Экологические особенности энтомопатогенных бактерий вида bacillus thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки

Вятчина, Ольга Федоровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экологические особенности энтомопатогенных бактерий вида bacillus thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Экологические особенности энтомопатогенных бактерий вида bacillus thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки"

На правах рукописи

Вятчина Ольга Федоровна

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS THURINGIENSIS, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В БИОЦЕНОЗАХ КАМЧАТКИ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2003

I I

Работа выполнена на кафедре микробиологии

Иркутского государственного университета I

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Дрюккер Валентин Валерианович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник Мамонтова Лилия Михайловна;

ка щидат биологических наук, старший научный сотрудник Огаркова Галина Родионовна

Ведущее учреждение: Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (г. Улан-Удэ).

Защита состоится 8 октября 2003 г. в /У час. ЗО мин. на заседании диссертационного совета Д 212. 074.07 Иркутского государственного университета по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского государственного университета.

Автореферат разослан " $ " 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.С. Купчинская

¿.ooj - н

\JbJ2, ОБ1ГАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Экологические аспекты изучения Bacillus thuringiensis имеют большое значение для выяснения роли этих факультативно-энтомопатогенных бактерий в биоценозах. Это важно не только для понимания отношений «хозяин-паразит», но и для целенаправленного поиска природных

штаммов с высокой энтомоцидной активностью.

Распространение отдельных серовариантов Вас. thuringiensis по географическим зонам обнаруживает определенную закономерность. В связи с этим представляют интерес исследования по изучению распространения Вас. thuringiensis в биоценозах Камчатки. Изолированность Камчатки от соседних территорий, а также своеобразие формирования энтомофауны полуострова, которая в послеледниковое время во многом развивалась и развивается как островная фауна, привлекают внимание с точки зрения выявления комплекса циркулирующих здесь серовариантов Вас. thuringiensis, тесно связанных паразитическими взаимоотношениями с насекомыми.

Новизна и научная ценность работы. Впервые исследованы лесные и сельскохозяйственные биоценозы Камчатки с целью выявления энтомопатогенных бактерий вида Вас. thuringiensis. Выявлено, что в биоценозах Камчатки циркулируют различные сероварианты: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus, canadensis. Доминирующим серовариантом является ssp. dendrolimus.

При изучении естественной эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.), обнаруженной в Пенжинском районе Камчатской области, установлено, что ее причиной является не один штамм Вас. thuringiensis, а комплекс штаммов следующих разновидностей: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus. Выделенные культуры отличались продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, ферментативной и биологической активностью. Среди изученных штаммов выявлей внутривидовой антагонизм. Отдельные особи насекомых явились источником выделения нескольких биотипов Вас. thuringiensis. При изучении эпизоотии обнаружен экзотоксигенный штамм 3-го сероварианта.

Высокопродуктивные и высоковирулентные штаммы выделялись не только из

погибших, но и из живых особей восприимчивы» (^¿^дц'^о^А^ШЙ! ридов'

БИБЛИОТЕКА

С.ПетерйурГ 09 I

входящих в различные звенья трофической цепи: «кормовое растение - фитофаги -зоофаги - некрофаги».

Обнаружены штаммы Вас. thuringiensis, обладающие необычной морфологией. Штамм К 56 (ssp. dendrolimus), выделенный из имаго березового пилильщика (Cimbex femorata Schrank), образует включения исключительно овоидной формы. Неидентифицированный штамм К 17-3, выделенный из комара-долгоножки (сем. Tipulidae), формирует крупные кристаллы, плотно прилегающие к споре одной из своих граней. Оба штамма оказались непатогенными по отношению к личинкам чешуекрылых.

Цель исследований. Целью исследований явилось изучение экологических особенностей Вас. 'thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки, а также выделение Lepidoptera- и £>гр/ега-активных штаммов Вас. thuringiensis.

Исходя из цели исследований были поставлены следующие задачи:

1 .Изучить распространенность Вас. thuringiensis в биоценозах Камчатки.

2.Провести сравнительное исследование морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств выделенных штаммов Вас. thuringiensis.

3.Изучить серологические свойства выделенных штаммов.

4.0пределить продуктивность культур Вас. thuringiensis

5.Изучить биологическую активность и выявить спектр патогенности выделенных культур.

Положения, выносимые на защиту.

1. Энтомопатогенные бактерии вида Вас. thuringiensis являются постоянным компонентом лесных биоценозов Камчатки и выделяются из различных звеньев трофической цепи: «кормовое растение - фитофаги - зоофаги - некрофаги».

2. Высокопродуктивные и высоковирулентные штаммы Вас. thuringiensis выделяются как из организма погибших особей, так из организма живых особей, восприимчивых и невосприимчивых видов членистоногих.

3. Функционирование в пределах одной бактериальной эпизоотии различных биотипов Вас. thuringiensis обеспечивает устойчивую циркуляцию инфекции в природном очаге.

4. В кишечнике насекомых могут сосуществовать различные сероварианты Вас. thuringiensis.

5. Природные штаммы Вас. thuringiensis в отличие от типовых серологически неоднородны и не стабильны.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований выделены Lepidoptera-активные штаммы, пригодные для производства бактериальных препаратов и экзотоксигенный штамм, эффективный по отношению к двукрылым и чешуекрылым, который может быть использован в качестве продуцента бактериального препарата широкого спектра действия. Для культивирования Вас thuringiensis с целью удешевления питательной среды предложена среда на основе экстракта дождевых червей (красного калифорнийского гибрида), используемого в качестве белкового компонента. Оформлены документы на получение патента.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Результаты исследований докладывались:

- на Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений" (Велегож, 1989);

- на региональных конференциях: «Энтомологические проблемы Байкальской Сибири» (Иркутск, 1997), «Биоразнообразие микроорганизмов ВосточноСибирского регаона и их научно-практическое использование» (Иркутск, 1999);

- на Российской научно-пракгаческой конференции "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе" (Иркутск, 2002).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов, приложения, списка литературы из 192 наименований, в т. ч. 66 иностранных работ. Работа изложена на 188 страницах, содержит 23 таблицы и 33 рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования явились 76 штаммов Вас. thuringiensis, выделенных из патологического материала, собранного в Мильковском, Пенжинском и Елизовском районах Камчатки. Бактериологическому анализу были подвергнуты здоровые,

больные и погибшие особи насекомых отрядов Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera, Diptera\ особи класса паукообразных (Arachnida)-, дождевые черви (Oligochaeta); моллюски класса брюхоногих (Gastropoda); образцы почвы, лесной подстилки, коры, листьев различных растений. Десять штаммов было выделено из особей личинок и куколок лиственничной мухи {Hylemyia laricicola Karl.), погибших при естественной эпизоотии популяции вредителя, обнаруженной на р.Таловка в Пенжинском районе.

Собранных насекомых фиксировали по методике Талалаева Е.В. (1961) и подвергали бактериологическому анализу. При изучении морфологических и культуральных признаков выделенных бактерий использовали общепринятые в микробиологической практике методы. Исследования по выяснению морфоструктуры вегетативных клеток, спор и кристаллов производили при помощи трансмиссионного электронного микроскопа BS-540 фирмы «Tesla» с разрешающей способностью 10 А и увеличением до 150000. Изучение физиолого-биохимических признаков штаммов проводилось в соответствии со схемой Баржак-Бонфуа (Barjac, Bonnefoi, 1973, 1990). Определение серологического варианта проводили при помощи объемного способа (Талалаева, Покровская, 1978). Индивидуальные антигенные свойства штаммов на популяционном уровне изучались на перекрестных реакциях агглютинации с типовыми Н- и О- антисыворотками. Перекрестный антагонизм у штаммов Вас. thuringiemis исследовали при помощи метода агаровых блочков (Егоров, 1995). Продуктивность культур определяли методом серийных разведений с высевом на МП А (Завезенова, Гиль, 1984). Предварительную оценку инсектицидной активности кристаллообразующих штаммов проводили на личинках Aglais urticae L., Hyponomeuta evonymellus L., Margaritia sticticalis L., Aporia crataegi L., Inachis ioL. Сравнительное изучение инсектицидности наиболее активных штаммов Вас. thuringiensis проводили на личинках Aglais urticae L. и Lymanthria dispar L. с последующим определением LK50 (Лескова и др., 1984). Содержание Д-экзотоксина в культуральной жидкости проводили спектрофотометрическим методом. Экзотоксигенность определяли на личинках Musca domestica L. и Galleria mellonella L. (Лебедева, Неудачина, 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В результате изучения морфолого-культуральных, физиолого-биохимических и серологических свойств выделенных штаммов три из них отнесены к ssp.

thuringiensis-, четыре - к ssp. kurstaki, два - к ssp. alesti; четыре - к ssp. canadensis; 62 штамма - к ssp. dendrolimus. Штамм К 17-3 не прореагировал ни с одной из имеющихся сывороток.

1. Распространение Bacillus thuringiensis в различных звеньях лесного биоценоза

В результате проведенных исследований выявлено, что Вас. thuringiensis

встречается в разных звеньях лесного биоценоза и может бьггь выделен не только из насекомых различных таксономических групп, но и других членистоногих, а также с тех объектов, с которыми эти животные контактировали. Вас. thuringiensis связан с основными компонентами лесного биоценоза по следующей трофической цепи:

Кормовое растение

Фитофаги

(восприимчивые и невосприимчивые к заболеванию насекомые)

Зоофаги

(невосприимчивые к заболеванию хищные и паразитические членистоногие)

Некрофаги

Следует отметить, что из 76 культур 67 выделено из насекомых различных отрядов. Зараженность от общего числа обследованных насекомых составила 4,7 %.

Наибольшее количество штаммов (54) выделено из живых насекомых различных отрядов как восприимчивых к Вас. thuringiensis, так и из устойчивых к нему. Основным источником выделения (52 штамма) явились насекомые-фитофаги следующих отрядов: Coleóptera (сем. Cerambycidae, Chrysomelidaé), Lepidoptera (надсем. Tineoidea), Hymenoptera (сем. Cimbicidaé), Díptera (сем. Anthomyinae, Tipulidaé). Важную роль в передаче Вас. thuringiensis в биоценозе играют хищные, паразитические членистоногие и насекомые-некрофаги, связанные тесными трофическими связями с восприимчивыми к Вас. thuringiensis насекомыми. Закономерным явилось выделение различных подвидов Вас. thuringiensis из наездников (сем. Jchneumonidae), муравьев (сем. Formicidae), божьих коровок (сем. Coccinellidae), пауков (отр. Araneí). Четыре культуры Вас. thuringiensis было изолировано с листьев жимолости голубой (Lonicera caerulea L.).

2. Штаммы Вас. thuringiensis, циркулирующие при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.)

При исследовании эпизоотии лиственничной мухи было выявлено, что ее причиной является не один штамм Вас. thuringiensis, а комплекс штаммов следующих разновидностей: ssp. thuringiensis, alesti, kurstaki, dendrolimus.

Бактериологический анализ показал, что отдельные особи являются резервуаром выделения нескольких биотипов Вас. thuringiensis. Штаммы ssp. kurstaki (3-2кс; З-Зкс; 7-13кс; 7-14кс) были выделены из погибших куколок лиственничной мухи. Причем, культуры 3-2кс, З-Зкс и 7-13кс, 7-14кс обитали в разных особях. И в первом и во втором случае один штамм был более высокопродуктивным. 7-13кс продуцировал экзотоксин (0,246 мг/мл).

Еще более уникальным было выделение четырех штаммов Вас. thuringiensis, обладающих различными биологическими свойствами, из одной погибшей личинки. Два штамма 6-9кс и 6-1 Оке, идентифицированные как ssp. thuringiensis, при одинаковой продуктивности (2,75±0,10х109 сп/мл) отличались биологической активностью по отношению к различным насекомым. Культура 6-9кс оказалась более активной. Штаммы 6-11кс (ssp. dendrolimus) и 6-12кс (ssp. alesti), выделенные из этой же особи, обладали более высокой продуктивностью (4,17±0,17х109 и 5,50±0,26х109 сп/мл), проявив при этом и высокую биологическую активность.

Из десяти штаммов Вас. thuringiensis, выделенных при эпизоотии, один штамм ssp. kurstaki З-Зкс обладал антагонистическими свойствами по отношению к большинству культур, в т.ч. и к 3-2кс, выделенной из той же особи погибшей куколки, что и штамм - антагонист.

Обнаружение при эпизоотии штаммов различных биотипов Вас. thuringiensis, отличающихся продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, биологической активностью, вероятно, обеспечивает устойчивость природной популяции патогенных микроорганизмов в условиях среды, определяющихся специфическим климатом Камчатского полуострова (высокая влажность, низкая температура).

3. Морфологические и культуральные особенности камчатских штаммов

В морфологическом отношении выделенные культуры представлены палочками длиной от 2,21 до 4,60 мкм, шириной от 0,73 до 1,80 мкм. Длина спор варьирует от 1,02 до 2,61 мкм, ширина - от 0,58 до 1,90 мкм.

Электронно-микроскопическое изучение кристаллов эндотоксина показало большое разнообразие в размерах и формах, как между различными серовариантами, так и в пределах одного штамма. У штамма 6-9 кс кристаллы кубической и неправильной формы со сглаженными вершинами и нечеткими гранями размером 1,75±0,05*1,40±0,02 мкм (рис. 1).

Рис. 1. Кристаллы эндотоксина штамма 6-9кс. х 12 ООО Рис.2. Кристалл эндотоксина штамма К18. х 40 ООО

Штаммы 3-го серо варианта (ssp. kurstaki; alesti) имеют кубическую, неправильную и ромбическую форму. Размеры варьируют: длина от 1,25 до 2,25 мкм, ширина - от 0,83 до 1,73 мкм.

Инклюзии штаммов ssp. canadensis К 14, К 15, К 18 имеют кубическую форму или форму широкого ромба со сглаженными вершинами (рис. 2). Для штамма К 16 характерно преобладание кристаллов ромбовидной формы, единичны кристаллы с неопределенной формой. Длина кристаллов колеблется от 1,40 до 1,81 мкм, ширина - от 0,65 до 1,40 мкм.

Культуры ssp. dendrolimus, выделенные из различных объектов, чаще имеют кристаллы правильной ромбовидной формы. Для штамма ssp. dendrolimus К 32 характерны включения неправильной геометрической формы (рис. 3). Штамм ssp. dendrolimus К 38 наряду с типичными кристаллами ромбической формы образует шаровидные включения белковой природы (рис. 4).

Штамм ssp. dendrolimus К 56, выделенный из имаго березового пилильщика (Cimbex femorata Schrank), образует инклюзии исключительно овоидной формы размером 0,75±0,01х 0,6ь±0,01 мкм, не свойственные для данного сероварианта (рис. 5). Штамм К 17-3, выделенный из комара-долгоножки, образует крупные кристаллы (2,10±0,05х1,58 ±0,03 мкм), плотно прилегающие к споре одной из своих граней (рис.6). Такая морфология кристаллов не характерна для известных разновидностей Вас. thuringiensis.

Рис. 3. Кристаллы эндотоксина Рис. 4. Кристаллы и шаровидные

штамма К 32. х 30 ООО включения штамма К 38. х 80 ООО

Рис. 5. Эндотоксин штамма К 56. х 35 ООО Рис. 6. Кристалл эндотоксина штамма 17-3. х 44 ООО

На МПА исследуемые штаммы образуют колонии округлой формы, за исключением штамма ssp.canadensis К 18, образующего колонии неправильной амебовидной формы. Окраска колоний включает различные оттенки белого. Колонии матовые, тускло- или жирно-блестящие. Штамм 6-9кс отличается полупрозрачными колониями. Профиль плоский, реже выпуклый или изогнутый, поверхность - гладкая или шероховатая. Край волнистый, зубчатый, ризоидный, ршоидно-лопастной, ворсинчатый или ровный. Структура колоний мелкозернистая, ,

крупнозернистая или однородная.

4. Физиолого-биохимические свойства камчатских штаммов (,

Изучение физиолого-биохимических признаков камчатских штаммов показало, что в некоторых случаях наблюдается значительная корреляция с дифференциальным ключом Баржак-Бонфуа.

Штаммы мр. thuringiensis образовывали АМК, обладали высокой лецитиназной, амилолитической и протеолитической активностью, что соответствует дифференциальному ключу. По физиологическим признакам из трех штаммов 1-го сероварианта наиболее полно типовому я.чр. гЬипп&ет1з соответствовали 6-1 Оке и

К 24. Штамм 6-9кс по отношению к маннозе, сахарозе и салицину больше тяготеет к ssp. dendrolimus.

Штаммы 3-го сероварианта (ssp. kurstaki и alesti) соответствовали ключу Баржак-Бонфуа, за исключением способности ферментировать сахарозу.

Камчатские штаммы ssp. dendrolimus обладали высокой лецитиназной, амилолитической и протеолитической активностью, что является типичным признаком для этого сероварианта. К 32 не образовывал лецитиназу, хотя и обладал высокой биологической Активностью. Вариабельным оказалось отношение штаммов ssp. dendrolimus к сахарозе, маннозе, эскулину и мочевине. Штаммы ssp. dendrolimus (III-6; К 1-3) отличались от типового способностью образовывать АМК. Для двух штаммов ssp. dendrolimus характерно пигментообразование. К 56 образовывал пигмент розового цвета на картофеле и кофейного цвета в ДПС. Культура III-5, выделенная из паука, продуцировала пигмент кофейного цвета в МПБ.

Камчатские штаммы ssp. canadensis в отличие от типовой культуры образовывали уреазу, а штамм К 14 не ферментировал эскулин.

Физиолого-биохимические признаки К 17-3 не соответствовали ни одному варианту Вас. thuringiensis. Штамм образовывал АМК, уреазу, амилазу, лецитиназу, пептонизировал молоко разжижал желатину, ферментировал сахарозу, не использовал маннозу, салицин и эскулин. На картофеле образовывал пигмент сиреневато-розового цвета.

5. Серологические свойства камчатских штаммов Bacillus thuringiensis

Серологически неоднородными и нестабильными оказались культуры Вас.

thuringiensis, обнаруженные при эпизоотии лиственничной мухи. Интересен штамм

6-9кс, имеющий сложную антигенную структуру и отличающийся нестабильностью

антигенных свойств. Эта культура, идентифицированная Баржаковскими Н-

антисыворотками как Вас. thuringiensis ssp. thuringiensis, при повторной

серотипизации не подтвердила свою принадлежность к 1-му сероварианту. При

рассеве три варианта из десяти дали яркую реакцию агглютинации с Н- и О-

антисыворотками ssp. thuringiensis, обнаружив при этом перекрестные реакции

агглютинации (ПРА) с ssp. kurstaki, galleriae, canadensis, aizawai. Четыре

прореагировали с антисыворотками ssp. dendrolimus, давая при этом ПРА с

сыворотками 3-го и 5-го серовариантов. Один вариант, четко прореагировав с

О-антисыворотками ssp. dendrolimus при параллельной агглютинабельности к ssp.

thuringiensis, отличался пестрой мозаикой перекрестных реакций (с ssp. alesti,

canadensis, aizawai, darmstadiensis). При рассеве двух серологически контрастных

колоний вновь произошло расщепление вариантов по антигенным свойствам. При этом выделялись штаммы ssp. dendrolimus, thuringiensis и штаммы, проявляющие параллельную агглютинабельность к сывороткам 1-го и 4-го серовариантов. Таким образом, этот природный штамм содержит детерминанты 1-го и 4-го серовариантов, что коррелирует с его биохимическими признаками.

Иную антигенную структуру имел ssp. thuringiensis 6-1 Оке, выделенный из той же погибшей особи лиственничной мухи, что и штамм 6-9кс. Этот природный штамм 1-го сероварианта проявил антигенную близость к ssp. kurstaki, давая ПРА с ssp. galleriae и aizawai. При рассевах штамма 6-1 Оке выделялись как варианты, проявляющие антигенное сродство к ssp. thuringiensis, так и варианты, утратившие антигенные детерминанты 1-го сероварианта, реагирующие только с сыворотками ssp. kurstaki. По биохимическим признакам культура тяготеет к ssp. thuringiensis.

Штаммы 3-го сероварианта, циркулирующие в популяции лиственничной мухи, при четкой реакции агглютинации с типовыми антисыворотками, проявили антигенную близость к ssp. galleriae и thuringiensis. Для штаммов ssp. kurstaki 3-2кс и 7-14кс характерными являются ПРА с антисывороткой ssp. darmstadiensis. Культура ssp. kurstaki 7-13кс отличалась от штаммов 3-2кс и 7-14кс тем, что давала ПРА не только с антисывороткой ssp. galleriae, но и с ssp. canadensis. Кроме того, для этого штамма свойственны ПРА с сывороткой ssp. aizawai.

Следует отметить, что штамм 3-2кс при повторном рассеве не проявил анти-хенной близости к ssp. finitimus, но обнаружил сродство к ssp. thuringiensis, а 7-14кс при вторичном рассеве утратил антигенные связи с ssp. thuringiensis. При рассеве штампа 7-13кс произошло выделение варианта, который дал четкую реакцию агглютинации с Н- и О-антисыворотками 1-го сероварианта, сохранив при этом свойственные для этого природного штамма ПРА с ssp. canadensis и aizawai.

Штаммы ssp. alesti 4кс и 6-12кс проявили антигенную близость к ssp. darmstadiensis. При рассевах этих культур также произошло выделение вариантов, отличающихся тем, что они не агглютинировали с типовыми сыворотками 3-го сероварианта. У культуры 4кс два варианта дали четкие реакции агглютинации с Н- и О-сыворотками ssp. finitimus, проявив при этом агглютинабельность к сывороткам ssp. thuringiensis, dendrolimus и darmstadiensis. У штамма 6-12кс при рассеве выделился серологически чистый вариант, четко прореагировавший только с Н- антисывороткой ssp. thuringiensis.

Камчатские штаммы ssp. canadensis дали яркую реакцию агглютинации с

антисывороткой canadensis, проявив параллельно агглютинабельность к galleriae.

Штаммы К 14 и К 15 дали перекрестные реакции с антисыворотками ssp. dendrolimus, darmstadiensis и thompsoni, штамм К 18 перекрестно прореагировал только с антисывороткой ssp. darmstadiensis.

Все камчатские штаммы ssp. dendrolimus четко прореагировали с антисыворотками ssp. dendrolimus, давая ПРА с ssp. sotto, darmstadiensis, alesti, thuringiensis, реже - с ssp. galleriae, kurstaki и thompsoni. Исключением является К 56, который при первичной серотипизации слабо прореагировал с антисывороткой ssp. dendrolimus, проявив также слабое родство к ssp. sotto, thuringiensis, darmstadiensis. При рассеве штамма четыре варианта четко агглютинировали с антисыворотками ssp. sotto, четыре - с dendrolimus при параллельной агглютинабельности к darmstadiensis. Два варианта слабо прореагировали с сыворотками ssp. alesti и darmstadiensis. По физиолого-биохимическим признакам штамм наиболее полно соответствует ssp. dendrolimus.

Серологическая нестабильность и неоднородность природных штаммов, по-видимому, связана с условиями их обитания, а именно, с их функционированием, как в организмах восприимчивых, так и невосприимчивых к Вас. thuringiensis насекомых и других членистоногих, а также в субстратах, контактирующих с ними (почва, растения и т.д.). 6. Продуктивность

Из десяти штаммов, явившихся причиной бактериальной эпизоотии, наибольшей продуктивностью обладали: ssp. kurstaki 6-12кс (5,50±0,26><109 сп/мл), 7-14кс (5,12±0,41х109 сп/мл) , 3-2кс (4,83+0,10x109 сп/мл) и ssp dendrolimus 1кс (4,55+0,12x109 сп/мл). Наряду с высокопродуктивными штаммами при эпизоотии в популяции лиственничной мухи циркулировали штаммы с низкой продуктивностью: ssp. kurstaki 3-3кс (3,02±0.10х109 сп/мл); ssp. alesti 4кс (2,54+0,10x109 сп/мл); ssp. thuringiensis 6-9кс и 6-1 Оке (2,75±0,10хЮ9 сп/мл). Высокопродуктивные штаммы выделялись не только из погибших при бактериальной эпизоотии насекомых, но и из живых бациллоносителей восприимчивых насекомых (К 3-4(2); К 3-10 (2); К 6-40) и невосприимчивых к Вас. thuringiensis насекомых (К 20; К 32; К 1-1; III-9; К 26; К 56). Среди выделенных культур имеются штаммы, обладающие высокой продуктивностью и биологической активностью (1кс; 3-2кс; 6-12кс; 7-14кс; 1П-5; Ш-7; III-8; К 2-1; К 20; К 32), и штаммы, обладающие низкой продуктивностью и высокой биологической активностью (6-9кс; З-Зкс).

В ходе исследований по определению продуктивности и для наращивания биомассы наряду со стандартными средами была использована новая питательная среда на основе экстракта красного калифорнийского гибрида. Продуктивность штамма А5р. кхтХакл 7-1]Зкс на новой среде составила 5,10±0,15х109 сп/мл, что превышает продуктивность при использовании стандартных сред (4,21±0,17х109 сп/мл). Развитие культуры шло синхронно, штамм продуцировал типичные для китаШ кристаллы. 7. Биологическая активность

Первичная оценка инсектицидной активности штаммов Вас. выделенных при эпизоотии лиственничной мухи показала, что культуры обладают высоким патогенным потенциалом по отношению к личинкам черемуховой моли и крапивницы. Луговой мотылек оказался менее восприимчивым к действию исследуемых штаммов Вас. Шипщ1ет1в (табл. 1).

Таблица 1

Биологическая активность камчатских штаммов Bacillus thuringiensis, выделенных при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.)

Штамм Титр, млрд. сп/мл Гибель насекомых, %

Черемуховая моль (Hyponomeuta evonymellus L.) Луговой мотылек (Margarina sticticalis L.) Крапивница (Agíais urticae L.) Павлиний msß(Inachis io L.)

1кс 4,55±0,12 98,25±0,00 69,05±4,.76 98Д5±0,00 -

3-2кс 4,83±0,10 90,91+2,94 71,43±4,13 98,25+0,00 -

З-Зкс 3,02±0,10 98,25+0,00 64,29±4,13 98,25±0,00 -

4кс 2,54±0,10 74,28+4,09 7б,19±6,.31 - -

6-9кс 2,75±0,10 98,25±0,00 61,91+2,38 - -

6-1 Оке 2,75±0,10 79,55±3,94 64^29+4,13 96,51+1,75 -

6-Пкс 4,17±0,17 98Д5±0,00 69,05£2,38 98,25+0,00 -

6-12кс 5,50±0Д6 98,25±0,00 98Д5±0,00 - -

7-13кс 4Д1±0,17 79,55±3,94 73,81+2,38 - 90,47±2,38

7-Икс 5,12±0,41 98,25+0,00 92,30±1,83 - 98,25±0,00

Примечание: "-"-отсутствиеданных

Исследование динамики гибели насекомых показало, что при использовании неразбавленной культуральной жидкости (КЖ) высоковирулентные штаммы вызывали максимальную габель на 3-й сутки. При снижении титра суспензии инфекционный процесс становится более растянутым, однако к концу опыта процент смертности насекомых достигает достаточно высоких значений (рис. 7).

При действии культур Вас. thuringiensis, обладающих меньшей биологической активностью по отношению к используемым тест-объектам, заболевание насекомых

носит более затяжной характер. Максимальная гибель происходит при использовании высоких концентраций КЖ. При снижении титра, как правило, смертность значительно снижается (рис. 8).

3 Б 7 сутки

Рис.7. Биологическая активность штамма 1кс на личинках крапивницы (Agíais urticae L.)

Титры используемых суспензий ЕЮ - 4.55±0.12хЮ,сп'чл ЕП -2.25±0.20х10! сгУмл ЕЕЗ - 8.04i0.17xl0'm\u

3 5? сутки

Рис. 8. Биологическая активно лъ штамма 6-10 кс на личинках крапивницы (Agíais urticae L.)

Титры иснсыызуемых суспензий В - 2.75±0,10x10'сп/мл в -0,98±0,14x10! cn/мл ВЯ - 1,84±0,09х10'сп/мл

Изучение биологической активности Вас. thuringiensis, выделенных из живых особей невосприимчивых насекомых, показало, что эти насекомые также могут являться источником выделения высоковирулентных культур. Наибольшей активностью отличался штамм ssp dendrolimus К 2-1, выделенный из полынного листоеда, который при испытании на личинках боярышницы вызывал высокую гибель уже на 3-й сутки (81,40+ 2,32 %). На 7-е сутки учета гибель составила 98,25±0,00 %. Следует отметить, что при снижении титра суспензии, используемой для заражения, процент гибели практически не снижался (рис. 9).

Рис. 9. Биологическая активность штамма К 2-1 на личинках боярышницы (Арогш сгШае%11.)

Титры используемых суспензий В - 4,38±0.05х109 сп/мл ЯП -2.44i0.08xlО5 сп/мл ШЯ - 4.10+0.02x101 сп/мл

Высокой биологической активностью обладали штаммы К 20 и К 32, также выделенные из живых особей полынного листоеда. Однако инфекционный процесс, вызываемый этими штаммами, в отличие от К 2-1, растянут во времени и максимальная гибель приходится на 7-е сутки (рис. 10).

3 6 7 сутки

Рис. 10. Биологическая активность штамма К 32 иа личинках боярышницы (Арогш crataegi L.)

Титры используемых суспензий.

В - 4,45±0,20х 10'сп/мл В - 1,72+0.15х105 сп/мл И - 2,37±0.08х10'сп/мл

' Высоковирулентные штаммы ssp. dendrolimus были выделены из особей пауков и муравьев, невосприимчивых к действию этих патогенных бактерий. Гибель крапивницы составила от 92,47±3,56 до 98,25±0,00 %.

Камчатские штаммы ssp. canadensis К 15, выделенный из наездника и К 18 - из личинки божьей коровки, оказались более эффективными против личинок павлиньего глаза (89,92+2,95 и 98,25±0,00%, соответственно). Гибель лугового мотылька составила от действия культурыК 15 - 80,95±2,38%, К 18 - 71,43±4,13%.

Штаммы, показавшие высокую инсектицидную активность (1кс; 6-11кс; 6-12кс; 7-14кс), были оценены по LK50. Высокие результаты показал ssp. kurstaki 7-Икс как на личинках непарного шелкопряда (3,05±0,12 х 106 сп/мл), так и на личинках крапивницы (3,4510,23x106 сп/мл). У штамма ssp. dendrolimus 1кс LK50 на непарном шелкопряде составила 4,4210,09*106, на крапивнице - 3,63±0,15х106 сп/мл. Значение LK50 штамма ssp. thuringiensis 6-9кс на непарном шелкопряде и крапивнице составило 6,00±0,04хЮ6 и 5,91 ±0,27x106 сп/мл, соответственно. LK50 штамма ssp. alesti 6-12кс на крапивнице - 5,45±0,38х106, на непарном шелкопряде - 11,83±0,19хЮ6 сп/мл.

Штаммы ssp. kurstaki 7-14кс и ssp. dendrolimus 1кс могут быть использованы в качестве продуцентов для производства бактериальных препаратов. 8. Действие {^-экзотоксина камчатских штаммов на личинок комнатной мухи (Musca domestica L.) и большой пчелиной огневки (Gallería mellonella L.)

По отношению к личинкам Musca domestica L. наиболее активным оказался штамм 6-9кс, образующий 0,298 мг/мл экзотоксина. При воздействии дозы 0,9 мл КЖ гибель составила 72,41+6,91 %. Более низкая биологическая активность оказалась у штамма 6-10кс (51,72±6,90 %) и 7-13кс (41,38±6,90 %).

При использовании для заражения неразбавленной неавтоклавированной КЖ у штамма 6-9кс шбель личинок составила 86,21±3,45 %, 7-Икс-75,8716,90 %, 6-10кс - 55,17±3,45 %. Использование автоклавированной КЖ привело к снижению показателя смертности личинок, что объясняется наличием спор и кристаллов, обнаруженных при микроскопировании в неавтоклавированной КЖ.

Аналогичные результаты были получены при испытании штаммов на личинках Gallería mellonella L. В первой серии опытов с неавтоклавированной КЖ наиболее высоковирулентным оказался штамм б-9кс (82,1413,58 %). Более низкие результаты показали штаммы 6-10кс (46,4316,19 %) и 7-13кс (53,5719,46%).

^ Штамм ssp. thuringiensis 6-9кс может быть использован в качестве продуцента

бактериального препарата широкого спектра действия, поражающего как личинок чешуекрылых, так и личинок двукрылых.

ВЫВОДЫ

1. В биоценозах Камчатки циркулируют следующие сероварианты: ssp. thuringiensis, kurstaki, aletti, dendrolimus, canadensis. Доминирующим является ssp. dendrolimus.

2. Bacillus thuringiensis является постоянным компонентом лесного биоценоза и встречается в разных его звеньях. Большая часть культур (52) выделена из насекомых-фитофагов следующих отрядов: Coleóptera (сем. Cerambycidae, Chrysomelidaé), Lepidoptera (надсем. Tineoidea), Hymenoptera (сем. Cimbicidae), Díptera (сем. Anthomyinae, Tipulidae). Тринадцать штаммов изолировано из зоофагов класса Insecta (отр. Coleóptera, Hymenoptera) и Arachnida (отр. Araneí). Семь штаммов - из насекомых-некрофагов отр. Hymenoptera (сем. Formicidaé). Четыре культуры выделены с поверхности листьев жимолости голубой (Lonicera caerulea).

3. При изучении эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.) установлено, что ее причиной является не один штамм Вас. thuringiensis, а комплекс < штаммов следующих разновидностей: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus. Выделенные культуры отличались продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, ферментативной и биологической активностью. Отдельные особи явились источником выделения различных биотипов Вас. thuringiensis. Выявлен внутривидовой антагонизм, ярко выраженными антагонистическими свойствами обладает ssp. kurstaki З-Зкс, который подавляет рост большинства штаммов Вас. thuringiensis, циркулирующих при эпизоотии.

4. Выделены штаммы, обладающие высокой продуктивностью и биологической активностью, как из погибших (1кс; 7-14кс; 6-12кс), так и из живых насекомых (К 2-1; К-20; К-32; 1П-7), а также из пауков. Штаммы 1кс (ssp. dendrolimus) и 7-14кс (ssp. kurstaki) могут быть использованы в качестве продуцента для производства

бактериальных препаратов.

5. Выявлены экзотоксигенные штаммы: Вас. thuringiensis ssp. thuringiensis 6-9кс,

образующий 0,298 мг/мл экзотоксина и Вас. thuringiensis ssp. kurstaki 7-13кс, образующий 0,246 мг/мл экзотоксина. Оба штамма эффективны по отношению к личинкам двукрылых и чешуекрылых.

6. Изучение серологических свойств камчатских штаммов Вас. thuringiensis показало, что природные штаммы в отличие от типовых серологически неоднородны и нестабильны. Выделение штаммов с пестрой антигенной структурой связано с условиями обитания, т.е. с их функционированием как в организме восприимчивых к

Вас. thuringiensis насекомых, так и невосприимчивых насекомых и других членистоногих, а также в субстратах контактирующих с ними.

7. Изучение физиолого-биохимических признаков показало, что культуры обладают высокой лецитиназной, амилолитической и протеолитической активностью. Исключением является Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus К 32, выделенный из полынного листоеда (Chrysolina graminis L.), который не образует лецитиназу. Сопоставление результатов физиолого-биохимических исследований с дифференциальным ключом Баржак-Бонфуа выявило в некоторых случаях значительную корреляцию.

8. Из имаго березового пилильщика (Cimbex femorata Schrank) выделен штамм ssp. dendrolimus К 56, образующий не свойственные для этого сероварианта инклюзии овоидной формы размером 0,75±0,01х0,65±0,01 мкм. Из имаго комара-долгоножки (сем. Tipulidae) выделен штамм К 17-3, обладающий не характерной для известных разновидностей Вас. thuringiensis морфологией кристаллов, не прореагировавший ни с одной из имеющихся сывороток. Оба штамма не патогенны по отношению к личинкам чешуекрылых.

Список публикаций:

1. Вятчина О.Ф., Покровская Л.А., Кудрявцева Т.Ю. Морфо-культуральные и серологические признаки штаммов Вас. thuringiensis третьего серовара, выделенные из биоценозов Камчатки // Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений: Тез. докл. Всес. конф. - Москва, 1989. - С. 18.

2. Завезенова Т.В., Вятчина О.Ф., Бычкова Н.В. Энтомопатогенные микроорганизмы биоценозов Камчатки // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия: Материалы Всес. симп. - Оренбург, 1991. - С. 36-37.

3. Завезенова Т.В., Вятчина О.Ф., Покровская J1.A. Характеристика энтомо-патогенных бактерий вид; Вас. thuringiensis, выделенных из биоценозов Камчатки // Энтомопатогенные микроорганизмы и их использование в народном хозяйстве: Сб. статей. - Иркутск, 1992. - С. 16-27.

4. Завезенова Т.В., Ветчина О.Ф., Макеева И.Л. Биологическая активность камчатских штаммов Вас. //шпл^'едаи // Актуальные проблемы биологии: Тез. докл. к юбилейной научной конференции. - Иркутск, 1994. - С 24.

5. Вятчина О.Ф., Завезенова Т.В. Энтомопатогенные бактерии природных биоценозов // Энтомологические проблемы Байкальской Сибири: Сб. статей. -Новосибирск, 1998. - С. 143-146.

6. Вятчина О.Ф., Завезенова Т.В. Поиск и отбор кристаллообразующих бактерий -возбудителей болезней насекомых // Материалы Юбилейной конференции Госкомприроды Иркутской обл. - Иркутск, 1998. - С. 193.

7. Вятчина О.Ф., Завезенова Т.В. Энтомопатогенные кристаллообразующие

(

бактерии биоценозов Камчатки // Биоразнообразие микроорганизмов ВосточноСибирского региона и их научно-практическое использование: Материалы регион, науч.-практ. конф. - Иркутск, 1999. - С. 54-55.

8. Вятчина О.Ф., Павлова О.В. Сохранение биологических свойств энтомопато-генных штаммов вида Вас. //гготи^геи.?/.? после длительного хранения // Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование: Материалы регион, науч.-практ. конф. - Иркутск, 1999. - С. 55-56.

9. Завезенова Т.В., Вятчина О. Ф., Дэлгермаа С., Буковская Н.Е. Эколого-географическое распространение энтомопатогенных кристаллообразующих бактерий группы thuringiensis // Проблемы экологии. Чтения памяти проф. М.М. Кожова: Материалы межд. науч. конф. - Иркутск, 2000. - С. 33-34.

10. Вятчина О.Ф., Завезенова Т.В. Энтомопатогенные бактерии вида Вас. г Жигт&етк, циркулирующие в биоценозах Камчатки // Оценка современного состояния микробиологических исследований в Вост.- Сиб. регионе: Материалы ». Росс, науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию со дня рожд. проф. Е.В. Талалаева. -Иркутск, 2002.-С. 13-18.

11. Вятчина О.Ф. Калифорнийский червь как основной источник белка для культивирования гетеротрофных бактерий / Вятчина О.Ф., Завезенова Т.В., Буковская Н.Е., Казаринова Т.Ф. // Сибирь-Восток. - 2003. - № 5. - С. 16-19.

Отпечатано в Глазковской типографии, г. Иркутск, ул. Гоголя, 53. Подписано в печать 5.09.2003 г. Формат 60х84'/16. Гарнитура "ПтезКе'й'К.отап. Усл. печ. л. 1,16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Заказ № 1287. Тираж 100 экз.

(7S72. Р138 7 2

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вятчина, Ольга Федоровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. БИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ

БАКТЕРИЙ ВИДА BACILLUS THURINGIENSIS.

1.1. История изучения энтомопатогенных микроорганизмов.

1.2. Современные представления о филогении, классификации и биологии вида Вас. thuringiensis.

1.3. Биология вида Bacillus thuringiensis.

1.3.1. Морфология.

1.3.2. Культуральные особенности Bacillus thuringiensis.

1.3.3. Физиология Bacillus thuringiensis.

1.4. Токсины Bacillus thuringiensis и механизм их действия на насекомых.

1.4.1. Энтомоцидные кристаллы.

1.4.2. Механизм действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis.

1.4.3. Термостабильный энтомоцидный токсин.

1.4.4. Фосфолипиды, протеазы и другие метаболиты.

1.5. Особенности инфекционного процесса, вызванного Bacillus thuringiensis у насекомых.

1.6. Функционирование энтомопатогенных кристаллообразующих бактерий в популяции вредителя

1.7. Эколого-географические особенности распространенияВасП1из thuringiensis.

Глава 2. ФИЗИКО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЙ ОБЗОР ПРИРОДНОЙ ЗОНЫ КАМЧАТКИ.

ЭНТОМОФАУНА КАМЧАТКИ.

Глава 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объекты исследования.

3.2. Методика сбора патологического материала.

3.3. Методика бактериального анализа.

3.4. Изучение морфолого-культуральных признаков.

3.5. Изучение физиолого-биохимических признаков.

3.6. Изучение серологических признаков.

3.7. Изучение антагонистических свойств исследуемых культур.

3.8. Определение продуктивности исследуемых штаммов.

3.9. Определение биологической активности.

3.10. Спектрофотометрическ'Ш метод определения Р- экзотоксина.

3.11. Определение экзотоксигенности на личинках комнатной мухи (Musca domestica L.) и большой пчелиной огневки (Galleria mellonella L.).

Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

4.1. Распространение Bacillus thuringiensis в различных звеньях лесного биоценоза.

4.1.1. Встречаемость Bacillus thuringiensis в различных объектах исследования.

4.1.2. Штаммы Bacillus thuringiensis, циркулирующие при эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.).

4.2. Морфологические особенности камчатских штаммов.

4.3. Культуральные признаки исследуемых штаммов.

4.4. Физиолого-биохимические признаки камчатских штаммов.

4.5. Серологические свойства камчатских штаммов.

4.6. Продуктивность исследуемых штаммов.

4.7. Биологическая активность камчатских штаммов.

4.8. Действие /^-экзотоксина камчатских штаммов на личинок комнатной мухи (Musca domestica L.) и большой пчелиной огневки (Galleria mellonella L.).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экологические особенности энтомопатогенных бактерий вида bacillus thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки"

Энтомопатогенные. бактерии вида Bacillus thuringiensis — самые распространенные агенты биологического контроля насекомых - эс|з фективны не только против Lepidoptera, Homoptera, Coleoptera, Diptera, ni>ictyoptera, Mallophaga, но и против нематод (Strongylida, Tylenchida), клещ^;й (Acari), Digenea, Protozoa (Diplomonadida).

Каждый год производится 13 ООО тонн бактериальных препаратcz> в на основе Bacillus thuringiensis. Препараты не представляют опасности для "«человека и теплокровных и могут успешно использоваться для регулирования чр^г сзленности насекомых, наносящих вред сельскому и лесному хозяйству. Также безопасны для использования в водной среде, где применяются проти:^ Diptera-переносчиков вирусных и паразитарных болезней (по данным IPCS, 1 S>99).

Избирательность действия различных разновидностей Вас. thz ълг-ingiensis обусловлена специфическим связыванием растворенного 8-эндотоксина с аффинным к нему белком, экспонированным на поверхности апикальных мембран эпителиальных клеток кишечника восприимчивых зЕ-ю.секомых (Hofmann et al., 1986, 19S8).

Споры Вас. thuringiensis могут длительное время сохраняться в ^ косистеме при постепенном уменьшении концентрации, как компонент естественной микрофлоры. Токсины Вас. thuringiensis инактивируются в почве в течение нескольких дней или часов другими микроорганизмами.

Для производства большинства бактериальных препаратов и: пользуют штаммы, выделенные из природы. Поскольку Вас. thuringiensis - эитомопато-генный вид, то распространение его разновидностей в какой-то степе ^^с и должно определяться ареалом насекомого-хозяина, хотя бациллы являются космополитами и благодаря своей способности образовывать споры, легк:о адаптируются к различным условиям обитания. Являясь факультатж>1 вно-энто-мопатогенным микроорганизмом, Вас. thuringiensis встречается в аз личных звеньях биоценозов. Энтомопатогены выделяются не только из погибших и больных насекомых различных систематических групп, но и регуля J3но обнаруживаются в составе нормальной микрофлоры здоровых насекомых. Вас. thu-ringiensis может быть выделен из почвы, воды, с поверхности растений и других субстратов, с которыми контактируют насекомые. Высокая частота встречаемости и обширный спектр насекомых-хозяев свидетельствует об участии Вас. thuringiensis в естественном регулировании численности насекомых.

Нами впервые проведены исследования по выявлению и распространению энтомопатогенных бактерий вида Вас. thuringiensis в биоценозах Камчатки. Эти исследования представляют интерес в связи с тем, что энтомофауна полуострова Камчатка очень своеобразна благодаря его палеографии. Камчатка неоднократно отделялась от материка, превращаясь в остров. Оледенения почти полностью уничтожили третичную фауну полуострова, но в послеледниковое время она во многом развивалась и развивается как островная фауна. В настоящее время Парапольский дол, расположенный на севере, препятствует проникновению лесных форм из соседних материковых зон.

Такая изолированность Камчатки от материка, характер формирования энтомофауны полуострова предполагают и распространение в этом регионе определенных разновидностей Вас. thuringiensis, тесно связанных паразитическими взаимоотношениями с насекомыми. При обследовании энтомофауны лесных и сельскохозяйственных биоценозов Елизовского, Мильковского и Пенжинского районов Камчатки для бактериологического анализа были взяты здоровые, больные и погибшие особи следующих отрядов: Lepidoptera, Coleoptera, Hymenoptera, Diptera. При проведении исследований обнаружена естественная эпизоотия в популяции лиственничной мухи Hylemyia laricicola Karl.) на р. Таловка в Пенжинском районе, вызванная Вас. thuringiensis. Кроме того, бактериологическому анализу были подвергнуты особи класса паукообразных (Arachnida), моллюски класса брюхоногих (Gastropoda), дождевые черви (Oligochaetaj. Для микробиологических исследований также собирались образцы почв, лесной подстилки, коры и листьев различных растений.

Целью исследований явилось изучение экологических особенностей Вас. thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки, а также выделение Lepidoptera- и Dlptera-активных штаммов Вас. thuringiensis.

В задачи исследований входило:

1 .Изучить распространенность Вас. thuringiensis в биоценозах Камчатки.

3.Изучить серологические свойства выделенных штаммов.

4.0пределить продуктивность культур Вас. thuringiensis

5.Изучить биологическую активность и выявить спектр патогенности выделенных культур.

При изучении естественной эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.), обнаруженной в Пенжинском районе Камчатской области, установлено, что ее причиной является не один штамм Вас. thuringiensis, а комплекс штаммов следующих разновидностей: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus. Выделенные культуры отличались продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, ферментативной и биологической активностью. Среди изученных штаммов выявлен внутривидовой антагонизм. Отдельные особи насекомых явились источником выделения нескольких биотипов Вас. thuringiensis. При изучении эпизоотии обнаружен экзотоксигенный штамм 3-го сероварианта.

Высокопродуктивные и высоковирулентные штаммы выделялись не только из погибших, но и из живых особей восприимчивых и невосприимчивых видов, входящих в различные звенья трофической цепи: "кормовое растение - фитофаги -зоофаги - некрофаги".

Обнаружены штаммы Вас. thuringiensis, обладающие необычной морфологией. Штамм К 56 (ssp. dendrolimns), выделенный из имаго березового пилильщика (Cimbex femorata Schrank), образует включения исключительно овоидной формы. Неидентифицированный штамм К 17-3, выделенный из комара-долгоножки (сем. Tipulidae), формирует крупные кристаллы, плотно прилегающие к споре одной из своих граней. Оба штамма оказались непатогенными по отношению к личинкам чешуекрылых.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований выделены Lepidoptera-aKmmue, штаммы, пригодные для производства бактериальных препаратов и экзотоксигенный штамм, эффективный по отношению к двукрылым и чешуекрылым, который может быть использован в качестве продуцента бактериального препарата широкого спектра действия. Для культивирования Вас. thuringiensis с целью удешевления питательной среды предложена среда на основе экстракта дождевых червей (красного калифорнийского гибрида), используемого в качестве белкового компонента. Оформлены документы на получение патента.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Результаты исследований докладывались на Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений" (Велегож, 1989); на региональных конференциях: "Энтомологические проблемы Байкальской Сибири" (Иркутск, 1997), "Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование" (Иркутск, 1999); на Российской научно-практической конференции "Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе" (Иркутск, 2002).

Заключение Диссертация по теме "Экология", Вятчина, Ольга Федоровна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследований, проведенных в биоценозах Камчатки, выявлено, что на этой изолированной от материка территории циркулируют различные сероварианты: ssp. thuringiensis, ssp. kurstaki, ssp. alesti, ssp. dendrolimus, ssp. canadensis. Доминирующим является ssp. dendrolimus.

Вас. thuringiensis является постоянным компонентом лесных биоценозов Камчатки и будучи факультативно-энтомопатогенным видом встречается в следующих звеньях лесного биоценоза: "кормовое растение - фитофаги -зоофаги - некрофаги".

Большая часть культур (52) выделена из насекомых-фитофагов следующих отрядов: Coleoptera (сем. Cerambycidae\ сем. Chrysomelidae), Lepidoptera (надсем. Tineoidea), Hymenoptera (сем. Cimbicidae), Diptera (сем. Anthomyinae\ сем. Tipulidae).

Большую роль в передаче Вас. thuringiensis в биоценозе играют паразитические и хищные членистоногие. Закономерным явилось выделение энтомопатогенных бактерий из наездников ([Ichneumonidae), божьих коровок (сем. Coccinellidae), пауков (отр. Aranei).

Некрофаги, поедая погибших, больных особей и бациллоносителей способны резервировать энтомопатогенные бактерии в своем организме. Так, семь штаммов Вас. thuringiensis было выделено из муравьев, устойчивых к этому патогену.

Четыре культуры выделено с листьев жимолости голубой (Lonicera caerulea L.). Из образцов почвы, воды и лесной подстилки кристаллообразующие бактерии выделены не были, что, вероятно, объясняется с одной стороны, меньшим по сравнению с различными насекомыми количеством взятых образцов, а с другой стороны - большей вероятностью выделения Вас. thuringiensis из насекомых. Возможно, второй причиной объясняется и тот факт, что энтомопатогены не были выделены из организма моллюсков и дождевых червей, непосредственно не связанных такими тесными трофическими связями с восприимчивыми к Вас. thuringiensis насекомыми, какие имеют место в случае взаимоотношения последних с хищными и паразитическими членистоногими.

При изучении эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.) установлено, что ее причиной является не один штамм Вас. thuringiensis, а комплекс штаммов следующих разновидностей: ssp. thuringiensis, ssp. kurstaki, ssp. alesti, ssp. dendrolimus.

Бактериологический анализ показал, что отдельные особи являются резервуаром выделения нескольких биотипов Вас. thuringiensis. Штаммы ssp. kurstaki (3-2кс; З-Зкс и 7-13кс; 7-Икс) были изолированы из двух особей погибших куколок лиственничной мухи. И в первом, и во втором случае один штамм оказался более высокопродуктивным по сравнению с другим штаммом, обнаруженном в погибшем насекомом. Из четырех штаммов ssp. kurstaki один штамм (7-1 Зкс) продуцирует экзотоксин в количестве 0,246 мг/мл.

Четыре штамма Вас. thuringiensis, обладающих разными биологическими свойствами, были выделены из одной погибшей личинки лиственничной мухи. Два штамма 6-9кс и 6-1 Оке, идентифицированные как ssp. thuringiensis при одинаковой продуктивности (2,75±0,10х109 сп/мл) отличались биологической активностью по отношению к различным тест-объектам. Культура 6-9кс оказалась более активной по сравнению с 6-1 Оке.

Штаммы 6-11 кс (ssp. dendrolimus) и 6-12кс (ssp. alesti), выделенные из этой же особи, обладали более высокой продуктивностью (4,17±0,17х109сп/мл и 5,50±0,26х109сп/мл), проявив при этом и высокую биологическую активность.

В результате исслздований по сравнительной оценке инсектицидной активности штаммов Вас. thuringiensis, выделенных при эпизоотии, были отобраны две наиболее активных культуры. Наибольшей биологической активностью обладал штамм Вас. thuringiensis ssp. kurstaki 7-14кс. LK50 на непарном шелкопряде составила 3,05±0,12х106 сп/мл, а на крапивнице -3,45±0,23х106 сп/мл. У штамма Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus 1кс LK5o на непарном шелкопряде - 4,42±0,09х106 сп/мл, на крапивнице - 3,63±0,15x10 сп/мл. Штаммы 1кс (ssp. dendrolimus) и 7-14кс (ssp. kurstaki) могут быть использованы в качестве продуцентов для производства бактериальных препаратов.

Исследуемые культуры проявили внутривидовой антагонизм. Вас. thuringiensis ssp. kurstaki З-Зкс, обладающая ярко выраженными антагонистическими свойствами, подавляла рост большинства штаммов Вас. thuringiensis, циркулирующих при эпизоотии.

Функционирование в пределах одной эпизоотии штаммов различных биотипов Вас. thuringiensis, отличающихся продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, ферментативной и биологической активностью, вероятно, является приспособлением к изменяющимся условиям среды, что обеспечивает устойчивую циркуляцию инфекции в популяции восприимчивого насекомого.

Высокопродуктивные и высоковирулентные штаммы были выделены не только из погибших насекомых, но и из живых бациллоносителей невосприимчивых насекомых и членистоногих. Из имаго полынного листоеда (Chrysolina graminis L.) выделен штамм ssp. dendrolimus К 2-1, который при испытании на личинках боярышницы вызывал высокую гибель уже на третьи сутки (81,98-79,73 %). На седьмые сутки учета гибель от суспензий различных титров составила от 98,25±0,00 до 94,79±1,74 %.

Штамм Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus III-7, изолированный из муравья, обладал высокой продуктивностью (4,32±0,26х109 сп/мл) и высокой биологической активностью. Гибель крапивницы составила на 7-е сутки 98,25±0,00-96,56±1,74%.

Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus Ш-5, выделенный из паука оказался высокопродуктивным (4,86±0,26х109 сп/мл) и эффективным по отношению к личинкам крапивницы. Смертность насекомых от суспензий различных титров составила от 98,25±0,00 до 91,91±5,56 %.

Таким образом, пассаж через организм невосприимчивых видов способствует не только поддержанию жизнеспособности энтомопатогена, но и сохранению его вирулентных свойств на достаточно высоком уровне.

Изучение серологических свойств камчатских штаммов показало, что природные штаммы серологически неоднородны и нестабильны. Исследуемые культуры в отличие от типовых, как правило, обладают пестрой антигенной структурой, что связано с условиями обитания штаммов, а, именно, с их функционированием как в организме восприимчивых, так и невосприимчивых к Вас. thuringiensis насекомых и других членистоногих, а также в субстратах, с которыми эти животные контактировали.

При повторных рассевах штаммов выделяются варианты, утрачивающие сродство к одному сероварианту, но обладающие сродством к другому сероварианту. Так, культура 3-2кс при повторном рассеве не обнаружила антигенного сродства к ssp. flnitimus, но проявила при этом сродство к ssp. thuringiensis, а при вторичном рассеве штамма ssp. alesti 6-12кс не было обнаружено ни одной перекрестной реакции с антисыворотками ssp. thuringiensis. Интересен штамм 6-9кс, соединяющий в себе агглютинабельные свойства 1-го и 4-го серовариантов. При рассеве этого штамма выделяются варианты, реагирующие только с антисыворотками ssp. thuringiensis или с антисывороткой ssp. dendrolimus, а также варианты, четко прореагировавшие с ssp. thuringiensis и проявившие при этом агглютинабельность к ssp. dendrolimus.

Изучение морфолого-культуральных и физиолого-биохимических признаков выявило ряд особенностей камчатских штаммов Вас. thuringiensis. Электронно-микроскопическое изучение кристаллов эндотоксина показало разнообразие в размерах и форме, как между различными серовариантами, так и в пределах одного сероварианта. Нетипичную морфологию кристаллов имеют два штамма. Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus К 56, выделенный из имаго березового пилильщика (Cimbex femorata Schrank), образует не свойственные для этого сероварианта инклюзии овоидной формы размером 0,75±0,01х0,65±0,01 мкм. Неидентифицированный штамм К 17-3, изолированный из имаго комара-долгоножки (сем. Tipulidae), образует крупные кристаллы (2,10±0,05х1,58±0,03 мкм), плотно прилегающие к споре одной из своих граней. Оба штамма не патогенны по отношению к личинкам чешуекрылых.

Изучение физиолого-биохимических признаков камчатских штаммов Вас. thuringiensis показало, что культуры обладают высокой лецитиназной, амилолитической и протеолитической активностью. Исключением является штамм ssp. dendrolimus К-32, выделенный из живой особи полынного листоеда (Chrysolina graminis L.), который не образует лецитиназу.

Сопоставление результатов физиолого-биохимических исследований с дифференциальным ключом Баржак-Бонфуа выявило в некоторых случаях значительную корреляцию признаков. Наиболее вариабельным оказалось отношение исследуемых штаммов к источникам углеродистого питания.

1. В биоценозах Камчатки циркулируют следующие сероварианты: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus, canadensis. Доминирующим является ssp. dendrolimus.

2. Bacillus thuringiensis является постоянным компонентом лесного биоценоза и встречается в разных его звеньях. Большая часть культур (52) выделена из насекомых-фитофагов следующих отрядов: Coleoptera (сем. Cerambycidae, Chrysomelidae), Lepidoptera (надсем. Tineoidea), Hymenoptera (сем. Cimbicidae), Diptera (сем. Anthomyinae, Tipulidae). Тринадцать штаммов изолировано из зоофагов класса Insecta (отр. Coleoptera, Hymenoptera) и Arachnida (отр. Aranei). Семь штаммов — из насекомых-некрофагов отр. Hymenoptera (сем. Formicidae). Четыре культуры выделены с поверхности листьев жимолости голубой (Lonicera caerulea).

3. При изучении эпизоотии лиственничной мухи (Hylemyia laricicola Karl.) установлено, что ее причиной является не один штамм Вас. thuringiensis, а комплекс штаммов следующих разновидностей: ssp. thuringiensis, kurstaki, alesti, dendrolimus. Выделенные культуры отличались продуктивностью, способностью образовывать экзотоксин, ферментативной и биологической активностью. Отдельные особи явились источником выделения различных биотипов Вас. thuringiensis. Выявлен внутривидовой антагонизм, ярко выраженными антагонистическими свойствами обладает ssp. kurstaki З-Зкс, который подавляет рост большинства штаммов Вас. thuringiensis, циркулирующих при эпизоотии.

4. Выделены штаммы, обладающие высокой продуктивностью и биологической активностью, как из погибших (1кс; 7-14кс; 6-12кс), так и из живых насекомых (К 2-1; К-20; К-32; III-7), а также из пауков. Штаммы 1кс (ssp. dendrolimus) и 7-14кс (ssp. kurstaki) могут быть использованы в качестве продуцента для производства бактериальных препаратов.

5. Выявлены экзотоксигенные штаммы: Вас. thuringiensis ssp. thuringiensis 6-9кс, образующий 0,298 мг/мл экзотоксина и Вас. thuringiensis ssp. kurstaki 7-Икс, образующий 0,246 мг/мл экзотоксина. Оба штамма эффективны по отношению к личинкам двукрылых и чешуекрылых.

7. Изучение физиолого-биохимических признаков показало, что культуры обладают высокой лецитиназной, амилолитической и протеолитической активностью. Исключением является Вас. thuringiensis ssp. dendrolimus К 32, выделенный из полынного листоеда (Chrysolina graminis L.\ который не образует лецитиназу. Сопоставление результатов физиолого-биохимических исследований с дифференциальным ключом Баржак-Бонфуа выявило в некоторых случаях значительную корреляцию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вятчина, Ольга Федоровна, Иркутск

1. Азизбекян А.А., Исследование адгезивных свойств спор Вас. thuringiensis подвидов galleriae и dendrolimus / А.А. Азизбекян, Т.А.Смирнова, М.Н. Поглазова и др. // Микробиология. 1991. - Т.60. Вып. 4. - С. 697-703.

2. Азизбекян P.P. Микробные инсектициды: достижения и перспективы / P.P. Азизбекян // Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. -1990.-Вып. 2.- С. 172-186.

3. Азизбекян P.P. Споро- и кристаллообразование у Вас. thuringiensis / P.P. Азизбекян, Т.А. Смирнова // Успехи микробиологии. 1988. - Т. 22. - С. 82108.

4. Африкян Э.К. Энтомэпатогенные бактерии и их значение. Ереван, 1973. -420 с.

5. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Медгиз, 1962.

6. Багдасарян С.Н. Физиолого-биохимические особенности некоторых групп спорообразующих бактерий и перспективы их применения. Автореф. дис. докт. биол. наук: 03.00.07 / С.Н. Багдасарян; Ин-т микробиологии НАН РА. -Абовян, 1998.-32 с.

7. Барайщук Г.В. Естественная изменчивость Bacillus thuringiensis var. finitimus при хранении в лабораторных условиях / Г.В. Барайщук, Л.А. Покровская // Энтомопатогенные бактерии и грибы в защите растений: Сб. статей. -Иркутск, 1985.-С. 32-43.

8. Батурин В.В. Гистопатология пищеварительного канала гусениц сибирского шелкопряда при заражении их Bacillus thuringiensis var. dendrolimus / В.В. Батурин, Л.И. Батурина // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -1974.-№2.

9. Батурина Л.И. О резистентности насекомых / Л.И. Батурина // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве: Сб. статей. Иркутск, 1978. - С. 67-79.

10. Бондаренко Н.В. Биологическая защита растений / Н.В. Бондаренко. М.: Агропромиздат, 1986. - С.278.

11. Борисова В.Н. Гифомицеты лиственного опада / В.Н. Борисова // Микромицеты почв: Сб. статей. Киев, 1984.-С. 155-180.

12. Бурцева Л.И. Бактериальные болезни насекомых / Л.И. Бурцева, М.В. Штерншис, Г.В. Калмыкова // Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. В.В. Глупова. М.: Круглый год, 2001. -С. 189-245.

13. Вейзер Я. Микробиологические методы борьбы с вредными насекомыми / Я. Вейзер. М.: Мир, 1972. - 640 с.

14. Власов Г.М. Четвертичное оледенение Камчатки / Г.М. Власов, Ю.Ф. Чемеков // Вопросы географии Дальнего Востока / Под ред. Е.М. Лавренко. -Владивосток, 1949. С. 200-237.

15. Воронцов А.И. Лесная энтомология / А.И. Воронцов. М.: Высш. шк., 1967. -393 с.

16. Воронцов А.И. Лесозащита / А.И. Воронцов, И.Г. Семенков. М.: Лесная пром., 1980.-328 с.

17. Горностаев Г.Н. Насекомые / Г.Н. Горностаев // Энциклопедия природы России. М.: ABF, 1998. - 560 с.

18. Гриценко И.Н. Микрофлора мелких млекопитающих Западной Сибири / И.Н. Гриценко. Новосибирск, 1971.

19. Гукасян А.Б. Некоторые итоги и перспективы применения микробиологического метода борьбы с сибирским шелкопрядом в Западной Сибири / А.Б. Гукасян // Изв. / АН СССР. Сер. биол. 1961. - № 5. - С.111.

20. Гукасян А.Б. Некоторые результаты применения микробиологического метода борьбы с сибирским шелкопрядом в Тувинской автономной области / А.Б. Гукасян // Изв. / СО АН СССР. Сер. биол. 1959. - № 9. - С. 87-91.

21. Гукасян А.Б. Эколого-географическое распространение кристаллообразующих споровых бактерий в лесах Тувинской АССР / А.Б. Гукасян // Кристаллоносные микроорганизмы и перспективы их использования в лесном хозяйстве: Сб. статей. М.: Наука, 1967. - С 41-45.

22. Евлахова А.А. Отбор вирулентных форм микроорганизмов в исследованиях по микробиологическому методу борьбы с вредными насекомыми / А.А.

23. Евлахова, О.И. Швецова // Микробиологические методы борьбы с вредными насекомыми: Сб. статей. М., 1963. - С. 24-29.

24. Егоров Н.С. О влиянии белков на синтез экзопротеазы Вас. thuringiensis / Н.С. Егоров, Ж.К. Лориа, Т.Г. Юдина // Микробиологическая промышленность.- 1983,- Т. 53. С. 569-574.

25. Егоров Н.С. Биологически активные соединения, определяющие токсичность микробных инсектицидов на основе Bacillus thuringiensis / Н.С. Егоров, Т.Г. Юдина. М.: ВНИИСЭНТИ, 1989. - Вып. 6. - 50 с.

26. Жигаев Г.Н. Последействие биопрепаратов на вредителей сада / Г.Н. Жигаев // Патология членистоногих и биологические средства борьбы с вредными насекомыми. Киев, 1974. - С. 71-73.

27. Жукаускене Я. Acta entomologica litaunica / Я. Жукаускене. Вильнюс, 1973.- 173 с.

28. Завезенова Т.В., Технология дендробациллина / Т.В. Завезенова, Т.А. Гиль. -Иркутск, 1984. 33 с.

29. Зингерова Р.А. Кристаллоносные бактерии, выделенные из виноградных листоверток / Р.А. Зингерова, Г.В. Симчук // I конф. Молодых ученых "Биологический метод в защите растений": Тез. докл. Кишинев, 1974. - С. 28-29.

30. Ивлиев JI.A. Главнейшие вредители лесов Камчатской области и возможные меры борьбы с ними / Л.А. Ивлиев // Энтомофауна лесов Курильских островов, полуострова Камчатки, Магаданской области. М.-Л.: Наука, 1966.- С. 77-88.

31. Исаев А.С. Особенности микрофлоры стволовых вредителей лиственницы сибирской / А.С. Исаев, А.Б. Гукасян, Д.А. Тарасова // Микроорганизмы в борьбе с вредителями лесного хозяйства: Сб. статей. 1966. - М. - С. 175.

32. Исакова Н.П. Испытание вирулентности бактерий на энтомофагах и некоторые данные по переносу ими бактериальной инфекции / Н.П. Исакова

33. Исследования по биологическому методу борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства: Сб. статей Новосибирск, 1964. - С. 57-59.

34. Исакова Н.П. Опытный отбор и сохранение штаммов Вас. cereus v. galleriae для производства энтобактерина-3 / Н.П. Исакова, И.А. Строева // Тр. / ВИЗР. 1968. - Вып. 31. - С. 371.

35. Кабанов Н.Е. Каменноберезовые леса в ботанико-географическом и лесоводственном отношениях /Н.Е. Кабанов. М.: Наука, 1972. - 136 с.

36. Каменек JI.K. Дельта-эндотоксин Bacillus thuringiensis: строение, свойства и использование для защиты растений: Автореф. дис. докт. биол. наук: 06.01.11/ J1.K. Каменек; Ульян, гос. ун-т. М., 1998. - с. 40.

37. Климентова Е.Г. Антимикробное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в отношении ряда фитопатогенных бактерий: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Е.Г. Климентова; Ульян, гос. ун-т. М., 2001. - с. 21.

38. Кожанчиков ИВ. Эпизоотии и эколого-физиологические особенности насекомых / ИВ. Кожанчиков // Инфекционные и протозойные болезни полезных и вредных насекомых: Сб. статей. M.-JI., 1956. - С. 30-46.

39. Коломиец Н.Г. Роль мух-саркофагин в распространении септицемии сибирского шелкопряда / Н.Г. Коломиец, А.Б. Гукасян // Изв. / СО АН СССР.- Новосибирск, 1960. № 2. - С. 116-119.

40. Кондря B.C. Эффективность энтобактерина в борьбе с листогрызущими гусеницами сада. / B.C. Кондря // Вопросы защиты растений. Кишинев, 1970.-Вып. I.-C. 80-85.

41. Красильников Н.А. Определитель бактерий и актиномицетов / Н.А. Красильников. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1949. - 830 с.

42. Определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1980. - 495 с.

43. Кулагин B.C., Лебедева Н.П., Нифонтова Е.А. Встречаемость энтомопатогенных бацилл в насекомых различных отрядов / B.C. Кулагин, Н.П. Лебедева, Е.А. Нифонтова // Микроорганизмы в защите растений: Сб. статей. Иркутск, 1990. - С. 61-71.

44. Кунина А.А. Последействие бактериальных токсинов на капустную белянку / А.А. Кунина // Сб. науч. тр. Удмурд. с.-х. опыт, станции. Ижевск, 1976. -Вып. 5.-С. 155-156.

45. Куренцов А.И. О зоогеографических особенностях фауны Камчатской области / А.И. Куренцов // Энтомофауна лесов Курильских островов, полуострова Камчатки, Магаданской области. М., Л.: Наука, 1966. - С. 63-76.

46. Лебедева Н.П., Кулагин B.C. Изучение численности Bacillus thuringiensis в лесных почвенных ценозах / Н.П. Лебедева, B.C. Кулагин // Биология микроорганизмов и их использование в народном хозяйстве: Сб. статей. -Иркутск, 1990.-С. 42-46.

47. Лескова А.Я., Рыбина Л.М. Биологическая защита плодовых и овощных культур / А.Я. Лескова, Л.М. Рыбина. Кишинев, 1971. - 167 с.

48. Лескова А.Я., Рыбина Л.М. Патогенез насекомых, вызываемый кристаллогенными бактериями, как фактор депрессии их численности / А.Я. Лескова, Л.М. Рыбина // Микроорганизмы в защите растений: Сб. статей. -Иркутск, 1983.-С. 22-31.

49. Лескова А.Я., Рыбинт. Л.М., Строева И.А. Идентификация культур Bacillus thuringiensis и оценка их патогенных свойств / А.Я. Лескова, Л.М. Рыбина, И.А. Строева. Л., 1984. - с.21.

50. Манько Ю.И. Еловые леса Камчатки / Ю.И Манько, В.П. Ворошилов. -М.: Наука, 1978.- 256 с.

51. Медведев Л.Н. Очерки по фауне листоедов (Coleoptera, Chrysomellidae) Арктической Азии и Камчатки / Л.Н. Медведев, Б.А. Коротяев // Исследование по энтомофауне Северо-Востока СССР: Сб. статей. -Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1980. С. 170.

52. Медицинская микробиология / Гл. ред. В.И. Покровский, O.K. Поздеев. М.: ГЭОТАР Медицина, 1998. - 1200 с.

53. Мельников Н.И., Мельников В.Н., Гимраков М.Г. Ферменты патогенности и токсины бактерий. М.: Медицина, 1969. - С. 251.

54. Овчинникова J1.A. Совершенствование микробиологической защиты капусты от чешуекрылых вредителей: Автореф. дис. канд. с.-х. наук.: 06.01.11 / JI.A. Овчинникова; Нозосибир. гос. аграр. ун-т. Новосибирск, 2002. — 18 с.

55. Осинцева JI.A. Экологически безопасная система регулирования численности листогрызущих насекомых в агроценозе капустного поля: Автореф. дис. докт. биол. наук: 03.00.16 / JI.A. Осинцева; Новосибир. гос. аграр. ун-т. Новосибирск, 1998. - 43 с.

56. Покровская Л. А. Серологические свойства кристаллообразующих бактерий: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Л.А. Покровская; Иркут. гос. ун-т. Иркутск, 1976. -22 с.

57. Полтев В.И. Использование энтомопатогенных бактерий в микробиологической борьбе с сибирским шелкопрядом / В.И. Полтев // Сибирский шелкопряд: Сб. статей Новосибирск, 1960. - С. 120-122.

58. Поспелов В.П. Микробиологический метод борьбы с вредными насекомыми / В.П. Поспелов. М.: Сельхозгид, 1933. - 85 с.

59. Поспелов В.П. Результаты работ лаборатории болезней насекомых по разработке микробиологического метода борьбы с вредными насекомыми / В.П. Поспелов //Итоги науч.-исследоват. работ ВИЗР за 1935 г. 1936. - С. 318.

60. Решетина А.Н. Микроорганизмы, патогенные для калифорнийской щитовки / А.Н. Решетина//Защита растений. 1961. - № 11. - С. 15.

61. Ромашева Л.Ф. Микробиологические методы борьбы с аргасовыми клещами / Л.Ф. Ромашева, А.В. Балыкин, Э.В. Видомский и др. Фрунзе: Илим, 1976.-98 с.

62. Рыбина Л.М. Проблемы защиты яблонь от вредителей и болезней / Л.М. Рыбина//Тр. / Латвийо. с.-х. акад. Вып. 176. - Елгава, 1979. - С. 77-85.

63. Рыбина Л.М., Лескова А.Я. Поиск и отбор штаммов Bacillus thuringiensis с высокой энтомоцидностью / Л.М. Рыбина, А.Я. Лескова // Использованиемикроорганизмов и их метаболитов в сельском хозяйстве: Сб. науч. тр. Л., 1976.-Т. 45.-С. 57-65.

64. Славгородская Л.Е. Горностаевые моли рода Hyponomeuta и пути биологического метода борьбы с ними: Автореф. дис. канд. биол. наук: 06.01.11 / Л.Е. Славгородская; Симферополь, 1969. 24 с.

65. Смирнов О.В. Патотипы Bacillus thuringiensis и экологические основы их использования в защите растений: Автореф. дис.докт. биол. наук: 06.01.11 / О.В. Смирнов; Всерос. науч.- исследоват. ин-т с.-х. микробиологии. СПб.; Пушкин, 2000. - с 42.

66. Смирнова Т.А. Исследование адгезивных свойств спор Bacillus thuringiensis подвидов galleriae и dendrolimus / Т.А. Смирнова, М.Н. Поглазова, А.В. Машковцева и др. // Микробиология. 1991. - Т. 60. Вып 4. - С. 697-703.

67. Солонцов И.Л. Сканирующая туннельная и электронная микроскопия параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis / И.Л. Солонцов, Т.Г. Юдина // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 2. - С. 235-240.

68. Спектор М.Р. Защита растений / М.Р. Спектор. М., 1970. - 40 с.

69. Талалаев Е. В. О воспроизведении эпизоотии септицемии у гусениц сибирского шелкопряда / Е.В. Талалаев // I энтомолог, обозрение. 1957. - Т.36, вып. 4.-С. 845-85S.

70. Талалаев Е. В. О воспроизведении эпизоотии септицемии у гусениц сибирского шелкопряда / Е.В. Талалаев // Энтомолог, обозрение. 1958. - Т.37, вып. З.-С. 641-652.

71. Талалаев Е.В. Бактериологический метод борьбы с сибирским шелкопрядом / Е.В. Талалаев. Иркутск, 1961. - 47 с.

72. Талалаев Е.В. Воспроизведение эпизоотии септицемии как метода борьбы с сибирским шелкопрядом / Е.В. Талалаев // Микробиологические методы борьбы с вредными насекомыми: Сб. статей. М., 1963. - С. 81-88.

73. Талалаев Е.В. Об унифицировании терминологии в разработке микробиологического метода защиты растений от вредных насекомых / Е.В. Талалаев // Изв. / Биол.- геогр. НИИ при Иркут. ун-те. Иркутск, 1970. - Т. 25.-С. 15-25.

74. Талалаев Е.В. Основные черты эпизоотии септицемии гусениц сибирского шелкопряда, вызываемой Bacillus thuringiensis / Е.В. Талалаев // Изв. / Биол. -геогр. НИИ при Иркут. ун-те. Иркутск, 1965. - Т. 19, вып. 1. - С. 4-12.

75. Талалаев Е. В. К вопросу о разработке микробиологического метода борьбы с сибирским шелкопрядом / Е.В. Талалаев // Изв. / Биол.-геогр. НИИ при Иркут. ун-те. Иркутск, 1956. - Т. 16, вып. 1-4. - С. 62-71.

76. Талалаев Е.В. Бациллоносительство у гусениц сибирского шелкопряда / Е.В. Талалаев//Энтомолог, обозрение. 1961. - Т. 41, вып. 1. - С. 42-48.

77. Талалаев Е.В. Бактериологический метод борьбы с сибирским шелкопрядом / Е.В. Талалаев. Иркутск, 1961. - 47 с.

78. Талалаева Г.Б. Естественные резервуары бацилл группы thuringiensis типа dendrolimus Восточной Сибири: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Г.Б. Талалаева; Иркут. гос. ун-т. Иркутск, 1967.

79. Талалаева Г.Б. Искусственные и естественные резервуары Bacillus dendrolimus Tal. Восточной Сибири // IX Международ, конгр. по микробиологии. Материалы съезда. М., 1966.

80. Талалаева Г.Б. Об естественных резервуарах кристаллофорных бактерий группы thuringiensis типа dendrolimus II Материалы I Межвузовской конференции по защите растений. Самарканд, 1966. - С. 159-160.

81. Талалаева Г.Б. Методы статистической обработки результатов микробиологического эксперимента / Г.Б. Талалаева. Иркутск, 1995. - 13 с.

82. Талалаева Г.Б. Естественные резервуары бацилл группы thuringiensis II Г.Б. Талалаева, Г.Г. Кашкова // Биология и селекция микроорганизмов: Сб. статей. Иркутск, 1973. - С. 153-160.

83. Талалаева Г.Б. Некоторые методические особенности изучения серологических свойств бактерий вида Вас. thuringiensis / Г.Б. Талалаева, JI.A. Покровская // Микроорганизмы в защите растений от вредных насекомых: Сб. статей. Иркутск, 1978. - С. 51-61.

84. Тюменцев С. Н. Бациллоносительство у гусениц сибирского как фактор эпизоотии, вызываемой Вас. thuringiensis Tal.: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07/Иркут. гос. ун-т. Иркутск, 1965.

85. Фримель X. Основы иммунологии / X. Фримель, Й. Брок. М.: Мир, 1986. -254 с.

86. Хесин Р.П. Непостоянство генома / Р.П. Хесин. М.: Наука, 1985. - 472 с.

87. Шапиро В.А. Биоценотические связи энтомофагов в агробиоценозах полевых культур / В.А. Шапиро // Биоценотическое обоснование критериев природных энтомофагов. Науч. тр. ВИЗР/ВАСХНИЛ. - Л., 1983. С. 5-17.

88. Швецова О.И. Биологическое обоснование эффективности бактриального препарата энтобактерина-3 для борьбы с вредными насекомыми / Швецова О.И. // Общая биология. 1962. - Т 23, № 5. - С. 381.

89. Штейнхауз Э. А. Патология насекомых / Э. А. Штейнхауз. М.: Издательство иностранной литературы, 1952. - 826 с.

90. Штерншис М.В. Принципы повышения эффективности энтомопатогенных препаратов для защиты растений: Автореф. дис. докт. биол. наук: 06.01.11 / М.В. Штерншис; Сибирс. науч.-исследоват. ин-т земледелия и химизации сельс. хоз-ва СО ВАСХНИЛ. Л., 1987. - с.30.

91. Штибен В.Д. Бактериозы гусениц тутового шелкопряда / В.Д. Штибен // Тр. / САНИИШ. Вып. 6. - Ташкент, 1934. - С. 85-92.

92. Штуцер М.И. Опыт изучения инфекций гусениц озимой совки (Еихоа segerum Schifj) / М.И. Штуцер, В.П. Взоров // Бюл. / Воронеж. СТАЗРА. № 7.- Воронеж, 1926. - С. 76-101.

93. Юдина Т. Г. Действие 5-эндотоксинов четырех подвидов Вас. thuringiensis на различных прокариот / Т. Г Юдина, Л. И. Бурцева // Микробиология. -1997.-Т. 66, вып. 1.-С. 25-31.

94. Юдина Т. Г. Влияние источников углерода на биологическую активность и морфологию параспоральных кристаллов Вас. thuringiensis / Т. Г. Юдина, О.

95. B. Саламаха, Е. В. Олехнович и др. // Микробиология. 1992. - Т. 61, вып. 4.1. C. 577-584.

96. Юдина Т. Г. Сканирующая туннельная и электронная микроскопия параспоральных кристаллов Вас. thuringiensis / Т. Г. Юдина, И. Л. Солонцов // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 2. - С. 235-240.

97. Ягудин В. Я. Изучение антигенной структуры эндотоксинов Вас. thuringiensis / В. Я. Ягудин, А. С. Крылов // Прикладная биохимия и микробиология. 1990. - Т. 26, вып. 1. - С. 85-91.

98. Яловицин М.В. Биологические и серологические особенности некоторых возбудителей бактериозов насекомых / М.В. Яловицин // Тр. / Ин-та микробиологии и вирусологии. Алма-Ата, 1963. - Т. 24. - С. 21.

99. Abbot W.S. J.Econ. Entomol. 1925. - № 18. - P. 265.

100. Afrikian E.G. Causal agents of bacterial diseases of the silkworm and the use of antibiotics in their control // J. Insect Pathol. 1960. - №2. - P. 299-303.

101. Aizawa L., Takasu, Kurata K. Isolaton of Bacillus thuringiensis fromthe dust of silhworm rearing houses of farmers // J. Sericult. S. Lapan. 1961. - №30. - P. 451-455.

102. Aoki K., Chidasaki V. // Uber das Toxin von sog. Sotto-Bacillen II Ibed. 1915.-V. 14, №1.-P. 59-63.

103. Angus T.A. A bacterial toxin paralyzing silkworm larvae // Nature. 1954. -V.173, № 4403. - P.545.

104. Barjac H., Frachon E. Classification of Вас. thuringiensis strains II Entomophaga. 1990. - № 35(2). - P. 233-240.

105. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology-9. USA. - 1996-97. - P 559.

106. Berliner E. Uber die Schlafsucht der Mehlmotten raupe // Ges. Getreidew. -1911. № 3. - P. 63.

107. Berliner E. Uver die Schlaffsucht der Mehlmettenraupe (Ephestia ruhniella, Zell.) und ihren Erreger Bacillus thuringiensis, n. sp. z. angew // Entomol. 1915. -№ 2. - P. 29.

108. Bucher G.E., Stephens J.M. Bacteria of grasshoppers of Western Canada: II. The Pseudomonaceae, Achromobacteraceae, Micrococcaceae, Brevibacte-riaceae, Lactobacillaceae and less importaht families // J. Insect Parhol. 1959. -№ 1. P. 374.

109. Bucher G.E. Disease of the larvae of tent-caterpillars caused by sporeforming bacterium // Can. J. Microbiol. 1957. - № 3(5). - P. 695.

110. Dutky S.R. Two new sporeforming bacteria causing milky diseases of Japanese beetle larvae //J. agric. Research. 1940. - №61. - P. 57.

111. Dulmage H.D., Aizawa K. Microbial and Viral Pesticides / Ed. Kurstak E.D. New-York. 1982. - P. 209-239.

112. English L., Slatin S. Mode of action of delta-endotoxins from Bacillus thuringiensis: comparison with other bacterial toxins // Insect. Biochem. and Mol. Biol. 1992.-V. 22. № l.-P. 1-7.

113. Jacobs S.E. 1950. Bacteriological control of the flour moth (Ephestia kuhniella) //Proc. Soc. appl. Bacteriol. 1950. - №13. - P. 83.

114. Hannay C. L. Crystalline inclusions in aerobic spore forming bacteria // Nature.- 1953.-№ 172.-P. 1004.

115. Heimpel A.M. Pathogenecity of Вас. cereus Frankland and Frankland and Вас. thuringiensis varieties for several species of sawfly larvae // J. Insect. Pathol. -1961. -№ 3(3). -P.271.

116. Heimpel A.M. A strain of Вас. cereus Fr. and Fr. pathogenic for the larch sawfly Pristiphora erichsoni (Htg.) И Can. Entomologist. 1954. - № 86(2).1. P. 73.

117. Heimpel A.M. A taxonomic rey proposed for rhe species of the "crystalliferrous bacteria" //J. invertebr. Pathol. 1967. - № 9 (3). - P. 364-375.

118. Heimpel A.M., Angus N.A. Bacterial Review. 1960. - V.24. - P. 21-73.

119. Hofte Y., Whiteley H. Insecticidal crustal proteins of Bacillus thuringiensis II Microbial. Rev. 1989. - V. 53, № 2. - P. 242-240.

120. Hofmann C., Luthy P., Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells // Arch. Microbiology. 1986. - № 146. - P. 7-11.

121. Hofmann C., Luthy P., Hutter R., Pliska V. Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae) // European Journal of Biochemistry. 1988. -№ 173.-P. 85-91.

122. Horska K., Kalvoda L., Sebesta K. // Collect, szechosl. Chem. Commun. 1976. -V. 41.-P. 3837-3841.

123. Ihara H., Kuroda E., Wadano A., Himeno M. Specific toxicity of d-endotoxins from Bacillus thuringiensis to Bombyx mori II Bioscience, Biotechnology, Biochemistry. 1993. - № 57. - P. 200-204.

124. Internacional Programme on Chemical Safety, Environmental Health Criteria 217, Bacillus thuringiensis, WHO, Genewa, 1999.

125. Klier A., Fargette F., Ribier J., Rapoport G. // EMBO J. 1982. - V. 1, № 7. - P. 791-799.

126. Knowles B. Mechanism of action of Bacillus thuringiensis insecticidal delta-endotoxins // J. Advances in Insect Physiology / London: Academic Press. 1994.- V.24. P. 275-308.

127. Krywienczyr J., Fast P. Serological Relationships of the crystals of Bacillus thuringiensis var. israelensis II J. Invertebr. Pathol. 1980. - № 36. - P. 139-140.

128. Carey P., Kaplan H., Pozsgay M. Molecular structure of the protein crystal from Bacillus thuringiensis: a Roman spectroscopic study // Biochim. et byophys. acta. -1986.-V. 872, № 3. P. 169-176.

129. Caroll J., Li J., Ellar D. Proteolytic processing of a coleopteran-specific 5-endotoxin produced by Вас. thuringiensis var. tenebrionis II Biochem. J. 1989. -V. 261, № l.-P. 99-105.

130. Laubach C.A., Rice J.L., Ford W.W. Studies on aerobic sporebearing nonpathogenic bacteria//J. Bacterid. 1916. -№ 1. - P. 493.

131. Lawrence J.S., Ford W.W. Studies on aerobic spore-bearing non-pathogenic bacteria // J. Bacteriol. 1916. - № 1. - P. 273.

132. Lechner S., Mayr R., Francis K. et al. Bacillus wiehenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group // Int. J. System Bacteriol. 1998. - № 48. - P. 1373-1378.

133. Lepesme P. Sur la presence du Bacillus prodigiosus chez le criquet pelerin (Schistocerca gregaria Forsk.) II Bull. Soc. Hist. Afr. 1937. - № 28. - P. 406.

134. Lynch M., Baumann P. Immunological comparisons of the crystal protein from strains of Bacillus thuringiensis II J. Invertebr. Parhol. 1985. - № 46. - P. 47-57.

135. Mattes O. Parasitare Krankheiten der Mehlmotten-Larven und Versuche uber ihre Verwendbarkeit als biologische Bekampfungsmittel. Sitzber, Ges. Beforder. ges // Naturw. 1927. - № 62. - P. 381.

136. Masson L, Tabashnik В., Liu Y. et al. Helix 4 of the Bacillus thuringiensis Cryl Aa toxin lines the lumen of the ion channel // J. Biological Chemistyr. 1999. №5; 274(45).-P. 1996-2000.

137. Mc Connell E., Richards A.G. // Canad. J. Microbiol. 1959. - V. 5, № 2. - P. 161-168.

138. Metalnikov S., Chorine V. The infections diseases of Pyrausta nubilalis Hb. И Intern. Corn. Borer Invest. Sci, Repts. 1929. - P. 41-69.

139. Ford W.W., et. al. 1916. Studies on acrobic sporebearing non-pathogenic bacteria //J. Bacteriol. 1916. - V. 1(3), 273, № 5. - P. 493.

140. Ford W.W. Texstbook of bacteriology. Saunders Co.- 1927.

141. Grochulski P., Masson L., Borisova S. et al. Bacillus thuringiensis CrylAa insecticidal toxin: crystal structure and channel formation //J. Molecular Biology. -1995.-№ 254.-P. 447-464.

142. Gonzales J.M. Jr., Dulmage H. Т., Carlton B.C.// Plasmid. 1981. - V. 5, № 3. -P. 351-365.

143. Gonzales J.M. Jr., Carlton B.C. // Plasmid. 1984. - V. 11. - P. 28-38.

144. Norris J. R. // Ann. Appl. Biology. 1965. - № 56(2). - P. 335.

145. Ohba M., Aizawa // J. Invertebr. Pathol. 1986. - V. 47. - P. 12-20.

146. Ohba M., Aizawa K. Serological identification of Bacillus thuringiensis and related bacteria isolated in Japan // J. Invertebr. Pathol. 1978. - № 32. - P. 303309.

147. Ohba M., Aizawa К (1986) Distribution of Bacillus thuringiensis in soils of Japan // J. Invertebr. Pathol. № 47. - P. 277-282.

148. Ohba M., Aizawa K. Properties of Bacillus thuringiensis subsp. ostriniae and subsp. wuhanensis II Pruc. Assoc. PI. Kyushu. 1979. - V. 25. - P. 125-128.

149. Orth P., Zalunin I., Gasparov V. et al. // J. Protein Chemistry. 1995. - № 14. -P. 241-249.

150. Osawa K., Iwahana H. // Curr. Microbiol. 1986.-V. 13. - P. 337-340.

151. Shanmugavelu M., Rajamohan F., Kalhirvel M. et al. // Appl. Envir. Microbiol. -1998.-V. 64.-P. 756-759.

152. Scherrer R. Molecular elastic gel network structure of the Bacillus megaterium cell wall //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiaol. 1986. - P. 191.

153. Smirnoff W.A. Test of Вас. thuringiensis var. thuringiensis Berliner and Вас. cereus Fr. and Fr. on larvae of Choristoneura fumiferana (Clemens) // Canad. Entomologist. 1963. - № 95(2). - P. 127.

154. Steinhaus E. A. Insect Microbiology. Comstock, Ithaca. N. Y. 1947.

155. Steinhaus E. A. Possible use of Вас. thuringiensis Berliner as an aid in the biological control of the alfalfa caterpillar / Hilgardia, Berkeley. 1951. - № 20. -P. 359-381.

156. Steinhaus E. A. Further observations on Вас. thuringiensis Berliner and other sporeforming bacteria / Hilgardia. 1954. - №. 23. - P. 1.

157. Stephens J. Disease in codling moth larvae produced by several strains of Вас. cereus II Canad. J. Zool. 1952. - № 30(1). - P. 30.

158. Stutzer M.J., Wsorow W.J., Uber Infection der Raupen der Wintersaateule (Euxoa segetum Schiff.) II Zentr. Bart. Parasitenk. Infekt. 1927. - № 71. - P. 113129.

159. Thwaites J.J., Surana U.C., Jones A.M. Mechanical properties of Bacillus subtilis cell walls: effects of ions and lysozyme // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. -№ l.-P. 204-210.

160. Toumanoff C., Durand J. Virulence comparee pour les vers a soie (Bombyx mori L.) de quelques varieties de Вас. cereus Frank, et Frank, entomophages et cristallophores et de leurs inclusions cristallines // Ann. Inst. Pasteur. 1961. - № 100.-P. 290.

161. Toumanoff C., Vago C. L'agent pathogere de la flacherie des vers a soie entemique dans la region des Cevennes: Вас. cereus var. alesti, var. nov. c. r. // Acad. Sci, Paris. 1951.-№ 233. - P. 1504.

162. Ueda K., Ohba M., Aizawa K. Serogrouping of Bacillus thuringiensis by extracellular heat-stable somatic antigens // System, and Appl. Microbiol. 1991. -V. 14. -№ 13.-P. 291-295.

163. Vago C. L'enchainement des maladies chez les insectr. // Ann. Inst. Nat. Rech. Agron.-Ser. C.- 1959.-№ 10.-P. 1-81.

164. Wilson W., Miles. Topley's a. Wilson's Principles of Bacteriol. a. Immunal. -London, 1955/

Информация о работе

Вятчина, Ольга Федоровна
кандидата биологических наук
Иркутск, 2003
ВАК 03.00.16

Диссертация

Экологические особенности энтомопатогенных бактерий вида bacillus thuringiensis, циркулирующих в биоценозах Камчатки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы