Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика детерминантов токсинообразования BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. THURINGIENSIS и SUBSP. DENDROLIMUS и получение новых энтомопатогенов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика детерминантов токсинообразования BACILLUS THURINGIENSIS SUBSP. THURINGIENSIS и SUBSP. DENDROLIMUS и получение новых энтомопатогенов"

?Г6 сд -5 IW? 13S3

4 ^ Российская Академия' наук

Институт микробиологии

На правах рукописи УДК 632.937.15. ВТ

КУЗИНА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕТЕРМИНАНТОВ ТОКСИНООБРАЗОВАНИЯ BACILLUS THÜRINGJENSIS SUBSP. THURINGIENSI3 И SUBSP. DENDROLIMUS И ПОЛУЧЕНИЕ НОВЫХ ЭНТОМОПАТОГЕНОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте прикладной микробиологии

Научный руководитель: кандидат биологических наук

А.П.Добрица

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Р.Р.Азизбекян

кандидат биологических наук Е.О.Добржанская

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов РАН

Защита состоится "^/"^/^й^Х- 1993 г. власов на заседании Специализированного совета Д.002.64.01 при Институте микробиологии РАЧ ш адресу: 117811, Москва, пр-т 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНШ РАН Автореферат разослан " иссс^пс^ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.Е.Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.Современное промышленное производство микробиологических средств защиты растений (МС5Р) базируется, главным образом, на выпуске препаратов на основе спор и иараспо-ральных кристаллических включений белкоБой природы, продуцируемых различными штаммами ВзсШиз ^иг'пгр епз1з. Основным токсическим началом этой бактерии является кристаллический белок иди Ь~- эндотоксин, хотя многие штаммы 3.1Ьиг1щ1епз1Б "(ВТ) продуцируют и другие токсину. Из последних наибольшее значение имеет термостабильный ,/5-экзотоксин яуклестадной природы, который расширяет спектр инсектицидной активности биоинсектицидов.

В последние годы, в сеязи- с необходимостью замены химические пестицидов, широкое и интенсивное применение которых привело к серьезным отрицательным экологическим последствиям, уровень производства биопрепаратов на основе ВТ неуклонно растет. Однако, биоинсектицида, по. ряду параметров уступают химическим СЗР, что уменьшает масштабы их применения, это довольно высокая себестоимость производства, ограниченность в ряде случаев спектра действия, сравнительно низкий уровень токсичности и длительная задержка во времени эффекта их дейетеия.

Определяющую соль в преодолении этих недостатков могут сыграть новые свойства энгсмопатогенов, на базе которых создаются биопрепараты. Улучшение характеристик этих микроорганизмов может быть достигнуто как путем селекционной работа, так и в результате направленной генетической модификации, что определяет необходимость создания соответствующей генетической базы.

Цель я задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение генетического контроля тсксиясгабразсвгнкя промышленных продуцентов отечественных биопрепаратов битоксибациллина ВЛЬиг1пЁГ1епз15 зиСБр. 1Ьиг.1пг1еп51з 202, 1140, 98 И дендробацил-лина - В.+,'пиг1л21еп51з 5иЬзр.с!ег.с1го]1гпиз 49/8 и получение новых энтомопагогенных штаммов ВТ. Б связи с этим были поставлены следуйте задали:

1.Найти косвенные биохимические критерии для отбора высоковирулентных клонов среди природных и экспериментально полученных путем химического мутагенеза вариантов В.1Ьиг:тЕ1еп51з зиЬзр. |1епс1го1:ти5.

\

2.Получить и изучить коллекцию мутантньи штаммов ВТ, отличающихся по уровне синтеза кристаллического белка, экзотоксина и спорообразованию.

3. Изучить плазмидный состав штаммов B.thurlng'iensis subsp.thuring'íensi.s.и .subsp. dendrollmus и рель внехромоссшшх генетических элементов в контроле синтеза основных токсинов этих бактерий.

4.Изучить возможности получения рекомбшактньгх штатов, продуцирующих несколько эитомошдных белков различной специфичности действия.

Научная новизна работы. С помощью химического мутагенеза получены мусактные штаммы B.thuringiensis subsp.der.drolirr,us 49/8. При изучении их свойств установлено, что величина активности про-теазк может слукить косвенным критерием при отборе вируленткьк клонов ВТ этого серогипа и может быть использована в качестве вспомогательного ферментативного теста при селекции.

Изучены плазмидные комплексы штаммов ВТ 202, 1140, 98, 49/8 и их мутантов. При ренатурации денатурированных ДНК внехромоссмных элементов штамма ВТ 202 в составе одноцепочечных молекул 78, 55. 49 и 37- ВДа плазмид обнаружены двунитевые участки, соответствующие дуплексам двух копий инвертированных повторяющихся последовательностей. Установлена связь синтеза ¿"-эндотоксина иД-экзотоксина в ВТ ?Н2 и 1140 с генами Сгу-плазмид. Выявлена роль 49 Ща плазывды з детерминировании продукции йактериошна в ВТ 202. Впервые получены данные, указывающие на отсутствие связи регуляции синтеза экзотоксина Cry-плазмлдсй в штамме ВТ 98.

В результате переноса совместно с плазмидой рВСаб Сгу-плазми-ды, несущей ген Сгу1А(Ь)-гина, из B.thuringiensis subsp. kurstakl НД1 в акристадлшесгай вариант B.thuringiensis subsp. thuringiensis 98-4 и в ктамы B.thuringiensis subsp. tenebrionis 1516, сконструированы два штамма ВТ К-19 (Н1) и ВТ LT-1 (Н8). Одновременная передача при трансцепшш пдазмиды рВС16 совместно с Сгу-пдазыидой упрощает отбор клонов с необходимым признаком.

Исследована кинетика накопления экзотоксина природными, му-тантиыми и рекомбкнантным штаммами ВТ Н1 с помощью чувствительного изотопного анализа.

Практическая значимость работы. На-основе детального изучения свойств полученных мутантов B.thuringiensis subsp. riendrolimus предложен косвенный биохимический тест для скрининга активных

штаммов-продуцентовб1эндотоксина.

При изучении плазмидных комплексов и инсектицидных свойств штаммов ВТ показана большая генеткЧескач стабильность продуцента Оитоксибациллина штамма 08 по сравнению с ВТ "О? и 1140. Получены мутанты, которые могут иметь практическое значение - штамм ВТ "02-Э (Н1) с увеличенной (ка Ж) продукцией/')-экзотоксина и аспо-рогекный штамм ВТ £-3. Использование аспорогенного штамма позволяем упростить способ получения аптисыворотют к5-эндотоксину ВТ И1 и получить экологически более чистый биопрепарат.

Методом котраясцепции сконструированы "два рекомбинантных штамма ВТ К-19 (Н1) и ВТ ЬТ-1 (НЗ) с новыми инсектицидными свойствами, имеющие преимущества перед природными знтомопатогенами. Полевые испытания экспериментального образца препарата, полученного на основе рекомбинантногс штамма Х-10 в условиях открытого и закрытого грунта показали возможность использования этого штамма для производства биопрепаратов.

Исследование продукции /ьзкзотоксина природными, мутантными и оекомбинантным штаммами ВТ К1 показало, что максимальный уровень накопления ^-экзотоксина назисит от фазы роста культур, фенотипи-ческих свойств штаммов и среди культивирования.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции молоды:'; ученых ВНИИ ПМ (1985 г.), на Всесоюзной конференции "Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекомыми и болезнями растений" (Велегож, 1986 г.), на 1-ой отраслевой конференции -конкурса молодых ученых (Новосибирск, 1988 г.), на Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений" (Велегож, 1989 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять работ и имеется два авторских свидетельства (А.с. N'1483941, СССР, 1989 г.: Л.с. N1497799, СССР, 1989 г.). Материалы исследований внесены в три отчета по научно-исследовательским работам.

Структура и обьеч диссертации. Диссертация изложена на 223 страницах машинописного текста, содержит 31 таблицу,. 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части," вызодов и списка литературы, включающего 393 наименований работ, в тем числе 308 ¡зарубежных авторотз.

- б -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Штаммы В.thurlnglensis различных серо-типов, B.cereus,' B.subtilis, а также грамотрицагольные бактерии получены из коллекции музейных культур ГосНИИШ и других институтов страны. Штамм ВТ HD1 (НЗ) получен от .Lecadet (Франция). В качестве питательных сред использовали жидкие: LB, NB, SSM, среду Спицайзена, дрозекеполисахаридные среды (Д11С), а также агаризован-ные среды. Для приготовления селективных сред вносили антиоштики (миг/мл): рифампицич - 5-50, какамицин - 40, стрептомицин - 100. Активность экзоферментов ВТ Н4 изучали на средах с соответствующими индукторами: с крахмалом для амилазы, желтком яйца для лецитика-зы, молоком для протеазы, деминерализованным пачцирем краоов для хитиказы, пенициллином длл пенициллиназы. Продуктивность культур определяли по числу иизнеспосоОных клеток по методу Коха. Спектр литического действия оценивали капельным способом. Для получения мутантов штаммов ВТ Н4 применяли нигрозогуанкдин и дяметилсупьфат. Для определения инсектицидной активности штаммов использовали гусениц непарного шелкопряда, личинки комнатной мухи к колорадского жука.

Тестирование бактеряоцинов проводили ка питательном агар?, содержащем клетки Sarclna flava или другие микроорганизмы по несколько измененному методу Rosenberg /Rosenberg: et al., 1971/.

Чувствительность баятериоцююв к нагревания и ферментам определяли после кипячения сконцентрированного в 10 раз супернатанта в течение 20 мин. и после добавления к супернатанту прсказы и трипсина б конечной концентрации 1мг/мл и выдержиьашш при ЕР*"- 30 мин. Тестирование проводили ло подавлению роста клеток b'.fiava.

Определение продукции ^-экзотоксина осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии (ТХ), жидкостной хроматографии высокого давления /ЖХБД/, /Bcbenscnikcva et al., 1983/, спектрофотометри-ческим методом и методом изотопного анализа.

Для элиминации илаамид использовали ковобноцин, штсмчцик С и суСингибируюшузо температуру роста A3"С.

Передачу плазыид методом грансцепцмм проводили в соответствии с процедурой, описанной"еопза1ег /Gonzalez et al., 1982/.

Плазмвднун ДНК из штаммов выделяли по методам Bii'nboim, Doli /Blmboim, Doli, 1979/ и Gonzalez /Gonzalez et al., 1981/.

Электрофорез ДНК , а также обработку ДНК ресгриктазой Hindi и проводили согласно /Машатис и соавт., 1984/. В качестве маркеров использовали плазмиды: Я40а, RP4, R"?-2, рНУЗЗ, pBCie, pBR3K2, рЕ1Э4, а также HindIII-фрагментн ДНК фагаЯ .

Злектронноьжкроскопическмй анализ, а такие гомодуплексный анализ проводили по методу Davis /Davis et al., 1971/. ■

Гибридизации ДНК б геле осуществляли по Tsao /Tsao et al., 1983/. В качестве зонда использовали рекомбинактные плазмиды, содержащие EcoRl-фрагмеит (0,7 т.п.н.) сгу-гена E.thuringiensis berliner 1715 (Hi). '

Выделение и очистка кристаллических белков. Споры и кристаллы ВТ, выращенные на питательном агаре, суспендировали в воде и добавляли п- ксилол. Смесь гомогенизировали и фракционировали в делительной воронке. Кристаллы осаждали центрифугированием при 6000 об/мин. е гечс-пие 10 мин., промывали трижды водой, и суспендировали в буфере (Ü.Q05M трио-HCl, pH 8.0; 0,05£ твин 80). Суспензию наносили на поверхность ренографина и центрифугировали 1-1,5 часа при 10000 об/мин. Фракцию кристаллов отбирали с помощью перистальтического насоса. Концентрацию кристаллического белка определяли по методу Lowry /Lowry et al., 195V.

Для получения антисыворотсж использовали кристаллы е"-эндотоксинов ВТ HI, НЗ, Н4, HS, которыми иммунизировали кроликов породы "шиншилла". Суммарную фракции иммуноглобулинов переосаждали сульфатом аммония, диализовали и очищали ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе /Остермая и соавт., 198?./.

Электрофорез белков в пластинках 102 полиакриламиднсго геля проводили по Laemmli /Laemmli, 1070/.

Иммуноблотинг. Электрсперенос белков на нитроцеллшозный фильтр осуществляли по методу Dunn /Dunn, 1986/.

Ракетный ммыуяоэлектрофорез проводили согласно методам Laurel1 /Laurel1, 1366/ и Andreas /Andreus et al., 1980/.

Математическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методам /Афифи, Эйзс-н, 1982; Плохинский, 1980/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Получение и изучение мутантов В. thuringlensls subsp.dendrolirnus.

Важным этапом производства бактериальных препаратов является

- в -

постоянна! селекционная работа со штаммами, на основе которых получают эти биоинсектициды. Для получения высокоактивных и продуктивных клонов, проросшие споры штамма ВТ 49/8 (Н4) обрабатывали нитрозогуанидином и диметилсульфатом. Однако, селекционная работа с ВТ осложняется из-аа отсутствия экспресс-методов отбора активных клонов. Поэтому неоходимо было оценить возможную корреляцию между энзиматическими и вирулентными свойствами мутантов. Для этого рп-. ределялась активность ферментов 'протеазы, лецитиназы, пенициллина-зы, хитияазы и инсектицидная активность клонов пробит-методом по " JIK50 на гусеницах непарного шелкопряда. Статистическая обработка результатов осуществлялась на мини-ЭВМ. Расчет коэффициентов корреляции показал, что у ВТ 49/8 (Н4) наблюдалась коррелятивная зависимость мегвду знтомоцидной активностью и активностью протеазы. Поэтому величина активности этого, фермента была рекомендована для использования в качестве вспомогательного ферментативного теста при селекции Л!евцов и соавт., 1985/.

2. Исследование природы детерминантов токсигенности B.thurir.g'tensis subsp.thüringiensís и subsp.dendrolimus.

Анализ препаратов ДНК, выделенных из штаммов ВТ 202, 1140, 98 (Н1), 49/8 (Н4), а также из ЕТ НД1 (НЗ) и ВТ 1516 (Н8), используемых для получения рекомбиналтных штаммов показал, что в состав их пдазмидных комплексов входит от 3 до S плазмид (рис. 1).

Молекулярные массы плазмид,- рассчитанные на основании их электрофоретической подвижности и подвижности плазмид с известной молекулярной массой (Mr): R4Ga, RP4, pHV33, рВС16, pBR322, рЕ194 - представлены в таблице 1.

Аналогичные этим значениям величины были получены при расчете Мг на основании результатов измерения контурных длин ОС-форм плазмид на злектронношкроскопических фотографиях.

При ренатурации денатурированных ДНК внехромосомных элементов ВТ 202 (Н1) в составе одноцепочечных молекул 78, 55, 49 и 37 МДа плазмид обнаружены инвертированные повторяющиеся последовательности. В структуре одиночных цепей 78- и 55 МДа плазмид найдено по одному дуплексу размером около 1,8 МДа, а в плазмидах с Мг 49 и 37 МДа - около 1,8 и 3,5 Ща. Возможно, что инвертированные повторы являются составной частью мигрирующих элементов. Этим можно объяснить и перестройки, происходящие в структуре плазмидного комп-

лекса этого штамма. В ДНК плазмид ВТ 49/6 (Н4) инвертированные повторы не удалось обнаружить, а в штаммах ВТ 1140 и 98 (Н1) они не изучались.

1 2 3 4 5 6

Рис.1. Электрсфореграмма плазмидной ДНК штаммов Bacillus thuringiensis (МДа). 1. 98 (Hl), 2. 202 (Hl), 3. НД1 (НЗ), 4. 49/8 (Н4), 5. 1516 (Н8), 6. 1140Г (Н1).

Таблица 1

Характеристика плазмид в штаммах Bacillus thuringiensis

--—-----i

Число |

Штамм Серотип плазмид Молекулярная масса плазмид (МДа)

202 Н1 7 78*. 55, 49, 37, 7.1, 6.1, 5.1

1140 Н1 9 78,60,49,30,12,10,5.1,4.0,3.0

98 Н1 5 56, 155 , 7.1, 6.1, .5.1 ■

НД1** НЗ 9' 130*,110*,52,44,30,9.7,Б. 2,4.8,1

49/8 НА 4 57, 35, 31, 3.6*

1516 Н8 3 105, 92, 48 " .

• * - плазмиды не всегда видны в агарозном геле

** - молекулярная масса ряда плазмид ВТ НД1, нам Ьесайей, отличается от литературных даяных.

представленного

Такие изменения возможны при работе со штаммами в различных лабораториях и, вероятно, зависят от генетической нестабильности штаммов ВТ. техники выделения к анализа плазшд.

Получение мутантов с различными феиогкгамесюпм свойствами. Для выяснения сгязи плззмид штаммов ВТ 20й, 1140, 98 и 49/8 с эн-томопатогенкостью, эти культуры выращизаяи в присутствии элимини- • рующих плазмиды агентов - новобисцина, мктомицика С и при повышенной температуре роста. Затем определялась частота потери бактериальными клетками способности к продукции Г-эндотоксина 'Cry), ^-экзотоксина (Ехо), бактериоцина (The) и вирулентность по отношению к тест-насекомым.. В таблице 2 представлена характеристика некоторых из полученных мутантов вышеуказанных штаммов с различными фенотипическими свойствами.

При определении способности к продукции экзотоксина методом ТХ в акристаллических мутантах штаммов ВТ 202 и 1140 было установлено, что они не обладают этим свойством, что указывало на возможную сцепленность генов, кодирующих зги признаки (мутанты £02-24, 1140-3-5, -11-4, -9, -RK)В то же вреыя все Cry- мутанты ВТ 93 сохранили способность к синтезу экзотоксина (мутанты 98-4, -6). Продукция или отсутствие продукции экзотоксина в исходных и полученных вариантах была проанализирована также методом ЖХВД. Новоби-" один и митомиция С индуцируют также появление мутантов ВТ 202 и 1140, утратизших способность оказывать антибактериальную активность (The) наметки Sarai na flava (202-3-2, -3-11, -24, 1140-А). The- мутанты ВТ 93 удалось получить после вторичной обработки но-вобиоцином и мктомицином С акристаллического клона ВТ 93-4 (мутанты 93-4-1, -4--6, -4-10).

При отборе акристаллических и не продуцирующих экзотоксин мутантов, после выращивания ВТ 202 Ка^в присутствии новобйоцина был выделен аспорогенныя мутант. ВТ 2-8, сохранивший способность к. продукции полноценного кристаллического белка и экзотоксина /Кузина, Андреева, 1989/,' а после инкубации ВТ 202 Кап*при 43° С отобран мутант ВТ . "02-Э с повышенной на 30Z продукцией экзотоксина по сравнению, с другими эгсзотоксинсодериащими продуцентами /Кузина, 1989/. .

Напичке аснорогенного .мутанта ВТ 2-8 позволило упростить процедуру получения антисыкоротки к 5"-эндотоксину HI серотипа, повысить еыход антигена до 99% по сравнению с выходом антигена из

Таблица 2

Характеристика штаммов ВТ 202, 1140, 98 (Н1), БТ 49/8 (.44) и их мутантов

Концентрация Бкопроба

экзотоксина ЛКБОХХН Факторы

Штамм Фенотип (мг/л)* непарный комнатная обработки

шелкопряд муха**

1х 2х

202 (дикий) Сгу+ЕХ0+ТЬс+ 500 0,21 1,44 но не обрабатывали

202-3-11 Сгу+ЕХО+ТЬс- 470 0,40 1,62 но митомиции 0

202-3-2 Сгу-:ех0+ТЬс- 480 0,33 1,53 но митомицин С

202-24 Сгу-Ехо-ТЬс- - *Ж* - - - митомицин С

202-Э Сгу+Ехо+Г(1с+ ИЗО 0,29 0,85 но t 43" С

1140 (ДИКИЙ) ПгухЕхо+г11с+ 550 0,20 1,30 но не обрабатывали

1140-А Сгу+Ехо+ГЬс- 500 0,73 1,54 но новобиоцин

1140-з-е Сгу-Ехо-Т(ю+ - - - - ..новобиоцин

1140-11-4 игу-Ехо-ТЬс-ь - - - - новобиоцин'

1140-КК Сгу-Ехо-ТЬс-т - - новобиоцин

1140-9 Сгу-Ехо-ТЬсл- - - - - митомицин С

98 (дикий) С'ГУ+ЕХО+ТЬС*- 930 0,13 1,08 но не обрабатывали

98-4 Огу-Ехо+ТЬс+ 980 - 0,79 но 1 43° С

98-6 Сгу-Ехо*-ТЬс+ 958 - 1,02 но

98-4-1 Сгу- Ехо+ТЬс- 810 - 1,56 но новобиоцин

93-4-6 Сгу- Ехо+ТЬс- 800 - 1,48 но митомицин С

98-4-Ю Сгу-Ехо-ЧЬс 7£0 1,71 но митомицин С

93-4М Сгу-Ехс+ТЬс+ 990 - 0,76 но митомицин С

98-4Т Сгу-ЕХО+ТЬсЬ 995 - 0,72 ко й 43"С'

98-4.4 Сгу- ЕхоЧ1"1с+ 993 - 0,71 но новобиоцин

49,''8 (дикий) Сгут - 0,10 • но но не обрабатывали

49/8-1 Сгу- но но митомицин С

* - методом тонкослойной хроматографии ** - исходный авгоклавкроваднай бупернатант (1х) и сконцентриро-

ванный в 2 раза (2.x) *** - отрицательный результат но - не определяли

" IS 7

прототипа (20-30Z) и обеспечило его чистоту - отсутствие спор, тогда как у исходного штамма их от 3 до 107.. Это стало возможным благодаря отсутствию стадий отделения кристаллов от спор и последующей очистки от споровых белков. Кроме того, нет стадии, где органические растворители оказывают вредное влияние на здоровье человека к разрушают структуру кристаллов. В дальнейшем полученная ангисыворогка использовалась для определения антигена при анализе бактериальных клонов, содержащих рекомбинантную ДНК, в составе которой находились генетические детерминанты синтеза £эндотоксина HI серотипа, для количественного определения ^зндотожзина в препаратах битоксибациллина, для выявления иммунологического родства белков и для синтеза иммуносорбента.

На основе аспорогенного штамма ВТ 2-8 можно получать также экологически более чистый препарат, не загрязняющий окружающую среду спорами.

Возможность практического использования штамма 202-Э была показана при наработке чистого препарата экзотоксина на его основе, который использовался как образец для различных лабораторных целей. Этот штамм можно также использовать в качестве продуцента СВР.

При шучеш» связи неляу сттезон экзотоксина и бактериоцияа в штаммах ВТ 202, 1140 и 98 оказалось, что чувствительный микробиологический тест с клетками S.flava /Rosenberg et а1.,1971/ можно использовать для скрининга клоков с повышенным содержанием экзотоксина, но не для поиска Ехо+ к Ехо- штаммов, так как в основном антибактериальный эффект обусловлен присутствием бактериоцинов в культурах. При выяснении их природы было показано, что бактерио-' даны не имеют фаговое происхождение, чувствительны к высокой температуре , трипсину и пролазе, отличаются по спектру антибактериального действия к индикаторным культурам и, очевидно, иыееют белковую природу.

№сектядою<гг& вхашкш. изучение биологической активности мутантов и их исходных штаммов • подтвердило их фенотипические свойства. Культуральная жидкость всех акристаллических вариантов ВТ 202, 1140, 98 и 4.9/8 не подавляла развитие гусениц непарного иелкопряда и, не только исходный, но и сконцентрированный в два раза автрклавированный супернатант акристаллических мутантов ВТ 202 и 1140 не действовал на личинок комнатной мухи. Но, в то же время, автоклавировакный супернатант всех акристаллических вариантов ВТ 98 был токсичен для этого тест-обьекта (табл. 2).

Результата сранмтельаай характеристики плазмидного состава

изучаемых штаммов показали, что утрата Cry+Ехсн- фенотипа клетками штамма ВТ 202 сопровождается элиминацией 55 ВДа плазмиды (202-24) й 60 ВДа плазмиды ВТ 1140 (1140-3-5, -11-4, -9. -RK). Потеря способности к кристаллообразованию в ВТ 98 (98-4, 98-6) коррелирует с удалением 56 ВДа, а в штамме ВТ 49/8 - 31 МДа плазмид. Контроль синтеза кристаллического белка 55 И 56 МДа плазмидамк в ВТ 202 и 98 подтвержден результатами гибридизации плазмидных ДНК этих штаммов с зондом. Что касается штамма ВТ 49/8, тс, по-видимому, или отсутствует область гомологии между сгу-генами ВТ 49/8 и berliner 1715 или, 31 Ща плазмида не детерминирует структурный ген кристаллообразования. При элиминации 49 Ща плазмиды из ВТ 202 (202-3-11, -3-2, -24) и при значительном уменьшении копийности такой- же плазмиды из ВТ 1140 (1140-А), утрачивается способность данных штаммов оказывать бактерицидное действие на рост ряда грампс-ложительных бактерий и Ri2obium phaseoli 693. Ллазмиднкй состав не продуцирующих бактериоцины мутантов штамма ВТ 98 (98-4-1, -4-6, -4-10) остался без изменений, за исключением утраты 7,1 ВДа плазмиды в ВТ 98-4-6. Возможно, как синтез экзотоксина, так и бактери-овдна в шгамме ВТ 98 контролируется или хромосомой или плазмидой, которую не удается элиминировать /Кузина, 1992/.

Перенос плазмид, контролирующих синтез энтомоиидних токсинов, из ВТ 202, 1140, 98 и 49/8 путем трансцепции в клетки культур ВТ и B.cereus, не обладающих этими свойствами, является дополнительным подтверждением плазмидной локализации токсических признаков. Удалось передать 55 и 60 ВДа Сгу-плазмиды, одновременно регулирующие и биосинтез экзотоксина из ВТ 202 и 1140, соответственно, в клетки B.cereus, а также 49 ВДа плазмиду из ВТ 202, отвечающую за образование бактериоцина. Не удалось передать 56 ВДа Сгу-плазмиду, а также признак экзотоксиносбразования из ВТ 98 и 31 МДа плазмиду из ВТ 49/8. Полученные данные являются первым свидетельством того, что геи(ы), регулирующий(не) экзотоксинсобразование могут быть не связаны с плазмидами, регулирующими синтез кристаллического белка.

3. Конструирование, рекомбикантных штаммов на основе В.thuringiensis subsp.thuringiensis, s^ibsp. kurstak i и subsp.tenebrioriis.

Рекомбинангний штамм BT К-19. Для получения этого штамма в качестве реципиента был использован В.thuringiensis

scbsp.thuringiensis 98-4 (Crv-Exc+Otr"'), а в качестве донора -B.thurlngiensis subsp.kurstaki НД1 (Cry+Rif^Tc*), маркированный плазмидой рВС26. В результате проведенного скрещивания получен штамм первого серотила ВТ К-19 (Cry+Exo+StrliTc"), в который передана совместно с плазмидой рВС16 44 МДа Сгу-плазмидэ из ВГ НД1, содержащая ген Сгу1А(Ь)-гипа, регулирующий синтез 130 кДа кристаллического белка. Эти данные были подтверждены гибридизацией по Tsao с использованием плазмщ и рестрицированных Hlnd: 11-фрагментов плззмидной ДНК родительских л рекомбинзнтного штамма, а также методом иммуноблоткнга. При оценке титра спор, количества и активности синтезируемых токсинов оказалось, что сконс-труированый штамм ВТ К-19 несколько превосходит штамм ВТ 98 по •титру спор и инсектицидной активности на личинках комнатной мухи.

Для проведения полевых испытаний экспериментального образца (ЭО) препарата на основе рекомбинантного штамма К-19, эго выращивали в ферментере "Анку.у-225" емкостью ?Ьл на среда ДПС. Черег 46 часов культивирования культураяьная жидкость была высушена на сушильном агрегате "Anhydro" в течение четырех часов. Нолевые испытания ЭО против различных вредителей сельскохозяйственных культур проводили в совхозе "Большевик" Московской области. Расход райочей жидкости составлял 500-600 л/га в открытом грунте и 1000 л/га в закрытом. На основания полученных результатов (учитывая гибель насекомых на 7-й день учета), можно сделать вывод, что биологическая активность SO препарата K-1S практически равна битоксибациллину на гусеницах репной белянки, а по инсектицидному дейстшо на паутинного клеща превышает на 157» битоксибациллин и на 40% лепвдоцид. Однако, необходимо также провести нолевые испытания опытной партии биопрепарата ка основе ВТ К-19, наработанной в заводских условиях.

Таким образом, полевые испытания ЭО препарата К-19 подтвердили возможность использования рекомбинанткого птамма для получения биопрепарата против насекомых отряда Lepidoptera и Coleoptera, являющихся основными вредителями таких ведущих ' сельскохозяйственных t су ль тур как картофель, овощи, фрукты, ягоды, подсолнечник.

, Реяомбияантиый! вггаыы ВТ LT-1. В результате котраисцепции между B.thurlnglensis subsp.tenebrlonis 1516 (Сгу+Кап* Тс * ) и B.thuringiensis subsp.karstak 1 НД1 (Cry+Rif*Tc*pBC16), был получен рекомбикантныи втаим восьмого серотипа ВТ LT-1 (Сгу+Кап*гс*), синтезирующий два S"-эндотоксина, активных против . насекомых отряда

- IB -

Lepidoptera и Coleóptera (в частности, колорадского жука). К сожалению, полученный штамм ВТ LT-1 имеет невысокую стабильность, связанную с утратой Lepidoptera-сгседафической активности. По-видимому. для большей стаоильнэсти сгу-ген из ВТ НД1 следует вводить иными методами - на другом векторе или в составе транспоэона.

4. Исследование динамики накопленияß -экзотоксина природными, мутантныш и рекомбинангкым штаммами ВТ subsp.thurlngiensis

Так как существует задача получения таких штаммов ВТ, в которых наибольший уровень продукции экзотоксина совпадал бы со стадией освобождения спорокристаллического комплекса, важно было выяснить как изменилась цина-м;са накопления экзотоксина в полученных штаммах. Исходные культуры ВТ 202, 98, 620-М, мутантные 98-4, 202-3 и рекомбинантний К-19 выращивали на дрожжеполисахаркдной среде и обедненной солегой среде SSM. Содержание экзотоксина опре-тдедяли с помощью чувствительного изотопного анализа через 12, 16, 20, 24, Ж, 36, 48 и 56 часов роста культур. Оказалось, что большее накопление экзогоксинз происходит в ДПС в поздней логарифмической фазе роста и зависит от стенотипических свойств штаммов.

мкг/мл

202-Э

98-4 Crv-Lxo+ 98 СГУ+ЕХО+

часы

О 10 - 20 30 40 50

Рис.2. Динамика накопления экзотоксина в. .штаммах В. 1Ь1иг1г.д1еп51з эиЬгр. 1Ьиг1п^1епз15 надрожже-полисахаридной среде. По оси абсцисс - время в часах, по оси ординат - концентрация экзотоксина в мкг/мл.

- 1(5 -

^кристаллический мутант ВТ 98-4 имее? белее короткий цикл развития (на 4-6 часов) и обеспечивает белее высоку» продукцию экзотоксина по сравнению с природными Сгу+аггаммами, что возможно, связано с большей экспрессией гэка(оь), регулирующего(их) синтез экзотоксина, благодаря снижению уровня нагрузки на клетку из-за отсутствия синтеза кристаллического белка. Максимальный уровень накоплении экзотоксина в ВТ 202-Э совпадает с максимумом накопления ^эндотоксина из-за более продолжительного периода формирования спор и кристаллов и более короткого - выхода спорокристаыического комплекса (Рис.2). При введении Огу-ллазмвды из ВГ НД1 в акристаяличес-кий вариаш ВТ 98-4 (ВТ К.-19). динамика накопления экзотоксина в нем стала подобна кинетике образования экзотоксина з природном крхсталлоабрагующем ¡птгмне ВТ 98.

ВЫВОДЫ

1. Изучен состав плазмидчьи комплексов штаммов ВТ продуцентов битоксибациллина и дендробациллияа. Клетки БЛЬиПпг1епг15 зиЬБр.ШпЧп^епзгз 1140 содержат 9, 202 - 7, 98 - 5, ВЛЬспп^ГепБ^ зиЬБр. йепйгоНии-ч 49/8 - 4 внехромоеомных элемента с Мг от 3,6 до 78 ЭДа. В структуру глазмид с Мг 78, 55, 46 и 3? ЩГа штамма ВТ 202 входят инвертированные повторяющиеся последовательности.

2. Установлено , что Сгу-Ехо- фенотип коррелирует с утратой плазмид с Мг 55 и 50 МДа в штаммах ВТ 202 и 1140, соответственно. Синтез £эндотоксина в ВТ 98 детерминируется 56 ЭДа плазмидой. Впервые показано, что гек(ы), регулирующий(ие) экзотсксинсобразо-вание в этом штамме не локаляаоваи(ы) на Сгу-плазмид е. Синтез бач-гериоцииа в итамме ВТ 202 контролируется плазмидой с Мг 49 МЯа.

3. Получен гетамм 8.Щ]г1пг1епз1з зиЬзр. 1Ьиг1пг1еп515 202-Э ' (Згс+Сгу+Ехэ-'Кап*) с повышенной на 30% продукцией экзотоксина по сравнению с другим? гкзотсксинсодержзлдоми продуцентами СЭР.

4. Выделен аспорогешыб штамм В. №иг:г.г1епз1В БиЬзр. ШлПпеиегшэ 2-8 (Зро- Сгу НЕхо+Кап"), применение которого позволило упросткть методику получения антисыворотки ¡^эндотоксину ВТ Н1. •

5. Сконструирован рскомОккангньш штамм В. ^ипп51епз1з • зиозрЛЬиг1п£1епз15 К-19 (Зрсн-Сгу+Ех'^ЬЧг^Гс'''), который может быть

- V? -

рекомендовал для производства биоиисектицидоЕ.

6'. Получен рекомбинантиьм итамм- S.thuritigiensis stibsp.tenebrionis LT-1 (Spo+CryfKar/Tc'S, синтезирующий две<£знцо-тсксина с Lepidoptera- и Coleóptera - специфическими активностям»;.

7. Изучена возможность использовании чувствительного микробиологического теста с клетками Sarcina flava для скрининга Ехе+ и Ехо- клонов. Показано, что наблюдаемый антибактериальный эффект обусловлен, в основном, синтезом бактеркоцжов белковой природы.

8. Исследована динамика накопления fi-экзотоксина природными, мутачтными и рекомбккантяьш штаммами B.thurt.nffiensts subsp.thur.lng-iensi.s.. Установлено, что максимальный уровень накопления экзотоксина наблюдается в дрслжеполисахаридкой среде в поздней логарифмическом фазе роста культур и зависит от фенстипическич свойств штаммов.

СПИСОК РАБОТ, ОЛУБДЖОЗАНКЫХ ПО ТИ1Е ДИССЕРТАЦИИ

1. Шевцов В.В., Шелокова Е.В., Славновз B.C., Абросимова Л.И... Жиркова H.A., Мазанов А.Л., Чигалейчик Л.Г., Кузина Л.В. К использованию показателей гидролитической активности длч отбора вирулентных тонов Bacillus tnurircgiensis //Сельскохозяйств. биология. - 1985. -N 12. - С. 52-Ü5.

Z. Кузина л.В., Андреева А. Ji., Данилова Э. Б., Ершов». В., Добрица A.1L Характеристика генетических детерминантов тсксинссб-разовашя штаммов Bacillus tburlnglensls -продуцентов битоксибациллина и дендробацчллпнэУ/Тез.кояф."Пути совершенствования микробиологической борьбы с вредными насекомыми и болезнями растений", 1986,- С. 213-214.

3. Кузина Л.В., Epcos Ю.В. Лтазмидные комплексы штаммов Bacillus thuringiensi5 продуцентов битоксибациллина и дендробацил-лина //Матер. 1 отраслевой кокф. конкурса молод, ученых "Актуальные проблемы биотехнологии", Новосибирск, 19-21 алр. - 1980. - С. S1-52.

4. Кузина Л.В., Андреева А. Л., (Добрица А. П. Штамм бактерий Bacillus thuringiensis subsp.t.hurlngi^nsis для получения энтомопа-тогеяного препарата //A.c. N 1483941, СССР - 1989.

5. Кузина Л.В., Андреева А.Л. Способ получения антисыворотки к ^эндотоксину Hl Bacillus thuringiensis //A.c. К 14S7799.. СССР -

1989.

6. Трофимекко А.Ф., Кузина Л.В. Исследование 27родукцииу;)-экзотоксина природными и мутантными штаммами Bacillus thuring-iensis sabsp.thurlngiensis/zTes. Всес. конф. "Проблемы ссзданля и применения микробиологических средств защиты растений", Велегож.- 1989. - С.44.

7. Кузина Л.В., Андреева А.Л., Асланян K.M., Добрица А.П., Данилова Э.Б., Бочаров Е.А. Изучений природы детерминантов синтеза Г-эндотоксина и ^-экзотоксина в штаммах Bacillus thuringiensis subsp.thuringiensls - продуцентах битоксибациллика /УМолек. генетика, микробиология и вирусология. - 1992. - N 21-12.

цниЭИг™"- *»• *•«" |в66