Регуляция экспрессии генов пороформирующих токсинов B. cereus

Шадрин, Андрей Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция экспрессии генов пороформирующих токсинов B. cereus
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии генов пороформирующих токсинов B. cereus"

На правах рукописи

Шадрин Андрей Михайлович

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПОРОФОРМИРУЮЩИХ ТОКСИНОВ В. СЕКЕиЯ

03.01.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ЛЕК 2010

Москва-2010

004616209

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино и в лаборатории молекулярных механизмов транскрипции прокариот Института микробиологии им. Ваксмана, г. Пискатавэй, шт. Нью Джерси, США.

Научные руководители: доктор биологических наук

Северинов Константин Викторович

кандидат биологических наук Солонин Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук

Озолинь Ольга Николаевна

кандидат биологических наук Кошелева Ирина Адольфовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится ^ декабря 2010 года в Н часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук /Р у* /У - Л.С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. По данным организации «European Food Safety Authority» Bacillus cereus является четвертой по распространенности причиной пищевых отравлений. Вид Bacillus cereus входит в состав группы В. cereus представителями которой являются В. anthracis, вызывающий сибирскую язву; В. thuringiensis, продуцирующий параспорапьные кристаллы токсина, действующего па определенные виды насекомых, и, сравнительно недавно охарактеризованный как отдельный психротолерантный вид, В. weihenstephanensis. Бактерии этой группы широко распространены в природе и часто встречаются в почве. Гены, предающие специфические свойства В. anthracis и В. thuringiensis, локализованы на макроплазмидах. Однако отдельно взятый штамм представителя группы В. cereus может синтезировать до десятка токсинов, гены которых расположены на бактериальной хромосоме. Некоторые из этих токсинов могут вызывать тяжелые отравления у людей, в том числе - со смертельным исходом. Особый интерес вызывают два пороформирующих токсина - гемолизин II и цитотоксин К. Аминокислотная последовательность гемолизина II сходна с последовательностью цитотоксина К (37% идентичности). Оба токсина относятся к семейству Р-складчатых пороформирующих токсинов. К другим представителям этого семейства относят а-гемолизин, лейкоцидины, у-гемолизин Staphylococcus aureus и р-токсин Clostridium perfringens. Однако регуляция экспрессии генов гемолизина II и цитотоксина К осуществляется независимо. Ген цитотоксина К находится под контролем транскрипционного активатора PlcR, включающего экспрессию большинства токсинов В. cereus по механизму «чувства кворума» («quorum sensing»), в то время как экспрессия гемолизина II репрессируется транскрипционным регулятором HlyllR.

Дня того чтобы обеспечить быстрое переключение экспрессии генов в ответ на изменение условий внешней среды, активность РНК-полимеразы строго контролируется. Стадия инициации транскрипции является главным этапом контроля регуляции генной экспрессии. Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами генов и влияния на это взаимодействие транскрипционных факторов является важнейшей задачей молекулярной биологии, позволяющей определить механизмы реализации информации, заложенной в геноме организма. Большинство накопленных к настоящему времени данных, описывающих инициацию транскрипции, базируются на результатах, полученных на моделях РНК-полимераз Я coli и Thermits thermophilus, молекулы которых имеют ряд существенных структурных и

функциональных отличий от РНК-полимераз микроорганизмов группы В. cereus. Понимание механизмов регуляции экспрессии, в особенности, генов токсинов Bacillus cereus и детальное изучение взаимодействия РНК-полимеразы с их промоторами, несомненно, представляют интерес для молекулярной биологии. Актуальность исследования регуляции генов токсинов бактерий рода Bacillus не вызывает сомнений. Более того, впоследствии, результаты исследований могут послужить основой для создания новых лекарственных препаратов используемых при терапии инфекционных заболеваний.

Цели и задачи исследования:

Целью данной работы являлось изучение особенностей механизма регуляции генов пороформирующих токсинов гемолизина II и цитотоксина К у микроорганизмов группы В. cereus. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Оценить разнообразие и особенности распределения аллелей генов цитотоксина К, гемолизина II и его транскрипционного регулятора hlyllR в большой популяции штаммов В. cereus, выделенных из различных природных источников.

2) Охарактеризовать взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами генов гемолизина II, цитотоксина К, plcR и papR.

3) Определить для генов цитотоксина К и гемолизина II этапы транскрипции, на которые влияют HlyllR и PlcR.

Научно-практическая значимость работы. Представленная работа является частью серии работ, направленной на исследование регуляции инициации транскрипции у грамм-положительных микроорганизмов. Используемый в данной работе метод стабилизации открытого комплекса с помощью нуклеотидов позволяет

четко отслеживать механизм инициации транскрипции для промоторов с коротким (несколько секунд) временем полураспада открытого комплекса. Предложенный вариант анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена цитотошша К может быть использован при разработке тест-систем, позволяющих детектировать штаммы, несущие смертельно опасный для человека аллель cytKI гена цитотоксина К. При моделировании регуляции экспрессии гена гемолизина II был создан штамм В. subtilis - суперпродуцент гемолизина II, который может послужить прототипом для суперпродуцентов других пороформирующих токсинов. Полученные в ходе данного исследования результаты имеют несомненное практическое значение и могут с успехом найти применение, как в медицинской диагностике, так и послужить основой для дальнейших научных исследований регуляции экспрессии генов Bacillus cereus.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: на 10-, 11-, 12-, 13- и 14-ой Международных Путинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 2006 - 2010; CSHL Meeting on Molecular Genetics of Bacteria and Phages, Cold Spring Harbor, NY, August 20-24, 2008; International Conference on Gram-positive Pathogens. Omaha, NE, October 5-8, 2008; International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld 2009), 2009; ежегодных институтских конференциях ИБФМ РАН, где в 2008 и 2009 годах была отмечена призовыми местами, и в 2009 - премией Г.К. Скрябина.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на _ страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 178 наименований. Работа содержит 18 рисунков и 5 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды для экспрессии белков Р1сЯ В. сегеиз АТСС 4342, КроА(«'1) В. зиЫШз ВЭ170, ЯроА(ДбО) В. хиЬШи В0170 и SigA В. сегеш АТСС 4342 были получены путем клонирования участков ДНК, кодирующих соответствующие гены, амплифицированных методом ПЦР. Плазмида для экспрессии Н1уШ1 на основе рЕТ28Ь

была любезно предоставлена Олегом Ковалевским. В качестве PapR, лиганда PlcR, использовали химически синтезированный пептид H-LPFEH-OH. РНКП Bacillus subtilis была очищена из штамма Bacillus subtilis BD170 методом, описанным Хелманном (Helmann, 2002). РНКП Е. coli дикого типа и РНКП Е. coli без С-концевых доменов а-субъедшшц, была любезно предоставлена Екатериной Богдановой. Для рутинного клонирования использовались штаммы Е. coli XLlblue, DH5a, JM109, JM110. Для экспрессии белков использовались штаммы Е. coli BL21(DE3), Tuner(DE3) pLysS. Для определения распространенности и разнообразия генов токсинов и регулятора HlyllR использовалась 40 штаммов представителей группы В. cereus из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов. В качестве матриц для транскрипции in vitro и футпринтинга использовались линейные молекулы ДНК промоторов, синтезированные методом ПЦР: MyII370 [-172/+108; -119/+89]; hlyII771 [-204/+108; -151/+89]; cytK [-66/+132; -66/+88]; papR [-326/+100; -193/+100]; plcR [-145/+143; -101/+143]; Т7А1 [-105/+77]. В скобках указано положение концов фрагмента ДНК относительно сайта старта транскрипции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка разнообразия и особенностей распределения генов пороформнрующнх токсинов цитотоксина К, гемолизина II и его регулятора.

Для оценки разнообразия генов было решено сопоставить сходство штаммов, определенное ПЦР фингерпринтным методом (Reyes-Ramirez and Ibarra, 2005), со сходством кодирующей области генов токсинов, определенным методом Полиморфизма Длины Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ). Было проанализировано 40 штаммов, представителей группы В. cereus, обнаруженных на территории стран СНГ на протяжении всего XX века. Штаммы были взяты из Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ).

При анализе ПЦР фингерпринтов на электрофореграмме выявлялось от 4 до 17 амплифицированых фрагментов ДНК длиной от 500 пн до 4000 пн (не показано). Среди 40 фингерпринтов насчитывалось 39 продуктов ПЦР с отличимой молекулярной массой. Каждый продукт считался отдельным таксономическим признаком. Штаммы со сходством более 70% были объединены в кластеры «А», «В», «С», «D» (см. рис. 1а). Каждый кластер содержал от 4 до 8 штаммов. В целом, распределение штаммов по кластерам на основании ПЦР фингерпринтов не всегда совпадало с данными об их видовой принадлежности. Подобная ситуация наблюдалась и при использовании

других методов типирования. Так, например, при использовании метода Мультилокусного Секвенационного Типирования (МЬБТ) значительная часть штаммов, ранее охарактеризованных как В. сегеш, группировалась со штаммами В. г/ги/7/!£/'елга (Ко е! а1, 2004).

(Ь) (с) (d)

Ctc(l)'

Рнс. 1. (а) Дендрограмма, отображающая результаты кластерного анализа группоспецифических фингерпрингов штаммов. Справа напротив коллекционных номеров штаммов, указаны группы последовательностей промоторов hlylly ПДРФ-группы генов cytK и hlyUy а также наличие генетической детерминашы hlylIR. Далее, в колонке "психротолерантность", указана минимальная температура, при которой наблюдается рост соответствующего штамма. Буквами «А», «В», «С» и «D» обозначены выделенные нами ПЦР кластеры. «-» обозначает отсутствует гена, «+» - наличие гена, «н.а.» - наличие гена не анализировали. (Ь, с) Дендрограммы, отображающие сходство генов hlyll (с) и cyiK(b) по данным ПДРФ анализа. Для ПДРФ-анализа использовались эндонуклеазы рестрикции AluI, Sau3AI и Rsal. В скобках, за названием группы, указано количество штаммов имеющих обозначенный тип гена. Помимо указанных штаммов в состав групп входили аллели cytK: С lb: cytK В. thuringiemis шт. 97-27, cytK-2 В. cereus ATСС 10987, cytK-2 В. cereus шт. 23, cytK-2 В. сегеш шт. FM-1; Clc: cylKB. cereus шт. E33L; СЗа: cyiK-2 В. cereus АТСС 14579т; СЗЬ: cytK-2 В. cereus шт. 1230-88; cytKI: cytK-I В. cereus шт. 391-98 и аллели hlyll: Н2: В. cereus АТСС 14579т, В. thuringiensis шт. 97-27; Н4: В. anihracis nrr.'Ames Ancestor', В. anthracis шт. Ames, В. anihracis шт. Sterne, В. cereus шт. E33L. (d) Дегдрограмма отображающая сходство последовательности участков разделяющих кодирующие области генов N-acetylmuramoyl-L-alnine amidase и hlyll, содержащий промотор гена гемолизина II.

Методом ПЦР гены гемолизина II и его регулятора были выявлены у 56% проанализированных штаммов, а ген цитотоксина К - у 61%. В исследованной ранее коллекции клинических и ассоциированных с пищевыми отравлениями изолятов гены cytK и hlyll были выявлены у 45% и 21% штаммов, соответственно (Fagerlund et al, 2004). Вероятно, что относительно высокая частота встречаемости анализируемых р-ПФТ в нашей коллекции обусловлена спецификой источников выделения штаммов. Так, значительная часть микроорганизмов, использованных в нашей работе, была выделена из почвы и насекомых.

Вполне ожидаемая закономерность прослеживается между частотами встречаемости генов гемолизина II и его регулятора hlyllR. Так у всех 15 штаммов, не содержащих ген hlyll, не обнаруживался и ген MylIR, а у 21 штамма детектировались оба гена одновременно. Такой характер распределения генов hlyll и hlyllR у штаммов В. cereus обусловлен близким расстоянием (около 300 пн) между этими генами, что, в свою очередь, повышает вероятность одновременного участия их в рекомбинационных событиях или совместной передачи при горизонтальном переносе генов.

Анализ Полиморфизма Длин Рестрикционных Фрагментов (ПДРФ) cytK и

hlyll

Специфические ампликоны длиной 813 пн генов цитотоксина К были получены для 23 (57.5%) из 40 протестированных штаммов. Кроме того, проведен анализ 8 вариантов гена cytK, имеющихся в GenBank. Проанализированные штаммы были разделены на 10 групп по типам ПДРФ генов cytK. В каждую группу входили от 1 до 11 штаммов (см. рис. Ib). Гены, ранее идентифицированные как cytK2, вошли в группы С Ib, СЗа и СЗЬ. В 23 проверенных нами штаммах не обнаружено генов цитотоксина К, сходных со смертельно опасным cytKl. Наиболее близкие к аллелю cytKl - cytK группы генов С1а отличались от него по 8 из 15 сайтов рестрикции (53%), а от ранее описанных генов cytK2 - лишь на I из 15 сайтов рестикции (6.8%). Таким образом, все протестированные гены cytK следует рассматривать как варианты менее опасного для млекопитающих цитотоксина К2. Поскольку предложенный нами метод ПДРФ позволяет различить аллели cytKl и cytK2 по 8-ми признакам (сайтам рестрикции), он может быть использован как надежный тест для выявления смертельно опасных штаммов, обладающих редким аллелем cytKl.

Фрагменты гена hlyll были амплифицированы с помощью праймеров HF2 и HR2 у 56% штаммов. Все продукты ПЦР имели размер, соответствующий расчетному - 955

пн. Анализ последовательностей ЫуП из ОепВапк позволил использовать для исследования еще семь вариантов гена ЫуП. По результатам анализа ПДРФ генов ЫуП 28 штаммов были объединены в 5 групп (см. рис. 1с). Полученные группы содержали от 2 до 12 штаммов. Отметим, что гены штаммов В. амИгаш, несущие мутацию сбивки рамки считывания, и полноценные гены В. сегеиз ЕЗЗЬ и ВКМ В-771, нуклеотидные последовательности которых доступны в СепВапк, группировались в один кластер Н4, а В. сегеих АТСС 14579т, В. шт. 97-27 - в кластер Н2.

Штаммы с генотипами ЫуП* и су1К* не формировали четких кластеров (см. рис. 1а). Отсутствие корреляции между филогенетическим положением штаммов и их кластеризацией, основанной на наличии и полиморфизме определенных генов токсинов и их регуляторов, является характерным для представителей группы В. сегеж. Например, филогенетическая взаимосвязь штаммов, основанная на \1LST консервативных генов, не совпадает с кластеризацией штаммов, основанной на последовательности ркЯ. - гена, кодирующего транскрипционный активатор факторов патогенности микроорганизмов группы В. сегеш. Соответствие классов совместимости «чувства кворума» для пар ркН-рарИ. так же не совпадает с филогенетическим положением штаммов, определенным методом МЬБТ. Все вышеперечисленные особенности обусловлены панмиктическим характером популяции В. сегем.

Внутри выделенных кластеров «А», «В», «С» и «И» (см. рис. 1а) микроорганизмы обладали одинаковыми типами генов ЫуП и су1К. Однако в ПЦР-фингерпринтных кластерах присутствуют штаммы без этих генов. Так в кластере «В» гены су(К отсутствуют у 3 из 8 штаммов, а гены ЫуП отсутствуют у штамма ВКМ В-13 в кластере «Э» и АТСС 35646 в кластере «В». Полученные данные свидетельствуют, скорее всего, об утере генов в предшествующих поколениях, но предполагают их наличие у предка группы.

Гемолизин II - основной гемолизин В. сегеиз разрушающий эритроциты человека, при отсутствии контроля Н1у1Ш

Как известно, штаммы В. сегеш секретируют около десятка белков, проявляющих Гемолитическую Активность (ГА). Именно поэтому сложно оценить индивидуальный вклад каждого токсина в общую ГА, наблюдаемую в культуре клеток. Для того чтобы определить вклад гемолизина II в общую ГА, ген ЫуП и его регуляторные элементы были интегрированы в локус атуЕ хромосомы штамма В. виЫШз ВБ170. В. ¡иЫШз ВБПО не проявляет ни гемолитической, ни циготоксической

Phly 11771

■i'iilM)—"CmRl-

EH2R

Phlyll771

—(CroR

10000

1000

ШШ B. subtilis EH2R ^"H B. subtilis EH2 1-771

2.5 5 7.5 10 16

Время, часы

Рнс. 2. Экспрессия гена гемолизина II в В. subtilis. Зоны гемолиза оставляемые штаммами ЕН2 и EH2R на чашке с кровяным агаром после 17 часов (а) и 25 часов (Ь) инкубации, (с) Схема конструирования рекомбинантных штаммов ЕН2 и EH2R. (d) Изменение гемолитическая активность штаммов в ходе роста культур.

внеклеточных активностей и имеет сходные с В. cereus процессы регуляции транскрипции, трансляции и белковой секреции. Следовательно, В. subtilis может служить удобным модельным организмом для изучения экспрессии генов гемолизинов, в частности hlyll.

Было создано два штамма В. subtilis: ЕН2, несущий ген гемолизина И; и EH2R -содержащий тандемно расположенные гены hlyll и hlyllR - ген регулятора гемолизина II (см. рис. 2с). В полученных штаммах гемолитическая активность детектировалась только в культуральной жидкости, но не в клеточных экстрактах, как это происходило при экспрессии hlyll в Е. coli.

Эффекты, связанные с наличием гена гемолизина II, были протестированы на чашках с кровяным агаром. Оба полученных штамма проявляли гемолитическую активность, однако активность штамма ЕН2 была выше. Зоны гемолиза ЕН2 можно было детектировать раньше, чем бактериальные колонии становились видимыми невооруженным глазом (рис. 2а,Ь). Секретируемая гемолитическая активность была измерена на протяжении всех фаз роста культуры. Для штаммов В. cereus ВКМ В-771 и ЕН2 наблюдался сходный характер изменения ГА, с максимумом в конце

экспоненциальной фазы (30 и 1500 ед./А600 соответственно), и последующим постепенным уменьшением в стационарной фазе. Кинетика экспрессии гена ЫуП в культуре штамма ЕН211 отличалась более поздним достижением максимальной ГА (7 ед./АбОО), которая наблюдалась в начале стационарной фазы. Максимальный уровень экспрессии гемолизина II в штамме ЕН2 в 200 раз выше, чем в ЕН2Я, и в 50 раз превышает ГА родительского штамма В. сегеш ВКМ В-771, вклад в которую также вносят и другие пороформирующие токсины Эти результаты являются первым доказательством того, что в случае утраты контроля Н1у11К над экспрессией гемолизина II гемолитическая активность, разрушающая человеческие эритроциты, главным образом, представлена гемолизином II.

Аллель гена гемолизина II с л слепней 32 нуклеотпда в промоторной области.

При секвенировании промоторных областей гена гемолизина II у 23 микроорганизмов группы В. сегеш был обнаружен новый аллель ЫуП с делецией от -29 до -60 (32 пн) нуклеотида относительно ранее определенного старта транскрипции для промотора В. сегеш ВКМ В-771 (Рыупт)- Деления в этом районе затрагивает участки, с которыми взаимодействуют РНК-полимераза и Н1у11Я (см. рис. За) (ВЫаппа ег а!, 2004). Таким аллелем обладали 4 из 23 (17%) проанализированных штаммов.

Были определены последовательности генов ЫуП и Ыу1Ш штамма В. сегеия ВКМ В-370. Оба гена не содержат мутаций сбивки рамки считывания, а длина их кодирующих областей совпадает с ранее описанной для ЫуП и ЫуПЛ штамма ВКМ В-771. Ген гемолизина II В. сегеиз ВКМ В-370 (с делецией в области промотора -29..-60) был введен в штамм В. ¡иЫШз на плазмидном векторе. Наличие гена Ыу11370 предавало трансформированному штамму В. зиЫШз гемолитический фенотип. Также гемолитическая активность детектировалась в супернатанте культуральной жидкости (32-64 гемолитических единицы).

Для определения уровня экспрессии двух аллелей промоторы гемолизина II штаммов В. сегеиз ВКМ В-370 и ВКМ В-771 были транскрипционно слиты с открытой рамкой считывания Р-галактозидазы и введены в В. зиЬШк в виде производных плазмиды рНТ304-^. Активность р-галактозидазы в случае Ршт: составляла 21000±6000 ед. Миллера, а в случае ?мупт ~47±20 ед. Более чем стократная разница активности промоторов говорит о важности взаимодействия РНК-полимеразы с участком -29...-60 для обеспечения эффективной экспрессии ЫуП.

Для проверки этой гипотезы была создана серия укороченных вариантов промотора Vhiyii77i (см. рис. За). При их анализе методом транскрипции in vitro количество продуктов образующихся с Рыу/77/-30, содержащего только «-10» элемент, и Vhiyimi-40, содержащего «-10» и «-35» элементы, значительно ниже, чем с промоторов

(а)

HlyllR

•-60

'-SO

'-40

•-30

АЛАСAAGAATTTTAAATATATATTTAAAATTCTTGTTTXAAГС

TTTA А AC АА ТA ATTTT- ----------------------------

^TTTAAACAAGAATTTTAAATATATATTTAAAATTCTTGTTTAAA

..........A A AT ATATATTTАА А АТТС TTGTTTА А А Г«

........................А АТТС TTGlTTAАА

..................................ТАААГ<

'СОТТАТК ТАТГ •CGTTATTC "CGTTATTC •CGTTATTC •CGTTATK

-10

»+1

«+10

•GTCTTTTAA7 * ATATTGATA ATAGTTATCACTAA AOA "ATGTTTT AAT k TT АТТС ATAATAGTTA ТС A ATA ATAG "GTGTTT TAAI У ATATTOATAATAGTTATCAGTAA AGA 'GTGTTTTAA"! UTATTGATAATAGTTATCAGTAAAC.A 'GTGTTTTAAT i.ATiTTGATAATAGTTATCAGTAAAGA GTGTTrrAATtAATATTGATAAtAGTTATCAGTAAAOA

(b)

LtlL

-30 "to -5-1 •?«■ -20«) -172

(C)

(d)

i—30

Piic. 3. Организация промоторов гена гемолизина II и их взаимодействие с РНК полимеразой. (а) Структурная организация двух аллелей Phiyimi и Phiyii37o промоторов гена гемолизина II. В скобках, за названием промотора указано количество выявленных штаммов обладающих этим аллелем. Ниже приведены последовательности укороченных вариантов промотора Рмути* Рамками обозначены «-10 удлиненный» элемент и участок, защищаемый HlyllR от ДНКазы I, одновременно представляющий собой инвертированный палиндром длиной 44 пн. Серым цветом выделены консервативные для всех определенных 23 последовательностей нуклеотиды. (Ь) Влияние ДНК локализованной позади «-35» элемента промотора на эффективность абортивной транскрипции in vitro с укороченных промоторов гена гемолизина II. Расстояние между сайтом старта транскрипции и задними концами ДНК-ДНК дуплексов указано над треками. Использована РНКП В. subtilis. (с) Футпринтинг а-субединцы РНКП В. subtilis при помощи ДНКазы1 на промоторе Рмути- «+» добавлена 4 мкМ а-субъединица. Черной линией указана область защиты ДНК, слева - расположение инвертированного повтора, (d) Влияние aCTD РНКП на однократную транскрипцию in vitro с ^uyimi и РыуЛ37о осуществляемую РНКП E.coli без aCTD (треки 1-3) с aCTD (дорожки 4-6). Дорожки 1, 4 промотор Рыупт, дорожки 2, 5 - ^мучпи дорожки 3, 6 - промотор Т7А1.

укороченных до -54, -78 и -204 позиции заднего дуплекса ДНК (см. рис. ЗЬ). Известны случаи, когда РНКП способна взаимодействовать с ДНК промотора локализованной выше «-35» элемента, так называемым UP-элементом, формируя контакты посредством aCTD. ДНК в районе -35/-90 Рмупт содержит более 90% пар аденин-тимин, что также характерно для элементов промотора взаимодействующих с aCTD РНК-полимеразы. Следовательно, можно выдвинуть предположение о наличие UP-элемента у Рыуипи делеция которого, в случае ?hiyii37o, приводит к нарушению контактов с aCTD.

ДНКазный футпринтинг a-субъединицы РНКП В. subtilis (см. рис. Зс) выявил участок экранирования ДНК Рмути в районе -30/-65. Обычно длина участка,

защищаемого aCTD, равна приблизительно двум виткам ДНК, а сам участок локализован в районе -45А65. Обширную зону защиты от ДНКазы I в случае Vuyimi можно объяснить наличием в инвертированном повторе длиной 44 пн дополнительного противонаправленного сайта для a-субъединицы, с которым она может взаимодействовать, поскольку в отличие от целой молекулы РНКП не фиксирована на «-10» элементе промотора. Относительно высокая транскрипционная активность в случае Vhiyiim укороченного до -54 позиции, по-видимому, обусловлена его взаимодействием с aCTD-I РНКП. Вероятно, этого взаимодействия достаточно для увеличения эффективности инициации.

Поскольку за взаимодействие РНКП с UP-элементом отвечает aCTD, мы использовали РНКП Е. coli, содержащую мутантную a-субъединицу, без С-концевого домена. На рисунке 3d представлен радиоавтограф продуктов однократной транскрипции in vitro полученных РНК-полимеразой Е. coli, лишенной (дорожки 1-3) и содержащей aCTD (дорожки 4-6). В случае контрольного промотора Т7А1 бактериофага Т7, не содержащего классического UP-элемента, продукты транскрипции видны обоих типов РНКП. Однако в случае промоторов гена гемолизина II продукты транскрипции детектируются лишь для интактной РНКП и Yhiyimi, но не Yhiyiim-

Эти наблюдения подтверждают гипотезу о важной роли UP-элемента в экспрессии гена Му11771.

Особенности Транскрипционных Комплексов (ТК) формируемых РНКП Bacillussubtilis на промоторах гена гемолизина II в ходе инициации транскрипции.

Ранее было показано, что Открытый Комплекс (OK) образуемый РНКП Е. coli на промоторе Vhiyimi не разрушался при добавлении гепарина (100 мкг/мл) и мог быть легко детектирован методами задержки в геле и фугпринтинга с использованием ДНКазы I или KMn04 (Budarina et. al, 2004). При использовании РНКП В. subtilis, для промотора гена гемолизина 11, введение гепарина (4 мкг/мкл) приводило к полной остановке реакции абортивной инициации (не показано). РНКП бацилл, в отличие от РНКП Е. coli, образует короткоживущие открытые комплексы на большинстве промоторов (Whipple and Sonenshein, 1992, Artsimovitch et. al., 2000). Это явление обусловлено структурным отличием РНК-полимераз, а именно отсутствием ß'-SI3 домена в РНКП В. subtilis. Свойства РНКП Е. coli, с делецией ß'-SI3 домена (Ecß'A(943-1130)), или примыкающего к нему домна ß'-челюсти (jaw, Ecß'A(l149-1190) по многим параметрам напоминают свойства РНКП В. subtilis. Делеция домена ß'-челюсти не

является летальной для Е. coli, однако приводит к значительным изменениям в регуляции транскрипции большого числа генов, опосредованных дестабилизацией OK (Ederth et al., 2002; Atrtsimovitch et al., 2003).

(a)

=3 э

« 4 i <

£ 0 0 О

m щ Щ' ff

— ifi- «tft

(d)

h- К w !* ~ •

i'« » # S1

1 ? * £ «

(b)

+G*A K3pA+U+A »G+A+U Гv Ц *

1/3 0 1/3 5 15 0 1/3 5 15 0 1/3 5 15 -»25 Ц M. Ц

(c)

-.13

♦ * * § « . -

g Ш fc Ш •

p»

-♦26

(e)

TK-2

TK-7

TK-12

TTTAATAATATT

kACAAGAATTTTAAATATATATTTAAAATTCTTGTTTAAATCGTTATTCTG-TGT GA TAA TAGT TATCAGTAAA GA AGA CATCGAAATTA

ТТСТТСГ7АЛААТ1ТАТАТАТАААТТПАЛСААСАААТТТАССААТААЬАСЛСА т тт г СТАТТАТСААТАСТСАТТ7СГТСГСТАСС7ТТАА7

АААТ TAT ТАТАА

i Т ТААТАА TAT Т(>А ТА

ААСААСААТТТТАААТАШСТГТЗиААТТСТТОТТТАААТСОТТАГТСГбТОТж А АЛ A АТЛ8ТТ А Т CAGTAAAGAAGA&AТG(¡АААТ Т А

TTGTTCTТАЛА АТТ ТАТАТАTAAAT TT Т ААСААСАЛАТ ТТАGСААТААGAСАСА » т» т тГАТСААТАСТСАТТТСТТеТСТАССТТТААТ

..............................................И АААТТАТТАТААСТАТ

1>ррСА

AATATTGATAATAGTT

AACMGAATTTTAAATATATATTTAAAATTCTTGTTTAAATCGTTATTCrCTßTTTTAAT A A a a aATCAGTAAACAAOAGATGGAAATTA TTGTTCTTAAAATTTATATATAAATTTTAAGAACAAATTTAGCAATAAGACACAAAATTA»t ? г TAGTCATTTCfТСТСТАССТТТААТ

М ТТАТААСТАТТАТСАА

___GAUAAUA_

TTGATAATAGTTATCA

ААСААСААТТТТАААТАТАТАТТТААААТТСТТОТТТАААТСГгТТАТТСТСТОТТТТААТААТААЛ * J. GTAAAGAAGAGÄTßGAAATTA

ГТОТТСГТАЛЛАГТТАТЛТЛТААЛТТТТАЛВАЛСАЛАТТТАССААТЛАСЛСЛСААЛАТТАТТАТ 1 тСАТТТСТТСТСТАССТТТААТ

AACTATTATCftATAGT ppgUAUAAUAGUUAUCA

Рис. 4. Свойства комплексов РНКП-промотор, образующихся в ходе инициации транскрипции, (а)

J 00 мкМ нтф увеличивают количество продуктов при однократной транскрипции in vitro, (b) Кинетика диссоциации стабилизированных Транскрипционных Комплексов (ТК). Остаточное количество ТК выявлено методом однократной транскрипции, (с, d) Футпринтинг РНКП и ТК формируемых на промоторе Рhiyimi с помощью КМпОа и ДНКазы I, соответственно (слева - матричная цепь; справа -нематричная цепь), (е) Общая схема. Черной полосой указаны зоны защиты ДНК промотора до ДНКазы

I. Черными треугольниками - сайты чувствительности к КМ1Ю4.

Инициацию транскрипции можно подразделить на несколько стадий: образование Закрытого Комплекса (ЗК), образование Открытого Комплекса (ОК), стадию абортивной инициации, и завершающую стадию - покидание РНК-полимеразой промотора - образование Элонгационного Транскрипционного Комплекса (ЭТК). Введение неполного набора нуклеотидов, на стадии формирования Транскрипционного Комплекса (ТК), позволяющих РНК-полимеразе начинать синтез молекулы РНК на промоторах ?ыуШ70 и Vhtyimi приводило к увеличению количества полноразмерных продуктов однократной транскрипции in vitro (рис 4а). Такой эффект достигается в присутствии нуклеотидов GTP+ATP, GpA+UTP+ATP и GTP+ATP+UTP, что можно объяснить образованием дополнительных комплексов, содержащих молекулы РНК длиной до 2 нт (ТК-2), 7 нт (ТК-7) и 12 нт (ТК-12) соответственно. При проверке устойчивости этих ТК к гепарину выяснилось, что комплексы, формирующиеся в присутствии вышеуказанных смесей НТФ, отличаются от ОК более длительным временем полураспада (рис 4Ь).

Транскрипционные комплексы, стабилизированные за счет образования РНК-ДНК гетеродуплексов, оказалось возможным охарактеризовать при помощи КМ11О4 и ДНКазного футпринтинга (см. рис. 4(с-е), рис. 5f). Задняя граница транскрипционного пузырька в ТК-2 совпадает с задней границей в ОК, в то время как передняя граница продвигается вперед до +4 нуклеотида, что отражает появление 2 пн РНК-ДНК гетеродуплекса. По сравнению с ТК-7 и ТК-12, ТК-2 демонстрирует наиболее длинную (-64/+20) зону защиты от ДНКазы I, и участок гиперчувствительности в позиции -39 матричной цепи. Такое расположение зон футпринтинга характерно для ОК и ТК находящихся на стадии абортивной Инициации (ИТК). Зоны защиты ДНК лежащей позади сайта инициации транскрипции одинаковы для ОК и ИТК, поскольку до перехода в стадию элонгации контакты между задним ДНК-ДНК дуплексом и РНКП не изменяются (Revyakin et. al, 2006; Kapanidis et. al, 2006). Внутри зоны защиты ТК-2 детектируется область, соответствующая позиции отдельно взятой а-субъединицы в районе -55/-64 (см. рис. 4е, рис. Зс).

В ТК-7 происходит сдвиг границ области чувствительности к КМпОа транскрипционного пузырька и сокращение участка защиты от ДНКазы I до ~40 пн. Перемещение задней границы транскрипционного пузырька можно трактовать как ей схлопывание, что в совокупности с потерей контактов с задним ДНК дуплексом говорит о превращении транскрипционного комплекса в элонгационный (Hsu, 2002). Однако ТК-7 обладает сравнительно небольшим периодом полураспада (-15 мин), что

нехарактерно для элонгационных комплексов. С другой стороны, длина молекулы РНК в ТК-7 составляет всего 7 нт. Вероятно, РНК-ДНК гетеродуплекс длиной 7 пн может диссоциировать, что приводит к образованию тупикового комплекса, который, поскольку короткая мРНК, может самостоятельно покидать активный центр, постепенно распадается на молекулы РНКП и ДНК промотора. Таким образом, ТК-7 вернее будет рассматривать как переходное состояние ИТК-ЭТК.

При образовании ТК-12 происходит дальнейшее перемещение вперед зон чувствительности к КМпС>4 и ДНКазе I. Период полураспада ТК-12 превышает 15 минут. Таким образом, параметры ТК-12 соответствуют характеристикам элонгационных комплексов.

Итак, в присутствии 100 мкМ GTP и АТР образуется инициирующий ТК-2, с помощью которого можно моделировать ОК, а в присутствии 100 мкМ GpA, UTP, АТР и 100 мкМ GTP, АТР, UTP формируются соответственно переходный ИТК-ЭТК ТК-7 и элонгационный ТК-12 комплексы.

Влияние транскрипционного регулятора HlylIR на экспрессию гена гемолизина II.

Оператор HlylIR находится на 26 пн выше старта инициации транскрипции и совпадает с инвертированным повтором длиной 44 пн для Phiyimi- Несмотря на то, что инвертированный повтор содержит 3 сайга узнавания HlylIR, с оператором взаимодействуют только два димера регулятора (Rodikova et al., 2007). По результатам выравнивания нуклеотидных последовательностей регуляторных областей ?hiyimi и l'hiyiim можно передоложить, что Рыуппо сохраняет один потенциальный участок связывания HlylIR, соответствующий дистальному сайту ?ыупт (см. рис. 5а). В результате делеции 32 пн потенциальный оператор HlylIR в случае Рыупз7о располагается на один виток ДНК ближе к сайту инициации транскрипции проксимального оператора HlylIR Рhiyimi.

Для того чтобы определить действие HlylIR на транскрипцию hlyII77I и ЫуП370, в штаммы В. subtilis, содержащие соответствующие транскрипционно слитые промоторы гена гемолизина И с ОРС р-галакгозидазы, был введен ген hlylIR. Для этого участок гена hlylIR с его регуляторными областями был интегрирован в локус атуЕ. Активность р-галакгозидазы в штамме с ?htyim¡ после введения HlylIR снижалась приблизительно в 100 раз (рис 5Ь). Введение HlylIR в штамм, несущий Рыушт, не влияло на активность промотора гемолизина II in vivo. В экспериментах по задержке в

геле выявлено, что HlyllR не формирует специфические комплексы с Phiyimo-нромотором (рис. 5с). ДНКазный футпринтинг также не выявил зоны защиты HlyllR на Phiyii37o (не показано). HlyllR не оказывал влияния на транскрипцию in vitro с Рыуипо (см. рис. 5d).

(а)

HlyllR

771(19) 370 (4) Ohali

ТГГЛААСАЛОЛАТТТТАААТАТАТАТТТАЛААТТСТТСТТТЛА.'.

ТТТАА АС ЛА ТААТТТТТАТПТАТОТГГ-------------

ТТТАААСААОААТТТТАААТАТ_

(Ь) 100000 10000 1000

19397 • Л 47 46 I

Ш1

(с)

in пун.

S3 t 1Гй]= ils

WI37Û

3 ïï

нк _

ск -

(d)

1 РНКП HlyllR нет РНКП HlyllR нет

2 HlyllR РНКП РНКП HlyllR РНКП РНКП

ок ф

ТК-2 llilll .

ТК-12 lip Щ0 щ т, ,

(е)

(f) Е

= Л Сч1 Е

ÎÊei

% i «ï f 1 S

123 45 6 789

il 1

1 V

$--33

f «

—1 »

¡Ril

Рис. 5. Взаимодействие HlyllR с вариантами промотора гена гемолизина II. (а) Схема, демонстрирующая альтернативный вариант выравнивания промоторов гена гемолизина II Рыупт и Рыунло- «Ohal6> - олигонуклеотид минимального размера достаточный для связывания HlyllR (Rodikova et al, 2007). (b) Активность р-галактозидазы в штаммах несущих транскрипционно слитые промоторы РMyimi (столбцы 3, 4) и Рщило (1. 2), содержащие ген HlyllR (1, 3) и без него (2, 4). (с) Методом задержи в геле показано, что HlyllR формирует специфические комплексы только с Рщит. Над треками указана концентрация HlyllR, нМ; «СД» - свободная ДНК; «СК» - специфические комплексы; «НК» -неспецифические комплексы, (d) Влияние HlyllR на инициацию транскрипции на промоторах Рщит и РMyimi- Для получения транскрипционных комплексов ДНК промотора и нуклеотиды необходимые для формирования соответствующего комплекса инкубировали 5 минут с белком указанным в строке «1». Далее добавляли белок указанный в строке «2», продолжали инкубацию 5 минут и добавляли субстратную смесь нуклеотидов и гепарин. В результате определяли количество транскрипционных комплексов по количеству продуктов однократной транскрипции in vitro. Для выявления продуктов транскрипции каждого комплекса использована индивидуальная экспозиция, (е) Комплексы, формируемые HlyllR с РНК полимеразами, детектированные методом задержки в геле. Образцы содержали избыток HlyllR (дорожки 1-2, 4-5, 7-8) и РНК полимеразы Thermus thermophilics (дорожки 2, 3) В. subtilis (дорожки 5, 6) и Е. coli (дорожки 7, 8). (f) Комплексы, формируемые HlyllR, РНКП В. subtilis на промоторе Рhtyimi выявленные методом ДНКазного футпринтинга. Справа показана матричная цепь, слева - нематричная. Использовался Na-глутаматный буфер, время стадий инкубации с HlyllR, гепарином и ДНКазой I было сокращено до 10 секунд. Для формирования TK-2+HlyIIR HlyllR добавляли к заранее сформированному ТК-2. Белой полосой выделена зона защиты HlyllR, черной полосой - зоны защиты стабилизированной РНКП (ТК-2).

В случаях, когда РНКП добавлялась к заранее сформированному комплексу HlyIIR-Р/,¡утл, HlyllR уменьшал количество образуемых продуктов транскрипции даже в присутствии нуклеотидов позволяющих формировать более стабильные, чем ОК транскрипционные комплексы (см. рис. 5d). Однако когда HlyllR добавлялся к комплексам РНКП-промотор, ингибирование транскрипции наблюдалось на стадиях OK, ТК-2 и, незначительно, ТК-7. Принимая во внимание, что степень ингибирования обратно пропорциональна периоду полураспада транскрипционных комплексов, можно предположить, что для проявления эффекта ингибирования HlyllR необходима стадия, где он может конкурировать с РНКП за участок взаимодействия с ДНК.

Ранее, исходя из данных, полученных для РНКП Е. coli, высказывалось предположение, что HlyllR влияет на процесс изомеризации ЗК —> ОК. Также было показано, что HlyllR способен формировать тройной комплекс: Н1у1Ж-РНКП-Ры>;/77/ (Budarina et. al, 2004). В этой работе мы выявили свойство HlyllR формировать комплексы с РНКП Bacillus subtilis, Escherichia coli и Thermus thermophilus (см. рис. 5e). Тройные комплексы РНКП В. subtilis-H\y\\K-?hiyimi, ввиду их малого периода полураспада, было невозможно зафиксировать. Однако, методом ДНКазного футпринтинга, удалось выявить четверной комплекс, где РНКП стабилизирована РНК-ДНК гетеродуплексом длиной 2 пн (TK-2-HlyIIR) (см. рис. 5f). Зона защиты от ДНКазы I РНКП В. subtilis в составе ТК-2 на промоторе Phiyimi отличалась от зоны защиты, описанной Будариной и др. для РНКП Е. coli (Budarina et. al, 2004). Так, видны более четкие участки защиты в районе UP-элемента: в позициях матричной -64, -55, -45 и -43/-49 нематричной цепей; сайт гиперчувствительности наблюдается только в положении -39 матричной цепи; участок защиты четверного комплекса представляет собой сумму зон защиты отдельно взятых ТК-2 и HlyllR. Поскольку, при добавлении HlyllR к ТК-2, происходило дополнительное экранирование зон -70, -49/-50 и -39 матричной цепи и -38, -60/-65 нематричной цепи, HlyllR в четверном комплексе взаимодействует с дистапьным и проксимальным операторами. Принимая во внимание быстрый распад ЗК и ОК можно предположить, что, после добавлении HlyllR к заранее сформированному ТК-2, HlyllR связывается с оператором, вытесняя aCTD РНКП с UP-элемента, но молекула РНКП удерживается в области «-10» элемента за счет 2 пн РНК-ДНК гетеродуплекса.

P hlyll370 I, oC 21 24 27 30 33 36

РЫу11771 ВЛИЯН1|е Н1у1Ш на кинетику

21 24 27 зо зз 36 образования открытых комплексов

на промоторах Упупзта » РыуМ7/- (а) Влияние температуры на количество формирующихся открытых комплексов.

время, МИН 1/4 1/2 1 2 4 8 Шумя- -•>• #

1/4 1/21 2 4 8 (Ь) Кинетика формирования открытых ^ ^ ^ ^ ш комплексов (24 "С) в присутствии и

HlyllR +

liMisiiiHiiiM

■ ~ *** «к

методом однократной транскрипции m vitro.

отсутствии Н1у11Н В обоих случаях открытые комплексы детектировали

Достижение динамического равновесия при формировании ОК на промоторах Рыу/шо и РыуН77( и период их полураспада составляют менее 20 секунд при 36 °С (рис 4Ь, дорожки 1, 2). Снижение температуры вызывает постепенное уменьшение количества формирующегося ОК и оказывает одинаковый эффект на Уыупзп и Рмуит, приводя к приблизительно двух- трехкратному уменьшению количества продуктов транскрипции при снижении температуры на каждые 3 °С (рис 6а). При проведении реакции при 24 "С удается отслеживать накопление ОК для Рмутт, которое происходит значительно медленнее по сравнению с Рыу«77/ (рис 6Ь). Причина этого эффекта, по-видимому, связана с отсутствием специфического контакта между аСТО-РНКП в ОК, формируемом на Рыупзю- Н1у11Л, несмотря на то что формирует комплексы с РНК-полимеразами, не стабилизирует ТК-2 на промоторе, поскольку периоды полураспада ТК-2 и ТК-2-Н1у1Ш сопоставимы (не показано). При выбранных нами условиях не зафиксировано значительного эффекта Н1уШ1 на скорость покидания РНКП промотора ¥ыу1пп (не показано).

Поскольку оба промотора формируют одинаковые стабильные тройные (РНКП-промотор-РНК) ТК, обладающие сходным периодом полураспада, и скорости покидания РНК-полимеразой промоторов Рыуиз70 и Рыут71 одинаковы, можно предполагать одинаковый ход инициации транскрипции на стадиях после образования ОК. По-видимому, необходимость взаимодействия аСТО - иР-элемент важна только на ранних стадиях инициации транскрипции - до образования ОК.

Из вышеприведенных результатов можно выдвинуть следующую модель ингибирования транскрипции белком Н1у11Я на Рмупт. Н1уШ1 связывается с промотором на участке, который одновременно отвечает за взаимодействие с аСТО РНКП (см. рис. 51). Таким образом, Н1уШ1, находясь на своём операторе, блокирует доступ аСТБ РНКП к ДНК 11Р-элемента. Поскольку Н1уП11 и ТК-2 могут присутствовать на ДНК промотора одновременно, а транскрипционную активность РНКП проявляет даже на матрице укороченной до -30 нуклеотида, диссоциация Н1у1Ж

для формирования ИТК с РНКП не является обязательной. Однако без контактов с промотором, образуемых посредством aCTD, снижается скорость формирования OK до скорости, характерной для промотора Рыупт, где РНК-полимераза взаимодействует лишь с «-10» элементом промотора

Регуляция гена цитотокснна К: PlcR стимулирует образования открытых комплексов на промоторах генов цитотокснна К,plcR и papR.

Известно, что для активации экспрессии гена цитотокснна К in vivo, необходим PlcR и его коактиватор PapR. Однако до сих пор экспериментально не изучены механизмы взаимодействия РНКП с промотором cylK и, как следствие, влияние PlcR на это взаимодействие. Поскольку PlcR является автоактиватором, т.е. активирует экспрессию своего собственного гена и гена papR, кодирующего пептид активирующий PlcR, для изучения эффекта, оказываемого PlcR на инициацию транскрипции, использовали промоторы cytK, а также plcR и papR. В случае CRP Е. coli смещение оператора лишь на 1 нт, относительно сайта инициации транскрипции, может привести к смене активации на репрессию (Davis at al., 2005). Однако в случае активации, опосредованной PlcR, расстояние между задней границей «-10» элемента промотора и оператором PlcR варьирует в диапазоне от 19 пн до 38 пн (Gohar et. al, 2008). В частности, для гена cytK оно составляет 27 пн, а для papR и plcR - 22 пн. Еще одной особенностью PlcR-зависимых промоторов является отсутствие четко выраженных последовательностей «-35» элементов.

Участки взаимодействия PlcR с промоторами были подтверждены методом ДНКазного футпринтинга и полностью совпадали с позицией PlcR-бокеа (см. рис. 7а, с). ДНКазный футпринтинг не выявил OK, формируемые на промоторах cytK, papR и plcR, в отсутствии PlcR, а КМп04 футпринтинг позволил детектировать лишь OK промоторов генов cytK и papR, и лишь при использовании 20 вместо 1 мМ КМ11О4 (см. рис. 7Ь). По-видимому, РНКП В. subtilis более эффективно взаимодействует с промоторами генов cytK и papR, поскольку в отличие от промотора plcR они содержат «-10 удлиненные» элементы (см. рис. 7с). В случае одновременного присутствия PlcR и PapR наблюдалось увеличение количества ОК. Расстояние между задними границами транскрипционных пузырьков и PlcR-боксами для промоторов papR и cytK составляло 23 пн и 28 пн, соответственно, подтверждая, что расстояние между PlcR и РНКП на активируемых промоторах может варьировать. Можно предполагать, что PlcR способен взаимодействовать с несколькими эпитопами молекулы РНКП, например, такими как

(а) (Ь)

у ' у ' Промотор гена рацй М93+101)^ Промотор гена су|р. {-66+851

Цепь: Нематричная Матричная Нематричная Матричная

ь, „ «^¿„л- К[,АР ++++— ++++-- ++++-- ++++ —

р--+ + _ --+ + _ --+ + - +-+-+- +-+-+- +-+_+- +- + - + -

plcR

,85582-

.м — + + - щтящ

1 1

т к

papR cytK

Isis- Isis-

— + + — Iii»»

1 "1 2

_ i Ü -.-s !

'"„в»-»

- -

(с)

pi CR. . TTÄTATS.TAaTATGCATTXTTTCA'I^C.üAftAi ЛЛТАТЛТЛГМТАСОТААТХААСТАТЛГ;

■щ '^ai Щ

-30 *-2& '-10 -1***1 PAAAATTGTCSÄATICACATTATTGTAGTGST^riJÄCMCTr 1TTTTAACAGCT17IÄGT0TAAXAACATCACCAT(*4'1 Г. Г -I

АТАААТТГТ

pspR.. AftAAAATOGGTATGCATAATTGCATArsAACGTSü ▼ TTTTTTACCCATACOTATTAACGTAT'I'TTGCACCa J

AAUßCfACJW: сттгт

1 *'•;•! AT

▼ ▼G^ri.CÜAC

а л AAA СССШУ^СГГ:-

Рис. 7. (а) Картирование районов взаимодействия PlcR с промоторами генов plcR, papR и cytK при помощи ДНКазного футпринтинга (показаны матричные цепи). Над треками указаны концентрации PlcR (нМ) и названия промоторов. (Ь) КМПО4 футпринтинг РНКП на промоторах papR и cytK. (с) Схема, описывающая взаимодействия PlcR и РНК-полимеразы с промоторами. Жирным шрифтом выделены консенсусные элементы промотора и сайт связывания PlcR (5'-ATGhAwwwwTdCAT-3\ где h - А или Т или С; d - А или Т или С; W - А или Т). Подчеркнутым курсивом выделена последовательность ДНК, совпадающая с последовательность мРНК. Закрашенными треугольниками обозначены участки чувствительности к КМ11О4. Прямоугольниками обозначены зоны защиты PlcR при ДНКазном футпринтинге. Символом «Н» обозначены участки гиперчувствительности к ДНКазе I.

aCTD, aNTD, с4.2, выбирая наиболее предпочтительный в зависимости от расстояния между сайтом старта транскрипции и P1cR-6okcom.

Методом нативного электрофореза в градиентном полиакриламидном геле удалось выявить комплексы PlcR с РНК-полимеразами В. subtilis и Е. coli, но не Thermus thermophilus (см. рис. 8а). Формирование комплексов PlcR с РНК-полимеразой В. subtilis наблюдалось при концентрации PlcR 4-8 мкМ и не зависело от наличия PapR (см. рис. 8Ь). Образование комплексов с промоторами детектировалось при концентрации 100-200 нМ, только в присутствии 0.1 мМ PapR (см. рис. 8с). Поскольку PlcR, образует комплексы с промоторами при более низкой концентрации, чем с РНКП, по-видимому, на первом этапе активации происходит связывание PlcR с ДНК. В результате чего на промоторе появляется дополнительный аффинный к РНК-полимеразе участок, который позволяет более прочно удерживать РНКП на промоторе, что приводит к увеличению количества продуктов транскрипции.

(а)

о $

сс

и:

CL CL

< < ее

(с) p/cR

о о о о о о о о о I

papR

cytK

О О О О о о о о

О О О О О I о о о о о СО <N "Г- Ю О 00 XT TN • ■ " '

• « tt

ШШШ^ШШШЫ;;:

м* .. . \

(d) р.нкп ß. subtilis E. coli

Промотор pIcR papR cytK pIcR papR cytK

PlcR ++-- ++-- + + + + + +

PapR + - + - + -+- + - + - + -

143 <►#

100

О;

"♦I

Рис. 8. (а, Ь) Электрофореграммы комплексов PlcR и РНКП Т. thermophilus, В. suhUlis и Е. coli, разделенных в градиентном полиакриламидном геле 4-15% (GE healthcare), (с) Комплексы PlcR-зависимых промоторов и PlcR разделенные в 2% агарозном геле, содержащем 0.1 мМ PapR. (е) Влияние PlcR на образования открытых комплексов, детектированное методом однократной транскрипции in vitro. Черными стрелками маркированы продукты транскрипции соответствующие ранее определенным промоторам; незаполненной стрелкой отмечен продукт образующегося с промотора РpapROs, ингибируемого PlcR.

Несмотря на то, что РНК-полимеразы Е. coli и В. subtilis формировали комплекс с PlcR, активация транскрипции происходила только в случае РНКП В. subtilis (см. рис. 8d). Это наблюдение можно объяснить, как отсутствием «правильного» взаимодействия между PlcR и РНКП Е. coli на выбранных для эксперимента промоторах, так и кинетическими особенностями инициации транскрипции РНКП этих видов бактерий. Отдельно взятые субъединицы РНК-полимеразы В. subtilis не формировали комплексов с PlcR (не показано). Следовательно, можно предполагать, что эпитоп(ы) РНКП отвечающие за взаимодействие с PlcR присутствуют только на целой молекуле РНКП и/или может состоять из участков нескольких субъединиц РНКП.

PlcR иигибирует синтез антисмыслового транскрипта к собственной мРНК.

Вблизи промотора PpapR был выявлен дополнительный промотор PpUiPÄas. Транскрипционный пузырек, соответствующий этому промотору локализован на расстоянии 8 пи от PIcR-бокеа (см. рис 7(Ь,с)). Расстояние между границами транскрипционных пузырьков Рр„рц и Ppapnas составляет не более 6 нуклеотидов. Таким образом, две молекулы РНКП не могут одновременно находиться на этих двух промоторах. Однако оба промотора детектируются методом КМп04 футпринтинга, поскольку в ходе реакции образуется смесь двух открытых комплексов. Исходя из длин дополнительного продукта наблюдаемого в реакции транскрипции in vitro, промотор Ppapjias является дивергентным по отношению к Ррарц. Следовательно, синтезирующаяся с Рр„рцаs молекула РНК, является антисмысловой по отношению к мРНК гена plcR (гены plcR и papR расположены тандемно) и, по этой причине, может влиять на его экспрессию. В случае активации Рраря вызванной PlcR-PapR происходит снижение количества открытого комплекса соответствующего Pwsas (рис. 7Ь) и количество соответствующего продукта транскрипции (рис. 8d). Можно предположить, что молекула РНК, синтезирующаяся с промотора Pp^as, является важным элементом PlcR-регулона, функция которого сводится к подавлению экспрессии гена plcR, до момента «включения» регуляции «чувства кворума» опосредованной накоплением PapR.

Кинетические особенности Р1сК-зависимых промоторов

При проведении реакции формирования ОК при температуре 36 °С, равновесие достигается менее чем через 30 секунд после введения РНКП (см. рис. 9а). В случае понижения температуры реакционной смеси до 18 "С удается более детально отследить кинетику: скорость формирования ОК в случаях, если Р1сЯ присутствует на промоторах, увеличивается (см. рис. 9с-е). В тоже время, Р1сК незначительно влияет на скорость диссоциации ОК. Период полураспада ОК для промотора су1К равен приблизительно 30 секундам, как в присутствии, так и в отсутствии Р1сЯ (см. рис. 9Ь). Отсутствие зоны защиты при ДНКазном футпринтинге РНКП на промоторах генов р/сК, рарЯ и су1К также косвенно указывает на их малый период полураспада, по-видимому, равный нескольким секундам. Таким образом, быстрый обмен молекул РНКП на РкЯ-зависимых промоторах напоминает поведение РНКП на промоторе гена гемолизина II.

Рис. 9. Характеристика кинетики взаимодействия РНКП с промоторами генов токсчнов. (а, Ь)

Кинетика ассоциации и диссоциации с промотором су/К при 36 "С. (с-d) Кинетика ассоциации РНКП с промоторами генов plcR (с), papll (d) и cylK (е) при 18 "С Количество сформировавшегося ОК определяли методом однократной транскрипции in vitro. Внизу графика показаны фрагменты радиоавтографов; чувствительность радиоавтографов выровнены для каждой кинетической реакции. Непрерывная линия графика радиоавтограф отмеченный «+» соответствует реакции в присутствии PlcR и PapR; «-» и штриховая линия - реакции без PlcR и без PapR.

Можно предположить следующий механизм действия Р1сЯ. В присутствие РарЯ, он связывается со своим оператором вблизи «-10» элемента промотора. Вследствие связывания Р1сЯ РНК-полимераза получает дополнительный контакт с ДНК и, как следствие, увеличивается скорость образования ЗК и/или скорость изомеризации ЗК-ОК.

ВЫВОДЫ:

1. Определены частоты встречаемости генов cytK, hlyll, hlyHR среди 40 природных изолятов бактерий группы Bacillus cereus и описан полиморфизм генов токсинов. Показано, что близкими ПДРФ типами генов обладают штаммы из одних и тех же фингерпринтных кластеров. Ген hlyHR встречается только совместно с геном гемолизина II.

2. Выявлено, что гемолизин II - доминирующий гемолитический фактор Bacillus cereus, в отсутствии HlyHR.

3. Обнаружена группа близкородственных микроорганизмов В. cereus и В. thuringiensis несущих аллель гена гемолизина II с делецией двух регуляторных элементов промотора: ш-активирующего UP-элемента и оператора для HlyHR.

4. Охарактеризованы транскрипционные комплексы, образующиеся на промоторе гемолизина II, и содержащие РНК-ДНК гетеродуплексы длиной 2, 7 и 12 пн.

5. Установлено, что для открытых комплексов, формируемых на промоторах генов hlyll, cytK, plcR и papR В. cereus, характерен малый период полураспада.

6. Для промоторов генов cytK, plcR, papR и hlyll определены стадии инициации транскрипции, на которые оказывают влияние регуляторы PlcR и HlyHR.

Список публикаций по теме диссертации:

1. Шадрин A.M.. Шапырина Е.В, Сиунов А.В., Северинов КВ., Солонин А.С. Пороформирующие токсины Bacillus cereus гемолизин II и цитотоксин К: полиморфизм и распределение генов среди представителей цереусной группы. Микробиология. 2007 Июль-Август; том 76(4): с. 462-70.

2. Sineva E.V., Andreeva-Kovalevskaya Z.I., Shadrin A.M.. Gerasimov Y.L., Ternovsky V.I., Teplova V.V., Yurkova T.V., Solonin A.S. Expression oí Bacillus cereus hemolysin II in Bacillus subtilis renders the bacteria pathogenic for the crustacean Daphrtia magna. FEMS Microbiol Lett. 2009 Jul 31. vol. 299 issue 1, p. 110-119.

3. Cámara В, Liu M, Reynolds J, Shadrin A. Liu B, Kwok K, Simpson P, Weinzierl R, Severinov К Cota E, Matthews S, Wigneshweraraj SR. T7 phage protein Gp2 inhibits the Escherichia coli RNA polymerase by antagonizing stable DNA strand separation near the transcription start site. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 2;107(5):2247-52.

4. Шадрин A.M.. Шапырина Е.В. , Поларшинова O.H., Сиунов А.В., Солонин А.С. распределение генов бета-складчатых-пороформирующих токсинов в изолятах группы В. cereus: цитотоксина К и гемолизина И. Сборник тезисов 10-ой Международной

Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущино. 2006.

5. Родикова Е.А., Майоров С.Г., Шадрин A.M., Солонин А.С. Белок Fur - негативный регулятор транскрипции гена гемолизина И. Сборник тезисов 10-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущино. 2006.

6. Шадрин A.M.. Шапырина Е.В., Родикова Е.А., Проценко А.С., Солонин А.С. UP-элемент промотора гена гемолизина II В. cereus необходим для его экспрессии. Сборник тезисов 11-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущино. 2007.

7. Шапырина Е.В., Шадрин A.M. Редокс-чувствительная система сигнальной трансдукции ResDE участвует в регуляции экспрессии гемолизина II цереусной группы микроорганизмов. Сборник тезисов 12-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пушино. 2008.

8. Shadrin A.. Shapyrina Е., Rodikova Е„ Kovalevskiy О., Protsenko A., Solonin А., Severinov К. The mechanism of regulation of Bacillus cereus hemolysin II gene promoter. CSHL Meeting on Molecular Genetics of Bacteria and Phages, Cold Spring Harbor, NY, August 20-24, 2008.

9. Andreeva-Kovalevskaya Z.I., Sineva E.V., Ternovsky V.I., Shadrin A.M. Gerasimov Y.L., Teplova V.V., Nesterenko V.F. and Solonin A.S. Functional importance of B. cereus hemolysin II: molecular mechanism of phatogenesis. International Conference on Grampositive Pathogens. Omaha, NE, October 5-8,2008.

10. Solonin A.S., Shadrin A.M.. Kovalevskiy O.V., Rodikova E.A., Shapyrina E.V., Budarina Z.I., Protsenko A.S., Sineva E. V. Transcription factors interplay in the regulation of hemolysin II gene expression. International Conference on Gram-positive Pathogens. Omaha, NE, October 5-8,2008.

11. Шапырина E.B., Шадрин A.M.. Солонин А.С. Регуляция экспрессии гена гемолизина II цереусной группы микроорганизмов двухкомпонентной системой сигнальной трансдукции ResDE. Сборник тезисов 13-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущино. 2009.

12. ZA. /. Andreeva-Kovalevskaya, Е. V. Sineva, V. I. Ternovsky, A.M. Shadrin. У. L. Gerasimov, V. V. Teplova, V. F. Nesterenko, A. S. Solonin. Bacillus cereus hemolysin II and its various applications. Book of abstracts III International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld2009), 2009, p. 778.

13. Шадрин A.M.. Солонин A.C., Северинов K.B. Регуляция экспрессии генов токсинов Bacillus cereus. Сборник тезисов 14-ой Международной Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века». Пущино. 2010.

Подписано в печать:

11.11.2010

Заказ № 4497 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шадрин, Андрей Михайлович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:.

ОГЛАВЛЕНИЕ:.

ВВЕДЕНИЕ.

1. Токсины Bacillus cereus их регуляторы.

1.1. Микроорганизмы группы В. cereus.

1.2. Токсины бактерий группы В. cereus.

1.2.1. Фосфолипазы.

1.2.2. Энтеротоксины: гемолизин BL. негемолитический энтеротоксин, цитотоксин К и гемолизин II.

1.2.3. Другие гемолизины В. cereus: гемолизин III, цереолизин О.

1.2.4. Мало охарактеризованные токсины: энтеротоксин FM и энтеротоксин ВсеТ

1.3. Регуляторы хромосомных гемолитических факторов патогенности.

1.3.1. PlcR, регулятор фосфолипазы С.

1.3.2. HlyllR, регулятор гемолизина II.

1.3.3. Für, регулятор гомеостаза железа.

1.3.4. Двухкомпонентная редокс чувствительная система ResD-ResE.

1.3.5. Fnr, регулятор восстановления фумарата и нитрата.

1.3.6. FlhA регулирует секрецию НЫ и PC-PLC.

2. Структура РНК-полимеразы прокариот и её транскрипционных комплексов.

2.1. Структура кор-фермента РНКП.

2.2. Структура холофермента.

2.3. Инициация транскрипции. Особенности закрытого комплекса.

2.4. Структура открытого комплекса [67].

2.5. Особенности структуры инициирующего транскрипцию комплекса. Абортивная инициация.

2.6. Элонгационный комплекс [109].

2.7. Структура активного центра фермента.

3. Особенности инициации транскрипции у микроорганизмов рода Bacillus.

3.1. Структурные элементы промоторов.

3.1.1. Базальные «-10» и «-35» элементы.

3.1.2. «-10 удлиненный» элемент.

3.1.3. UP-элемент.

3.1.4. Дискриминатор.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии генов пороформирующих токсинов B. cereus"

Актуальность темы исследования. По данным организации «European Food Safety Authority» Bacillus cereus является четвертой по распространенности причиной пищевых отравлений. Вид Bacillus cereus входит в состав группы В. cereus, представителями которой являются В. anthracis, вызывающий сибирскую язву; В. thuringiensis, продуцирующий параспоральные кристаллы токсина, действующего на определенные виды насекомых, и, сравнительно недавно охарактеризованный как отдельный психротолерантный вид. В. weihenstephanensis. Бактерии этой группы широко распространены в природе и часто встречаются в почве. Гены, предающие специфические свойства В. anthracis и В. ihuringiensis, локализованы на макроплазмидах. Однако отдельно взятый штамм представителя группы В. cereus может синтезировать до десятка токсинов, гены которых расположены на бактериальной хромосоме. Некоторые из этих токсинов могут вызывать тяжелые отравления у людей, в том числе — со смертельным исходом. Особый интерес вызывают два пороформирующих токсина - гемолизин II и цитотоксин К. Аминокислотная последовательность гемолизина II сходна с последовательностью цитотоксина К (37% идентичности). Оба токсина относятся к семейству Р-складчатых пороформирующих токсинов. К другим представителям этого семейства относят а-гемолизин, лейкоцидины, у-гемолизин Staphylococcus aureus и Р-токсин Clostridium perfringens. Однако регуляция экспрессии генов гемолизина II и цитотоксина К осуществляется независимо. Ген цитотоксина К находится под контролем транскрипционного активатора PlcR, включающего экспрессию большинства токсинов В. cereus по механизму «чувства кворума» («quorum sensing»), в то время как экспрессия гемолизина II репрессируется транскрипционным регулятором HlyllR.

Для того чтобы обеспечить быстрое переключение экспрессии генов в ответ на изменение условий внешней среды, активность РНК-полимеразы строго контролируется. Стадия инициации транскрипции является главным этапом контроля регуляции генной экспрессии. Изучение взаимодействия РНК-нолимеразы с промоторами генов и влияния на это взаимодействие транскрипционных факторов является важнейшей задачей молекулярной биологии, позволяющей определить механизмы реализации информации, заложенной в геноме организма. Большинство накопленных к настоящему времени данных, описывающих инициацию транскрипции, базируются на результатах, полученных на моделях РНК-полимераз Е. coli и Thermus thermophilus, молекулы которых имеют ряд существенных структурных и функциональных отличий от РНК-полимераз микроорганизмов группы В. cereus. Понимание механизмов регуляции экспрессии, в особенности, генов токсинов Bacillus cereus и детальное изучение взаимодействия РНК-полимеразы с их промоторами, несомненно, представляют интерес для молекулярной биологии. Актуальность исследования регуляции генов токсинов бактерий рода Bacillus не вызывает сомнений. Более того, впоследствии, результаты исследований могут послужить основой для создания новых лекарственных препаратов используемых при терапии инфекционных заболеваний. Цели и задачи исследования:

Целью данной работы являлось изучение особенностей механизма регуляции генов пороформирующих токсинов гемолизина II и цптотоксина К у микроорганизмов группы В. cereus. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Оценить разнообразие и особенности распределения аллелей генов цитотоксина К, гемолизина II и его транскрипционного регулятора hlyTIR в большой популяции штаммов В. cereus, выделенных из различных природных источников.

2) Охарактеризовать взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами генов гемолизина II, цитотоксина К,plcR и papR.

3) Определить для генов цитотоксина К и гемолизина II этапы инициации транскрипции, на которые влияют HlyllR и PlcR.

Научная новизна работы. Впервые определены частоты встречаемости аллелей генов цитотоксина К, гемолизина II и его транскрипционного репрессора HlyllR у 40 штаммов группы В. cerens, выделенных на территории стран СНГ. На модели В. subtilis установлено что, в случае отсутствия контроля экспрессии гена гемолизина II регулятором HlyllR, гемолитическая активность, наблюдаемая в культуре клеток, увеличивается в 200 раз, что в не менее чем в 5 раз превышает гемолитическую активность родительского штамма В. cereus ВКМ В-771. Впервые детально охарактеризованы комплексы, формируемые РНК-полимеразой в ходе инициации транскрипции на промоторах генов гемолизина II, цитотоксина К, plcR и papR. Впервые определены стадии инициации транскрипции, на которые оказывают влияние HlyllR и PlcR для промоторов генов гемолизина II, цитотоксина К, plcR и papR. Научно-практическая значимость работы. Представленная работа является частью серии работ, направленной на исследование регуляции инициации транскрипции у грамм-положительных микроорганизмов. Используемый в данной работе метод стабилизации открытого комплекса с помощью нуклеотидов позволяет четко отслеживать механизм инициации транскрипции для промоторов с коротким (несколько секунд) временем полураспада открытого комплекса. Предложенный вариант анализа полиморфизма длин рестрикционпых фрагментов гена цитотоксина К может быть использован при разработке тест-систем, позволяющих детектировать штаммы, несущие смертельно опасный для человека аллель cytKl гена цитотоксина К. При моделировании регуляции экспрессии гена гемолизина II был создан штамм В. subtilis - суперпродуцент гемолизина II, который может послужить прототипом для суперпродуцентов других пороформирующих токсинов. Полученные в ходе данного исследования результаты имеют несомненное практическое значение и могут с успехом найти применение, как в медицинской диагностике, так и послужить основой для дальнейших научных исследований регуляции экспрессии генов Bacillus cereus.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Шадрин, Андрей Михайлович

ВЫВОДЫ:

1. Определены частоты встречаемости генов cytK, hlyll, hlyllR среди 40 природных изолятов бактерий группы Bacillus cereus и описан полиморфизм генов токсинов. Показано, что близкими ПДРФ типами генов обладают штаммы из одних и тех же фингерпринтных кластеров. Ген hlyllR встречается только совместно с геном гемолизина II.

2. Выявлено, что гемолизин II - доминирующий гемолитический фактор Bacillus cereus, в отсутствии HlyllR.

3. Обнаружена группа близкородственных микроорганизмов В. cereus и В. thuringiensis несущих аллель гена гемолизина II с делецией двух регуляторных элементов промотора: с /¿-активирующего UP-элемента и оператора для HlyllR.

4. Охарактеризованы транскрипционные комплексы, формируемые на промоторах гемолизина II, содержащие РНК-ДНК гетеродуплексы длиной 2, 7 и 12 пн.

5. Установлено, что для открытых комплексов, образующихся на промоторах генов hlyll, cytK,plcR и papR В. cereus, характерен малый период полураспада.

6. Для промоторов генов cytK, plcR, papR и hlyll определены стадии инициации транскрипции, на которые оказывают влияние регуляторы PlcR и HlyllR.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шадрин, Андрей Михайлович, Москва

1. Rasko D.A., Altherr M.R., Han C.S. Ravel J., Genomics of the Bacillus cereus group of organisms. FEMS Microbiol Rev, 2005. 29(2): p. 303-29.

2. Di Franco C., Beccari E., Santini Т., Pisaneschi G. Tecce G., Colony shape as a genetic trait in the pattern-forming Bacillus mycoides. BMC Microbiol, 2002. 2: p. 33.

3. Nakamura L.K., Bacillus pseudomycoides sp. nov. Int J Syst Bacteriol, 1998. 48 Pt 3: p. 1031-5.

4. Lechner S., Mayr R., Francis K.P., Pruss B.M., Kaplan Т., Wiessner-Gunkel E., Stewart G.S. Schcrer S., Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is a new psychrotolerant species of the Bacillus cereus group. Int J Syst Bacteriol. 1998. 48 Pt 4: p. 1373-82.

5. Ко K.S., Kim J.W., Kim J.M., Kim W. Chung S.I., Kim I.J. Kook Y.H., Population structure of the Bacillus cereus group as determined by sequence analysis of six housekeeping genes and the plcR Gene. Infect Immun. 2004. 72(9): p. 5253-61.

6. Priest F.G., Barker M., Baillie L.W., Holmes E.C. Maiden M.C., Population structure and evolution of the Bacillus cereus group. J Bacteriol, 2004. 186(23): p. 7959-70.

7. Slamti L. Lereclus D., A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of the Bacillus cereus group. Embo J, 2002. 21(17): p. 4550-9.

8. Michelet N G.P., Mahillon J, Bacillus cereus enterotoxins, hi- and tri-component cytolysins, and other hemolysins, in The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Alouf J P.M., Editor. 2006, Elsevier, p. 1072.

9. Dorland, Dorland's Medical Dictionary. 2007: Elsiver. 2208.

10. Beecher D.J. Macmillan J.D., Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect Imraun, 1991. 59(5): p. 1778-84.

11. Lund T. Granum P.E., Characterisation of a non-hacmolytic enterotoxin complex from Bacillus cereus isolated after afoodborne outbreak. FEMS Microbiol Lett, 1996. 141(2-3): p. 151-6.

12. Granum P.E., O'Sullivan K. Lund T., The sequence of the non-haemolytic enterotoxin operonfrom Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett, 1999. 177(2): p. 225-9.

13. Lund T., De Buyser M.L. Granum P.E., A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Mol Microbiol, 2000. 38(2): p. 254-61.

14. Tran S.L., Guillemet E., Ngo-Camus M., Clybomv C., Puhar A., Moris A., Gohar M., Lereclus D. Ramarao N., Haemolysin II is a Bacillus cereus virulence factor that induces apoptosis of macrophages. Cell Microbiol, 2010.

15. Fagerlund A., Ween O., Lund T., Hardy S.P. Granum P.E., Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus. Microbiology, 2004. 150(Pt 8): p. 268997.

16. Andreeva Z.I., Nesterenko V.F., Fomkina M.G., Ternovsky V.I., Suzina N.E., Bakulina A.Y., Solonin A.S. Sineva E.V., The properties of Bacillus cereus hemolysin II pores depend on environmental conditions. Biochim Biophys Acta, 2007.1768(2): p. 253-63.

17. Beecher D.J., Schoeni J.L. Wong A.C., Enterotoxic activity of hemolysin BLfrom Bacillus cereus. Infect Immun, 1995. 63(11): p. 4423-8.

18. Guinebretiere M.H., Broussolle V. Nguyen-The C., Enterotoxigenic profiles of food-poisoning and food-borne Bacillus cereus strains. J Clin Microbiol, 2002. 40(8): p. 3053-6.

19. Stentors L.P., Mayr R., Scherer S. Granum P.E., Pathogenic potential of fifty Bacillus weihenstephanensis strains. FEMS Microbiol Lett, 2002. 215(1): p. 47-51.

20. Granum P.E. Lund T., Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol Lett, 1997.157(2): p. 223-8.

21. Lindback T., Fagerlund A., Rodland M.S. Granum P.E., Characterization of the Bacillus cereus Nhe enterotoxin. Microbiology, 2004. 150(Pt 12): p. 3959-67.

22. Beecher D.J. Wong A.C., Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus. Hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. .T Biol Chem, 1997. 272(1): p. 233-9.

23. Gohar M., Okstad O.A., Gilois N., Sanchis V., Kolsto A.B. Lereclus D., Two-dimensional electrophoresis analysis of the extracellular proteome of Bacillus cereus reveals the importance of the PlcR regulon. Proteomics, 2002. 2(6): p. 784-91.

24. Lund T. Granum P.E., Comparison of biological effect of the two different enterotoxin complexes isolated from three different strains of Bacillus cereus. Microbiology, 1997.143 ( Pt 10): p. 3329-36.

25. Sinev M.A., Budarina Zh I., Gavrilenko I.V., Tomashevskii A. Kuz'min N.P., Evidence of the existence of hemolysin IIfrom Bacillus cereus: cloning the genetic determinant of hemolysin II. Mol Biol (Mosk), 1993. 27(6): p. 1218-29.

26. Budarina Z.I., Sinev M.A., Mayorov S.G., Tomashevski A.Y., Shmelev I.V. Kuzmin N.P., Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Arch Microbiol, 1994. 161(3): p. 252-7.

27. Gouaux E., Hobaugh M. Song L., alpha-Hemolysin, gamma-hemolysin, and leukocidin from Staphylococcus aureus: distant in sequence but similar in structure. Protein Sci, 1997. 6(12): p. 2631-5.

28. Baida G.E. Kuzmin N.P., Cloning and primary structure of a new hemolysin gene from Bacillus cereus. Biochim Biophys Acta, 1995. 1264(2): p. 151-4.

29. Baida G.E. Kuzmin N.P., Mechanism of action of hemolysin IIIfrom Bacillus cereus. Biochim Biophys Acta, 1996. 1284(2): p. 122-4.

30. Palmer M., The family of thiol-activated, cholesterol-binding cytolysins. Toxicon, 2001. 39(11): p. 1681-9.

31. AgataN., Ohta M., Arakawa Y. Mori M., The bceT gene of Bacillus cereus encodes an enterotoxicprotein. Microbiology, 1995. 141 ( Pt 4): p. 983-8.

32. Hansen B.M., Hoiby P.E., Jensen G.B. Hendriksen N.B., The Bacillus cereus bceT enterotoxin sequence reappraised. FEMS Microbiol Lett, 2003. 223(1): p. 21-4.

33. Agaisse H., Gominet M., Okstad O.A., Kolsto A.B. Lereclus D., PlcR is apleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol, 1999. 32(5): p. 1043-53.

34. Gohar M., Faegri K., Perchât S. Ravnum S., Okstad O.A., Gominet M., Kolsto A.B. Lereclus D., The PlcR virulence regulon of Bacillus cereus. PLoS One, 2008. 3(7): p. e2793.

35. Callegan M.C., Kane S.T., Cochran D.C. Gilmorc M.S., Gominet M. Lereclus D., Relationship of plcR-regulatedfactors to Bacillus endophthalmitis virulence. Infect Immun, 2003. 71(6): p. 3116-24.

36. Pomerantsev A.P., Pomerantseva O.M., Camp A.S., Mukkamala R., Goldman S. Leppla S.H., PapR peptide maturation: role of the NprB protease in Bacillus cereus 569 PlcRJPapR global gene regulation. FEMS Immunol Med Microbiol, 2009. 55(3): p. 361-77.

37. Bouillaut L., Perchât S., Arold S., Zorrilla S., Slamti L., Henry C., Gohar M. Declerck N. Lereclus D., Molecular basis for group-specific activation of the virulence regulator PlcR by PapR heptapeptides. Nucleic Acids Res, 2008. 36(11): p. 3791-801.

38. Gominet M„ Slamti L., Gilois N., Rose M. Lereclus D., Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcR regulon and for virulence. Mol Microbiol, 2001. 40(4): p. 963-75.

39. Slamti L. Lereclus D., Specificity and polymorphism of the PlcR-PapR quorum-sensing system in the Bacillus cereus group. J Bacteriol, 2005. 187(3): p. 1182-7.

40. Kovalevskiy O.V., Lebedev A.A., Surin A.K., Solonin A.S. Antson A.A., Crystal structure of Bacillus cereus HlyllR. a transcriptional regulator of the gene for pore-forming toxin hemolysin II. J Mol Biol, 2007. 365(3): p. 825-34.

41. Baichoo N. Helmann J.D., Recognition of DNA by Fur: a reinterpretation of the Fur box consensus sequence. J Bacteriol, 2002.184(21): p. 5826-32.

42. Carpenter B.M., Whitmire J.M. Merrell D.S., This is not your mother's repressor: the complex role of fur in pathogenesis. Infect Immun, 2009. 77(7): p. 2590-601.

43. Bsat N. Helmann J.D., Interaction of Bacillus subtilis Fur (ferric uptake repressor) with the dhb operator in vitro and in vivo. J Bacteriol, 1999. 181(14): p. 4299-307.

44. Harvie D.R., Vilchez S., Steggles J.R. Ellar D.J., Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology, 2005. 151(Pt 2): p. 569-77.

45. Родикова E.A. Регуляция транскрипции гена гемолизина IIBacillus cereus : диссертация . кандидата биологических наук : 03.00.03. 2007, Пущино. 112 с.

46. Esbelin J., Armengaud J., Zigha A. Duport C., ResDE-dependent regulation of enterotoxin gene expression in Bacillus cereus: evidence for multiple modes of binding for ResD and interaction with Fnr. J Bacteriol, 2009. 191(13): p. 4419-26.

47. Esbelin J., Jouanneau Y., Armengaud J. Duport C., ApoFnr binds as a monomer to promoters regulating the expression of enterotoxin genes of Bacillus cereus. J Bacteriol, 2008. 190(12): p. 4242-51.

48. Messaoudi K., Clavel T., Schmitt P. Duport C., Fnr mediates carbohydrate-dependent regulation of catabolic and enterotoxin genes in Bacillus cereus F4430/73. Res Microbiol, 2010. 161(1): p. 30-9.

49. Zhang G., Campbell E.A., Minakhin L., Richter C., Severinov K. Darst S.A., Crystal structure ofThermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell, 1999. 98(6): p. 811-24.

50. Murakami K.S., Masuda S., Campbell E.A., Muzzin O. Darst S.A., Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science, 2002. 296(5571): p. 1285-90.

51. Murakami K.S., Masuda S. Darst S.A., Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science, 2002. 296(5571): p. 1280-4.

52. Vassylyev D.G., Sekinc S., Laptenko O., Lee J., Vassylyeva M.N., Borakhov S. Yokoyama S., Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature, 2002. 417(6890): p. 712-9.

53. Vassylyev D.G., Vassylyeva M.N., Perederina A., Tahirov T.H. Artsimovitch I., Structural basis for transcription elongation by bacterial RNA polymerase. Nature, 2007. 448(7150): p. 157-62.

54. Vassylyev D.G., Vassylyeva M.N., Zhang J., Palangat M., Artsimovitch I. Landick R., Structural basis for substrate loading in bacterial RNA polymerase. Nature, 2007. 448(7150): p. 163-8.

55. Sousa R., Chung Y.T., Rose J.P. Wang B.C., Crystal structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution. Nature, 1993. 364(6438): p. 593-9.

56. Jeruzalmi D. Steitz T.A., Structure ofT7 RNA polymerase complexed to the transcriptional inhibitor T7 lysozyme. Embo J, 1998.17(14): p. 4101-13.

57. Cheetham G.M. Steitz T.A., Structure of a transcribing T7 RNA polymerase initiation complex. Science, 1999. 286(5448): p. 2305-9.

58. Cheetham G.M., Jeruzalmi D. Steitz T.A., Structural basis for initiation of transcription from an RNA polymerase-promoter complex. Nature, 1999. 399(6731): p. 80-3.

59. Tahirov T.H., Temiakov D., Anikin M., Patlan V., McAllister W.T., Vassylyev D.G. Yokoyama S., Structure of a T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9 A resolution. Nature, 2002. 420(6911): p. 43-50.

60. Cramer P., Bushnell D.A. Kornberg R.D., Structural basis of transcription: RNA polymerase Ilat 2.8 angstrom resolution. Science, 2001. 292(5523): p. 1863-76.

61. Gnatt A.L., Cramer P., Fu J., Bushnell D.A. Kornberg R.D., Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science, 2001. 292(5523): p. 1876-82.

62. Naryshkin N., Revyakin A., Kim Y., Mekler V. Ebright R.H., Structural organization of the RNA polymerase-promoter open complex. Ceil, 2000. 101(6): p. 601-11.

63. Korzheva N., Mustaev A., Kozlov M., Malhotra A., Nikiforov V., Goldfarb A. Darst S.A., A structural model of transcription elongation. Science, 2000. 289(5479): p. 619-25.

64. Darst S.A., Bacterial RNA polymerase. Curr Opin Struct Biol, 2001.11(2): p. 155-62.

65. Campbell E.A., Korzheva N., Mustaev A., Murakami K., Nair S., Goldfarb A. Darst S.A., Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial rna polymerase. Cell, 2001.104(6): p. 901-12.

66. Allison L.A., Moyle M., Shales M. Ingles C.J., Extensive homology among the largest subunits ojeukaryotic andprokaryotic RNA polymerases. Cell, 1985. 42(2): p. 599-610.

67. Borukhov S. Nudler E., RNA polymerase: the vehicle of transcription. Trends Microbiol, 2008.16(3): p. 126-34.

68. Ghosh P., Ishihama A. Chatterji D., Escherichia coli RNA polymerase subunit omega and its N-terminal domain bind full-length beta' to facilitate incorporation into the alpha2beta subassembly. Eur J Biochem, 2001. 268(17): p. 4621-7.

69. Darst S.A., OpalkaN., Chacon P., Polyakov A., Richter C., Zhang G. Wriggers W., Conformational flexibility of bacterial RNA polymerase. Proc Natl Acad Sei USA, 2002. 99(7): p. 4296-301.

70. Nudler E., RNA polymerase active center: the molecular engine of transcription. Annu Rev Biochem, 2009. 78: p. 335-61.

71. Nikiforov V.G., The RNA polymerase structure-activity studies (1962-2001). Mol Biol (Mosk), 2002. 36(2): p. 197-207.

72. Borukhov S. Nudler E., RNA polymerase holoenzyme: structure, function and biological implications. Curr Opin Microbiol, 2003. 6(2): p. 93-100.

73. Artsimovitch I., Svetlov V., Murakami K.S. Landick R., Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subimits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J Biol Chem, 2003. 278(14): p. 12344-55.

74. Naryshkina T., Kuznedelov K. Severinov K., The role of the largest RNA polymerase subunit lid element in preventing the formation of extended RNA-DNA hybrid. J Mol Biol, 2006. 361(4): p. 634-43.

75. Severinov K.V., Interactions of DNA-dependent bacterial RNA polymerase with promoters. Mol Biol (Mosk). 2007. 41(3): p. 423-32.

76. Ederth J., Artsimovitch I., Isaksson L.A. Landick R., The downstream DNA jaw of bacterial RNA polymerase facilitates both transcriptional initiation and pausing. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37456-63.

77. Wigneshweraraj S.R., Burrows P.C., Nechaev S., Zenkin N., Severinov K. Buck M., Regulated communication between the upstream face of RNA polymerase and the beta' subunit jaw domain. Embo J, 2004. 23(21): p. 4264-74.

78. Murakami K.S. Darst S.A., Bacterial RNA polymerases: the wholo story. Curr Opin Struct Biol, 2003.13(1): p. 31-9.

79. Zenkin N., Kulbachinskiy A., Yuzenkova Y., Mustaev A., Bass I., Severinov K. Brodolin K., Region 1.2 of the RNA polymerase sigma subunit controls recognition of the -10 promoter element. Embo J, 2007. 26(4): p. 955-64.

80. Craig M.L., Suh W.C. Record M.T., Jr., HO. and DNase I probing of E sigma 70 RNA polymerase—lambda PR promoter open complexes: Mg2+ binding and its structural consequences at the transcription start site. Biochemistry, 1995.34(48): p. 15624-32.

81. Schickor P., Metzger W., Werel W., Lederer H. Heumann H., Topography of intermediates in transcription initiation ofE.coli. Embo J, 1990. 9(7): p. 2215-20.

82. Spassky A., Kirkegaard K. Buc H., Changes in the DNA structure of the lac UV5 promoter during formation of an open complex with Escherichia coli RNA polymerase. Biochemistry, 1985. 24(11): p. 2723-31.

83. Ozoline O.N. Tsyganov M.A., Structure of open promoter complexes with Escherichia coli RNA polymerase as revealed by the DNase Ifootprinting technique: compilation analysis. Nucleic Acids Res, 1995. 23(22): p. 4533-41.

84. Haugen S.P., Ross W. Gourse R.L., Advances in bacterial promoter recognition and its control by factors that do not bind DNA. Nat Rev Microbiol, 2008. 6(7): p. 507-19.

85. Hsu L.M., Promoter clearance and escape in prokaryotes. Biochim Biophys Acta, 2002. 1577(2): p. 191-207.

86. Kapanidis A.N., Margeat E., Ho S.O. Kortkhonjia E., Weiss S. Ebright R.H., Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science, 2006. 314(5802): p. 1144-7.

87. Revyakin A., Liu C., Ebright R.H. Strick T.R., Abortive initiation and productive initiation by RNA polymerase involve DNA scrunching. Science, 2006. 314(5802): p. 1139-43.

88. Vassylyeva M.N., Svetlov V., Dearborn A.D., Klyuyev S., Artsimovitch I. Yassylyev D.G., The carboxy-terminal coiled-coil of the RNA polymerase beta'-subunit is the main binding site for Gre factors. EMBO Rep, 2007. 8(11): p. 1038-43.

89. Gelles J. Landick R., RNA polymerase as a molecular motor. Cell, 1998. 93(1): p. 13-6.

90. Spirin A.S., RNA polymerase as a molecular machine. Mol Biol (Mosk), 2002. 36(2): p. 208-15.

91. Lewin B., Genes VIII. 2004: Benjamin Cummings. 1056.

92. I-Ielmann J.D., Compilation and analysis of Bacillus subtilis sigma A-dependent promoter sequences: evidence for extended contact between RNA polymerase and upstream promoter DNA. Nucleic Acids Res, 1995. 23(13): p. 2351-60.

93. Voskuil M.I., Voepel K. Chambliss G.H., The -16 region, a vital sequence for the utilization of a promoter in Bacillus subtilis and Escherichia coli. Mol Microbiol, 1995.17(2): p. 271-9.

94. Camacho A. Salas M., Effect of mutations in the "extended -10" motif of three Bacillus subtilis sigmaA-RNA polymerase-dependentpromoters. J Mol Biol, 1999. 286(3): p. 683-93.

95. Voskuil M.I. Chambliss G.H., The -16 region of Bacillus subtilis and other gram-positive bacterial promoters. Nucleic Acids Res, 1998. 26(15): p. 3584-90.

96. Voskuil M.I. Chambliss G.H., The TRTGn motif stabilizes the transcription initiation open complex. J Mol Biol, 2002. 322(3): p. 521-32.

97. Ozoline O.N., Fujita N. Ishihama A., Transcription activation mediated by the carboxyl-terminal domain of the RNA polymerase alpha-subunit. Multipoint monitoring using a fluorescent probe. J Biol Chem, 2000. 275(2): p. 1119-27.

98. Ross W., Thompson J.F. Newlands J.T. Gourse R.L., E.coli Fisprotein activates ribosomal RNA transcription in vitro and in vivo. Embo J, 1990. 9(11): p. 3733-42.

99. Ross W., Gosink K.K., Salomon J. Igarashi K., Zou C., Ishihama A. Severinov K. Gourse R.L., A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. Science, 1993. 262(5138): p. 1407-13.

100. Browning D.F. Busby S .J., The regulation of bacterial transcription initiation. Nat Rev Microbiol, 2004. 2(1): p. 57-65.

101. Ross W. Gourse R.L., Sequence-independent upstream DNA-alphaCTD interactions strongly stimulate Escherichia coli RNA polymerase-lacUV5promoter association. Proc Natl Acad Sci USA, 2005.102(2): p. 291-6.

102. Davis C.A., Capp M.W., Record M.T., Jr. Saecker R.M., The effects of upstream DNA on open complex formation by Escherichia coli RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(2): p. 285-90.

103. Estrem S.T., Gaal T., Ross W. Gourse R.L., Identification of an UP element consensus sequence for bacterial promoters. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(17): p. 9761-6.

104. Katayama S., Matsushita O., Jung C.M., Minami J. Okabe A., Promoter upstream bent DNA activates the transcription of the Clostridium perfringens phospholipase C gene in a low temperature-dependent manner. Embo J, 1999.18(12): p. 3442-50.

105. Gourse R.L., Ross W. Gaal T., UPs and downs in bacterial transcription initiation: the role of the alpha subunit of RNA polymerase in promoter recognition. Mol Microbiol, 2000. 37(4): p. 687-95.

106. Haugen S.P., Berkmen M.B., Ross W., Gaal T., Ward C. Gourse R.L., rRNA promoter regulation by nonoptimal binding of sigma region 1.2: an additional recognition element for RNA polymerase. Cell, 2006. 125(6): p. 1069-82.

107. Haugen S.P., Ross W., Manrique M. Gourse R.L., Fine structure of the promoter-s igma region 1.2 interaction. Proc Natl Acad Sci USA, 2008.105(9): p. 3292-7.

108. Graves M.C. Rabinowitz J.C., In vivo and in vitro transcription of the Clostridium pasteurianum ferredoxin gene. Evidence for "extended" promoter elements in gram-positive organisms. J Biol Chem, 1986. 261(24): p. 11409-15.

109. Zaman Z., Ansari A.Z., Gaudreau L., Nevado J. Ptashne M., Gene transcription by recruitment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1998. 63: p. 167-71.

110. Helmann J.D., Purification of Bacillus subtilis RNA polymerase and associatedfactors. Methods Enzymol, 2003. 370: p. 10-24.

111. Hyde E.I., Hilton M.D. Whiteley H.R., Interactions of Bacillus subtilis RNA polymerase with subunits determining the specificity of initiation. Sigma and delta peptides can bind simultaneously to core. J Biol Chem, 1986. 261(35): p. 16565-70.

112. Lopez de Saro F.J., YoshikawaN. Helmann J.D., Expression, abundance, and RNA polymerase binding properties of the delta factor of Bacillus subtilis. J Biol Chem, 1999. 274(22): p. 15953-8.

113. Borukhov S. Severinov K., Role of the RNA polymerase sigma subunit in transcription initiation. Res Microbiol, 2002.153(9): p. 557-62.

114. Artsimovitch I., Svetlov V., Anthony L., Burgess R.R. Landick R., RNA polymerases from Bacillus subtilis and Escherichia coli differ in recognition of regulatory signals in vitro. J Bacteriol, 2000.182(21): p. 6027-35.

115. RojcrF., Nuez B., Mencia M. Salas M., The main early and late promoters of Bacillussubtilis phage phi 29 form unstable open complexes with sigma A-RNA polymerase that arecstabilized by DNA supercoiling. Nucleic Acids Res, 1993.21(4): p. 935-40.

116. Whipple F.W. Sonenshein A.L., Mechanism of initiation of transcription by Bacillus subtilis RNA polymerase at several promoters. J Mol Biol, 1992. 223(2): p. 399-414.

117. Nechaev S., Chlenov M. Severinov K., Dissection of two hallmarks of the open promoter complex by mutation in an RNA polymerase core submit. J Biol Chem, 2000. 275(33): p. 2551622.

118. Bartlett M.S., Gaal T., Ross W. Gourse R.L., RNA polymerase mutants that destabilize RNA polymerase-promoter complexes alter NTP-sensing by rrn PI promoters. J Mol Biol, 1998. 279(2): p. 331-45.

119. Severinov K. Darst S.A., A mutant RNA polymerase that forms unusual open promoter complexes. ProcNatl Acad Sci USA, 1997. 94(25): p. 13481-6.

120. Zhou Y.N. Jin D.J., The rpoB mutants destabilizing initiation complexes at stringently controlled promoters behave like "stringent" RNA polymerases in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(6): p. 2908-13.

121. Buc H. McClure W.R., Kinetics of open complex formation between Escherichia coli RNA polymerase and the lac UV5 promoter. Evidence for a sequential mechanism involving three steps. Biochemistry, 1985. 24(11): p. 2712-23.

122. Straney D.C. Crothers D.M., A stressed intermediate in the formation of stably initiated RNA chains at the Escherichia coli lac UV5promoter. J Mol Biol, 1987. 193(2): p. 267-78.

123. Brunner M. Bujard H., Promoter recognition and promoter strength in the Escherichia coli system. Embo J, 1987. 6(10): p. 3139-44.

124. Knaus R. Bujard H., PL of coliphage lambda: an alternative solution for an efficient promoter. Embo J, 1988. 7(9): p. 2919-23.

125. Ramos J.L., Martinez-Bueno M., Molina-Henares A.J., Teran W., Watanabe K., Zhang X., Gallegos M.T., Brennan R. Tobes R., The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol Mol Biol Rev, 2005. 69(2): p. 326-56.

126. Martin R.G., Gillette W.K., Martin N.I. Rosner J.L., Complex formation between activator and RNA polymerase as the basis for transcriptional activation by Mar A and SoxS in Escherichia coll Mol Microbiol, 2002. 43(2): p. 355-70.

127. Brown N.L., Stoyanov J.V., Kidd S.P. Hobman J.L., The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev, 2003. 27(2-3): p. 145-63.

128. Schlax P. J., Capp M.W. Record M.T., Jr., Inhibition of transcription initiation by lac repressor. J Mol Biol, 1995. 245(4): p. 331-50.

129. Straney S.B. Crothers D.M., Lac repressor is a transient gene-activating protein. Cell, 1987. 51(5): p. 699-707.

130. Lee J. Goldfarb A., lac repressor acts by modifying the initial transcribing complex so that it cannot leave the promoter. Cell, 1991. 66(4): p. 793-8.

131. Smith T.L. Sauer R.T., Dual regulation of open-complex formation and promoter clearance by Arc explains a novel repressor to activator switch. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(17): p. 8868-72.

132. Monsalve M., Calles B., Mencia M., Salas M. Rojo F., Transcription activation or repression by phage psi 29 protein p4 depends on the strength of the RNA polymerase-promoter interactions. Mol Cell, 1997.1(1): p. 99-107.

133. Cheng Y., Dylla S.M. Turnbough C.L., Jr., A long T. A tract in the upp initially transcribed region is requiredfor regulation of upp expression by UTP-dependent reiterative transcription in Escherichia coli. J Bacteriol, 2001.183(1): p. 221-8.

134. Yarnell W.S. Roberts J.W., The phage lambda gene Q transcription antiterminator binds DNA in the late gene promoter as it modifies RNA polymerase. Cell, 1992. 69(7): p. 1181-9.

135. Ausubel F.M., Current Protocols in Molecular Biology ed. Ausubel FM B.R., Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K 2003, New York: John Wiley & Sons. 5300.

136. Reyes-Ramirez A. Ibarra J.E., Fingerprinting of Bacillus thuringiensis type strains and isolates by using Bacillus cereus group-specific repetitive extragenic palindromic sequence-based PCR analysis. Appl Environ Microbiol, 2005. 71(3): p. 1346-55.

137. Joseph Sambrook D.R., Molecular cloning — laboratory manual. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 999.

138. Van de Peer Y. De Wachter R., TREECONfor Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput Appl Biosci, 1994.10(5): p. 569-70.

139. Nei M. Li W.H., Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc Natl Acad Sci USA, 1979. 76(10): p. 5269-73.

140. Saitou N. Nei M., The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees Mol Biol Evol, 1987. 4(4): p. 406-25.

141. Michel E., Reich K.A., Favier R., Berche P. Cossart P., Attenuated mutants of the intracellular bacterium Listeria monocytogenes obtained by single amino acid substitutions in listeriolysin O. Mol Microbiol, 1990. 4(12): p. 2167-78.

142. Bhavsar A.P., Zhao X. Brown E.D., Development and characterization of a xylose-dependent system for expression of cloned genes in Bacillus subtilis: conditional complementation of a teichoic acid mutant. Appl Environ Microbiol, 2001. 67(1): p. 403-10.

143. Baida G., Budarina Z.I., Kuzmin N.P. Solonin A.S., Complete nucleotide sequence and molecular characterization of hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEMS Microbiol Lett, 1999.180(1): p. 7-14.

144. Borukhov S. Goldfarb A., Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. Protein Expr Purif, 1993. 4(6): p. 503-11.

145. Tang H., Kim Y., Severinov K., Goldfarb A. Ebright R.H., Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme: rapid reconstitution from recombinant alpha, beta, beta', andsigma subunits. Methods Enzymol, 1996. 273: p. 130-4.

146. Zeigler, Bacillus Genetic Stock Center Catalog of Strains. Seventh Edition ed. Vol. Volume 4: Integration Vectors for Gram-Positive Organisms. 2002. 56.

147. Guinebretiere M.H., Fagerlund A., Granum P.E. Nguyen-The C., Rapid discrimination of cytK-1 and cytK-2 genes in Bacillus cereus strains by a novel duplex PCR system. FEMS Microbiol Lett, 2006. 259(1): p. 74-80.

148. Kovalevskii O.V., Antson A. A. Solonin A.S., Contraction of the disordered loop located within C-terminal domain of the transcriptional regulator HlyllR causes its structural rearrangement. Mol Biol (Mosk), 2009. 43(1): p. 126-35.

149. Borukhov S., Sagitov V., Josaitis C.A., Gourse R.L. Goldfarb A. Two modes of transcription initiation in vitro at the rmB PI promoter of Escherichia coli. J Biol Chem, 1993. 268(31): p. 23477-82.1. Благодарности:

150. Я искренне благодарен своим научным руководителям Константину Викторовичу Северинову и Александру Сергеевичу Солонину за мудрое руководство и помощь при выполнении данной работы.

151. Я признателен оппонентам и рецензентам за критические замечания и обсуждение работы.

152. Также я хочу выразить особую признательность JI.C. Грабовской за помощь и поддержку в оформлении огромного количества документов сопутствующих защите кандидатской диссертации.

153. Особую благодарность выражаю своей маме Нине Павловне Шадриной за многолетнюю поддержку, помощь и сопереживание.

Информация о работе

Шадрин, Андрей Михайлович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.03

Диссертация

Регуляция экспрессии генов пороформирующих токсинов B. cereus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы