональные изменения лактатдегидрогеназы из скелетных мышц рыб / О.С. Клячко, Е.С. Полосухина, Н.Д. Озернюк // Биофизика. 1993. - Т. 38, вып. 4.-С. 596-601.

30. Коэн Ф. Регуляция ферментативной активности / Ф. Коэн. М.: Мир, 1986.-144 с.

31. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты / Б.И. Курганов. М., 1978. - 248 с.

32. Курганов Б.И. Новый подход к анализу отклонений от гиперболического закона в ферментативной кинетике / Б.И. Курганов // Биохимия. 2000. - Т. 65, вып. 8. - С. 1058-1071.

33. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М. : Высшая школа, 1990. -352 с.

34. Литоавтотрофный рост пресноводного штамма бесцветных серобактерий Beggiatoa "leptomitiformis" Д-402 / В.Ю.Патрицкая и др.. // Микробиология. 2001. - Т.70, № 2. - С. 182-188.

35. Ллойд Э. Справочник по прикладной статистике / Э. Ллойд, У. Ледерман. М.: Финансы и статистика, 1989. - 508 с.

36. Маркина В.Л. Особенности термической инактивации малатдегидрогеназы / В.Л. Маркина, А.Н. Еремин, Д.И. Метелица // Биофизика. 1985. - Т. 30, вып. 6. - С. 971-975.

37. Мауэр Г. Диск-электрофорез / Г. Мауэр. М.: Мир, 1971. - 222 с.

38. Медленные конформационные переходы в мышечной гликогенфосфорилазе Ь, индуцируемые специфическими лигандами / Б.И. Курганов и др. // Биохимия. 1994. - Т. 59, вып. 4. - С. 559-567.

39. Метелица Д.И Кинетические аспекты необратимой термической инактивации ферментов / Д.И. Метелица, А.Н. Еремин // Успехи химии. 1987. - Т. 46, вып. 11.- С. 1921-1948.

40. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова; Под ред. Н.П. Мешковой и С.Е. Северина. М.: 1979. - 430 с.

41. Миксотрофный и литогетеротрофный рост пресноводного штамма скользящих нитчатых серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 / М.Ю. Грабович и др.. // Микробиология. 1998. - Т. 67, № 4. - С. 464-470.

42. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников. М. : Просвещение, 1987. -815 с."

43. Озернюк Н.Д. Механизмы адаптаций / Н.Д. Озернюк. М. : Наука, 1992. - 272 с.

44. Особенности углеродного метаболизма при хемолито- и хемоорганогетеротрофном росте нитчатых серобактерий Thiothrix arctophila и Leucothrix thiophila / М.Ю. Грабович и др.. // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 2. - С. 149-153.

45. Остерман J1.A. Исследование биологических макромолекул / J1.A. Остерман. М.: Мир, 1983. - 297 с.

46. Патрицкая В.Ю. Регуляция углеродного и серного метаболизма у нитчатых скользящих серобактерий родов Beggiatoa и Leucothrix: автореф. дис. . канд. биол. наук / В.Ю. Патрицкая. М., 2001. -25 с.

47. Пинейру де Корвалью М.А.А. Малатдегидрогеназа высших растений / М.А.А. Пинейру де Корвалью, А.А. Землянухин, А.Т. Епринцев. -Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1991.-216 с.

48. Попов Е.М. Структурно-функциональная организация белков / Е.М. Попов. М.: Наука, 1992. - 358 с.

49. Садунишвили Т.А. Кинетические свойства малатдегидрогеназы лимона / Т.А. Садунишвили, Н.Н. Нуцубидзе // Изв. АН ГССР. Сер. биол. науки. 1979. - Т. 5, № 4.

50. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М. : Мир, 1985. -358 с.

51. Справочник биохимика / Р. Досон и др.. М.: Мир, 1991. - 544 с.

52. Старынин Д.А. Альгобактериальные маты бухты Кратерной (Курильские острова) / Д.А. Старынин, В.М. Горленко, М.В. Иванов // Биология моря. 1989. - № 3. - С. 70-77.

53. Степанова И.Ю. Некоторые кинетические характеристики малатдегидрогеназы из Beggiatoa alba / И.Ю. Степанова // Труды молодых ученых. Воронеж, 2000. - Вып. 2. - С. 130-140.

54. Страйер JI. Биохимия / Л. Страйер. М.: Мир, 1984. - Т. 1. - 232 с.

55. Термодинамические свойства лактатдегидрогеназы из мышц рыб Misgurnus fossilis, адаптированных к разным температурам среды / А.Н. Даниленко и др. // Биофизика. 1998. - Т.43, вып. 1. - С. 26-30.

56. Ткемаладзе Г.Ш. Аллостерическая регуляция активности растительной МДГ никотинамидадениндинуклеотидом / Г.Ш. Ткемаладзе // Биохимия растений. Тбилиси. - 1973.

57. Ткемаладзе Г.Ш. Кинетические свойства МДГ / Г.Ш. Ткемаладзе // Биохимия. 1981. - Т. 46, вып. 6. - С. 1133-1141.

58. Ткемаладзе Г.Ш. Стабильность МДГ и NADP-глутаматдегидрогеназы чайного растения и виноградной лозы / Г.Ш. Ткемаладзе // Сообщ. АН. 1984.- Т. 116, № 3.

59. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы / П. Фридрих. М.: Мир, 1986. - 374 с.

60. Хочачка П. Биохимическая адаптация / П. Хочачка, Дж. Сомеро. М. : Мир. - 1988.-568 с.

61. Хочачка П. Стратегия биохимической адаптации / П. Хочачка, Дж. Сомеро. М.: Мир. - 1977. - 398 с.

62. Чеканова Ю.А. Связь процесса окисления восстановленных соединений серы с особенностями функционирования дыхательной цепи Macromonas bipunctata и Beggiatoa leptomitiformis штамм Д-405: автореф. дис. . канд. биол. наук / Ю.А. Чеканова. М., 1991. - 25 с.

63. Чеканова Ю.А. Цитохимическая локализация перекиси водорода и супероксидного радикала в клетках бесцветных серобактерий / Ю.А. Чеканова, Г.А. Дубинина // Микробиология. 1990. - Т. 59, вып. 5. - С. 856-861.

64. Чернышев Г.А. Вероятность и статистика в биологии и химии / Г.А. Чернышев, В.Н. Стариков. Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1998.-270 с.

65. Чурикова В.В. Основы микробиологии и вирусологии / В.В. Чурикова, Д.П. Викторов. Воронеж : Изд-во Воронеж, гос. ун-та, 1994. - 278 с.

66. Шульц Г. Принципы структурной организации белков / Г. Шульц, Р. Ширмер. М.: Мир, 1982. - 354 с.

67. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель. М. : Мир, 1987. -566 с.

68. Якубке Х.-Д. Аминокислоты, пептиды, белки / Х.-Д. Якубке, X. Ешкайт. М.: Мир, 1985. - 456 с.

69. A single amino acid mutation enhances the thermal stability of Escherichia coli malate dehydrogenase / C.R. Goward et. al.. // Eur. J. Biochem. -1994. V. 224, № 1. - P. 249-255.

70. A specific, highly active malate dehydrogenase by redesign of a lactate dehydrogenase framework / H.M. Wilks et. al.. // Science. 1988. - V. 242.-P. 1541-1544.

71. Adjustment of conformational flexibility is a key event in the thermal adaptation of proteins / P. Zavodszky et. al.. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1998. V. 95, № 13. - P. 7406-7411.

72. An improved purification method for cytosolic malate dehydrogenase from several sources / C. Domenech et. al.. // Prep. Biochem. 1988. - V. 18, № 1.-P. 17-35.

73. Aquino-Silva M.R. Isoform expression in the multiple soluble malate dehydrogenase of Hoplias malabaricus (Erythrinidae, Characiformes) / M.R. Aquino-Silva, M.L.B. Schwantes, A.R. Schwantes // Braz. J. Biol. -2003.-V. 63, № 1. P.7-15.

74. Bartlett D.H. Microbial life at high pressures / D.H. Bartlett // Sci. Prog. -1992. V. 76, № 3-4. - P. 479-496.

75. Binding of citrate synthase and malate dehydrogenase to mitochondrial inner membranes: distribution and metabolite effects / G. Moore et. al.. // Biochem. and Biophys. Res. Common. 1984. - V. 121, № 2.

76. Biodiversity in deep-sea sites located near the south part of Japan / H. Takami et. al.. // Extremophiles. 1999. - V. 3, № 2. - P. 97-102.

77. Bioenergetics and cytoplasmic membrane stability of the extremely acidophilic, thermophilic archaeon Picrophilus oshimae / Vossenberg et. al.. // Extremophiles. 1998. - V. 2, № 2. - P. 67-74.

78. Birktoft J.J. Refined crystal structure of cytoplasmic malate dehydrogenase at 2.5-A resolutin / J.J. Birktoft, G. Rhodes, L.J. Banaszak // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 6065-6089.

79. BirktoftJJ. Structure-function relationships among nicotinamide-adenine dinucleotide dependent oxidoreductases / J.J. Birktoft, L.J. Banaszak // Peptide Protein Rev. 1984. - V. 4. - P. 1-46.

80. Breiter D.R. Engineering the quaternary structure of an enzyme: construction and analysis of a monomeric form of malate dehydrogenase from Escherichia coli / D.R. Breiter, E. Resnik, L.J. Banaszak // Protein Sci. 1994. - V. 3, № 11. - P. 2023-2032.

81. Brock T.D. The genus Leucothrix / T.D. Brock // The procariotes. 1992. -P. 3247-3255.

82. Brune A. Life at the oxic-anoxic interface: microbial activities and adaptations / A. Brune, P. Frenzel, H. Cypionka // FEMS Microbiology Reviews. 2000. - V. 24. - P. 691-710.

83. Catalitic-rate improvement of a thermostable malate dehydrogenase by a subtle alteration in cofactor binding / R. M. Alldread et.al.. // Biochem. J. 1995. - V. 305, № 2. - P. 539-548.

84. Chan M. Functional characterization of an alternative lactate dehydrogenase-like. malate dehydrogenase in Plasmodium falciparum / M. Chan, Sim T.S. // Parasitol. Res. 2004. - V. 92, № 1. - P. 43-47.

85. Characterization of alanine and malate dehydrogenases from a marine psychrophile strain PA-43 / J.A. Irwin et. al.. // Extremophiles. 2001 -V. 5, №3. - P. 199-211.

86. Cloning and sequence analysis of cDNAs encoding mammalian cytosolic malate dehydrogenase. Comparison of the amino acid sequences of mammalian and bacterial malate dehydrogenase / T. Joh et. al.. // J. Biol. Chem. 1987. -V. 262, №31.-P. 15127-15131.

87. Cloning, sequencing, and expression in Escherichia coli of the gene coding for malate dehydrogenase of the extremely halophilic archaebacterium Haloarcula marismortui / F. Cendrin et. al.. // Biochemistry. 1993. -V.32.-P. 4308-4313.

88. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli gene enconding malate dehydrogenase / L. McAlister-Henn et. al.. // Nucleic Acids Research. 1987. - V. 15, № 12. - P. 4993.

89. Contribution of engineered electrostatic interactions to the stability of cytosolic malate dehydrogenase / F. Trejo et. al.. // Protein Eng. 2001. -V.14, №11.-P. 911-917.

90. Crystal structure of the MJ0490 gene product of the hyperthermophilic archaebacterium Methanococcus jannaschii, a novel member of the lactate/malate family of dehydrogenases / B.I. Lee et. al.. // J. Mol. Biol. -2001.- V. 307, №5.-P. 1351-1362.

91. Cytoplasmic malate dehydrogenase from Phycomyces blakesleeanus: kinetics and mechanim / F. Teixido et. al.. // Can. J. Biochem. Cell. Biol. 1985. - V. 63, № 10. - P. 1097-1105.

92. Davis, B.J. A new high resolution electrophoresis method / B.J. Davis, L. Ornstein // Society for the study at the New York Academy of medicine. -1959.-P. 112-118.

93. Deferribacter desulfuricans sp. nov., a novel sulfur-, nitrate- and arsenate-reducing thermophile isolated from a deep-sea hydrothermal vent / K. Takai et. al.. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. - V.53, № 3. - P.839-846.

94. Determinants of protein thermostability observed in the 1.9-A crystal structure of malate dehydrogenase from the thermophilic bacterium Thermus flavus / C.A. Kelly et. al.. // Biochemistry. 1993. - V. 32, № 15.-P. 3913-3922.

95. Distribution, diversity and activity of microorganisms in the hyper-alkaline spring waters of Maqarin in Jordan / K. Pedersen et. al.. // Extremophiles. 2004. - V.8, № 2. - P. 151-164.

96. Drmota T. Isolation and characterisation of cytosolic malate dehydrogenase from Trichomonas vaginalis / T. Drmota, J. Tachezy, J. Kulda // Folia Parasitol. (Praha). 1997. - V. 44, № 2. - P. 103-108.

97. Effect of cavity-modulating mutations on the stability of Escherichia coli HI / S. Kimura et. al.. // Eur. J. Biochem. 1992. - V. 206, № 2. - P. 337343.

98. Effects of engineered salt bridges on the stability of subtilisin BPN' / C.R. Erwin et. al.. // Protein Eng. 1991. - V. 4, № 1. - P. 87-97.

99. Electrostatic interactions across the dimer-dimer interface contribute to the pH-dependent stability of a tetrameric malate dehydrogenase / A. Bjork et. al.. // FEBS Lett. 2003b. - V. 553, № 3. - P. 423-426.

100. Enhancement of the turnover number of thermostable malate dehydrogenase by deleting hydrogen bonds around the catalytic site / M. Nishiyama et. al.. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - V. 225, № 3.- P. 844-848.

101. Factors affecting L-malate activation of mitochondrial malate dehydrogenase from chicken liver / A. Dordal et. al.. // Biochem. Int. -1990. V. 20, № 1. - P. 177-182.

102. Fieldes M.A. An explanation of the achromatic bands produced by peroxidase isozymes in polyacrylamide electrophoresis gels stained for malate dehydrogenase / M.A. Fieldes // Electrophoresis. 1992. - V. 13, № 1-2. - P. 82-86.

103. Fieldes P.A. Protein function at thermal extremes: balancing stability and flexibility / P.A. Fieldes // Сотр. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2001. - V. 129, № 2-3. - P. 417-431.

104. Fukuchi S. Protein surface amino acid compositions distinctively differ between thermophilic and mesophilic bacteria / S. Fukuchi, K. Nishikawa // J. Mol. Biol. 2001. - V. 309, № 4. - P. 835-843.

105. Functions of the membrane-associated and cytoplasmic malate dehydrogenases in the citric acid cycle of Corynebacterium glutamicum / D. Molenaar et. al.. // J. Bacteriol. 2000. - V.l82. - P. 6884-6891.

106. Gietl C. Malate dehydrogenase isoenzymes: cellular locations and role in the flow of metabolites between the cytoplasm and cell organelles / C. Gietl // Biochim. Biophys. Acta. 1992. - V. 1100, № 3. - P. 217-234.

107. Goward C.R. Malate dehydrogenase: a model for structure, evolution, and catalysis / C.R. Goward, D.J. Nicholls // Protein Sci. 1994. - V.3. - P. 1883-1888.

108. Gromiha M.M. Important inter-residue contacts for enhancing the thermal stability of thermophilic proteins / M.M. Gromiha // Biophys. Chem. -2001.-V. 91, № 1.- P. 71-77.

109. Growth kinetics of haloalkaliphilic, sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio versutus strain ALJ 15 in continuous culture / H. Banciu et. al.. // Extremophiles. 2004. - V. 8, № 3. - P. 185-192.

110. Hall M.D. Crystal structure of a ternary complex of Escherichia coli malate dehydrogenase citrate and NAD at 1.9 A resolution / M.D. Hall, L.J. Banaszak // J. Mol. Biol. 1993. - V. 232, № 1. - p. 213-222.

111. Hall M.D. Crystal structure of Escherichia coli malate dehydrogenase. A complex of the apoenzyme and citrate at 1.87 A resolution / M.D. Hall, D.G. Levitt, L.J. Banaszak // J. Mol. Biol. 1992. - V. 226, № 3. - P. 867882.

112. Halobacillus locisalis sp. nov., a halophilic bacterium isolated from a marine solar saltern of the Yellow Sea in Korea / J.H. Yoon et. al.. // Extremophiles. 2004. - V.8, № 1. - P. 23-28.

113. Hecht K. Catalytic properties of thermophilic lactate dehydrogenase and halophilic malate dehydrogenase at high temperature and low water activity / K. Hecht, A. Wrba, R. Jaenicke // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 183, № i. p. 69-74.

114. Hrdy I. Purification and partial characterization of cytosolic malate dehydrogenase from Tritrichomonas foetus / I. Hrdy // Folia Parasitol. (Praha). 1993. - V. 40, № 3. - P. 181-185.

115. Identification, cloning and expression analysis of strawberry (Fragaria xananassa) mitochondrial citrate synthase and mitochondrial malate dehydrogenase / P.P. Iannetta et. al.. // Physiol. Plant. 2004. - V. 121,№ l.-P. 15-26.

116. Isolation and characterization of Thermus thermophilus Gy 1211 from a deep-sea hydrothermal vent / V.T. Marteinsson et. al.. // Extremophiles. -1999. V. 3,№ 4. - P. 247-251.

117. Jacq E. Microscopic examination and fatty acid characterization of filamentous bacteria colonizing substrata around subtidal hydrothermal vents / E. Jacq, D. Prieur, P. Nichols // Arch. Microbiol. 1989. - V.152, №1.-P. 64-71.

118. Jaenicke R. How do proteins acquire their three-dimensional structure and stability? / R. Jaenicke // Naturwissenschaften. 1996a. - V.83, № 12. - P. 544-554.

119. Jaenicke R. Protein stability and protein folding / R. Jaenicke // Ciba Foundation Symp. 1991. - V. 161. - P. 206-216.

120. Jaenicke R. Protein structure and function at low temperatures / R. Jaenicke // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1990. - V. 326, № 1237.-P. 535-551.

121. Jaenicke R. Stability and folding of ultrastable proteins: eye lens crystallins and enzymes from thermophiles / R. Jaenicke // FASEB J. -1996b. V. 10, № l.-P. 84-92.

122. Jaenicke R. Stability and stabilization of globular proteins in solution / R. Jaenicke // J. Biotechnol. 2000. - V. 79, № 3. - P. 193-203.

123. Jaenicke R. The stability of proteins in extreme environments / Jaenicke R., Bohm G. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. - V. 8, № 6. - P. 738-748.

124. Jaenicke, R. What ultrastable globular proteins teach us about protein stabilization / R. Jaenicke // Biochemistry. 1998. - V. 63, № 3. - P. 312321.

125. Janiczek O. Purification and properties of malate dehydrogenase from Paracoccus denitrificans / O. Janiczek, J. Kovar, Z. Glatz // Prep. Biochem. 1993. - V.23, № 3. - P. 285-301.

126. Jorgensen B. Colorlees sulfur bacteria, Beggiatoa spp. and Thiovulum spp., in O2 and H2S microgradients / B. Jorgensen, P. Revsbach // Applied and Environmental Microbiology. 1983. - V. 45, № 4. - P. 1261-1270.

127. Kato С. Isolating and characterizing deep-sea marine microorganisms / C. Kato, A. Inoue, K. Horikoshi // Trends Biotechnol. 1996. - V. 14, № 1. -P. 6-12.

128. Kato C. Microbial diversity of deep-sea extremophiles Piezophiles, Hyperthermophiles, and subsurface microorganisms / C. Kato, K. Takai // Biol. Sci. Space. - 2000. - V. 14, № 4. - P. 341-352.

129. Kinetic and molecular modeling of nucleoside and nucleotide inhibition of malate dehydrogenase / D.J. Harris et. al.. // Nucleosides. Nucleotides. Nucleic Acids. 2002. - V. 21, № 11-12. - P. 813-823.

130. Kinetic studies of the regulation of mitochondrial malate dehydrogenase by citrate / J.L. Gelpi et. al.. // Biochem. J. 1992. - V. 283, № 1. - P. 289297.

131. Kristjansson H. Purification and properties of malate dehydrogenase from the extreme thermophile Bacillus candolyticus / H. Kristjansson, C. Ponnamperuma // Orig. Life. 1980. - V.10, № 2. - P. 185-192.

132. Kuijk B.L. Purification and characterization of malate dehydrogenase from the syntrophic propionate-oxidizing bacterium strain MPOB / B.L. Kuijk, A.J. Stams// FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V.144, № 2-3. - P. 141-144.

133. Kumar S. Close-range electrostatic interactions in proteins / S. Kumar, R. Nussinov // Chembiochem. 2002. - V.3, № 7. - P. 604-617.

134. Labrou N.E. L-Malate dehydrogenase from Pseudomonas stutzeri: purification and characterization / N.E. Labrou, Y.D. Clonis // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V. 337, № 1. - P. 103-114.

135. Ladenstein R. Proteins from hyperthermophiles: stability and enzymatic catalysis close to the boiling point of water / R. Ladenstein, G. Antranikian // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1998. - V. 61. - P. 37-85.

136. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmly // Nature. 1970. - V.77, №4. -P.680-683.

137. Lang-Unnasch N. Purification and properties of Plasmodium falciparum malate dehydrogenase / N. Lang-Unnasch // Mol. Biochem. Parasitol. -1992.-V. 50, № 1. P. 17-25.

138. Lithoheterotrophic growth and electron transfer chain components of the filamentous gliding bacterium Leucothrix mucor DSM 2157 during oxidation of sulfur compounds / M.Yu. Grabovich et. al.. // FEMS Micribiol. Lett. 1999. - V. 178. - P. 155-161.

139. Lithoautotrophic growth of the freshwater strain Beggiatoa D-402 and energy conversation culture under mixotrophic condition / M.Yu. Grabovich et. al.. // FEMS Micribiol. Lett. 2001. - V. 204. - P. 341345.

140. Ma H. Malate dehydrogenase isoenzymes in Aspergillus niger / H. Ma, C.P. Kubicek, M. Rohr // FEMS Microbiol. Lett. 1982. - V. 12, № 2. - P. 147-151.

141. Machado M.F. Malate dehydrogenase (MDH; EC 1.1.1.37) isozymes in tissues and callus cultures of Cereus peruvianus (Cactaceae) / M.F. Machado, A.J. Prioli, C.A. Mangolin // Biochem. Genet. 1993. - V. 31, №3-4.-P. 167-172.

142. Madern D. Molecular adaptation: the malate dehydrogenase from the extreme halophilic bacterium Salinibacter ruber behaves like a non-halophilic protein / D. Madern, G. Zaccai // Biochimie. 2004. - V. 86, № 4-5.- P. 295-303.

143. Mahmoud Y.A. Purification and characterization of malate dehydrogenase from Cryptococcus neoformans / Y.A. Mahmoud, S.M. Souod, W.G. Niehaus // Arch. Biochem. Biophys. 1995. - V. 322, № 1. - P. 69-75.

144. Malate dehydrogenase: distribution, function and properties / R.A. Musrati et. al.. //Gen. Physiol. Biophys. 1998. - V. 17, № 3. - P. 193-210.

145. Malate dehydrogenases—structure and function / P. Minarik et. al.. // Gen. Physiol. Biophys. 2002. - V.21, № 3. - P.257-265.

146. Malick A.W. Effect of lipids on anzymatic activity of pig heart mitichondrial malate dehydrogenase monomolecular films / A.W. Malick, N.D. Weiner// J. Pharm. Science. 1977. - V.66, № 10.

147. Mansini E. Purification and properties of mitochondrial malate dehydrogenase of Toxocara canis muscle / E. Mansini, E.G. Oestreicher, L.P. Ribeiro // Сотр. Biochem. Physiol. B. 1986. - V.85, № 1. - P.223-228.

148. Markina V.L. The effect of modification of lactate and malate dehydrogenases on their stability and activity / V.L. Markina, A.N. Eremin, D.I. Metelitsa // Biophis. 1990. - V. 35, № 1. - P. 30-35.

149. Mass spectrometric sequncing of proteins from silver-stained polyacrylamide gels / A. Shevchenko et. al.. // Anal. Chem. 1996. - V. 68. - P. 850-858.

150. Matthews B.W. Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding / B.W. Matthews, H. Nicholson, W.J. Becktel // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84, № 19. - P. 6663-6667.

151. McAlister-Henn L. Evolutionary relationships among the malate dehydrogenases / L. McAlister-Henn // Trends Biochem. Sci. 1988. - V. 13.-P. 178-181.

152. McGuire, J.P. Studies of enzyme inhibition. The interaction of some platinum (II) complexes with fumarase and malate dehydrogenase / J.P. McGuire, M.E. Friedman, Ch.A. McAuliffe // Inorganic. Chim. Acta. -1984.-V. 91, №3.

153. Menendez-Arias L., Argos P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics point to residue substitution in alpha-helices / L. Menendez-Arias, P. Argos // J. Mol. Biol. 1989. - V. 206, № 2. - P. 397406.

154. Minard K.I. Glucose-induced degradation of the MDH2 isozyme of malate dehydrogenase in yeast / K.I. Minard, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 1992. - V. 267, № 24. - P. 17458-17464.

155. Mitichondrial malate dehydrogenase from the thermophilic, filamentous fungus Talaromyces emersonii / A.P. Maloney et. al.. // Eur. J. Biochem. -2004. V. 271, № 15. - P. 3115-3126.

156. Mottram J.C. Purification of particulate malate dehydrogenase and phosphoenolpyruvate carboxykinase from Leishmania mexicana / J.C. Mottram, G.H. Coombs // Biochem. Biophys. Acta. 1985. - V. 827, № 2. -P. 310-319.

157. Nelson D.S. Physiology and biochemistry of filamentous sulfur bacteria / D.S. Nelson // Autotrophic bacteria. 1989. - P. 219-238.

158. Nelson D.S. Chemoautotrophic growth of a marine Beggiatoa in sulflde-gradient cultures / D.S. Nelson, H.W. Jannasch // Arch. Microbiol. 1983. -V. 136. -P.262-269.

159. Nelson D.S. Growth pattern and yield of chemoautotrophic Beggiatoa sp. in oxygen-sulfide microgradients / D.S. Nelson, B. Jorgensen, P. Revsbach // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 52. - P. 225-233.

160. Nesterenko M.V. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels / M.V. Nesterenko, M. Tilley, S.J. Upton // J. Biochem. Biol. 1994. - V. 28. - P. 239-242.

161. Nies D.H. Heavy metal-resistant bacteria as extremophiles: molecular physiology and biotechnological use of Ralstonia sp. CH34 / D.H. Nies // Extremophiles. 2000. - V.4, № 2. - P. 77-82.

162. Nicholson H. Enhanced protein thermostability from designed mutations that interact with aipha-helix dipoles / H. Nicholson, W.J. Becktel, B.W. Matthews // Nature. 1988. - V. 336, № 6200. - P. 651-656.

163. NishiyamaM. Alteration of coenzyme specificity of malate dehydrogenase from Thermus flavus by site-directed mutagenesis / M. Nishiyama, J.J. Birktoft, T. Beppu // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268, № 7. - P. 4656-4660.

164. Patnaik S.K. Differential regulation of malate dehydrogenase isoenzymes by estradiol in the brain of rats of various ages / S.K. Patnaik // Biochem. Int. 1990. - V. 20, № 3. - P. 633-639.

165. Petrotoga mexicana sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic and xylanolytic bacterium isolated from an oil-producing well in the Gulf of Mexico / E. Miranda-Tello et. al.. // Int J Syst Evol Microbiol. 2004. -V. 54,№ l.-P. 169-174.

166. Pfennig N.D., Lippert K.D. Uber das vitamin В12 bedurfuis phototropher Schwefelbakterien. / N.D. Pfennig, K.D. Lippert // Arch. Microbiol. -1966. - V.55, № 1. - P. 245-259.

167. Pressure effects on Clostridium strains isolated from a cold deep-sea environment / F.M. Lauro et. al.. // Extremophiles. 2004. - V.8, № 2. -P. 169-173.

168. Properties and function of malate enzyme from Pseudomonas putida / A. Garrido-Pertierra et. al.. // Biochimie. 1983. - V. 65, № 11-12. - P. 629635.

169. Properties and primary structure of a thermostable L-malate dehydrogenase from Archaeoglobus fulgidus / A. S. Langelandsvik et. al.. // Arch. Microbiol. 1997. - V. 168, № 1. - P.59-67.

170. Properties and primary structure of the L-malate dehydrogenase from the extremely thermophilic archaebacterium Methanothermus fervidus / E. Honka et. al.. // Eur. J. Biochem. 1990. - V. 188, № 3. - P. 623-632.

171. Protein meacuament with the folin pihend reagent / O.H. Lowry et. al.. //J. Biologi. 1951. - V. 193. - P.265-275.

172. Protein thermostability in extremophiles / R. Scandurra et. al.. // Biochimie. 1998. - V. 80, № 11. - p. 933-941.

173. Purification and characterization of malate dehydrogenase from Streptomyces aureofaciens / D. Mikulasova et. al.. // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 159, № 2. - P. 299-305.

174. Purification and N-terminal amino-acid sequence of bacterial malate dehydrogenases from six actinomycetaes strains and from Phenylobacterium immobile, strain E / Т.О. Rommel et. al.. // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1989. - V. 370, № 7. - P. 763-768.

175. Purification and properties of malate dehydrogenase from the thermoacidophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum / W. Grossebuter et. al.. // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1986. - V. 367, № 6. -P. 457-463.

176. Purification and properties of two malate dehydrogenases from Candida sp. N-16 grown on methanol / J. Yoshikawa et. al.. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. - V. 65, № 7. - P. 1659-1662.

177. Purification of bacterial malate dehydrogenases by selective elution from a triazinyl dye affinity column / K. Smith et. al.. // Biochim. Biophys. Acta.- 1982.-V. 708.-P. 17-25.

178. Purification procedure and N-terminal amino-acid sequence of yeast malate dehydrogenase isoenzymes / E. Kopetzki et. al.. // Biochem. Biophys. Acta. 1987. - V.912, № 3. - P. 398-403.

179. Rat liver mitochondrial malate dehydrogenase: purification, kinetic properties, and role in ethanol metabolism / M.S. Wiseman et. al.. // Arch. Biochem. Biophys. 1991. - V. 290, № 3. - P. 191-196.

180. Roderick S.L. The three dimensional structure of porcine heart mitochondrial malate dehydrogenases at 3.0-A resolution / S.L. Roderick, L.J. Banaszak//J. Biol. Chem. 1986. -V. 261. - P. 9461-9464.

181. Saito R. Differences in malate dehydrogenases from the piezophilic deep-sea bacterium Moritella sp. strain 2D2 and the psychrophilic bacterium Moritella sp. strain 5710 / R. Saito, A. Nakayama // FEMS Microbiol. Lett.- 2004. V. 233, № 1. - P. 165-172.

182. Sequence and structure of D- D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus / G. Biesecker et. al.. // Nature. 1977. - V. 266. - P. 328-333.

183. Shah H.N. Malate dehydrogenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase, key markers for studing the genetic diversity of Actinobacillus actinomycetemcomitans / H.N. Shah, D.M. Andrews // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - V. 122, № 1-2. - P. 69-73.

184. Sheikh S. Active site mapping studies of malate dehydrogenase : identification of essential amino acid residues by o-phthalaldehyde / S. Sheikh, S.S. Katiyar // Biochem. Int. 1992. - V. 27, № 3. - P. 517-524.

185. Skulachev V.P. Membrane bioenergetics / V.P. Sculachev. Springer, Berlin. - 1988. - 556 p.

186. Smith K. Stability and immunological cross-reactivity of malate dehydrogenases from mesophilic and thermophilic sources / K. Smith, Т.К. Sundaram // Biochim. Biophys. Acta. 1988. - V. 955, № 2. - P. 203213.

187. Smith K. Malate dehydrogenases from actinomycetes: structural comparison of Thermoactinomyces enzyme with other actinomycete and Bacillus enzymes / K. Smith, Т.К. Sundaram, M. Kernick // J. Bacteriol. 1984. - V. 157, № 2. - P. 684-687.

188. Stability and reconstitution of pyruvate oxidase from Lactobacillus plantarum: dessection of the stabilizing effects of coenzyme bindings and subunit interaction / B. Risse et. al.. // Protein. Sci. 1992. - V. 1. - P. 1699-1718.

189. Stabilisation of a tetrameric malate dehydrogenase by introduction of a disulfide bridge at the dimmer-dimer interface / A. Bjork et. al.. // J. Mol. Biol. 2003a. - V. 334, № 4. - P. 811-821.

190. Stabilization of halophilic malate dehydrogenase / G. Zaccai et. al. // J. Mol. Biol. 1989. - V. 208, №3.

191. Steffan J.S. Isolation and characterization of the yeast gene encoding the MDH-3 isoenzyme of malate dehydrogenase / J.S. Steffan, L. McAlister-Henn // J. Biol. Chem. 1992. - V.267,№ 34. - P. 24708-24715.

192. Steffan, J.S. Structural and functional effects of mutations altering the subunit interface of mitochondrial malate dehydrogenase / J.S. Steffan, L. McAlister-Henn // Arch. Biochem. Biophys. 1991. - V. 287, № 2. - P. 276-282.

193. Stetter K.O. Extremophiles and their adaptation to hot environments / K.O. Stetter // FEBS Lett. 1999. - V. 452, № 1-2. - P.22-25.

194. Sterner R. Thermophilic adaptation of proteins / R. Sterner, W. Liebl // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2001. - V. 36, №1. - P. 39-106.

195. Structural basis for cold adaptation. Sequence, biochemical properties, and crystal structure of malate dehydrogenase from a psychrophile Aquaspirillum arcticum / S.Y. Kim et. al.. // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274,№ 17.-P. 11761-11767.

196. Structural basis for thermophilic protein stability: structures of thermophilic and mesophilic malate dehydrogenases / B. Dalhus et. al.. // J. Mol. Biol. 2002. - V.318, №3. - P.707-721.

197. Structure and stability of hyperstable proteins: glycolytic enzymes from hyperthermophilic bacterium Thermogota maritime / R. Jaenicke et. al.. // Adv. Protein. Chem. 1996. - V. 48. - P. 181-269.

198. Tayeh M.A. Malate dehydrogenases in phototrophic purple bacteria: purification, molecular weight, and quaternary structure / M.A. Tayeh, M.T. Madigan // J. Bacterid. 1987. - V. 169, № 9. - P. 4196-4202.

199. Tayeh M.A. Malate dehydrogenases in phototrophic purple bacteria. Thermal stability, amino acid composition and immunological properties /

200. М.А. Tayeh, M.T. Madigan // Biochem. J. 1988. - V. 252, № 2. - P. 595-600.

201. Tetrameric and dimeric malate dehydrogenase isoenzymes in Trypanosoma cruzi epimastigotes / G.R. Hunter et. al.. // Mol. Biochem. Parasitol. 2000. - V. 105, № 2. - P. 203-214.

202. The 2.9 A resolution crystal structure of malate dehydrogenase from Archaeoglobus fulgidus: mechanisms of oligomerisation and thermal stabilization / A. Irimia et. al.. // J. Mol. Biol. 2004. - V. 335, № 1. - P. 343-356.

203. The stability and hydrophobity of cytosolic and mitochondrial malate dehydrogenases and their relation to chaperonin-assisted folding / R.A.Staniforth et. al.. // FEBS Lett. 1994. - V. 344, № 2-3. - P. 129135/

204. Thermal stability and protein structure / P. Argos et. al.. // Biochemistry. 1979. -V. 18. -P. 5698-5703.

205. Thermococcus marinus sp. nov. and Thermococcus radiotolerans sp. nov., two hyperthermophilic archaea from deep-sea hydrothermal vents that resist ionizing radiation / E. Jolivet et. al.. // Extremophiles. 2004. - V.8, № 3. - P. 219-227.

206. Two malate dehydrogenases in Methanobacterium thermoautotrophicum / H. Thompson et. al.. // Arch. Microbiol. 1998. - V. 170, № 1. - P. 3842.

207. Tung P.P. Substrate and cofactor binding to fluorescently labeled cytoplasmic malate dehydrogenase / P.P. Tung, G.M. Alter // Biochim. Biophys. Acta. 2001. -V. 1545, № 1-2. - P. 132-145.

208. Tyagi A.K. Studies on the purification and characterization of malate dehydrogenase from Mycobacterium phlei. / A.K. Tyagi, F.A. Siddiqui, T.A. Venkitasubramanian // Biochim. Biophys. Acta. 1977. -V. 485. - P. 255-267.

209. Uttaro A.D. Characterisation of the two malate dehydrogenase from Phytomonas sp. Purification of the glicosomal isoenzyme / A.D. Uttaro, F.R. Opperdoes // Mol. Biochem. Parasitol. 1997. - V. 89, № 1. - P. 5159.

210. Vieille C. Thermozymes / C. Vieille, D.S. Burdette, J.G. Zeikus // Biotechnol. Annu. Rev. 1996. - V. 2. - P. 1-83.

211. Vihinen M. Relationship of protein flexibility to thermostability / M. Vihinen // Protein Eng. 1987. - V.l, № 6. - P. 477-480.

212. Vogt G. Protein thermal stability, hydrogen bonds, and ion pairs / G. Vogt, S. Woell, P. Argos // J. Mol. Biol. 1997. - V. 269, № 4. - P. 631-643.

213. Vulcanithermus medioatlanticus gen.nov.,sp. nov. a novel member of the family Thermaceae from a deep-sea hot vent / M.L. Miroshnichenko et.al.. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. - V.53. - P. 1143-1148.

214. Walker J.E. Heat stability of a tetrameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase / J.E. Walker, A.J. Wonacott, J.I. Harris // Eur. J. Biochem. 1980. - V. 108, № 25. - P. 581-586.

215. Waters J.K. Malate dehydrogenase from Rhizobium japonicum 31 lb-143 Bacteroids and glicin max root nodule mitochondria / J.K. Waters, D.B. Karr, D.W. Emerich // Biochemistry. 1985. - V. 24, № 23.

216. Wiegel J. Alkalithermophiles / J. Wiegel, V.V. Kevbrin // Biochem. Soc.

217. Trans. 2004. - V.32, №2. - P. 193-198.

218. Wise D.J. Purification and kinetic characterization of Haemophilus influenzae malate dehydrogenase / D.J. Wise, C.D. Anderson, B.M. Anderson // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V. 344, № 1. - P. 176-183.

219. Yueh A.Y. Purification and molecular properties of malate dehydrogenase from the marine diatom Nitzchia alba / A.Y. Yueh, C.S. Chung, Y.K. Lai // Biochem. J. 1989. - V. 258, № 1. - P. 221-228.

220. Zenka J. Purification and properties of cytoplasmic malate dehydrogenase from Taenia crassiceps (Zeder, 1800) cysticerci / J. Zenka, J. Prokopic // Folia Parasitol. (Praha). 1989. - V. 36, № 1. - P. 59-65.

221. Zimmerle C.T. Cooperativity in the mechanism of malate dehydrogenase / C.T. Zimmerle, G.M. Alter // Biochemistry. 1993. - V. 32, № 47. - P. 12743-12748.

222. Zuber H. Structure and function of enzymes from thermophilic microorganisms / H. Zuber // Strategies of Microbial life in extreme environments 1979. - P. 393-415.

Информация о работе

Парфёнова, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Воронеж, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы