Про- и антиоксиданты как факторы формирования и регуляции симбиотических систем с участием прокариот

Сгибнев, Андрей Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Про- и антиоксиданты как факторы формирования и регуляции симбиотических систем с участием прокариот
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Про- и антиоксиданты как факторы формирования и регуляции симбиотических систем с участием прокариот"

На правах рукописи

СГИБНЕВ АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ПРО- И АНТИОКСИДАНТЫ КАК ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ И РЕГУЛЯЦИИ СИМБИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ С УЧАСТИЕМ ПРОКАРИОТ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 8 НОЯ 2013

Оренбург-2013

005539710

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН

Научный консультант: академик РАН и РАМН,

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

ГБОУ ВПО Оренбургская государствен- Красиков

ная медицинская академия Росздрава Сергей Иванович

Доктор биологических наук, доцент,

ГБОУ ВПО Тюменская государственная Тнмохина Та-

медицинская академия тьяна Харнтоновна

Доктор биологических наук, доцент,

ФГБУН Институт клеточного и внутри- Яценко-Степанова Та-клеточного симбиоза УрО РАН тьяна Николаевна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 19 декабря 2013 г. в S ч.-^мин. на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03 при ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, конференц-зал (аудитория № 205) тел.: (3532)40-35-62, факс: (3532)77-24-59, e-mail: orgma_dsl@esoo.ru, официальный сайт: http://orgma.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинскойрШсадемии Росздрава.

Автореферат разослан /Г г., автореферат и текст

объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор ¿^¿^¿¿¿^^у^ Немцева Наталия Вячеславовна

Актуальность проблемы

Рассматривая симбиоз в качестве формы существования организмов в биосфере, его по праву считают основой современного разнообразия форм жизни, положившего начало появлению эукари-от (Margulis, 2002). Появление эукариот связано с воздействием активных форм кислорода - побочных продуктов локального повышения концентрации кислорода в процессе фотосинтеза (Gross, Bhattacharya, 2010). Дополнением к этому служат материалы о том, что исходно эндосимбиотические предки митохондрий не могли ни импортировать белки, ни экспортировать АТФ, но, получая от клетки-хозяина пируват, обезвреживали токсичный для нуклеоци-топлазмы кислород (Kurland, Andersson, 2000). В последние годы получены новые доказательства роли кислорода в развитии современных спмбиотических систем - это симбиоз между жёлтопятни-стой амбистомой (Ambystoma maculatum) и микроскопической водорослью Oophila amblystomatis (Kerney et al., 2011), где водоросли, используя метаболиты животного, в процессе фотосинтеза вырабатывают кислород, необходимый для получения химической энергии митохондриями хозяина.

Появление около 3 миллиардов лет назад процессов оксиген-ного фотосинтеза (Buick, 2008) способствовало накоплению в биосфере кислорода (Farquhar et al., 2000), что, в свою очередь, повлекло ряд как благоприятных, так и неблагоприятных моментов для живых организмов.

С одной стороны, кислород стал причиной мощного эволюционного скачка, проявившегося как в появлении новых механизмов добывания энергии, так и появлении принципиально новых организмов - эукариот (Anbar, Knoll, 2002), с другой - участие кислорода в метаболизме способствовало формированию оксидатнвного стресса, который отражает существующий в биологических системах дисбаланс между образованием и детоксикацией легко возникающих активных форм кислорода (Sies, 1997).

концентрации вторичного мессенджера цГМФ под влиянием гид-роксильного радикала (Mittal, Murad, 1977) и пероксида водорода (White et al., 1976), образующихся из супероксиданиона. В настоящее время растет число работ, посвященных биорегуляторной роли про- и антиоксидантов в реакции организмов на различные медиаторы и факторы внешней среды (Torres, 2010, Mittler et al., 2011).

Возможность образования прооксидантов и антиоксидантов в биологических объектах известна (Commoner et al., 1954), и было показано, что прооксиданты, в частности, активные формы кислорода, будучи побочными продуктами аэробного метаболизма, являются важнейшей причиной повреждений в клетке (Harman, 1981), а открытие фермента-антиоксиданта - супероксиддисмутазы (McCord, Fridovich, 1969) подтвердило их важную регуляторную роль в биологии.

Оксидативный стресс, его причины и последствия чаще всего рассматриваются применительно к отдельным клеткам, тканям и органам многоклеточных (Владимиров, 2009). Понятие оксидатив-ного стресса, по всей вероятности, применимо и для сообществ: например, продукция активных форм кислорода - распространенное явление в водных экосистемах, а окислительный стресс является важным компонентом реакции организмов на изменения условий окружающей среды (Lesser, 2006).

... В то же время остается открытым вопрос о биологической роли про- и антиоксидантов в межклеточных и межвидовых взаимоотношениях, в частности их участии в процессах формирования симбиотических отношений между прокариотами и другими организмами.

А между тем, именно эти симбиотические взаимоотношения прокариот с многоклеточным организмом имеют существенное значение, получив в последнее время поддержку с появлением новой концепции в симбиологии - ассоциативного симбиоза (Бухарин и др., 2007).

Рассмотрение инфекции в качестве модельной системы ассоциативного симбиоза определило «инфектологическое поле» как пригодное для изучения регуляторной функции про- и антиоксидантов в симбиотической системе «паразит — хозяин», обозначив новые перспективы в управлении инфекционным процессом (Бухарин и др., 2011).

Именно эти моменты и определили цель и задачи нашей работы.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является характеристика роли про- и ан-тиоксидантов, продуцируемых микроорганизмами, в формировании и регуляции симбиозов с участием прокариот.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение спектра метаболитов с про- и антиоксидантным действием, продуцируемых микрофлорой, установление распространенности и выраженности продукции этих веществ бактериями, определение факторов среды, регулирующих их синтез (на примере вагинального биотопа).

2. Исследование связи уровней про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием биотопа хозяина.

3. Характеристика влияния про- и антиоксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал (адгезивные характеристики, способность к биопленкообразованию, гидрофобность клеточной поверхности, ка-талазную, лизоцимную и антилизоцимную активности).

4. Определение влияния микробных про- и антиоксидантов на чувствительность бактерий к факторам микробного антагонизма и врожденного иммунитета макроорганизма.

5. Изучение возможности усиления антагонистической активности пероксидпродуцирующих доминантов путем подавления антиоксидантной защиты бактерий-ассоциантов и/или стимуляции образования из пероксида водорода активных форм кислорода с высокой реакционной способностью.

Научная новизна

Установлена роль про- и антиоксидантов в обеспечении стабильного существования и функционирования симбиотических систем, включающих генотипически разнородные элементы. Показано, что изменение баланса продукции про- и антиоксидантов возникает как реакция микросимбионтов на внешние воздействия, через модификацию биологических свойств симбионтов, определяя стабильность сообщества в целом.

Изучен спектр метаболитов с про- и антиоксидантным дей-

ствием (на примере вагинальной микрофлоры), установлены распространенность и выраженность продукции про- и антиоксидантов бактериями, определены факторы среды, регулирующие их синтез.

Синхронные высокие уровни продукции про- и антиоксидантов являются характерным признаком эубиоза, а дисбиотические состояния сопровождаются смещением баланса про- и антиоксидантов.

Обнаружена способность бактерий защищать другие микросимбионты от бактерицидного действия гидроксильных радикалов, образующихся в реакции Фентона (Патент РФ № 2279079). Механизмом, определяющим этот эффект являются способность бактерий окислять Ре2+ в Бе3", что препятствует образованию гидроксильных радикалов в реакции Фентона, и продукция веществ, обладающих антиоксидантными свойствами - внеклеточных полисахаридов, пигментов и липидсодержащих соединений.

Выявлено наличие у микроорганизмов механизмов, запускающих при недостатке Ре2+ работу клеточных систем, синтезирующих метаболиты, инактивирующие гидроксильные радикалы или препятствующие их образованию в реакции Фентона.

Установлен механизм поддержания стабильности микробных биоценозов, основанный на синергидном эффекте факторов врожденного иммунитета хозяина и активных форм кислорода, продуцируемых нормальной микрофлорой. Показано, что антагонистический эффект лактобацилл, обусловленный продукцией пероксида водорода, усиливается метаболитами бактерий с прооксидантным действием, направленным на ингибирование ферментов антиокислительной системы и восстановление железа.

Выявлены дозозависимые эффекты изменения поверхностных свойств бактериальных клеток под влиянием продуцируемых нормальной микрофлорой активных форм кислорода, заключающиеся в снижении гидрофобности и адгезивности бактерий, уменьшении их способности сорбировать белки, модификации уровня биопленко-образования. Пероксидпродуцирующие микроорганизмы оказывают регулирующее влияние на характер взаимодействия бактерий с колонизируемыми ими поверхностями за счет продукции активных форм кислорода, определяя структурно-функциональное состояние микробных биоценозов.

На примере антилизоцимной и каталазной активностей бактерий обнаружено изменение гетерогенности бактериальных популя-

ций по указанным признакам в результате воздействия про- и анти-оксидантов бактериального происхождения.

Разработан новый подход к усилению бактерицидной эффективности пероксидпродуцирующих микроорганизмов, заключающийся в подавлении антиоксидантной защиты клетки и стимуляции образования из пероксида водорода гидроксильных радикалов и ги-пойодида - мощных антибактериальных агентов, не вызывающих к ним резистентность у микроорганизмов.

Теоретическая и практическая значимость

Получены новые данные, расширяющие представления о механизмах симбиотических взаимоотношений, обеспечивающих стабильное состояние симбиоза за счет изменения в нем баланса продукции про-и антиоксидантов.

Практическая ценность работы характеризуется возможностью создания препаратов и технологий для терапии и профилактики инфекций человека и животных, а также контроля за санитарным состоянием среды обитания. Определены принципы создания оптимальных условий для генерации гидроксильных радикалов путем подбора соответствующих концентраций ионов железа.

На основании полученных данных о чувствительности микроорганизмов к гидроксильным радикалам предложены «Способ дезинфекции объектов окружающей среды» (Патент РФ № 23221426) и инновационная разработка «Технология контроля численности нежелательных микроорганизмов», удостоенная серебряной медали VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008).

Результаты работы по усилению бактерицидного эффекта пероксида водорода пероксидазой хрена и йодидом калия позволяют повысить эффективность применения пробиотиков, содержащих пероксидпродуцирующие микроорганизмы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Баланс про- и антиоксидантов в симбиотических системах с участием прокариот - инфектологический феномен, обеспечивающий регуляцию и поддержание стабильности биоценоза за счет модификации биологических свойств симбионтов и создаю-

щий препятствия колонизации биотопа аллохтонными микроорганизмами.

2. Потенцирование метаболитами пероксидпродуцирующих микроорганизмов бактерицидного эффекта факторов врожденного иммунитета хозяина является одним из механизмов формирования стабильного микробного биоценоза человека, связанным со способностью нормальной микрофлоры регулировать функции биологически активных молекул макроорганизма.

3. Пероксидпродуцирующие микроорганизмы определяют механизм защиты биотопа, связанный с дифференцированным влиянием пероксида водорода на факторы колонизации автохтонных и аллохтонных микроорганизмов (адгезия и гидрофобность) и изменением их адаптивного потенциала (антилизоцимной и каталазной активностей и способности к биопленкообразованию).

4. Изменения в балансе продукции про- и антиоксидантов -биологическая основа регуляции гомеостаза симбиотической системы, где выявленные закономерности реакций симбионтов на эти изменения открывают возможности управления исходом микробиоценоза.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на: IV - VII России-.....

ских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2003, 2006, 2009, 2012; Российской научной конференции «Репродуктивное здоровье населения» г. Оренбург, 2005; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», г. Москва, 2004; Конференции «Фундаментальные науки - медицине» по программе фундаментальных исследований Президиума РАН, г. Москва, 2004; «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», г.Москва, 2006, 2009, IV Международной научной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», г. С-Петербург, 2008.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 13 -в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, получено 3 патента РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 220 страницах и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 50 отечественных и 250 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 12 таблицами и 35 рисунками.

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН в соответствии с планом научно-исследовательской работы: тема «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека», № гос. регистрации 01.2.00 104756; проект «Межбактериальные взаимодействия и их роль в формировании микробных биоценозов тела человека» по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки -медицине»; тема «Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в различных биологических системах», № гос. регистрации 0120.0 600145, программы инициативных фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-У-4-1023 и программы Президиума РАН №5 «Фундаментальные науки - медицине», проект № 12-П-4-1015.

Материалы и методы исследования

Для изучения спектра, распространенности и выраженности метаболитов с про- и антиоксидантным действием использовали 522 штамма микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 220 женщин, проходивших обследование в Областном центре планирования семьи и репродукции г. Оренбурга (гл. врач М.Г. Шухман). Выделенные штаммы идентифицировали общепринятыми методами на основании морфологических, тинкто-риальных, культуральных и биохимических свойств (Берджи, 1997).

Наличие метаболитов с прооксидантными (пероксида водорода, супероксиданиона, гидроксильных радикалов, ингибиторов ка-талазы, железовосстанавливающей способности) и антиоксидант-ными (общей антиоксидантной активности, каталазной активности, способности инактивировать гидроксильные радикалы и снижать их бактерицидность, железоокисляющей способности) свойствами определяли в фильтратах культуральных жидкостей исследуемых

микроорганизмов.

Концентрацию образующегося пероксида водорода у микроорганизмов определяли по окислению раствора тетраметилбензидина (ТМБ) пероксидом в присутствии пероксидазы хрена (Wilks М. et al., 2004) и выражали в миллимолях (мМ).

Образование супероксиданиона определяли по восстановлению нитросинего тетразолия хлорида в формазан (Auclair, Voisin, 1985). Содержание гидроксильных радикалов оценивали по ранее описанному методу с использованием раствора бриллиантового зеленого (Не et al, 2004).

Способность ингибировать каталазу определяли по снижению уровня каталазной активности тест-штамма Staphylococcus aureus АТСС 6538Р (Бухарин и др., 2002) и выражали в процентах подавления.

Способность восстановления или окисления ионов железа определяли согласно рекомендациям (ГОСТ 4011-72, Вода питьевая..., 2003) с использованием сульфосалициловой кислоты, выражали в мкг/мл.

Общую антиоксидантную активность определяли с использованием 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозила (ДФПГ), в качестве положительного контроля использовали Тролокс™ (Brand-Williams et al., 1995) и выражали в условных единицах (у.е.). Каталазную активность внеклеточных метаболитов бактерий исследовали по описанному методу (Бухарин и др., 2002), активность выражали в мМ*мин/мг белка.

Для выяснения природы веществ, ответственных за антиоксидантную активность культуральные жидкости делили на фракции -внеклеточные полисахариды осаждали согласно рекомендациям (Кочетков и др., 1967), липиды и пигменты извлекались смесью гексан : изопропанол в соотношении 3:2 и ацетоном как описано ранее (Modern Experimental Biochemistry..., 2000).

Для оценки влияния факторов среды на способность микроорганизмов продуцировать про- и антиоксиданты использовали добавляемые в виде индивидуальных веществ до конечной концентрации 1мкМ/мл среды оксикислоты (лактат, цитрат сукцинат), летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая и масляная), гемсодержа-щие соединения (гемоглобин, гемин, каталаза), восстановители (ли-копин, лютеин, ¡З-каротин, аскорбат), амины (триметиламин, эти-лендиамин, спермин), пероксид водорода, этанол, глюкозу, фруктозу,

ионы железа и марганца.

При исследовании связи уровней про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием биотопа использовали 210 штаммов микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 116 женщин, находившихся на обследовании обследование в Областном центре планирования семьи и репродукции г. Оренбурга. Женщины были разделены на 2 группы: 63 с эубиозом влагалища и 53 - с дисбиозом. Для оценки микроэкологического состояния вагинального биотопа использовали критерии, предложенные Соколовой с соавторами (1988).

Антилизоцимную (АЛА) активность микроорганизмов, способность ингибировать каталазу изучали по описанным методам (Бухарин и др., 1999).

Ферментативную активность лизоцима определяли по скорости лизиса ацетонированного порошка M.luteus (Бухарин и др., 1999). Изучение адгезивных свойств микроорганизмов проводили по методике В.И. Брилис с соавт. (1986) с использованием фиксированных эритроцитов человека 0 (I) группы Rh (+). В качестве показателя адгезивности определяли индекс адгезии микроорганизмов (ИАМ) - среднее количество микробных клеток на одном эритроците, участвующем в адгезивном процессе.

Способность бактерий образовывать биопленки изучали по количеству связанного кристаллического фиолетового (O'Toole et al., 1999) в 96-луночных полистироловых планшетах, меченных коллагеном из фибробластов человека согласно рекомендациям (Егоров и др., 1991) и выражали в условных единицах (у.е.).

Влияние на выживаемость бактерий факторов врожденного иммунитета (лизоцим, лактоферрин и антимикробный белок тромбоцитов), пероксида водорода, гидроксильных радикалов, суперна-тантов пероксидпродуцирующих лактобацилл определяли путем высева серийных разведений бактериальных суспензий на агаризо-ванные среды (American Society for Microbiology, 2003) и выражали в КОЕ/мл.

Антимикробный белок тромбоцитов получали согласно ранее описанной методике из тромбоцитов человека (Бухарин и др., 2000). Концентрацию белка в культуральных жидкостях исследуемых микроорганизмов, препаратах лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов определяли по Лоури (1951) и выража-

ли в мг общего белка.

При статистической обработке полученных результатов проверка нормальности распределения данных проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовался критерий Манна-Уитни. Для сравнения частот встречаемости использовали критерий согласия Пирсона (%2). Исследование взаимосвязи между признаками осуществляли при помощи коэффициента корреляции Спирмена (г) (Гланц, 2004). В качестве минимально допустимого использовали уровень значимости р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе работы нами были изучены спектр, распространенность и выраженность про- и антиоксидантов во внеклеточных метаболитах микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 220 женщин. Для этого исследовали 522 культуры микроорганизмов - 175 штаммов лактобацилл, 27 - аэрококков, 65 -стрептококков, 141 - коринебактерий, 23 — микрококков и 91 - коагулазоотрицательных стафилококков. В фильтратах куль-туральных жидкостей исследуемых микроорганизмов определяли наличие прооксидантов и антиоксидантнов согласно описанным выше методикам.

Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с прооксидантным действием у микроорганизмов, выделенных из н имен его отдела женского репродуктивного тракта

При изучении способности исследуемых микроорганизмов продуцировать пероксид водорода было установлено, что это свойство было характерно только для представителей 3 родов бактерий, выделенных из женского репродуктивного тракта: Lactobacillus, Streptococcus и Aerococcus.

Отмечено, что частота встречаемости микроорганизмов, образующих пероксид водорода, выше при нормальном состоянии биотопа, чем при микроэкологических нарушениях (Рис. 1).

Так, среди 107 штаммов лактобацилл, выделенных при эубио-зе, пероксид водорода продуцировали 78% штаммов, а из 68 куль-

тур, выделенных при дисбиозе - лишь 25%.

Из 16 штаммов аэрококков, выделенных при эубиозе, перок-сид водорода выделяли 87%, и только 27% из 11 штаммов из биотопов с дисбиозом. Что касается стрептококков, из 33 выделенных при эубиозе были способны продуцировать пероксид водорода 57% культур, из 32 штаммов, изолированных при дисбиозе - 34 %.

100 80 60 40 20 о

___1 rh

-1-

1 1 t

Оэубиоз Идисбиоз

Lactobacilius

Streptococcus

Aerococcus

Рис. 1. Частота встречаемости Н202-продуцирующих микроорганизмов при эубиозе и дисбиотических нарушениях.

Принимая во внимание полученные данные о высокой распространенности при эубиозе пероксидпродуцирующих лактобацилл в сочетании с их численным доминированием в вагинальном биотопе, мы посчитали необходимым исследовать выраженность перок-сидпродукции у исследуемых микроорганизмов.

Почти половина штаммов лактобацилл, выделенных при эубиозе, - 49%, продуцировала пероксид водорода в диапазоне концентраций 3,0-4,5 мМ, 33,7% - от 4,5 до 6 мМ, 3,5% - 6 - 7,5 мМ и 14% -1,5-3 мМ. Лактобациллы, выделенные при дисбиозе продуцировали пероксид водорода в заметно меньших концентрациях: 47% до 1,5 мМ и 53% - от 1,5 до 3 мМ (Рис. 2).

При этом у лактобацилл, выделенных при эубиозе, наблюдались высокие среднепопуляционные значения продукции ими пе-роксида водорода - 4,4±0,7 мМ, тогда как при дисбиозе - 1,5±0,3

мМ (р<0,01).

В отличие от лактобацилл, количество пероксида водорода, образуемого стрептококками и аэрококками, выделенными при эубиозе, было значительно меньше и составило 1,3±0,3 и 1,7+0,2 мМ, соответственно. Стрептококки и аэрококки, выделенные при дисбиозе, образовывали соответственно 0,4±0,3 и 0,5±0,3 мМ пероксида водорода.

ь о о 5 о

га —

а у-

о ш

то h-О

1 «ж ш Wi 1 К; Ш Г rh

Из Й

г-1

Оэубиоз Идисбиоз

0,0<х<1,5 1,5<х<3,0 3,0<х<4,5 4,5<х<6,0 6,0<х<7,5 диапазон концентраций Н202, мКЛ

Рис. 2. Разнообразие Н202-продуцирующих Lactobacillus spp. при эубиозе и дисбиозе.

Супероксиданион и гидроксильные радикалы в культуральной среде всех изученных бактерий не были обнаружены, вероятной причиной этому является короткий период существования этих активных форм кислорода (Imlay, 2003).

Таким образом, в противоположность дисбиотическому состоянию, наличие в вагинальном биотопе микроорганизмов с относительно высоким уровнем продукции пероксида водорода было характерной чертой эубиоза. Показанная ранее важная роль пероксида водорода в регуляции потоков энергии и углерода в бактериальном планктонном сообществе (Baltar et al., 2013) позволяет предположить его участие в подобных процессах и в организме человека, в частности в вагинальном биотопе женщин.

На следующем этапе исследования была определена способность изучаемых микроорганизмов ингибировать каталазу тест-штамма Staphylococcus aureus АТСС 6538Р (Рис. 3).

Как и в случае с продукцией пероксида водорода, распространенность способности ингибировать каталазу у микроорганизмов, выделенных при эубиозе, была выше, чем при дисбиотических нарушениях. Так, выделенные из биотопов с нормальным микроэкологическим статусом Lactobacillus spp. ингибировали каталазу в 94% случаев, Streptococcus spp. - 80%, Aerococcus spp. - 13,4%, Corynebacterium spp. - 98%, Micrococcus spp. - 87%, коагулазоотри-цательные стафилококки - 94%. Среди микроорганизмов, выделенных при дисбиозе, частота ингибирования каталазы была существенно ниже: у Lactobacillus spp. - в 14%, Streptococcus spp. - 21%, Aerococcus spp. - 8,5%, Corynebacterium spp. - 43%, Micrococcus spp. - 57% и коагулазоотрицательных стафилококков - в 34% случаев.

КОС

Micrococcus spp.

Corynebacterium spp.

Aerococcus spp.

Streptococcus spp.

Lactobacillus spp.

0 50 100

частота встречаемости, %

Одисбиоз □ эубиоз

Рис. 3. Частота встречаемости микроорганизмов, способных ингибировать бактериальную каталазу при эубиозе и дисбиотических нарушениях.

Широко распространенный эффект ингибирования каталазы S. aureus метаболитами нормальной микрофлоры можно рассматривать как один из возможных механизмов, определяющих стабильность эубиоза за счет усиления бактерицидного эффекта перок-сидпродуцирующий микрофлоры, так как снижение уровня антиок-

сидантной защиты микроорганизмов при воздействии бактериальных ингибиторов каталазы увеличивает повреждающий эффект пе-роксида водорода (Бухарин и др., 2002).

Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с антиоксидантним действием у микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела женского репродуктивного тракта

На следующем этапе работы мы изучили способность исследуемых микроорганизмов, выделенных из женского репродуктивного тракта, синтезировать метаболиты с антиоксидантным эффектом.

Одним из проявлений такой способности стало снижение бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов, образующихся в реакции Фентона. Среди культур Lactobacillus spp., выделенных при эубиозе, такой способностью обладали 47 %, Corynebacterium spp. -86%, Micrococcus spp. - 56%, Streptococcus spp. - 52%, Aerococcus spp. - 29%, и среди коагулазоотрицательных стафилококков - 88,2% (Рис. 4).

КОС

Micrococcus spp.

Corynebacterium spp.

Aerococcus spp.

Streptococcus spp.

Lactobacillus spp.

Ндисбиоз Оэубиоз

100

частота встречаемости, %

Рис. 4. Распространенность защитного действия бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов у микроорганизмов при эубиозе и дисбиозе.

Микроорганизмы, выделенные при дисбиозе, в меньшей сте-

пени снижали бактерицидный эффект гидроксильных радикалов: Lactobacillus spp. - 14%, Streptococcus spp. - 21%, Aerococcus spp. -27%, Corynebacterium spp. - 65%, Micrococcus spp. - 34% и коагула-зоотрицательные стафилококки - в 46% случаев.

Уменьшение бактерицидной активности гидроксильных радикалов определялось падением их концентрации, о чем свидетельствовало полное отсутствие продуктов реакции гидроксильных радикалов с бриллиантовым зеленым.

Исследование общей антиоксидантной активности (ОАА) культуральных жидкостей исследуемых микроорганизмов с использованием ДФПГ показало, что спосособность бактериальных метаболитов снижать бактерицидную активность гидроксильных радикалов прямо зависит от их антиоксидантной активности. Так, Lactobacillus spp., снижающие бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, синтезировали метаболиты с общей антиоксидантной активностью 8,6±1,4 у.е., тогда как штаммы не обладающие такой способностью - 1,8±0,3 у.е. (р<0,01), Corynebacterium spp. - 12,1±1,1 и 3,7±0,6 у.е. (р<0,01), Micrococcus spp. - 4,8±0,2 и 2,8±0,5 у.е. (р<0,05), Streptococcus spp. - 5,5±0,4 и 1,1 ±0,3 у.е. (р<0,05), Aerococcus spp. - 5,8±0,7 и 1,6±0,4 у.е. (р<0,01) и среди коагулазоотрица-тельных стафилококков - 6,9±1,1 и 3,8±0,3 у.е. (р=0,07), соответственно.

Для выяснения природы веществ, ответственных за антиоксидантную активность культуральные жидкости делили на фракции -внеклеточные полисахариды, липиды и пигменты и определяли способность этих фракций снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, одновременно с этим определяя у исследуемых бактерий способность окислять ионы железа (II) в ионы железа (III) и каталазную активность.

Результаты этих исследований суммированы в таблице 1, из которой видно, что для большинства исследуемых микроорганизмов характерно одновременное присутствие нескольких механизмов снижения бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов (Табл.1).

Так, способность окислять железо встречалось у 16,7 % исследуемых лактобацилл, 63,2 % - коринебактерий, 37,5 % - микрококков и 60 % - КОС. Среди лактобацилл и коринебактерий отмечена высокая частота встречаемости продукции полисахаридов - 100 и 57,9%, соответственно, а все изученные КОС и микрококки синте-

зировали пигменты.

Протективное действие бактериальных метаболитов от гид-роксильных радикалов по отношению к микроорганизмам сопровождалось, в ряде случаев, способностью бактерий окислять ионы железа (II) в ионы железа (1П), тем самым предотвращая их участие в реакции Фентона (Прайер, 1970).

Таблица 1 - Механизмы защитного действия бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов.

Бактерии N Окисление Ре2+ в Бе3+ Внеклеточно секретируемые

липиды пигменты полисахариды

п частота % п частота % п частота % п частота %

Lactobacillus spp. 12 2 16,7 1 8,3 0 0 12 100

Corynebacterium spp. 19 12 63,2 14 73,7 3 15,8 11 57,9

Micrococcus spp. 8 3 37,5 7 87,5 8 100 1 12,5

КОС 15 9 60 10 66,7 15 100 2 13,3

С другой стороны, бактерии выделяли в окружающую среду большое количество метаболитов (полисахариды, липиды и пигменты), выделенные индивидуальные фракции которых реагировали с уже образовавшимися гидроксильными радикалами. Снижение бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов определялось концентрацией этих веществ - ловушек радикалов.

В случае коагулазоотрицательных стафилококков в среде культивирования обнаруживались незначительные уровни каталаз-ной активности - 0,2 - 0,7 мМ/мин*мг белка. Мы полагаем, что даже такое небольшое количество этого антиоксидантного фермента, разлагающего пероксид водорода, достаточно для эффективного предотвращения образования гидроксильных радикалов. Следует также отметить, что у большинства изученных бактерий способность снижать бактерицидность гидроксильных радикалов осуществляется при помощи двух и более механизмов.

Таким образом, защитное действие бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов обеспе-

чивается продукцией микроорганизмами веществ инактивирующих их или препятствующих их образованию.

Изучение влияния факторов среды па способность микроорганизмов продуцировать про- и антиоксиданты

На следующем этапе исследования была предпринята попытка изучения влияния факторов среды на способность лактобацилл продуцировать пероксид водорода и общую антиоксидантную активность. В качестве таких факторов мы использовали добавляемые в виде индивидуальных веществ до конечной концентрации 1мкМ/мл среды оксикислоты (лактат, цитрат сукцинат), летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая и масляная), гемсодержащие соединения (гемоглобин, гемин, каталаза), восстановители (ликопин, люте-ин, р-каротин, аскорбат), амины (триметиламин, этилендиамин, спермин), пероксид водорода, этанол, глюкозу, фруктозу, ионы железа и марганца.

Полученные результаты показали, что ряд веществ оказывал стимулирующее влияние на продукцию пероксида водорода лакто-бациллами (Рис.5). Продукция пероксида по сравнению с контролем (3,4±0,8 мМ) под влиянием лактата увеличивалась до 5,4±0,3 мМ, сукцината - 4,9±0,5 мМ, цитрата - 4,3±0,5 мМ, Р-каротина - 4,3±0,7 мМ, ликопина - 4,3±0,3 мМ, аскорбата - 4,1±0,7 мМ, лютеина -4,0±0,4 мМ, этанола - 3,8±0,1 мМ, фруктозы - 3,5±0,1 мМ и глюкозы - 3,5±0,2 мМ. Напротив, добавление к культуре-продуценту ацетата приводило к угнетению пероксидпродукции до 1,9±0,13 мМ, пропи-оната - 1,62±0,11 мМ, этилендиамина - 1,17±0,08 мМ, триметилами-на -1,16±0,08 мМ, бутирата - 1,13±0,08 мМ, пероксида водорода -0,98±0,07 мМ, спермина - 0,72±0,05 мМ, гемина - 0,28±0,02 мМ, гемоглобина - 0,25±0,02 мМ, каталазы - 0,21±0,01 мМ, ионов железа (III) и марганца (II) - 0,32±0,02 и 1,2±0,08 мМ, соответственно.

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что продукция пероксида водорода лактобациллами стимулируется оксикислотами, такими как лактат, сукцинат и цитрат, наличие которых характерно для состояния эубиоза в нижнем отделе женского репродуктивного тракта (Черкасов, 2008).

-100 -80

-40 -20 0 20 40 отклонение от контроля, %

100

[встимуляция Шугнетение |

Рис. 5. Влияние различных факторов среды на продукцию перокси-да водорода лактобациллами.

-40 -20 0 20 отклонение от контроля, %

100

|ЕЗстимуляциз Иингибирование

Рис. 6. Влияние различных факторов среды на продукцию антиоксид антов лактобациллами.

Напротив, гемсодержащие соединения (гемоглобин, гемин и каталаза), ионы железа и марганца существенно снижали продукцию пероксида. Особенно важным представляется тот факт, что вещества, присутствующие в биотопе при дисбиотических нарушениях - амины (триметиламин, этилендиамин, спермин) и летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая и масляная) также угнетают продукцию пероксида.

При изучении влияния факторов среды на общую антиоксидантную активность лактобацилл (Рис.6) было установлено, что по сравнению с контролем (12,8±0,9 у.е) пероксид водорода стимулировал ОАА до 22,Ш,5 у.е., лактат - 18,9±1,1 у.е., ионы железа (III) - 18,2±1,6 у.е., цитрат 14,5±0,3 у.е.. Напротив, добавление к продуценту спермина снижало ОАА до 6,4±0,7, пропионата - 6,3±0,7, эти-лендиамина - 6,0±0,8, триметиламина - 5,9±0,6, этанола -5,7±0,4, бутирата -5,4±0,5, ионов марганца (П) - 5,2±0,7, лютеина -5,0±0,3, аскорбата -4,1±0,3 у.е.

Проведенное исследование позволило установить, что продукция антиоксидантов стимулируется факторами среды, наличие которых ассоциировано с состоянием эубиоза в женском репродуктивном тракте, такими как пероксид водорода и лактат (Черкасов, 2008).

Все это позволяет заключить, что продукция про- и антиоксидантов в микробном сообществе в немалой степени определяется окружением. Особый интерес вызывают полученные данные о стимуляции продукции пероксида водорода антиоксидантами растительного происхождения ф-каротин, ликопин, лютеин, аскорбат) и этанолом: вероятно эти вещества предохраняют продуцента от сво-боднорадикального повреждения (Владимиров, 2009) и, по-видимому, могут быть перспективны для применения в пробиоти-ческих препаратах, содержащих пероксидпродуцирующие бактерии.

Изучение связи уровня про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием вагинального биотопа

Принимая во внимание высокую встречаемость и выраженность продукции про- и антиоксидантов микроорганизмами, выделенными из репродуктивного тракта женщин с нормальным состоя-

ниєм микробиоценоза, была предпринята попытка изучить информативность наличия этих веществ для оценки микроэкологического

состояния биотопа.

Для этой цели был осуществлен анализ данных, полученных при определении способности продуцировать про- и антиоксидан-тов у 210 микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 116 женщин, находившихся на обследовании в Областном центре планирования семьи и репродукции, разделенных с использованием критериев, предложенных Соколовой с соавторами (1988), на 2 группы: 63 с эубиозом влагалища и 53 - с дисбио-зом. У всех выделенных микроорганизмов определяли наличие способности к продукции пероксида, ингибиторов каталазы, снижению бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов и общую антиоксидантную активность с использованием описанных выше методик.

В результате исследования установлено, что уровень продукции пероксида водорода лактобациллами, выделенными от женщин с эубиозом влагалища находился в диапазоне 1,5±0,3 - 6,4±0,7 мМ и был существенно выше чем при дисбиозе - 0,4±0,1 - 2,1±0,4 мМ (1X0,01).

Способность ингибировать каталазу S. aureus у микроорганизмов, выделенных при эубиозе встречалась в 36-94% случаев, тогда как при дисбиозе - в 8-43% (р<0,01).

Снижение бактерицидного действия гидроксильных радикалов внеклеточными метаболитами у микроорганизмов, выделенных при эубиозе встречалось в 59-96% случаев, при дисбиозе - 14-46% (р<0,01).

Уровень общей антиоксиданти ой активности у микроорганизмов, выделенных при эубиозе составлял 4,8±0,5 - 9,7±0,4 у.е., тогда как при дисбиозе - 1,8±0,2 - 3,9±0,8 у.е. (р<0,01).

В итоге применения неоднородной последовательной процедуры распознавания было выяснено, что исследуемые биотопы можно дифференцировать на 2 группы (эубиоз и дисбиоз) в зависимости от активности в них продуцентов про- и антиоксидантов. Наиболее значимыми признаками микроорганизмов, определяющими состояние биотопа в порядке убывания являются: продукция лактобациллами пероксида водорода в концентрации более 1,8 мМ, синтез ингибиторов каталазы, образование веществ, снижающих бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, одновременное

присутствие в вагинальном биотопе двух и более штаммов, продуцирующих прооксиданты или антиоксиданты.

Одновременное присутствие в биотопе микроорганизмов с высоким уровнем продукции про- и антиоксидантов являлось признаком эубиоза, а дисбиотические состояния сопровождались смещением баланса про- и антиоксидантов (Рис.7).

При анализе результатов выяснено, что состоянию эубиоза и дисбиоза присущи свои соотношения уровней продукции про- и антиоксидантов. Так, для биотопов с эубиозом была характерна продукция антиоксидантов в диапазоне 3,65 - 9,8 у.е. при среднем значении 7,8±0,18 у.е., а для биотопов с дисбиозом диапазон был шире - 0,1 - 9,5 у.е. и в средний уровень составил 2,2±0.31 у.е. (р<0,05). Среднее значение уровня продукции прооксидантов в биотопах с эубиозом было выше, чем при дисбиозе: 7,7±0,17 против 1,8±0,2 у.е. (р<0,01), а диапазон соответственно составлял 4,9-9,9 и 0,16-6,5 у.е..

В целом следует отметить, что соотношение уровней антиоксидантов к прооксидантам при эубиозе составляло в среднем 1,03±0,2 у.е., тогда как при дисбиозе 4,2±0,9 у.е. (р<0,01).

ш о ь х

(В

О —

С >;

ЬЙ

О. с

10 -

в . в

продукция антиоксидантов (у.е.)

О эубиоз • дисбиоз

Рис. 7. Связь между состоянием микробиоценоза и продукцией микроорганизмами про-и антиоксидантов.

Следует заключить, что для биотопов с эубиозом характерно наличие микроорганизмов с высокими уровнями продукции и прооксидантов и антиоксидантов, а их соотношение близко к единице,

тогда как для дисбиоза характерно превышенное соотношение ан-тиоксидантов над прооксидантами. Все это свидетельствует о том, что баланс про- и антиоксидантов обеспечивает регуляцию и поддержание стабильности биоценоза.

Таким образом, полученные сведения о связи уровня про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием вагинального биотопа свидетельствуют о важной роли этих веществ в поддержании гомеостаза биотопа.

Изучение влияния микробных про- и антиоксидантов на чувствительность бактерий к факторам микробного антагонизма и врожденного иммунитета

Ранее нами было показано, что метаболиты представителей нормальной микрофлоры способны снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов и, одновременно с этим, ингибировать каталазу бактерий. Однако до настоящего времени не описаны эффекты сочетанного действия метаболитов Н202-продуцирующих лактобацилл и коринебактерий на выживаемость бактерий, тогда как получение таких данных позволило бы расширить представле-1 ния о роли ассоциативных микроорганизмов в реализации домини-[ рующей микрофлорой антагонистического потенциала. В связи с этим, мы изучили влияние метаболитов Corynebacterium minutissi-тит, обладающей одновременной способностью ингибировать ка, талазу и уменьшать бактерицидный эффект гидроксильных радика-1 лов, на проявление антагонистической активности Н202-I продуцирующих лактобацилл в отношении S. aureus и L. acidophy-lus (Рис. 8, 9).

Влияние метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на выживаемость каталазопозитивного S. aureus было незначительно (Рис. 8): с увеличением в метаболитах лактобацилл концентрации пероксида водорода с 0,14±0,02 до 1,78±0,09 мМ количество выживших клеток тест-штамма уменьшалось с 5,6±0,55 по 4,6±0,43 lg КОЕ/мл.

Обработка метаболитами коринебактерии угнетала каталазную I активность стафилококка, это приводило к существенному снижению количества жизнеспособных клеток S. aureus с 5,6±0,39 до

1,54±0,11 lg КОЕ/мл при использовании тех же концентраций Н20? (Рис. 8).

■I ""— — | — 11

0.14+0.02 0.69+0.05 1.27±0.07 1.78+0.09 концентрация Н202, мМ

Рис.8. Влияние внеклеточных метаболитов коринебактерий и Н202-продуцирующих лактобацилл на выживаемость S. aureus.

0.1410.02 0.69+0.05 1.27+0.07 1.78±0.09 концентрация Н202, мМ

Рис.9. Влияние внеклеточных метаболитов коринебактерий и Н202 продуцирующих лактобацилл на выживаемость L. acidophylus.

Бактерицидный эффект метаболитов лактобацилл наиболее ярко проявлялся в отношении каталазонегативного Ь. а^орИу1ш (Рис. 9): по мере увеличения содержания пероксида водорода ПМО штамма снижался с 5,8±0,6 КОЕ/мл в контроле до 0,56±0,06 Ig КОЕ/мл при концентрации Н202 1,78±0,09 мМ. Обработка метаболитами коринебактерий клеток Ь. ас1(1орКу1из значительно снижала наблюдаемый ранее выраженный бактерицидный эффект метаболитов лактобацилл (Рис. 9), так при концентрации Н202 1,78±0,09 мМ ПМО составлял 4,6±0,34 КОЕ/мл, тогда как в контроле - 5,7±0,44 ^ КОЕ/мл.

Таким образом, выявленные закономерности разнонаправленного влияния метаболитов коринебактерий на чувствительность представителей нормальной микрофлоры и условнопатогенных бактерий к метаболитам пероксидпродуцирующих лактобацилл свидетельствуют о существовании механизмов, определяющих формирование и стабильное существование многокомпонентных симбиоти-ческих систем, обусловленных продукцией про- и антиоксидантов участниками симбиозов.

Ограниченный бактерицидный эффект пероксида водорода определяется тем, что его низкая реакционная способность (1_лп1еу е1 а!., 2012) в сочетании с широкой распространенностью и высокой активностью каталазы (1т1ау, 2003) не влечет за собой выраженного повреждающего действия.

Стабильность вагинального микросимбиоза, проявляющаяся в относительном постоянстве численности и видового состава бактерий, предполагает наличие механизмов защиты биотопа, связанных с взаимодействием факторов местного иммунитета и антимикробных метаболитов представителей нормальной микрофлоры. Поэтому в последующем мы изучили влияние метаболитов пероксидпродуцирующих микроорганизмов на бактерицидную активность факторов врожденного иммунитета - лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов (Табл.2).

Пероксидпродуцирующие лактобациллы усиливали антимикробный эффект факторов врожденного иммунитета. Так, МБК лактоферрина в контроле составила для Е.соИ 47,2±3,6 мкг/мл, после обработки белка экзометаболитами лактобацилл - 28,6±1,8 мкг/мл (р<0.05), для Б.сшггт, соответственно, 63,9±5,1 и 49,1±2,3 мкг/мл (р<0.05). В случае лизоцима его МБК для Е.соИ в контроле составила 107±9,8 мкг/мл, после коньакта белка с метаболитами лактоба-

цилл - 51±4,6 мкг/мл, для S.aureus - 93±6,5 и 78±3,4 мкг/мл соответственно (р<0.05).

Таблица 2 - Изменение бактерицидной активности факторов врожденного иммунитета под влиянием метаболитов Н2С>2-продуцирующих лактобацилл

Вид бактерий фактор врожденного иммунитета контроль Влияние метаболитов

на клетки на фактор

Е. coli лизоцим, мкг/мл 107±9,8 88±5,3* 51±4,6*

лактоферрин, мкг/мл 47,2±3,6 42,2±2,4* 28,6±1,8*

антимикробный белок тромбоцитов, нг/мл 1400±53 1200±29 933±19*

S. aureus лизоцим, мкг/мл 93±6,5 73±5,9* 78±3,4*

лактоферрин, мкг/мл 63,9±5,1 51,5±5,4* 49,1±2,3*

антимикробный белок тромбоцитов, нг/мл 470±22 430±9 373±15*

* - статистически значимые различия с контролем при р<0.05

Предварительная обработка клеток S.aureus и E.coli секреторными продуктами лактобацилл повышала их чувствительность к действию факторов врожденного иммунитета. Так, МБК лизоцима в отношении E.coli в контроле составила 107±9,8 мкг/мл, после обработки - 88±5,3 мкг/мл, в отношении S.aureus, - 93±6,5 и 73±5,9 мкг/мл, соответственно. МБК лактоферрина после контакта клеток тест-штаммов с метаболитами пероксидпродуцирующих лактобацилл также уменьшалась и составила для E.coli 47,2±3,6 мкг/мл в контроле и 42,2±2,4 мкг/мл после обработки (р<0.05), для S.aureus, соответственно, 63,9±5,1 и 51,5±5,4 мкг/мл (р<0.05)

Для объяснения причин потенцирующего эффекта мы изучили влияние пероксидпродуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима в отношении Е. coli и L. acidophilus (Рис.10).

Ферментативная активность лизоцима, определяемая по скорости лизиса микрококка, снижалась с 27 до 8,5 у.е./мг белка*мин после его контакта с метаболитами лактобацилл, содержащими пе-

роксид водорода в диапазоне концентраций 0-1,9 мМ (Рис.10), а степень этого подавления находилась в прямой зависимости от содержания в них Н2Ог (г=0.89, р<0.01).

120

100

80 -

40 -

±1

ifi

[fl

rfl

0.0

0,18 0,43 0,57 0,84 1,12 1,27 1,35 1,78 концентрация H202, мМ

1,9

о г

С^ЭМБК Е. coli I 1МБК L. acidophyius —Активность лизоцима

Рис. 10. Влияние внеклеточных метаболитов лактобацилл с различным содержанием Н202 на ферментативную активность лизоцима и МБК по отношению к Е. coli и L. acidophyius.

Снижение ферментативной активности лизоцима метаболитами лактобацилл сопровождалось уменьшением его бактерицидно-сти для L. acidophyius и увеличением в отношении Е. coli (Рис.10), что сопровождалось соответственным изменение МБК лизоцима с 7,8 до 25,2 мг/мл для лактобацилл и с 107 до 56,9 - для кишечной палочки.

Степень бактерицидности лизоцима, модифицированного метаболитами лактобацилл, зависела от количества продуцируемого этими бактериями пероксида водорода (г=0.93, р<0.01 в случае с Е. coli и г=-0.96, р<0.01 для L. acidophyius). После обработки каталазой метаболиты пероксидобразующих бактерий не оказывали модифицирующего влияния на функциональную активность лизоцима.

С учетом имеющихся данных о способности активных форм кислорода изменять вторичную и третичную структуры протеинов (Davies, Delsignore, 1987), не исключено, что окисление лизоцима

пероксидом, содержащимся в метаболитах лактобацилл, определяет снижение ферментативной активности и, как следствие, увеличение МБК в отношении представителя грамположительной флоры - L. acidophylus.

Ферментативная активность лизоцима не является необходимым условиям для проявления им бактерицидных свойств в отношении грамотрицательных бактерий (Nash et al, 2006), поэтому выявленное нами уменьшение МБК лизоцима в отношении чужеродной для вагинального биотопа Е. coli можно объяснить ростом гид-рофобности белка в результате окислительного повреждения.

Таким образом, выявленное влияние метаболитов перок-сидпродуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима можно рассматривать в качестве механизма поддержания стабильности микробных биоценозов, основанного на синергизме эффектов факторов врожденного иммунитета хозяина и активных форм кислорода, продуцируемых нормальной микрофлорой.

Характеристика влияния прооксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал

Прооксиданты оказывали влияние и на факторы микроорганизмов, способствующие их колонизации, такие как адгезия и способность к биопленкообразованию.

Адгезивные характеристики Е. coli и S. aureus значимо уменьшались после обработки бактерий метаболитами пероксидпродуци-рующих лактобацилл (Табл. 3). Метаболиты лактобацилл, непроду-цирующих пероксид водорода, существенного влияния на адгезивную активность бактерий не оказывали. Противоположный эффект наблюдался в отношении адгезивной способности Corynebacterium spp. и Lactobacillus spp.: индекс адгезии существенно увеличивался под влиянием метаболитов содержащих Н202, и незначительно уменьшался после обработки метаболитами, не содержащими пероксид водорода.

Изменения адгезивных характеристик бактерий определялись Н202, так как после обработки супернатантов пероксидпродуциру-ющих лактобацилл каталазой значения индекса адгезии приближались к контрольным.

Таблица 3 - Влияние метаболитов лактобацилл на адгезию микроорганизмов к эритроцитам (индекс адгезии, бакт/эритроцит (М±т)).

Вид бактерий E. coli S. aureus Corynebacterium spp. Lactobacillus spp.

Вид обработки С каталазой Без катал азы С каталазой Без катал азы С каталазой Без каталазы .....- - С каталазой Без каталазы

Контроль 5.7 ± 0.4 5.7 ± 0.4 6.3 ± 0.43 6.2 ± 0.3 4.3 ± 0.27 4.3 ± 0.36 3.0 ± 0.22 3.0 ■ ± 0.2

Lactobacillus spp. Н2О2«-» 5.5 ± 0.54 5.6 ± 0.5 5.8 ± 0.43 5.9 ± 0.33 4.1 ± 0.18 4.1 ± 0.22 2.7 ± 0.17 2.7 ± 0.15

Lactobacillus spp. H2O2 «+» 5.5 ± 0.42 3.3 ± 0.6* 5.7 ± 0.3 3.9 ± 0.3* 4.4 ± 0.45* 4.8 ± 0.4* 3.2 ± 0.25 4.4 ± 0.42*

Таблица 4 - Влияние метаболитов лактобацилл на величину образования биопленок микроорганизмами (у.е.)_

Вид бактерий E. coli S. aureus Corynebacterium spp. Lactobacillus spp.

Вид обработки С каталазой Без каталазы С каталазой і Без каталазы С каталазой Без каталазы ¡С каталазой Без каталазы

Контроль 0.48 ± 0.03 0.48 ± 0.03 0.50 ± 0.03 0.49 0.02 0.58 ± 0.03 0.58 ± 0.04 0.38 ± 0.03 0.38 ± 0.03

Lactobacillus spp. Н202 «-» 0.41 ± 0.05* 0.4 ± 0.04* 0.36 ± 0.03* 0.37 ± 0.03* 0.51 ± 0.02 0.52 ± 0.02 0.35 ± 0.02 0.35 ± 0.02

Lactobacillus spp. H202 «+» 0.46 ± 0.04 0.32 ± 0.05* 0.45 ± 0.02 0.31 ± 0.02* 0.59 ± 0.05 0.64 ± 0.04* 0.39 ± 0.03 0.56 ± 0.05*

* - статистически значимые различия с контролем при р<0.05 Н202 «-»- лактобациллы, не продуцирующие Н202 Н202 «+»- лактобациллы, продуцирующие Н202

Биопленкообразование у Corynebacterium spp. и Lactobacillus spp. увеличилось под влиянием пероксидпродуцирующих лактоба-цилл на 10 и 47 % соответственно, этот эффект исчезал после обработки Н202-содержащих метаболитов лактобацилл каталазой (Табл. 4). Одновременно с этим наблюдалось незначительное уменьшение способности биопленкообразования этих бактерий под влиянием метаболитов лактобацилл, не образующих пероксид водорода. Напротив, пероксид водорода, продуцируемый лактобациллами, снижал способность Е. coli и S. aureus образовывать биопленки, соответственно на 33 и 36% по сравнению с контролем (Табл. 4). Одновременно с этим способностью уменьшать биопленкообразование обладали и метаболиты лактобацилл, не продуцирующих Н2О2: на 15% у Е. coli и 27 % у S. aureus.

Таким образом, на основании полученных результатов можно предположить, что в микробных биоценозах активные формы кислорода, продуцируемые представителями нормальной микрофлоры, при взаимодействии с компонентами поверхностных структур микроорганизмов влияют на характер отношений бактерий с колонизируемой ими поверхностью. Не исключено, что оппозитные изменения в адгезивности бактерий и способности образовывать биопленки являются адаптивной реакцией микроорганизмов в условиях окислительного стресса, что позволяет рассматривать активные формы кислорода как регуляторный фактор, определяющий структурно-функциональную характеристику микробного сообщества.

Принимая во внимание тот факт, что стабильность вагинального биоценоза не всегда определяется только антагонистической активностью лактобацилл (Бухарин и др., 2007), мы посчитали необходимым исследовать характер влияния пероксидпродуцирующих лактобацилл на биологические свойства бактерий, определяющих их адаптационный потенциал - антилизоцимную и каталазную активности.

Оказалось, что добавление метаболитов лактобацилл, содержащих относительно высокие концентрации пероксида водорода, к растущим культурам S. aureus и E.coli приводило к усилению продукции каталазы. После обработки бактерий 3,2 мМ пероксида ка-талазная активность культур возросла на 34 % для S. aureus и 22 % -E.coli соответственно. Добавление метаболитов с концентациями 0,8 и 1,9 мМ пероксида водорода к культурам приводила к снижению активности каталазы на 14 и 18% - для S.aureus и 12 и 29 %

для E.coli.

Характер влияния разнообразных биотических и абиотических факторов на антилизоцимную активность микроорганизмов позволяет предположить, что причиной изменения гетерогенности бактериальной популяции по антилизоцимному признаку могут являться активные формы кислорода, регулирующее действие которых на свойства микроорганизмов описано (Бухарин и др., 2008). В связи с этим, представляло интерес изучить влияние пероксидпродуциру-ющих лактобацилл на гетерогенность бактериальной популяции по антилизоцимному призйаку (Рис. 11).

В результате выяснено, что обработка клеток E.coli метаболитами лактобацилл с содержанием пероксида водорода 0,8 и 1,9 мМ приводит к снижению среднепопуляционного уровня АЛА до 2,9±0,7 и 2,5±0,4 мкг/мл*ОД, соответственно при 3,4±0,2 мкг/мл*ОД в контроле.

диапазон АЛА, мкг/мл*ОД

-"О-контроль -а-0,8 мМ Н202 мМ Н202 -♦-3,2 мМ Н202

Рис. 11. Влияние метаболитов Lactobacillus spp. с различным содержанием пероксида водорода на гетерогенность популяции E.coli по антилизоцимному признаку.

Этот эффект связан со смещением популяционной структуры E.coli в сторону преобладания клонов с низкими уровнями антили-зоцимной активности и появлению субпопуляций с АЛА меньшей, чем в контрольной популяции (Рис. 11). После обработки бактерий метаболитами, содержащими 3,2 мМ пероксида водорода наблюдали повышение среднепопуляционного уровня антилизоцимной активности до 3,8±0,9 мкг/мл*ОД и исчезновение клонов с антилизоцимной активностью до 2,5 мкг/мл*ОД.

Таким образом, на основании полученных результатов, следует заключить, что пероксид водорода, продуцируемый вагинальными лактобациллами, можно рассматривать как экологический фактор, позволяющий реализовывать бактериям адаптационный потенциал за счет изменения внутрипопуляционной гетерогенности их персистентных характеристик.

Изучение механизмов усиления антагонистической активности пероксидпродуцирующих лактобацилл путем стимуляции образования из пероксида водорода активных форм кислорода с высокой реакционной способностью

Выявленная возможность существенного увеличения бактери-цидности пероксида водорода путем ингибирования каталазной активности (Бухарин и др., 2002) открывает новый подход к усилению его эффективности, подразумевающий подавление антиоксидант-ной защиты клетки. С нашей точки зрения также перспективным является подход, основанный на создании оптимальных условий для превращения пероксида водорода в более реакционноспособные формы активного кислорода, например гидроксильные радикалы или гипойодид.

Пероксид водорода в диапазоне концентраций до 150 мМ не оказывал значимого бактерицидного эффекта на 5". aureus. 150 мМ пероксида водорода и более высокие концентрации снижали обсе-мененность aureus на 1-2,5 lg КОЕ/мл в течение 30 минут (Рис.12).

Использование в эксперименте сульфата железа (II) способствовало повышению чувствительности S. aureus к пероксиду водорода вследствие генерации гидроксильных радикалов. Так, при обработке взвеси бактерий растворами 5 или 10 мМ сульфата железа (II) и 50 мМ раствора Н202 количество жизнеспособных клеток S.

aureus снижалось до 1,42 и 1,16 lg KQE/мл, соответственно, при контроле 3,8 lg КОЕ/мл. 5 4,5 4 3,5

I з

§2,5

О 5 50 100 125 150 175 250 300 концентрация Н202, мМ -О- контроль -О-1 мМ Fe (II) —А— 5 мМ Fe (И) * 10 мМ Fe (II)

Рис. 12. Выживаемость Staphylococcus aureus АТСС 6538Р в системе генерации гидроксильных радикалов в зависимости от концентрации пероксида водорода и сульфата железа (II).

В случае совместного использования 5 или 10 мМ сульфата железа (II) и 100 мМ раствора Н202 выживали единичные клетки S. aureus, а дальнейшее повышение концентрации пероксида водорода приводило к полной гибели бактерий. Сходный эффект наблюдался и при использовании в эксперименте 1 мМ раствора сульфата железа (И) - выживаемость 5". aureus уменьшалась после добавления пе-рокида водорода, однако это уменьшение было достоверно лишь в диапазоне концентраций 100-150 мМ Н202.

Скорость проявления бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов была значительно выше. За 10 минут инкубации с 300 мМ Н202 число жизнеспособных клеток S. aureus снизилось с 4,2 до 1,9 lg КОЕ/мл. Однако, предварительная обработка тест-штаммов 5 мМ сульфата железа (И) значительно увеличила скорость гибели бактерий. Так, уже через 2 минуты после обработки гидроксильны-ми радикалами численность жизнеспособных клеток S. aureus снизилась с 4,2 до 0,39 lg КОЕ/мл, а к четвертой минуте бактерии погибли полностью.

Особый интерес представляло сочетание короткого периода существования гидроксильных радикалов с их высокой и быстрой биоцидной активностью, что позволило рассматривать системы, генерирующие гидроксильные радикалы, как средство продукции высокоэффективного природного дезинфектанта широкого спектра действия, к тому же не способного к накоплению в окружающей среде.

Существует мнение, что уровня пероксида водорода, образуемого лактобациллами, недостаточно для проявления ими антагонистической активности (Strus et al., 2006). Тем не менее, мы полагаем, что существует возможность усиления антагонистического потенциала пероксидпродуцирующих лактобацилл. Для реализации этой идеи были проведены исследования совместного влияния пе-роксидазы хрена, йодида калия, и метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на выживаемость S. aureus и E.coli.

Установлено, что метаболиты лактобацилл, содержащие пе-роксид водорода в диапазоне концентраций 0 - 5,4 мМ сами по себе не оказывали бактерицидного эффекта на S. aureus и E.coli. Однако, добавление к метаболитам лактобацилл пероксидазы хрена (10 мг/л) и йодида калия (2 г/л) приводило к снижению выживаемости бактерий. Так, при совместном действии метаболитов лактобацилл, пероксидазы хрена и йодида калия численность выживших клеток E.coli уменьшалась до 4,38±0,15, 3,84±0,13, 3,04±0,11, 2,73±0,1, 1,98±0,07, 1,61±0,06 lg КОЕ/мл при содержании пероксида водорода, соответственно, 1, 1,5, 3, 3,8, 4,6, 5,4 мМ, тогда как в контроле -6±0,21 lg КОЕ/мл.

Сходный эффект оказывало совместное применение метаболитов лактобацилл, пероксидазы хрена и йодида калия и на S. aureus. Количество жизнеспособных клеток при содержании пероксида водорода 1мМ составило 4,9±0,23 lg КОЕ/мл, 1,5 - 4,8±0,23 lg КОЕ/мл, 3 - 4,6±0,2, 3,8 - 3,6±0,2, 4,6 - 3,1±0,15, 5,4 - 2,4±0,12 и в контроле 6,3±0,29 lg КОЕ/мл

Полученные данные, вероятно, могут служить подтверждением того, что существующий in vivo антагонистический эффект пероксидпродуцирующих лактобацилл, определяющий высокую колонизационную резистентность вагинального биотопа, опосредован превращением малоактивного пероксида водорода в высокореакци-онноспособные активные формы кислорода.

Заключение

Полученные в настоящем исследовании результаты о роли про- и антиоксидантов, продуцируемых микроорганизмами, в формировании и регуляции функционирования симбиозов с участием прокариот, позволяют обосновать значение этого явления для поддержания эубиоза.

Важным моментом в развитии и существовании биоценоза является возможность модификации метаболитами пероксидпродуци-рующих свойств бактерий, ответственных за их адаптацию и колонизационный потенциал. Не менее существенное значение имеет и выявленная способность пероксидпродуцирующнх бактерий потенцировать бактерицидный эффект факторов врожденного иммунитета (на примере лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов).

Значительную роль в поддержании стабильности эубиоза следует отвести антагонистическому эффекту лактобацилл, обусловленному продукцией пероксида водорода и усиленному метаболитами бактерий с прооксидантным действием, направленным на ин-гибирование ферментов антиокислительной системы и восстановление железа.

Также нужно отметить важное значение способности бактерий снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов и тем самым предохранять пероксидпродуцирующие микроорганизмы от самоуничтожения. Это дает основание признать, что равновесные состояния баланса про- и антиоксидантов способствуют стабилизации эубиоза, тогда как его изменения сопровождают дисбиотиче-ские состояния биотопа.

Наконец, высокая биоцидная активность гидроксильных радикалов позволяет рассматривать генерирующие их системы, как природный высокоэффективный дезинфектант широкого спектра действия.

Оценивая изложенный материал в целом, следует выделить 3 основные положения:

- про- и антиоксиданты - регуляторы симбиотических отношений, определяющие уровень стабильности в биоценозе, за счет модификации биологических свойств симбионтов и препятствия колонизации биотопа аллохтонными микроорганизмами;

- выявленные закономерности участия про- и антиоксидантов в обеспечении стабильности симбиоза определяют экологическое состояние биотопа (на примере вагинального) за счет смещения баланса или изменения концентраций этих веществ.

- возможность усиления биоцидного эффекта пероксида водорода, продуцируемого лактобациллами, позволяет рассматривать эти бактерии как источник активных форм кислорода - высокоэффективного природного дезинфектанта широкого спектра действия.

Выводы:

1. Высокая распространенность и выраженность продукции про-и антиоксидантов представителями нормальной микрофлоры репродуктивного тракта женщин определяют экологическое благополучие биотопа.

2. Продукция про- и антиксидантов в микробном сообществе индуцируется факторами среды, определяя исход биоценоза.

3. Выявленная способность микроорганизмов снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов - причина устойчивости пероксидпродуцирующих бактерий к оксидативному стрессу.

4. Инактивация гидроксильных радикалов антиоксидантами и препятствование их образованию за счет окисления двухвалентного железа в трехвалентное объясняют механизм снижения бактерицидности этих активных форм кислорода бактериальными метаболитами.

5. Снижение антиоксидантной защиты бактерий за счет ингиби-рования каталазы метаболитами нормальной микрофлоры является одним из механизмов потенцирования антагонистической активности пероксидпродуцирующих лактобацилл.

6. Модификация факторов врожденного иммунитета макроорганизма метаболитами пероксидпродуцирующих микроорганизмов, приводящая к оппозитному изменению его активности в отношении автохтонных и аллохтонных бактерий, является одним из механизмов формирования и регуляции стабильного микробного биоценоза в организме человека.

7. Разнонаправленное изменение уровня биопленкообразования и адгезивности микроорганизмов метаболитами лактобацилл, продуцирующих пероксид водорода, свидетельствует об определяющей роли этого метаболита в дифференциации автохтонных и аллохтонных бактерий.

8. Высокая биоцидная активность гидроксильных радикалов позволяет рассматривать генерирующую их систему, как природный высокоэффективный дезинфектант широкого спектра действия.

Список опубликованных работ в журналах, рекомендованных ВАК

1. Черкасов C.B., Забирова Т.М., Сгибнев A.B., Черкасов И.В. Роль биологических свойств вагинальных лактобацилл в процессах колонизации // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2003. №4. С. 61-64.

2. Сгибнев A.B. Механизмы выживания бактерий в условиях окислительного стресса и дефицита ионов железа // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2006. №4. С. 20-22.

3. Семёнов A.B., Сгибнев A.B., Черкасов C.B., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий // Бюлл. эксперим. биол. и мед., 2007. Т. 144. №11. С. 545-548.

4. Бухарин О.В., Сгибнев A.B., Черкасов C.B. Активные формы кислорода как фактор, регулирующий поверхностные свойства бактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2008. №4. С. 3-6.

5. Сгибнев A.B., Черкасов C.B., Бухарин О.В. Механизмы про-тективного действия внеклеточных метаболитов бактерий в снижении бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2009. №4. С. 26-28.

6. Сгибнев A.B., Черкасов C.B. Влияние активных форм кислорода на антилизоцимную активность бактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2009. №4. С. 59-62.

7. Глухова Е.В., Черкасов C.B., Сгибнев A.B., Бухарин О.В. Характеристика микроэкологических нарушений при эндометрите // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,. 2009. №4. С. 93-96.

8. Бухарин О.В., Сгибнев A.B. Влияние активных форм кислорода на адгезивные характеристики и продукцию биопленок бактериями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. №3. С. 70-73.

9. Бухарин О.В., Сгибнев A.B. Влияние метаболитов коринебак-терий на антагонистическую активность Н202-

продуцирующих лактобацилл // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. №4. С.48-51.

Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгнбнев A.B. Роль ассоциативных микросимбионтов в функционировании ассоциативного симбиоза // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. № 6. С.89-95.

Бухарин О.В., Сгнбнев A.B. Влияние метаболитов Н2О2-продуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2013. № 4. С.60-64.

Бухарин О.В., Сгнбнев A.B., Черкасов C.B. Сравнительная характеристика антимикробных эффектов гидроксильных радикалов и пероксида водорода // Дезинфекционное дело, 2013. № 3. С. 38-42.

Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгнбнев A.B., Черкасов C.B. Участие доминантной микрофлоры в механизмах защиты вагинального биотопа женщин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2013. № 6. С. 100-104.

Публикации в других изданиях

Черкасов C.B., Забирова Т.М., Сгнбнев A.B., Черкасов И.В. Биологические свойства лактобацилл биотопов человека в норме и при дисбиозах //Сб. материал, междунар. конф. «Про-биотики, пребиотики, синбиотки и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004, с. 36-37.

Черкасов C.B., Сгнбнев A.B. Бактериальные механизмы колонизационной резистентности //Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева): Материалы междунар. науч. конф., Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006 г. - М.: МАКС Пресс, 2006. - С. 43.

Сгнбнев A.B. Влияние активных форм кислорода на культу-рально-морфологическую диссоциацию бактерий //Идеи Па-стера в борьбе с инфекциями: Материалы IV междунар. науч. конф., С-Петербург, НИИЭМ им. Пастера, 2-4 июня 2008 г. -С. 160.

Патенты на изобретения

17. Сгибнев A.B., Черкасов C.B., Забирова Т.М., Бухарин О.В. Способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте Фентона. Патент РФ на изобретение № 2279079 от 27.06.2006. Бюл. № 18.

18. Бухарин О.В., Сгибнев A.B., Черкасов C.B. Способ дезинфекции объектов окружающей среды. Патент РФ на изобретение № 23221426 от 10.04.2008. Бюл. № 10.

19. Бухарин О.В., Семёнов A.B., Черкасов C.B., Сгибнев A.B. Способ определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий. Патент РФ на изобретение № 2376381 от 20.12.2009 г. Бюл. № 35.

Список сокращений

АЛА - антилизоцимная активность АФК - активные формы кислорода ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозил КОЕ - колониеобразующие единицы ОАА - общая антиоксидантная активность ПМО - показатель микробной обсемененности

СГИБНЕВ АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ПРО- И АНТИОКСИДАНТЫ КАК ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ И РЕГУЛЯЦИИ СИМБИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ С УЧАСТИЕМ ПРОКАРИОТ

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Подписано в печать 19.09.2013 г. Формат 60x84 1/16. Печать оперативная. Усл. печ. листов - 2,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ООО «Печатный салон «ТиКс» 10.10.2013 г.

ООО "Печатный салон "ТиКс" г. Оренбург ул. Шевченко, 24 оф. 208 тел: (3532) 43-00-64, 60-95-60

Оригинал-макет изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Word 2003 for Windows. Гарнитура Times.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Сгибнев, Андрей Викторович, Оренбург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ КЛЕТОЧНОГО И ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СИМБИОЗА

На правах рукописи

СГИБНЕВ АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ПРО- И АНТИОКСИДАНТЫ КАК ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ И РЕГУЛЯЦИИ СИМБИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ С УЧАСТИЕМ

ПРОКАРИОТ

03.02.03 - Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант академик РАН, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Бухарин Олег Валерьевич

Оренбург - 2013 г.

Содержание

Введение............................................................. 6

Глава 1 Роль редоксактивных соединений во взаимоотношениях между партнерами в сообществах микроорганизмов (обзор литературы)................................................ 16

1.1. Межвидовая коммуникация с использованием химических сигналов и жизнедеятельность бактерий..... 16

1.1.1. Химическая сигнализация в формировании и развитии ассоциации «хозяин-бактерия» между Rhizobiaceae и бобовыми............................................................ 22

1.1.2. Химическая коммуникация между микроорганизмами, образующими биопленки в полости рта человека......... 27

1.1.3. Химическая коммуникация в межвидовых взаимоотношениях с участием Pseudomonas aeruginosa .. 32

1.1.4. Развитие межвидовой коммуникации в сообществах почвенных бактерий............................................. 36

1.1.5. Перспективы исследований, направленных на установлении роли химических соединений, продуцируемых микроорганизмами, в межвидовой коммуникации...................................................... 46

1.2. Про- и антиоксиданты в коммуникации и адаптации микробных сообществ........................................... 48

1.2.1. Редоксактивные соединения в колониальном развитии S.cerevisiae.......................................................... 51

1.2.1.1. Межклеточная коммуникации, дифференциация колоний

и защита от стресса S.cerevisiae..........................................51

1.2.1.2. Участие про- и антиоксидантов в механизмах защиты от стресса в колониях S.cerevisiae............................... 55

1.2.1.3. Активные формы кислорода и запрограммированная смерть клетки у S.cerevisiae..................................... 60

1.2.2. Редоксактивные соединения и биопленки Candida sp...... 62

1.2.2.1. Фарнезол и активные формы кислорода в межклеточной

сигнализации в популяциях Candida sp...................... 64

1.3. Редоксактивные соединения и бактериальные биопленки. 67

1.3.1. Активные формы кислорода в межклеточной

сигнализации в биопленках бактерий........................ 72

1.3.2. Бактериальные биопленки и адаптация к оксидативному

стрессу............................................................. 76

Глава 2. Материалы и методы исследования......................................................80

2.1. Общие данные............................................................................................................80

2.2. Характеристика штаммов микроорганизмов....................................80

2.3. Методы выделения микроорганизмов........................... 81

2.4. Методы идентификации выделенных штаммов микроорганизмов.................................................... 81

2.5. Изучение биологических свойств бактерий................. 82

2.5.1. Метод определения продукции бактериями пероксида водорода............................................................ 82

2.5.2. Метод определения продукции бактериями гидроксильных радикалов........................................ 83

2.5.3. Метод определения продукции бактериями супероксиданион радикала........................................ 84

2.5.4. Метод определения продукции бактериями ингибиторов катал азы............................................................. 84

2.5.5. Метод определения каталазной активности бактерий...... 85

2.5.6. Метод определения железовосстанавливающей и железоокисляющей способности бактерий................. 86

2.5.7. Метод определения общей антиоксидантной активности бактерий и отдельных фракций их метаболитов.............. 86

2.5.8. Метод определения способности бактерий снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов.......... 87

2.5.9. Метод оценки влияния факторов среды на способность микроорганизмов продуцировать про- и антиоксиданты.. 87

2.5.10. Метод определения адгезивных свойств бактерий......... 87

2.5.11. Метод определения гидрофобных свойств бактерий........ 89

2.5.12. Метод определения способности бактерий образовывать биопленки............................................................. 89

2.5.13. Метод определения способности бактерий сорбировать белки................................................................. 90

2.5.14. Метод определения антилизоцимной активности бактерий............................................................... 90

2.6. Метод определения активности лизоцима..................... 92

2.7. Метод изучения потенцирующего действия метаболитов пероксидпродуцирующих микроорганизмов на бактерицидную активность факторов врожденного иммунитета......................................................... 93

2.8. Метод изучения потенцирующего действия метаболитов коринебактерий на антагонистическую активность пероксидпродуцирующих лактобацилл..................... 93

2.9. Методика изучения изменения биологических свойств бактерий под влиянием метаболитов

пероксидпролуцирующих лактобацилл...................... 94

2.10 Методы статистической обработки полученных

результатов......................................................... 94

Глава 3. Характеристика способности представителей нормальной микрофлоры нижних отделов женского репродуктивного тракта продуцировать редоксактивные соединения....... 97

3.1. Характеристика исследуемых микроорганизмов............. 98

3.2. Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с прооксидантным действием у микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела женского репродуктивного тракта............................. 99

3.2.1. Изучение способности микроорганизмов продуцировать пероксид водорода.................................................. 100

3.2.2. Изучение способности микроорганизмов продуцировать супероксиданион и гидроксильные радикалы................. 106

3.2.3. Изучение способности микроорганизмов продуцировать ингибиторы бактериальной каталазы........................... 108

3.2.4. Изучение влияния факторов среды на продукцию пероксида водорода лактобациллами.......................... 111

3.3. Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с антиоксидантным действием у микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела женского репродуктивного тракта.............................. 114

3.3.1. Оценка распространенности защитного действия бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов....................................... 114

3.3.2. Изучение общей антиоксидантной активности (ОАА) внеклеточных метаболитов бактерий........................... 116

3.3.3. Изучение механизмов, обеспечивающих снижение бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов....... 118

3.3.4. Изучение механизмов, регулирующих выживание бактерий в условиях окислительного стресса и дефицита ионов железа......................................................... 121

3.3.5. Изучение влияния факторов среды на продукцию антиоксидантов лактобациллами.............................. 128

3.4. Изучение связи уровня про- и антиоксидантов,

продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием вагинального биотопа.. 130

Глава 4. Изучение влияния микробных про- и антиоксидантов на чувствительность бактерий к факторам микробного антагонизма и врожденного иммунитета..................... 140

4.1. Изучение влияния метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на бактерицидную активность факторов врожденного иммунитета....................................... 140

4.2. Изучение влияния метаболитов бактерий с прооксидантным и антиоксидантным эффектом на антагонистическую активность пероксидпродуцирующих лактобацилл......................................................... 152

Глава 5. Характеристика влияния про- и антиоксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал............ 162

5.1. Влияние прооксидантов на адгезивные характеристики микроорганизмов и их способность к

биопленкообразованию.......................................... 163

5.2. Влияние антиоксидантов на адгезивные характеристики микроорганизмов и их способность к

биопленкообразованию........................................... 171

5.3. Влияние прооксидантов на антилизоцимную и

каталазную активности........................................... 176

Глава 6. Характеристика потенциальных возможностей

использования активных форм кислорода для снижения численности микроорганизмов.................................. 185

6.1. Сравнительная характеристика биоцидных эффектов гидроксильных радикалов и пероксида водорода.......... 185

6.2. Перспективы применения пероксидпродуцирующих микроорганизмов для создания биоцидных способов и композиций, использующих в качестве действующего

начала активные формы кислорода........................... ^^

Заключение........................................................... 204

Литература........................................................... 220

Актуальность проблемы

2010). Дополнением к этому служат материалы о том, что исходно эндосимбиотические предки митохондрий не могли ни импортировать белки, ни экспортировать АТФ, но, получая от клетки-хозяина пируват, обезвреживали токсичный для нуклеоцитоплазмы кислород (Kurland, Andersson, 2000). В последние годы получены новые доказательства роли кислорода в развитии современных симбиотических систем - это симбиоз между жёлтопятнистой амбистомой (Ambystoma maculatum) и микроскопической водорослью Oophila amblystomatis (Kerney et al.,

2011), где водоросли, используя метаболиты животного, в процессе фотосинтеза вырабатывают кислород, необходимый для получения химической энергии митохондриями хозяина.

Появление около 3 миллиардов лет назад процессов оксигенного фотосинтеза (Buick, 2008) способствовало накоплению в биосфере кислорода (Farquhar et al., 2000), что, в свою очередь, повлекло ряд как благоприятных, так и неблагоприятных моментов для живых организмов.

С одной стороны, кислород стал причиной мощного

эволюционного скачка, проявившегося как в появлении новых

механизмов добывания энергии, так и появлении принципиально новых

организмов - эукариот (Anbar, Knoll, 2002), с другой - участие кислорода

в метаболизме способствовало формированию оксидативного стресса,

который отражает существующий в биологических системах дисбаланс

между образованием и детоксикацией легко возникающих активных форм кислорода (Síes, 1997).

Негативное действие физиологически высоких концентраций АФК на структуры клетки, проявляющееся в повреждении ДНК, белков, липидов и других компонентов (Beckman, Ames, 1998) хорошо изучено, но известен и «положительный» биологический эффект АФК на клетку и ее системы. Так, например, была выявлена стимуляция активности фермента гуанилатциклазы и повышение концентрации вторичного мессенджера цГМФ под влиянием гидроксильного радикала (Mittal, Murad, 1977) и пероксида водорода (White et al., 1976), образующихся из супероксиданиона. В настоящее время растет число работ, посвященных биорегуляторной роли про- и антиоксидантов в реакции организмов на различные медиаторы и факторы внешней среды (Torres, 2010, Mittler et al., 2011).

Оксидативный стресс, его причины и последствия чаще всего рассматриваются применительно к отдельным клеткам, тканям и органам многоклеточных (Владимиров, 2009). Понятие оксидативного стресса, по всей вероятности, применимо и для сообществ: например, продукция активных форм кислорода - распространенное явление в водных экосистемах, а окислительный стресс является важным компонентом реакции организмов на изменения условий окружающей среды (Lesser, 2006).

В то же время остается открытым вопрос о биологической роли

про- и антиоксидантов в межклеточных и межвидовых взаимоотношениях, в частности их участии в процессах формирования симбиотических отношений между прокариотами и другими организмами.

Рассмотрение инфекции в качестве модельной системы ассоциативного симбиоза определило «инфектологическое поле» как пригодное для изучения регуляторной функции про- и антиоксидантов в симбиотической системе «паразит - хозяин», обозначив новые перспективы в управлении инфекционным процессом (Бухарин и др., 2011).

Именно эти моменты и определили цель и задачи нашей работы.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является характеристика роли про- и антиоксидантов, продуцируемых микроорганизмами, в формировании и регуляции симбиозов с участием прокариот.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

2. Исследование связи уровней про- и антиоксидантов,

продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с

микроэкологическим состоянием биотопа хозяина.

3. Характеристика влияния про- и антиоксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал (адгезивные характеристики, способность к биопленкообразованию, гидрофобность клеточной поверхности, каталазную, лизоцимную и антилизоцимную активности).

Научная новизна

Изучен спектр метаболитов с про- и антиоксидантным действием (на примере вагинальной микрофлоры), установлены распространенность и выраженность продукции про- и антиоксидантов бактериями, определены факторы среды, регулирующие их синтез.

Синхронные высокие уровни продукции про- и антиоксидантов

являются характерным признаком эубиоза, а дисбиотические состояния

сопровождаются смещением баланса про- и антиоксидантов.

Обнаружена способность бактерий защищать другие микросимбионты от бактерицидного действия гидроксильных радикалов, образующихся в реакции Фентона (Патент РФ № 2279079). Механизмом, определяющим этот эффект являются способность бактерий окислять Ре2+ в Ре3+, что препятствует образованию гидроксильных радикалов в реакции Фентона, и продукция веществ, обладающих антиоксидантными свойствами - внеклеточных полисахаридов, пигментов и липидсодержащих соединений.

Выявлено наличие у микроорганизмов механизмов, запускающих при недостатке Бе24" работу клеточных систем, синтезирующих метаболиты, инактивирующие гидроксильные радикалы или препятствующие их образованию в реакции Фентона.

Выявлены дозозависимые эффекты изменения поверхностных

свойств бактериальных клеток под влиянием продуцируемых

нормальной микрофлорой активных форм кислорода, заключающиеся в

снижении гидрофобности и адгезивности бактерий, уменьшении их

способности сорбировать белки, модификации уровня

биопленкообразования. Пероксидпродуцирующие микроорганизмы

оказывают регулирующее влияние на характер взаимодействия бактерий

с колонизируемыми ими поверхностями за счет продукции активных

форм кислорода, определяя структурно-функциональное состояние

микробных биоценозов.

На примере антилиз

Информация о работе