Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп

Спиридонова, Елизавета Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. Ломоносова _Биологический факультет_

на правах рукописи СПИРИДОНОВА ЕЛИЗАВЕТА МИХАЙЛОВНА

Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006 г.

Работа выполнена на базе ЦКП Центра «Биоинженерия» РАН

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

,.... -- ....... Ивановский Р.Н.

Научный консультант кандидат биологических наук

Турова Т.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Бонч-Осмоловская Е. А. доктор биологических наук Кочиева Е. 3.

Ведущая организация Научно-исследовательский институт

физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Защита состоится 24 октября 2006 года в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан /3 сентября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. V// ПискуиковаН.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Первичная продукция органического углерода в биосфере основана на ассимиляции СОг автотрофными организмами. В процессе эволюции у разных групп автотрофов выработались различные механизмы фиксации ССЬ, наиболее распространненым из которых является восстановительный рибулозобисфосфатный цикл (цикл Кальвина). Ключевым ферментом автотрофной фиксации СОг в цикле Кальвина является рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа(РБФК, КФ 4.1.1.39), по структурным и функциональным свойствам разделяемая на четыре формы. Наиболее распространенной является форма I, которая состоит из больших и малых субъединиц, кодируемых, соответственно, генами cbbL и cbbS. В свою очередь, РБФК формы I подразделяют на два типа: так называемые «зеленый» (варианты IA и IB) и «красный» (варианты 1С и ID). РБФК формы II, кодируемая геном cbbM, встречается гораздо реже и состоит только из больших субъединиц. Форма III недавно обнаружена у архей, к форме IV относят РБФК-подобные белки. В то время, как структурные и биохимические свойства РБФК обстоятельно исследованы классическими методами, данные о происхождении и эволюции этого фермента чрезвычайно ограничены.

Наиболее эффективные способы исследования происхождения и эволюции РБФК основаны на молекулярно-биологических методах, позволяющих проводить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих этот белок, у различных групп прокариот, принадлежащим к удаленным друг от друга эволюционным ветвям. Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов, кодирующих РБФК, широко применяется в таксономии растений и водорослей (Clegg, 1993; Freshwater et al., 1994). Сравнение филогенетических схем (деревьев), построенных на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих РБФК, традиционного анализа генов, кодирующих 16S рРНК, а также, в некоторых случаях, анализа и других структурных генов, позволяет выявить особенности эволюции и функционирования генов, кодирующих РБФК, у различных прокариот.

В этой связи разработка методов выявления и филогенетической характеристики генов, кодирующих РБФК у различных прокариот, представляется весьма актуальной. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в разработке универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I бактерий, и ее применении для анализа разнообразия исследуемых генов у фото- и хемотрофных бактерий, различающихся по экологическим, физиологическим особенностям и таксономическому положению.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Конструирование универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I, у максимально широкого спектра бактерий.

2. Проверка выбранной системы праймеров на препаратах ДНК, выделенных из бактерий, для которых ранее была продемонстрирована способность к фиксации СОг через цикл Кальвина и известна первичная структура генов, кодирующих РБФК.

3. Подбор и оптимизация условий ПЦР для амплификации выбранных фрагментов генов, кодирующих РБФК, и применение разработанных системы праймеров и протокола проведения реакции для исследования модельной группы бактерий, использующих восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов. Проведение филогенетического анализа полученных последовательностей,

4. Сопоставление филогенетических деревьев, построенных на основе анализа последовательностей генов, кодирующих РБФК и 16S рРНК.

5. Проверка применимости разработанной системы праймеров для исследования микробных сообществ.

Научная новизна н практическая значимость работы. Разработана универсальная система праймеров, позволяющая амплифицировать фрагменты генов cbbL у максимально широкого спектра бактерий.

Впервые выявлены и ссквенированы гены ebbL фототрофных зеленых несерных бактерий рода Oscillochloris, а также ряда хемотрофных серуокисляющих бактерий, принадлежащих к родам Thiobacillus, Thioalkalivibrio, Thioalkalispira, Thioalkalimicrobium, Thiomicrospira и Thioclava, и проведен их филогенетический анализ.

Предложена схема эволюции генов, кодирующих РБФК, у представителей ролов Thioalkalimicrobium и Thiomicrospira.

Предположено существование нового варианта «красного» типа РБФК формы I у бактерий Oscillochloris trichoides и Sulfobacillus acidophilus.

Проведен комплексный анализ разнообразия симбиотического бактериального сообщества, обитающего в жабрах глубоководных двустворчатых моллюсков Bathymodiolus azoricus. Показано, что разработанная система праймеров может использоваться при проведении исследований биоразнообразия автотрофных микроорганизмов в различных природных сообществах. Показано, что результаты анализа функциональных генов позволяют существенно дополнять выводы, получаемые при проведении анализа генов, кодирующих löSpPHK, и получать более полную информацию о составе прокариотньгх природных сообществ.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (Badajoz, 2005), XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005), Всероссийской Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005), Всероссийском симпозиуме «Автотрофные

микроорганизмы» (Москва, 2005), 11th International Symposium on Microbial Ecology (Vienna, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей, 5 тезисов в сборниках

работ российских и зарубежных конференций, 2 статьи приняты в печать.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 127 страницах

машинописного текста и включают 31 рисунок и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов:

«Введение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты и обсуждение»,

«Выводы» и «Список литературы», который содержит 11 отечественных и 189 иностранных

наименований.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись 28 штаммов бактерий, использующих восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов, из коллекций кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова и Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Образцы жаберной ткани двустворчатых моллюсков Bathymodiolus azoricus были предоставлены Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Выбор праймеров. Построение консенсусных последовательностей по результатам выравнивания нуклеотидных последовательностей генов cbbL и поиск в них консервативных участков осуществляли с помощью программы Consens (Марусина, неопубликованные данные).

Выделение ДНК. Для выделения ДНК применяли модифицированную методику щелочной экстракции (Birnboim & Doly, 1979) и Wizard-технологии фирмы Promega (США). ПНР. Разработанные ранее системы праймеров и протоколы проведения реакции были использованы для амплификации фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК (Lane, 1991) и мембранную метанмонооксигеназу (Holmes et al., 1995).

Амплификацию фрагментов генов cbbb «зеленого» типа проводили с использованием сконструированных праймеров: RublgF S'-GAYTTCACCAARGAYGAYGA-3';

RublgR 5 ' -TCRAACTTGATYTCYTTCCА-3 '. Объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав: буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NH.O2SO4, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8,4 мМ MgClj); по 6.25 нмоль каждого из dNTP, 25 нг ДНК-матрицы; по 7.8 пмоль каждого праймера и 1.5 ед. ДНК полимеразы BioTaq (Диалат ЛТД, Россия). Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл - 94°С х 3 мин, 58°С х 1 мин, 72°С х 1 мин; последующие 7 циклов - 94°С х 30 с, 58°С х 20 с, 72°С х 45 с; последние 28 циклов - 94°С х 30 с, 45°С х 30 с, 72°С х 30 с; завершающий цикл - 72°С х 7 мин.

Амплификацию фрагментов генов cbbL «красного» типа проводили с использованием сконструированных праймеров: RublrF 5'-GCVACCTGGACSGTSGTVTGG-3';

RublrR 5'-TCGCCYTCSAGCTTGCCSAC-3'; RubIr892R S -TCTTCTGSCGSGTRTAGGTSSMRTGRCC-3-. Для пары праймеров RublrF-RublrR объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав: буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NH4)2S04, 67 мМ трис-HCI, рН 8.8,

4 мМ MgCb); по 6.25 нмоль каждого из dNTP, 17.5 нг ДНК-матрицы; по 3.9 пмоль каждого праймера и 1.5 ед. ДНК полимеразы BioTaq. Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл - 94°С х 3 мин, 6б°С х 1 мин, 72°С х 1 мин; последующие 7 циклов - 94°С х 30 с, 66°С х 20 с, 72°С х 45 с; последние 28 циклов - 94°С х 30 с, 55"С х 30 с, 72°С х 30 с; завершающий цикл - 72°С х 7 мин. Для пары праймеров RubIrF-RubIr892R объем амплификационной смеси составлял 25 мкл и имел следующий состав: буфер ДНК полимеразы (17 мМ (NH4)2S04, 67 мМ трис-IICl, рН 8.8, 2 мМ MgCl2); по 6.25 нмоль каждого из dNTP, 17.5 нг ДНК-матрицы; по 3.9 пмоль каждого праймера и 1 ед. ДНК полимеразы BioTaq. Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл - 94°С х 3 мин, 60°С х 30 с, 72°С х 30 с; последующие 35 циклов - 94°С х 30 с, 60°С х 30 с, 72°С х 30 с; завершающий цикл - 72°С х 7 мин.

Очистка и клонирование ПЦР-фрагментов. Продукты ПЦР очищали с применением набора реактивов «Wizard PCRPreps» (Promega, США). Клонирование выделенных ПЦР-фрагмснтов проводили с использованием набора реактивов «pGEM-Т Easy Vector System» (Promega, США) в компетентных клетках Escherichia coli DH5a. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили при помощи набора реактивов Wizard MiniPrep (Promega, США).

Секвенирпняниу ДНК. Секвенирование проводили с использованием набора реактивов «Silver Sequence™ DNA Sequencing System» (Promega, США) согласно рекомендациям производителя, с незначительными модификациями. Клонированные фрагменты исследуемых генов секвенировали с универсальных плазмидных праймеров M13F, M13R26, SP6 и Т7 (Sambrook et al., 1989). Секвенирование ПЦР-фрагментов исследуемых генов проводили с использованием соответствующих амплифицирующих и секвенирующих праймеров.

Филогенетический анализ. Первичный сравнительный анализ секвенированных последовательностей проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы CLUSTAL Wv 1.75 (Thompson et al., 1994). Построение филогенетических деревьев проводили с использованием различных алгоритмов, реализованных в пакетах программ TREECON W (Van de Peer & De Wachter, 1994) и PIIYLIP (Felsenstein, 1989). Расчет относительных частот использования кодонов (RSCU) и проведение анализа соответствия осуществляли с помощью пакета программ Codon W (http://www.molbiol.ox.ac.uk/cu). Уронни синонимичных (dS) и несинонимичных (dN) замен рассчитывали при помощи пакета программ PAML (Yang, 2000).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование системы олигонуклеотидиых поаймеоов. Был проведен компьютерный анализ всех имевшихся в электронных базах данных последовательностей генов cbbL. По результатам анализа степени консервативности различных районов консенсусных последовательностей для генов cbbL «зеленого» и «красного» типов были выбраны несколько участков, на основе которых была сконструирована система праймеров для амплификации фрагментов исследуемых генов длиной приблизительно 800 пар нуклеотидов. В процессе работы разрабатываемая праймерная система подвергалась совершенствованию по мере появления новых последовательностей генов cbbL. Последовательности разработанных праймеров указаны в разделе «Объекты и методы исследования».

Проверка разработанной системы праймеров проводилась на препаратах ДНК бактерий Acidithiobacillus ferrooxidans TFY и Rhodobacter sphaeroides 2R. У исследуемых штаммов были выявлены фрагменты ожидаемой длины, последовательности которых были в значительной степени гомологичны (90.1-98.9%) генам cbbL штаммов соответствующих видов, ранее депонированным в базу данных GenBank, что свидетельствовало об эффективности разработанной системы праймеров.

С целью уменьшения количества неспецифических продуктов ПЦР и получения нужного фрагмента в повышенной концентрации были подобраны и оптимизированы условия проведения ПЦР для амплификации участков генов cbbL и «зеленого» и «красного» типов по методу Тагучи (Cobb, 1997). Конечные протоколы проведения реакций приведены в разделе «Объекты и методы исследования».

2. Филогенетический анализ генов cbbL V представителей различных таксонов прокариот. Эффективность разработанной нами системы праймеров была проверена на модельной группе бактерий, способных использовать восстановленные соединения серы в качестве доноров электронов. К ней относятся фото- и хемотрофные, авто- и гетеротрофные микроорганизмы, принадлежащие к различным, не родственным в систематическом отношении, подгруппам. Большинство автотрофных представителей этой группы ассимилируют СОг через цикл Кальвина. Однако, данные о первичных последовательностях генов, кодирующих РБФК этой группы прокариот, ограничены.

2.1. Выявление, секвенирование и Филогенетический анализ генов cbbL, у ФотолитоавтотроФных бактерий семейства Oscillochloridaceae. Бактерии семейства Oscillochloridaceae являются единственными представителями филогенетической линии аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ) (Рис. 1а), для которых ранее было показано наличие активности РБФК (Ivanovsky et at., 1999). У трех представителей рода Oscillochloris нами впервые были выявлены и секвенированы фрагменты генов cbbL «красного» типа. Также был проведен анализ последовательностей генов, кодирующих 16SpPHK.

Несмотря на то, что исследуемые штаммы рода Oscillochloris были выделены из географически отдаленных пресноводных источников, филогенетически они оказались

rCh

"Ü Chic Уем

CUoroflexus auranüaeus J10FL Chhroflexus aurantiacus J-10-fl ш'CUoroflexus aurantiacus DSM 637 Chhroflexus aurantiacus DSM 636 1Ир Chhroflexus sp. 396-1 I Бактерия №E

горячих серных источников

Chhroflexus aggregate DSM 9486 Chhroflexus aggregans MD-66T 'Chhronema gtganleum'

Некультивируемая АНФБ AKYH632 ige] OsciUochloris sp. A19 Oscilbchloris sp. BM 1 OsciUochloris trichoides DG-6T IM| OsciUochloris sp. R ' 'OsciUochloris sp. C6

.............Candidates "Chlorothrix hafophila'

———> Roseißexus castenhokü

" Heliotkrix ortgonenäs

f 7Tnobacilhis denürificasts

* AdJiihü>baciUusJirrooxuiaHecbb'L-2

■ Thiomonas vtterrm&a " Aüochromatxum vptoeum cbbX

* Mslhyiococcus capsv latus

■ Acidükiobacilhisferrooxidwis ebbt-] - Bhodohaclar capsuhtus

■ Hydrogenovibrio marinus ebbt-}

* Aibchromatium удодом cAÄL - /fydrog«nowiruj marvtus cbbL-2

■ Syrtechococcvs sp.WH7803

■ Prochhrococcus marinus Swctococcuff sp. PCC 6301

fl— ЛяоЬв^лл sp. PCC 7120 r- Chlamydomonas шуrwsn j" Chlorella vulgaris |r Ihcobam acuminata

* Or^aasaüva n |— Cfratofttortj trichoides

r Fhodobacter azoloformans ' Fhodobacter sphaeroides

■ Sinorktzebium mehbä

• ¡Canthohacterjlavus • Cupriavidus iwcator

• Bradyrh izobium japomeum

■ Qwadiiu« caldarium m Cyhndrotheca sp.

■ O&siAodrscujr fatatf

• Eclocarpus eiheubsus

• Quillardia theia

• Porpkyrxbum aerugirmim - Anäthammon sp.

• Akttfiitiafasägiaia

i «Зслевьй» тип формы I РБФК

>«KpatH>ii»> тип формы I РБФК

Рис. 1. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее

5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 95%). Подчеркнуты последовательности исследованных бактерий.

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее

10 заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев на основании bootstrap-анализа. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

идентичными, согласно результатам анализа последовательностей генов, кодирующих как 16S рРНК, так и РБФК. Это не противоречит ранее полученным данным фенотипического анализа, включая детальное исследование углеродного метаболизма, которые также не выявили заметных различий между этими штаммами (Керреп et al„ 2000; Берг и др., 2005). Таким образом, на основании всего комплекса данных можно заключить, что все исследованные штаммы являются представителями одного вида Osc. trichoides.

Анализ генов cbbL свидетельствовал об особом положении представителей рода Oscillochloris, которые с высоким уровнем bootstrap-поддержки (97%) образовывали на филогенетическом дереве отдельную ветвь, значительно удаленную от вариантов 1С и ID генов cbbL «красного» типа (уровни гомологии аминокислотных последовательностей 73.185.3% и 74.0-79.5%, соответственно). В то же время, по данным анализа генов cbbL, единственной близкой к исследуемым АНФБ оказалась грамположительная факультативно хемоавтотрофная бактерия Sulfobacillus acidophilus (уровень гомологии аминокислотных последовательностей 89.2%), которая образовывала с исследуемыми штаммами монофилетический кластер с высоким уровнем bootstrap-поддержки (98%) (Рис. 16).

Обособленное положение кластера последовательностей cbbL Osc. trichoides/S. acidophilus, возможно, свидетельствует о существовании нового варианта «красного» типа РБФК формы I. Вопрос о том, является ли обнаруженное сходство последовательностей генов cbbL между видами Osc. trichoides и S. acidophilus результатом вертикальной эволюции или же результатом латерального переноса генов, пока остается открытым.

2.2. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL. у жемолитоавтотрофных бактерий.

2.2.1. p. ThiobaciUus. Недавно из низкотемпературных сероводородных источников Хойто-Гол (Восточные Саяны) были выделены штаммы алкалитолерантных облигатно автотрофных серуокисляющих бактерий (СОБ). Согласно результатам анализа генов, кодирующих 16S рРНК, эти изоляты были отнесены к p-протеобактериям рода Thiobacilius, в монофилетическом кластере которого они составляли отдельную ветвь (Рис. 2а).

На основании фенотипичсских и генотипических различий было предложено выделить изолированные штаммы в новый вид ThiobaciUus sajartensis (Дульцева и др., 2006). К этому моменту к роду ThiobaciUus относили только три вида: Т. thioparus, Т. aquaesuiis и Т. denitrificans.

Все исследованные представители рода ThiobaciUus ассимилируют СОг через цикл Кальвина. Была известна первичная структура генов, кодирующих РБФК, только для одного представителя рода ThiobaciUus - Т. denitrificans. С помощью разработанной системы праймеров нами были выявлены гены ebbL «зеленого» типа у Т. thioparus DSM 505т, а также у штаммов 4HGT и 1HG 'Т. sajartensis', при этом оказалось, что последовательности генов cbbL исследованных штаммов 'Г. sajanensis' были идентичными.

В отличие от дерева, основанного на анализе генов, кодирующих 16S рРНК, последовательности РБФК близкородственных представителей рода ThiobaciUus не образуют

m.Tkmbacitius saianensts'АШ^ ^ TkobaciUus saianensis' 1EG Thiahaalhis tteopams LV43 Thiobaattvs demtrtficarG ThiobaciUus Onoparus ATCC 81581 Tkwbadttus aquaesuhs Neisseria demtrificans Spirillum vohktns I 'Tkiobxilkisplumbopkibs' " 1ЮС Nitroso-ptra multiformis l-ffitrososptro sp. 40KI Fhotbcycbs tamls Azoarais demtnficlans

Tfaomonas cuprtoa Thtomonas arsenwarcms'

TMomonas perometabobs Thlomonas intermedia Acublhiobacuhis tkiooxkhns AcidifaobaciUus ferrootidans Habthtobacillus neapoittams —' ThiobaciUus toregentfs'

(ШТротеобахтерни

IMiAcidnhiobaciUus/emoxidane ATCC 23270 cbbh-2 nt^AtidiOaobacillusftrrooxidaHS ATCC 19859 1Taobacillus ¿¡епИгфсаяе

ThiobaciUus thioparus J

AHochromatium vmosum cbbA Eciolhiorkodospira shaposhmkovn

нThiobacilhis sa ianensis' ~L _ ,

r —-:-:--¡р-Нротеооактерии

Tmomonas intermedia J

Halothiobacilhs neapolitanus

1W r-AadUhiobacittusjerrooudane ATCC 23270 cbbL-1

l—AcidtikiohaciHusferrooxidaxs Fel

Hydrogenovibrio marvms cbbL-2

Alhchromatium vinosum cbbL

1ИI Prochkrococcus marvms

Synechococcus sp WH7803

Hydrogenovibrio marinus cbbL-1

¡iydrogenophilus thermohiteolus

Fhodobacier blasticus

Skodobacter veldkampn

Skodobacter azotoformans

Skodobacter capsulalus

Anabaena sp. PCC 7120

Synechococcus sp. PCC 6301

Synechococcus sp. PCC 7002

Prochhron sp.

Prochbrolhnx hollandica

Рис. 2. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеогидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты;

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 аминокислот. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 90%).

монофилетического кластера. Более того, их ближайшими соседями на филогенетическом дереве, основанном на анализе транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL, оказались различные представители ß- и у-протеобактерий: Т. denitrißcans образует единый кластер с видом 7-протсобактерий Acidithiobacillus ferrooxidans с высоким уровнем сходства последовательностей (95.5-95.9% гомологии) и bootstrap-поддержки (92%), Т. thioparus составляет отдельную ветвь с неустойчивым положением на дереве (уровень bootstrap-поддержки 31%), а 'Т. sajanensis' образует монофилетический кластер с представителем другого рода ß-протеобактерий — Thiomonas intermedia - также с высоким уровнем сходства последовательностей (96.2% гомологии) и bootstrap-поддержки (98%) (Рис. 26).

Таким образом, проведенный нами филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов cbbL, в таксономическом плане подтверждал необходимость выделения новых изолятов в отдельный вид 'Т. sajanensis', а в эволюционном плане свидетельствовал о возможном участии в эволюции генов, кодирующих РБФК у тиобацилл, процессов латерального переноса.

2.2.2. рр. Thioalkativibrio и Thioalkalispira. В результате интенсивных микробиологических исследований содовых озер была обнаружена и охарактеризована новая группа галоалкалифильных облигатно автотрофных СОБ, основным отличием которых является способность к оптимальному росту в соленых щелочных растворах с pH 9-10.6. Эта группа к настоящему времени включает три рода, относящиеся к у-протсобактериям: Thioalkalimicrobium, Thioalkalivibrio и Thioalkalispira.

Согласно результатам анализа последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК, род Thioalkalivibrio составляет единый филогенетический кластер, разделенный на 3 подгруппы (Sorokin et al., 2001; 2002; 2003; 2004; Banciu et al., 2004); Thioalkalispira microaerophila ALEN 1т не является близким ни к одному из известных таксонов 7-протсобактерий и образует в этом подклассе новую глубокую ветвь (Sorokin et al., 2002) (Рис. За).

Хотя для представителей родов Thioalkalivibrio и Thioalkalispira было показано наличие активности РБФК (Sorokin et al., 2000; 2002), до сих пор оставались неизвестными как форма и структура фермента, так и последовательности детерминирующих его генов.

С использованием разработанной нами системы праймеров у типовых штаммов видов родов Thioalkalivibrio и Thioalkalispira были выявлены гены cbbL «зеленого» типа.

В результате анализа генов cbbL не было обнаружено близкого филогенетического родства между единственным видом рода Thioalkalispira и каким-либо видом, принадлежащим к роду Thioalkalivibrio, что подтверждает разделение этих двух типов галоалкалифильных СОБ на два различных рода, проведенное ранее на основании комплекса фенотипических и генотипических данных.

На деревьях, построенных по результатам анализа последовательностей генов cbbL, род Thioalkalivibrio не является монофилетичным, хотя его разделение на независимые

кластеры отчасти коррелирует с внутренней филогенетической дивергенцией, выявляемой по результатам анализа генов, кодирующих 16S рРНК (Рис. 36,в)

Из сравнения результатов анализа генов, кодирующих 16S рРНК и РБФК формы I, следует, что наиболее обширная группа видов Tv. versutus, Tv. jannaschii, Tv. nitratis и Tv. thiocyanoxidans (кластер 1) объединяет безусловно родственные организмы, имеющие единое происхождение. Представители этой группы, несмотря на физиолого-биохимические различия, позволяющие разделить их на самостоятельные виды, имеют типичную для данного рода вибрионоподобную форму клеток с полярным жгутиком; большинство из них способны к росту в гиперсоленых условиях. Слабогалофильные виды Tv. denitrificans и Tv. thiocyanodenitrijicans (кластер 3) с палочковидной формой клеток и способностью к денитрификации, относятся к отдельной филогенетической подгруппе, которая согласно результатам анализа последовательностей 16S рРНК, расположена на дереве ближе всего к точке ответвления всего кластера рода Thioalkalivibrio (Рис. За). Наибольшая степень генетической дивергенции этих видов относительно других представителей исследуемого рода также подтверждается и низким уровнем ДНК-ДНК гибридизации, не превышающей 20% (Sorokin et al., 2001; 2004). Согласно филогенетическому анализу генов cbbh, эта группа видов также значительно дивергировала от основной группы облигатно аэробных видов, причем межвидовое родство внутри кластера 3 прослеживается только при сравнении на уровне нуклеотидных последовательностей, а на дереве, основанном на анализе аминокислотных последовательностей, этот кластер распался на две независимые ветви.

Филогенетические взаимоотношения видов, входящих в кластер 2 (Tv. nitratireducens и Tv. paradoxus), особенно интересны. Согласно результатам анализа генов, кодирующих 16SpPIIK, они составляют единую филогенетическую группу внутри исследуемого рода. Общность происхождения и филогенетическая обособленность этой группы видов подтверждаются также их высоким уровнем ДНК-ДНК гибридизации в сравнении с очень низким уровнем гибридизации с ДНК бактерий двух других групп, а также весьма необычной для рода Thioalkalivibrio морфологией клеток (оба вида имеют крупные, неподвижные, кокковвдные клетки с крупными включениями серы) (Sorokin et al., 2002). Согласно результатам проведенного нами анализа как нуклеотидных, так и аминокислотных последовательностей, гены cbbh этой группы видов также имеют общее происхождение и значительно дивергировали по сравнению с остальными видами исследуемого рода и, кроме того, эти два вида достоверно кластеризуются с пурпурной серной бактерией Allochromalium vinosum, являющейся представителем другого семейства у-подкласса протеобактерий - Chromatiaceae. С высокой вероятностью, это свидетельствует об общности происхождения генов cbbh у этих различающихся по филогенетическому положению и физиолого-биохимическим особенностям микроорганизмов. Одним из возможных эволюционных механизмов в данном случае мог быть горизонтальный перенос генов, вклад которого в эволюцию семейства генов, кодирующих РБФК, предполагается весьма значительным (Delwiche & Palmer, 1996). Этот процесс, возможно, осуществлялся на уровне общего предка обоих видов Thioalkalivibrio и предшественника семейства Chromatiaceae, как

Paoalka^vibrio jamaschi i Thmalka&vibrio versulus Jhioaikab^xbrio niiraiis Thbalkaiivibna tMocvanoxidane TJiioalkakvibrio paradoxus TJnoalkaHvibno niiratireducetts f-Tkioalkaftvibrio tMocvan&dertilnficans] left Thioalkabnbrio denitrifieans j 5

——■ Ectothorh odospira shaposhnikovn Alkahiimracola ehrlkhei Thioalkalispira mcroaerovkila AUochrotnaimtn vinosum Methylococcus capsulatus

Acuhthiohacillusferrocxidans Hydrogenopkihs tkermoiuteohts

Tkiobacilhts denitrtficans Thiomonas intermedia Cuprtavk&is melaJhdurans Hydrogenophaga psaudojlava Halotkiabaci Hue neapohtanus Hydrogenovibrio marinue Bhodobacter capsulatus ШгоЬасШ wixogradstyi Synechococcus jp. PCC 7002 Axebaew sp. PCC 7120 Prochlorococcus maruius Prockbrotkrix hoUandica Synechococcus sp. PCC 6301

mCupriavidus metalUdurats » ifydrogtnophaffi psaidoflara

cidi thofatilliisJerrooxidaK cbbV2 m1biobadUu5 demtrtyccra m AHochromatium vinomm cbbA -Thiomonaj intermedia | m' fmNitrobaeter-Htnogradskyi mifitrobacter vulgaris

Tthbrhodozpira shaposhtik&rii *Methplococcus cap&Iatus

О JM

•А1ШШтШсокз thriicha

■ Hydrogenopfaiis thcrmoiutecius Rnodaoacter capsAetui ioalkativibriojattnaschii TbioajkaHvibrio nitratis TkioalkaUvibho versuEIs •Thioalkaiivibrio thiocyanoxidans

'Jfynectvcoccus «p. WH7803 ■ Ai lochromatiuTn rinosum cbbL 7hioa!kaiivibria paradoxus tj ^bwcdkaiivzhrio nitratireducens J 'AcidStteobQciBiufmooxidtFis cbbLr 1

"Nzz:

mlhiobacilius (krntr$ccns »AciditkobaciBusftrreoxiikns cbbL-2 »Hydrogencphag* puutbfiava a Cupriavichts trxtaltidurera »TMoalkahvibrio tfaocvcuiodenitrificans

mHydrogenovjbrio marinus cbbL-l fydrogenopkilus thermoluteolus Fhodobacter capsActus <Xtetkylococcus capsulatus

Alkahlimnicola ehrHchei

Acidittiobacittusfcrrooxidau cbbL 1

—HalothiobacHkis neapolitanus mThioalkahstnra microaerovhila

-Hftbcgenovibric marinas cbbH

■ ' i ProchlorococcitS sp. GP2

m fydrogenovibrio maritms cbbL-2 -Prochlorethrix holloidica mSynechococcus sp. PCC 6301 mSrnechxoccus sp. PCC 7002

mAnabaena sp. PCC 7120

ihI —'

Lin, in »SynecV Чршвшйад!

¿"^Дяк,

^'1HoaVcaimbrio versutus Thioalkahyihrio niiraiis I , 'lioalkahvtbrlo tmocyanoxkbns [ 1

noaikativibrio юппазсШ J

Hdlothiobacilhs ntapditaws

T^oalkahvibrio denitrificans

BctcthiOThadc spira shaposfrdkarii •Alhchromatium rinosum cbbA Thiomonas intermedia Nitrobarter yiino&adskyi wNitrobarter vulgaris Thioalkaiispira microaerovhila •Prochlorococcus ep. G?2 Synectecoccus sp. WH7803 AHochromatium vinosum cbbL

TbioalkaHvibrio nitratireducens \ * 'Ibioalkahvibrio varadoms / vgenov&rio mannus cbbL-2 /faabaena sp.PCC 7120 fyntchxocciusp. PCC 6301 •klorofhrix hdtendica Synecfococcus ep. PCC 7002

в)

Рис. 3. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов. Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты;

б) нуклеотидных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов;

в) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 аминокислот. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты. Цифрами показана достоверность ветвления 100 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 70%).

это следует из относительно невысокого сходства последовательностей генов сЬЬЬ у этих организмов и А1с. хчпохит.

Следует отметить, что оба данных вида ТЫоа1ка1ШЬНо морфологически очень напоминают АПосИготаНит и настолько сильно отличаются от других представителей рода ТМоа1ка!тЬПо, что один из них был назван «рагас!охи.1». Данный случай - яркий пример из многих, накопившихся к настоящему времени, когда таксономическое положение бактерии, определяемое только на основе последовательностей 16Э рРНК, не совпадает с комплексом других признаков. И хотя обычно преимущество отдается результатам анализа рибосомных генов, такой подход, по всей видимости, не совсем оправдан. В случае с парой 7\>. рагайохж!Т\. пигаигесклсепй наиболее естественным решением стало бы их выделение за пределы рода ТЫоЫШтЬгю в самостоятельный род. В то же время, учитывая удивительное морфологическое сходство двух таких различных типов серозависимых автотрофов, как фототрофные АИосИгота/шт и хемотрофные ТЫоЫШтЬгю, можно предположить, что в процесс переноса генов между этими филогенетически отдаленными бактериями могли вовлекаться не только отдельные гены, такие как кодирующие РБФК, но и целые генетические блоки.

Признание возможности горизонтального переноса в процессе эволюции обширных блоков генетической информации может сильно осложнить создание естественной системы бактерий, из чего вытекает необходимость выработки новых подходов в таксономии. Использование дополнительных филогенетических данных, особенно касающихся генов, имеющих первостепенное значение для изучаемой группы, может в какой-то мерс помочь прояснить сомнительные в эволюционном и таксономическом аспекте случаи. 2.2.3. рр. ТМоаЬкаЧписгоЫит и ГЛго/юспшм'гд. Род ТИют^сгохр^га включает облигатно хемолитоавтотрофных СОБ, выделенных из соленых, преимущественно морских, мест обитания и принадлежащих к у-протеобактериям. Основными особенностями, отличающими род ТЫоткгоир1га от остальных СОБ, являются толерантность к соли и высокие скорости роста (ВппкЬойе! а1., 2005).

Согласно результатам анализа генов, кодирующих 168рРНК, род ТЫоткго5р1га является гетерогенным и включает в свой состав по крайней мере две различные группы, кластеризующиеся либо с Ттз. ре!орЫ1а, либо с Тт.ч. сгипоцепа (ВппкЪоГГ « а1., 1999; Така! е1 а1., 2004). Кроме того, род ТМоткголрЬа является частью более крупной группы близкородственных бактерий, названной нами группа «ТИштгсгояргга». Эта группа включает в себя галоалкалифильных СОБ рода ТЫоЫкаИткгоЫит (Богокт й а1., 2001; 2002) и водородокисляющую бактерию рода ! 1ус1го%епо\чЬгю (МзЫЬага сЧ а1., 1991), являющихся членами кластеров «7т.?. ре1орЫ1аъ и «Ттз. crunogena», соответственно (Рис. 4а).

Недавно было показано, что HydrogenoviЬrio таппиз обладает тремя наборами генов, кодирующих РБФК (два гена сЬЬЪ «зеленого» типа и один ген с££>М) (УовЫгаууа е1 а!., 2004). Проведенные нами исследования показали, что Тт$. киепепИ и Тт$. сгипоцепа также имеют по три набора генов, кодирующих РБФК, тогда как Ттв. ре1орЫ1а, филогенетически обособленная от этой группы видов, имеет два набора генов, соответствующих генам сЬЬЬ-2

ТЪкхг&оЬлЬгюjamoKktx Dooalkakvibno vradu Thioaihiiivibno Oaocyanoxidaju 7*воа1ЫгпЬпо nilra&t TfaxUkaJtribna paradoxus 1 Tfooalkahvibrio nUraitmiuc4ftt Tkoaitairnb no Ойосуажхкя itrtficMt Deocdkahvibno dentirtfuzans • Eclolteorhodcspira sfwpnshmkovi Unoaikahspira imcroaerophila Attochromatmm yinosum

AddUkobaci liusferrooxidane НуйгофпарЫЬи Atrmobueolue Thobacilbs denitrifiavu Ttaymonas intermedia — Jfydrogi/uphagfl paeudojlava HabtkobacOhif ntapohlanus •Thoaikabmcrobrnm abiriaim Ивоа&аЬмвсгрЫит акЬтм

Ttoomacrospiratftyaarot '.ТЬюшкгоетга naiookHa Thomkrotpira p^cknspkila Tfaomxrospvb arcttca Thiomkrospira сЫклае Tfoomxrospira fnsta Thomicrospira thtmctpkHa Tbumacroeoira eruttoema НнЬовшжппЬпо мапшя

■Тйюткпиига fafmm ,

E- BMadobaetsr tpkatrouist Bhodobaclar capeulatui —Tkoclava pacifica Symchococcbs tp. 4VH 7803 Prochlo rococcut marimit Anabeuna tp PCC7120 Syntchococcus tp. PCC 7002 Synectococcus fp FCC (301 bvchloroihnj коИалсЬса

Кластер € Tna. pelophtla*

^Кластер йТаа. oiMfow

»-«Красными тип формы I

Лет сараЛЛил • ffydrcgcnophtius thrrmoluteolui m Thoelarapaqfiea

- AcidifHobociUm Jerrooxidau cbbL-1

* Halottoobacdba жарсШоши

—TfaoaSkalispiTa nOcrooercphla

fMMMm rrochlorococcuz marima

. TnipMcmmm pebtmb •ptioaltehmteroblwn cvcbcum \ШоаШ\яйсп^щт а*к>вШт ТШоаШШсгоЬШт ПЫПсия

^fydroiftHOfilrnQ tnartms

"^amtcrvsm юспжфпа _ ...JMC/уяпю кшшпи I Thtamtcmspih сгигюагпа 1 '""■j—T" Tfaomicrcspira пттпй" IcAiL-l 1 1 fydrcgtrKribrio таптгиз J

~Pr ochlorolhr) к hdlendica mfyntckxoccui »p. FCC 630 ] ——«АиЬаета «р. PCC 7120 - Sjmtchoccvcus fp. PCC 7002 "—-"Sjmtchococcus tp. WH7B03

"Ailochrometim Tincnm cbbL j*~T)aoalkaliiitbrto paradon* ^^Thoalkailwibrio ritrafireAjcva 77я' oelkalivibrio ¡amuchii Th oalkoiMbrio ttiocjmotid&a Tbioalhaliribno rtfratfs 7Ыоа!каЗШЬпо nrMtf Thicmontu inttmedto llioehro аихЬия rtnanao cbbA 7я obodHui demtr^fieaet • AiidHHobaciQuiftrrootiditii ebbL-2 Hydrogtnophagi pteueb/lara ThioaDuili vibrio faocjanoticnttrificttna — ThoaMlyfbrlo ¿VBtnJSctns -HctvthiorhodoipiTa ihapoibvk&rii

ciiL-2«—

«Красшй» inn

•АпаЬежа ер. PCC 7120 фОртВД I

tymchococcui >p. PCC £301 Prochlordhnx hcUcndiea

Sjmechococcus «p. PCC 7002

7faoc!a*o pacifica 111 J?hodo6«art£r саряйЫиз

Ifydrogt noptu ¡us rhermofuteoluj Tmcmicrospi/u сгипояяпа

}fydrogenovib)io martini* I

Thiomtcnsi/tra kuemntt J

•HalottoobtkaSia neepoMamis ThfMlkoHiibrloJamaschii ThoatkalMbrlo thocjvmoxida7s TJa'AsAafmbn'o vtrsutu» JhioaDtalmbrio ritratis

TteoafltaHabrio fhioejarxxitrutriji cans ifycbogenspttagapteucbflata •AXdiikobcifiUmJitneoxiiiau cbbL- 2 Thiohxiihu dentblficaB Thiomonas Intermedia Ailocfoonatium rinostm ebb A Thialkdinbrio dtnifnjicans

ictothxrr hodo spira shapoihvkarii

•Aadithobac№u5j&K>oxidau cbbL-I ТЪоаНцзИфго mic?oatropH)a

Frochlcrococcus marina SprHchococcus *p. WH7S03 'AHockromaHim Wwosum cbbL ТЫоеЛеШЫо paradoaa ThioaSkaliiabrio rifratire&ctns •ifydrognvrtorio marina

'hpmicrvsptra crunpi — Tkiomcrospini pebpktla | ТЫоакакяй crobiim sibtricum Thica&ahJBJcrobiwn аеюрШшп pTtcaSiahmic robem cvchcum.

Рис. 4. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

б) нуклеотидных последовательностей генов cbbL;

в) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов/аминокислот. Последовательности генов cbbL, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (в скобках указаны значения для алгоритма maximum-parsimony).

и сЪЪЫ Н. таппиз. Представители рода 1Ыоа1каИт1СгоЫит обладают только одним геном сЬЬЬ, соответствующим гену сЪЪ\.-1 Н. таппю (Рис. 46,в; 5).

Как на нуклеотидном, так и на аминокислотном деревьях, последовательности сЬЬЬ-2 Тшб. crunogena и Тт$. киепепп, а также последовательности сЬЬЬ Ттз. ре!орЫ1а и трех видов рода Ткюа1каИт1СгоЫит формировали единый кластер с высоким уровнем ЬооМтар-подцержки (100% и 97% для нуклеотидов и аминокислот, соответственно) с последовательностью сЬЬЪ-2 II. тагтих. Последовательности сЬЬЪ-1 Ттз. crunogena и 7»м. киепепп также формировали единый кластер с высоким уровнем Ымзи-ар-поддержки (100% и для нуклеотидов, и для аминокислот) с последовательностью сЬЬЬ-1 Н. таппиз.

Однако для группы «ТЫот1сго5р1га» в целом видно, что филогенетические деревья, построенные на основании сравнения нукпеотидных и аминокислотных последовательностей РБФК, отличаются по топологии и длине ветвей (Рис. 46,в). На нуклеотидном дереве последовательности сЬЬЬ-1 и сЬЬЬ-2 группы «ТЫотктргга» формировали единую группу (с уровнем ЫкЛяй-ар-подцержки 87%), кластеризуясь с геном гЬсЪ цианобактерии РгосЫогососсиз тагтш (с уровнем Ьоо^ггар-поддержки 84%), с большой длиной ветви. Ближайшим соседом этого кластера является основной кластер генов гЬсЪ цианобактерии РгосЫоШкгЫ ЬоНапсИса, Зупескососсю ер. РСС 6301, ЗупесИососсиа ер. РСС 7002 и АпаЬаепа эр. РСС 7120 (уровень Ьо^вйар-поддержки 92%). На аминокислотном дереве последовательности сЬЬЬ-1 и сЬЬЬ-2 группы «ТЫотгсго5р1га» формировали два отдельных кластера с неопределенным положением точек ответвления, в то время как Р. тагтиз кластеризовался с Пупескососсш ер. '^Н7803 (с высоким уровнем ЬооМгар-поддержки 99%) с почти равными длинами ветвей. Сходства группы «ТМоткгозргга» и основного кластера цианобактерий на аминокислотном дереве не наблюдалось.

Результаты филогенетического анализа последовательностей генов сЬЬЬ для группы «ТЫот1сгозргга» коррелируют с кластеризацией группы, получаемой в результате проведения анализа последовательностей генов, кодирующих 16в рРНК (Рис. 4а-в). На дереве генов 168 рРНК Ттз. ре1орЫ1а образует кластер с видами рода ТЫосАкаИттсгоЫит (кластер «Тти. ре1орЫ1ая), в то время как Ттх. сгипоцепа и Тт$\ киепепи образуют другой кластер с Н. таппия (кластер «Ттх. сгипс^епал). Однако, близкое родство генов сЬЬЬ этой группы генам гЬсЪ цианобактерий противоречит филогенетическим взаимоотношениям, вытекающим из анализа генов, кодирующих 165 рРНК, согласно которому группа «'1Ыот!сго5р1га» относится к у-протеобактериям.

На нуклеотидном дереве гены сЬЬМ видов рода ТЫотгсгоархга и Н. тагтш образуют единый кластер (уровень ЫкЛэ^ар-поддержки 100%). Этот кластер попадает в точку ветвления, разделяющую тиоавтотрофных р- и у-протеобактерий, принадлежащих к родам ТкюЬасШт, АЫеШЫоЬасИЬи, НаШЫоЬасШш и ТЪютопаа. На аминокислотном дереве только Ттл\ ре1орЫ1а и Тт^. crunogena остаются в тиоавтотрофном сЪЪЫ кластере, в то время как Ття. киепепп и II тагтиз с практически идентичными (98.1%) аминокислотными последовательностями формируют отдельную ветвь с неопределенной позицией точки ветвления (Рис. 5а,б) (Тоигоуа е1 а1., 2006).

Symbiodiniи m sp. «»и — GoYfyaulax polytdra —-—.I.., RhodospTiUum rubrum —- i ■ i и- « MagMebspi>jliu»i wtdg^Jfotocft'ci^m —Fhodobac ter capaulatus i I"- Rhodobacter sphzeroidts j-SthodcpsewiomQnM palustris DH1 *~Rhodcpseiido7nonas palusMS DCP3 ■»Симбионт Hiftia pochjrptiSa

•fymbiodinium sp. - Gotyraulax polyedra

Tfoomicrospira kutmnii

Г1 momicrosoira килгкпи 1 Hndro*e>x>vibrio marinus

»AciditHobaciUusforrooxidcMS

0.1

■ м «петит- с о держвщий г ибрион М V-1

HalothiobaaHus neapatitanus -ТУаоЬааНш dtm'trificcms

• Tteomonas intermedia •AridjthobaciUusJirrooxid&is

Рис. 5. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

а) нуклеотидных последовательностей генов сМ>М;

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbM.

Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 10 заменам на каждые 100 нуклеотидов/аминокислот. Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (в скобках указаны значения для алгоритма maximum-parsimony). Последовательности исследованных бактерий подчеркнуты.

По результатам проведенного нами анализа частот использования кодонов генов cbbL, наиболее близким к группе «Thiomicrospira» оказался штамм Anabaena sp. РСС 7120.

Филогенетический анализ группы «Thiomicrospira» выявил неплохую корреляцию между данными, полученными на основании анализа последовательностей генов, кодирующих как 16SpPHK, так и РБФК. Прежде всего, анализ генов, кодирующих РБФК, свидетельствует о монофилетичности группы (включая ранее исследованный род Hydrogenovibrio), что следует из высокого уровня кластеризации этих генов на нуклеотидном дереве. Выделение в отдельную ветвь генов cbbb-X кластера «Tms. crunogena» и генов cbbM пары Tms. kuenenii-H. marinus на аминокислотном дереве может быть объяснено повышенной частотой несинонимичных замен в генах, кодирующих РБФК этих организмов.

Разделение группы «Thiomicrospira» на два кластера, основанное на результатах анализа генов, кодирующих 16S рРНК, коррелирует с результатами анализа генов cbbL. В частности, гены cbbL-1 были обнаружены только в кластере «.Tms. crunogena», а топологии деревьев, построенных на основании сравнения последовательностей cbbL-2 и 16S рРНК, весьма сходны между собой.

Но, r то же время, внутреннее разделение группы на основании анализа генов cbbM недостаточно ясно, что может являться результатом специфичного пути эволюции этой формы РБФК и иного давления естественного отбора на форму II фермента для различных видов группы, в зависимости от занимаемых ими экологических ниш. Можно предположить, что сравнение последовательностей генов cbbM позволяет проследить только отдаленно родственные связи внутри всей группы «Thiomicrospira», но не более современную дивергенцию группы на два филогенетических кластера.

На основании ранее проведенного исследования трех оперонов генов, кодирующих две формы РБФК у Я. таггпи.ч, его авторами (Уо5Ы2а\та е1 а1., 2004) был предложен следующий сценарий их возникновения: предковая форма Н. тагтш, обладающая кластером генов сЬЬЪЛ, получила гены сЬЬЬ-2 путем латерального переноса. Затем произошла дупликация генов сЬЬЪ-2. Последующая реорганизация их с генами кластера сЬЬМ привела к образованию кластера генов сЬЬЪ-1.

Результаты проведенного нами исследования позволяют расширить эту гипотезу, предложив схему эволюции генов, кодирующих РБФК, для группы «ТЪют¡сго.чр1га» в целом. Сходство последовательностей генов сЬЬЬ-2 и сЬЬЪ-1 и их практически идентичные ГЦ-состав и частоты использования кодонов у всех исследованных представителей группы «ТЫотктргга» подтверждают предположение о дупликации, произошедшей в геноме предковой формы кластера «Ттз. crunogena», от которой и произошли Ттз. crunogena, Ття. киепепи и Я. таппиз. Кроме того, принимая во внимание эволюционные расстояния и частоты использования кодонов, можно предположить, что наиболее вероятными донорами набора генов сЬЬЪ-2 для предковой формы группы «ТИют1сгозр1га» являлись цианобактерии (Рис.6).

? Цмонобоктерия ?

Латерогъньхй перенос """-ч сЬЫ. $-2

произошла дупликация"""'"»,, гено! сЬЫ.5-2

яввсрохрио сгипоз*

.'Потери сЬЫ$-1 еперона>

от«ря сЬЬМ опережав

тЪпо таппых.

(ТЫояи,

.Кластер *7Ы&гшен>ф1Кюмпбз«1и№

Кнастер «ТЫАтсюяр&я

Рис. 6. Гипотетическая схема эволюции группы «ТЫоткгозррал.

Также, на основании полученных данных можно предположить два пути дальнейшей эволюции кластера «Ттз. ре!орИИа». Либо в геноме предковой формы этого кластера не произошла дупликация гена сЬЬЬ-2, либо дупликация все же произошла, но ген сЬЬЪЛ был утерян в процессе последующей эволюции группы. У представителей рода 1Ыоа1каИт1сгоЬшт также произошла потеря генов сЬЬМ (Рис. 6).

Полученные в нашей работе результаты расширяют круг микроорганизмов, обладающих множественным набором генов cbbL. Причинами возникновения мультикопийности считаются латеральный перенос генов или дупликация генов (с возможной избирательной потерей одной из копий в процессе эволюции). Такого рода потеря могла быть результатом эволюционного отбора оптимальной формы РБФК. Поскольку РБФК формы I может избирательно ассимилировать СОг, несмотря на присутствие кислорода, и является, таким образом, наиболее приспособленной к современным атмосферным условиям, присутствие дополнительных генов сЬЬЫ или cbbL не является обязательным. Поэтому вполне вероятна их инактивация и последующая потеря в зависимости от условий существования организмов.

Возможно, что потеря генов сЪЬЬЛ и cbbM у представителей рода Thioalkalimicrobium (облигатных алкалифилов, выделенных из содовых озер) и сЬЬЬЛ Tms. pelophila (алкалитолерантной бактерии) произошла как раз в связи с адаптацией к занимаемой экологической нише, а именно к низкой концентрации СОг при рН выше 8.

Однако, в некоторых эконишах наличие нескольких форм фермента с отличающимися каталитическими свойствами обеспечивает бактериям определенные экологические преимущества и гибкость. Подтверждением этому может служить тот факт, что Tms. crunogena, которая обладает тремя наборами генов, кодирующими РБФК, является наиболее быстрорастущим мезофильным хемолитоавтотрофом (Jannasch et al., 1985).

Результаты как анализа генов, кодирующих 16SpPHK, так и проведенного нами анализа генов, кодирующих РБФК, свидетельствуют в пользу необходимости таксономической ревизии этой группы; более конкретно - разделения ее на четыре рода внутри нового монофилетического семейства «Thiomicrospiraceae». Роды Thioalkalimicrobium и Hydrogenovibrio достаточно отделены от рода Thiomicrospira физиологически и генетически, чтобы сохранить за ними исходный родовой статус. Род Thiomicrospira предлагается разделить на два рода, основанных на кластерах «Tms. crunogena» и «Tms. pelophila».

2.2.4. и. Thioclava. Облигатно аэробная факультативно автотрофная СОБ Thioclava pacifica TL2T была выделена из прибрежных морских гидротерм. Согласно результатам анализа генов, кодирующих 16SpPHK, Тс. pacifica формирует на филогенетическом дереве отдельную ветвь, расположенную между пурпурными несерными бактериями родов Rhodobacter и Rhodovulum (Рис. 7а) с неустойчивым положением точки ответвления (уровень bootstrap-поддержки менее 24%). Уровни сходства гена, кодирующего 16S рРНК у Тс. pacifica, с аналогичными генами различных видов родов Rhodobacter и Rhodovulum были почти одинаковыми (92.4 — 95% гомологии) (Sorokin et al., 2005).

Поскольку для Тс. pacifica было показано наличие активности РБФК (Sorokin et al., 2005), для уточнения филогенетического положения нового организма в кластере Rhodobacter- Rhodovulum нами был проведен дополнительный филогенетический анализ генов, кодирующих РБФК. Ввиду отсутствия в базе данных GenBank последовательностей

0.05

щ ^'Rhodobacter apigmentum' si I ^—Pseudarhodabacler Jerrugineus I Rhodobacter sphaeroides

Rhodobacter azotoformans ¡-""'Rhodobacter gfacorúcum' Я 1 Rhodobacter blasücus L ii "'Rhodobacter massiüensis' У Rhodobacter capsulatus — Rhodobacter veldkampii Thioclava pacifica

111 Albidovulum inexpectaium

_i Rhodovulum stríctum

■* Rhodovulum ewyhahmm Rhodovulum sulfidophHum Rhodovulum iodosum

Rhodovulum robiginosum Rhodovulum adriaücum Paracoccus derátnficans

Suljitobacter ponüacus

Roseobacter denitrtficans ■ Rhodothahssium salexigens

sHj-^

1-RU,

l_j-i

Thiobacillus denitrtfcans AciditkiobaciHus ferrooxidans cbbt-2 Hydrogenophaga pseudojlava ThiobaciHus tíáoparus Albchromaüum vinosum cbbA Ectothiorhodospira shaposhmkovii Ihiobacilhis sqjanensis' Vúomonas intermedia Halotitiobacillus neapoliíanus

Acid¡th¡cbaá!lusjerrooxidans cbbL-1 ASochromatium vinosum cbbL Hydrogenovibrio marinus cbbL-2 ffydrogenovibrio marinus cbbL-1

Thioclava pacifica

Rhodobacter azotojormans cbbL-2 Rhodobacter capsulatus Rhodobacter veldkampii Hydrogenopkibs thermohiteolus

Rhodovulum ewyhalimim Rhodovulum adriaticum Rhodovulum sulüdophikm

Rhodobacter blasücus 1ИГ* Rhodobacter azotoformans cbbL-\ ' Rhodobacter sphaeroides

Рис. 7. Филогенетические деревья, построенные с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения:

крупным шрифтом и подчеркнуты.

Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 80%).

РБФК каких-либо видов рода Rhodovulum, необходимых для проведения корректного сравнения, объектами исследования также стали типовые ¡ штаммы видов Rdv. adriaticum, Rdv. euryhalinum и Rdv. suljidophilum. У всех исследованных штаммов были выявлены гены сЬЬL «зеленого» типа :

Из результатов филогенетического анализа транслированных аминокислотных последовательностей генов cbbL следует, что Тс. pacifica входит в кластер, также включающий а-протеобактерии родов Rhodobacter и Rhodovulum и (í-протеобактерию Hydrogenophilus thermoluteolus (уровень bootstrap-поддержки 100%), но, тем не менее, образует на филогенетическом дереве обособленную ветвь (уровень bootstrap-поддержки 98%), только отдаленно родственную подкластеру Rhodobacter-Rhodovulum-Hydrogenophilus (Рис. 76).

Таким образом, проведенный нами дополнительный филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов cbbL, подтвердил обособленное положение Тс. pacifica среди фототрофных бактерий кластера Rhodobacter-Rhodovulum и правомочность выделения исследуемого организма в новый род.

3. Исследование разнообразия эндосимбиотичсского сообщества моллюска Bathymodiolus azoricus. Для проверки эффективности разработанной нами системы праймеров при выявлении генов cbbL в молекулярно-экологических исследованиях, в качестве модельной экосистемы было выбрано симбиотическое бактериальное сообщество, обитающее в жабрах глубоководных двустворчатых моллюсков Bathymodiolus azoricus. Это сообщество было ранее исследовано цитологическими и физиолого-биохимическими методами, и было показано, что оно состоит всего из двух компонентов: тиоавтотрофного и метанотрофного (Пименов и др., 2002).

Нами были проведены амплификация, клонирование и секвенированис фрагментов генов cbbL «зеленого» типа из суммарной ДНК, выделенной из жаберной ткани В. azoricus. Были выявлены два сиквенс-типа генов cbbL, которые, по результатам анализа сходства последовательностей, входили в кластер некультивируемых симбиотических и свободноживущих бактерий из морских гидротерм, которому принадлежал также и ранее изученный эндосимбионт Bathymodiolus sp. (номер доступа в GenBank АВ038634) (Рис. 8).

Таким образом, выявление генов cbbL в сложной смеси, содержащей эукариотическую и прокариотические ДНК, свидетельствует об эффективности разработанной нами системы праймеров и показывает, что предлагаемая методика может служить основой для проведения исследования биоразнообразия автотрофных микроорганизмов в различных природных сообществах. ' :

Применение системы праймеров, специфичной для генов, кодирующих 16SpPHK, выявило наличие в исследуемом сообществе только одного сиквенс-типа (Рис. 9а). Этот сиквенс-тип принадлежал кластеру у-протеобактерий, содержащему всех ранее изученных тиоавтотрофных симбионтов Bathymodiolus.

.0.05

Некультибируе мая бактерия гидротерм Euiyo (1)-1

971 НгкульткБирусм

Ц*- BA-Syiti(KJ)-~

* 111 Симбиаит О ¿iffг.

' Симбионт Ohgobrachia maehikai • Симбионт Solemya velum и Симбионт Bathymodiolus sp. I/ Некультавируемая бактерия гидротерм Mariana (I)-7 ь BA-SvmíRfí-1

Симбионт мидии Suiyo ■ Hydrogenophaga pseudoflava Thiobacillus denilnficans Acidithiobacilhisjerrooxidans сЬЬЪ-2 AUochromatium vinosum cbbA

BctotMorhodospira sfiaposhnikovii Thiomonas intermedia

Methylococcus capsuialus Hatothxabacilhis neapohtanus

AciditkiobaciHusfirrooxidans cbbb-1

AUochromatium vinosum ebbL

■ tfydrogenovibrio marinus cbb~L-2 • ifydrogenovibrio marinus ciéL-1 ■ tfydrogenophilus thermoluleolus • Bhodobacter blasticus

• Rkodabacter capsuiatus

Рис.8. Положение эндосимбионтов В. caoricus на филогенетическом дереве, построенном с использованием алгоритма neighbor-joining на основе сравнения транслированных аминокислотных последовательностей генов ebbh. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 аминокислот. Цифрами показана достоверность ветвления 1000 альтернативных деревьев с помощью bootstrap-анализа (больше 80%). Последовательности генов cbbb, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

Поскольку с помощью анализа 168рДНК сообщества метанотрофный компонент обнаружен не был, его выявление проводили с применением системы праймеров, специфичной для генов, детерминирующих метанотрофию. В результате было показано наличие гена ртоА, кодирующего мембранную метанмонооксигеназу. Анализ сходства последовательностей генов ртоА указывает на принадлежность метанотрофного эндосимбионта В. агогхеив к метанотрофам типа I (Рис. 96).

Таким образом, результаты проведенного нами комплексного анализа генов подтверждают данные, полученные цитологическими и физиолого-биохимическими методами, о наличии тиоавтотрофного и метанотрофного компонентов в составе симбиотического бактериального сообщества В. агопсия и показывают, что результаты анализа функциональных генов существенно дополняют выводы, получаемые при проведении стандартного анализа генов, кодирующих 16Э рРШС.

од;

J3L

iBA-Srm(lóS)

I Симбионт Bathynuxñofas azoricus •I Симбйс-нт Batkymodiolus puleoserpentis J' Симбионт Bathymodiohisputeoserpentis MARI «• Симбионт Sathymodiolus thermopkilus

СНекулътнвируемая бактерия гидротерм 1!иВ2-31

0Я5.

имбионт Conchocele é&juncta

7-тш>автотрофные симбионты

| Симбионт Bathymocholus sp. Я. Симбионт Balhymodiohís eeptemdarum

Симбионт BalkymGdiolus septorruüerum Suiyo j Thiomicrospira crunogena ¡iydrogpxovibrio marinus Thoalkahrmcrobmm mbiricum Thiomicrospira thyaárae Methybmonas methanica Methybcoccus capsu lalus Methybsphaera hansonii Methybbacter psychropkikis Симбионт Ikilhy*nodiohis piitQozerpentls MAE.2 Симбионт мидии Louisiana

Симбионт ¡kühymotbohisjapónicas Симбионт Batkymodiolus plattfrons

7~тноавгогрофы

,Т~сво6адножЕЮупо1е и симбвотические метанотрофы

Наупыивируемах бактерия __ i гидротврм TAO-G*hm(pMMO)-2 [Симбионт Balhymodiokis sp. BA-SvmíM)

•thybbacter sp. BB5.1 Methylobacter psychrophikis Methylobacter sp. Ш12 Metkybbacter sp. SV96

Methybmonas methanica Methybmcrobium pelagicum

'Methybbacter sp. LW14 Methylobacter sp. LW1 Methybbacter albus Methybcoccus capsulatus Methylocatíum szegediense Meíhybcaldum groóle Methylocaldum tepidum

Meihylocapsa acidiphila ' Methybcystisparvus •Methylocysüs eckinoides 'ethybsimis sporium Methybsms trickosporium

Тпп1

Тип X

Тип II

а)

б)

Рис. 9. Положение эндосимбионтов В. агопсиз на филогенетическом дереве, построенном с использованием алгоритма пе1£ЬЬог^отт§ на основе сравнения:

а) нуклеотадных последовательностей генов, кодирующих 16Б рРНК.

б) транслированных аминокислотных последовательностей генов ртоА.

Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 5 заменам на каждые 100 нуклеотидов/аминокислот. Цифрами показана достоверность ветвления 1 ООО альтернативных деревьев с помощью ЫхЛзйар-анализа (больше 95%). Последовательности генов, определенные в данном исследовании, выделены крупным шрифтом и подчеркнуты.

выводы

1. Разработана универсальная система олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I, у бактерий различных таксономических групп; подобраны и оптимизированы условия полимеразной цепной реакции.

2. С помощью предложенной методики определена первичная структура и проведен филогенетический анализ фрагментов 32 генов, кодирующих РБФК формы I, у широкого круга серозависимых автотрофных бактерий.

3. Использование генов, кодирующих РБФК формы I, в качестве молекулярных маркеров позволило:

а) выявить особенности эволюции различных групп автотрофов, как это было показано на примере pp. Oscillochloris, Thiobacillus, Thioalkalivibrio;

б) предложить схему эволюции генов, кодирующих РБФК, и подтвердить необходимость таксономической реорганизации группы «Thiomicrospira»;

в) способствовать описанию новых таксонов автотрофов (pp. Thiobacillus, Thioclava, Thioalkalispira)',

г) предположить существование нового варианта «красного» типа РБФК формы I у бактерий Oscillochloris trichoides и Sulfobacillus acidophilus.

4. На примере симбиотического бактериального сообщества, обитающего в жабрах глубоководных двустворчатых моллюсков рода Bathymodiolus:

а) показана эффективность разработанной системы праймеров при выявлении генов, кодирующих РБФК формы I, в молекулярно-экологических исследованиях;

б) показано, что результаты анализа функциональных генов могут существенно дополнить выводы, получаемые при проведении стандартного апализа генов, кодирующих 16SpPHK, и дать более полное представление о составе микробных сообществ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Спиридонова Е.М., Берг И.А., Колганова Т.В., Ивановский Р.Н., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у бактерий различных таксономических групп. Микробиология, 2004, т.73, №3, с.377-387

2. Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Берг И.А., Кузнецов Б.Б., Сорокин Д.Ю. Филогения генов рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы у облигатно автотрофных галоалкалофильных сероокисляющих бактерий рода Thioalkalivibrio. Микробиология, 2005, т.74, №3, с.378-386

3. Sorokin, D.Yu., Tourova, Т.Р., Spiridonova, E.M., Rainey, F.A., Muyzer, G. Thioclava pacifwa gen. nov., sp. nov., a novel facultatively autotrophic, marine, sulfur-oxidizing bacterium from a near-shore sulfidic hydrothermal area. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, v. 55, № 3, p. 1069-1075

4. Турова Т.П., Спиридонова E.M., Слободова H.B., Булыгина Е.С., Кеппен О.И., Кузнецов Б.Б., Ивановский Р.Н. Филогения аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochtoridaceae на основании сравнительного анализа генов rrs, cbbL и njjН. Микробиология, 2006, т.75, №2, с.235-244

5. Tourova Т.Р., Spiridonova EJM., Berg 1.А., Kuznetsov B.B., Sorokin D.Yu. Occurrence, phylogeny and evolution of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase genes in obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria of the genera Thiomicrospira and Thioalkalimicrobium. Microbiology, 2006, v. 152, №7, p. 2159-2169

6. Дульцева H.M., Турова Т.П., Спиридонова Е.М., Колганова Т.В., Осипов Г.А., Горленко В.М. Thiobacillus sajanensis sp.nov.-новая облигатно автотрофная сероокисляющая бактерия, выделенная из сероводородных источников Хойто-Гол, Бурятия. Микробиология, 2006, т.75, №5, с.670-681.

7. Спиридонова Е.М., Кузнецов Б.Б., Пименов Н.В., Турова Т.П. Определение филогенетического разнообразия эндосимбионтов моллюска Bathymodiolus azoricus на основании анализа генов 16S рРНК, cbbL и ртоА. Микробиология, 2006. В печати.

8. Sorokin D. Yu., Tourova Т.Р., Kolganova Т. V., Spiridonova E. M., Berg I, A., Muyzer G. Thiomicrospira halophila sp. nov., a novel, moderately halophilic, obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacterium from hypersaline lakes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006. In press.

9. Spiridonova E.M., Kuznetsov B.B., Tourova T.P. Phylogenetic characterization of endosymbionts in hydrothermal vent mussel Bathymodiolus azoricus. 1 st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, March 15-18th 2005. Book of Abstracts, p. 182.

10. Спиридонова E.M. Усовершенствование системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов РуБисКО у бактерий различных таксономических групп. XII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых <Ломоносов-2005», Москва, Россия, 12-15 апреля 2005 г. Тезисы докладов, с.203.

П.Спиридонова Е.М., Берг И.А., Турова Т.П. Сравнительный анализ генов, кодирующих РуБисКО, у представителей рода Thiomicrospira. Всероссийская Молодежная школа-

конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии», Москва, Россия, 1-3 ноября 2005 г. Тезисы докладов, с.80

12. Спиридонова Е.М., Турова Т.П., Кеппен О.И., Ивановский Р.Н. Филогенетический анализ бактерий рода Oscillochloris на основе сравнения последовательностей генов, кодирующих РуБисКО. Всероссийский симпозиум «Автотрофные микроорганизмы», Москва, Россия, 21 - 24 декабря 2005 г. Материалы симпозиума, с. 69.

13. Spiridonova Е. М., Berg I. A., Tourova Т. P., Kuznetsov В. В., Sorokin D. Yu. Extended phylogenetic analysis of a first truly halophilic representative of the genus Thiomicrospira. 11th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-11), Vienna, Austria, August 20-25 2006. Book of Abstracts, p. 30.

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 08.09.2006 г.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Спиридонова, Елизавета Михайловна

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Пути автотрофной ассимиляции СОг.

1.1. Восстановительный рибулозобисфосфатный цикл.

1.2. Восстановительный цикл трикарбоновых кислот.

1.3. 3-гидроксипропионатный цикл и восстановительный цикл дикарбоновых кислот.

1.4. Нециклические системы автотрофной ассимиляции СО2.

Глава 2. Формы РБФК.

2.1. Форма 1.

2.2. Форма II.

2.3. РБФК архей (форма III).

2.4. РБФК-подобные белки (форма IV).

2.5. Локализация и организация генов, кодирующих РБФК.

Глава 3. Филогения и эволюция РБФК.

3.1. Сопоставление филогении РБФК с пластидной и протеобактериальной филогенией.

3.2. Горизонтальный перенос генов, кодирующих РБФК.

3.3. Дупликация и дифференциальная потеря гена.

Глава 4. Изучение биоразнообразия природных сообществ.

4.1. Молекулярно-биологические методы изучения микробных сообществ.33.

4.2. Использование генов, детерминирующих автотрофию, для анализа природных экосистем.

Экспериментальная часть.

Глава 5. Материалы и методы.

5.1. Объекты исследования.

5.2. Выделение ДНК.;.

5.3. Выбор праймеров.

5.4. Амплификация фрагментов исследуемых генов.

5.4.1. Амплификация фрагментов генов, кодирующих РБФК формы 1.

5.4.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК.

5.4.3. Амплификация фрагментов генов, кодирующих метанмонооксигеназу.

5.5. Детектирование продуктов ПЦР.

5.6. Очистка ПЦР-фрагментов.

5.7. Клонирование ПЦР-фрагментов.

5.7.1. Приготовление компетентных клеток.

5.7.2. Лигирование.

5.7.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК.

5.7.4. Выделение плазмидной ДНК.

5.8. Секвенирование ДНК.

5.9. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей.

5.10. Депонирование нуклеотидных последовательностей.

Результаты и обсуждение.

Глава 6. Разработка и проверка системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации фраментов генов, кодирующих РБФК формы I, у бактерий различных таксономических групп.

6.1. Разработка системы олигонуклеотидных праймеров для амплификации фрагментов генов, кодирующих РБФК формы I, у бактерий различных таксономических групп.

6.2. Проверка разработанной системы праймеров на автотрофных бактериях с известной первичной структурой генов, кодирующих РБФК формы 1.

6.3. Оптимизация условий ПЦР для амплификации фрагментов генов, кодирующих РБФК формы 1.

Глава 7. Филогенетический анализ генов cbbL у представителей различных таксонов прокариот.

7.1. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у фотолитоавтотрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae.

7.2. Выявление, секвенирование и филогенетический анализ генов cbbL у хемолитоавтотрофных бактерий.

7.2.1. p. Thiobacillus.

7.2.2. p. Thioalkalivibrio и Thioalkalispira.

7.2.3. p. Thioalkalimicrobium и Thiomicrospira.

7.2.4. p. Thioclava.

Глава 8. Определение разнообразия эндосимбиотического сообщества моллюска Bathymodiolus azoricus.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп"

Первичная продукция органического углерода в биосфере основана на ассимиляции СОг автотрофными организмами. В процессе эволюции у разных групп автотрофов выработались различные механизмы фиксации СО2: восстановительный рибулозобисфосфатный цикл (цикл Кальвина), восстановительный цикл трикарбоновых кислот, 3-гидроксипропионатный цикл, восстановительный цикл дикарбоновых кислот, восстановительный ацетил-КоА путь (цит. по Кондратьева, 1996).

Ключевым ферментом автотрофной фиксации СО2 в цикле Кальвина является рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК, КФ 4.1.1.39). В то время, как структурные и биохимические свойства этого фермента обстоятельно исследованы классическими биохимическими методами, данные о его происхождении и эволюции чрезвычайно ограничены. Известно, что автотрофные организмы, ассимилирующие СОг с помощью цикла Кальвина, принадлежат к различным и достаточно удаленным друг от друга эволюционным ветвям. Достаточно широко разнообразие первичных последовательностей РБФК, которые в настоящее время разделены на четыре формы, поэтому вопрос о моно- или полифилетическом происхождении РБФК до сих пор остается открытым.

Для исследования происхождения и эволюции РБФК необходимо использовать молекулярно-биологические методы, позволяющие проводить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей структурных генов, кодирующих этот белок, у различных групп прокариот. Филогенетический анализ, основанный на сравнении последовательностей генов, кодирующих РБФК, широко применяется в таксономии растений и водорослей и на низших таксономических уровнях соответствует данным других маркеров (Clegg, 1993; Freshwater et al., 1994). Сравнение филогенетических схем (деревьев), построенных на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих РБФК, традиционного анализа генов, кодирующих 16S рРНК, а также, в некоторых случаях, анализа других структурных генов, может позволить выявить особенности эволюции и функционирования генов, кодирующих РБФК, у различных прокариотных микроорганизмов.

Несмотря на большую экологическую и практическую значимость процесса фиксации СОг, до настоящего времени остаются малоизученными вопросы, связанные с оценкой биоразнообразия автотрофных бактерий в природных сообществах, вклада конкретной экосистемы в общую продукцию органического углерода, влияния различных факторов на биоразнообразие сообществ.

Молекулярно-биологические методы позволяют получить данные, отражающие весь спектр эволюционных взаимоотношений в мире прокариот и позволяющие проводить их выявление и идентификацию. Кроме того, применение этих методов в микробной экологии позволяет получить обширную информацию о составе микробного сообщества сравнительно быстро и с высокой степенью точности.

Наиболее полную информацию о биоразнообразии микробных популяций, влиянии на него различных воздействий, динамике популяционных изменений в настоящее время получают с применением подходов, основанных на использовании метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использование анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК в сочетании с методами клонирования позволило изучать состав микробных популяций (Giovannoni et al., 1990; Ward et al., 1990). Такой подход явился большим достижением в микробной экологии, поскольку существенно расширил представление о составе микробных сообществ, позволив идентифицировать микроорганизмы без предварительного культивирования в лабораториях и выделения чистых культур.

В настоящее время все более перспективными объектами для исследований в области молекулярной экологии становятся функциональные гены, позволяющие детектировать и идентифицировать микроорганизмы, выполняющие определенную функцию в данной экосистеме. Разработка и применение на практике универсальных праймерных систем, специфичных к первичным нуклеотидным последовательностям генов, кодирующих ключевые ферменты тех или иных биохимических процессов, позволяет создавать своеобразные функциональные срезы микробных популяций, в которых идентифицируются, среди всех прочих, и микроорганизмы, не выявляемые как классическими микробиологическими методами, так и с помощью анализа клонированных фрагментов суммарного амплификата 16S рДНК сообщества.

В настоящее время специфичные системы праймеров разработаны для амплификации фрагментов генов, кодирующих: метанмонооксигеназу (Holmes et al., 1995; McDonald et al., 1995); метанолдегидрогеназу (McDonald et al., 1995; McDonald a. Murrell, 1997); монооксигеназу аммиака (Rotthauwe et al., 1997); нитрогеназу (Марусина и др., 2001); нитратредуктазу (Gregory et al., 2000); нитритредуктазу (Braker et al., 1998); хлоритдисмутазу (Bender et al., 2004); бисульфитредуктазу (Wagner et al., 1998); арсенатредуктазу (Malasarn et al., 2004), М-субъединицу фотосинтетического реакционного центра пурпурных бактерий (Achenbach et al., 2001) и другие белки.

Для обнаружения и идентификации генов, кодирующих РБФК, ранее предлагались праймерные системы, позволяющие амплифицировать участки этих генов (Paul et al, 1990; Черных, 1995; Pichard et al., 1997; Elsaied a. Naganuma, 2001; Alfreider et al., 2003;

Nanba et al., 2004). Однако степень универсальности этих праймерных систем ограничивалась тем, что они были сконструированы на основании анализа небольшого числа первичных нуклеотидных последовательностей, имевшихся к тому моменту в международных базах данных. На начальных этапах разработки универсальных праймерных систем для выявления гомологичных нуклеотидных последовательностей уровень универсальности критичным образом зависит от объема выборки, на основании анализа которой создается система. В ряде случаев появление даже одной новой последовательности способно существенным образом повлиять на конечный результат.

Цель настоящей работы заключалась в разработке универсальной системы олигонуклеотидных праймеров, позволяющей амплифицировать фрагменты генов, кодирующих большую субъединицу РБФК формы I бактерий, и ее применении для анализа разнообразия исследуемых генов у фото- и хемотрофных бактерий, различающихся по экологическим, физиологическим особенностям и таксономическому положению.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

5. Проверка применимости разработанной системы праймеров для исследования микробных сообществ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Спиридонова, Елизавета Михайловна

выводы

3. Использование генов, кодирующих РБФК формы I, в качестве молекулярных маркеров позволило: а) выявить особенности эволюции различных групп автотрофов, как это было показано на примере pp. Oscillochloris, Thiobacillus, Thioalkalivibrio', б) предложить схему эволюции генов, кодирующих РБФК, и подтвердить необходимость таксономической реорганизации группы «Thiomicrospira»; в) способствовать описанию новых таксонов автотрофов (pp. Thiobacillus, Thioclava, Thioalkalispira); г) предположить существование нового варианта «красного» типа РБФК формы I у бактерий Oscillochloris trichoides и Sulfobacillus acidophilus.

4. На примере симбиотического бактериального сообщества, обитающего в жабрах глубоководных двустворчатых моллюсков рода Bathymodiolus: а) показана эффективность разработанной системы праймеров при выявлении генов, кодирующих РБФК формы I, в молекулярно-экологических исследованиях; б) показано, что результаты анализа функциональных генов могут существенно дополнить выводы, получаемые при проведении стандартного анализа генов, кодирующих 16S рРНК, и дать более полное представление о составе микробных сообществ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Спиридонова, Елизавета Михайловна, Москва

1. Берг И. А., Кеппен О. И., Красильникова Е. Н., Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. Углеродный метаболизм аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий семейства Oscillochloridaceae // Микробиология. 2005. - Т. 74. - № 3. - С. 305-312.

2. Захарчук Л. М., Цаплина И. А., Красильникова Е. Н., Богданова Т. И., Каравайко Г. И. Метаболизм углерода у Sulfobacillus thermosulfidooxidans штамм 1269 // Микробиология. 1994. - Т. 63. - С. 573-580.

3. Кондратьева Е. Н. Автотрофные прокариоты. М.: Изд-во МГУ, 1996. -312 с.

4. Марусина А. И., Булыгина Е. С., Кузнецов Б. Б., Турова Т. П., Кравченко И. К., Гальченко В. Ф. Система олигонуклеотидных праймеров для амплификации генов niftl различных таксономических групп прокариот // Микробиология. 2001. -Т. 70. -№ 1. - С. 86-91.

5. Уголькова Н. В., Ивановский Р. Н. О механизме автотрофной фиксации углекислоты у Chloroflexus aurantiacus II Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 2. - С. 175-179.

6. Чемерис А. В., Ахунов Э. Д., Вахитов В. А. Секвенирование ДНК. М.:Наука, 1999.-429 с.

7. Черных Н. А. Использование полимеразной цепной реакции для детекции гена РБФК в природных образцах // Микробиология. 1995. - Т. 64. - № 6. - С. 792-796

8. Achenbach L. A., Carey J., Madigan М. Т. Photosynthetic and phylogenetic primers for detection of anoxygenic phototrophs in natural environments // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67. - № 7. - P. 2922-2926.

9. Alfreider A., Vogt C., Hoffmann D., Babel W. Diversity of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large-subunit genes from groundwater and aquifer microorganisms // Microb. Ecol. 2003. - V. 45. - № 4,- P. 317-328.

10. Ashida H., Danchin A., Yokota A. Was photosynthetic RuBisCO recruited by acquisitive evolution from RuBisCO-like proteins involved in sulfur metabolism? // Res. Microbiol. 2005. - V. 156.-№ 5-6.- P. 611-618.

11. Ashida H., Saito Y., Kojima C., Kobayashi K., Ogasawara N., Yokota A. A functional link between RuBisCO-like protein of Bacillus and photosynthetic RuBisCO I I Science. -2003.-V. 302.-P. 286-290.

12. Bassham J. A., Calvin M. The path of carbon in photosynthesis. Englewood Cliffs, NJ: Prentis Hall, 1957.- 104 p.

13. Bazylinski D. A., Dean A. J., Williams T. J., Long L. K., Middleton S. L., Dubbels B. L. Chemolithoautotrophy in the marine, magnetotactic bacterial strains MV-1 and MV-2 // Arch. Microbiol. 2004. - V. 182. - № 5. - P. 373-387.

14. Bhatnagar L., Jain M. K., Zeikus J. G. Methanogenic bacteria // In: Variations in autotrophic life / Shively J. M. a. Barton L. L. (Eds.). London: Academic Press, 1991. -P. 251-270.

15. Bhattacharya D., Medlin L. The phylogeny of plastids: a review based on comparisons of small-subunit ribosomal RNA coding regions // J. Phycol. 1995. - V. 31. - № 4. - P. 489-498.

16. Birnboim H. C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA //Nucleic Acids Res. 1979. - V. 7. - № 6. - P. 1513-1523.

17. Bonnet R., Suau A., Dore J., Gibson G. R., Collins M. D. Differences in rDNA libraries of faecal bacteria derived from 10- and 25-cycle PCRs // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2002.-V. 52. -№3. P. 757-763.

18. Bowes G., Ogren W. L., Hagerman R. H. Phosphoglycolate production catalyzed by ribulose diphosphate carboxylase // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1971. - V. 45. -№3.-P. 716-722.

19. Brinkhoff Т., Muyzer G. Increased species diversity and extended habitat range of sulfur-oxidizing Thiomicrospira spp. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - № 10. - P. 3789-3796.

20. Brinkhoff Т., Muyzer G., Wirsen С. O., Kuever J. Thiomicrospira chilensis sp. nov., a mesophilic obligately chemolithoautotrophic sulfur-oxidizing bacteria isolated from a Thioploca mat // Int. J. Syst. Bacterid. 1999a. - V. 49. - № 2. - P. 875-879.

21. Campbell В. J., Сагу S. С. Abundance of reverse tricarboxylic acid cycle genes in free-living microorganisms at deep-sea hydrothermal vents // Appl. Environ. Microbiol. -2004. V. 70. - № io. - P. 6282-6289.

22. Campbell B. J., Stein J. L., Cary S. C. Evidence of chemolithoautotrophy in the bacterial community associated with Alvinella pompejana, a hydrothermal vent polychaete // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - № 9. - P. 5070-5078.

23. Cavanaugh С. M. Symbiosis of chemoautotrophic bacteria in marine invertebrates from hydrothermal vents and reducing sediments // Biol. Soc, Wash. Bull. 1985. - V. 6. -P.373-388.

24. Chandler D. P., Fredrickson J. K., Brockman F. J. Effect of PCR template concentration on the composition and distribution of total community 16S rDNA clone libraries // Mol. Ecol. 1997. - V. 6. - № 5. - P. 475-482.

25. Clegg M. T. Chloroplast gene sequences and the study of plant evolution // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. - V. 90. - № 2. - P. 363-367.

26. Cleland W. W., Andrews T. J., Gutteridge S., Hartman F. C., Lorimer G. H. Mechanism of Rubisco: the carbamate as general base // Chem. Rev. 1998. - V. 98. - № 2. - P. 549561.

27. Cobb B. Optimization of RAPD fingerprinting // In: Fingerprinting methods based on arbitrarily primed PCR / Micheli M. R. a. Bova R. (Eds.). Berlin: Springer-Verlag, 1997.-P. 93-102.

28. Coulter-Mackie M. B. Single-base sequencing for rapid screening of plasmids for inserts with known mutations and correct orientation // Biotechniques. 1994. - V. 16. - № 6. -P. 1026-1029.

29. De Rijk P., Van de Peer Y., Van den Broeck I., De Wachter R. Evolution according to large ribosomal subunit RNA // J. Mol. Evol. 1995. - V. 41. - № 3. - P. 366-375.

30. Delwiche C. F., Kuhsel M., Palmer J. D. Phylogenetic analysis of tufk sequences indicates a cyanobacterial origin of all plastids // Mol. Phylogenet. Evol. 1995. - V. 4. -№2. -P. 110-128.

31. Delwiche C. F., Palmer J. D. Rampant horizontal transfer and duplication of Rubisco genes in eubacteria and plastids // Mol. Biol. Evol. 1996. - V. 13. - № 6. - P. 873-882.

32. Distel D. L., Cavanaugh С. M. Independent phylogenetic origins of methanotrophic and chemoautotrophic bacterial endosymbionts in marine bivalves // J. Bacterid. 1994. -V. 176.-№7.-P. 1932-1938.

33. Distel D. L., Lee H. K., Cavanaugh С. M. Intracellular coexistence of methano- and thioautotrophic bacteria in a hydrothermal vent mussel // Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. -V. 92. -№21. -P. 9598-9602.

34. Douglas S. E., Murphy C. A. Structural, transcriptional and phylogenetic analyses of the atpB gene cluster from the plastid of Cryptomonas ¥ (Cryptophyceae) // J. Phycol. -1994.-V. 30.-№2.-P. 329-340.

35. Edwards D. В., Nelson D. C. DNA-DNA solution hybridization studies of the bacterial symbionts of hydrothermal vent tube worms (Riftia pachyptila and Tevnia jerichonana) И Appl. Environ. Microbiol. -1991. V. 57. - № 4. - P. 1082-1088.

36. Ellis R. J. The most abundant protein in the world // Trends Biochem. Sci. 1979. -V. 4.-P. 241-244.

37. Elsaied H., Naganuma T. Phylogenetic diversity of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large-subunit genes from deep-sea microorganisms // Appl.Environ.Microbiol. 2001. - V. 67. - № 4. - P. 1751-1765.

38. English R. S., Williams C. A., Lorbach S. C., Shively J. M. Two forms of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from Thiobaeillus denitrificans IIFEMS Microbiol. Lett. -1992. V. 94. - № 1,2. - P. 111-119.

39. Evans M. C., Buchanan В. В., Arnon D. I. A new ferredoxin-dependent carbon reduction cycle in a photosynthetic bacterium // Proc. Natl. Acad. Sci. 1966. - V. 55. - № 4. -P. 928-934.

40. Feldman R. A., Black M. В., Сагу С. S., Lutz R. A., Vrijenhoek R. C. Molecular phylogenetics of bacterial endosymbionts and their vestimentiferan hosts // Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 1997. - V. 6. - № 3. - P. 268-277.

41. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach // J. Mol. Evol. -1981. V. 17. - № 6. - P. 368-376.

42. Felsenstein J. PHYLIP Phylogenetic Inference Package version 3.2 // Cladistics. -1989.-V. 5.-P. 164-166.

43. Fennoy S. L., Bailey-Serres J. Synonymous codon usage in Zea mays L. nuclear genes is varied by levels of С and G-ending codons // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. -№23.-P. 5294-5300.

44. Finn M. W., Tabita F. R. Modified pathway to synthesize ribulose 1,5-bisphosphate in methanogenic archaea // J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - № 19. - P. 6360-6366.

45. Finn M. W., Tabita F. R. Synthesis of catalytically active form III ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase in archaea // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - № 10. -P. 3049-3059.

46. Fitch W. M. Toward defining the course of evolution: minimum change for a specified tree topology // Systematic Zoology. -1971. V. 20. - P. 406-416.

47. Fitch W. M., Margoliash E. Construction of phylogenetic trees // Science. 1967. -V. 155.-P. 279-284.

48. French J. C., Chung M. G., Hur Y. K. Chloroplast DNA phylogeny of the Ariflorae // In: Monocotyledons: Systematics and Evolution / Rudall P. J. et al. (Eds.). Kew: Royal Botanic Gardens, 1995. - P. 255-275.

49. Freshwater D. W., Fredericq S., Butler B. S., Hommersand M., Chase M. W. A gene phylogeny of the red algae (Rhodophyta) based on plastid rbcL // Proc. Natl. Acad. Sci. -1994. V. 91. - № 15. - P. 7281-7285.

50. Fujiwara Y., Takai K., Uematsu K., Tsuchida S., Hunt J. C., Hashimoto J. Phylogenetic characterization of endosymbionts in three hydrothermal vent mussels: influence of host distributions //Mar. Ecol. Prog. Ser. 2000. - V. 208. - 147-155.

51. Garrity G. M., Holt J. G, Phylum BVI. Chlorojlexi phy. nov. // In: Bergey's manual of systematic bacteriology. 2 ed. / Boone D. R. et al. (Eds.). New York, Berlin, Heidelberg: Springer, 2001. - P. 427-446.

52. Gibson J. L., Falcone D. L., Tabita F. R. Nucleotide sequence, transcriptional analysis, and expression of genes encoded within form I CO2 fixation operon of Rhodobacter sphaeroides // J. Biol. Chem. -1991. V. 266. - № 22. - P. 14646-14653.

53. Gibson J. L., Tabita F. R. Different molecular forms of D-ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase from Rhodopseudomonas sphaeroides I I J. Biol. Chem. 1977a. - V. 252. -№3.-P. 943-949.

54. Gibson J. L., Tabita F. R. Isolation and preliminary characterization of two forms of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase from Rhodopseudomonas capsulata II J. Bacteriol. 1977b. - V. 132. - № 3. - P. 818-823.

55. Gich F., Garcia-Gil J., Overmann J. Previously unknown and phylogenetically diverse members of the green nonsulfur bacteria are indigenous to freshwater lakes // Arch. Microbiol. 2001. - V. 177. - № 1. - P. 1-10.

56. Giovannoni S. J., Britschgi Т. В., Moyer C. L., Faild K. J. Genetic diversity in Sargasso Sea bakterioplankton // Nature. -1990. V. 345. - P. 60-63.

57. Giri B. J., Bano N., Hollibaugh J. T. Distribution of RuBisCO genotypes along a redox gradient in Mono Lake, California // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70. - № 6. -P. 3443-3448.

58. Gregory L. G., Karakas-Sen A., Richardson D. J., Spiro S. Detection of genes for membrane-bound nitrate reductase in nitrate-respiring bacteria and in community DNA // FEMS Microbiol. Lett. 2000. - V. 183. - № 2. - P. 275-279.

59. Gupta R. S. Protein phylogenies and signature sequences: A reappraisal of evolutionary relationships among archaebacteria, eubacteria, and eukaryotes // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62. - № 4. - P. 1435-1491.

60. Hanada S., Takaichi S., Matsuura K., Nakamura K. Roseiflexus castenholzii gen. nov., sp. nov., a thermophilic, filamentous, photosynthetic bacterium that lacks chlorosomes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. - V. 52. - № 1. - P. 187-193.

61. Hanson Т. E., Tabita F. R. Insights into the stress response and sulfur metabolism revealed by proteome analysis of a Chlorobium tepidum mutant lacking the Rubisco-like protein// Photosynth. Res. 2003. - V. 78. - № 3. - P. 231-248.

62. Haygood M. G. The potential role of functional differences between RuBisCO forms in governing expression in chemoautotrophic symbiosis // Limnol. Oceanogr. 1996. - V. 41.-№2.-P. 370-371.

63. Heinhorst S., Baker S. H., Johnson D. R., Davies P. S., Cannon G. C., Shively J. M. Two copies of form I RuBisCO genes in Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 // Curr. Microbiol. 2002. - V. 45. - № 2. - P. 115-117.

64. Hilario E., Gogarten J. P. Horizontal transfer of ATPase genes the tree of life becomes a net of life // Biosystems. - 1993. - V. 31. - № 2-3. - P. 111-119.

65. Holmes A. J., Costello A., Lidstrom M. E., Murrell J. C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 132. - № 3. - P. 203-208.

66. Horken К. M., Tabita F. R. The «green» form I ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from nonsulfur purple bacterium Rhodobacter capsulatus II J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - № 13. - P. 3935-3941.

67. Hugler M., Huber H., Stetter К. O., Fuchs G. Autotrophic CO2 fixation pathways in archaea (Crenarchaeota) // Arch. Microbiol. 2003. - V. 179. - № 3. - P. 160-173.

68. Husemann M., Klintworth R., Buttcher V., Salnikow J., Weissenborn C., Bowien B. Chromosomally and plasmid-encoded gene clusters for CO2 fixation (cfx genes) in Alcaligenes eutrophus И Mol. Gen. Genet. 1988. - V. 214. - P. 112-120.

69. Imhoff J. F., Truper H. G., Pfennig N. Rearrangement of the species and genera of the phototrophic 'purple nonsulfur bacteria' // Int. J. Syst. Bacteriol. 1984. - V. 34. - P. 340343.

70. Ishii M., Miyake Т., Satoh Т., Sugiyama H., Oshima Y., Kodama Т., Igarashi Y. Autotrophic carbon dioxide fixation in Acidianus brierleyi II Arch. Microbiol. -1997.-V. 166.-№6.-P. 368-371

71. Ivanova Т. I., Tourova T. P., Antonov A. S. DNA-DNA hybridization studies on some purple nonsulfur bacteria // Syst. Appl. Microbiol. 1988. - V. 10. - P. 259-263.

72. Ivanovsky R. N., Krasilnikova E. N., Fal Y. I. A pathway of the autotrophic CO2 fixation in Chloroflexus aurantiacus II Arch. Microbiol. 1993. - V. 159. - № 3. - P. 257-264.

73. Ivanovsky R. N., Sintsov N. V., Kondratieva E. N. ATP-linked citrate lyase activity in the green sulfur bacterium Chlorobium limicola forma thiosulfatophilum II Arch. Microbiol. 1980. - V. 128. - № 2. - P. 239-241.

74. Jannasch H. W., Wirsen С. O., Nelson D. C., Robertson L. A. Thiomicrospira crunogena sp. nov., a colorless sulfur-oxidizing bacterium from a deep-sea hydrothermal vent // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. - V. 35. - P. 422-424.

75. Jordan D. В., Ogren W. L. Species variation in the specificity of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase //Nature. -1981. V. 291. - P. 513-515.

76. Jouanneau Y., Tabita F. R. Independent regulation of synthesis of form I and form II ribulose bisphosphate carboxylase-oxygenase in Rhodopseudomonas sphaeroides II J. Bacteriol. 1986. - V. 165. - № 2. - P. 620-624.

77. Kalkus J., Ren M., Schlegel H. G. Hydrogen autotrophy of Nocardia opaca strains is encoded by linear megaplasmids // J.Gen. Microbiol. 1990. - V. 136. - № 6. - P. 11451151.

78. Kellogg E. A., Juliano N. D. The structure and function of RuBisCO and their implications for systematic studies // Am. J. Bot. 1997. - V. 84. - № 3. - P. 413-428.

79. Kimura H., Higashide Y., Naganuma T. Endosymbiotic and ambient microflora of vestimentiferan tubeworms // Jpn. Mar. Sci. Technol. Center J. Deep Sea Res. 1999. -V. 15.-P. 25-33.

80. Kimura H., Higashide Y., Naganuma T. Endosymbiotic microflora of the vestimentiferan tubeworm (Lamellibrachia sp.) from a bathyal cold seep // Mar. Biotechnol. 2003. - V. 5.-№6.-P. 593-603.

81. Kimura H., Sato M., Sasayama Y., Naganuma T. Molecular characterization and in situ localization of endosymbiotic 16S ribosomal RNA and RuBisCO genes in the pogonophoran tissue // Mar. Biotechnol. 2003. - V. 5. - № 3. - P. 261-269.

82. Kuenen J. G., Veldkamp H. Thiomicrospira pelophila, gen. п., sp. п., a new obligately chemolithotrophic colourless sulfur bacterium // Ant. van Leeuwenhoek. 1972. - V. 38. -P. 241-256.

83. Kusano Т., Takeshima Т., Inoue C., Sugawara K. Evidence for two sets of structural genes coding for ribulose bisphosphate carboxylase in Thiobacillus ferrooxidans II J. Bacteriol. -1991. V. 173. - № 22. - P. 7313-7323.

84. Kusian В., Bednarski R., Husemann M., Bowien B. Characterization of the duplicate ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase genes and ebb promoters of Alcaligenes eutrophus II J. Bacterid. -1995. V. 177. - № 15. - P. 4442-4450.

85. Kusian В., Bowien B. Organization and regulation of ebb СОг assimilation genes in autotrophic bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 1997. - V. 21. - № 2. - P. 135-155.

86. Lane D. J. 16S/23S sequencing // In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics / Stackebrandt E. a. Goodfellow M. (Eds.). Chichester: John Wiley & Sons, Ltd., 1991. -P. 115-175.

87. Li H., Sawaya M. R., Tabita F. R., Eisenberg D. Crystal structure of a RuBisCO-like protein from the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum II Structure. 2005. - V. 13. - № 5. - P. 779-789.

88. Maeda N., Kanai Т., Atomi H., Imanaka T. The unique pentagonal structure of an archaeal Rubisco is essentional for its high thermostability // J. Biol. Chem. 2002. -V. 277.-№35.-P. 31656-31662.

89. Malasarn D., Saltikov C. W., Campbell К. M., Santini J. M., Hering J. G., Newman D. K. arrA is a reliable marker for As(V) respiration // Science. 2004. - V. 306. - P. 455.

90. Martin W., Brinkmann H., Savonna C., Cerff R. Evidence for a chimeric nature of nuclear genomes: eubacterial origin of eukaryotic glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase genes // Proc. Natl. Acad. Sci. 1993. - V. 90. - № 18. - P. 8692-8696.

91. McClung C. R., Chelm В. K. A genetic locus essential for formate-dependent growth of Bradyrhizobium japonieum I I J. Bacterid. 1987. - V. 169. - № 7. - P. 3260-3267.

92. McDonald I. R., Kenna E. M., Murrell J. C. Detection of methanotrophic bacteria in environmental samples with the PCR // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - № 1. -P. 116-121.

93. McDonald I. R., Murrell J. C. The methanol dehydrogenase structural gene mxa¥ and its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - № 8. - P. 3218-3224.

94. McFadden B. A. Autotrophic CO2 assimilation and the evolution of ribulose diphosphate carboxylase // Bacterid. Rev. 1973. - V. 37. - № 3. - P. 289-319.

95. Medigue С., Rouxel Т., Vigier P., Henaut A., Danchin A. Evidence for horizontal gene transfer in Escherichia coli speciation. // J. Mol. Biol. -1991. V. 222. - № 4. - P. 851856.

96. Morse D., Salois P., Markovic P., Hastings J. W. A nuclear-encoded form II RuBisCO in dinoflagellates // Science. 1995. - V. 268. - P. 1622-1624.

97. Moszer I., Rocha E. P., Danchin A. Codon usage and lateral gene transfer in Bacillus subtilis // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - V. 2. - № 5. - P. 524-528.

98. Musto H., Romero H., Rodriguez-Maseda H. Heterogeneity in codon usage in the flatworm Schistosoma mansoni // J. Mol. Evol. 1998. - V. 46. - № 2. - P. 159-167.

99. Naganuma Т., Kato C., Hirayama H., Moriyama N., Hashimoto J., Horikoshi K. Intracellular occurrence of s-proteobacterial 16S rDNA sequences in the vestimentiferan trophosome // Journal of Oceanography. 1997. - V. 53. - P. 193-197.

100. Newman J., Gutteridge S. The X-ray structure of Synechococcus ribulose-bisphosphate carboxylase/oxygenase-activated quaternary complex at 2.2-A resolution // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - № 34. - P. 25876-25886.

101. Nishihara H., Igarashi Y., Kodama T. Hydrogenovibrio marinus gen. nov., sp. nov., a marine obligately chemolithoautotrophic hydrogen-oxidizing bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. -1991. V. 41. - P. 130-133.

102. Palenik B„ Swift H. Cyanobacterial evolution and prochlorophyte diversity as seen in DNA-dependent RNA polymerase gene sequences // J. Phycol. 1996. - V. 32. - № 4. -P. 638-646.

103. Paoli G. C., Morgan N. S., Tabita F. R„ Shively J. M. Expression of the cbbLcbbS and cbbM genes and distinct organization of the ebb Calvin cycle structural genes of Rhodobacter capsulatus II Arch. Microbiol. 1995. - V. 164. - № 6. - P. 396-405.

104. Paoli G. C., Vichivanives P., Tabita F. R. Physiological control and regulation of the Rhodobacter capsulatus ebb operons // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - № 16. - P. 42584269.

105. Paul J. H., Cazares L., Thurmond J. Amplification of the rbcL gene from dissolved and particulate DNA from aquatic environments // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - № 6. - P. 1963-1966.

106. Hl.Pichard S. L., Campbell L., Paul J. H. Diversity of the ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase form I gene (rbcL) in natural phytoplankton communities I I Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - № 9. - P. 3600-3606.

107. Rajagopalan R., Altekar W. Characterisation and purification of ribulose-bisphosphate carboxylase from heterotrophically grown halophilic archaebacterium, Haloferax mediterranei II Eur. J. Biochem. 1994. - V. 221. - № 2. -P. 863-869.

108. Robertson L. A., Kuenen J. G. The colourless sulfur bacteria // In: The prokaryotes: an evolving electronic resource for the microbiological community. 3 ed. -New York: Springer-Verlag, 1999. http://link.springer-ny.com/link/service/books/10125/

109. Rotthauwe J. H., Witzel K. P., Liesack W. The ammonia monooxygenase structural gene amok as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations //Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - № 12. - P. 4704-4712.

110. Ruby E. G., Wirsen C. 0., Jannasch H. W. Chemolithotrophic sulfur-oxidizing bacteria from the Galapagos Rift hydrothermal vents // Appl. Environ. Microbiol. -1981. V. 42. -№ 2.-P. 317-324.

111. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. - V. 4. - № 4. - P. 406-425.

112. Schneider G., Lindqvist Y., Lundqvist T. Crystallographic refinement and structure of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase from Rhodospirillum rubrum at 1.7 A resolution // J. Mol. Biol. 1990. - V. 211. - № 4. - P. 989-1008.

113. Sekowska A., Danchin A. The methionine salvage pathway in Bacillus subtilis II BMC Microbiology. 2002. - V. 2. - P. 8-21.

114. Shively J. M., van Keulen G., Meijer W. G. Something from almost nothing: carbon dioxide fixation in chemoautotrophs // Annu. Rev. Microbiol. 1998. - V. 52. - P. 191230.

115. Sorokin D. Y., Kuenen J. G. Chemolithotrophic haloalkaliphiles from soda lakes // FEMS Microbiol. Ecol. 2005. - V. 52. - № 3. - P. 287-295.

116. Sorokin D. Y., Robertson L. A., Kuenen J. G. Isolation and characterization of alkaliphilic, chemolithoautotrophic, sulphur-oxidizing bacteria // Ant. van Leeuwenhoek. 2000. - V. 77. - № 3. - P. 251-262.

117. Stein J. L., Haygood M., Felbeck H. Nucleotide sequence and expression of a deep-sea ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase gene cloned from a chemoautotrophic bacterial endosymbiont // Proc. Natl. Acad. Sci. 1990. - V. 87. - № 22. - P. 8850-8854.

118. Stoner M. Т., Shively J. M. Cloning and expression of the D-ribulose- 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase form II gene from Thiobaeillus intermedius in Escherichia coli II FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 107. - № 2-3. - P. 287-292.

119. Strauss G., Fuchs G. Enzymes of a novel autotrophic CO2 fixation pathway in the phototrophic bacterium Chloroflexus aurantiacus, the 3-hydroxypropionate cycle // Eur. J. Biochem. 1993. - V. 215. - № 3. - P. 633-643.

120. Tabita F. R. Molecular and cellular regulation of autotrophic carbon dioxide fixation in microorganisms // Microbiol. Rev. 1988. - V. 52. - № 2. - P. 155-189.

121. Tabita F. R. The biochemistry and metabolic regulation of carbon metabolism and CO2 fixation in purple bacteria // In: Anoxygenic photosynthetic bacteria / Blankenship R. E. et al. (Eds.). Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995. - P. 885-914.

122. Tabita F. R. Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a different perspective // Photosynth. Res. -1999. V. 60. - P. 1-28.

123. Tabita F. R., Gibson J. L., Bowien В., Dijkhuizen L., Meijer W. G. Uniform designation for genes of the Calvin-Benson-Bassham reductive pentose phosphate pathway of bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - V. 78. - № 2-3. - P. 107-110.

124. Tabita F. R., McFadden B. A. D-Ribulose 1,5-disphosphate carboxylase from Rhodospirillum rubrum II J. Biol. Chem. 1974. - V. 249. - № 11. - P. 3459-3464.

125. Tolli J., King G. M. Diversity and structure of bacterial chemolithotrophic communities in pine forest and agroecosystem soils // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - V. 71. -№12.-P. 8411-8418.

126. Uchino Y., Yokota A. «Green-like» and «red-like» RubisCO cbbL genes in Rhodobacter azotoformans II Mol. Biol. Evol. 2003. - V. 20. - № 5. - P. 821-830.

127. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. -1994. V. 10. - № 5. - P. 569-570.

128. Viale A. M., Arakaki A. K., Soncini F. C., Ferreyra R. G. Evolutionary relationships among eubacterial groups as inferred from GroEL (chaperonin) sequence comparisons // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - V. 44. - № 3. - P. 527-533.

129. Wagner M., Roger A. J., Flax J. L., Brusseau G. A., Stahl D. A. Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports an early origin of sulfate respiration // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - № 11. - P. 2975-2982.

130. Ward D. M., Weller R., Bateson M. M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in natural community // Nature. 1990. - V. 345. - P. 63-65.

131. Watson G. M. F., Tabita F. R. Regulation, unique gene organization, and unusual primary structure of carbon fixation genes from a marine phycoerythrin-containing cyanobacterium // Plant Mol. Biol. 1996. - V. 32. - № 6. - P. 1103-1115.

132. Watson G. M. F., Tabita F. R. Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for phylogenetic and enzymological investigation // FEMS Microbiol. Lett. 1997. - V. 146. - № 1. - P. 13-22.

133. Watson G. M. F., Yu J. P., Tabita F. R. Unusual ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase of anoxic archaea // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - № 5. - P. 1569-1575.

134. Won Y. J., Hallam S. J., O'Mullan G. D., Pan I. L., Buck K. R., Vrijenhoek R. C. Environmental acquisition of thiotrophic endosymbionts by deep-sea mussels of the genus Bathymodiolus II Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69. - № 11. - P. 67856792.

135. Wood A. P., Kelly D, P. Isolation and characterization of Thiobacillus thyasiris sp. nov., a novel marine facultative autotroph and the putative symbiont of Thyasira flexuosa II Arch. Microbiol. -1989. V. 152. - P. 160 -166.

136. Wood A. P., Kelly D. P. Reclassification of Thiobacillus thyasiris as Thiomicrospira thyasirae comb. nov. an organism exhibiting pleomorphism in response to environmental conditions // Arch. Microbiol. 1993. - V. 159. - P. 45 -47.

137. Wood H. G., Ljungdahl L. G. Autotrophic character of the acetogenic bacteria // In: Variations in autotrophic life / Shively J. M. a. Barton L. L. (Eds.). London: Academic Press, 1991.-P. 201-250.

138. Yang Z. Phylogenetic analysis by maximum likelihood (PAML). v. 3.0. London: University College London, 2000.

139. Yang Z., Nielsen R. Estimating synonymous and nonsynonymous substitution rates under realistic evolutionary models // Mol. Biol. Evol. 2000. - V. 17. - № 1. - P. 32-43.

Информация о работе

Спиридонова, Елизавета Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Выявление и филогенетический анализ генов, кодирующих большую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы формы I, у бактерий различных таксономических групп - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы