Регуляция транскрипции гена гемолизина II Bacillus cereus

Родикова, Екатерина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция транскрипции гена гемолизина II Bacillus cereus
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция транскрипции гена гемолизина II Bacillus cereus"

На правах рукописи

Родикоса Ека терпка Александровна

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА ГЕМОЛИЗИНА II ВасШи* сетей5

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации па сонскапне ученой етепевп капдпдата биологических паук

□ □ЗОБ 1721

Пущине - 2007

003061721

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Солонин Александр Сергеевич

Официальные оппопенты: доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Пущино

Диссертационного совета Д 002.038.01 при Инсшгуте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, Московской области, Институтская ул., д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Озолинь Ольга Николаевна

Институт биофизики клетки РАН, Пущино

кандидат биологических наук

Кошелева Ирина Адольфовна

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г. К. Скрябина РАН, Пущино

Защита диссертации состоится 2007 года в /Г30

часов на заседании

Автореферат разослан «_» ........2007

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

.2007 г.

Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Исследование молекулярных основ патогенности микрооргшшзмов является одной из фундаментальных задач микробиологии и медицины. Среди многообразия веществ, вырабатываемых бактериями для обеспечения проникновения в макроорганизм, преодоления его защитных систем и развития инфекционного процесса, особое место занимают токсины, которые для многих бактерий являются основными факторами патогенности. Известно, что патогенные свойства того или иного микроорганизма в значительной мере определяются как спектром его структурных генов, кодирующих факторы патогенности, так и механизмами, обеспечивающими регуляцию экспрессии этих генов. Выяснение механизмов регуляции сопряжено с изучепием белок-белкового и ДНК-белкового взаимодействий и представляется одним из наиболее актуальных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов.

Для проведения исследований в данном направлении интересными объектами являются представители бацилл цереусной группы. Бактерии этой группы широко распространены в природе и имеют ярко выраженное филогенетическое родство, морфологическое и физиолого-биохимическое сходство на фоне широкого диапазона их патогенных свойств. В.сегеш, занимая по патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бацилл и продуцируя широкий спектр гемолизинов, может служить удобной моделью для изучения этих токсинов.

Еще одной причиной, которая побуждает к активному изучению регуляции экспрессии токсинов, вырабатываемых В. сегеиз и его ближайшими родственниками В. ¡Ииг^геюгз и В.ашНгаск, является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. В.сггеш -один из основных бактериальных загрязнителей производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. В. 1кигт§1еп515, широкомасштабно используемый в качестве инсектицидных препаратов, неконтролируемо выбрасывается в окружающую среду. В. апхЬтасгх печально известен как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву. Поэтому изучение регуляции отдельных токсинов, продуцируемых данными бактериями, для определения степени их безопасности для животных и человека является актуальной задачей.

Хорошо известно, что В. сегеиз производит ряд внеклеточных токсинов, обладающих гемолитической активностью и рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности (ТигпЬи11, 1986; Drobшewski, 1993). Гемолпзин II принадлежит к семейству р-складчатых пороформируюпшх токсинов (РРТ), имеет высокую степень гомологии (31,2%

идентичности) с а токсином Staphylococcus aureus и вноснт значительный вклад в суммарную гемолитическую активность штаммов В. cereus и В. thuringiensis.

Несмотря на то, что гемолитические токсины В. cereus активно изучаются, на сегодняшний день весьма мало известно об их генетической регуляции, также как и о регуляции других факторов вирулентности этого микроорганизма. Подробно описан лишь один плейотропный регулятор, PlcR, который является активатором генов фосфолипаз, негемолнтического и гемолитического энтеротоксинов, а также некоторых других генов В. cereus и В. thuringiensis (Lereclus et al., 1996; Agaisse, 1999, Ivanova et al., 2003). Было показано влияние еще одного гена, flhA, на продукцию фосфолипаз, гемолизина BL и ряда других внеклеточных факторов вирулентности у штаммов В. cereus и В. thuringiensis (Ghelardi et al., 1999). Но в данном случае это влияние сводится к регуляции экспорта белков из клетки, а не затрагивает их синтез. Сравнительно недавно был описан еще один плейотропный транскрипционный регулятор Fur (ferric uptake repressor), регулирующий как процессы усвоения и накопления железа бактериальной клеткой, так и биосинтез некоторых факторов патогенносш (Нагvie et al., 2005). Между тем вопрос о регуляции экспрессии генов токсинов неразрывно связан с вопросом регуляции патогенных свойств и весьма актуален. Такие исследования заслуживают самого серьезного внимания, поскольку их результаты являются необходимым первоначальным этапом, закладывающим основу для дальнейшего выяснения сложных механизмов координированной регуляции генов, обеспечивающих патогенпостъ микроорганизмов цереусной группы.

Целя и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось исследование регуляции транскрипции гена гемолизина И В. cereus. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

- исследовать организацию регуляторной области гена гемолизина II;

- исследовать участие белка HlyllR в регуляции экспрессии гена hlyll;

- изучить особенности узнавания и взаимодействия HlyllR с операторами гена hlyll;

- исследовать участие глобального регулятора Fur в транскрипции гена hlyll.

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина РАН.

Научная новизна работы. Впервые получены данные о регуляции экспрессии потенциального фактора патогенносги В. cereus - гемолизина II. Показано, что в промоторно-операгорнон области гена hlyll расположено два операторных участка - сайты связывания двух регуляторных белков HlyllR и Fur.

Продемонстрировано, что белок HlylIR негативно регулирует транскрипцию гена гемолизина И В. cereus, препятствуя образованию открытого промоторного комплекса. Установлено, что в промоторно-операторной области гена hlyll расположено три потенциальных перекрывающихся сайта связывания HlylIR, с которыми одновременно взаимодействует только два димера регуляторного белка. Показано, что в отличие от ряда ДНК-связываощих белков HlylIR не способен вносить значительных конформационных изменений в ДНК сайта мишени. Показано негативное влияние на транскрипцию гена гемолизина II B.cereus глобального транскрипционного регулятора Fur.

Практическое значение работы. Исследование регуляции экспрессии бактериальпых токсинов не только представляет несомненный научный интерес, но и важно в практическом плане, как создание основы для осуществления направленного контроля процесса патогенеза. Знания о регуляции экспрессии генов, кодирующих токсины, может быть использовано при создании принципиально новых терапевтических и профилактических подходов, а также новых лекарственных препаратов, что позволит отказаться от традиционной терапии антибиотиками. Полученные данные по исследованию молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов гемолизинов В. cereus могут использоваться в дальнейших исследованиях по разработке методов направленной регуляции патогенеза у В. anthracis, как наиболее близкого микроорганизма к В. cereus. Кроме того, данные исследования важны ц для сельского хозяйства, в котором применяется ряд микроорганизмов, содержащих потенциальные факторы патогенности (В. ihuringiensis').

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано две статьи. Результаты работы представлены па третьем международном семинаре "The Molecular Biology of Bacillus cereus, B.anthracis and B.thuringiensis" (Nice, France, 2003), на международных конференциях: "IUBMB/SASBMB Special Meeting on The Biochemical & Molecular Basis of Disease" (Cape Town, SAR, 2001), Gordon Research Conference (Andover, USA, 2004), на 6-ой (2002) и 10-ой (2006) Международной Путинской школе-конференции молодых ученых. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на rfS страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает^Л/ источников. Работа содержит J?9 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1, Структура регуляторпой области гена гемолизина И.

Нуклеотидпая последовательность фрагмента ДНК хромосомы В. сегеш УКМ-В771, содержащего гены гемолизина II и его регулятора была определена ранее (Ва1(1а а!., 1999).

Eco И _

SMITCTATAA1 I 11 I I I СТА I М I I I ТАААСААбААТТТТАААТАТАТ^дГТААААТТ • 1Ú Sspl l'ur-оохг

60 jnTGTTT^TeGmTTCT§ÍS^^

120 GATGGAAATTAGCAAATCAAGTGTTGATAGTTATTGGCATAAAGATTAATAAATTTCTAC 180 ATTGTAACGTTАТАААТСТATCTCTA6TATTGAGAGCTAAAAATAATACGTTTATATCTT SD M К К Structural part of hfyll gene

240 TTAAATGTTTAAGAAGGAGTGGCTGTCTGTATGAAAAAA...........

411 К I stop hfyll

1500 AAAATCTAATCAGTAAATAAGGTACAATTGATGGATAATTATTTCATCAAAATATGAGTA 1560 TAAAGGTTTATTTTAAATCTGTATAACGTAATGAAAGGACCAGATAAACTCTGGTCCTTA 1620 TTAI I I 1 1 1GT 1CATTCI I I IACTCAAGTAGAAAAGAGCGTAAAATATTTGAAAGCTATT 1680 CATGTCACGCAGGGGGATAI I I I I I 1 AAGCATGGCGTTTAATTAGGAAAGGAfiAGATTGA 1740 AGAGCTGTCTCI I I I 1GAGGCGTACGTTGTGTGGCGAATTGTTTAAAGTAATGAAGACCT

-35 -10

1800 ^TCGGff^AAGTTACTACTTTAAATATAff^TTAAATTTcATTAAAAAGAAACTCTA -35 -10 M

i860 ttcaaattccttattcsái1111 gaaotgamtatatattatttgaggtGtgtgaaatgg

Structural part of hfyllR gene 1s2 wmpedlvs dkpni

2460 GGATGCCAGAAGATTTGGTGAGC........................................ATAAGCCTAATATAT

202 stop hfyrlReg

2520 GAATTGCTCAGTGTTTATGAATCCTAATTTTCCTATTAAAAAGCCTAATTTCTCAATGTA 2880 GATATATCI I' I И CAAATTGAATTC 2904

ECOKL

Phc. 1. Нуклеотндпая последовательность £а>Ш-фрагмента длиной 2,9 т.п.и., несущего гены hlyll и hlyüReg. Стрелками обозначен инвертированный повтор, сплошной линией выделен «псевдооперагор». Fur-бокс отмечен пунктиром. Определенные экспериментально точки начала транскрипции выделены крупными буквами, соответствующие промоторные боксы - серым цветом. Использованные в работе сайты эндонуклеаз рестрикции отмечены двойным подчеркиванием.

Методом удлинения праймера выявлен единственный продукт реакции элонгации, которому соответствует транскрипт, начинающийся на расстоянии 174 основания перед инициирующим кодоном АТС гена гемолизина II (Рис. 1 и 2), что позволило определить точку начала транскрипции гена гемолизина II.

Стартовой точке транскрипции предшествует протяженный промоторный -10-6оке ОТСГПТААТ (Рис. 1), последовательность которого хорошо согласуется с консенсусной последовательностью (Оаа1 & а1., 2001). Выявлено отсутствие -35-элемента промоторной области, который, как показано (Вате ^ а!., 1997), не требуется для активности промоторов данного класса.

Рис, 2. Определение стартовой точки транскрипции методом удлинения нряймера. Использовали тотальную РНК из плеток Е. coli с ллазмидой, содержащей штактиый ген hlyll, и из В. cereus VKM-B771. В качестве праймера использован олигонуклеотид, комплементарный последовательности начала hlyll. Продукты реакши разделяли в 6% денатурирующем ПААГ и визуализировали с помощью радноавто график. Слева обозначены выявленная точка начала транскрипции и премоторный -Ю бокс.

В экспериментах с использованием РНК, выделенной да клеток, несущих плазмцду pASspI с делецпей (£coRI-5spl) в промоторно-операторной области гена гемолизина |[ {Рис. 1) продукта реакции, как и ожидалось, не детектируется, поскольку в данной конструкции отсутствует протяженный -10 яромоторный элемент (Рис. ЗА, дорожка 3), Клетки, несущие апазмиду pASspJ, не проявляют гемолитической активности.

Перед геном hlyll (Рис. 1.) на расстоянии 25 п,н, от стартовой точки транскришши обнаружен совершенный шгеертяровашшй повтор длиной 44 п,н. Такие структуры перед промоторньщи областями генов, как правило, являются участками взаимодействия с регуляторными ДНК-связывающими белками. В экспериментах по задержке в геле и по защите ДНК от расщепления ДНКазоЙ I (материалы представлены ниже) показано, что данный повтор является сайтом связывания с регуляторныя белком HlyUR. Данный инвертированный повтор с единичными нуклеотидными заменами был выявлен практически во всех содержащих ген гемолизина II штаммах микроорганизмов цереусной группы, для которых был выполнен геномный сяквено. Очевидно, данная структура оператора является эволюционно стабильной и играет важную биологическую роль.

Анализ нуклеотидной последовательности промоторно-операторной области гена гемолизина II (Рис, I) выявил потенциальный участок узнавания для транскрипционного фактора Fur (ferric uptake regulator). Обнаруженная перед геном Myll последовательность практически идентична (за исключением единственного нуклеотида) консенсусной последовательности Fur-бокса B.subtilis (Fuangthong and Helmann, 2003). Данный Fur-бокс присутствует во всех проанализированных ыггаимах башглл и перекрывается со стартовой точкой транскрипции гена hlyll (Рис. 1). Вероятно, белок Fur конкурирует с РЙК-полнмеразой за участок связывания

Таким образом, в пром о горно-операторной области гена гемолизина I! выявлен ряд регуляторных элсмен'гов. Определен промотор гена hlyll, относящийся к классу промоторов с протяженной -10 областью. Обнаружены два потенциальных операторных участка - сайты связывание регудаторных бепкоа - HMIR я Fur. Роль этих участков в регудкции гена htylt было детально исследована в дальнейших экспериментах. 2. HlyHR негативно регулирует тр а искри пин ю гена гемолизина II,

Анализ аминокислотной последовательности HlyliR показал, что N-кощевая часть белка имеет значительную гомологию с бактериальными репрессорами, принадлежащими к TetR-семейству транскрипционных регуляторов, в то время как С-хониевая часть более дивергентна.

Для того чтобы показать, что HVyllR действует на транскрипционном уровне, &ыла

повторена реакция удлинения прайм ера в присутствии и отсутствии этого белка (Рис. ЗА).

Как видно из рисунка (сравните дорожки 1 и 2), количество продукта реакции в клетках,

несущих ген гемолизина И и его регулятора (hlyliR), существенно ниже, чем в клетках.

Рис. 3. Влияние белка IJIyilft на транскрипцию генв гемолизина П. А.

Реакция удлинения праймера. Использовали тотальную РНК, выделенную из клеток Е. сoil с планидой, содержащей гены hlyll и hlyllK (1), клеток, содержащих только hlyll (2), и клеток, аесуших плазмиду pASspI с делецией (fcaRI-iltpi) промсторно-операторной области гена гемолизина Q {Рис. 1) (3). В качестве гтраймера использован олигонухлеотид,

комплементарный последовательности начала гена hlyll, Б. Икгибирование транскрипции гена гемолизина II in vitro. В качестве матриц использовали: фрагмент ДНК, содержащий нативный промотор (1-3) и мутантный вариант промотора (hfylIA -, деления 55 нуклеотилов в дисгальной части инвертированного повтора от EcoRl сайта, Рнс.1) (4-6). Звездочкой обозначен белок, добавленный в реакцию первым. Продукты реакции разделены в 7% ПААГ и идентифицированы с помощью радиоввто графии.

Методом однократной инициации транскрипции ¿и vitro определено влияние рекамбинантного белка HlyliR на транскрипцию с промотора гена гемолизина II. Добавление в реакционную смесь HlyliR привода к полному блокированию транскрипции с данного промотора как при использовании а70 хо л о фермента РНК-полимер азы Е. coli так и и

содержащих только hlyll, А

"Т2Э

ж t}tyti hi/Нл

l'llkll t . t. + t

Н1,ИП ■ *' + • +' *

innllï —

? ft*

1 S Э * S 6

er* холофермента РНК-полимеразы В. cereus. Активность последней была значительно ниже активности фермента Е. coli. Поэтому в дальнейших экспериментах использовался о70 холофермент РНК-полимеразы Е. coli. Очередность добавления белков на ингабирование не влияет (Рис. ЗБ, дорожки1-3). При использовании в качестве матрицы ДНК-фрагмента с делецией в инвертированном повторе (hlyllà - делегировано 55 п.н от EcoRI-сайта) отмечается лишь незначительное влияние HlylIR на транскрипцию (Рис. ЗБ, дорожки 4-6). Таким образом, было показано, что HlylIR действует как ингибитор транскрипции in vitro, и степень ингибирования, по-видимому, зависит от наличия полного сайта связывания белка HlylIR - 22 п.н. инвертированного повтора.

Ингабирование транскрипции белком регулятором наблюдается также в случае использования о565 холофермента РНК-полимеразы, полученного из корового фермента РНК-полимеразы и мутантной субъединицы о70, в которой отсутствует С-терминальная консервативная область 4.2. (Minakhin et al., 2003). Полученные результаты подтверждают, что промотор гена hfyll принадлежит к классу протяженных - 10 промоторов (поскольку область 4.2 в о70 взаимодействует с - 35 консенсусным элементом промотора и не является необходимой для транскрипции с промоторов с протяженным -10 консенсусным элементом) и подтверждает, что область 42 в а70 не является мишенью для ингибирования HlylIR.

Ингибирующий эффект HlylIR, возможно, является следствием стерического препятствия посадке РНК-полимеразы или инактивации комплексов РНК-полимераза-й^Я промотор. Эксперименты по задержке в геле в присутствии HlylIR и РНК-полимеразы выявили наличие комплекса с меньшей электрофоретической подвижностью, чем подвижность комплекса HlylIR- ДНК или открытого комплекса РНК-полимеразы (Рис. 4, дорожки 3 и 4). Образование тройного комплекса отмечается вне зависимости от очередности добавления белка HlylIR и РНК-полимеразы. Данные результаты указывают на существование тройного комплекса, образованного фрагментом ДНК, содержащим промоторно-операторную область гена гемолизина И, РНК-полнмеразой и HlylIR. Ингибирование транскрипции белком HlylIR, по-видимому, не является результатом стерического препятствия связыванию РНК-полимеразы с промотором, поскольку в этом случае было бы невозможно образование тройного комплекса.

При изменении порядка добавления белков наблюдаются некоторые отличия в формировании ДНК-белковых комплексов. В случае, когда РНК-полимераза добавляется к уже сформированному комплексу HlyIIR-ДИК, последний переходил в тройной комплекс не полностью (Рис. 4, дорожка 3), тогда как при добавлении HlylIR к комплексу РНК-полимераза-ДНК происходит образование только тройного комплекса (Рис. 4, дорожка 4).

Данный факт, вероятно, свидетельствует о том, что HlyllR понижает аффинность Р11К-попнмеразы к промоторно-опсраторной ДНК.

Рис. 4. Комплексообрязоишяе Н1у)Ш и РНК-нол нмеризь] с прОМоторно-

_рнкп-шуди-днк операторной областью гена Idyll. у-Р

меченный НЦР-фрагмснт ДНК длиной 400 п.н, содержащий промоторно-операторную область гена ЫуП инкубировали с белком HlyllR. о'" холоферментом РНК-полнмерачы В.соИ. Продукты реакции разделяли в 7%

_днк ПААГ. Эксперименты выполняли в

присутствии гепарина (конкурент ДНК). Звездочкой обозначен белок, добавляемый в реакцию первым.

Представленные выше результаты позволили предположить, что HlyllR способен взаимодействовать с холоферментом РНК-полимеразы, по крайней мере, в составе тройного комплекса. Выло показано, что в отсутствии ДНК HlyllR способен взаимодействовать как с холо-, так и с кофермектом РНК-полимеразы Е. coli. Субьелинииа а, вероятно, не при!тмает участие 0 этом взаимодействии. Денатурирующий электрофорез образовавшихся комплексов подтвердил наличие ъ них йу&ьединия РНК-полимеразы и HtyllR

ДНК-белковые комплексы, формируемые РНК-полимеразой в присутствии и отсутствии HlyllR, были изучены методом, основанным на защите ДИК от ДНКазы 1. Результаты тестирования топологии контактов РНК-полимеразы и HlyllR с фрагментом ДНК, содержащим промоторно-операторную область гена гемолизина Н, представлены на рисунке 5. Участки взаимодействия с ДНК белков HlyllR и РНК-полимеразы не перекрываются: белок HlyllR защищает от нуклеазной атаки фосфоднафирные связи на участке От -17 до -60 нуклеотадов (Рис. 5, дорожка 3), в то время как РНК-полимераза - от +20 до -13 (Рис. 5, дорожка 4). Взаимодействие с РНК-полимеразой приводит к появлению на ДНК пяти гиперчувствительных к ДНКазе 1 сайтов (в позициях -24, -34, -44, -54, -64), что, вероятно, является следствием «наматывания» АТ-богатых участков ДНК на РНК-полимеразу (Bums et al., 1999). В присутствии HlyllR и РНК-полимеразы область ДНК между позициями +20 и -13 полностью защищена вне зависимости от очередности добавления белков (Рис. 5). Добавление белка HlyllR понижает степень гипер'чувствительности ДНК к ДНКазе ! в присутствии РНК-пол имеразы. Кроме того, наличие РНК-полимеразы заметно понижает степень запиты области ДНК. экранируемой регуляторным белком. Ряд количественных отличий между профилями защиты ДНК в присутствии HlyllR и РНК-полимеразы и одной РНК-полимеразы (Рис. 5) подтверждает

РНКП ■ + + +* -

HlyllR + -+*+-

РККП-ДНК „ —1 HlyIIR-ДИК _

рнкп А

Hiyim

tttt

- • - а

Рис. 5. Локализация участков взанмол'йггяия Н!у11И м РНК-пол и иеразы с промоторно-операториой областью гена МуП (футпрнитимг ДНКазой I). у-Р'*3 меченный ПЦР-фрагмент ДНК (400 п.н.), содержащий промоторно-операторную облаем гена /;/>'//. инкубировали с белком Й1уИК и РНК-пол нмеразой и обрабатывали ДНКатой I Продукты реакции разделяли в 7% денатурирующем ПААГ и визуализировали с помощью радиоавтографии. Стрелками обозначены участки пшерчувствительности Звездочкой обозначен белок, добавляемый в реакцию пер вы м.

1 2 3 4 5 6

образование тройного комплекса. Таким образом, результаты экспериментов по задержке в геле (Рис. 4) и ДН Кат нота фушриктинга (Рис. 5) продемонстрировали, что на промоторно-операторной област и гена МуП может образовываться комплекс, содержащий Н1уМК и РНК-полимер азу Контакты е ДНК, образуемые Н1у1Щ и Р! 1К-полимеразой в тройном комплексе, отличаются от контактов, образуемых каждым из этих белков с ДНК в отдельности.

PHKI 1 - - + + +* А G

HlyllR - + " +* +

—30 20

—ю

- + 1

+10

-+20

1 2 3 4 5 6

Рис. 6. Образование открытого комплекса РНК-пел нмеразой в присутствии Н1у11Н (пермемга н ятн ы и футпринт). у-Р'-' меченный ПЦР фрагмент ДНК (400 п.н.), содержащий пром отор но -о п е р нторну ю область гена МуП инкубировали с белком Н1у11К и РНК-пол нмеразой, обрабатывали КМ11О4. После переосаждения ДНК обрабатывали пиперидином. Продукты реакции разделяли в 7% денатурирующем ПААГ и визуализировали с помощью ралиоавтографии. Звездочкой обозначен белок добавляемый в реакцию первым.

Методом определения чувствительности тимипов, расположенных в одно цепочечной

ДНК, к окислению герм анган атом калия показано, что добавление РНК-пол и мер азы к ДНК

промоторно-операторной области гена МуН приводит к появлению чувствительных к KMnOj

тиминов в позициях +3, -1, -2, -5 and -12 (Рис. б). Добавление в реакционную смесь белка

fllylJR приводит к заметному понижению степени чувствительности этих тиминов. Данные

результаты свидетельствуют, что I llyllR препятствует образованию каталитически активного

открытого комплекса РНК-пол и меразы е промотором гена hfyll.

Белок Н1у1Ш. принадлежит к семейству тетрациклиновых регуляторов. Характерной чертой представителей данного семейства является связывание с палиндромной последовательностью ДНК. Операторный участок ШуНИ. представляет собой совершенный инвертированный повтор длиной 44 п. н. (Рис. 7). Внутри этого инвертированного повтора можно вычленить четыре прямых повтора, каждая пара из которых, в свою очередь, является вырожденным инвертированным повтором.

-1 лгу» -1 пгуня

-Ю +1

I алм»

Рис. 7. Структура иромоторно-оиераторной области гена гемолизина II. Жирными стрелкам обозначен инвертированный повтор. Субповторы выделены серыми боксами. Внизу приведены варианты используемых субстратов (олигонуклеотиды 0_1ш1С и О юр).

ДНК-связывающая активность белка Н1у11К была исследована методом задержки в геле с использованием различных ДНК-субстратов. (Рис. 8). О способности белка связываться с фрагментом ДНК судили по снижению элекгрофоретической подвижности данного фрагмента в результате образования комплекса ДНК-белок. При использовании в качестве субстрата 132 п.н. ПЦР-фрагмента, содержащего промоторно-операторную область гена гемолизина II (Рис.1) отмечается одновременное появление двух различных ДНК-белковых комплексов (Рис. 8А).

Щугт-днЦ.... '.

ДНК-ь — — — —

[ Рл\о,4 0,з|1,7[б^1 2б| 104]417|

Н1у11Я-ДНК-■

днк-

0,2 | 0,4| 0,9| 3,51 7,0| 141

Рис. 8. Взаимодействие Н1у1Ш с нативным оператором (А) и синтетическим олигонуклеотидом 0_Ьа1Г (Б). Фиксированное количество ДНК-субсграта титровали различными концентрациями белка Н1уШ1. В качестве конкурентной ДНК использовали тотальную ДНК из эритроцитов цыпленка. Цифрами снизу обозначено молярное соотношение белок-ДНК. Справа стрелками обозначены позиции ДНК маркеров.

Их образование регистрируется даже при очень низком молярном соотношении белок -ДНК. Увеличение концентрации белка приводит к изменению соотношения интенсивностей полос вплоть до полного исчезновения полосы с большей электрофоретической подвижностью. Дальнейшее изменение подвижности в геле, по-видимому, обусловлено неспецифическим взаимодействием Н1у1Ж с ДНК.

Наличие двух различных ДНК-белковых комплексов свидетельствует, по-видимому, о взаимодействии с природным операторным участком более чем одной молекулы Н1у1П1. Данное предположение было подтверждено методом флуоресцентной анизотропии (Рис.9). Установлено, что с фрагментом ДНК, содержащим полный инвертированный повтор, связывается четыре молекулы Н1у11Я. Как показано ранее, белок Н1у11Я взаимодействует с ДНК только в виде димера (К.0Уа1еУ51ау, 2007). Таким образом, очевидно, что с полным оператором гена гемолизина II взаимодействуют два димера регуляторного белка. Характер кривой титрования не позволяет говорить о кооперативном взаимодействии молекул ШуНЯ при образовании ДНК-белковых комплексов, что согласуется с данными экспериментов по задержке в геле.

I 0.18 /

| 0.16 /

* / I 0.14- /

0.12- /

0.10- /

0.06- £ >

0.06-

О 2 4 б в 10 12

Н1у11Ядим9р{нМ)

Наличие 4 субповторов в операторной области (Рис. 7) позволило предположить, что в пределах полного операторного участка находится несколько сайтов связывания регуляторного белка. Методом задержки в геле проанализировано взаимодействие Н1у11Я с двумя синтетическими олигонуклеотидами: центральной частью инвертированного повтора 0_Юр и его половиной 0-Ьа1Г (Рис. 8 Б). ШуПК специфически связывается с обоими ДНК-субстратами. Следовательно, и половина инвертированного повтора, и его центральная часть содержат сайт связывания регуляторного белка. В обоих случаях фиксируется образование только одного комплекса белок-ДНК при любом молярном соотношении. Это позволяет предположить, что с данными субстратами взаимодействует только один димер Н1у1Ш..

Значение констант диссоциации для комплексов Н1у1111-ПЦР фрагмент и НКНЯ-0_Ьа1£ определенных с помощью графика Скетчарда, (4.4±1.7х10"' М и 8.3±3.0х10"9 М соответственно) позволяет говорить о довольно сильном взаимодействии. Изменение ионной

Рис. 9. Флуоресцентная анизотропия. 2,5

нМ флуоресцентномеченого 132 п.н. ДНК фрагмента титровали увеличивающимся количеством регуляторного белка Н1у11Я.

силы (50мМ - 500мМ КаС1) и рН раствора (от 6.8 до 8.5) не оказывают значительного влияния на связывание Н1уЖ с субстратом. Образующийся комплекс является очень стабильным, поскольку выдерживает повышение концентрации мочевины до 2 М.

220 240 260 280 300 320

220 240 280 2вО 300 320

длина волны (им)

длина волны (нм)

Рис. 10. Спектры кругового дихроизма. В левой части приведены спектры субстрата и регуляторного белка, в правой - комплексов HlyIIR-ДНК. ПЦР-фрагмент длиной 132 п.н., содержащий промоторно-операторную область гена гемолизина II, титровали увеличивающимся количеством белка.

Ранее для ряда ДНК-связывающих белков, например, TetR-penpeccopa (Altschmied et al., 1984) было показано, что они способны вносить конформационные изменения в ДНК. О существовании таких изменений судят по увеличению сигнала спектра кругового дихроизма - Де (длина волны более 250 нм) вследствие комплексообразования. Белок HlyllR не способен вносить значительных конформационных изменений в ДНК сайта-мишени (Рис.

3. Структура промоторно-операторной области гена ЫуПЯ.

Реакция удлинения праймера, выполненная с использованием РНК, выделенной из клеток Е.соИ, содержащих плазмиду с геном Ыу1Ш выявила две точки начала транскрипции гена регулятора. Этим точкам предшествуют -10 и -35 промоторные боксы. Таким образом, идентифицировано два потенциальных промотора гена МуПК (Рис. 1).

Перед геном регулятора гемолизина II был обнаружен участок ДНК, имеющий высокую степень гомологии (4 нуклеотидные замены) с центральной частью инвертированного повтора - синтетическим олигонуклеотидом 0_Юр (Рис.7, 11). Проверено взаимодействие ШуПК с данным участком ДНК. Результаты экспериментов по задержке в геле с использованием синтетического олигонуклеотида показали, что регуляторный белок ШуПК взаимодействует с данным участком ДНК приблизительно в 8 раз менее эффективно по сравнению с оператором гена гемолизина II. Дальнейшие эксперименты были направлены на определение роли каждой из 4-х нуклеотидных замен (Рис. 11). Показано, что замены

10).

нуклеотидов Т, С и Т не оказывают влияния на связывание с Н1у1111. Как видно из рисунка 11, в пределах этой последовательности можно вычленить 2 бокса - ТТТААА (4 по двум цепям соответственно).

оператор Ь1у11 (о_^ор) 5'- СААТТТТАААТАТ*АТАТТТААЛАТТС +++

3' - СТТААААТТТАТА*ТАТАААТТ ТТААЯ

промотор-оператор Ыу11Е1 5' -ТАСТАСТТТАААТАТ*АТААТТАААТТТСАТ - +

3' -АТСАТСАААТТТАТА*ТАТТААТТТАААСТА

мутантный олигонуклеотид 5'- СААТТТТААТТАТ*АТААТТААААТТС

3' - СТТААААТТААТА*ТАТТААТТТТААО

мутантный олигонуклеотид 5' - СААТТТТАААТСС*ССАТТТААААТТС +++

3'- СТТААААТТТАСС5*ССлГАААТТТТААС

Рис. 11. Последовательность синтетических олигонуклеотпдов, используемых в экспериментах по задержке в геле. Серым цветом выделены последовательности ДНК, необходимые для связывания с ШуПЯ, красным цветом выделены нуклеотидные замены.

Замена нуклеотида А, нарушающая один из этих боксов, значительно понижает аффинность регуляторного белка к данной последовательности ДНК. Нарушение второго бокса (дополнительная замена Т) (Рис. 11) приводит к полному блокированию связывания ШуШ*. с мутантным олигонуклеотидом. При использовании синтетических субстратов с заменами 4-х центральных нуклеотидов показано, что данные замены не влияют на эффективность связывания, что подтверждается наличием подобных замен в последовательностях оператора в ряде штаммов. Наличие двух мотивов ТТТААА, по всей видимости, является необходимым для взаимодействия с Н1у1Ж.

# и-, Л V'

Л; у^

<-*'- С.г" \

,. л С - •■• !'■■ .\ I,).

г!-Ч с>Х1

Рис. 12. Модель взаимодействия белка Н1уШ1 с операторным участком гена гемолизина II. Три потенциальных сайта связывания выделены на ДНК.

Полученные результаты указывают на то, что в операторе гена гемолизина II расположено три потенциальных перекрывающихся сайта связывания IllylIR. Поскольку ланные флуоресцентной анизотропии показали, что с тативкым оператором взаимодействуют только 2 димера HlylIR, мы предположили, что регуляторный белок связывается с двумя крайними сайтами (Рис 12).

4, Fur негативно регулирует транскрипцию гена гемолизина II in vitro.

Вторая часть наших исследований была направлена на исследование влияния на экспрессию гена гемолизина II другого регулятора - белка Fur. Для получения продуцента белка была сконструирована рекомбинантная плазм ид a pFur6His, кодирующая белок Fur с 6 дополнительными гистидиновыми остатками на С-конце. ОРС гена fur была амплифшшрована с хромосомы В. cereus ATCC-14S79. клонирована в экспресс л онном векторе рЕТ29Ь(+) и экспрессирована в штамме Е. coli BL21 (DE3). Рекомбинантный белок FuröHis был очищен из клеточного экстракта с помощью хроматографии на Ni-îs! [ А-агарозе

Рис. 13. Анализ фракций после элюции с Ni-NTA-агарозы в 7% денатурирующем ПЛАГ. Стрелками в левой части обозначены белковые маркеры с молекулярными массами 94.6, 66.2, 45.0, 31.0, 21.5, 14,4 кДа соответственно. (Очистка белка проведена С.Г. Майоровым).

I Полученный белковый препарат При электрофоретнчсском разделении визуализируется в

виде двух полос (Рис. 13). Препарат белка после ионообменной хроматографии на MonoQ (градиент NaCl - 0 > 0.7М) и хроматографии гидрофобных взаимодействий на PhenylSepharose CL-4B (градиент (NH4);S04 - 2.ОМ > 0) также визуализируется на электрофорезе в виде двух полос.

1 MALDI-TOF анализ материала, входяшего в состав каждой из этих полос, показал, что

они содержат только белок Fur-6His В. cereus. Существование бациллярного белка Fur в виде двух форм было отмечено ранее. Показано, что N-концевая часть обоих белков идентична (Flarvie at al., 2005; Bsad and Helman. 1999). Вопрос о происхождении этих форм на сегодняшний день остается ые решенным. Однако, наличие 2-х форм Fur, по-видимому7, не связана с модификацией С концевого участка, как было предположено ранее (Harvie at aLt

(Градиент имидозола - 0 > 0,5M).

Градиент имидазола

зда м

-»

211.

_ Fur 1-й His " 1 :i-6H:-

2005; Bsad and Helman, 1999). В дальнейших экспериментах использовался суммарный препарат белка.

В экспериментах по задержке в геле показано, что белок Fur специфически связывается с фрагментом ДНК, содержащим промоторно-операторную область гена hfyll, с образованием трех разных ДНК-белковых комплексов (Рис. 14). Анализ взаимодействия Fur с ДНК в присутствия другого регуляторного белха - HlylIR показал, что белки связызаются с ДНК независимо, при этом регистрируется образование тройного комплекса (Рис.14, дорспоса 9). Участок узиаеания Fur в регулятсрнсй области гена hfyll перекрывается со стартовой точкой транскрипции (Рис. 1), что позволяет предположат, конкуренцию ретудятсрисго белка с РНК-полпмеразой зз участок связывания.

Кенпептгазяя For

HlyltR * + - 4

Fur - - + +

HlyUR-ДИК

-H'yHR-AHK-Fur

-ну^-днк

еспецифическзя ДНК

Fur-ДНК

дн:<

12 3 4 5

6 7 8 9

Рис. 14. Взаимодействие Fur с операторной областью гена гемолизина II. В качестве субстрата использовали у-АТФ (Р32) 400 п.н. фрагмент ДНК, содержаний прсмоторпо-операторпую область гена klyll. Дорожки 1,6 -контроль, 2-5 - добавлено 0.125, 0.25, 0.5, 1 мкг Fer, 7 - HlylIR, 8 - Fur, 9 - HlylIR u Fur. Регхшэо проводили в присутствии 1 мкг кеспецифичесхсй ДНК.

В экспериментах по защите от ДНКазы I комплексов Fur - ДНК продемонстрировано, что белок защищает от расщепления ДНКгзой I область ДНК от +22 до -10 (Рис. 15, дорожка 4). Эта область содер-zcirr Fur — бокс. РНК-полимеразз запнпкает область ДНК от +25 до -65 (Рис. 15, дорожка 5). Области взаимодействия с ДНК РНК-полимеразы и белха Fur перекрываются. В присутствии обоих белков имеется ряд отличий между профилями защиты ДНК. Так, если регуляторпый белох добазлен в реакцию первым, то защищаемая область ДНК полностью соответствует области, экранируемой Fur. При добавлении белка Fur к уже сформированному комплексу РНК-полимер аза-ДНК - область, экранируемая регуляторным белком, остается полностью защищенной и наблюдается снижение степени защиты области экрашгруемой РНК-полимеразой (Рис. 15, дорожки 6 и 7).

Pur ~ А + — -и +

РНКП - |g - + + -г* -

"Т т

S s

Рис. 15. Защита промоторно-олераторного района белком Fur и РПК-полимсраюй от ДИКязы 1. Дорожки 1- нативный ДНК-фрагмент, 2- A+G, 3, 9 - контроль, 4, 8-Fur, 5 - РНКП. 6 - Fur + РНКП, 7 - РНКП + Fur. Звездочкой обозначен белок, добавленный в реакцию первым. В качестве субстрата использовали меченный по одной цепи ПЦР-фрагмент (400 п. я.), содержащий промоторно-операторную область гена гемолизина I]. Продукты реакщш разделяли в 7% денатурирующем ПААГ.

1 ¡34 stis I

Результаты экспериментов по влиянию Fur на транскрипцию in vitro гена гемолизина ¡1 полностью подтверждают конкурентный характер действия данного белка (Рис. !б). В случае, когда Fur в реакционную смесь добавляется первым, наблюдается полное блокирование транскрипции с промотора гена гемолизина il (Рис. 16, дорожки 3 и 4). Если первой добавляется РНК-полимераза, наблюдался транскрипг, соответствующий контролю (Рис. 16. дорожки \ 2). Полученные данные свидетельствуют о том, что Fur оказывает негативное влияние на транскрипцию гена гемолизина II in vitra, конкурируя с РНК-пол имеразой.

РНКГ1 Fur + -

+ + +*

Рис. 16. Транскрипния гена гемолизин* II in vitro. Дорожки: 1, 2 - первой в реакцию добавлена РНК-полимераза; 3,4- первым добавлен Fur ; 5 - контроль В качестве субстрата использовали ПЦР-фрагменг (400 п. в.), содержащий промоторно-операторную область гена гемолизина II. Продукты реакции разделяли в 7% денатурирующем ПААГ.

12 3 4 5

В результате проведенной работы показано, что экспрессия гена гемолизина il

находится под контролем, по крайней мере, двух регуляторных белков, механизм действия

которых различен. Негативный эффект HlyllR обусловлен инактивацией комплекса РНК-

полимераза-промотор hlyll. Тогда как белок Fur ингибируег транскрипцию гена hlyll путем

стерического препятствия посалке РНК-полимеразы

Бациллы цереусной группы способны жить как в почве, так и в позвоночньга и

беспозвоночных животных. Можно предположить, что когда B.cereus находится в почве

высокий синтез гемолизина не j-ребуется, и в бактериальной клетке поддерживается пекнй

невысокий стационарный уровень экспрессии hlyll. При попадании бактерии в макроорганизм целесообразно резкое увеличение продукции гемолизина. Следовательно, должен существовать некий дополнительный механизм или фактор, позволяющий снимать репрессию с гена hfyll. В этом процессе могут принимать участие различные кофакторы. Белок Fur взаимодействует с оператором (а, следовательно, ингибирует трапскршщию) только в присутствии свободных двухвалентных катионов, количество которых в макрооргаинзме ниже, чем в почве. Для HlylIR также можно предположить наличие кофактора, поскольку в структуре белка имеется «карман», характерный для всех представителей TetR семейства. Однако в данном случае взаимодействие с кофактором приводит к освобождению белка с ДНК (а, следовательно, к дерепрессни). Таким образом, в клетках эукарнот бактерия поддерживает еысокий уровень синтеза гемолизина II.

Кроме того, в промоторно-операторной области гена hlyll пайдены сайты связывания еще, как минимум, трех регуляторных белков (ResD, Нрг, IcaR). Дальнейшая работа будет направлена на выяснение тонких механизмов согласованной регуляции гена гемолизина II.

Выводы:

1. Белок HlylIR, специфически связываясь с 22 п.н. инвертированным повтором промоторно-операторной области гена гемолизина II В. cereus, негативно регулирует транскрипцию гена hly II.

2. HlylIR, понижая аффинность РНК-полимеразы к промоторно-операторной ДНК, препятствует образованию каталитически активного открытого промоторного комплекса.

3. Операторная область гена гемолизина II содержит три потенциальных перекрывающихся сайта связывания HlylIR. Во взаимодействие с регулятором одновременно вовлечены только два из них.

4. Белок Fur блокирует транскрипцию гена гемолизина И, конкурируя с РНК-полимеразой за участок связывания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Budarina Z.I., Nikitin D.V., Zenkin N., Zakharova M., Semenova E., Shlyapnikov M.G., Rodikova E.A.. Masyukova S., Ogarkov O., Baida G.E., Solonin A.S., Severinov K. A new Bacillus cereus DNA-bindmg protein, HlyllR, negatively regulates expression of B. cereus haemolysin II. Microbiology, 2004, 150,3691-3701.

2. Rodikova E.A.. Kovalevskiy O.V., Mayorov S.G., Budarina Z.I., Marchenkov V.V., Melnik B.S., Leech A.P., Nikitin D.V., Shlyapnikov M.G., Solonin A.S. Two HlyllR dimers bind to a long perfect inverted repeat in the operator of the hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEBS Lett, 2007,581,1190-1196.

3. Nikitin D., Budarina Zh., Rodikova E.. Solonin A. DNA binding properties of a new hemolysine II regulatory protein from B. cereus. Proceedings of the First IUBMB/SASBMB Special Meeting on Biochemical and Molecular Basis of Disease. Cape Town, South Africa, 2001, P. 132.

4. Родикова E. А.. Никитин Д. В., Бударина Ж. И. Регуляторный белок Bacillus cereus HlyllR: взаимодействие с операторным участком гена гемолизина И.. Материалы бой Международной Путинской школы-конференции молодых учепых "Ш10Л0ГИЯ • НАУКА XXI ВЕКА", Пущнио, 20-24 мая 2002 г., е. 310-311

5. Solonin S. A., Nikitin D. V., Budarina Zh. I., Rodikova E. A.. Ogarkov O., Severinov K. HlyllR is negative transcriptional regulator of hemolysin II expression. Abstracts of the 5Л International Conference on Anthrax and 3rd International Workshop on the Molecular Biology of Bacillus cereus, B. anthracis and B. tkuringiensis , Nice, France, March 30 -April 3 2003 г.,. C. 58.

6. Solonin A. S., Nikitin D.V., Budarina, Zh.1., Rodikova E. A.. Andreeva Zh.I., Ogaikov O., Severinov it Hemolysin II (Hlyll) from B. cereus and transcriptional regulation of hlyll gene expression. Gordon's research conference, Andover, NH, 18-23 July, 2004.

7. Родикова E. А.. Майоров С. Г., Шадрин А. М., Солонин А. С. Белок FUR -негативный регулятор транскрипции гена гемолизина II. Материалы 10-ой Междугородной Путинской школы-конференшш молодых ученых "БИОЛОГИЯ • НАУКА XXI ВЕКА", Пущина, 17-21 апреля200бг,.С,43.

Принято в печать 07.08.2007. Заказ № 19. Тираж 75 экз. ООО «Фотон-век». ИНН 5039008988 г. Пунщно. Московская область. (4967) 73-94-32 Ьеогпо1@гатЫег.ш

http://photon-vck.narod.ru - кварцевые кюветы

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Родикова, Екатерина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. В. cereus как объект для изучения гемолизинов

1.2. Гемолизины Bacillus cereus и их гены 11 1.2.1. Сфингомиелиназа и цереолизин АВ 11 1.2.2.11ереолизин (гемолизин I)

1.2.3. Гемолизин BL

1.2.4. Гемолизин III

1.2.5. Цитотоксин К (CytK)

1.2.6. Гемолизин II

1.3. Регуляторы продукции гемолизинов В. cereus

1.3.1. Плейотроппый регулятор PlcR

1.3.2. Регулятор гомеостаза железа (Fur)

1.3.3. Регулятор экспрессии гемолизина II В.cereus- IIlyllR

1.4. TetR семейство транскрииционпых регуляторов 24 1.4. 1. Регулятор TetR

1.4.2. Регулятор QacR

1.4.3. Регулятор EthR

1.4.4. Репрессор СргВ

1.4.5. Белок AcrR

1.4.6. Белок Mtr

1.4.7. Betl - регулятор превращения холина в глицинбетаин в Е. coli

1.4.8. Регулятор АгрА 36 1.4.9. Белок IlapR регулирует гены факторов вирулентности в Vibrio cholerae.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и реактивы

2.1.1. Штаммы бактерий и плазмидные вектора

2.1.2. Среды и основные буферы

2.1.3. Материалы и реактивы

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение тотальной Д1IK и^ микроорганизмов рода Bacillus

2.2.2. Выделение тотальной РНК.

2.2.3. Выделение плазмидпой ДНК

2.2.4. Препаративное выделение фрагмента ДНК

2.2.5. Получение компетентных клеток E.coli и их трансформация

2.2.6. Анализ рскомбинаптных клопов

2.2.7. ПЦР-амнлификация ДНК

2.2.8. Проведение реакций модификации ДНК

2.2.9. Плазмидные конструкции '

2.2.10. Определение и анализ первичной последовательности ДНК

2.2.11. Электрофорез в полиакриламидпом и агарозном гелях

2.2.12. Реакция удлинения праймера

2.2.13. Экспрессия и очистка белков

2.2.13.1. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Fur

2.2.13.2. Экспрессия и очистка РПК-полимеразы

2.2.13.3. Экспрессия и очистка HlyllR

2.2.14. Взаимодействие белков с ДНК

2.2.15. Взаимодействие PIIK-полимеразы с HlyllR

2.2.16. Защита ДНК от расщепления ДНказой I

2.2.17. Определение транскрипционной активности промоторов

2.2.18. Пермангапатный фут-принтинг

2.2.19. Спектры кругового дихроизма

2.2.20. Измерения флуоресценции анизотропии

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Структура регуляториой области гена гемолизина II

3.2. Анализ выведенной аминокислотной последовательности HlyllR

3.3. HlyllR негативно регулирует транскрипции гена гемолизина II

3.4. Взаимодействие HlyllR с оператором гена гемолизина II

3.5. Промогорно-операторный район гена hlyllR

3.6. Fur негативно регулирует транскрипцию гена гемолизина II in vitro

3.6.1. Получение рекомбинантпого белка Fur- 6His

3.6.2. Взаимодействие Fur с промоторно-онераторпой область гена гемолизина II

3.6.3. Влияние Fur па экспрессию гена гемолизина II 86 ВЫВОДЫ 88 СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ dATP - дезоксиаденозии-5'-трифосфат dNTP - дезоксинуклеозид-5'-трифосфат ddNTP - дидезоксинуклеозид-5'-трифосфат

ДДС - Na - додсцилсульфатнатрия

НДТА - этилендиаминтетрауксусиая кислота

ОП545- оптическое поглощение при 540 им

ОПбоо - оптическое поглощение при 600 им

ДИК - дезоксирибонуклеиповая кислота

PI IK - рибонуклеиновая кислота мРПК - матричная рибонуклеиновая кислота

РНКаза - рибонуклеаза

ИГ1ТГ - изопроиилтиогалактозид кДа - килодальтон ф.п. - нар нуклсотидов т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ПЦР - нолимеразная цепкая реакция

X-gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-уалактозид

SDS - додецил сульфат натрия

ТВЕ - трис-боратпый буфер

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция транскрипции гена гемолизина II Bacillus cereus"

Актуальность работы. Исследование молекулярных основ натогенности микроорганизмов является одной из фундаментальных задач микробиологии и медицины. Среди многообразия веществ, вырабатываемых бактериями для обеспечения проникновения в макроорганизм, преодоления его защитных систем и развития инфекционного процесса, особое место занимают токсины, которые для многих бактерий являются основными факторами натогенности. Известно, что патогенные свойства того или иного микроорганизма в значительной мере определяются как спектром его сгруктурпых генов, кодирующих факторы патогенности, так и механизмами, обеспечивающими регуляцию экспрессии этих генов. Выяснение механизмов регуляции сопряжено с изучением белок-белкового и ДНК-белкового взаимодействий и представляется одним из наиболее актуальных направлений в исследовании молекулярных основ натогенности и вирулентности микроорганизмов.

Для проведения исследований в данном направлении интересными объектами являются представители бацилл цереусной группы. Бактерии этой группы широко распространены в природе и имеют ярко выраженное филогенетическое родство, морфологическое и физиолого-биохимическое сходство па фоне широкого диапазона их патогенных свойств. В. cereus, занимая но патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бацилл и продуцируя широкий спектр гемолизинов, может служить удобной моделью для изучения этих токсинов.

Пщс одной причиной, которая побуждает к активному изучению регуляции экспрессии токсинов, вырабатываемых В. cereus и его ближайшими родственниками B.thuringiensis и В. anthracis, является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. В. cereus - один из основных бактериальных загрязнителей производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. B.thuringiensis, широкомасштабно используемый в качестве инсектицидных препаратов, неконтролируемо выбрасывается в окружающую среду. В. anlhracis печально известен как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву. Поэтому изучение регуляции отдельных токсинов, продуцируемых данными бактериями, для определения степени их безопасности для животных и человека является актуальной задачей.

Хорошо известно, что В. cereus производит ряд внеклеточных токсинов, обладающих гемолитической активностью и рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогепности (Turnbull, 1986; Drobniewski, 1993). Гемолизин П принадлежи!' к семейству ^-складчатых пороформирующих токсинов (PFT), имеет высокую степень гомологии (31,2% идентичности) с а токсином Staphylococcus aureus и вносит значительный вклад в суммарную гемолитическую активность штаммов В. cereus и В. thuringiensis.

Несмотря па то, что гемолитические токсины В. cereus активно изучаются, на сегодняшний день весьма мало известно об их генетической регуляции, также как и о регуляции других факторов вирулентности этого микроорганизма. Подробно описан лишь один плейотронный регулятор, PlcR, который является активатором генов фосфолииаз, иегемолитического и гемолитического энтеротоксинов, а также некоторых других генов В. cereus и В. thuringiensis (Lereclus et al., 1996; Agaisse, 1999, Ivanova et. al., 2003). Ныло показано влияние еще одного гена,/7hA, на продукцию фосфолииаз, гемолизина 131, и ряда других внеклеточных факторов вирулентности у штаммов В. cereus и В. thuringiensis (Ghelardi et al., 1999). Но в данном случае это влияние сводится к регуляции экспорта белков из клетки, а не затрагивает их синтез. Сравнительно недавно был описан еще один плейотронный транскрипционный регулятор Fur (ferric uptake repressor), регулирующий как процессы усвоения и накопления железа бактериальной клеткой, так и биосинтез некоторых факторов патогепности (Harvie et al., 2005). Между тем вопрос о регуляции экспрессии генов токсинов неразрывно связан с вопросом регуляции патогенных свойств и весьма актуален. Такие исследования заслуживают самого серьезного внимания, поскольку их результаты являются необходимым первоначальным этапом, закладывающим основу для дальнейшего выяснения сложных механизмов координированной регуляции генов, обеспечивающих пагогенность микроорганизмов цереусной группы.

Цели и задачи исследования.

Целыо настоящей работы являлось исследование регуляции транскрипции гена гемолизина II В. cereus. Для достижения указанной цели последовательно ставились следующие задачи:

- исследовать организацию регуляторной области гена гемолизина 11;

- исследовать участие белка HlyllR в регуляции экспрессии гена hlyll;

- изучить особенности узнавания и взаимодействия HlyllR с операторами гена hlyll;

- исследовать участие глобального регулятора Fur в транскрипции гена hlyll.

Научная новизна работы. Впервые получены данные о регуляции экспрессии потенциального фактора патогенности В. cereus - гемолизина II. Показано, что в промоторпо-онераторпой области гена hlyll расположено два операторных участка -сайты связывания двух регуляторпых белков HlyllR и Fur.

Продемонстрировано, что белок HlyllR негативно регулирует транскрипцию гена гемолизина II В. cereus, препятствуя образованию открытого промоторпого комплекса. Установлено, что в промоторно-операторной области гена hlyll расположено три потенциальных перекрывающихся сайта связывания HlyllR, с которыми одновременно взаимодействует только два димера регуляторного белка. Показано, что в отличие от ряда ДПК-связывающих белков HlyllR не способен вносить значительных копформациоппых изменений в ДНК сайга мишепи. Показано негативное влияние па транскрипцию гена гемолизина II B.cereus глобального транскрипционного регулятора Fur.

Практическое значение работы. Исследование регуляции экспрессии бактериальных токсинов не только представляет несомненный научный интерес, но и важно в практическом плане, как создание основы для осуществления направленного контроля процесса патогенеза. Знания о регуляции экспрессии генов, кодирующих токсины, может быть использовано при создании принципиально новых терапевтических и профилактических подходов, а также новых лекарственных препаратов, что позволит отказаться от традиционной терапии антибиотиками. Полученные данные но исследованию молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов гемолизинов Б. cereus могут использоваться в дальнейших исследованиях по разработке методов направленной регуляции патогенеза у В. anthracis, как наиболее близкого к В. cereus микроорганизма Кроме того, данные исследования важны и для сельского хозяйства, в котором применяется ряд микроорганизмов, содержащих потенциальные факторы патогенности (В. thuringiensis).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Родикова, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ:

1. Нелок HlyllR, специфически связываясь с 22 п.п. инвертированным повтором иромоторно-операторной области гена гемолизина II В. cereus, негативно регулирует транскрипцию гена hly II.

2. HlyllR, понижая аффинность РНК - полимеразы к промоторпо-операторной ДНК, препятствует образованию каталитически активного открытого промоторпого комплекса.

3. Операторная область гена гемолизина II содержит три потенциальных перекрывающихся сайта связывания HlyllR. Во взаимодействие с регулятором одновременно вовлечены только два из них.

4. Велок Fur блокирует транскрипцию гена гемолизина II, конкурируя с РНК-полимеразой за участок связывания в экспериментах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Родикова, Екатерина Александровна, Пущино

1. Agaisse И., Gominet М., Okstad О.A., Kolsto А-В., Lereclus D. (1999) PIcR is а pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol., V. 32, P. 1043-1053.

2. Ahlert J, Shepard E, Lomovskaya N, Zazopoulos E, Staffa A, Bachmann BO, I Iuang K, Fonstein L, Czisny A, Whitwam RE, Farnet CM, Thorson JS. (2002) The calicheamicin gene cluster and its iterative type I enediyne PKS. Science., V. 297, P. 1173-6.

3. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, V.25, P. 3389-402.

4. Altschmied L, Hillen W. (1984) ГЕТ repressor.tet operator complex formation induces conformational changes in the tet operator DNA. Nucleic Acids Res., V. 12, P. 2171-80.

5. Andreeva ZI, Nestcrcnko VF, Yurkov IS, Budarina ZI, Sineva EV, Solonin AS. (2006) Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II. Protein Expr Vurif, V. 47, P.186-93.

6. Andreeva ZI, Nesterenko VF, Fomkina MG, Ternovsky VI, Suzina NE, Bakulina AY, Solonin AS, Sineva EV. (2007) The properties of Bacillus cereus hemolysin II pores depend on environmental conditions. Biochim Biophys Acta., V. 1768, P. 253-63.

7. Aramaki H, Yagi N, Suzuki M. (1995) Residues important for the function of a multihelical DNA binding domain in the new transcription factor family of Cam and I'ct repressors. Protein Eng., V. 8, P. 1259-66.

8. Aramaki II, Sagara Y, Kabata II, Shimamoto N, Horiuchi T. (1995a) Purification and characterization of a cam repressor (CamR) for the cytochrome P-450cam hydroxylase operon on the Pseudomonas pulida CAM plasmid. J Bacterial., V. 177, P. 3120-7.

9. Arribas JM, Caballero P, Baos V, Casarrubios E. (1988) Etiologic diagnosis of Turner's syndrome by radiography of the hand. Rev Clin Esp., V. 183, P. 154-5. Spanish.

10. Auger S, Krin E, Aymerich S, Gohar M. (2006) Autoinducer 2 affects biofilm formation by Bacillus cereus. Appl Environ Microbiol., V. 72, P. 937-41.

11. Baichoo N, Wang T, Ye R, Helmann JD. (2002) Global analysis of the Bacillus subtilis Fur regulon and the iron starvation stimulon. Mol Microbiol., V. 45, P. 1613-29.

12. Baida G.B. and Kuzmin N.P. (1995) Cloning and primary structure of a new hemolysin gene from Bacillus cereus. Biochim Biophys. Acta, V. 1264, P. 151-154.

13. Baida G.E. and Kuzmin N.P. (1996) Mechanism of action of hemolysin III from Bacillus cereus. Biochim Biophys. Acta, V. 1284, P. 122-124.

14. Baida G.E., Sidorov I.A. and Kuzmin N.P. (1997) Hemolysin III from Bacillus cereus. P. 48. Abstracts of the First International Workshop on The Molecular Biology of B. cereus, B. anthracis and B. thuringiensis, May 23-25, Oslo.

15. Baida G, Budarina ZI, Kuzmin NP, Solonin AS. (1999) Complete nucleotide sequence and molecular characterization of hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett., V. 180, P. 7-14.

16. Barne KA, Bown JA, Busby SJ, Minchin SD. (1997) Region 2.5 of the Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the 'extended-10' motif at promoters. EMBO J., V. 16, P. 4034-40.

17. Baulard AR, Betts JC, Engohang-Ndong J, Quan S, McAdam RA, Brcnnan PJ, Locht C, Besra GS. (2000) Activation of the pro-drug ethionamide is regulated in mycobacteria./ Biol Chem., V. 275, P. 28326-31.

18. Baumeister R, Helbl V, Hillen W. (1992) Contacts between Tet repressor and tet operator revealed by new recognition specificities of single amino acid replacement mutants. J Mol Biol, V. 226, P. 1257-70.

19. Bccskci, A., and L. Serrano (2000) Engineering stability in gene networks by autoregulation. Nature, V. 405, P. 590-593.

20. Beecher D.J. and Macmillan J.D. (1990) A novel bicomponent hemolysin from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 58, P. 2220-2227.

21. Beecher D.J. and Macmillan J.D. (1991) Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 59, P. 1778-1784.

22. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994) Improved purification and characterization of hemolysin BL, a hemolytic dermonecrotic vascular permeability factor from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 62, P. 980-986.

23. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994a) Identification of hemolysin BL-producing Bacillus cereus isolates by a discontinuous hemolytic pattern in blood agar. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1646-1651.

24. Beecher D.J., Pulido J.S., Barney N.P., Wong A.C.L. (1995) Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infect. Immun., V. 63, P. 632-639.

25. Beecher D.J., Schoeni J.L. and Wong A.C.L. (1995a) Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 63, P. 4423-4428.

26. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1997) Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus: hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. J. Biol. Chem., V. 272, P. 233-239.

27. Bernheimcr A.W. and Grushoff P. (1967a) Extracellular hemolysins of aerobic sporogenic Bacilli. J. Bacteriol., V. 93, P. 1541-1543.

28. Bernheimer A.W. and Grushoff P. (19676) Cereolysin: production, purification and partial characterization. J.Gen. Microbiol., V. 46, P. 143-150.

29. Bowman M.N., Ottolenghi A.C. and Mengel C.E. (1971) Effects of phospholipase С on human erythrocytes. J. Membr. Biol., V. 4, P. 156-164.

30. Brillard J, Lereclus D. (2004) Comparison of cytotoxin cytK. promoters from Bacillus cereus strain ATCC 14579 and from a B. cereus food-poisoning strain. Microbiology., V. 150, P. 2699-705.

31. Bsat N, Helmann JD. (1999) Interaction of Bacillus subtilis Fur (ferric uptake repressor) with the dhb operator in vitro and in vivo. J Bacteriol., V. 181, P. 4299-307.

32. Budarina ZI, Sinev MA, Mayorov SG, Tomashevski AY, Shmelev IV, Kuzmin NP. (1994) Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Arch Microbiol., V. 161, P. 252-7.

33. Bujard II, Gentz R, Lanzer M, Stueber D, Mueller M, Ibrahimi I, Haeuptle MT, Dobberstein B. (1987) Л T5 promoter-based transcription-translation system for the analysis of proteins in vitro and in vivo. Methods Enzymol., V. 155, P. 416-33.

34. Busby S., Kolb A., Minchin S. (1994) DNA-protein interaction: principles and protocols.// Methods in molecular biology, ed. by G. Geoff Kneale. Humana press Inc., Ottowa, New Jersey., V. 30, P. 397-411.

35. Callcgan MC, Kane ST, Cochran DC, Gilmore MS, Gominet M, Lereclus D. (2003) Relationship of plcR-regulated factors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infect Immun., V. 71, P. 3116-24.

36. Carlson C.R., Caugant D.A. Kolsto A.-B. (1994) Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1719-1725.

37. Carlson C.R., Johansen T. and Kolsto A.-B. (1996) The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain АТС С 14579. FEMS Microbiol. Lett., V. 141, P. 163-167.

38. Chater KF. (1993) Genetics of differentiation in Streptomyces. Annu Rev Microbiol., V. 47, P. 685-713.

39. Claus D. and Berkeley R. C. W. (1996) Genus Bacillus. Р/ 1105-1139. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Sneath P. II. A., Main N. A, Sharpe M. E. Holt J. G. (eds.), Williams and Wilkins, Baltimore, MD.

40. Coolbaugh J.C. and Williams R.P. (1978) Production and characterization of two hemolysins of Bacillus cereus. Can. J. Microbiol., V. 24, P. 1289-1295.

41. Compan I, Touati D. (1993) Interaction of six global transcription regulators in expression of manganese superoxide dismutase in Escherichia coli K-12. J Ikicleriol., V. 175, P. 1687-96.

42. Cousin SL Jr, Whittington WL, Roberts MC. (2003) Acquired macrolide resistance genes and the 1 bp deletion in the mtrR promoter in Neisseria gonorrhoeae./ Antimicrob Chemother., V. 51, P. 131-3.

43. Coy M, Neilands JB. (1991) Structural dynamics and functional domains of the fur protein. Biochemistry., V. 30, P. 8201-10.

44. Delany, I., R. leva, C. Alaimo, R. Rappuoli, and V. Scarlato. (2003) The iron-responsive regulator Fur is transcriptionally autoregulated and not essential in Neisseria meningitidis. J. Bacteriol., V. 185, P. 6032-6041.

45. De Lorenzo V, Herrero M, Giovannini F, Neilands JB. (1988) Fur (ferric uptake regulation) protein and CAP (catabolite-activator protein) modulate transcription of fur gene in Escherichia coli. Eur J Biochem., V.173, P. 537-46.

46. De Lorenzo V, Giovannini F, Herrero M, Neilands JB. (1988a) Metal ion regulation of gene expression. Fur repressor-operator interaction at the promoter region of the aerobactin system of pColV-K30. J Mol Biol., V. 203, P. 875-84.

47. Dover LG, Corsino PE, Daniels IR, Cocklin SL, Tatituri V, Bcsra GS, Futtcrer K. (2004) Crystal structure of the TetR/CamR family repressor Mycobacterium tuberculosis EthR implicated in ethionamide resistance. J Mol Biol., V. 340, P. 1095-105.

48. Drobniewski F.A. (1993) Bacillus cereus and related species. Clin. Microbiol. Rev. V. 6, P. 324-338.

49. Duncan R. Ilarvie, Susana Vilchez, James R. Stegglcs and David J. Hilar. (2004) Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Department of Biochemistry, University of Cambridge, 80 Tennis Court Road, Cambridge.

50. Eckhardt Т. (1978) A rapid method for the identification of plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid, V. 1, P. 584-588.

51. Escolar L, Perez-Martin J, de Lorenzo V. (1999) Opening the iron box: transcriptional metalloregulation by the Fur protein. J Bacleriol., V. 181, P. 6223-9.

52. Escolar L, Perez-Martin J, de Lorenzo V. (2000) Evidence of an unusually long operator for the fur repressor in the aerobactin promoter of Escherichia coli. J Biol Chem., V. 275, P. 24709-14.

53. Eshoo MW. (1988) lac fusion analysis of the bet genes of Escherichia coli: regulation by osmolarity, temperature, oxygen, choline, and glycine betaine. J Bacleriol., V. 170, P. 5208-15.

54. Fagerlund A, Ween O, Lund T, Hardy SP, Granum PE. (2004) Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus. Microbiology., V. 150, P. 2689-97.

55. Fedhila S, Daou N, Lereclus D, Nielsen-LeRoux C. (2006) Identification of Bacillus cereus internalin and other candidate virulence genes specifically induccd during oral infection in insects. Mol Microbiol., V. 62, P. 339-55.

56. Fossum K. (1963) Separation of hemolysin and egg yolk turbidity factor in cell-free extracts of Bacillus cereus. Ada Path. Microbiol. Scand., V. 59, P. 400-406.

57. Fralick JA. (1996) Evidence that TolC is required for functioning of the Mar/AcrAB efflux pump of Escherichia coli. J Bacleriol., V. 178, P. 5803-5.

58. Fuangthong M, Helmann JD. (2003) Recognition of DNA by three fcrric uptake regulator (Fur) homologs in Bacillus subtilis. J Bacterial., V. 185, P. 6348-57.

59. Gaal T, Ross W, Estrem ST, Nguyen LI I, Burgess RR, Gourse RE. (2001) Promoter recognition and discrimination by EsigmaS RNA polymerase. Mol Microbiol., V. 42, P. 93954.

60. Gominet M, Slamti L, Gilois N, Rose M, Lereclus D. (2001) Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcR regulon and for virulence. Mol Microbiol., V. 40, P. 963-75.

61. Granum P.E. and Lung T. (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett., V. 157, P. 223-228.

62. Grkovic S, Brown MH, Roberts NJ, Paulsen IT, Skurray RA. (1998) QaeR is a repressor protein that regulates expression of the Staphylococcus aureus multidrug el'llux pump QacA.J Biol Chem., V. 273, P. 18665-73.

63. Grkovic S, Brown MH, Skurray RA. (2001) Transcriptional regulation of multidrug efflux pumps in bacteria. Semin Cell Dev Biol., V. 12, P. 225-37.

64. Grkovic S, Brown MH, Schumacher MA, Brennan RG, Skurray RA. (2001a) The staphylococcal QacR multidrug regulator binds a correctly spaced operator as a pair of dinners. J Bacterial., V. 183, P. 7102-9.

65. I lager P.W. and Rabinowitz J.C. (1985) Translational specificity in Bacillus subtilis. P. 1-32. The molecular biology of the Bacilli, Dubnau D.A. (ed.), Acad. Press, New York.

66. Hager PW, Rabinowitz JC. (1985a) Inefficient translation of T7 late mRNA by Bacillus subtilis ribosomes. Implications for species-specific translation. J Biol Chem., V. 260, P. 1516315167.

67. I Iagman KE, Pan W, Spratt BG, Balthazar JT, Judd RC, Shafer WM. (1995) Resistance of Neisseria gonorrhoeae to antimicrobial hydrophobic agents is modulated by the mtrRCDE efflux system. Microbiology, V. 141, P. 611-22.

68. Hantke K. (2001) Iron and metal regulation in bacteria. Curr Opin Microbiol., V. 4, P. 172-7.

69. Ilara O, Beppu T. (1982) Mutants blocked in streptomycin production in Streptomyces griseus the role of A-factor. J Antibiot (Tokyo)., V. 35, P. 349-58.

70. Ilara O, Beppu T. (1982a) Induction of streptomycin-inactivating enzyme by A-factor in Streptomyces griseus. J Antibiot (Tokyo)., V. 35, P. 1208-15.

71. Harvie DR, Vilchez S, Steggles JR, Ellar DJ. (2005) Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology, V. 151, P. 569-77.

72. Hayes A, llobbs G, Smith CP, Oliver SG, Butler PR. (1997) Environmental signals triggering methylenomycin production by Streptomyces coelicolor A3(2). J Bacteriol., V. 179, P. 5511-5.

73. Helgason E, Okstad OA, Caugant DA, Johansen HA, Fouet A, Mock M, Hegna 1, Kolsto AB. (2000) Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus lhuringiensis--one species on the basis of genetic evidence. Appl Environ Microbiol, V. 66, P. 2627-30.

74. Heinrichs J.II., Beecher D.J., Macmillan J.D., Zilinskas B.A. (1993) Molecular cloning and characterization of the ША gene encoding the В component of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacterial., V. 175, P. 6760-6765.

75. Hinrichs W, Kisker C, Duvcl M, Muller A, Tovar K, Hillen W, Saenger W. (1994) Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic resistance. Science, V. 264, P. 418-20.

76. Ilillen W, Bcrcns C. (1994) Mechanisms underlying expression of TnlO encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol., V. 48, P. 345-69.

77. Hinrichs, W., C. Kisker, M. Du'vel, A. Muller, K. Tovar, W. Ilillen, and W. Saenger. (1994) Structure of the Tet repressor-tetracycline complex and regulation of antibiotic resistance. Science, V. 264, P. 418-420.

78. Hirata T, Saito A, Nishino K, Tamura N, Yamaguchi A. (2004) Effects of efflux transporter genes on susceptibility of Escherichia coli to tigecycline (GAR-936). Antimicrob Agents Chemother., V. 48, P. 2179-84.

79. Honda Т., Shiba A., Seo S., Yamamoto J., Matsuyama J., and Miwatani T. (1991) Identity of hemolysins produced by Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett., V. 79, P. 205-210.

80. Horinouchi S, Beppu T. (1990) Autoregulatory factors of secondary metabolism and morphogenesis in actinomycetes. Crit Rev Biotechnol., V. 10, P. 191-204.

81. Horinouchi S, Beppu T. (1994) A-factor as a microbial hormone that controls cellular differentiation and secondary metabolism in Slreplomyces griseus. Mol Microbiol., V. 12, P. 859-64.

82. Horinouchi S, Ohnishi Y, Kang DK. (2001) The A-factor regulatory cascade and cAMP in the regulation of physiological and morphological development in Slreplomyces griseus. J Ind Microbiol Biotechnol., V. 27, P. 177-82.

83. Horinouchi S. (2002) A microbial hormone, A-factor, as a master switch for morphological differentiation and secondary metabolism in Slreplomyces griseus. Front BioscL, V. 7, P. 2045-57.

84. Ikezava II., Mori M. and Taguchi R. (1980) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus: Hydrolytie and hemolytic actions on erythrocyte membranes. Arch. Biochem. Biophys., V. 199, P. 572-577.

85. Ikezawa II., Matsushita M., Tomita M., Taguchi R. (1986) Effects of metal ions on sphingomyelinase activity of Bacillus cereus. Arch. Biochem. Biophys., V. 249, P. 588-595.

86. Johnson C.E. and Bonventre P.F. (1967) Lethal toxin of Bacillus cereus. I.Relationships and nature of toxin, hemolysin , and phospholipase. J. BaclerioL, V. 94, P. 306-316.

87. Kaneko M, Yamaguchi A, Sawai T. (1985) Energetics of tetracycline efflux system encoded by TnlO in Escherichia coli.FEBS Lett. V. 193, P. 194-8.

88. Kashlcv, M., Nudler, E., Severinov, K., Borukhov, S., Komissarova, N. & Goldfarb, A. (1996) Ilistidine-tagged RNA polymerase of Escherichia coli and transcription in solid phase. Methods Enzymol, V. 274, P.326-334.

89. Kato, J., A. Suzuki, II. Yamazaki, Y. Ohnishi, and S. Horinouchi (2002) Control by A-factor of a metallocndopeptidase gene involved in aerial mycelium formation in Slreptomyces griseus. J. Bacleriol., V. 184, P. 6010-6025.

90. Kato, J.-Y., I. Miyahisa, M. Mashiko, Y. Ohnishi, and S. Horinouchi (2004) A single target is sufficient to account for biological effects of the A-factor rcccptor protein of Slreptomyces griseus. J. Bacleriol., V. 186, P. 2206-2221.

91. Klein JR, Plapp R. (1992) Locations of the cnvCD genes on the physical map of the Escherichia coli chromosome./ Bacleriol., V. 174, P. 3828-9.

92. Koronakis V, Sharff A, Koronakis E, Luisi B, Hughes C. (2000) Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export. Nature., V. 405, P. 914-9.

93. Kovalevskiy OV, Lebedev AA, Surin AK, Solonin AS, Antson AA. (2007) Crystal structure of Bacillus cereus HlyllR, a transcriptional regulator of the gene for pore-forming toxin hemolysin II. J Mol Biol., V. 365, P. 825-34.

94. Kovacikova G, Skorupski K. (2002) Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol Microbiol., V. 46, P. 1135-47.

95. Kunin CM, I Iua TH, Van Arsdale White L, Villarcjo M. (1992) Growth of Escherichia coli in human urine: role of salt tolerance and accumulation of glycine bctaine. J Infect Dis., V. 166, P. 1311-5.

96. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, V. 227, P. 680-685.

97. Lamark T, Styrvold OB, Strom AR. (1992) Efllux ofcholinc and glycine betainc from osmoregulating cells of Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett., V. 75, P. 149-54.

98. Lamark T, Rokenes TP, McDougall J, Strom AR. (1996) The complex bet promoters of Escherichia coli: regulation by oxygen (ArcA), choline (Betl), and osmotic stress./ Bacteriol., V. 178, P. 1655-62.

99. Landfald B, Strom AR. (1986) Choline-glycine betaine pathway confcrs a high level of osmotic tolerance in Escherichia coli. J Bacterial., V. 165, P. 849-55.

100. Lavrrar JL, Christoffersen CA, Mcintosh MA. (2002) Fur-DNA interactions at the bidirectional fepDGC-entS promoter region in Escherichia coli. J Mol Biol., V. 322, P. 983-95.

101. Lee, E. II., C. Rouquette-Loughlin, J. P. Folster, and W. M. Shafer (2003) FarR regulates the /wv4Z?-encoded efflux pump of Neisseria gonorrhoeae viab an MtrR regulatory mechanism. J. Bacterial., V 185, P. 7145-7152.

102. Levy SB, McMurry LM, Barbosa TM, Burdett V, Courvalin P, Ilillen W, Roberts MC, Rood J I, Taylor DE. (1999) Nomenclature for new tetracycline resistance determinants. Antimicrab Agents Chemother., V. 43, P. 1523-4.

103. Lcreclus D, Agaisse II, Grandvalet C, Salamitou S, Gominet M. (2000) Regulation of toxin and virulcnce gene transcription in Bacillus thuringiensis. lntJ Med Microbiol., V. 290, P. 295-9.

104. Lucas CE, Ilagman KE, Levin JC, Stein DC, Shafer WM. (1995) Importance of lipooligosaccharide structure in determining gonococcal resistance to hydrophobic antimicrobial agents resulting from the mtr efflux system. Mol Microbiol., V. 16, P. 1001-9.

105. Lucas СЕ, Balthazar JT, Hagman KE, Shafer WM. (1997) The MtrR repressor binds the DNA sequence between the mtrR and mtrC genes of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol., V. 179, P. 4123-8.

106. Lundblad JR, Laurance M, Goodman RH. (1996) Fluorescence polarization analysis of protein-DNA and protein-protein interactions. Mol Endocrinol., V. 10, P. 607-12.

107. Ma D, Cook DN, Hearst JE, Nikaido II. (1994) Efflux pumps and drug resistance in gram-negative bacteria. Trends Microbiol., V. 2, P. 489-93.

108. Ma D, Cook DN, Alberti M, Pon NG, Nikaido H, Hearst JE. (1995) Genes acrA and acrB encode a stress-induced efflux system of Escherichia coli. Mol Microbiol., V. 16, P. 4555.

109. Ma D, Alberti M, Lynch C, Nikaido H, Hearst JE. (1996) The local repressor AcrR plays a modulating role in the regulation of acrAB genes of Escherichia coli by global stress signals. Mol Microbiol., V. 19, P. 101-12.

110. Mails G., Bayley II., Cheley S. (2002) Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore. Protein Sci., V. 11. P. 1813-1824.

111. Makrides S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev., V. 60, P. 512-538.

112. Marmur J. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. V. 3, P. 208-218.

113. Mavroidi A, Tzouvelekis LS, Kyriakis KP, Avgerinou H, Daniilidou M, Tzelepi E. (2001) Multidrug-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae in Greece. Antimicrob Agents Chemother., V. 45, P. 2651-4.

114. Mikshis N1, Eremin SA, Bolotnikova MF. (1999) Correlation of the virulence of Bacillus anlhracis with expression of signs, coded for by chromosomal genes. Mol Gen Mikrobiol Virusol., V. 4, P. 25-8.

115. Natsume R, Ohnishi Y, Senda T, Morinouchi S. (2004) Crystal structure of a gamma-butyrolactone autoregulator receptor protein in Streptomyces coelicolor A3(2). J Mol Biol., V. 336, P. 409-19.

116. Nikaido II. (1996) Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria. J Bacleriol., V. 178, P. 5853-9.

117. Nikaido H. (1998) Antibiotic resistance caused by gram-negative multidrug efflux pumps. Clin Infect Dis., Suppl I, P. 32-41.

118. Oethinger M, Podglajen I, Kern WV, Levy SB. (1998) Overexpression of the niarA or soxS regulatory gene in clinical topoisomerase mutants of Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother., V. 42, P. 2089-94.

119. Ohnishi Y, Kameyama S, Опака H, Ilorinouchi S. (1999) The A-factor regulatory cascade leading to streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus : identification of a target gene of the A-factor receptor. Mol Microbiol., V. 34, P. 102-11.

120. Okusu II, Ma D, Nikaido H. (1996) AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants.J Bacterial., V. 178, P. 306-8.

121. Опака H, Ando N, Nihira T, Yamada Y, Beppu T, Horinouchi S. (1995) Cloning and characterization of the A-factor receptor gene from Streptomyces griseus. J Bacterial., V. 177, P. 6083-92.

122. Опака II, Horinouchi S. (1997) DNA-binding activity of the Л-factor receptor protein and its recognition DNA sequences. Mol Microbiol., V. 24, P. 991-1000.

123. Orth P, Cordes F, Schnappinger D, Hillen W, Saenger W, Hinrichs W. (1998) Conformational changes of the Tet repressor induced by tetracycline trapping. J Mol Biol., V. 279, P. 439-47.

124. Orth P, Saenger W, Hinrichs W. (1999) Tetracycline-chelated Mg2+ ion initiates helix unwinding in Tet repressor induction. Biochemistry, V. 38, P. 191-8.

125. Orth P, Schnappinger D, Hillen W, Saenger W, Hinrichs W. (2000) Structural basis of gene regulation by the tetracycline inducible Tet repressor-operator system. Nat Struct Biol., V. 7, P. :215-9.

126. Pan W, Spratt BG. (1994) Regulation of the permeability of the gonococcal cell envelope by the mtr system. Mol Microbiol., V. 11, P. 769-75.

127. Ramos JL, Martinez-Bueno M, Molina-IIenares AJ, Teran W, Watanabe K, Zhang X, Gallegos MT, Brennan R, Tobes R. (2005) The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev., V. 69, P. 326-56.

128. Rokenes TP, Lamark T, Strom AR. (1996) DNA-binding properties of the Betl repressor protein of Escherichia coli: the inducer choline stimulates Betl-DNA complex formation./ Bacterial, V. 178, P. 1663-70.

129. Rosenberg M., Court, D. (1979) Regulatory sequences involved in the promotion and termination of DNA transcription. Ann. Rev. Genet., V. 13, P. 319-353.

130. Ryan P.A., Macmillan J.D. and Zilinskas B.A. (1997) Molecular cloning and characterization of the genes encoding the LI and L2 components of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacterial., V. 179, P. 2551-2556.

131. Sala, C., F. Forti, E. di Florio, F. Canneva, A. Milano, G. Riccardi, and D. Ghisotti (2003) Mycobacterium tuberculosis FurA autoregulates its own expression. ./. Bacterial, V. 185, P.5357-5362.

132. Salah-Bey K, Thompson CJ. (1995) Unusual regulatory mechanism for a Streptomyces multidrug resistance gene, ptr, involving three homologous protein-binding sites overlapping the promoter region. Mol Microbiol., V. 17, P. 1109-19.

133. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York.

134. Sanchez P, Alonso A, Martinez JL. (2002) Cloning and characterization of SmeT, a repressor of the Stenotrophomonas maltophilia multidrug efflux pump SmeDEF. Antimicrob Agents Chemother, V. 46, P. 3386-93.

135. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. PNAS, V. 74, P. 5463-5467.

136. Scatchard G. (1949) The attraction of proteins for small molecules and ions. Ann. NY Acad. Sci., 660-672.

137. Shinagawa K., Ichikawa K., Matsusaka N., Sugii S. (1991) Purification and some properties of a Bacillus cereus mouse lethal toxin. J. Vet. Med. Sci., V. 53, P. 469-474.

138. Schoeni JL, Wong AC. (2005) Bacillus cereus food poisoning and its toxins. ./ Food Prot., V. 68, P. 636-48.

139. Schumacher MA, Miller MC, Grkovic S, Brown MH, Skurray RA, Brennan RG. (2001) Structural mechanisms of QacR induction and multidrug recognition. Science, V. 294, P. 215863.

140. Schumacher MA, Miller MC, Grkovic S, Brown MI I, Skurray RA, Brennan RG. (2002) Structural basis for cooperative DNA binding by two dimers of the multidrug-binding protein QacR. EMBOJ., V. 21, P. 1210-8.

141. Schumacher MA, Brennan RG. (2002) Structural mechanisms of multidrug recognition and regulation by bacterial multidrug transcription factors. Mol Microbiol., V. 45, P. 885-93.

142. Sinev MA, Budarina ZhI, Gavrilcnko IV, Tomashevskii AIu, Kuz'min NP. (1993) Evidence of the existence of hemolysin II from Bacillus cereus: cloning the genetic determinant of hemolysin II Mol Biol (Mosk), V. 27, P. 1218-29.

143. Slamti E, Lereclus D. (2002) A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group. EMBO J., V. 21, P. 4550-9.

144. Slamti L, Lereclus D. (2005) Specificity and polymorphism of the PlcR-PapR quorum-sensing system in the Bacillus cereus group. J Bacteriol., V. 187, P. 1182-7.

145. Smith A, Hooper N1, Shipulina N, Morgan WT. (1996) Heme binding by a bacterial repressor protein, the gene product of the ferric uptake regulation (fur) gene of Escherichia coli. J Protein Chem., V. 15, P. 575-83.

146. Steitz J.A. (1979) Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA. P. 349399. Biological regulation and development. V. I. Gene Expression, Goldenberger R.F. (ed.), Plenum Press, New York.

147. Stenfors LP, Mayr R, Scherer S, Granum P.E. (2002) Pathogenic potential of fifty Bacillus weihenstephanensis strains. FEMS Microbiol Lett., V. 215, P. 47-51.

148. Stojiljkovic I, Hantke K. (1995) Functional domains of the Escherichia coli ferric uptake regulator protein (Fur). Mol Gen Genet., V. 247, P. 199-205.

149. Strom, A. R., P. Falkenberg, and B. Landfald (1986) Genetics of osmoregulation in Escherichia coli: uptake and biosynthesis of organic osmolytes. FEMS Microbiol. Rev., V. 39, P. 79-86.

150. Styrvold OB, Falkenberg P, Landfald B, Eshoo MW, Bjornsen T, Strom AR. (1986) Selection, mapping, and characterization of osmoregulatory mutants of Escherichia coli blocked in the choline-glycine betaine pathway. J Bacteriol., V. 165, P. 856-63.

151. Titball R.W. (1993) Bacterial phospholipases C. Microbiol. Rev., V. 57, P. 347-366.

152. Thieffry, D„ A. M. Huerta, E. Perez-Rueda, and J. Collado-Vides (1998) From specific gene regulation to genomic networks: a global analysis of transcriptional regulation in Escherichia coli. Bioessays, V. 20, P. 433-440.

153. Tomita M., Taguchi I.R., Ikezava H. (1991) Sphingomyelinase of Bacillus cereus as a bacterial hemolysin. J. Toxicol.-Toxin Rev., V. 10, P. 169-207.

154. Turnbull P.C. and Kramer J.M. (1991) Bacillus. P. 296-303. Manual of clinical microbiology, 5th ed., Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., lsenberg II.D., Shadomy H.J. (eds.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

155. Turnbull P.C.B. (1986) Bacillus cereus toxins. P. 397-448. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J., (eds.), Pergamon Press, Oxford.

156. Turnbull P.C., Kramer J.M., Jorgensen K., Gilbert R.J., Melling J. (1979) Properties and production characteristics of vomiting, diarrheal, and necrotizing toxins of Bacillus cereus. Amer. J. Clin. Nutr., V. 32, P. 219-228.

157. Veal WL, Nicholas RA, Shafer WM. (2002) Overexpression of the MtrC-MtrD-MtrE efflux pump due to an mtrR mutation is required for chromosomally mediated penicillin resistance in Neisseria gonorrhoeae. J Bacleriol., V. 184, P. 5619-24.

158. Veal WL, Shafer WM. (2003) Identification of a cell envelope protein (MtrF) involved in hydrophobic antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae. J Anlimicroh Chemother, V. 51, P. 27-37.

159. Ueda, К., K. Matsuda, II. Takano, and T. Beppu (1999) A putative regulatory element for carbon-source-dependent differentiation in Streptomyces griseus. Microbiology, V. 145, P. 2265-2271.

160. Wissmann A., Baumeister R., Muller G., Hecht В., Pfleiderer K„ Hillen W. (1991) Amino acids determining operator binding specificity in the helix-turn-helix motif of TnlO Tet repressor. EMBO J., V. 10, P. 4145-4152.

161. Yamaguchi, A., N. Ono, T. Akasaka, T. Noumi, and T. Sawai (1999) Metaltetracycline/ II antiporter of Escherichia coli encoded by a transposon, Tn/0. J. Biol. Chem., V. 265, P. 15525-15530.

162. Yamaguchi, A., T. Udagawa, and T. Sawai (1999a) Transport of divalent cations with tetracycline as mediated by the transposon Tn/O-encoded tetracycline resistance protein.J. Biol. Chem., V. 9, P. 4809-4813.

163. Yamazaki, H., Y. Ohnishi, and S. Horinouchi (2000) An A-factor-dependent extracytoplasmic function sigma factor (aAdsA) that is essential for morphological development in Streptomyces griseus. J. Bacleriol., V. 182, P. 4596-4605.

164. Yamazaki, M., Y. Ikuto, A. Ohira, K. Chatcr, and II. Kinashi (2003) Limited regions of homology between linear and circular plasmids encoding methylenomycin biosynthesis in two independently isolated streptomycetes. Microbiology, V. 149, P. 1351-1356.

165. Yamazaki, H., Y. Takano, Y. Ohnishi, and S. Horinouchi (2003a) amfR, an essential gene for aerial mycelium formation, is a member of the AdpA regulon in the A-factor regulatory cascade in Streptomyces griseus. Mol. Microbiol., V. 50, P. 1173-1187.

166. Yanish-Perron С., Viera J. and Messing J. (1985) Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13 mpl8 and pUC19 vectors. Gene, V. 33, P. 103-119.

167. Yu EW, Aires JR, Nikaido II. (2003) AcrB multidrug efflux pump of Escherichia coli: composite substrate-binding cavity of exceptional flexibility generates its extremely wide substrate specificity./Bacteriol., V. 185, P. 5657-64.

168. Yu EW, McDermott G, Zgurskaya III, Nikaido H, Koshland DE Jr. (2003a) Structural basis of multiple drug-binding capacity of the AcrB multidrug efflux pump. Science, V. 300, P. 976-80.

169. Zhao J, Aoki T. (1992) Nucleotide sequence analysis of the class G tetracycline resistance determinant from Vibrio anguillarum. Microbiol Immunol., V. 36, P. 1051-60.

170. Zheng M, Doan B, Schneider TD, Storz G. (1999) OxyR and SoxRS regulation of fur./ Bacteriol., V. 181, P. 4639-43.

171. Бицаев A.P. и Езепчук Ю.В. (1987) Молекулярная природа патогенного действия, вызываемого Bacillus cereus. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол., N 7, С. 18-23.

172. Гавриленко И.В., Байда Г.Е., Карпов А.В., Кузьмин Н.П. (1993) 11уклеотидная последовательность генов фосфолипазы С и сфингомиелиназы Bacillus cereus ВКМ-В164. Биоорганическая химия, Т. 19, С. 133-138.

173. Гловер Д. (1988) Клонирование ДНК. Методы. Мир, Москва, 538 с. (перевод с английского).

174. Зайцев Е.П., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин II.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. (1986) Клонирование и секвенирование гена гесА из штамма Pseudomonas aeruginosa. Генетика, Т. 22, С. 2721-2727.

175. Козырев Д. II., Васинова Н. А. (2004) Роль железорегулирусмых ге-нов в надменности бактерий. Цитология, Т. 46, С. 465—473.

176. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С., Холодилов II.Г. и др.( 1990) Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука, Новосибирск, 248 с.

177. Автор крайне благодарна своему наставнику Будариной Жанне Игоревне за совместную работу на начальных стадиях исследования, многолетнюю моральную и интеллектуальную поддержку, а также за помощь в написании этой работы.

178. Автор выражает признательность Ковалевскому Олегу за плодотворную совместную работу и помощь в создании модели взаимодействия HlyllR с оператором, Северинову Константину за решающее участие в подготовке совместной публикации.

179. Искренняя благодарность Захаровой Марине Викторовне за моральную поддержку, бесценные советы при освоении методик и любезно предоставленные препараты РНК-полимеразы Е. coli и В. cereus.

180. Хотелось бы отдельно поблагодарить всех сотрудников нашей лаборатории за ту необыкновенную атмосферу в коллективе, делающую работу в нем настолько приятной и плодотворной.

181. Отдельно хотелось бы поблагодарить Смолихину Татьяну Ивановну за внимательное отношение и четкую организацию при защите этой работы.

Информация о работе

Родикова, Екатерина Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Регуляция транскрипции гена гемолизина II Bacillus cereus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы