Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственная структура транскрипционного регулятора HlyIIR B. Cereus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Пространственная структура транскрипционного регулятора HlyIIR B. Cereus"

На правах рукописи

Ковалевский Олег Владимирович

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ТРАНСКРИПЦИОННОГО РЕГУЛЯТОРА НЬУ1№ В. СЕЛЕНЯ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003450253

Пущино - 2008

003450253

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизиов им. Г. К.| Скрябина РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук

старший научный сотрудник Солонин Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва

адресу: 142290, г».Пущино, Московской области, Институтская ул., д. 3.

I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клеткв РАН, Пущино.

Никонов Станислав Владимирович Институт белка РАН, Пущино; доктор биологических наук Равин Виктор Константинович Институт биофизики клетки РАН, Пущино

Защита диссертации состоится ( 3 ^_2008 года в_часов на заседаний

Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН пс!

Автореферат разослан .!.(?„. 2008 Ученый секретарь Диссертационного coi кандидат биологических наук

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из основных задач современной молекулярной биологии является всестороннее изучение процесса экспрессии генетической информации. Современные данные свидетельствуют о том, что экспрессия подавляющего большинства генов регулируется на многих уровнях. Тончайшая настройка всех клеточных систем в соответствии с потребностями клетки обеспечивается функционированием сложных многокомпонентных регуляторных сетей. В случае прокариотических организмов основная часть регуляторных событий приходится на уровень транскрипции, поэтому всестороннее, в том числе структурно-функциональное, изучение белковых транскрипционных регуляторов является приоритетной фундаментальной задачей молекулярной биологии прокариот.

Bacillus cereus - широко распространенный грам-положительный, спорообразующий, условно-патогенный для человека микроорганизм. Некоторые штаммы В.cereus могут вызывать пищевые отравления, пост-травматические инфекции, а также другие заболевания. Патогенные свойства В. cereus определяются синтезом многочисленных белковых токсинов, различающихся по механизму действия на ферментативные (например, сфингомиелиназа и др.) и порообразующие (гемолизин BL, гемолизин II и др.). В настоящее время в научной литературе охарактеризовано всего три регулятора, контролирующих экспрессию токсинов B.ceretts. Это (i) глобальный регулятор PlcR, активирующий более ста генов и оперонов, (ii) шгейотропный регулятор Fur, контролирующий синтез металлопротеинов и некоторых токсинов, а так же (iii) HlylIR - регулятор экспрессии гена гемолизина II. Следует отметить важность работ по выяснению деталей функционирования транскрипционных регуляторов, контролирующих синтез токсинов В.cereus, ведь они закладывают основы нашего понимания логики принятия решений патогенными микроорганизмами, а значит, в перспективе, позволят более эффективно проводить терапию вызванных ими заболеваний.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей работы являлось детальное изучение структуры транскрипционного регулятора HlylIR В.cereus. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

• определение олигомерной формы HlylIR в растворе и в бактериальной клетке, как в свободном состоянии, так и при взаимодействии с оператором;

• получение кристаллов HlylIR и экспериментальное определение его пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа;

• анализ структуры HlylIR и выявление структурно и функционально важных областей с помощью направленного мутагенеза, экспериментальное определение структур мутантов;

• кристаллизация комплекса HlylIR с операторной ДНК.

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научная новизна работы. Впервые определена пространственная структура транскрипционного регулятора, участвующего в контроле синтеза токсинов B.cereus, установлено, что белок HlylIR в растворе и при взаимодействии с ДНК, in vitro и in vivo существует в виде димера. Впервые получены данные, указывающие на возможное участие стероидных производных в регуляции экспрессии гена гемолизина П, и показана способность мутантного варианта белка TetR-семейства к образованию альтернативного димера.

Координаты атомов транскрипционного регулятора HlylIR и его мутантов, определенные методом рентгеноструктурного анализа, занесены в Protein Data Bank (коды PDB 2FX0,2JJ7 и 2ЖЗ).

Практическое значение работы. Определение структуры HlylIR создает основу для понимания молекулярной логики регуляции экспрессии гена гемолизина II B.cereus, а точная идентификация низкомолекулярного лиганда, взаимодействующего с HlylIR, может оказаться важной для терапии инфекций и пищевых отравлений, вызванных данным микроорганизмом. Выявление неожиданной способности мутанта HlylIR образовывать альтернативный димер представляет интерес с фундаментальной точки зрения, для углубления нашего понимания деталей белок-белковых взаимодействий и образования четвертичной структуры бежа.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в реферируемых научных журналах. Результаты работа были представлены на Пущинской школе-конференции молодых ученых (2006), конференции молодых ученых

«Ломоносов» (МГУ, 2008), конференциях «Molecular Genetics of Bacteria and Phages» (Колд-Спринг-Харбор, США, 2008) и «Gram-positive pathogens» (Омаха, США, 2008).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 136 источников. Работа содержит 28 рисунков и 4 таблицы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Ген hlylIR, кодирующий белок длиной 201 а.к., в геноме B.cereus располагается сразу за геном гемолизина II (hlyll), оба гена являются независимыми транскрипционными единицами. Проведенные ранее эксперименты в гетерологичных системах in vivo показали, что присутствие hlylIR снижает уровень экспрессия гемолизина II (Budarina et al., 2004). Добавление белка HlylIR значительно ингибировало транскрипцию с промотора гемолизина II in vitro. Было показано, что HlylIR является ДНК-связывающим белком, узнающим специфичную область длиной 44 п.н. в районе промотора гена hlyll. При этом на промоторно-операторном сегменте гена hlyll HlylIR образует тройной комплекс с РНК-полимеразой и снижает уровень транскрипции путем ингибирования изомеризации закрытого промоторного комплекса в открытый (Budarina et al., 2004). 1. Определение олигомерной формы HlylIR в растворе

Анализ аминокислотной последовательности HlylIR показал его сходство с представителями TetR семейства транскрипционных регуляторов в области N-концевого домена (а.к. 12-58), несущего ДНК-связывающий мотив Helix-Turn-Helix. (Budarina et al., 2004). Транскрипционные регуляторы этого семейства существуют в виде гомодимеров, при взаимодействии же с ДНК белки-регуляторы могут устанавливать дополнительные белок-белковые контакты и взаимодействовать с ДНК кооперативно. Для определения молекулярной массы комплексов, образуемых очищенным HlylIR в растворе, использовалась гель-фильтрация и аналитическое ультрацентрифугирование в режимах скоростной и равновесной седиментации. В случае гель-фильтрации, на профиле элюции очищенного препарата HlylIR наблюдался одиночный симметричный пик, гидродинамический радиус частиц соответствовал гидродинамическому радиусу глобулярного белка молекулярной

массы ~45 кДа (Рис. 1). Молекулярная масса мономера Н1у1Ш, определенная по нуклеотидной последовательности его гена, составляет 23,5 кДа, следовательно, в растворе белок Н1у1ГО. существует в виде гомодимера. Результаты ультрацентрифугирования в режиме скоростной седиментации так же показывают, что Н1у1Ш. осаждается в виде монодисперсных частиц с коэффициентом седиментации 3,248, что соответствует глобулярному белку молекулярной массы 48 кДа (Рис. 1). Эксперимент по равновесной седиментации ШуПЯ позволил определить его молекулярную массу как лежащую в диапазоне 46,7-51,5 кДа, что опять-таки согласуется с ожидаемой молекулярной массой димера (47 кДа). Также в ходе эксперимента не было зафиксировано диссоциации Н1у1Ш., то есть образуемые им димеры стабильны во времени.

(а)

5 tí s

íOfcDa

Рис. 1. Результат анализ молекулярной массы HlylIR растворе с помощью гель фильтрации на колонке Superóse 12 HR 10/30 (а) и аналитическог ультрацентрифугирования (б).

(б)

Объем зяюции, мл

HlylIR 0,35 мг/мл 4S0QO об/мии 3,24 S

1 HíyHR 0,35 мг/мл

Л 45000 о$Шн

i j 48143 Да

|_j I

Коэффицект седиментации, &

Кажущаяся молекулярная масел, Да

2. Определение олигомерной формы HlylIR при взаимодействии с оператором

Способность HlylIR изменять олигомерную форму при взаимодействии оператором была исследована in vitro с помощью метода химических сшивок ¡ бактериальной гибридной системы «X cl fusion» in vivo. Ковалентная сшивк

свободного ШуПЯ приводит к появлению зон, подвижность которых в условиях денатурирующего электрофореза соответствует димерной форме Н1у1Ж (Рис. 2). Слабые полосы, соответствующие высокомолекулярным комплексам, очевидно, возникли из-за неспецифичной сшивки. Такая же химическая сшивка Н1у1Ж, проведенная в присутствии избытка операторной ДНК, не изменила картину сшивки на электрофореграмме. (Рис. 2) Следовательно, Н1у1Ж не изменяет олигомерную форму при взаимодействии с операторной ДНК. Было установлено (Яос^коуа е1 а1., 2007), что с операторной областью гена Ыу11 взаимодействует 4 молекулы ШуПЯ, значит, с оператором взаимодействуют два димера ШуПЯ. Отсутствие изменений в картине сшивки глутаровым альдегидом при добавлении операторной ДНК свидетельствует о том, что два димера ШуПЯ располагаются на ДНК на расстоянии, превышающим длину связи, образуемой сшивающим реагентом. Это так же указывает на отсутствие белок-белковых взаимодействий между димерами при связывании ДНК.

Для подтверждения данных, полученных in vitro, была использована бактериальная гибридная система "X. cl fusion", позволяющая исследовать олигомеризацию белков in vivo. Одним из достоинств данной гибридной системы является возможность отличить димеризацию белка от его способности образовывать другие олигомерные формы и устанавливать дополнительные белок-белковые контакты (Ни et al.,1990; Di Lallo et al.,1999). Принцип действия системы " X cl fusion" основан на взаимодействии репрессора cl фага X с его операторным участком 0R. N-концевой ДНК-связывающий домен с1-репрессора (аминокислоты 1-132) сам по себе не может функционировать как репрессор, так как он неэффективно связывается с операторной ДНК из-за отсутствия димеризации, обеспечиваемой С-концевым доменом. Было показано, что при замене С-концевого домена cl-penpeccopa другим

Рис. 2. Химическая сшивка Н1у11Я 0,1% глутаровым альдегидом в свободном состоянии (дорожка 3) и в комплексе с операторной ДНК (дорожка 4). Дорожка 1 - маркеры, дорожка 2 - необработанный Н1у11Я, контроль.

12 3 4

белком, способным к димеризации, репрессорная функция этого гибридного белка сохраняется (Ни et al.,1990). Таким образом, способность тестируемого белка к олигомеризации in vivo может быть проанализирована путем сравнения биологической активности гибридного белка (N-концевой домен с1-репрессора слитый с тестируемым белком) с активностью с1-репрессора дикого типа Репрессорная активность химерного белка может быть количественно оценена по уровню экспрессии репортерного гена (р-галактозидазы), находящегося под контролем промотора и оператора фага X, например PrOr. Анализ уровня репрессии репортера, находящегося под контролем разных синтетических промоторно-операторных областей, позволяет отличить димеризацию тестируемого белка от его способности образовывать более сложные олигомерные формы (Ни et al., 1990).

Структурная часть гена hlylIR была слита с областью, кодирующей N-концевой домен cl-penpeccopa (cINTD, а.к. 1-132) в составе плазмиды pJH391. Данная конструкция была трансформирована в три репортерных штамма E.coli. В штамме JH372 ген репортера lacZ находится под контролем природного промотора X 0RPR, а в штаммах JH607 и XZ980 ген репортера контролируется синтетическими промоторно-операторными областями, содержащими разные комбинации сильных и слабых операторов фага X. Анализ активности р-галактозидазы в штамме JH372, синтезирующим гибридный белок cINTD-HlyíIR, показал, что гибридный белок обладает такой же репрессорной активностью, как и el репрессор дикого типа (Рис. 3). Это означает, что HlylIR образует олигомеры in vivo. Измерение активности репортера в штаммах JH607 и XZ980, экспрессирующих cINTD-HlyíIR, и сравнение с димерными и тетрамерными контролями, свидетельствует, что HlylIR образует димеры in vivo и не способен к образованию более сложных олишмерных форм (Рис. 4). Эти данные полностью согласуются с биохимическими данными, полученными in vitro, и указывают на то, что два димера HlylIR взаимодействуют с операторной областью гена гемолизина II независимо.

3. Кристаллизация и реитгеиоструктурный анализ белка HlylIR

Для выяснения деталей пространственного строения бежа HlylIR был использован метод рентгеноструктурного анализа. Первым этапом рентгеноструктурного анализа является получение кристаллов белка, обладающих способностью к дифракции рентгеновского излучения.

2500 , 2000 I 1600 a iooo

® 500

l

Рис. 3. Активность Р-галактозидазы в репортерном штамме JH372

1. AG 1688 - контрольный штамм без р -галактозидазы

2. JH372 pZ 150 - не содержит репрессора

3. JH372 pKHlOl - N-концевой домен cl-репрессора, негативный контроль

4. JH372 pFG 157 - ингактный el репрессор, позитивный контроль

5. JH372 рШ1 - интактный HlyllR

6. JH372 pHCFI - гибридный белок dNTD-HlylIR

Начальный поиск условий кристаллизации белка HlyllR бьш проведен с использованием препарата, очищенного по обычной схеме (Budarina et al., 2004). Кристаллизация велась методом диффузии паров растворителя в варианте «лежачей капли», белок смешивался с раствором осадителя в соотношении 0,15 мкл: 0,15 мкл в специальных планшетах фирмы Greiner с использованием робота Mosquito фирмы ТТР Labtech. Было проанализировано примерно 500 различных условий с использованием фирменных наборов для поиска условий кристаллизации (Hampton Crystal Screen 1 -2, Index, PACT, SaltRX, PEG/Ion фирм Hampton Research и Molecular Dimensions), однако кристаллы HlyllR получены не были. В обычную схему очистки белка входила стадия осаждения сульфатом аммония, которая иногда негативно влияет на возможность такого препарата белка кристаллизоваться. Поэтому белок был заново очищен по модифицированной методике, исключающей стадию осаждения сульфатом аммония и включающей дополнительную стадию очистки гель-фильтрацией. Повторный скрининг условий с использованием нового препарата белка выявил два условия кристаллизации, в качестве осадителя в обоих условиях выступал сульфат аммония. Была проведена оптимизация условий кристаллизации, лучшие кристаллы росли при использовании 0.1 М Na Cacodylate рН 6.0, сульфат аммония 60% насыщения, 3% изопропанола п качестве осадителя. В этих условиях росли крупные одиночные кристаллы, длиной около 0,4 мм, шириной 0,1-0,2 мм,

Рис. 4. Активность р -галактозидазы в репортерных штаммах 1Н607,Х2980

1. рКН101 - Ы-концевой домен С1-репрессора, негативный контроль (отношение активности Л1607/>2980 = 0,9)

2. р.!Н370 - позитивный контроль на димеризацию

(отношение активности Ш607/Х2980 = 0,9)

3. рШ622 - позитивный контроль на тстрамеризацию

(отношение активности ,/Н607/Х2980 = 2,8)

4. рНСН- гибридный белок сГЫТЭ-Иуте (отношение активности 1Н607/Х2980 = 1,1)

обычно дифрагирующие рентгеновское излучение до разрешения примерно 7-10Е. Проверка нескольких десятков кристаллов позволила найти невоспроизводимый кристалл, дифрагирующий до разрешения 2,9 Е на синхротронном источнике излучения (станция Ш-23 синхротрона ESRF, г. Гренобль, Франция). Был собран набор данных, однако попытки решить структуру методом молекулярного замещения закончились неудачей из-за отсутствия близких гомологов с известной структурой (ближайший гомолог с известной структурой - белок Ycdc из E.coli, код PDB 1РВ6, идентичность а.к. последовательности с HlylIR составляет лишь 22%).

Для экспериментального определения начальных фаз было решено получить кристаллы селено-метионинового производного белка HlylIR, в котором все остатки метионина замещены на селено-метионин, содержащий атом селена вместо атома серы. Селено-метиониновый (SeMet) вариант белка HlylIR был получен и очищен по модифицированной методике. Включение селено-метионина было подтверждено анализом молекулярной массы белка с помощью масс-спектрометрии. Попытки получить кристаллы SeMet-HlylIR в условиях, оптимизированных для нативного белка, не увенчались успехом - образовывался аморфный осадок. При модификации условий были получены кристаллы SeMet-HlylIR при другом значении рН (в качестве осадителя использовался 0,1М ацетат натрия, рН 5,0, сульфат аммония 50% насыщения). Хотя дифракционное качество основной массы кристаллов было неудовлетворительным (предел дифракции примерно 7-10 Е), после проверки нескольких десятков кристаллов был найден невоспроизводимый кристалл, дифрагирующий до разрешения 2,4 Е. С него были собраны наборы данных на станции ВМ-14 синхротрона ESRF (Гренобль, Франция) на трех длинах волн: 0.9794 Е (минимум f), 0.9792 Е (максимум f") и 0.9184 Е (удаленная длина волны высокой энергии, см. таблицу 1).

Координаты двух атомов селена, и начальные фазы были определены методом аномальной дисперсии на трех длинах волн (MAD) с использованием программы SOLVE, затем начальная модель HlylIR была построена автоматически программой RESOLVE. Модель содержала 74% аминокислотных остатков, из которых 46% были построены с боковыми цепями, а остальные - как полиаланиновая модель (Rw<,rk= 37.4%, Rfree =41.0%). Далее модель была достроена вручную с использованием программ COOT и Quanta, для уточнения использовалась программа REFMAC5.

Итоговая модель характеризуется значениями рабочего и свободного R-факторов равными соответственно 22.3% и 27.6%, рассчитанными по 13895 и 695 рефлексам в диапазоне разрешения 2,4-25 Е (Таблица 1). Модель содержит 179 остатков (Ser4 -Lys 198). Остатки 170-185 не были построены из-за отсутствия интерпретируемой электронной плотности. Стереохимическое качество модели было проанализировано программой PROCHECK, 91,3% аминокислотных остатков находились в предпочтительных областях по Рамачандрану, остальные - в разрешенных областях (Таблица 1). Координаты атомов HlylIR были депонированы в Protein Data Bank, структуре присвоен код 2FX0.

Анализ структуры показал, что белок HlylIR образует димер и имеет характерную для TetR семейства укладку, с общими размерами димера 60 Е Ч 60 Е Ч 25 Е. Белок является полностью альфа-спиральным, каждая субъединица состоит из 9 альфа-спиралей. Третичная структура стабилизирована гидрофобными контактами между спиралями и одиннадцатью солевыми мостиками. Мономер HlylIR можно подразделить на два домена - N-концевой, ответственный за связывание ДНК и С-концевой, ответственный за димеризацию.

Рис. 5. Структура Н1у1Ж. (а) - карта электронной плотности 2|Ро|-|Рс| для первой альфа-спирали, контур на 1,25 о. (б) - скелетная модель мономера Н1у1Ш., окрашенная по радуге, (в) - димер Н1у1Ж, желтым обозначена поверхность внутренней полости - лиганд-связывающего кармана.

Ы-концевой домен состоит из трех альфа-спиралей, вторая и третья образуют канонический ДНК-связывающий мотив НеНх-Тигп-НеНх. Аминокислотные остатки этого домена консервативны для всех представителей TetR семейства регуляторов, за исключением остатков, определяющих специфичность узнаваемой последовательности ДНК. Первая альфа-спираль одновременно служит интерфейсом

N-концевой домен N-

С-концевой домен

лиганд-

связыаающе

полость

-N

для соединения с С-концевым доменом и стабилизирует, поддерживает пространственное расположение мотива НеНх-Тигп-НеПх. Таблица 1. Кристаллографическая статистика

Рентгенодифракционмые параметры SeMet-HlyllR HlyllRAL HlyllRÜLS7

Пространственная группа Рв,22 P2,2,2 P2,2,2,

Параметры элементарной ячейки а,Ь,с (Е) 124,1; 124,1; 79,5 66,8, 120,4, 55,2 38,4, 78,9; 143,8

Длина волны (Е) 0,9792 (peak) 0,9794 (inflection) 0,9184 (remote) 0,934 0,9804

Л г (в) -8,09, 6,39 -9,87, 3,41 -4,1, 3,5

Разрешение, Е (внешняя оболочка) 25-2,4 (2,49-2,4) 25-2,7 (2,8-2,7) 25-2,9 (3,0-2,9) 25-2,1 (2,18-2,1) 25-2,2 (2,28-2,2)

Число независимых отражений 14593 (1422) 10250(874) 8440 (800) 26373 (2279) 22752 (2063)

Среднее число наблюдений отражения 11,5(10,5) 6,6 (5,1) 6,9 (7,2) 4,8 (3,2) 4,1 (3,8)

Полнота набора (%) 99,9 (99,3) 98,5 (87,1) 99,8(99,8) 97,6 (86,1) 98,7(91,4)

<1/о(1)> 21,5(3,8) 21,7 (3,4) 18,2 (3,9) 15(1,8) 15.8 (1,9)

Ятегде® (%) 9,0 (58,8) 7.3 (42,9) 10,2(55,7) 7,4 (50,0) 7,5 (58,0)

Параметры уточнения структуры

Разрешение (Е) 25-2,4 25-2,1 25-2,2

Количество отражений использованных при 13895 25102 21749

уточнении 0,223

Кристаллографический К-факторь 0,179 0,198

Число контрольных отражений 695 1062 946

Свободный (^-фактор" 0,276 0,237 0,254

Количество атомов белка 1476 2981 2976

Количество молекул воды 114 195 140

Вильсоновский В-фактор (Е2) 45,3 34 40.5

Средний В-фактор (Е2) 51,9 39,8 30,8

Среднеквадратичные отклонения 0,012 (0,02)

Длин связей" (Е) 0,01 (0,02) 0,013 (0,02)

валентных угловс (град) 1,17 (1,9) 1,1 (1,9) 1,5(1,9)

Статистика по Рамачандрану 91,3

Предпочтительные области (%) 96,0 93,5

Разрешенные области (%) 8,7 4,0 6,5

Запрещенные области (%) О 0 0

3 Rmerge ~ 2 I'" <!>!1 ^ Ь Кристаллографический R-фактор, свободный R-фактор = Z |1F0| - |F01[ / £ |F0[ . с В скобках дано среднеквадратичное отклонение от стандартных значений

С-концевой домен состоит из шести альфа-спиралей, пять из которых

формируют анти-параллелъный пучок. С-концевые домены двух субъединиц димера

образуют ядро белка, площадь димеризационного интерфейса составляет 1800 Е2

(17% поверхности мономера). Большинство межсубъединичных контактов

образованы шестой и восьмой альфа-спиралями, так же некоторые контакты

образованы петлей, соединяющей спирали седьмую и восьмую с девятой спиралью соседней субъединицы. В основном межсубъединичные контакты гидрофобны по

10

своему характеру, однако, они дополнены десятью прямыми водородными связями между субъединицами и четырьмя водородными связями через молекулы воды. Область белка между восьмой и девятой альфа-спиралями (сегмент Prol61-Serl69) образует два альфа-спиральных поворота и входит в соответствующее углубление на поверхности соседней субъединицы. Следующий за этим сегментом участок полипептидной цепи а.к. 170-185 не был построен из-за отсутствия интерпретируемой электронной плотности, что свидетельствует о разупорядоченности данной области белка

В структуре HlyllR была обнаружена значительная по объему внутренняя полость, располагающаяся в центре альфа-спирального пучка С-концевого домена. Длина этой полости 18 Е, объем -550 Е3 (Рис. 5,6). Поверхность полости образована 25 гидрофобными остатками, располагающимися на альфа-спиралях с четвертой по восьмую. Вход в полость расположен между четвертой и пятой альфа-спиралями и ограничен боковыми группами Туг62 и His93.

Присутствие внутренней полости и аналогия с другими представителями TetR семейства позволяет заключить, что ДНК-связывающие свойства HlyllR могут модулироваться связыванием низкомолекулярного лиганда. Структурная информация для апо- и лиганд-связанной формы доступна для двух белков TetR семейства: QacR и TetR. В обоих случаях в связанной с лигандом форме ДНК-связывающие домены белка изменяют свое пространственное расположение, в такой конформации белок не способен связывать ДНК. Проведенный анализ потенциальной подвижности белка HlyllR (метод NMA, использован сервер ElNemo) показывает, что его N-концевые домены обладают значительной потенциальной подвижностью относительно С-концевых доменов. Таким образом, можно сделать вывод, что внутренняя полость HlyllR является лиганд-связывающим карманом, а связывание лиганда в свою очередь модулирует ДНК-связывающие свойства белка, изменяя пространственную ориентацию его ДНК-связывающих доменов.

Для идентификации потенциальных лигандов, с которыми может взаимодействовать HlyllR, был проведен компьютерный скрининг библиотеки малых молекул NCI Diversity Set (~2000 соединений) с помощью программы AutoDock 3.0. Для каждого лиганда было сгенерированно 20 случайных положений в области гидрофобной полости HlyllR и для каждого положения проведен поиск

энергетического минимума, ограниченный 750 ООО вычислениями свободной энергии по генетическому алгоритму локального поиска. Результаты были оценены по значениям предсказанной свободной энергии связывания. Лучшие отобранные лиганды с самой низкой предсказанной свободной энергией связывания, от -16,7 до -14,6 ккал/моль, являлись стероидными производными. Отобранные соединения имели близкую структуру: стероидное ядро, к которому с помощью линкера присоединено ароматическое кольцо. Контрольный расчет, выполненный для белка <3ас11 и его природных лигандов, дал значения свободной энергии связывания от -12,5 до -9,8 ккал/моль. Результаты виртуального скрининга библиотеки лигандов свидетельствуют о том, что Н1у11Я потенциально способен связывать достаточно крупные молекулы с массой 400-500 Да, возможно являющиеся стероидными производными (Рис. 6).

Н1у1Ш. является репрессором гена гемолизина II, порообразующего токсина, атакующего мембраны эукариотических клеток. В состав эукариотических мембран входит стероидное производное холестерин, его масса составляет от 3% до 15% от массы мембраны. Можно предположить, что именно холестерин, либо продукт его деградации/модификации бактериальными ферментами, может являться лигандом, изменяющим ДНК-связывающую активность Н1у11Я, а значит и определяющим синтез самого гемолизина И. Данное предположение нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке.

А , /„, Б

^ 0 j6

Рис. 6. (а) Лиганд-связывающий карман HlyllR, стерео. Желтым обозначен контур по Ван-дер-Ваальсовым радиусам аминокислотных остатков, формирующих полость. Внутри полости отображена молекула лиганда NCI #23904, получившего самый высокий рейтинг по результатам виртуального скрининга библиотеки лигандов. (б) Потенциальные лиганды, отобранные в ходе виртуального скрининга. (NCI #3354, #17245, #23904, #88915)

4. Кристаллизация комплекса Н1у1ГО и операторной ДНК

Многие транскрипционные регуляторы, в том числе репрессоры Те1К-семейства (ТеЖ. и С?ас11), способны значительно изменять локальную конформацию молекулы ДНК в области специфичного связывания. Для изучения структурных особенностей комплекса белка ШуПЯ с операторной областью гена гемолизина II, были предприняты попытки получить кристаллы комплекса Н1уШ1 и двухцепочечного олигонуклеотида, представляющего минимальный сайт связывания ШуПН.

Известно, что успех кристаллизации ДНК-белкового комплекса часто зависит от структуры ДНК-субстрата (его длины, наличия неспаренных нуклеотидов по краям и т.д.). Минимальный сайт связывания ШуИЖ. был идентифицирован ранее (ЯосИкоуа е1 а1., 2007), он составляет половину (22 п.н.) совершенного инвертированного повтора длиной 44 п.н., находящегося в операторной области гена МуП. Чтобы найти оптимальный ДНК-субстрат для кристаллизации комплекса с ШуПХ, были проверены пять двухцепочечных олигонуклеотидов с тупыми концами, длиной 22-28 п.н., содержащих минимальный сайт связывания Н1уШ1. Для каждого субстраха его комплекс с Н1у1Ш. бьи очищен гель-фильтрацией, сконцентрирован до 15 мг/мл (по белку) и использован для поиска условий кристаллизации. Наблюдалась следующая картина: комплексы Н1уИК с двухцепочечным ДНК-субстратом длиной 22 п.н. образовывали сростки мелких игл в условиях, содержащих полиэтиленгликоль в качестве осадителя. Комплексы с субстратами длиной 24-26 п.н. формировали крупные кристаллы в виде qpocткoв толстых пластин в таких же условиях, а комплексы ГПуПЯ с олигонуклеотидом длиной 28 п.н. не образовывали кристаллов, наблюдалось лишь образование аморфных осадков или сферулитов. Хотя крупные кристаллы комплекса Н1у1Ш. с ДНК были получены уже на этой стадии, эти кристаллы не дифрагировали рентгеновское излучение, за исключением кристаллов комплекса ШуГО и олигонуклеотида длиной 24 п.н Для подтверждения того, что полученные кристаллы содержат именно комплекс Н1у1ГО. и ДНК, кристаллы были отмыты от исходного раствора, после чего проверены с помощью электрофореза. Анализ показал, что кристаллы действительно содержат и белок, и ДНК. Дальнейшая оптимизация ДНК-субстрата была проведена на основании субстрата длиной 24 п.н., были проверены производные этого олигонуклеотида, содержащие дополнительные

неспаренные нуклеотиды на 5' и 3' концах. Наилучшими кристаллизационными свойствами обладал комплекс HlyllR с ДНК-субстратом, содержащим, соответственно, неспаренные аденин и тимин на 5' концах. К сожалению, несмотря на интенсивную оптимизацию условий кристаллизации (вариации pH и поиск оптимальной буферной системы, варьирование молекулярной массы полиэтиленгликоля, выступающего в качестве главного осадителя, проверка различных органических и неорганических добавок, потенциально способных улучшить ход кристаллизации, варьирование температуры кристаллизации, и др.) и проверку почти двух сотен кристаллов, лучшие кристаллы дифрагировали рентгеновское излучение лишь до разрешения 7-10 Е на домашнем источнике с вращающимся анодом. При проверке на станции ID14-1 синхротрона ESRF (г. Гренобль, Франция) лучший кристалл давал анизотропную дифракцию до разрешения 4,5 Е в одном направлении и 6,5 Е в другом. К сожалению, этого недостаточно для определения структуры комплекса HlyllR с ДНК. Тем не менее, проделанная работа показала принципиальную возможность получения кристаллов комплекса HlyllR и ДНК, так же был подобран оптимальный ДНК-субстрат для кристаллизации.

S. Улучшение кристаллизационных свойств HlyQR направленным мутагенезом

При определении структуры HlyllR была обнаружена неупорядоченная область а.к. 170-185, располагающаяся между сегментом Prol61-Serl69, образующим два альфа-спиральных оборота, и девятой альфа-спиралью. (Рис. 7-а) Сегмент Рго161-Serl69 образует контакты со второй молекулой в составе димера, соответственно разупорядоченная область находится вблизи димеризационного интерфейса. Расстояние между атомами Ca последних упорядоченных аминокислотных остатков Serl69 и Aspl86 составляет 16,9 Е. Соответственно, 6 аминокислотных остатков достаточно, чтобы покрыть это расстояние, однако в нативном белке этот сегмент состоит из 15 аминокислотных остатков. Для изучения влияния этой области на свойства HlyllR, а так же возможного улучшения дифракционных качеств кристаллов белка, была проведена работа по замене неупорядоченной области HlyllR (а.к. 170185) на короткие линкеры с использованием сайт-направленного мутагенеза.

Так как для покрытия расстояния между последними упорядоченными аминокислотами, окружающими неупорядоченную область, достаточно шести

аминокислот, была предпринята попытка заменить неупорядоченную область 170-185 на линкер, состоящий из четырех адалинов и двух глицинов по краям. Клетки Е. coli продуцировали мутантный белок, но он образовывал нерастворимые тельца включения. Попытки получить растворимый белок стандартными методами (варьирование температуры выращивания штамма-продуцента, варьирование pH, ионной силы и состава буферов для растворения, использование детергентов) не увенчались успехом, что может свидетельствовать о нарушении сворачивания данного мутантного белка. А

\ J

а ^'if

W сЭ

-.16.9 А

^ г,

HlyllR

предсказание Modeller

HlyllRAL

Рис. 7. Скелетная модель, иллюстрирующая ход основной цепи вблизи разуцорядоченной области а.к. 170-185 в (а) нативном HlylfR, (б) - в предсказанной программой Modeller конформации белка после замены области 170-!85 на апанин. Структура нативного HlyllR показана светлым, предсказанная структура мутанта - темным, (в) - наложение структур нативного HlyllR и экспериментально определенной структуры мутанта HlyllRAL с заменой области 170-185 на аланин. Структура нативного HlyllR показана светлым, мутанта HlyllRAL - темным.

Далее была иснользована программа Modeller для моделирования линкера. Результат расчетов свидетельствует о том, что возможно разворачивание последних оборотов девятой альфа-спирали и сегмента Prol61-Serl69, что может привести к значительному сближению остатков Serl69 и Aspl86. Соответственно, по данным моделирования, всего одной аминокислоты может оказаться достаточно для соединения этих остатков (Рис. 7-6). В соответствии с этим был получен мутант HlyllR, в котором разупорядоченная область 170-185 была заменена на один аланиновый остаток, мутантный белок назван HlyllRAL. Этот белок, эффективно продуцируемый в клетках £ coli, был очищен до гомогенного состояния. По результатам соответственно гель-фильтрации и EMSA мутантный белок образует димер, но потерял ДНК-связывающую активность.

Эксперименты по кристаллизации HlylIRAL показали, что мутантный белок обладает значительно лучшими кристаллизационными свойствами по сравнению с нативным HlylIR. Если кристаллы HlylIR обычно дифрагировали до разрешения 710 Е, то мутант с замененной на аланин областью 170-185 рутинно давал кристаллы, дифрагирующие по меньшей мере до разрешения 3 Е. В результате структура HlyllRAL была определена с разрешением 2,1 Е и уточнена до значений рабочего и свободного R-факторов соответственно 17,9% и 23,7%. (Таблица 1) Координаты атомов мутанта HlylIRAL занесены в Protein Data Bank, структуре присвоен код 2JJ7.

Таким образом, разупорядоченная область 170-185 действительно негативно влияет на кристаллизационные свойства нативного HlylIR. Полученный результат подтверждает возможность использования сайт-направленого мутагенеза для создания мутантных белков со значительно улучшенными кристаллизационными свойствами.

Наиболее удивительной особенностью структуры мутанта HlylIRAL является полная перестройка димера белка. Как видно из рисунка 8, субъединицы HlylIRAL развернуты друг относительно друга на 160 градусов по отношению к их положению

Рис. 8. Структуры димеров нативного ШуПЯ (а) и мутанта Н1у1ЖДЬ (б). Субъединицы показаны разными оттенками серого.

в димере нативного Н1у1Ж, причем новые контакты между субъединицами в структуре мутанта поддерживаются тем же участком поверхности, что и в димере

N-/

нативного белка. Анализ биохимических свойств HlyllRAL неожиданно показал, что мутантный белок не способен связывать ДНК. Для узнавания специфичной последовательности ДНК димерный белок HlyllR использует два N-концевых домена, несущих широко распространенный мотив Helix-Turn-Helix. Соответственно, оба мотива должны корректно располагаться в пространстве друг относительно яруга, чтобы одновременно взаимодействовать с двумя участками большой бороздки ДНК, находящимися на расстоянии одного оборота спирали ДНК. Однако в белке HlyllRAL из-за реорганизации димера ДНК-связывающие домены расположены совершенно иначе и не могут одновременно взаимодействовать с ДНК, что объясняет отсутствие способности связывать ДНК у мутантного белка.

Причина столь значительной структурной перестройки белка после замены разупорядоченной области 170-185 на аланин заключается в том, что в мутантном белке сегмент Prol61-Serl69 принял абсолютно другую конформацию, не соответствующую предсказанной программой Modeller (Рис. 7 б,в). Согласно теоретическим расчетам, последний виток девятой альфа-спирали мог развернуться, обеспечив сближение Aspl86 и Serl69. В экспериментально определенной структуре девятая альфа-спираль удлинена на один оборот, что приводит к изменению позиции всего сегмента Prol61-Serl69. Этот сегмент вносит значительный вклад в образование димеризационного интерфейса нативного HlyllR. Так, общая площадь интерфейса составляет примерно 1800 Е2, из них примерно 800 Е2 образовано двумя сегментами Prol61-Serl69 соседних субъединиц димера. Эти сегменты выступают из плоскости интерфейса и входят в соответствующие углубления на поверхности субъединицы-партнера, служа защелкой, фиксирующей димер в пативкок ориентации. Однако в мутанте HlyllRAL позиция сегмента Prol61-Serl69 изменилась настолько, что он уже не может образовывать контакты с соседней субъединицей и участвовать в формировании димеризационного интерфейса. Сегмент Prol61-Serl69 в новом положении не может фиксировать субъединицы в нативной ориентации и, как следствие, субъединицы HlyllRAL развернулись на 160 градусов вокруг оси, примерно перпендикулярной плоскости исходного димеризационного интерфейса, найдя энергетический минимум в новом положении. Площадь интерфейса при новом положении субъединип составила 1400 Е2 (13% от общей поверхности мономера). Таким образом, наблюдается удивительная способность мутанта HlyllRAL

устанавливать альтернативные межсубъединичные контакты на том же самом димеризационном интерфейсе и формировать альтернативный, ненативный димер.

Экспериментальное определение структуры мутанта HlylIRAL позволило установить принципиальную важность сегмента Prol61-Serl69 для поддержания и нативной структуры димера белка. Функция же разупорядоченной области 170-185, по всей видимости, заключается лишь в обеспечении возможности принятия правильной конформации для сегмента Prol61 -Serl69. Данные выводы не могли быть сделаны на основании анализа одной лишь структуры нагивного HlylIR, то есть определение структуры мутанта HlylIRAL принципиально для понимания устройства нативного белка. Кроме того, полученный мутант действительно обладает значительно улучшенными кристаллизационными свойствами, однако, использовать его для определения структуры комплекса HlyIIR-ДНК невозможно из-за изменения четвертичной структуры белка и, как следствие, потери ДНК-связывающей активности.

Следующим шагом в структурных исследованиях HlylIR стало создание мутанта с модифицированным линкером, замещающими неупорядоченную область а.к. 170-185. Из анализа структуры HlylIRAL следовала необходимость увеличения длины линкера для обеспечения возможности принятия нативной конформации сегментом Prol61-Serl69. Был создан мутант HlylIR, названый HlyIIRALS7, с заменой неупорядоченной области на серин-глициновый линкер длиной 7 аминокислот (GSSGSSG). Так же в этом мутанте последние упорядоченные аминокислоты, ограничивающие неупорядоченную область (Aspl86 и Serl69) были заменены глицинами. Мутантный белок синтезировался в клетках E.coli и был очищен до гомогенности. Биохимический анализ показал, что мутант HlyIIRALS7 потерял ДНК-связывающую активность. Тем не менее, HlyIIRALS7 обладал улучшенными кристаллизационными свойствами по сравнению с нативным белком и рутинно давал кристаллы, дифрагирующие до разрешения примерно 3 Е и выше. В результате структура HlyIIRALS7 была определена с разрешением 2,2 Е и уточнена до значений рабочего и свободного R-факторов соответственно 19,8% и 25,4% (Таблица 1). Анализ структуры показал, что HlyIIRALS7 образует димер, субьединицы которого расположены в ориентации, близкой к ориентации субъединиц нативного HlylIR. (Рис. 9) Тем не менее, в мутантном белке произошла структурная перестройка, как в

области димеризационного интерфейса (позиционный сдвиг на ~4,5 Е, Рис. 10), так и в конформации отдельных субъединиц (изменение положения 1М-концевых доменов), что привело к изменению расположения ДНК-связывающих элементов и потере ДНК-связывающей активности. Определение структуры мутанта Н1у1ШДЬ87 снова указывает на важность разупорядоченной области а.к. 170-185 и сегмента Рго161-8ег169 для поддержания нативной четвертичной структуры белка, так как вмешательство в эту область приводит к

Рис. 10. Сравнение некоторых межсубъединичных контактов нативного Н1у1ГО. и мутантного варианта Н1у1ЖД1£7

Полученные результаты значительно проясняют особенности структурной организации белка HlylIR, специфического регулятора экспрессии гена гемолизина П, а так же помогают понять логику обеспечиваемой им регуляции. Стоит отметить, что в контроле экспрессии гена гемолизина II также участвуют другие регуляторы - Fur и ResD/E, обеспечивающие вместе с HlylIR тонкую настройку синтеза гемолизина II в ответ на изменение условий окружающей среды. Необходимы дальнейшие исследования, направленные на выяснение деталей комплексной регуляции синтеза гемолизина II B.cereus .

Рис. 9. Наложение структур Н!уПКЛЬ57 (субъедишшы окрашены синим и красным) и нативного Н1у11К (серый)

изменению четвертичной структуры.

TrplM

выводы

1. Белок HlylIR в растворе и в бактериальной клетке существует в виде гомодимера. Два димера HlylIR взаимодействуют с операторным участком гена гемолизина II независимо.

2. Получены кристаллы HlylIR и методом рентгеноструктурного анализа определена его пространственная структура с разрешением 2,4 Е. Установлено, что HlylIR имеет пространственную укладку, характерную для TetR семейства репрессоров.

3. В структуре HlylIR обнаружен гидрофобный лиганд-связывающий карман объемом 550 Е3. Компьютерный анализ библиотеки лигандов показал, что HlylIR потенциально способен связывать молекулы массой -400-500 Да, возможно являющиеся стероидными производными.

4. Получены обладающие улучшенными кристаллизационными свойствами мутантные формы HlylIR с заменами в неупорядоченной области с 170 по 185 аминокислотный остаток. Пространственные структуры двух мутантных белков определены методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,1 Е и 2,2 Е. Выявлена способность одного из этих белков к образованию альтернативного димера.

5. Установлена роль сегмента HlylIR с 161 по 169 аминокислотный остаток в поддержании нативной структуры белка.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Kovalevskiy O.V., Lebedev А.А., Surin А.К., Solonin A.S., Antson A A. (2007). Crystal structure of Bacillus ccreus HlyllR, a transcriptional regulator of the gene for pore-forming toxin hemolysin II. J Mol Biol. 365(3):825-34.

2. Rodikova E.A., Kovalevskiy O.V., Mayorov S.G., Budarina Z.I., Marchenkov V.V., Melnik B.S., Leech A.P., Nikitin D.V., Shlyapnikov M.G., Solonin A.S. (2007) Two HlyllR dimers bind to a long perfect inverted repeat in the operator of the hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEBS Lett. 581(6):1190-6.

3. Ковалевский О.В., Антсон А.А., Солонин А.С. (2008) Укорочение неупорядоченной петли С-концевого домена транскрипционного регулятора HlyllR вызывает его структурную перестройку. Молекулярная Биология, принята в печать.

4. Ковалевский О.В.. Майоров С.Г., Антсон А.А., Солонин А.С. (2006) HlyllR -транскрипционный регулятор гена гемолизина II В.cereus. Сборник тезисов 10-й Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино.

5. Ковалевский О.В.. Антсон А.А., Солонин А.С. (2008) Структурные исследования HlyllR - транскрипционного регулятора гена гемолизина II Bacillus cereus. Сборник тезисов 15-й международной конференции молодых ученых «Ломоносов», Москва.

6. Shadrin A., Shapyrina Е., Rodikova Е., Kovalevskiy О.. Protsenko A., Solonin А., Severinov К. (2008) The mechanism of regulation of Bacillus cereus hemolysin II gene promoter. Конференция «Molecular Genetics of Bacteria and Phages», Колд-Спринг-Харбор, США.

7. Solonin A.S., Shadrin A.M., Kovalevskiy O.V.. Rodikova E.A., Shapyrina E.V., Budarina Z.I., Protsenko A.S., Sineva E.V. (2008) Transcription factors interplay in the regulation of hemolysin II gene expression. Конференция «National Conference on Gram-positive Pathogens», Омаха, США.

Опечатка: по всему тексту "Е" следует читать как "А" (ангстрем).

Издательство и типография «Фотон-век», г. Пущино, Московская область. 8 (916) 982-18-60 ЬеогпоЩгатЫег. ги ЬЩ//рЬо1оп-уек. паюс!, ги

ИНН 5039008988

Подписано в печать 29.09.2008. Заказ № 32 Формат 60 х 90/16. Тираж 75 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалевский, Олег Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bacillus cereus - микроорганизм, условно-патогенный для человека

1.1. Гемолизины Bacillus cereus

1.1.1. Гемолизины, имеющие ферментативный механизм действия

1.1.2. порообразующие гемолизины

1.2. Регуляция экспрессии генов токсинов в. cereus

1.2.1. Глобальный регулятор PlcR

1.2.2. Плейотропный регулятор Fur

1.2.3. HlyIIR - специфичный регулятор гена гемолизина II

1.3. Семейство транскрипционных регуляторов TetR

1.3.1. TetR - регулятор гена устойчивости к тетрациклину

1.3.2. QacR - регулятор, контролирующий процесс множественной лекарственной устойчивости

1.3.3. Другие белки TetR семейства с известной пространственной структурой

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы бактерий и плазмидные векторы

2.1.2. Среды и основные буферы ^

2.1.3. Материалы и реактивы.

2.2. Методы исследования 57 2.2.1. Получение компетентных клеток е. coli

2.2.2. Трансформация компетентных клеток

2.2.3. Проведение реакций модификации ДНК

2.2.4. Выделение плазмидной ДНК

2.2.5. Приготовление олигонуклеотидов

2.2.6. Амплификация ДНК с помощью ПЦР

2.2.7. Сайт-направленнь'ш мутагенез

2.2.8. Электрофорез в полиакриламидном геле и агарозе

2.2.9. Очистка белка НьуНК

2.2.9.1. Очистка НьуШ1 с гистидиновым тэгом по обычной методике

2.2.9.2. Очистка НьуШ1 с гистидиновым тэгом по модифицированной методике

2.2.9.3. Очистка НьуШ1 и его мутантных вариантов с отщепляемым тэгом

2.2.10. Продукция селено-метионинового производного белка НьуПЯ.

2.2.11. Проверка связывания НьуГШ. и его мутантов с ДНК

2.2.12. Аналитическая гель-фильтрация

2.2.13. Аналитическое ультрацентрифугирование

2.2.14. Химическая сшивка глутаровым альдегидом

2.2.15. Определение /?-галактозидазной активности

2.2.16. Приготовление комплексов НьуПЯ с ДНК для кристаллизации

2.2.17. Кристаллизация белка НьуПЯ, его мутантов и комплексов с ДНК

2.2.18. Сбор дифракционных данных, определение и уточнение структур

2.2.19. Виртуальный скрининг библиотеки лигандов

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Определение олигомерной формы НьуПЯ в растворе

2. Определение олигомерной формы НьуНК при взаимодействии с оператором

3. Кристаллизация и рентгеноструктурный анализ белка НьуПЯ

4. Анализ пространственной структуры белка НьуНЯ

5. Кристаллизация комплекса НьуИЯ и операторной ДНК

6. Улучшение кристаллизационных свойств НьуИЯ с помощью направленного мутагенеза

7. Мутанты НьуИЯ с заменой области а.к. 170-185 на удлиненный линкер

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Пространственная структура транскрипционного регулятора HlyIIR B. Cereus"

Актуальность работы. Одной из основных задач современной молекулярной биологии является всестороннее изучение процесса экспрессии генетической информации. Современные данные свидетельствуют о том, что экспрессия подавляющего большинства генов регулируется на многих уровнях, тончайшая настройка всех клеточных систем в соответствии с потребностями клетки обеспечивается функционированием сложных многокомпонентных регуляторных сетей. Новое направление молекулярно-генетических исследований - геномика, пытается одновременно рассматривать все гены организма в качестве единой динамической системы, компоненты которой, формируя генные сети, взаимодействуют друг с другом в пространстве и времени. Программой-максимумом функциональной геномики можно считать установление функциональных взаимоотношений между всеми взаимодействующими генами организма, познание фундаментальных отношений между генотипом и фенотипом (Патрушев, 2004). В случае прокариотических организмов основная часть регуляторных воздействий, определяющих экспрессию генетической информации, приходится на уровень транскрипции, поэтому всестороннее, в том числе структурно-функциональное, изучение белковых транскрипционных регуляторов является приоритетной фундаментальной задачей молекулярной биологии прокариот.

Следует отметить, что данная фундаментальная задача так же имеет огромную практическую ценность в случае изучения регуляции синтеза факторов патогепности микроорганизмов, ведь патогенные свойства бактерий определяются не только наличием в их геномах структурных генов токсинов, но и в значительной мере особым контролем экспрессии этих генов. Понимание логики, лежащей в основе ответа микроорганизма на изменение условий среды, проявляющейся, например, в виде скоординированного запуска синтеза токсинов, позволит более эффективно бороться с патогенными бактериями и проводить терапию вызванных ими заболеваний.

В настоящее время активно изучаются генетические системы, контролирующие синтез бактериальных факторов патогенности. Для ряда патогенных микроорганизмов выявлены гены, белковые продукты которых, выступая в роли позитивных или негативных плейотропных регуляторов, контролируют экспрессию целых комплексов из десятков генов, определяющих патогенные свойства бактерий. Наряду с этим обнаружена и более специфическая регуляция, когда белок-регулятор контролирует экспрессию одного или малого числа генов вирулентности, определяя тем самым тонкие особенности патогенного процесса. Эти исследования заслуживают самого серьезного внимания, поскольку их результаты представляют не только фундаментальный научный интерес, но и важны в практическом плане, для повышения эффективности и разработки новых схем терапии инфекционных заболеваний.

Bacillus cereus - широко распространенный грам-положительный, спорообразующий, условно-патогенный для человека микроорганизм. Некоторые штаммы В.cereus могут вызывать пищевые отравления, пост-травматические инфекции, а также другие заболевания. Патогенные свойства B.cereus определяются синтезом многочисленных белковых токсинов, различающихся по механизму действия на ферментативные (например, сфингомиелиназа и др.) и порообразующие (гемолизин BL, гемолизин II и др.). В настоящее время в научной литературе охарактеризованпо всего три регулятора, контролирующих экспрессию токсинов B.cereus. Большинство токсинов, экспрессирующихся в начале стационарной фазы роста (фосфолипаза С, цереолизин, негемолитический энтеротоксин Nhe и другие), находятся под контролем позитивного регулятора PlcR (Slamti and Lereclus, 2002). Данный регулятор инициирует синтез токсинов по механизму "quorum sensing". Недавние исследования показали, что мутантный штамм B.cereus с инактивированным геном транскрипционного регулятора Fur проявляет аттенуированный фенотип. Регулятор Fur контролирует экспрессию генов, вовлеченных в метаболизм и транспорт железа, но его сайт связывания так же обнаружен в промоторной области гена гемолизина II (Harvie et al., 2005). И, наконец, недавно был описан специфичный транскрипционный регулятор цитотоксина гемолизина II, названый HlyllR (Budarina et al., 2004).

Ген hlylIR , кодирующий белок длиной 201 а.к., в геноме B.cereus находится сразу за геном гемолизина II (hlyll), оба гена являются независимыми транскрипционными единицами. Проведенные ранее эксперименты в гетерологичных системах in vivo показали, что присутствие hlylIR снижает уровень экспрессии гена гемолизина II (Budarina et al., 2004). Добавление белка HlylIR значительно ингибировало транскрипцию с промотора гемолизина II in vitro. Было показано, что HlylIR является специфичным ДНК-связывающим белком, связывающим область длиной 44 п.н. в районе промотора гена hlyll. При этом на промоторно-операторном сегменте гена hlyll HlylIR образует тройной комплекс с РНК-полимеразой и снижает уровень транскрипции гена гемолизина II путем ингибирования изомеризации закрытого промоторного комплекса в открытый (Budarina et al., 2004).

Следует отметить важность работ по выяснению деталей функционирования транскрипционных регуляторов, контролирующих синтез токсинов B.cereus, ведь они закладывают основы нашего понимания логики принятия решений патогенными микроорганизмами, а значит, в перспективе, позволят более эффективно проводить терапию вызванных ими заболеваний.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей работы являлось детальное изучение структуры транскрипционного регулятора HlylIR B.cereus. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

• определение олигомерной формы HlylIR в растворе и в бактериальной клетке, как в свободном состоянии, так и при взаимодействии с оператором;

• получение кристаллов HlylIR и экспериментальное определение его пространственной структуры методом рентгеноструктурного анализа;

• анализ структуры HlylIR и выявление структурно и функционально важных областей с помощью направленного мутагенеза, экспериментальное определение структур мутантов;

• кристаллизация комплекса HlylIR с операторной ДНК.

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.

Научная новизна работы. Впервые определена пространственная структура транскрипционного регулятора, участвующего в контроле синтеза токсинов B.cereus^ установлено, что белок HlylIR в растворе и при взаимодействии с ДНК, in vitro и in vivo существует в виде димера. Впервые получены данные, указывающие на возможное участие стероидных производных в регуляции экспрессии гена гемолизина II, и показана способность мутантного варианта белка TetR-семейства к образованию альтернативного димера.

Координаты атомов транскрипционного регулятора HlylIR и его мутантов, определенные методом рентгеноструктурного анализа, занесены в Protein Data Bank (коды PDB 2FX0, 2JJ7 и 2JK3).

Практическое значение работы. Определение структуры HlylIR создает основу для понимания молекулярной логики регуляции экспрессии гена гемолизина II B.cereus, а точная идентификация низкомолекулярного лиганда, взаимодействующего с HlylIR, может оказаться важной для терапии инфекций и пищевых отравлений, вызванных данным микроорганизмом. Выявление неожиданной способности мутанта HlylIR образовывать альтернативный димер представляет интерес с фундаментальной точки зрения, для углубления нашего понимания деталей белок-белковых взаимодействий и образования четвертичной структуры белка.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ковалевский, Олег Владимирович

выводы

1. Белок HlylIR в растворе и в бактериальной клетке существует в виде гомодимера. Два димера HlylIR взаимодействуют с операторным участком гена гемолизина II независимо.

2. Получены кристаллы HlylIR и методом рентгеноструктурного анализа определена его пространственная структура с разрешением 2,4 Â. Установлено, что HlylIR имеет пространственную укладку, характерную для TetR семейства репрессоров.

3. В структуре HlylIR обнаружен гидрофобный лиганд-связывающий карман объемом 550 Ä3. Компьютерный анализ библиотеки лигандов показал, что HlylIR потенциально способен связывать молекулы массой —400-500 Да, возможно являющиеся стероидными производными.

4. Получены обладающие улучшенными кристаллизационными свойствами мутантные формы HlylIR с заменами в неупорядоченной области с 170 по 185 аминокислотный остаток. Пространственные структуры двух мутантных белков определены методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,1 Â и 2,2 Â. Выявлена способность одного из этих белков к образованию альтернативного димера.

5. Установлена роль сегмента HlylIR с 161 по 169 аминокислотный остаток в поддержании нативной структуры белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалевский, Олег Владимирович, Пущино

1. Agaisse, Н., Gominet, М., Okstad, О. A., Kolsto, А. В., Lereclus, D. (1999) PlcR is а pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol, 32,1043-53.

2. Agata, N., Ohta, M., Mori, M., Isobe, M. (1995) A novel dodecadepsipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett, 129, 17-20.

3. Andreeva, Z. I., Nesterenko, V. F., Yurkov, I. S., Budarina, Z. I., Sineva, E. V., Solonin, A. S. (2006) Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II. Protein Expr Pur if, 47, 186-93.

4. Baida, G., Budarina, Z. I., Kuzmin, N. P., Solonin, A. S. (1999) Complete nucleotide sequence and molecular characterization of hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett, 180, 7-14.

5. Baida, G. E., Kuzmin, N. P. (1995) Cloning and primary structure of a new hemolysin gene from Bacillus cereus. Biochim Biophys Acta, 1264, 151-4.

6. Baida, G. E., Kuzmin, N. P. (1996) Mechanism of action of hemolysin III from Bacillus cereus. Biochim Biophys Acta, 1284, 122-4.

7. Baulard, A. R., Betts, J. C., Engohang-Ndong, J., Quan, S., McAdam, R. A., Brennan, P. J., Locht, C., Besra, G. S. (2000) Activation of the pro-drug ethionamide is regulated in mycobacteria. J Biol Chem, 275, 28326-31.

8. Beecher, D. J., MacMillan, J. D. (1990) A novel bicomponent hemolysin from Bacillus cereus. Lnfect Immun, 58, 2220-7.

9. Beecher, D. J., Macniillan, J. D. (1991) Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect Lmmun, 59, 1778-84.

10. Beecher, D. J., Schoeni, J. L., Wong, A. C. (1995) Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect Immun, 63, 4423-8.

11. Beecher, D. J., Wong, A. C. (1994) Improved purification and characterization of hemolysin BL, a hemolytic dermonecrotic vascular permeability factor from Bacillus cereus. Infect Immun, 62, 980-6.

12. Beecher, D. J., Wong, A. C. (1997) Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus. Hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. J Biol Chem, 272, 233-9.

13. Bernheimer, A. W., Grushoff, P. (1967) Cereolysin: production, purification and partial characterization. J Gen Microbiol, 46, 143-50.

14. Bernheimer, A. W., Grushoff, P. (1967) Extracellular hemolysins of aerobic sporogenic bacilli. J Bacteriol, 93, 1541-3.

15. Bhakdi, S., Bayley, H., Valeva, A., Walev, I., Walker, B., Kchoe, M., Palmer, M. (1996) Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O, and Escherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins. Arch Microbiol, 165, 73-9.

16. Bowman, M. N., Ottolenghi, A. C., Mengel, C. E. (1971) Effects of phospholipase C on human erythrocytes. J. Membr. Biol., 4, 156-164.

17. Bragg, P. D., Hou, C. (1986) Chemical crosslinking of alpha subunits in the F1 adenosine triphosphatase of Escherichia coli. Arch Biochem Biophys, 244, 361-72.

18. Budarina, Z. I., Sinev, M. A., Mayorov, S. G., Tomashevski, A. Y., Shmelev, I. V., Kuzmin, N. P. (1994) Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Arch Microbiol, 161, 252-7.

19. Callegan, M. C., Kane, S. T., Cochran, D. C., Gilmore, M. S., Gominet, M., Lereclus, D. (2003) Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infect Immun, 71,3116-24.

20. Carlson, C. R., Caugant, D. A., Kolsto, A. B. (1994) Genotypic Diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Strains. Appl Environ Microbiol, 60, 1719-1725.

21. Carlson, C. R., Johansen, T., Kolsto, A. B. (1996) The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMSMicrobiol Lett, 141, 163-7.

22. CCP4. (1994) The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 50, 760-3.

23. Coolbaugh, J. C., Williams, R. P. (1978) Production and characterization of two hemolysins of Bacillus cereus. Can J Microbiol, 24, 1289-95.

24. Coy, M., Neilands, J. B. (1991) Structural dynamics and functional domains of the fur protein. Biochemistry, 30, 8201-10.

25. De Silva, R. S., Kovacikova, G., Lin, W., Taylor, R. K., Skorupski, K., Kull, F. J. (2007) Crystal structure of the Vibrio cholerae quorum-sensing regulatory protein IiapR. J Bacteriol, 189,5683-91.

26. Di Lallo, G., Ghelardini, P., Paolozzi, L. (1999) Two-hybrid assay: construction of an Escherichia coli system to quantify homodimerization ability in vivo. Microbiology, 145 ( Pt 6), 1485-90.

27. Drobniewski, F. A. (1993) Bacillus cereus and related species. Clin Microbiol Rev, 6, 324-38.

28. Emsley, P., Cowtan, K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 60, 2126-32.

29. Fagerlund, A., Ween, O., Lund, T., Hardy, S. P., Granum, P. E. (2004) Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus. Microbiology, 150, 2689-97.

30. Fedhila, S., Daou, N., Lereclus, D., Nielsen-LeRoux, C. (2006) Identification of Bacillus cereus internalin and other candidate virulence genes specifically induced during oral infection in insects. Mol Microbiol, 62, 339-55.

31. Fiser, A., Do, R. K., Sali, A. (2000) Modeling of loops in protein structures. Protein Sci, 9, 1753-73.

32. Fossum, K. (1963) Separation of Hemolysin and Egg Yolk Turbidity Factor in Cell-Free Extracts of Bacillus Cereus. Acta Pathol Microbiol Scand, 59, 400-6.

33. Frenois, F., Engohang-Ndong, J., Locht, C„ Baulard, A. R., Villeret, V. (2004) Structure of EthR in a ligand bound conformation reveals therapeutic perspectives against tuberculosis. Mol Cell, 16,301-7.

34. Gominet, M., Slamti, L., Gilois, N., Rose, M., Lereclus, D. (2001) Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcR regulon and for virulence. Mol Microbiol, 40, 963-75.

35. Granum, P.' E. 2002. Bacillus cereus and food poisoning. Applications and systematics of Bacillus and relatives. 37-46.

36. Granum, P. E., Lund, T. (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol Lett, 157,223-8.

37. Grkovic, S., Brown, M. H., Roberts, N. J., Paulsen, I. T., Skurray, R. A. (1998) QacR is a repressor protein that regulates expression of the Staphylococcus aureus multidrug efflux pump QacA. J Biol Chem, 273, 18665-73.

38. Grkovic, S., Brown, M. H., Schumacher, M. A., Brennan, R. G., Skurray, R. A. (2001) The staphylococcal QacR multidrug regulator binds a correctly spaced operator as a pair of dimers. JBacteriol, 183, 7102-9.

39. Grkovic, S., Hardie, K. M., Brown, M. I I., Skurray, R. A. (2003) Interactions of the QacR multidrug-binding protein with structurally diverse ligands: implications for the evolution of the binding pocket. Biochemistry, 42, 15226-36.

40. Gu, R., Li, M., Su, C. C., Long, F., Routh, M. D., Yang, F., McDermott, G., Yu, E. W. (2008) Conformational change of the AcrR regulator reveals a possible mechanism of induction. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 64, 584-8.

41. Gu, R., Su, C. C., Shi, F., Li, M., McDermott, G., Zhang, Q., Yu, E. W. (2007) Crystal structure of the transcriptional regulator CmeR from Campylobacter jejuni. J Mol Biol, 372, 58393.

42. Hantke, K. (2001) Iron and metal regulation in bacteria. Curr Opin Microbiol, 4, 172-7.

43. Harvie, D. R., Vilchez, S., Steggles, J. R., Ellar, D. J. (2005) Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology, 151, 569-77.

44. Hayward, S., Lee, R. A. (2002) Improvements in the analysis of domain motions in proteins from conformational change: DynDom version 1.50. JMol Graph Model, 21, 181-3.

45. Hillen, W., Berens, C. (1994) Mechanisms underlying expression of TnlO encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol, 48, 345-69.

46. Hinrichs, W., Kisker, C., Duvel, M., Muller, A., Tovar, K., Hillen, W., Saenger, W. (1994) Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic resistance. Science, 264, 418-20.

47. Hirata, T., Saito, A., Nishino, K., Tamura, N., Yamaguchi, A. (2004) Effects of effluxitransporter genes on susceptibility of Escherichia coli to tigecycline (GAR-936). Antimicrob Agents Chemother, 48, 2179-84.

48. Holm, L., Sander, C. (1998) Touring protein fold space with Dali/FSSP. Nucleic Acids Res, 26,316-9.

49. Hsueh, Y. H., Somers, E. B., Lereclus, D., Ghelardi, E., Wong, A. C. (2007) Biosurfactant production and surface translocation are regulated by PlcR in Bacillus cereus ATCC 14579 under low-nutrient conditions. Appl Environ Microbiol, 73, 7225-31.

50. Hsueh, Y. H., Somers, E. B., Lereclus, D., Wong, A. C. (2006) Biofilm formation by Bacillus cercus is influenced by PlcR, a pleiotropic regulator. Appl Environ Microbiol, 72, 508992.

51. Hu, J. C., O'Shea, E. K., Kim, P. S., Sauer, R. T. (1990) Sequence requirements for coiled-coils: analysis with lambda repressor-GCN4 leucine zipper fusions. Science, 250, 1400-3.

52. Ikezawa, H., Mori, M., Ohyabu, T., Taguchi, R. (1978) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus. I. Purification and properties. Biochim Biophys Acta, 528, 247-56.

53. Ikezawa, H., Mori, M., Taguchi, R. (1980) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus: hydrolytic and hemolytic actions on erythrocyte membranes. Arch Biochem Biophys, 199, 572-8.

54. Jacob, F., Monod, J. (1964) Biochemical and Genetic Mechanisms of Regulation in the Bacterial Cell. Bull Soc Chim Biol (Paris), 46, 1499-532.

55. Jobling, M. G., Holmes, R. K. (1997) Characterization of hapR, a positive regulator of the Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homologue of the Vibrio harveyi luxR gene. Mol Microbiol, 26, 1023-34.

56. Johnson, C. E., Bonventre, P. F. (1967) Lethal toxin of Bacillus cereus. I. Relationships and nature of toxin, hemolysin, and phospholipase. J Bacteriol, 94, 306-16.

57. Kaneko, M., Yamaguchi, A., Sawai, T. (1985) Energetics of tetracycline efflux system encoded by TnlO in Escherichia coli. FEBSLett, 193, 194-8.

58. Kisker, C., Hinrichs, W., Tovar, K., Hillen, W., Saenger, W. (1995) The complex formed between Tet repressor and tetracycline-Mg2+ reveals mechanism of antibiotic resistance. J Mol Biol, 247, 260-80.

59. Kotiranta, A., Lounatmaa, K., Haapasalo, M. (2000) Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections. Microbes Infect, 2, 189-98.

60. Kovacikova, G., Skorupski, K. (2002) Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol Microbiol, 46, 1135-47.

61. Kramer, J. M., Gilbert, R. J. (1989) Bacillus cereus and other Bacillus species, in Foodborne Bacterial Pathogens, 21-70.

62. Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-5.

63. Laskowski, R. A. (1995) SURFNET: a program for visualizing molecular surfaces, cavities, and intermolecular interactions. JMol Graph, 13, 323-30, 307-8.

64. Laskowski, R. A., MacArthur, M. W„ Moss, D. S., Thornton, J. M. (1993) PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Cryst, 26, 283-291.

65. Lereclus, D., Agaisse, H., Grandvalet, C., Salamitou, S., Gominet, M. (2000) Regulation of toxin and virulence gene transcription in Bacillus thuringiensis. Int J Med Microbiol, 290, 295-9.

66. Levy, S. B., McMurry, L. M., Barbosa, T. M., Burdett, V., Courvalin, P., Hillen, W., Roberts, M. C., Rood, J. I., Taylor, D. E. (1999) Nomenclature for new tetracycline resistance determinants. Antimicrob Agents Chemother, 43, 1523-4.

67. Lewin, B. (2004). Genes VIII. pp. 1056 Pearson Education.

68. Li, M., Gu, R, Su, C. C„ Routh, M. D., Harris, K. C., Jewell, E. S., McDermott, G., Yu, E. W. (2007) Crystal structure of the transcriptional regulator AcrR from Escherichia coli. J Mol Biol, 374, 591-603.

69. Lin, J., Akiba, M., Sahin, O., Zhang, Q. (2005) CmeR functions as a transcriptional repressor for the multidrug efflux pump CmeABC in Campylobacter jejuni. Antimicrob Agents Chemother, 49, 1067-75.

70. Lin, J., Cagliero, C., Guo, B., Barton, Y. W., Maurel, M. C., Payot, S., Zhang, Q. (2005) Bile salts modulate expression of the CmeABC multidrug efflux pump in Campylobacter jejuni. J Bacteriol, 187, 7417-24.

71. Lund, T., De Buyser, M. L., Granum, P. E. (2000) A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Mol Microbiol, 38, 254-61.

72. Lund, T., Granum, P. E. (1999) The 105-kDa protein component of Bacillus cereus non-haemolytic enterotoxin (Nhe) is a metalloprotease with gelatinolytic and collagenolytic activity. FEMS Microbiol Lett, 178, 355-61.

73. Ma, D., Alberti, M., Lynch, C., Nikaido, H., Hearst, J. E. (1996) The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals. Mol Microbiol, 19, 101-12.

74. Manickam, N., Knorr, A., Muldrew, K. L. (2008) Neonatal Meningoencephalitis Caused by Bacillus Cereus. Pediatr Infect Dis J.

75. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. (1998) Overexpression of marA, soxS, or acrAB produces resistance to triclosan in laboratory and clinical strains of Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 166, 305-9.

76. Miles, G., Bayley, II., Cheley, S. (2002) Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore. Protein Sci, 11, 1813-24.

77. Miller, M. B., Skorupski, K., Lenz, D. H., Taylor, R. K., Bassler, B. L. (2002) Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholerae. Cell, 110, 303-14.

78. Morris, G. M., Goodsell, D. S., Halliday, R. S., Huey, R., Hart, W. E., Belcw, R. K., Olson, A. J. (1998) Automated Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and and Empirical Binding Free Energy Function. J. Computational Chemistry, 19, 1639-1662.

79. Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 53, 240-55.

80. Natsume, R., Ohnishi, Y., Senda, T., Horinouchi, S. (2004) Crystal structure of a gamma-butyrolactone autoregulator receptor protein in Streptomyces coelicolor A3(2). JMol Biol, 336, 409-19.

81. Neilands, J. B. (1993) Siderophores. Arch Biochem Biophys, 302, 1-3.

82. Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. (1996) AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. JBacteriol, 178, 306-8.

83. Onaka, H., Nakagawa, T., Horinouchi, S. (1998) Involvement of two A-factor receptor homologues in Streptomyces coelicolor A3(2) in the regulation of secondary metabolism and morphogenesis. Mol Microbiol, 28, 743-53.

84. Orth, P., Schnappinger, D., Hillen, W., Saenger, W., Hinrichs, W. (2000) Structural basis of gene regulation by the tetracycline inducible Tet repressor-operator system. Nat Struct Biol, 7, 215-9.

85. Otto, B. R., Sparrius, M., Wors, D. J., de Graaf, F. K., MacLaren, D. M. (1994) Utilization of haem from the haptoglobin-haemoglobin complex by Bacteroides fragilis. Microb Pathog, 17, 137-47.

86. Otwinowski, Z., Minor, W. (1997). Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode. In: Methods in Enzymology, Vol. 276: Macromolecular Crystallography, part A, pp. 307-326 Academic Press, New York.

87. Painter, J., Merritt, E. A. (2006) Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing TLS motion. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62, 439-50.

88. Perrakis, A., Morris, R., Lamzin, V. S. (1999) Automated protein model building combined with iterative structure refinement. Nat Struct Biol, 6, 458-63.

89. Rajkovic, A., Uyttendaele, M., Ombregt, S. A., Jaaskelainen, E., Salkinoja-Salonen, M., Debevere, J. (2006) Influence of type of food on the kinetics and overall production of Bacillus cereus emetic toxin. J Food Prot, 69, 847-52.

90. Ramos, J. L., Martinez-Bueno, M., Molina-Henares, A. J., Teran, W., Watanabe, K., Zhang, X., Gallegos, M. T., Brennan, R., Tobes, R. (2005) The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev, 69, 326-56.

91. Ratledge, C., Dover, L. G. (2000) Iron metabolism in pathogenic bacteria. Annu Rev Microbiol, 54, 881-941.

92. Reyes, J. E., Bastias, J. M., Gutierrez, M. R., Rodriguez Mde, L. (2007) Prevalence of Bacillus cereus in dried milk products used by Chilean School Feeding Program. Food Microbiol, 24, 1-6.

93. Salah-Bey, K., Thompson, C. J. (1995) Unusual regulatory mechanism for a Streptomyces multidrug resistance gene, ptr, involving three homologous protein-binding sites overlapping the promoter region. Mol Microbiol, 17, 1109-19.

94. Sambrook, J., Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., pp. 2100 CSHL Press, New York.

95. Schumachcr, M. A., Miller, M. C., Grkovic, S., Brown, M. H., Skurray, R. A., Brennan, R. G. (2001) Structural mechanisms of QacR induction and multidrug recognition. Science, 294, 2158-63.

96. Schumacher, M. A., Miller, M. C., Grkovic, S., Brown, M. H., Skurray, R. A., Brennan, R. G. (2002) Structural basis for cooperative DNA binding by two dimers of the multidrug-binding protein QacR. Embo J, 21, 1210-8.

97. Silva, A. J., Pham, K., Benitez, J. A. (2003) Haemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae. Microbiology, 149, 1883-91.

98. Sinev, M. A., Budarina Zh, I., Gavrilenko, I. V., Tomashevskii, A., Kuz'min, N. P. (1993) Evidence of the existence of hemolysin II from Bacillus cereus: cloning the genetic determinant of hemolysin II., Mol Biol (Mosk), 27, 1218-29.

99. Slamti, L., Lereclus, D. (2002) A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group. Embo J, 21, 4550-9.

100. Smith, A., Hooper, N. I., Shipulina, N., Morgan, W. T. (1996) Heme binding by a bacterial repressor protein, the gene product of the ferric uptake regulation (fur) gene of Escherichia coli. J Protein Chem, 15, 575-83.

101. Stojiljkovic, I., Hantke, K. (1995) Functional domains of the Escherichia coli ferric uptake regulator protein (Fur). Mol Gen Genet, 247, 199-205.

102. Suhre, K., Sanejouand, Y. H. (2004) EINemo: a normal mode web server for protein movement analysis and the generation of templates for molecular replacement. Nucleic Acids Res, 32, W610-4.

103. Takahashi, M., Altschmied, L., Hillen, W. (1986) Kinetic and equilibrium characterization of the Tet repressor-tetracycline complex by fluorescence measurements. Evidence for divalent metal ion requirement and energy transfer. JMol Biol, 187, 341-8.

104. Tauch, A., Puhler, A., Kalinowski, J., Thierbach, G. (2000) TetZ, a new tetracycline resistance determinant discovered in gram-positive bacteria, shows high homology to gramnegative regulated efflux systems. Plasmid, 44, 285-91.

105. Terwilliger, T. C. (2000) Maximum-likelihood density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 56, 965-72.

106. Terwilliger, T. C., Berendzen, J. (1999) Automated MAD and MIR structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 55, 849-61.

107. Titball, R. W. (1993) Bacterial phospholipases C. Microbiol Rev, 57, 347-66.

108. Tomita, M., Taguchi, I. R., Ikezava, H. (1991) Sphingomyelinase of Bacillus cereus as a bacterial hemolysin. J. Toxicol.-Toxin Rev., 10, 169-207.

109. Turnbull, P. 1986. Bacillus cereus toxins. Pharmacology of Bacterial Toxins.

110. Vagin, A., Teplyakov, A. (2000) An approach to multi-copy search in molecular replacement. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 56, 1622-4.

111. Vilas-Boas, G. T., Peruca, A. P., Arantes, O. M. (2007) Biology and taxonomy of Bacillus cereus, Bacillus anthracis, and Bacillus thuringiensis. Can J Microbiol, 53, 673-87.

112. Wadsworth, R. I., White, M. F. (2001) Identification and properties of the crenarchaeal single-stranded DNA binding protein from Sulfolobus solfataricus. Nucleic Acids Res, 29, 91420.

113. Winn, M. D., Isupov, M. N., Murshudov, G. N. (2001) Use of TLS parameters to model anisotropic displacements in macromolecular refinement. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 57, 122-33.

114. Zhao, J., Aoki, T. (1992) Nucleotide sequence analysis of the class G tetracycline resistance determinant from Vibrio anguillarum. Microbiol Immunol, 36, 1051-60.

115. Zhu, J., Miller, M. В., Vance, R. E., Dziejman, M., Bassler, B. L., Mekalanos, J. J. (2002) Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc Natl Acad SciUS A, 99, 3129-34.

116. Досон, P., Эллиот, Д., Эллиот, У. (1991) Справочник биохимика. Наука, Москва.

117. Козырев, Д. П., Васинова, Н. А. (2004) Роль железорегулируемых генов в патогенности бактерий. Цитология, 46, 465-73.

118. Мазин, А. В., Кузнеделов, К. Д., Краев, А. С., Холодилов, Н. Г. (1990) Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука, Новосибирск.

119. Миллер, Д. (1976) Эксперименты в молекулярной генетике. Наука, Москва.

120. Остерман, Л. А. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука, Москва.

121. Патрушев, Л. И. (2004) Искусственные генетические системы, (редактор А. И. Мирошников). Наука, М.