Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика гемолизина II Bacillus cereus

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика гемолизина II Bacillus cereus"

На правах рукописи

Ковалевская Жанна Ивановна

Выделение в характеристика гемолизина II ВасШт сект

03 00 03 - Молекулярная биология

0031619В7

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г Москва-2007

003161967

Работа выполнена в лаборатория молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г К Скрябина РАН, г Пущине, в лаборатории молекулярной физиологии клетки Института биофизики клетки РАН, г Пущино

Научные руководители кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Солонин Александр Сергеевич, ШФМ РАН

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, профессор, Харакоз Дмитрий Петрович, ИТЭБ РАН, г Пущино

Ведущая организация Институт биоорганической химии РАН им академиков ММ Шемякина и Ю А Овчинникова, г Москва

Защита диссертации состоится ноября 2007г в 14 00 часов на заседании Диссертационного Совета Д217 013.01 при ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» но адресу 117545, г Москва, 1-й Дорожный 1фоезд,1 Факс (495)315-05-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП ГосНИИгенегака

кандидат биологических наук,

Терновский Вадим Игоревич, ИБК РАН

доктор биологических наук, профессор, Азизбекян Рудольф Рубенович, ФГУП ГосНИИгенегака, г Москва

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ЗаиграеваГ Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из основных фундаментальных направлений современных микробиологии и медицины является изучение патогенности микроорганизмов В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают широкий спектр веществ, как непосредственно повреждающих или убивающих клетки макро- и микроорганизмов, так и способствующие проникновению бактерий в организм хозяина, вследствие преодоления его защитных систем Эти соединения играют главную роль в развитии заболеваний, вызываемых бактериями (McDonel et а!, 1986)

Среди многообразия таких веществ можно выделить цитолитические токсины, которые играют немаловажную роль в патогенезе Характерными примерами токсинов являются такие цитолизины, как фосфолипаза С Clostridium perfrmgens - основной фактор, ответственный за развитие газовой гангрены, отечный и летальный токсины Bacillus anthracis, обеспечивающие вирулентность, альфа-токсин Staphylococcus aureus, вызывающий целый ряд клинических эффектов при стафилококковых инфекциях и являющийся Р-складчатым каналообразующим цитолизином

Интерес к исследованиям (¡-складчатых каналообразующях токсинов не ограничивается лишь медшщнской сферой Изучение этих белков стимулируется и тем, что они стали ценными инструментами при исследовании клеточной физиологии и функционирования клеточных мембран и превосходными модельными объектами для выяснения связи между структурой и функцией белка. Р-Складчатые каналообразующие цитолизины являются хорошей моделью в изучении белок-мембраниого взаимодействия В последнее время они нашли своё применение и в биотехнологии, в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков (Noireaux, 2004), а также в конструкции нанопор (Merzlyak, 2005) и биосенсоров (Gu, 2001) К Р-складчатым каналообразующим токсинам относят ряд цитолизинов Staphylococcus aureus (a-токсин, лейкоцидины, у-гемолизин), р-токсин Clostridium perfrmgens and CytK токсин В cereus

Изучение механизмов действия этих токсинов и их функции в патогенезе представляется одним из наиболее актуальных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов Особый интерес вызывают токсины цереусной группы микроорганизмов рода Bacillus, в эту группу входят В anthracis, известный как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву, В thurmgiensis - являющийся патогенным для насекомых и широко использующимся для производства инсектицидных препаратов, что ведет к широкомасштабному внесению и неконтролируемому распространению этого микроорганизма в окружающей среде, В cereus, который относится

к условно-патогенным для теплокровных, но является одним из основных бактериальных загрязнителей продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов Эти микроорганизмы продуцируют ряд цитолитических белков, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности В связи с выше изложенным, важно определить степень безопасности этих микроорганизмов для животных и человека и изучить участие отдельных токсинов, продуцируемых этими бактериями в патогенном процессе

В cereus может вызывать диаррейный и эметический синдромы, а также заболевания глаз, маститы и другие болезни. Ряд внеклеточных токсинов В cereus, обладают гемолитической активностью и рассматриваются в качестве потенциальных факторов патогенности (Drobmewski, 1993) Один из цитолитических порообразующих токсинов В cereus - гемолизин II (Hlyll) представляет особый интерес, так как он является гомологом такого опасного токсина, как альфа-токсин Staphylococcus aureus Более того, он широко распространен среди бацилл цереусной группы, так как его ген обнаружен также в клетках В thurmgiensis, В ш ihenstephanensis и В anihracis.

К настоящему времени ряд гемолизинов В cereus получен в очищенном состоянии и активно изучаются в самых разнообразных аспектах, тогда как гемолизин II до сих пор практически не изучен, поскольку не удавалось получить высокоочшценный препарат бежа Благодаря высокой гомологии с альфа-токсином есть основания считать, что гемолизин может играть немаловажную роль в патогенезе и поэтому требуется его всестороннее изучение. Данное обстоятельство определяет актуальность разработки метода очистки, получения гомогенного препарата белка и исследования его свойств

Цели н задачи исследования. Целью настоящей работы являлось проведение структурно-функционального анализа гемолизина П Bacillus cereus. Для достижения указанной цели решались следующие задачи

1 Подобрать оптимальные условия для максимальной экспрессии гена гемолизина II Bacillus cereus в клетках Е coli

2 Разработать метод очистки препарата Hlyll

3 Определить роль сигнальной пептидазы в процессинге Hlyll

4 Изучить механизм действия гемолизина II с использованием искусственных и клеточных мембран

5. Изучить свойства пор, формируемых гемолизином Н в естественных и искусственных мембранах, механизм и условия порообразования

6 Изучить цитолитическое действие и влияние на макроорганизмы гемолизина II

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г К Скрябина РАН

Научная новизна работы. Впервые получен высокоочищенный препарат гемолизина II В cereus, исследованы его свойства и определен механизм действия.

Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве Получение чистого препарата гемолизина II и изучение его структурно-функциональных особенностей дабт возможность для выяснения возможности его участия в патогенезе и поиска подходов для нейтрализации действия токсина Препарат гемолизина II может быть использован в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков, а также в конструкции нанопор Полученные результата можно применять в нанотехнологии, конструировании мембранных пор с определёнными свойствами (с разной проводимостью, селективностью и т д ) Такие поры могут бьггь употреблены как компоненты фильтров, биосенсоров и других наноустройств Тот факт, что гемолизин II широко распространен среди штаммов В thuringiemis, применяемых как биологический инсектицид, заставляет усилить внимание к тщательному анализу используемых штаммов на предмет их безопасности для человека и животных, а также заостряет вопрос о правомочности использования данного микроорганизма в качестве инсектицидного препарата

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 Статьи. Результаты работы были представлены на 7-ой Путинской конференции молодых ученых (Пущино, апрель 2003), на конференции ИБФМ РАН (Пупдано, декабрь 2003), на международной конференции Gordon Research Conference (Andover, USA, 2004), на 3-ей международной конференции из серии "Наука и бизнес" (Пущино, июнь 2006), на 106-ой конференции American Society for Microbiology (Orlando, 2006)

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы Список литературы включает 261 источников Работа содержит 40 рисунков и 4 таблицы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Продукция зрелого гемолизина П при помощи секреционного аппарата Е. coll Гемолизин II был очищен из культуральной среды, выращенных при оптимальных условиях клеток Е coli Z85 (pUJ2) (Рис 2А) с использованием эмпирической аффинной хроматографии При подборе оптимальных условий бактериального роста и индукции (Табл I) была обнаружена зависимость уровня продукции Hlyll от температуры культивирования клеток Е coli Z85 трансформированных плазмидой pUJ2 Уровень продукции токсина определяли по гемолитической активности в культуральной среде и внутри клетки

Табл. 1. Влияние условий культивирования на продукцию гемолизина II

рекомбинантными клетками Е coli Z85 (рШ2)

Условия культивирования гемолитическая активность, ГЕ/мл

18°С 24°С ] 37°С

в присутствии ИПТГ 20 120 1

без ИПТГ 10 40 I 1

Наибольшая продукция токсина была получена при 24°С При 37°С ни значительная активность токсина в культуральной среде, ни накопление белка внутри клетки не были обнаружены, видимо из-за температурной инактивации гемолизина II Также необходимыми факторами были сильная аэрация и повышение концентрации №С1 до 15-20 г/л, что приводит к умеренному увеличению гемолитической активности в культуральной среде Полученная гемолитическая активность в культуральной среде составила 100-120 ГЕ/мл (ПЕ - гемолитическая единица), что в 4-5 раз выше активности в неочищенном экстракте разрушенных клеток Это может указывать на то, что гемолизин II является секреторным белком

Внеклеточный Н1у11 был очищен из культуральной среды по схеме представленной в таблице 2 (Рис №) Аффинная хроматография проводилась на эмпирически подобранном аффинном сорбенте с золотисто-желтым лигандом (Рис 1А), который является одним из 30-ти различных хлортриазиновых красителей, ковалентно связанных с гидрофильным носителем йерЬагоэе 4В Очищенный белок имел молекулярную массу равную 42 кДа меньшую молекулярной массы гемолизина II, вычисленного из нуклеотидной последовательности (45,6 кДа) Это может свидетельствовать о том, что Н1у11 синтезируется в форме предшественника, имеющего сигнальный пепггид, который в ходе секреции отщепляется с образованием зрелого белка.

Табл. 2. Очистка гемолизина II из культуральной среды Е. coh Z85 (pUJ2)

Стадии очистки Общее количество белка, мкг Общая гемолитическая активность, ГЕ Удельная активность, ГЕ/мкг Степень очистки

культуральный супернатант 360000 100000 0 27 1

ультрафильтрация 352000 100000 0 28 102

фосфоцеллюлоза Р-11 4700 93000 20 72 20

аффинная хроматография 1080 90000 83 299 64

Supero.se-12 125 52000 416 1501 80

Оптимальная температура хранения Н1уП -20°С Гемолитическая активность Н1у11 при 4°С уменьшалась до 1% за 3 дня Уменьшение активности после короткого хранения при такой температуре может быть из-за спонтанной агрегации гемолитически активных мономеров

Для и чистки внутриклеточного гемолизина II который включал периплазм этическую фракцию была разработана совершенно иная схема выделения (Рис. 1С), К1-концевой аминокислотный анализ внутриклеточное и внеклеточного гемолизина II, перенесенных с 8М-РААО на мембрану, показал, что белки не содержат сигнального пептида н начинаются с 32 аминокислот о го остатка (Рие. 2А, В). Скорее всего, внутриклеточный ШуИ сразу транслоцируется через внутреннюю мембрану в периплазму и процессируется. Таким образом, гемолизин II синтезируется в форме предшественника, имеющего сигнальный пептид из 31 аминокислотного остатка, который в ходе секреции отщепляется с

образованием зрелого белка.

Акр.

MlI эв, г

г»»—. — Hlytl _ -21'6

S ЯШ 14,4

123 45 ПЗ 4 5 12346

Рнс.1, Экспрессия и очистка гемолизина II. Химическая структура золотисто-желтого красителя (А), SDS-элеюрофорегическпе разделение в 12% полиакрнламидном геле белков при очистке внеклеточного гемолизина II (В), продуцируемых клетками Е. coli Z85 (pUJ2) (дорожка 2), после хроматографии на фосфо целлюлозе Р-11 (3), после аффинной хроматографии (4), после гель фильтрации на Superose-12 (5), смеси маркерных белков (дорожка 1); при очистке внутриклеточного гемолизина II (С) из клеточного экстракта (дорожка 1), после КМ-целлюлозы (2), после АсА-44 (3), после гелъфильтрации на Superose-12 (4) и очищенного внеклеточного гемолизина IL, в качестве маркера (5); белков клеток (D) Е. coli BL21 (pET29-Hlyü-Kis6) до индукции (дорожка 2), через 2 часа (3), 4 часа (4) и 6 часов (5) после индукции ИПТГ, гемолизина II (1). Экспрессия Hlyl! с сигнальным пептидом (Е). SDS-электрофорегическое разделение в 10% полиакрил ам и дном геле белков, продуцируемых клетками Е coli LEPI(pUJ2) до индукции (дорожка 2), после индукции ИПТГ (3), после индукции клеток £. coli LEPI (4), очищенного HlylJ, без сигнального пептида (5), смеси маркерных белков (дорожка 1),

Подтверждение участия сигнальной пептидазы в процессинге гемолизина !1 было получено при использовании бактериального штамма Е. coli LEPI дефектного по сигнальной пентидазе. После индукции экспрессии гемолизина II в Е. coli LEPI (pUJ2) была обнаружена

экспрессия белкового продукта внутри клетки с более высоким молекулярным весом (-45,6 кДа), в отличие от зрелого гемолизина II (42 кДа) (Рис 1Е) Присутствие сигнального пептида в этом белке было подтверждено N-концевым анализом Таким образом, процессинг гемолизина II в клетках Е coli обеспечивается сигнальной пептидазой

EcoRI

hlyll

hlyllR

В

EcnRl

1 GAATTCTATAATTTTTTTGTAI I I II I TAAACAAGAATTTTAAATAT^TATTTAAAATT

HljTm binding site

60 cttgtttaaatcgttattctgtgttttaataatattGataatagttatcagtaaagaaga -10 hlyll transcription start

120 GATGGAAATTAGCAAATCAAGTGTTGATAGTTATTGGCATAAAGATTAATAAATTTCTAC

180 ATTCSTAACGrTTATAAATCTATCTCTAGTATTGAGAGCTAAAAATAATACGTTTATATCTT

structural part of hlyll gene SD MKKAKGXAKS

240 TTAAATGTTTAAGAAGGAGTGGCTGTCTGTATGAAAAAAGCAAAGGGAATAGCTAAAAGT signal peptide

11 VAVASVIMSGSLGLOATSAFA

300 GTTGCCGTAGCGTCCGTTATAATGrCTSGATCACTTGGTT'racaagcaacatctgcatttgca ^ mature Hlyil

31t d s k_<5_t_

360 GATTCTAAAGGAACTGTAGAAAATCTTCAAAATGGTGGGAAAGTCTATAATAGTTTTA

411 K I stop hlyll 1500 AAAATCTTAATCAGTAAATA

Ndel

hlyll

fad

кап

pET29b-Hlyll-H,s 6470 bp

signal peptide

31 aa DSKGTV->

mature Hlyll

380 aa

cleavage alte

t

Ms-tag

N-termlnal domain 286 aa

C-termlnal domain 94 aa

Рис.2. A

плазмиде

Схема EcoRI фрагмента хромосомальной ДНК В cereus 111, содержащегося в pUJ2 В Нуклеотидная последовательность гена hlyll Стартовая точка транскрипции hlyll обозначена крупным шрифтом Последовательность Шайна-Дальгарно (SD) обозначена жирным шрифтом Сигнальный пептид выделен жирным шрифтом и подчеркнут Стартовый кодон обозначен одинарным подчеркиванием, терминирующий -двойным подчеркиванием Сайт связывания для белка регулятора HlyfIR отмечен встречными стрелками Сайт отщепления сигнального пептида указан вертикальной стрелкой С Схема рекомбинантной плазмиды pET29-HlyII-His6 D Структура белка гемолизина П

Секреция гемолизина II штаммом Bacillus subtihs BD170-EH2 (Bacillus subtilis subsp mbhlis 168 в хромосому которого в локус атуЕ интегрирована кассета, содержащая ген устойчивости к хлорамфениколу и часть 2,9 kb фрагмента ДНК от ЕсоШ до Bss&l сайтов с геном hlyll) осуществляется сразу во внеклеточную среду, так как гемолитическая активность в культуральной среде была 2000 ГЕ/мл, а внутриклеточная гемолитическая активность равнялась нулю, что подтверждает секреторные свойства гемолизина II

Штамм Е coli - продуцент гемолизина II был создан с использованием векторной гогазмиды с регуляцией экспрессии чужеродных генов Структурная часть данного гена, включая сигнальный пептид, амплифицирована посредством ПЦР и клонирована в экспрессирующий вектор рЕТ-29Ь(+) под контроль промотора гена 10 фага Т7 Были сконструированы плазмиды рЕТ29-Н1у11 и pET29-HlyII-His6, последняя обеспечивала продукцию гемолизина II с шестью гистидинами на С-конце (Рис 2 С, D) Индукция синтеза HlyII-His6 показана на рис ID

2. Моделирование структуры поры гемолизина П Аминокислотная последовательность Hlyll (исключая 94 С-концевые аминокислоты) имеет высокую степень гомологии с последовательностью а-токсина S aureus (31% идентичности) Кристаллическая структура поры а-токсина с разрешением 19 Ä, сформированная семью идентичными субьединицами, была использована для гомологичного моделирования поры Hlyll Полученная модель гептамерного комплекса Hlyll, имеет грибовидную форму и состоит из кэп домена, стеблевого домена и семи краевых доменов (Рис ЗА) Размер олигомера около 10 нм в диаметре с высотой 10 нм Внутренний диаметр поры варьирует от 1 до 4 нм вдоль длины канала (2 нм при входе, максимальный - 4 нм внутри кэп домена, 1 2 нм в начале трансмембранного стебля и от 1 нм до 1 6 нм вдоль остального стебля) (Рис ЗС)

Стеблевой район Hlyll длиннее на 3 аминокислоты, чем у а-токсина и содержит внутри больше заряженных аминокислотных групп Внутренняя поверхность стеблевого домена Hlyll имеет четыре пояса заряженных аминокислотных остатков К105 и D146 на верхушке стебля, Е109 и К140, К119 и D130, D124 и К125 у основания стебля (Рис 3 В, D, Е), в отличие от а-токсина, который имеет два пояса заряженных остатков Примерное расстояние между Са-атомами поясов 1 3, 2 5 и 1 5 нм (Рис ЗС) Сравнение с другими ß-складчатыми каналообразующими цитолизинами показало, что аминокислотные остатки, вовлеченные в протомер-протомер взаимодействие не консервативны, в то время как часть краевого домена Hlyll (176-197, 250-259 аминокислоты), которая взаимодействуют с мембраной, более консервативна

РисД. M o.i скуля pu к н модель норы гемолизина 11. Молекулярное моделирование было проведено с использованием 3D структуры гептамериой поры аН1_ {7 AHL.) при употреблении сервера Frankenstam (http://genesilico.pl /frankenstein/). Вид сбоку гептамерной поры Hlyl!, внедренной в пшнШШЙ бислой (А), Размеры поры И положение стебля в лшщаноы бислое. Равные протомеры изображены различными цветами. Обозначены основные домены: стеблевой (stem), краевой (rim) н "юп"-домен (cap). Продольный разрез гептамерной поры Hlylí (В. С). Распределение заряженных остатков внутри поры (красным цветом показаны отрицательно заряженные остатки, сшшм - положительно заряженные) (В). Радиусы внутреннего канала (С). Распределение аминокислотных остатков внутренней (D) и внешней (Е) поверхности стеблевого домена гемолизина II. Показаны остатки, цепи которых выступают внутрь канала (DJ и наружу (Е). Ser, Thr. Asm. Туг - выделены зеленым цветом: Asp. Glu - красным: Lys. Arg - голубым; все остальные - черным цветом.

Моделирование Hlyíl мономера проводили, с использованием кристаллических структур лейкоцидиновых мономеров 3LKF.pdb и lPVL.pdb, которые при взаимодействии с мембранами формируют гексамеры и структур цитолизинов, образующих октамеры. Для проверки возможности формирования гекса- и октамеров было выполнено моделирование Hlyl I октамерных и гексамерных структур при помощи m-zdock программы (http://zIab-bu-edu/m-zdock/). Не было обнаружено никаких стерических ограничений, которые могли бы препятствовать формированию каналов с большим числом субъединиц (т.е. октамеров), ко формирование гексамеров может быть затруднено, так как длинные боковые цепи заряженных аминокислот направлены внутрь канала (Рис.4). Моделирование разных олигомерных форм Hlyll говори! о том, что в природе вероятнее всего может происходить формирование гекса-, гепта- и октамерных пор Hly II.

-10 пт

в

с

Риё.4. Модели различны! олигомерных состояний гемолюиш II А; Представлена модель кэпа гексдаерной структуры Н1уП. В Модель юга гегагамёрной структуры Н1у1!. С: Модель юга окгамернвЯ структуры Н1у11, Модели юное были выполнены m-7.doc к программой 1Шр ШшШ\1-е&Ыт-%Доск/у

94 С-концевых ам инокизлопгных остатка гемолизина II, отсутствует в аН L. Мы предположили, что С-коиен Hlyll существует как независимый белковый домен, основываясь на сто чувствительности к проте оптическом у расщеплению. MlyM, лишенный С-концсвого домена, сохранял способность формировать поры в мембранах, но с меньшей эффективностью. Мы употребили подход de novo моделирования совместно с поиском в белковом банке данных для распознавания дальних скрученных участков (Рис, 5А). Основываясь на наших моделях, мы предполагаем, что С-конце вой домен располагается с внешней стороны поры, являясь дополнением к каждой субъединиие гемолшина в районе кэп домена н не может блокировать частично или полностью вход в нее. Скорее всего, он участвует в протомер-нротомер взаимодействии, поэтому его утрата ведет к снижению способности белка к олигомеризапии. Интересно, что модельная структура С-концевого домена Hlyll имеет укладку подобную фратаксинам (Рис. 5В). которые играют важную роль в связывание железа е помощью участков негативно наряженной поверхности в прокариотах и эукарногах. Маленькие, негативно заряженный участки были найдены и в С -концевом

длчI ! I !v 11

Рис.5. Молекулярная мЩельCS-концевого домена гемолшина II (А) и 3D структуры frataxin Е. coli (1 L:\V4) (В). Модель С-концевого домена Hlyll была получена при помощи de novo белкового моделирования программой Rosetta (Воппеаи, 2001) с последующим выравниванием к пределах PDI3 базы данных. На обоих рисунках показаны заряженные аминокислотные остатки, которые могут функционировать как хелаторы железа.

3. Размеры нор сфорхиропанны* гемолизином II

Гидродинамический радиус лоры определяли, используя в качестве осмотических протестантов ряд поли этиленгликоле й, имеющих молекулы различного и известного диаметра. Значительный эффект снижения уровня гемолиза (около 40%) наблюдали и присутствии ПЭГ 400 (радиус 0,68 нм). Гемолиза не было замечено, когда эритроциты инкубировали с Н1у11 в растворе с ПЭГ более высокого молекулярного веса (от 600 до 6000) (Рис.бА) Оцененный нами функциональный диаметр пор составил около 1.5 им.

£

(А

1 1

0.0 0.5 г: »л £.0 1.6 1"1ус1[0(1уп0|1>1с 1чг;

10 пт

Ш тШМи

Рис.6. Электронная микроскопия пор гемолнтияв II. сформированных в л II носа мах. Ингибиторное действие осмотических протектантов ни Н!у11 индуцированный гемолиз (Л). Осмотические протектанты имеют следующие гидродинамические радиусы: ПЭГ 200. 0.56 нм: ПЭГ 400, 0.68 нм: ПЭГ 600. 0.8 нм; ПЭГ 1000, 1.0 нм: ПЭГ 1500. 1.2 им; ПЭГ 4000. 1.9 им: ПЭГ 6000. 2.9 нм. Эксперименты были проведены при 4°С (черные кружки) н 37°С (белые кружки}. Электронные микрофотографии негативно окрашенных лило сом. Содержащих гемолизин II. Шкала в нижнем левом угл; микрофотографий соответствует 200А. Липосомы (80 00Ох) (В). Липосомы обработанные Шу11 (80000x1 (С). Липосомы с Н1у 11. цифровое увеличение изображения взятого е рисунка С (1)-Р). Смоделированная пора ( вид сверху) (О'), Компьютерное наложение Ё н О (Н).

Анализ электронных микрофотографий негативно окрашенных липидных везикул в присутствии 111у![, полученных с помощью высокоразрешающей электронной микроскопии.

показал многочисленные кольцеобразные ассамблеи собранные вместе (Рис 6 В-Е) Мы провели анализ более ста мультипрофильных изображений молекул (т е ориентированных в поле зрения под различным углом) и на основании этого анализа сделали заключение, что поры могут иметь структуру, состоящую из разного количества субъединиц, возможно формирование гекса-, гепта- и октамеров, что подтверждается успешным моделированием этих структур

Большинство этих ассамблей имели внутренний диаметр пор около 2 нм и внешний диаметр варьировал от 8 до 10 нм, что соответствует результатам, полученным при анализе трехмерной модели гептамерной поры Н1у11 (Рис 6 А-Н) Таким образом, гемолизин II действует как пороформирующий токсин с функциональным диаметром пор около 1 5 нм Результаты полученные с помощью осмотических протектантов соответствуют результатам моделирования Также, при анализе электронно-микроскопических данных было обнаружено, что ШуП как и стафилококковый у-гемолизин, образует многочисленные кластеры с разным количеством пор

4. Свойства каналов, сформированных гемолизином II

Электрофизиологические свойства ионных каналов, сформированных гемолизином II, изучались методом фиксации потенциала на бислойных липидных мембранах (БЛМ) Добавление гемолизина II в мембраноомывающий раствор с одной стороны БЛМ вызывает ступенчатое нарастание тока через мембрану, по мере формирования ионных каналов (Рис 10, И) Были изучены основные свойства Н1у11 канала, такие как проводимость одиночного канала, вольтамперная характеристика одиночного канала, его ионная селективность и зависимость от потенциала в различных экспериментальных условиях В присутствии 100 мМ КС1 каналы находились преимущественно в открытом состоянии (Рис 10 А) Проводимость канала определяли по высоте ступенек тока отображаемых на регистрирующем устройстве после добавления токсина (Рис 10 А, О) Распределение амплитуд проводимостей одиночных каналов в этих условиях (ЮОмМ КС1, 5мМ НЕРЕЗКОЙ, рН 7 4) было достаточно широким (Рис 10 В), однако анализ позволял выявить три пика амплитуд со значениями равными 18±6, 31±3 и 46±9 рБ Следует отметить, что для стафилококкового альфа-токсина, при сходных условиях регистрации, средняя амплитуда проводимости канала составляла 107±3 2 рЯ (Мегйуак, 1999) Эти различия, очевидно, не связаны с радиусом пор, который согласно экспериментам осмотической протекции и белкового моделирования близки по размеру как дня ШуП так и для а-токсина, но могут быть связаны с отличиями в проводящих структурах этих каналов и/или с их зарядовой конституцией Более высокая концентрация заряженных остатков внутри поры Н1у11, возможно, является ответственной за этот эффект Вольтамперная характеристика одиночного канала (ВАХ) была симметричной и линейной во всем использованном

диапазоне потенциалов (Рис ЮС)

от -100 мВ до +100 мВ при 100 мМ KCl

srgle channel conductance (pS)

sngb channel conductance (pS)

Рис. 10. Элекгрофизиологические свойства каналов Hlyll A, D Регистрация проводимости одиночных каналов, сформированных Hlyll добавленным в св камеру (конечная концентрация ~ 50 нг/мл) содержащую 100 мМ (А) и 1000 мМ KCl (D) К мембране было приложено напряжение 30 мВ, trans камера была виртуальным нулем В, Е Гистограммы проводимости одиночных каналов сформированных Hlyll в 100 мМ (В) и 1000 мМ KCl (Е) Количество сформированных каналов было 230 (В) и 150 (Е) (4-5 канала на мембрану) Гистограмма аппроксимирована функцией Гаусса с помощью программы Sigma Plot Пунктирные линии означают наилучшую подгонку под одно распределение амплитуд проводимостей из большинства возможных значений проводим остей, которое составило около 30 pS при 100 мМ KCl и 342 pS при 1000 мМ KCl Сплошной линией показана альтернативная обработка результатов, предполагающая наличие трех проводящих структур (гекса-, гепга- окгамерная структура) С, F Вольтам перная характеристика одиночного канала сформированного Hlyll в 100 мМ (С) и 1000 мМ KCl (F) Каждая ВАХ представляет набор данных полученных из 4-5 независимых экспериментов

При увеличении в экспериментальной среде концентрации KCl до 1 М на гистограмме распределения амплитуд удавалось выявить три пика со средними величинами проводимости 266±80, 502±73 и 805±55 pS (Рис 10 D, Е) Три пика на распределении амштигуд проводимости могут отражать проводимость пор с различной структурой Вольтамперная характеристика канала претерпевала значительные изменения, она становилась гиперлинейной при отрицательных потенциалах и слабо гиполинейной при положительных (Рис 10F) Такое изменение формы ВАХ (по сравнению с 0 1 М раствором)

предположительно может быть вызвано появлением дополнительных барьеров на пути

проходящих ионов за счет увеличения общей гидрофобности образующих канал молекул

токсина Повышение концентрации соли до 1 М вызывало также появление у В АХ

характерной N-образной формы (Рис 10 F) Это интерпретируется как gating, потенциал-

зависимый переход каналов в малопроводящее состояние

Мы обнаружили, что вместе с большинством поринов и многими другими ß-

складчатыми переформирующими токсинами, Hlyll проявляет потенциал-зависимый gating в

1 М KCl при относительно низких значениях напряжения (Рис 11) Так при фиксации на

мембране отрицательного потенциала -60 мВ и ниже, каналы переходили в малопроводящее

отличное от нуля состояние Реверсия потенциала по знаку мгновенно восстанавливало

исходное значение проводимости (Рис 11) Это указывает на то, что наблюдаемый gaiting не

связан с вымыванием под действием электрического поля молекул токсина из мембраны и не

обусловлен долговременными перестройками в структуре поры

Рис.11. Регистрация проводимости канала токсина Hlyll, зависимый от напряжения gating, gating был получен только в 1000 мМ KCl, в 100 мМ KCl каналы остаются открытыми большую часть времени В начале к мембране были приложены 30 мВ После добавления токсина (конечная концентрация 50 нг/мя) мы ждали открытия 3-4 единичных каналов и затем прикладывали импульсы напряжения Стрелки показывают знак и величину импульсов приложенных к мембране Фиксация напряжения 0 мВ была необходима для стандартизации начальных условий При фиксации позитивных потенциалов каналы были в открытом состояние в течение всего времени регистрации При негативном потенциале - 100 мВ, был получен спонтанный переход каналов на более низкий (отличный от нуля) уровень проводимости Только при приложении позитивных потенциалов значение первоначальной проводимости было восстановлено Пунктирная линия соответствует уровню нулевой проводимости мембраны

Широкое распределение амплитуд проводимости канала с тремя выраженными пиками говорит о том, что не все поры Hlyll обладают идентичной структурой Наблюдаемые три пика проводимости скорее всего соответствуют гекса-, гепта- и октамерным структурам канала Для доказательства вероятности существования этих структур, с помощью молекулярного моделирования мы оценили, как изменение геометрического сечения канала во всех трех случаях могло бы повлиять на его амплитуду проводимости При этом мы вынуждены допустить, что добавление или удаление из проводящей структуры одной субъединипы белка несущественно влияет на все свойства канала, кроме проводимости и тогда проводимость канала пропорциональна только площади его сечения Полученные отношения проводимостей 1 1 7 2 6 (в 100 мМ KCl) и 1 1 9 3 (в 1000 мМ KCl) оказались близкими к отношению площадей сечений полученных из моделей

25 рА j_

5s

Irrt/

КТО mW

-«On«

1=0

Ю0 mV mV

различных олигомерных состояний 1 1 8 2 8, для гекса-, гспта-, октамеров (рис 4) Проведенная нами оценка показывает, что сделанные нами предположения весьма вероятны Такое хорошее совпадение результатов служит аргументом в пользу того, что мы наблюдаем гекса-, гепта- и октамеры Hlyll

Мембраны, модифицированные Hlyll токсином, имели анионную селективность, которая уменьшалась с ростом концентрации электролита в экспериментальной среде Трансмембранный потенциал в условиях градиента концентрации KCl через мембрану был измерен в ряде экспериментов Трансмембранный потенциал, измеренный в трехкратном градиенте 0 12/0 04 М KCl, был равен -12 2 ± 0 82 мВ и в пятикратном градиенте 1 0/0 2 М KCl был равен -20 0 ± 0 84 мВ Отношение коэффициентов проницаемостей, Pk+/Pci-, при обоих этих градиентах было близко по значению 0 36 и 0 30 соответственно Увеличение ионной силы среды (использование градиента концентрации соли KCl 3/1 М) снизило селективность гемолизиновых каналов, в этих условиях трансмембранный потенциал был равен -2 75 ± 0 75 мВ и Psci/Pci составило 0 81 Селективность поры Hlyll, отличается от селективности aHL каналы (Рк+/Ра = 0 79 при условиях градиента 10/0 2 М KCl) (Gu, 2000) Различия в ионной селективности обусловлено различием в распределении зарядов внутри поры Полость стебля aHL поры нейтральна, потому что заряд компенсируется между остатками, такими как Glulll-Lysl47 при входе и Aspl27-Lysl31 при выходе Подобная компенсация может осуществляться и в Hlyll, где присутствуют три пары остатков компенсированных по заряду, но при выходе из поры Lysl25 не имеет ближайшего зарядового партнера Таким образом, общий позитивный заряд в поре Hlyll вероятно вносит вклад в наблюдаемую анионную селективность

5. Влияние температуры на формирование пор гемолизином II Механизм действия гемолизина изучали при помощи экспериментов поставленных на человеческих эритроцитах Показали зависимость эффективности гемолиза от концентрации Hlyll, температуры и времени Кривые зависимости эффективности гемолиза от концентрации Hlyll имели сигмоидальный вид при всех тестируемых температурах через 30 мин инкубации (Рис 7В) Было установлено, что и общая эффективность гемолиза при добавлении различных концентраций гемолизина, и кинетика лизиса эритроцитов зависят от температуры 100% гемолиз при 4°С наблюдали при концентрации гемолизина II от 4 ГЕ и выше, а при 15°С, 25°С и 37°С достигал 100% при более низких значениях (2 ГЕ) (Рис 7В) Всегда более высокие концентрации Hlyll были необходимы для того чтобы получить уровень гемолиза при 4°С' таким же, какой он был при более низкой концентрации при остальных температурах за тоже самое время инкубации За 5 мин инкубации (Рис 7А) уровень гемолиза был ниже, в отличие от значений, полученных при инкубации в течение 30 мин (Рис 7В) при тех же температурах и концентрациях токсина В течение этого времени

гемолиз при 4°С вообще был незначительным при любых концентрациях гемочизина II При

концентрациях Н1у11 5 ГЕ и выше, 100% гемолиз наблюдали через 5 мин при температуре

15°С, 25°С, 37°С, а при более низких концентрациях гемолиз достигал 100% только через 30

мин Это же время инкубации необходимо для гемолиза при 4°С Из полученных данных

можно предположить, что лизис сопровождается кооперативными событиями между

молекулами токсина, подтверждающими олигомерную природу пор Н1у11, и процесс

переформирования является зависимым от температуры При этом гемолизин II связывается

с мембранами только как мономер и дальнейшая олигомеризация происходит на мембране

При высоких концентрациях белка, мономеры быстрее образуют олигомерные комплексы в

плоскости мембраны А 100 -

Е

time {min)

time (min)

Рис.7. Переформирующие свойства

гемолизинаН. Зависимость степени гемолиза эритроцитов от концентрации Н1уП при различных температурах Различные концентрации токсина (06 ГЕ(Ни)/мл) инкубировали в 1 мл смеси, содержащей 0 5% человеческих эритроцитов и ФСБ при 4°С (белые треугольники), 15°С (черные треугольники), 25°С (белые кружки) и 37°С (черные кружки) в течение 5 мин (А) и 30 мин (В) времени tme (rrtn) инкубации Зависимость степени гемолиза от

времени инкубации при 4°С (черные кружки, сплошная линия), 15°С (белые кружки, линия в виде точек), 25°С (черные треугольники, пунктирная линия) и 37°С (белые треугольники, линия из чередующихся пунктиров и точек) Hlyll (I ГЕ/мл) (С), (2 ГЕ/мл) (D) и (3,3 ГЕ/мл) (Е) в смеси, содержащей 0 5% человеческих эритроцитов и ФСБ, преинкубированной при 4°С, 15°С, 25°С, 37°С, инкубировали при тех же самых преинкубационных температурах Спонтанный гемолиз был проверен в течение всего времени инкубации (черные квадраты) Каждая кривая представляет гри-четыре независимых эксперимента, ошибки в пределах 5%

^----

/ /

"' /

/ / - 4°с 15°с —— 2s°c

/ / f / --37°с

Анализ зависимости уровня гемолиза от времени при температурах от 4°С, 15°С, 25°С и 37°С (Рис 7 С-Е), и при действии на эритроциты высокими концентрациями Hlyll (3,3 ГЕ/мл), показал что lag период в лизисе наблюдался только при 4°С (Рис 7Е) При менее высоких концентрациях гемолизина II (2 ГЕ/мл), и температурах 25°С и 37°С уровень гемолиза был идентичен 100% гемолиз был получен в течение 20 мин, без какого-либо значительного lag периода в лизисе (Phc.7D) Уровень гемолиза был немного снижен при 15°С, хотя 100% гемолиз был получен за 30 мин тоже без значительного lag периода При 4°С lag период был более длительным, это позволяет предположить, что скорость формирования поры более медленная, чем при более высоких температурах Уровень гемолиза после lag периода менее зависим от температуры При низких концешрациях Hlyll (1 ГЕ/мл) в подобном эксперименте (Рис 7С), lag период был около 10 мин при 25°С и 37°С, а при 4°С и 15°С lag период был длиннее

Максимальный лизис эритроцитов наблюдался при +25°С. Быстрая температурная инактивация гемолизина II была при 37°С (гемолитическая активность падала на половину за 10 мин) и более медленная при 24°С (инактивировался за 12 часов) и 4°С (за 2 дня)

Для того чтобы узнать, чем вызван длительный lag период в гемолизе при низкой температуре (менее эффективным связыванием гемолизина с мембраной, более медленной олигомеризацией, конформационным изменением или открытием поры), мы провели следующие эксперименты Hlyll (1 ГЕ/мл) инкубировали с эритроцитами при 4°С в течение определенного времени 1,5 мин, 5 мин, 10 мин, т е. в течение lag периода, затем осажденные эритроциты промывали (не более минуты) холодным ФСБ (фосфатно-солевой буфер), для того чтобы удалить не связавшийся токсин Отмытые эритроциты Продолжали инкубировать в снова добавленном ФСБ при 37°С в течение 30 мин Измеряли уровень гемолиза в пробах после инкубации и сравнивали с уровнем гемолиза полученном в контрольных пробах, в которых эритроциты переносились на 37°С, и инкубировались так же в течение 30 мин, непосредственно с 4°С без отмывки от не связавшегося белка Мы не обнаружили значительных различий между уровнем гемолиза в тестируемых и контрольных пробах Значит, первый шаг, связывание Hlyll с клеточными мембранами, не зависит от температуры и протекает быстро при любой температуре Мы показали, что Hlyll может связываться с мембраной в первую минуту lag периода при 4°С Следовательно, при температуре 4°С длительный lag период может быть обусловлен медленной олигомеризацией и переходом поры в открытое состояние Таким образом, олигомеризация на мембране и открытие поры являются самыми медленными стадиями в процессе переформирования

Эксперименты по формированию поры были проведены в присутствие осмотических протектантов Hlyll (2 ГЕ/мл) преинкубировали с 0 5% суспензией эритроцитов и с ПЭГ 600 (Рис 8А) и ПЭГ 1000 (Рис 8В) (их присутствие блокирует лизис эритроцитов) в течение 5

мин при разных температурах 4°С, 25°С и 37°С, затем отмывали от ПЭГ и продолжали инкубировать при температуре 25°С Освобождение гемоглобина во всех пробах тестировали после 5 мин, 10 мин и 30 мин времени инкубации при 25°С После преинкубации с ПЭГ 1000 (Рис 8В) зависимость уровня гемолиза от времени при разных температурах была подобна зависимости наблюдаемой во время наших экспериментов описанных выше (Рис 7) более высокий начальный уровень гемолиза при высоких температурах и самый высокий полный гемолиз при 25°С и более низкий начальный уровень гемолиза при низкой температуре (4°С) Такая же зависимость в скорости гемолиза от времени была получена после преинкубации Н1у11 (1 ГЕ/мл) с эритроцитами без добавления ПЭГ при 4°С, 25°С и 37°С Было выявлено уменьшение эффективности гемолиза в эксперименте с ПЭГ 600 при 37°С, не наблюдавшегося при других температурах и в экспериментах с ПЭГ с большими гидродинамическими радиусами Гемолиз никогда не достигал 100% и был около 20%, однако, полный гемолиз этих проб можно легко получить с помощью детергентов или осмотического шока водой Зависимость уровня гемолиза от времени при более низких температурах преинкубации (25°С и 4°С) была такой же, как и в присутствии ПЭГ 1000 и в отсутствие осмотических протектантов Эти результаты означают то, что молекулы ПЭГ 600 способны проникать внутрь поры Н1у11 и оставаться там после отмывания эритроцитов, если поры сформированы при 37°С, но не могут этого, когда поры сформированы при 4°С и 25°С Это может свидетельствовать о различиях в структуре пор образуемых при разных температурах Более того, начальная температура переформирования является решающей для скорости и общего уровня гемолиза

25 °С 4°С

Рис. в. Влияние температуры на формирование поры гемолизином П. Гемолизин II (8 ГЕ) смешивали с 5 мл 0 5% суспензией человеческих Зуо^ эритроцитов в ФСБ в присутствии 30 мМ ПЭГ 600 (А) и ПЭГ 1000 (В) После инкубации при 4°С (черные кружки), 25°С (белые кружки) и 37°С (черные треугольники) в течение 5 мин, пробы центрифугировали Гемолиз равнялся нулю в 4оС измеренном удаленном ФСБ буфере содержащем 37°С ПЭГ Осажденные клетки ресуспендировали в ФСБ преинкубированном при 25°С и далее инкубировали при этой же температуре Каждая кривая представляет три независимых эксперимента, ошибки в пределах 5%

tira

Обобщая полученные результаты мы предполагаем, что в процессе сборки поры Hlyll (Рис 9), как и у а-токсина и у стафилококкового у-гемолизина существует несколько стадий Первой стадией является связывание находящейся в растворе мономерной формы Hlyll с

мембраной за счет начального электростатического взаимодействия, возможно, нахождение в растворе не активных ол иго мерой из нескольких субъединиц. На второй стадии мономеры связанные с мембраной олигомеризуются и формируют нелитический интермедиат -претору, которая является по нашим данным зависимой от температуры. Н1у11 и гомологичный ему а-токсин формируют гомогептамерные трансмембранныс поры, что ясно из гомологичного моделирования. Н1у (1 также может формировать гомогексамерные и гомооктамерные поры. На третьей стадии обогащенные глицином центральные районы семи (либо шести или аосьми) субъединиц внедряются в литшдный бнелой, и формируют устойчивую к ЭРЗ литическую пору (трансмембранный канал). Таков механик сборка единичной активной поры. конце концов, гемолизин Н возможно формирует кластеры пор, так же как и у-гемолизин. Формирование препоры и поры является в случае для Н1у11 зависимым от температуры, концентрации мономеров и возможно от типа мембран и, следовательно, может различаться Возможно, формируются преимущественно гекса-, гепта-или октамерные поры в зависимости от разных условий.

Процессииг. выход во внеклеточную среду Н1уП Н!у11

Мономер с сигнальным ^ Мономер в растворе

пептидом внутри клетки продуцента(активный)

(зрелый, активный) Связывание

Hlyll

Агрегат в растворе неактивный

/

Hlyll

Мономер связанный с мембраной (активный)

/

Формирование поры

Hlyll

Олигомер связанный с мембраной ( порг закрыта )

II [уII

Олигомер связанный с мембраной (пора открыта)

Конфирмационные изменения, проникновение в ме мбрану, открытие поры

\

Лизис атакованной клетки

Рис.9. Процесс втанмодействнн гемолизина II с мембраной.

6. Цитолнтическое действие очищенного гемолизина II

Одной из характеристик, обычно используемых при описании свойств гемолитических токсинов, является их действие Fia эритроциты различных видов животных.

При идентичных условиях чувствительность эритроцитов к действию гемолизина II уменьшалась в ряду кроличьи человеческие: бы чьи: мышиные и соответствовало отношению 55:14:8:1. Чувствительность эритроцитов кролика к Н1 у11 (10 пМ) более чем в 100 раз выше чем к а-токсину. В экспериментах с человеческими клеточными линиями было изучено влияние ЩуН на митохондриальный мембранный потенциал (ДЧ'тп) и на целостность плазматической мембраны нервных (Ра^) и карциномы ободочной кишки (Сисо-2) клеток. Обработка клеток Н1у11 вызывает полнута потерю ДЧ'тп и нарушение плазматической мембраны (красный цвет), т.е. гибель опухолевых клеток (Рис. 12). Таким образом, гемолизин II способен лидировать различные эукариотические клетки

Рнс.12. Чувствительность .1С-1 и Р1 окрашенных человеческих нервных клеток РЯ]Н (А, В, С) н человеческих клеток карциномы ободочной кишки Сасо-2 (О. Е, р) к действию гемолтина II в, сегею. 1С-1 флуоресцирует оранжевым при высоком мнтохондриальном потенциале клеток и зеленым с более низким потенциалом. нет флуоресценции при отсутствии потенциала. Р1 флуоресцирует красным в клетках с разрушенной мембраной и не флуоресцирует в целых клетках Ра|и и С'асо-2 клетки без Н1у11 (А, Ь), с 0.75 мкг/мл (В. Е). с 1,5 мкг/мл (С, Р| гемолизином II. (Фотографии получены Тепловой В.В.)

С

В. 5иЬ/Ш* ЕН2 в, шыт енз

1

Time, da/a

о-а и o.i 0.1 ы ».о Рис,13. Действие штимма D °а- B.subtilis BD170-EH2 на D. magna.

А: Зависимость количества выживших дафннй от времени инкубации В: LDs». (полулетальная доза). С: Микроскопия D. magna проинкубированных с В subtilis ЕН2 окрашенными акридиновым оранжевым в течение 12 и 24 часов, D: Микроскопия D. magna, ннхубйроаанных с В. subtilis BDi 70 и Е*Н2. Дафнии окрашены JC-1. который флуоресцирует красно-оранжевым цветом при высоком мнтохондриальном потенциале всех клеток и зеленым с более низкий потенциалом. Увеличение 25х.

Также было проверено токсическое действие гемолизина II на макроорганизмы Bacillus subtilis BD170 и Bacillus subhlis BD170-EH2 использовали в экспериментах по действию их на Daphma magna, Drosophila melanogaster, Pœciha reticulata Было показано летальное воздействие штамма В subtihs BD170-EH2 на D maffia и рыб ЛД50 D magna равно 0,18 ОЕ (5х105 клепок в 1 мл) (Рис 13 A-D) В subtihs BD170 и В subtihs BD170-EH2R с геном регулятором hlylIR не вызывали гибели D magna и Р reticulata Таким образом, цитолитическое патогенное действие Hiyll на разные клетки и макроорганизмы обусловлено образованием ионпроводящих каналов в клеточных мембранах

ВЫВОДЫ

1 Впервые получен очищенный препарат внеклеточного гемолизина IIВ cereus

2 Гемолизин II является секреторным белком и синтезируется в форме предшественника, имеющего сигнальный пептид из 31 аминокислотного остатка, который в ходе процессинга отщепляется сигнальной пептидазой с образованием зрелого белка.

3 Зрелый гемолизин II образует анион-селективные и потенциал-зависимые каналы с функциональным диаметром пор 12-16 Â и с внешним диаметром 80-100 Â Возможно формирование гекса-, гепта- и октамерных комплексов Hlyll

4 Полное связывание Hlyll с мембраной в виде мономера происходит в течение первой минуты lag периода и не зависит от температуры В дальнейшем, процесс формирования поры осуществляется в плоскости мембраны и является зависимым от температуры

5 Гемолизин II обладает цитолитическим патогенным действием

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Andreeva Zh I, Nesterenko V F, Yurkov I V, Budanna Z I, Smeva E V, Solonin A. S 2006 Purification and cytotoxic properties of Bacillus cereus hemolysin II Protein Expression and Purification, v 47, p 186-193

2 Andreeva Zh I, Nesterenko V F, Fomkina M G, Ternovsky V I, Suzma N E, Bakulina A Y, Solonin A S and Sineva E V 2007 The properties of Bacillus cereus hemolysin II pores depend on environmental conditions BBA-Btomembranes, v 1768, p 253-263

3 Андреева Ж И, Нестеренко В Ф, Солонин А С Получение очищенных препаратов гемолизина II. Материалы 7-ой Путинской конференции молодых ученых Биология-наукаXXI века, Пущино, 14-18 апреля, 2003, с 302

4 Нестеренко В Ф, Андреева Ж И Преимущества красителей в качестве лигандов для аффинной хроматографии и аналитический прибор для быстрого выбора таких сорбентов Материалы 3-ей международной конференции из серии "Наука и бизнес" Международное сотрудничество в биотехнологии ожидания и реальность Пущино, 19-21 июня, 2006, с 51

5 Andreeva Zh.1, Bakulina A Y , Nesterenko V F , Fomkina M G, Ternovsky VI, Suzma N E, Solonm A S and Sineva E V Pore-forming properties of В cereus hemolysin II experiments and modeling American Society for Microbiology, 106th General Meeting, Orlando, 2006

Заказ №22 Тираж 70 экз ООО «Фотон-век» г Пупвшо, Московская область ИНН 5039008988

Тел (4967 или 827) 73-94-32 Ьеопю1@гатЫег ги

Ьйр //рЬоЮп-уйк пагой га - кварцевые кювета

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ковалевская, Жанна Ивановна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гемолизины как группа бактериальных токсинов 9 1.1.1.Общие сведения о бактериальных токсинах

1.1.2. Место гемолизинов в классификации токсинов

1.1.3. Гемолизины как факторы патогенности и вирулентности

1.1.4. Эволюционная и адаптационная роль гемолизинов

1.2. Типы бактериальных гемолизинов

1.2.1. Фосфолипазы - цитолизины с ферментативной активностью

1.2.2. Порообразующие гемолизины

1.3. Механизмы действия бактериальных гемолизинов

1.4. Механизмы секреции бактериальных токсинов

1.5. В. cereus как объект для изучения гемолизинов

1.6. Спектр гемолизинов, продуцируемых Bacillus cereus

1.6.1. Сфингомиелиназа и цереолизин АВ

1.6.2. Цереолизин (гемолизин I)

1.6.3. Гемолизин BL

1.6.4. Гемолизин III

1.6.5. Гемолизин IV (токсин CytK)

1.6.6. Цереолизинподобный гемолизин

1.6.7. Гемолизин II

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 51 ПЛ. Материалы

II. 1.1. Штаммы бактерий, плазмидные векторы

II. 1.2. Среды и основные буферы

II. 1.3. Материалы и реактивы

II.2. Методы исследования

11.2.1. Выделение плазмидной ДНК

11.2.2. Препаративное выделение фрагмента ДНК

11.2.3. Проведение реакций рестрикции и лигирования ДНК

11.2.4. ПЦР-амплификация ДНК

11.2.5. Получение компетентных клеток

11.2.6. Трансформация

11.2.7. Анализ рекомбинантных клонов

П.2.8. Отбор рекомбинантных клонов по гемолитическому фенотипу

11.2.9. Плазмидные конструкции

11.2.10. Анализ первичной последовательности ДНК

11.2.11. Тестирование гемолитической активности

11.2.12. Получение бесклеточных экстрактов

11.2.13. Электрофорез в полиакриламидном геле

11.2.14. Определение количества белка

11.2.15. Приготовление сорбентов

11.2.16. Экспрессия и очистка до гомогенного состояния внеклеточного гемолизина II

11.2.17. Очистка внутриклеточного гемолизина II

11.2.18. Экспрессия и очистка рекомбипантпого белка HlyII-His

11.2.19. Перенос белков с геля на мембрану - вестерн трансблоттинг

11.2.20. Исследование Hlyll на бислойных липидпых мембранах

11.2.21. Электронная микроскопия олигомеров Hlyll связанных с липосомами

11.2.22. Определение диаметра пор с помощью осмопротектантов

11.2.23. Моделирование структуры поры гемолизина II

11.2.24. Влияние Hlyll па разные типы клеток

11.2.25. Влияние Hlyll на макроорганизмы

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 70 III. 1 .Экспрессия гемолизина II в клетках Е. coli

111.2. Очистка внеклеточного гемолизина II

111.3. Очистка внутриклеточного гемолизина II

111.4. Продукция зрелого Hlyll при помощи секреционного аппарата Е. coli

111.5. Клонирование генетической детерминанты гемолизина II

111.5.1. Получение рекомбинантных клонов и их фенотипический анализ

111.5.2. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков

111.6. Цитолитическое действие очищенного гемолизина II

111.7. Моделирование структуры поры гемолизина II

111.8. Размеры пор сформированных гемолизином II

111.9. Свойства каналов сформированных гемолизином II 105 ШЛО. Влияние температуры на формирование пор гемолизином II

III. 10.1. Первый шаг, взаимодействие Hlyll с мембранами, не зависит от температуры

III. 10.2. Структура Hlyll пор, сформированных при 4°С и 37°С, различается

II 1.11. Патогенное действие гемолизином II на макроорганизмы

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и характеристика гемолизина II Bacillus cereus"

Актуальность работы. Одним из основных фундаментальных направлений современных микробиологии и медицины является изучение патогенности микроорганизмов. В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают широкий спектр веществ, как непосредственно повреждающих или убивающих клетки макро- и микроорганизмов, так и способствующих проникновению бактерий в организм хозяина, вследствие преодоления его защитных систем. Эти вещества играют главную роль в развитии заболеваний, вызываемых бактериями (McDonel et al., 1986).

Среди многообразия таких веществ можно выделить цитолитические токсины, которые играют немаловажную роль в патогенезе. Характерными примерами, подтверждающими этот тезис, являются такие цитолизины, как фосфолипаза С Clostridium perfringens - основной фактор, ответственный за развитие газовой гангрены (Stevens et al., 1988), тиол-активируемый токсин Listeria monocytogenes, нарушение продукции которого приводит к потере вирулентности (Cossart et al., 1989), альфа-токсин Staphylococcus aureus, ответственный за целый ряд клинических эффектов при стафилококковых инфекциях и являющийся Р-складчатым каналообразующим цитолизином (Freer, 1988; Дерябин, 2000).

Интерес к исследованиям цитолитических токсинов не ограничивается лишь медицинской сферой. Изучение этих белков стимулируется и тем, что цитолизины стали ценными инструментами при исследовании клеточной физиологии и функционирования клеточных мембран (Ahnert-Hilger and Weller, 1998; Hucho, 1995), а также являются превосходными модельными объектами для выяснения связи между структурой и функцией белка (Bayley, 1994; Gouaux, 1998). Р-Складчатые каналобразующие цитолизины нашли своё применение и в биотехнологии, в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков (Noireaux, 2004), а также в конструкции нанопор (Howorka, 2001; Merzlyak, 2005), биосенсоров (Braha, 2000; Gu, 2001). Цитолизины являются хорошей моделью в изучении белок-мембранного взаимодействия (Menestrina et al., 2001). К Р-складчатым каналообразующим токсинам относят ряд цитолизинов Staphylococcus aureus (а-токсин, лейкоцидины, у-гемолизин), Р-токсин Clostridium perfringens (Gouaux, 1998) и CytK токсин В. cereus (Lund et al., 2000).

Изучение цитолитических токсинов и их генетических детерминант, включающее в себя клонирование, идентификацию, молекулярный анализ, гетерологичную экспрессию генов цитолизинов, выяснение путей регуляции их экспрессии, а также - изучение механизмов действия этих токсинов представляется одним из наиболее перспективных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов.

Особый интерес вызывает цереусная группа микроорганизмов рода Bacillus, в которую входят: В. anthracis, известный как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву; В. thuringiensis - являющийся патогенным для насекомых; В. cereus, который относится к условно-патогенным для теплокровных. Эти микроорганизмы продуцируют ряд цитолитических белков, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов вирулентности. В. cereus, занимая по патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бактерий и продуцируя широкий спектр цитолизинов, может служить прекрасной моделью для изучения этих токсинов.

Одной из причин, которая побуждает к активному изучению токсинов, вырабатываемых В. cereus (и его ближайшим родственником В. thuringiensis), является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. В настоящее время для производства инсектицидных препаратов широко используется В. thuringiensis, приводя к широкомасштабному внесению этого микроорганизма в окружающую среду. Другой важной проблемой является бактериологическое загрязнение производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. При этом В. cereus - один из основных бактериальных загрязнителей. В связи с вышеизложенным встает задача определения степени безопасности таких микроорганизмов для окружающей среды, животных и человека. В рамках данной задачи изучение отдельных токсинов, продуцируемых этими бактериями, является необходимым звеном.

В. cereus, синтезирует ряд токсинов, которые способствуют развитию инфекции, и может вызывать диаррейный и эметический синдромы, а также заболевания глаз, нервной системы, маститы и другие болезни. Ряд внеклеточных токсинов В. cereus, обладают гемолитической активностью и рассматриваются в качестве потенциальных факторов иатогснности (Turnbull, 1986; Drobniewski, 1993). На настоящий момент в разной степени описаны цереолизин, сфингомиелиназа, цереолизин АВ, гемолизин BL, цереолизин-нодобный гемолизин, гемолизины II и III и CytK. Спектр и свойства гемолитических белков, продуцируемых данным микроорганизмом, изучены далеко не полно. Это обусловлено сложностью получения индивидуальных препаратов данных белков из исходного микроорганизма. Один из цитолитических порообразующих токсинов В. cereus - гемолизин II (Hlyll) представляет особый интерес, так как он является гомологом такого опасного токсина, как альфа-токсин Staphylococcus aureus. Более того, он характерен для цсреусной группы бацилл, так как его ген был обнаружен в клетках В. thuringiensis, В. weihenstephanensis и В. anthracis. В геноме В. anthracis обнаружен ген, структура которого повторяет структуру гена hlyll В. cereus, но содержит мутацию приводящую к сбивке рамки считывания. К настоящему времени ряд гемолизинов В. cereus получены в очищенном состоянии и активно изучаются в самых разнообразных аспектах. В тоже время гемолизин II, будучи обнаружен уже давно, до сих пор практически не изучен, поскольку не удавалось получить высокоочищенный препарат белка. Есть основание считать, что гемолизин играет немаловажную роль в патогенезе и поэтому требуется его всестороннее изучение. Данное обстоятельство определяет актуальность разработки метода очистки, получения гомогенного препарата белка и исследование его свойств.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось проведение структурно-функционального анализа гемолизина II Bacillus cereus. Для достижения указанной цели ставились следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные условия для максимальной экспрессии гена гемолизина II Bacillus cereus в Е. coli.

2. Разработать метод очистки препарата Hlyll.

3. Определить роль сигнальной пептидазы в процессинге Hlyll.

4. Изучить механизм действия гемолизина II с использованием искусственных и клеточных мембран.

5. Изучить свойства пор, формируемых гемолизином II в естественных и искусственных мембранах, механизм и условия порообразования.

6. Изучить цитолитическое действие и влияние на макроорганизмы гемолизина И. Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН.

Научная новизна работы. Впервые получен высокоочищенный препарат гемолизина II В. cereus, исследованы его свойства и определен механизм действия.

Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве. Получение чистого препарата гемолизина II и изучение его структурно-функциональных особенностей даёт возможность для дальнейших исследований - выяснения участия его в патогенезе, поиска подходов для нейтрализации действия токсина. Гемолизин II может играть важную роль при развитии заболеваний вызываемых В. cereus. Также знание о Hlyll позволит использовать этот объект при исследовании клеточной физиологии и функционирования мембран клеток. Можно применить этот продукт в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков, а также в конструкции нанопор. Развитие наиобиологии не возможно без понимания механизмов сборки канала и его функционирования. Полученные результаты можно применять в конструирование мембранных пор с определёнными свойствами (с разной проводимостью, селективностью и т.д.). Такие поры могут быть употреблены как компоненты фильтров, биосенсоров и других наноустройств. Тот факт, что гемолизин Н-подобный токсин обнаружен у В. thuringiensis, широко применяемого как биологический инсектицид, заставляет усилить внимание к тщательному анализу используемых штаммов на предмет их безопасности для человека и животных, а также заостряет вопрос о правомочности использования данного микроорганизма в качестве инсектицидного препарата.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ковалевская, Жанна Ивановна

выводы

1. Впервые получен очищенный препарат внеклеточного гемолизина II В. cereus.

2. Гемолизии II является секреторным белком и синтезируется в форме предшественника, имеющего сигнальный пептид из 31 аминокислотного остатка, который в ходе процессинга отщепляется сигнальной пептидазой с образованием зрелого белка.

3. Зрелый гемолизин II образует анион-селективные и потенциал-зависимые каналы с функциональным диаметром пор 12-16 А и с внешним диаметром 80-100 А. Возможно формирование гекса-, гепта- и октамерных комплексов Hlyll.

4. Полное связывание Hlyll с мембраной в виде мономера происходит в течение первой минуты lag периода и не зависит от температуры. В дальнейшем, процесс формирование поры осуществляется в плоскости мембраны и является зависимым от температуры.

5. Гемолизин II обладает цитолитическим патогенным действием.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ковалевская, Жанна Ивановна, Пущино

1. Abdel-Hameed A. and Landen R. (1994) Studies on Bacillus thuringiensis strains isolated from Swedish soils: insect toxicity and production of Bacillus ceretts-diarrhoeal-type enterotoxin. World J. Microbiol. Biotechnol., V. 10, P. 406-409.

2. Agaisse H., Gominet M., Okstad O.A., Kolsto A-B., Lereclus D. (1999) PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis. Mol. Microbiol., V. 32, P. 1043-1053.

3. Ahnert-Hilger G. and Weller U. (1998) Alpha-toxin and streptolysin О as tools in cellbiological research. P. 103-110. Cell Biology: A Laboratory Handbook, V. 4, Acad. Press, New York.

4. Aksimentiev A. and Schulten K. (2005) Imaging alpha-hemolysin with molecular dynamics: ionic conductance, osmotic permeability, and the electrostatic potential map. Biophys J, V. 88, P. 3745-3761.

5. Alouf J.E. (2000) Cholesterol-binding cytolytic protein toxins. Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 351-356 Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 295-299.

6. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res., V. 25, P. 3389-3402.

7. Arbuthnott J.P., Freer J.H. and Bernheimer A.W. (1967) Physical states of staphylococcal a-toxin. J. Bacteriol., V. 94, P. 1170-1177.

8. Ash C, Collins MD. (1992), Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus anthracis and emetic Bacillus cereus determined by PCR-direct sequencing. FEMS Microbiol Lett.;73(l-2), 75-80.

9. Ash C, Farrow JA, Dorsh M, Stackebrandt E, Collins MD. (1991) Comparative analysis of Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and related species on the basis of reverse transcriptase sequencing of 16S rRNA. Int. JSyst. Bacteriol. 41,343-346.

10. Awad M.M., Ellemor D.M., Boyd R.L., Emmins J.J., Rood J. (2001) Synergistic effects of alpha-toxin and perfringolysin О in Clostridium perfringens-medlated gas gangrene. Infect. Immun., V. 69, P. 7904-7910.

11. Baida G.E. and Kuzmin N.P. (1995) Cloning and primary structure of a new hemolysin gene from Bacillus cereus. Biochim Biophys. Acta, V. 1264, P. 151-154.

12. Baida G.E. and Kuzmin N.P. (1996) Mechanism of action of hemolysin III from Bacillus cereus. Biochim Biophys. Acta, V. 1284, P. 122-124.

13. Baida G.E., Sidorov I.A. and Kuzmin N.P. (1997) Hemolysin III from Bacillus cereus. P. 48. Abstracts of the First International Workshop on The Molecular Biology of B. cereus, B. anlhracis andB. thuringiensis, May 23-25, Oslo.

14. Baida G., Budarina Z.I., Kuzmin N.P., Solonin A.S. (1999) Complete nucleotide sequence and molecular characterization of hemolysin II gene from Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett., V. 180, P. 7-14.

15. Bainbridge G., Gokce I., and Lakey J. H. (1998) Voltage gating is a fundamental feature of porin and toxin beta-barrel membrane channels. FEBS Lett, V. 431, P. 305-308.

16. Barth H., Aktories K., Popoff M. and Stiles B. (2004) Binary bacterial toxins: biochemistry, biology and applications of common Clostridium and Bacillus proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews, V.68, N.3, P. 373-402.

17. Bayley H. (1994) Triggers and switches in a self-assembling pore-forming protein. J. Cell. Biochem., V. 56, P. 177-182.

18. Beecher D.J. and Macmillan J.D. (1990) A novel bicomponent hemolysin from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 58, P. 2220-2227.

19. Beecher D.J. and Macmillan J.D. (1991) Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 59, P. 1778-1784.

20. Beecher D.J. and Wong A.C. (2000) Cooperative, synergistic and antagonistic haemolytic interactions between haemolysin BL, phosphatidylcholine phospholipase С and sphingomyelinase from Bacillus cereus. Microbiology, V. 146, P. 3033-3039.

21. Beecher D.J. and Wong A.C. (2000a) Tripartite haemolysin BL: isolation and characterization of two distinct homologous sets of components from a single Bacillus cereus isolate. Microbiology, V. 146, P. 1371-1380.

22. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994) Improved purification and characterization of hemolysin BL, a hemolytic dermonecrotic vascular permeability factor from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 62, P. 980-986.

23. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1994a) Identification of hemolysin BL-producing Bacillus cereus isolates by a discontinuous hemolytic pattern in blood agar. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1646-1651.

24. Beecher D.J. and Wong A.C.L. (1997) Tripartite hemolysin BL from Bacillus cereus: hemolytic analysis of component interactions and a model for its characteristic paradoxical zone phenomenon. J. Biol Chem., V. 272, P. 233-239.

25. Beecher D.J., Pulido J.S., Barney N.P., Wong A.C.L. (1995) Extracellular virulence factors in Bacillus cereus endophthalmitis: Methods and implication of involvement of hemolysin BL. Infect. Immun., V. 63, P. 632-639.

26. Beecher D.J., Schoeni J.L. and Wong A.C.L. (1995a) Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 63, P. 4423-4428.

27. Benz R., Schmid A., Wagner W., Goebel W. (1989) Pore formation by Escherichia coli hemolysin: evidence for an association-dissociation equilibrium of the pore-forming aggregates. Infect. Immun., V. 57, P. 887-895.

28. Bernadac A., Bolla J.M., Lazdunski C., Inouye M., Pages J.M. (1987) Precise localization of an overproduced periplasmic protein in Escherichia coli: use of double immunogold labelling. Biol.Cell, V. 161, P.141-147.

29. Bernheimer A.W. (1976) Mechanisms in bacterial toxinology, Wiley, New York.

30. Bernheimer A.W. (1988) Assay of hemolytic toxins. Meth. Enzymol., V. 165, P. 213-217.

31. Bernheimer A.W. and Grushoff P. (1967) Cereolysin: production, purification and partial characterization. J.Gen. Microbiol., V. 46, P. 143-150.

32. Bernheimer A.W. and Grushoff P. (1967a) Extracellular hemolysins of aerobic sporogenic Bacilli. J. Bacteriol., V. 93, P. 1541-1543.

33. Bhakdi S., Bayley H., Valeva A., Walev I., WalkerB., Weller U., Kehoe M., Palmer M„ (1996) Staphylococcal alpha-toxin, streptolysin-O, and Escherichia coli hemolysin: prototypes of pore-forming bacterial cytolysins. Arch. Microbiol., V. 165, P. 73-79.

34. Bhakdi S., Mackhan N., Nicaud J.-M., Holland I.B. (1986) Escherichia coli hemolysin may damage target cell membranes by generating transmembrane pores. Infect. Immun., V. 52, P. 6369.

35. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. and Sziegoleit A. (1985) Mechanism of membrane damage by streptolysin-O. Infect. Immun., V. 47, P. 52-60.

36. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. (1991) Alpha-toxin of Staphylococcus aureus. Microbiological Reviews, V. 55, N.4, P. 733-751.

37. Bhakdi S., Walev I., Palmer M., Valeva A. (2000) Staphylococcal a-toxin. P. 509-527. Bacterial protein toxins, Aktories K. and Just I. (eds.), Springer, Berlin.

38. Binet R., Letoffe S., Ghigo J.M., Delepelaire P., Wandersman C. (1997) Protein secretion by gram-negative bacterial ABC exporters. Folia Microbiol., V. 42, P. 179-183.

39. Boehm D.F., Welch R.A. and Snyder I.S. (1990) Domains of Escherichia coli hemolysin (HlyA) involved in binding of calcium and erythrocyte membranes. Infect. Immun., V. 58, P. 1959-1964.

40. Bonneau R., Tsai J., Ruczinski I., Chivian D., Rohl C., Strauss С. E. and Baker D. (2001) Rosetta in CASP4: progress in ab initio protein structure prediction. Proteins, Suppl 5, P. 119126.

41. Bortoli-German I., Brun E., Py В., Chippaux M., Barras F. (1994) Periplasmic disulphide bond formation is essential for cellulase secretion by the plant pathogen Erwinia chrysantemi. Mol. Microbiol., V. 11, P. 545-553.

42. Bowman M.N., Ottolenghi A.C. and Mengel C.E. (1971) Effects of phospholipase С on human erythrocytes. J. Membr. Biol., V. 4, P. 156-164.

43. Bradford M.M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein.Utilizing the Principle of Proteine. J. Anal. Biochem., V. 72., P. 248-254.

44. Braha O., Gu L., Zhou L., Lu X., Cheley S., and Bayley H. (2000) Simultaneous stochastic sensing of divalent metal ions. Nature biotechnology, V. 17.

45. Brillard J. and Lereclus D. (2004) Comparison of cytotoxin cytK promoters from Bacillus cereus strain ATCC 14579 and from a B. cereus food-poisoning strain. Microbiology, V. 150, P. 2699-2705.

46. Brinton G.S., Topping T.M., Hyndiuk R.A., Aaberg T.M., Reeser F.H., Abrams G.W. (1984) Posttraumatic endophthalmitis. Arch. Ophthalmol., V. 102, P. 547-550.

47. Budarina Z. I., Sinev M. A., Mayorov S. G., Tomashevski A. Y., Shmelev I. V. and Kuzmin N.P. (1994) Hemolysin II is more characteristic of Bacillus thuringiensis than Bacillus cereus. Arch.Microbiol., V. 161, P. 252-257.

48. Burnette W.N. (1981) Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from SDS-PAAG to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem., V. 12, P. 195-203.

49. Carlson C.R., Caugant D.A. Kolsto A.-B. (1994) Genotypic diversity among Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains. Appl. Environ. Microbiol., V. 60, P. 1719-1725.

50. Carlson C.R., Johansen Т. and Kolsto A.-B. (1996) The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMSMicrobiol. Lett., V. 141, P. 163-167.1.^

51. Cassidy P. and Harshman S. (1976) Studies on the binding of staphylococcal I-labeled a-toxin to rabbit erythrocytes. Biochemistry, V. 15, P. 2348-2355.

52. Cheng L.W., Anderson D.M., Schneewind 0. (1997) Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol. Microbiol., V. 24, P. 757-765.

53. Claus D. and Berkeley R.C.W. (1996) Genus Bacillus. P. 1105-1139. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Sneath P.H.A., Mair N.A., Sharpe M.E. Holt J.G. (eds.), Williams and Wilkins, Baltimore, MD.

54. Clinkenbeard K.D. and Thiessen A.E. (1991) Mechanism of action of Moraxella bovis hemolysin. Infect. Immun., V. 59, P. 1148-1152.

55. Coolbaugh J.C. and Williams R.P. (1978) Production and characterization of two hemolysins of Bacillus cereus. Can. J. Microbiol., V. 24, P. 1289-1295.

56. Cortajarena A.L., Goni F.M., Ostolaza H. (2003) A receptor-binding region in Escherichia coli alpha-hemolysin. J. Biol. Chem. V. 278, P. 19159-19163.

57. Cortajarena A. L., Goni F. M. and Ostolaza H. (2002) His-859 Is an Essential Residue for the Activity and pH Dependence of Escherichia coli RTX Toxin a -Hemolysin. J. Biological Chemistry, V. 277, N. 26, P. 23223-23229.

58. Cortajarena A. L., Goni F. M. and Ostolaza H. (2001) Glycophorin as a Receptor for Escherichia coli a -Hemolysin in Erythrocytes. J. Biological Chemistry, V. 276, N. 16, P. 12513-12519.

59. Cossart P. and Lecuit M. (1998) Interactions of Listeria monocytogenes with mammalian cells during entry and actin-based movement: bacterial factors, cellular ligands and signaling. EMBOJ., V. 17, P. 3797- 3806.

60. Cossart P. and Mengaud J. (1989) Listeria monocytogenes: a model system for the molecular study of intracellular parasitism. Mol. Biol. Med., V. 6, P. 463-474.

61. Cossart P., Vincente M.F., Mengaud J., Baquero F., Perez-Diaz J.C., Berche P. (1989) Listeriolysin О is essential for virulence of Listeria monocytogenes: direct evidence obtained by gene complementation. Infect. Immun., V. 57, P. 3629-3636.

62. Cowell J.L., Grushoff-Kosyk P.S., Bernheimer A.W. (1976) Purification of cereolysin and the electrophoretic separation of the active (reduced) and inactive (oxidized) forms of the purified toxin. Infect. Immun., V. 14, P. 144-154.

63. Crowell K.M. and Lutz F. (1989) Pseudomonas aeruginosa cytotoxin: the influence of sphingomyelin on binding and cation permeability increase in mammalian erythrocytes. Toxicon, V. 27, P. 531-540.

64. Czajkowsky D. M., Sheng S.T., Shao Z.F. (1998) Staphylococcal alpha-hemolysin can form hexamers in phospholipid bilayers. JMol Biol, V.276, P. 325-330.

65. Czajkowsky D. M., Iwamoto H., Cover T. L. and Shao Z. (1999) The vacuolating toxin from Helicobacter pylori forms hexameric pores in lipid bilayers at low pH. Biochemistry, V. 96, P. 2001-2006.

66. Damgaard P.H. (1995) Diarrhoeal enterotoxin production by strains Bacillus thuringiensis isolated from commercial Bacillus thuringiensis-based insecticides. FEMS Immun. Med. Microbiol., V. 12, P. 245-250.

67. Date T. (1983) Demonstration by a novel genetic technique that leader peptidase is an essential enzyme of Escherichia coli. J Bacteriol, V. 154, P. 76-83.

68. Diep D. В., Nelson K. L., Lawrence T. S., Sellman B. R., Tweten R. K. and Buckley J. T. (1999) Expression and properties of an aerolysin- Clostridium septicum alpha toxin hybrid protein. Molecular Microbiology, V. 31, N. 3, P. 785-794.

69. Dijl J.M., de Jong A., Vehmaanpera J., Venema G., Bron S. (1992) Signal peptidase I of Bacillus subtilis: patterns of conserved amino acids in prokaryotic and eukaryotic type I signal peptidases. EMBO J., V. 11, P. 2819-2828.

70. Drobniewski F.A. (1993) Bacillus cereus and related species. Clin. Microbiol. Rev. V. 6, P. 324-338.

71. Edman P. (1956) On the mechanism of the phenyl isothiocyanate degradation of peptides. Acta Chem. Scand., V. 10, P. 761-768.

72. Edgar R.C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res, V. 32, P. 1792-1797.

73. Eisenberg D., Luthy R. and Bowie J. U. (1997) VERIFY3D: assessment of protein models with three-dimensional profiles. Methods Enzymol, V. 277, P. 396-404.

74. Elek S.D. and Levy E. (1954) The nature of discrepancies between haemolysins in culture filtrates and plate haemolysin patterns of staphylococci. J. Pathol. Bacteriol., V. 68, P. 31-40.

75. Fagerlund A., Ween 0., Lund Т., Hardy S.P., Granum P.E. (2004) Genetic and functional analysis of the cytK family of genes in Bacillus cereus. Microbiology, V. 150, P. 2689-2697.

76. Felmlee T. and Welch R.A. (1988) Alterations of amino acid repeats in the Escherichia coli hemolysin affect cytolytic activity and secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., V. 85, P. 52695273.

77. Ferreras M., Hoper F., Dalla Serra M., Colin D.A., Prevost G. and Menestrina G. (1998) The interaction of Staphylococcus aureus bi-component у -hemolysins and leucocidins with cells and lipid membranes. Biochim. Biophys., V. 1414, P. 108-126.

78. Filloux A., Michel G., Bally M. (1998) GSP-dependent protein secretion in gram-negative bacteria: the Xcp system of Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Rev., V. 22, P. 177198.

79. Fossum K. (1963) Separation of hemolysin and egg yolk turbidity factor in cell-free extracts of Bacillus cereus. Acta Path. Microbiol Scand., V. 59, P. 400-406.

80. Fossum K. (1964) The heat sensitivity of Bacillus cereus hemolysin. Acta Path. Microbiol. Scan., V. 60, P. 523-527.

81. Freer J.H. (1988) Toxins as virulence factors of gram-positive pathogenic bacteria of veterinary importance. P. 264-288. Virulence mechanisms of bacterial pathogens, Roth J.A. (ed.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

82. Freer J.H., Arbuthnott J.P. and Bernheimer A.W. (1968) Interaction of staphylococcal a-toxin with artifical and natural membranes. J. Bacteriol., V. 95, P. 1153-1168.

83. Gaviria Rivera A.M., Granum P.E., Priest F.G. (2000) Common occurrence of enterotoxin genes and enterotoxicity in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett., V. 190, P. 151-155.

84. Geoffroy C. and Alouf J.E. (1983) Selective purification by thiol-disulfide interchange chromatography of alveolysin, a sulphydryl-activted toxin of Bacillus alvei. J. Biol. Chem., V. 258, P. 9968-9972.

85. Gouaux E. (1998) a-Hemolysin from Staphylococcus aureus: An archetype of p-barrel, channel-forming toxins. J. Struct. Biol., V. 121, P. 110-122.

86. Gouaux E., Hobaugh M.R. and Song L. (1997) a-Hemolysin, y-hemolysin and leukocidin from Staphylococcus aureus: distant in sequence but similar in structure. Protein Sci, V.6, P. 2631-2635.

87. Gouaux E., Braha 0., Hobaugh M., Song L., Cheley S., Shustak C. and Bayley H. (1994) Subunit stoichiometry of staphylococcal a-hemolysin in crystals and on membranes: A heptameric transmembrane pore. Biochemistry, V 91, P. 12828-12831.

88. Granum P.E. (1997) Bacillus cereus. P. 327-336. Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers, Doyle M.P., Beuchat L.R., Montville T.J. (eds.), ASM Press, Washington, DC.

89. Granum P.E. and Lund T. (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett., V. 157, P. 223-228.

90. Gu L. Q., Dalla S. M., Vincent J. В., Vigh G., Cheley S., Braha O., and Bayley H. (2000) Reversal of charge selectivity in transmembrane protein pores by using noncovalent molecular adapters. Proc Natl Acad Sci, V. 97, P. 3959-3964.

91. Gu L., Cheley S., Bayley H. (2001) Capture of a Single Molecule in a Nanocavity. Science, V. 291, P. 636-640.

92. Hacker J., Hughes C., Hof. H., Goebel W. (1983) Cloned hemolysin genes from Escherichia coli that cause urinary tract infection determine different levels of toxicity in mice. Infect. Immun., V. 42, P. 57-63.

93. Hangombe M.B., Kohda Т., Mukamoto M., Kozaki S. (2005) Relationship between Clostridium septicum alpha-toxin activity and binding to erythrocyte membranes. J. Vet. Med. Sci., V. 67, P. 69-74.

94. Hansen B.M. and Hendriksen N.B. (2001). Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis. Appl. Environ. Microbiol., V. 67, P. 185-189.

95. Hardy S.P., Lund Т., Granum P.E. (2001) CytK toxin of Bacillus cereus forms pores in planar lipid bilayers and is cytotoxic to intestinal epithelia. FEMS Microbiol. Lett., V. 197, P.47-51.

96. Harvie D.R., Vilchez S., Steggles J.R., Ellar D.J.(2005) Bacillus cereus Fur regulates iron metabolism and is required for full virulence. Microbiology, V. 151, P. 569-577.

97. Heinrichs J.H., Beecher D.J., Macmillan J.D., Zilinskas B.A. (1993) Molecular cloning and characterization of the hblA gene encoding the В component of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacterid, V. 175, P. 6760-6765.

98. Henderson I.R., Navarro-Garcia F., Nataro J.P. (1998) The great escape: structure and function of the autotransporter proteins. Trends Microbiol., V. 6, P. 370-378.

99. Hendriksen N.B., Hansen B.M. and Johansen J.E. (2006) Occurrence and pathogenic potential of Bacillus cereus group bacteria in a sandy loam. Antonie Van Leeuwenhoek, V. 89, P. 239-249.

100. Hertle R. (2000) Serratia type pore forming toxins. Curr. Protein Pept. Sci., V. 1, P. 75-89.

101. Hertle R. (2002) Serratia marcescens hemolysin (ShlA) binds artificial membranes and forms pores in a receptor-independent manner. J. Membr. Biol. V. 189, P. 1-14.

102. Heuck A.P., Tweten R.K., Johnson A.E. (2003) Assembly and topography of the prepore complex in cholesterol-dependent cytolysins. J. Biol. Chem., V. 27.

103. Hildebrand A., Pohl M. and Bhakdi S. (1991) Staphylococcus aureus a-toxin. Dual mechanism of binding to target cells. J. Biol. Chem., V. 266,17195-17200.

104. Hille B. (1984) Ionic Channels of Excitable Membranes. Sunderland, MA: Sinauer Associate Publishers.

105. Honda Т., Shiba A., Seo S., Yamamoto J., Matsuyama J., and Miwatani T. (1991) Identity of hemolysins produced by Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus. FEMS Microbiol. Lett., V. 79, P. 205-210.

106. Hotze E.M., Heuck A.P., Czajkowsky D.M., Shao Z., Johnson A.E., Tweten R.K. (2002) Monomer-monomer interactions drive the prepore to pore conversion of a P-barrel -forming cholesterol-dependent cytolysin. J. Biol. Chem., V. 277, P. 11597-11605.

107. Howorka S., Cheley S., and Bayley H. (2001) Sequence-specific detection of individual DNA strands using engineered nanopores. Nature biotechnology, V. 19.

108. Hucho F. (1995) Toxins as tools in neurochemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., V. 34, P. 39-50.

109. Hueck C. J. (1998) Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants. Microbiol. Mol. Biol. Rev., V. 62, P. 379-433.

110. Ikezava H., Mori M. and Taguchi R. (1980) Studies on sphingomyelinase of Bacillus cereus-. Hydrolytic and hemolytic actions on erythrocyte membranes. Arch. Biochem. Biophys., V. 199, P. 572-577.

111. Ikezawa H., Matsushita M., Tomita M., Taguchi R. (1986) Effects of metal ions on sphingomyelinase activity of Bacillus cereus. Arch. Biochem. Biophys., V. 249, P. 588-595.

112. Jayasinghe L. and Bayley H. (2005) The leukocidin pore: Evidence for an octamer with four LukF subunits and four LukS subunits alternating around a central axis. Protein Science, V. 14, P. 2550-2561.

113. Johnson C.E. and Bonventre P.F. (1967) Lethal toxin of Bacillus cereus. I.Relationships and nature of toxin, hemolysin, and phospholipase. J. Bacteriol., V. 94, P. 306-316.

114. Jung Y., Bayley H. and Movileanu L. (2006) Temperature-responsive protein pores. J. Am. Chem. Soc., V. 128, P. 15332-15340.

115. Kaneko J. and Kamio Y. (2004) Bacterial two-component and hetero-heptameric pore-forming cytolytic toxins: structures, pore-forming mechanism, and organization of the genes. Biosci. Biotechnol. Biochem., V. 68, N. 5, P. 981-1003.

116. Kajava A.V., Zolov S.N., Pyatkov K.I., Kalinin A.E. and Nesmeyanova M.A. (2002) Processing of Escherichia coli Alkaline Phosphatase. J. Biological Chemistry, V. 277, N. 52, P. 50396-50402.

117. Kawate T. and Gouaux E. (2003) Arresting and releasing Staphylococcal a-hemolysin at intermediate stages of pore formation by engineered disulfide bonds. Protein Science, V.12, P. 997-1006.

118. Kehoe M.A., Miller L., Walker J.A., Boulnois G.J. (1987) Nucleotide sequence of the streptolysin О (SLO) gene: structural homologies between SLO and other membrane-damaging, thiol-activated toxins. Infect. Immun., V. 55, P. 3228-3232.

119. Kennedy С. L., Krejany E. 0., Young L. F., O'Connor J. R., Awad M. M., Boyd R. L., Emmins J. J., Lyras D. and Rood J. I. (2005) The a -toxin of Clostridium septicum is essential for virulence. Molecular Microbiology, V. 57, N. 5, P. 1357-1366.

120. Knapp S., Hacker J., Jarchau Т., Goebel W. (1986) Large, unstable inserts in the chromosome affect virulence properties of uropathogenic Escherichia coli 06 strain 536. J. Bacteriol., V. 168, P. 22-30.

121. Koster M., Bitter W., Tommassen J. (2000) Protein secretion mechanisms in Gram-negative bacteria. Int. J. Med. Microbiol., V. 290, P. 325-331.

122. Kovalevskiy О. V., Lebedev A. A., Surin A. K., Solonin A. S. and Antson A. A. (2007) Crystal Structure of Bacillus cereus HlyllR, a Transcriptional Regulator of the Gene for Pore-forming Toxin Hemolysin II. J. Mol. Biol., V. 365, P. 825-834.

123. Kramer J.M., Turnbull P.C.B., Jorgensen K., Parry J., Gilbert R.J. (1978) Separation of exponential growth exotoxins of Bacillus cereus and their preliminary characterization. J. Appl. Bacl. V. 45, P. 19-23.

124. Krug E.L. and Kent C. (1984) Phospholipase С from Clostridium perfringens: preparation and characterisation of homogenous enzyme. Arch. Biochem. Biophys., V. 231, P. 400-410.

125. Lacy D.B. and Stevens R.C. (1998) Unraveling the structure and modes of action of bacterial toxins. Curr. Op. Struct. Biol., V. 8, P. 778-784.

126. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, V. 227, P. 680-685.

127. Lowe C.R., Hans M., Spibey N. and Drabble W.T. (1980) The Purification of Inosine 5'-Monophosphate Dehydrogenase from E. coli by Affinity Chromatography on Immobilized Procion Dyes. Analytical biochemistry, V. 104, N. 1, P. 23-28.

128. Ludwig A., Schmid A., Benz R. and Goebel W. (1991) Mutations affecting pore formation of hemolysin from Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., V. 226, P. 198-208.

129. Lund Т., De Buyser M.-L., Granum P.E. (2000) A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Molecular Microbiology, V. 38, P. 254-261.

130. McDonel J.L. (1986) Toxins of Clostridium perfringens types А, В, C, D and E. P. 477-517. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J. (eds.), Pergamon Press, Oxford.

131. McDonel J.L., Dorner F. and Drews J. (1986) The role of toxins in bacterial pathogenesis. P. 1-4. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J. (eds.), Pergamon Press, Oxford.

132. McMahon J.W. and Rigler F.H. (1965) Feeding rate of Daphnia magna Straus in different foods labeled with radioactive phosphorus. Limnol. Oceanogr., V. 10, P. 105-113.

133. Menestrina G. (1986) Ionic channels formed by Staphylococcus aureus alpha-toxin: voltage-dependent inhibition by divalent and trivalent cations. JMembr.Biol, V. 90, P. 177-190.

134. Menestrina G. (1988) Escherichia coli hemolysin permeabilizes small unilamellar vesicles loaded with calcein by a single-hit mechanism. FEBSLett., V. 232, P. 217-220.

135. Menestrina G., Dalla Serra M., Prevost G. (2001) Mode of action of P-barrel pore-forming toxins of the staphylococcal a-hemolysin family. Toxicon, V. 39, P. 1661-1672.

136. Merzlyak P. G., Yuldasheva L. N., Rodrigues C. G., Carneiro С. M., Krasilnikov О. V., and Bezrukov S. M. (1999) Polymeric nonelectrolytes to probe pore geometry: application to the alpha-toxin transmembrane channel. Biophys J, V. 77, P. 3023-3033.

137. Merzlyak P. G., Capistrano M. F., Valeva A., Kasianowicz J. J. and Krasilnikov О. V. (2005) Conductance and ion selectivity of a mesoscopic protein nanopore probed with cysteine scanning mutagenesis. Biophys. J.

138. Mezes P.S.F. and Lampen J.O. (1985) Secretion of proteins by Bacilli. P. 151-183. The molecular biology of the Bacilli, Dubnau D.A. (ed.), Acad. Press, New York

139. Miles G., Bayley H., Cheley S. (2002) Properties of Bacillus cereus hemolysin II: a heptameric transmembrane pore. Protein Sci., V. 11, P. 1813-1824.

140. Miles G., Movileanu L., Bayley H. (2002) Subunit composition of a bicomponent toxin: Staphylococcal leukocidin forms an octameric transmembrane pore. Protein Sci., V. 11, P. 894902.

141. Mitsui К., Mitsui N. and Hase J. (1973) Clostridium perfringens exotoxins. I. Purification and properties of the a-toxin. Jpn. J. Exp. Med., V. 43, P. 65-80.

142. Mollby R. (1978) Bacterial phospholipases. P. 367-424. Bacterial toxins and cell membranes, Jeljaszewicz J. and Wadstrom T. (eds.), Academic Press Ltd., London.

143. Morgan P.J., Hyman S.C., Rowe A.J., Mitchell T.J., Andrew P.W., Saibil H.R. (1995) Subunit organization and symmetry of pore-forming, oligomeric pneumolysin. FEBS Lett., V. 371, P. 77-80.

144. Mueller P. and Rudin D.O. (1963) Induced excitability in reconstituted cell membrane structure. J Theor Biol, V. 4, P. 268-280.

145. Naumann M., Reuter R., Metz P. and Kopperschlager G. (1989) Affinity chromatography of bovine heart lactate dehydrogenase using dye ligands linked directly or spacer-mediated to bead cellulose. J Chromatogr., V. 466, P. 319-329.

146. Nesmeyanova M. A. (1982) Membrane function in biosynthesis of secreted proteins in Escherichia coli. Doctor of Sciences Thesis, Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino.

147. Nguyen V. Т., Kamio Y. and Higuchi H. (2003) Single-molecule imaging of cooperative assembly of y-hemolysin on erythrocyte membranes. EMBOJ., V. 22, N. 19, P. 4968-4979.

148. Nguyen V. T. and Kamio Y. (2004) Cooperative assembly of p-barrel pore-forming toxins. J.Biochem., V. 136, P. 563-567.

149. Noireaux V. and Libchaber A. (2004) A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. PNAS, V. 101, N. 51, P. 17669-17674.

150. Olson R. and Gouaux E. (2005) Crystal Structure of the Vibrio cholerae Cytolysin (VCC) Pro-toxin and its Assembly into a Heptameric Transmembrane Pore. J. Mol. Biol., V. 350, P. 997-1016.

151. Pages J.M., Anba J., Lazdunski C. (1987) J. Bacterid., V.169, P. 1386-1390.

152. Palmer K.L., Goldman W.E. and Munson Jr.R.S. (1996) An isogenidc haemolysin-deficient mutant of Haemophilus ducreyi lacks the ability to produce cytopathic effects on human foreskin fibroblasts. Mol. Microbiol., V. 21, P. 13-19.

153. Panbangred W., Kondo Т., Negoro S., Shinmyo A., Okada H. (1983) Mol. Gen. Genet., V. 192, P. 335-341.

154. Parker D.A. and Goepfert J.M. (1978) Enhancement of synthesis of Bacillus cereus enterotoxin using a sac-culture technique. J. Fd. Protect., V. 41, P. 116-117.

155. Parker M.W., van der Goot F.G. and Buckley J.T. (1996) Aerolysin the ins and outs of a model channel-forming toxin. Mol. Microbiol., V. 19, P. 205-212.

156. Paton J.C., Berry A.M., Lock R.A., Hansman D., Maiming P.A. (1986) Cloning and expression in Escherichia coli of the Streptococcus pneumoniae gene encoding pneumolysin. Infect. Immun., V. 54, P. 50-55.

157. Pendleton I.R., Bemheimer A.W. and Grushoff P. (1973) Purification and partial characterization of hemolysins from Bacillus thuringiensis. J. Invert. Path., V. 21., P. 131-135.

158. Pflugfelder S.C. and Flynn H.W. (1992) Infectious endophthalmitis. Infect. Dis. Clin. N. Am.y. 6, P. 859-873.

159. Poole K. and Braun V. (1988) Iron regulation of Serratia marcescens hemolysin gene expression. Infect. Immun., V. 56, P. 2967-2971.

160. Portnoy D.A., Jacks P.S. and Hinrichs D.J. (1988) Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med., V. 167, P. 1459-1471.

161. Promdonkoy B. and Ellar D. J. (2003) Investigation of the pore-forming mechanism of a cytolytic delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis. Biochem J, V. 374, P. 255-259.

162. Pugh G.W. and Hughes D.E. (1968) Experimental bovine infectious keratoconjunctivitis caused by sunlamp irradiation and Moraxella bovis infections: correlation with hemolytic ability and pathogenecity. Am. J. Vet. Res., V. 29, P. 835-839.

163. Reers M., Smiley S. Т., Mottola-Hartshorn C., Chen A., Lin M. and Chen L. B. (1995) Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods Enzymol, V. 260, P. 406417.

164. Ryan P.A., Macmillan J.D. and Zilinskas B.A. (1997) Molecular cloning and characterization of the genes encoding the LI and L2 components of hemolysin BL from Bacillus cereus. J. Bacteriol., V. 179, P. 2551-2556.

165. Sabirov R. Z. and Okada Y. (2004) Wide nanoscopic pore of maxi-anion channel suits its function as an ATP-conductive pathway. Biophys J, V. 87, P. 1672-1685.

166. Sali A. and Blundell T. L. (1993) Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. J Mol Biol, V. 234, P. 779-815.

167. Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab. Press, New York.

168. Sato N., Kurotaki H., Watanabe Т., Mikami Т., Matsumoto T. (1998) Use of hemoglobin as an iron source by Bacillus cereus. Biol. Pharm. Bull., V. 21, P. 311-314.

169. Scherrer R., Gerhardt P. (1971) Molecular sieving by the Bacillus megaterium cell wall and protoplast. J. Bacteriol., V. 107, N. 3, P. 718-735.

170. Scherrer R., Cabrera В. T. and Gerhardt P. (1971) Macromolecular sieving by the dormant spore of Bacillus cereus. J Bacteriol, V. 108, P. 868-873.

171. Schlebel E. and Braun V. (1989) Integration of the Serratia marcescens haemolysin into human erythrocyte membranes. Mol. Microbiol., V. 3, P.445-453.

172. Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitenson J., Zeigler D.R., Dean D.H. (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal protein. Microbiol. Mol. Biol. Rev., V. 62, P. 775-806.

173. Schoeni J.L. and Wong A.C. (2005) Bacillus cereus food poisoning and its toxins. J. Food Prot.,W.68, P. 636-648.

174. Schuerch D. W., Wilson-Kubalek E. M. and Tweten R. K. (2005) Molecular basis of listeriolysin О рН dependence. PNAS, V. 102, N. 35, P. 12537-12542.

175. Scott D.E. and Silhavy T.J. (1982) Molecular components of the signal sequence that function in the initiation of protein export. J. Cell Biol., V. 95, P. 689-696.

176. Sekiya K., Satoh R., Danbara H., Futaesaku Y. (1993) A ring-shaped structure with a crown formed by streptolysin О on the erythrocyte membrane. J. Bacteriol., V. 157, P. 5953-5961.

177. Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. (2003) Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun., V. 71, P. 3183-3189.

178. Shewen P.E. and Wilkie B.N. (1982) Cytotoxin of Pasteurella haemolytica acting on bovine leukocytes. Infect. Immun., V. 35, P. 91-94.

179. Shimada Y., Maruya M., Iwashita S., Ohno-Iwashita Y. (2002) The C-terminal domain of perfringolysin О is an essential cholesterol-binding unit targeting to cholesterol-rich microdomains. Eur. J. Biochem., V. 269, P. 6195-6203.

180. Shinagawa K., lchikawa K., Matsusaka N., Sugii S. (1991) Purification and some properties of a Bacillus cereus mouse lethal toxin. J. Vet. Med. Sci., V. 53, P. 469-474.

181. Simonen M. and Palva I. (1993) Protein secretion in Bacillus species. Microbiol. Rev., V. 57, P. 109-137.

182. Smith NR, Gordon RE, and Clark FE. (1952) In Aerobic Spore-forming Bacteria, 56-67. Washington, DC: US Department of Agriculture.

183. Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux J.E. (1996) Structure of staphylococcal a-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science, V. 274, P. 1859-1866.

184. Souckova A. and Soucek A. (1972) Inhibition of the hemolytic action of a and (5 lysins of Staphylococcus pyogenes by Corynebacterium hemolyticum, C. ovis and C. ulcerans. Toxicon, V. 10, P. 501-509.

185. Steinthorsdottir V., Halldorsson H., Andresson O.S. (2000) Clostridium perfringens beta-toxin forms multimeric transmembrane pores in human endothelian cells. Microb. Pathog., V. 28, P. 45-50.

186. Stevens D.L., Troyer B.E., Merrick D.T., Mitten J.E., Olson R.D. (1988) Lethal effects and cardiovascular effects of purified a and 0 toxins. J. Infect. Dis., V. 157, P. 272-279.

187. Stoebner J.A. and Payne S.M. (1988) Iron-regulated hemolysin production and utilization of heme and hemoglobin by Vibrio cholerae. Infect. Immun., V. 56, P. 2891-2895.

188. Sugahara Т., Takahashi Т., Yamaya S., Ohsaka A. (1977) Vascular permeability increase by a-toxin (phospholipase C) of Clostridium perfringens. Toxicon, V. 15, P. 81-87.

189. Sugavara N., Tomita T. and Kamio Y. (1997) Assembly of Staphylococcus aureus y-hemolysin into pore-forming ring-shaped complex on the surfase of human erythrocytes. FEBS Lett., V. 410, P. 333-337.

190. Takahashi Т., Sugahara T. and Ohsaka A. (1981) Phospholipase С from Clostridium perfringens. Methods Enzymoi, V. 71., P. 710-725.

191. Thompson N.E., Ketterhagen M.J., Bergdoll M.S., Schantz EJ. (1984) Isolation and some properties of an enterotoxin produced by Bacillus cereus. Infect. Immun., V. 43, P. 887-894.

192. Tilley S. J., Orlova E. V., Gilbert R. J.C., Andrew P. W. and Saibil H. R. (2005) Structural Basis of Pore Formation by the Bacterial Toxin Pneumolysin. Cell, V. 121, P. 247-256.

193. Titball R.W. (1993) Bacterial phospholipases C. Microbiol. Rev., V. 57, P. 347-366.

194. Tomita M., Taguchi I.R., Ikezava H. (1991) Sphingomyelinase of Bacillus cereus as a bacterial hemolysin. J. Toxicol.-Toxin Rev., V. 10, P. 169-207.

195. Tomita Т. and Kamio Y. (1997) Molecular biology of the pore-forming cytolysins from Staphylococcus aureus, a- and y-hemolysins and leukocidin. Biosci. Biotech. Biochem., V. 61, P. 565-572.

196. Trees D.L. and Morse S.A. (1995) Chancroid and Haemophilus ducreyi: an update. Clin. Microbiol. Rev., V. 8, P. 357-375.

197. Turnbull P.C. and Kramer J.M. (1991) Bacillus. P. 296-303. Manual of clinical microbiology, 5th ed., Balows A., Hausler W.J., Herrmann K.L., Isenberg H.D., Shadomy H.J. (eds.), American Society for Microbiology, Washington, D.C.

198. Turnbull P.C., Kramer J.M., Jorgensen K., Gilbert R.J., Melling J. (1979) Properties and production characteristics of vomiting, diarrheal, and necrotizing toxins of Bacillus cereus. Amer. J. Clin. Nutr., V. 32, P. 219-228.

199. Turnbull P.C.B. (1986) Bacillus cereus toxins. P. 397-448. Pharmacology of Bacterial Toxins, Dorner F. and Drews J., (eds.), Pergamon Press, Oxford.

200. Tweten R.K. (1988) Nucleotide sequence of the gene for perfringolysin О (theta-toxin) from Clostridium perfringens: significant homology with the genes for streptolysin О and pneumolysin. Infect. Immun., V. 56, P. 3235-3240.

201. Valeva A., Weisser A., Walker В., Kehoe M., Bayley H., Bhakdi S., Palmer M. (1996) Molecular architecture of a toxin pore: A 15-residue sequence lines the transmembrane channel of staphylococcal a-toxin. EMBO J., V. 15, P. 1857-1864.

202. Viero G., Cunaccia R., Prevost G., Werner S., Monteil H., Keller D., Joubert O., Menestrina G., Dala Serra M. (2006) Homologous versus heterologous interactions in the bicomponent staphylococcal gamma-haemolysin pore. Biochem J., V. 394, P. 217-225.

203. Waite M. (1987) The phospholipases. Handbook of lipid reseach, V. 5, Hanahan D.J. (ed.), Plenum Press, New York, London.

204. Wallner B. and Elofsson A. (2005) All are not equal: a benchmark of different homology modeling programs. Protein Sci, V. 14, P. 1315-1327.

205. Welch R.A. (1991) Pore-forming cytolysins of Gram-negative bacteria. Mol. Microbiol., V. 5, P.521-528.

206. Yamane K., Bunai K., Kakeshita H. (2004) Protein traffic for secretion and related machinery of Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem., V. 68, P. 2007-2023.

207. Ye Y. and Godzik A. (2003) Flexible structure alignment by chaining aligned fragment pairs allowing twists. Bioinformatics, V. 19, Suppl 2, P. 246-255.

208. Yeh C.J., Hsi B.L. and Faulk W.P. (1981) Propidium iodide as a nuclear marker in immunofluorescence. II. Use with cellular identification and viability studies. J Immunol Methods, V. 43, P. 269-275.

209. Yuan Z., Hansen B.M., Andrup L., Eilenberg J. (2002) Detection of enterotoxin genes in mosquito-larvicidal Bacillus species. Curr. Microbiol., V. 45, P. 221-225.

210. Бицаев A.P. и Езепчук Ю.В. (1987) Молекулярная природа патогенного действия, вызываемого Bacillus cereus. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол., N 7, С. 18-23.

211. Гловер Д. (1988) Клонирование ДНК. Методы. Мир, Москва, 538 с. (перевод с английского).

212. Дарбре А. (1989) Практическая химия белка. Мир, Москва, 623 с. (пер. с англ.).

213. Дерябин Д. Г. (2000) Стафилококки: Экология и патогенностъ. Екатеринбург: УрО РАН, 240 с.

214. Добош Д. (1980) Электрохимические константы. Мир, Москва, 365с.

215. Зайцев Е.Н., Зайцева Е.М., Бакланова И.В., Горелов В.Н., Кузьмин Н.П., Крюков В.М., Ланцов В.А. (1986) Клонирование и секвенирование гена reck из штамма Pseudomonas aeruginosa. Генетика, Т. 22, С. 2721-2727.

216. Мазин А.В., Кузнеделов К.Д., Краев А.С., Холодилов Н.Г. и др.(1990) Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука, Новосибирск, 248 с.

217. Маниатис Т., Фриш Э., Сэмбрук Д. (1984) Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Мир, Москва, 480с.

218. Маурер Г. (1971) Диск-электрофорез. Мир, Москва, 248с.

219. Михайлов А.Т., Симирский В.Н. (1991) Методы иммунохгшического анализа в биологии развития. Наука, Москва, 288 с.

220. Михалева Н.И., Золов С.Н., Сузина Н.Е., Мелкозернов А.Н., Несмеянова М.А. (1995) Проницаемость внешней мембраны Escherichia coli для ионов этидия и периплазменной щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе. Биохимия, Т. 60, С. 1161-1170.

221. Михалева Н.И., Калинин А.Е., Молотковский Ю.Г., Несмеянова М.А. (1997) Взаимодействие предшественника щелочной фосфотазы Е. coli с искусственными фосфолипидными мембранами. Биохимия, Т.62., Вып.2, С. 217-224.

222. Остерман JI.A. (1985) Хроматография белков и нуклеиновых кислот. Наука, Москва, 536 с.

223. Синев М.А., Бударина Ж.И. (1993) Доказательство существования гемолизина II B.cereus. Клонирование генетической детерминанты гемолизина II. Молекулярная биология, Т. 27, Вып. 6, С.1218-1229.

224. Скоупс Р. (1985) Методы очистки белков. Мир, Москва (перевод с английского).

225. Сомов Г.П., Варвашевич Т.Н., Тимченко Н.Ф. (1991) Психрофилъностъ патогенных бактерий. Новосибирск: Наука, 204 с.

226. Строганов Н.С., Колосова JI.B. (1971) Ведение лабораторной культуры и определение плодовитости дафний в ряде поколений. Сборник Методики биологич. исслед. по водн. коксикол, Москва: Наука, С.210.

227. Шадрин A.M., Шапырина Е.В., Сиунов А.В., Солонин А.С. (2007) Пороформирующие токсины Bacillus cereus гемолизин II и цитотоксин К: полиморфизм и распределение генов среди представителей цереусной группы. Микробиология, Т. 76, №4, С. 1-9.

228. Юдина Т.Г. и Бурцева Л.И. (1997) Действие 5-эндотоксинов четырех подвидов Bacillus thuringiensis на различных прокариот. Микробиология, Т. 66, С. 25-31.1. Благодарности

229. Автор очень благодарна своему соруководителю Терновскому Вадиму Игоревичу за советы, идеи, за помощь в подготовке к защите.

230. Автор очень благодарна своим оппонентам Харакозу Дмитрию Петровичу и Азизбекяну Рудольфу Рубеновичу. Также благодарна ученому секретарю Диссертационного совета Заиграевой Галине Григорьевне.