Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispa

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispa"

005019690 На пРавах рукописи

Ткачева Екатерина Сергеевна

Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии

Heteractis crispa

03.01.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 лп р 2072

Владивосток - 2012

005019690

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель: д.х.н., профессор Козловская Эмма Павловна

Официальные оппоненты:

Костецкий Эдуард Яковлевич, д.б.н., профессор,

Дальневосточный федеральный университет,

зав. кафедрой биохимии, микробиологии и биотехнологии.

Ковальчук Светлана Николаевна, к.б.н., Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, с.н.с. лаборатории Морской биохимии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток

Защита состоится «11» мая 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан « Ж апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

к.б.н.

Черников О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Актинопорины - белковые цитолизины (20 кДа), продуцируемые ядовитыми морскими кишечнополостными, актиниями, принадлежат к группе а-пороформирующих токсинов (а-ПФТ) (Parker and Feil, 2005). Огромный интерес исследователей к этим белкам обусловлен наличием у них уникальной пространственной структуры — высоко консервативного фолда (5-сэндвича и N-концевой a-спирали, способных претерпевать конформационные перестройки при переходе белка из водорастворимого в мембраносвязанное состояние, в котором он осуществляет свое пороформирующее действие. С мембранолитическим действием связывают широкий спектр биологической активности актинопоринов: противоопухолевой, кардиостимулирующей, дерматонекротической, антипаразитарной (Turk, 1991). В последние годы а-ПФТ актиний используют для создания потенциальных фармакологических агентов — химерных молекул, представляющих собой иммуноконьюгаты актинопоринов (либо их фрагментов, например, N-концевого участка) с лигандами (моноклональными антителами, гормонами или факторами роста) (Tejuca et al., 2009). Действие этих конъюгатов направлено на биологические мишени, мембраны опухолевых и паразитарных клеток. а-ПФТ являются незаменимыми инструментами исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических и модельных мембран (Чантурия и др., 1990; Shnyrov et al., 1992; Parker and Feil, 2005). Проявляемые актинопоринами фармакологические эффекты свидетельствуют о том, что эти белки связываются не только с липидными, но и с белковыми компонентами мембран, интегринами, посредством RGD-мотива (трипептида: аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), что может быть использовано для получения противоопухолевых агентов нового поколения.

Повышенный интерес к изучению взаимосвязи структуры и функции актинопоринов связан, в первую очередь, с необходимостью более глубокого понимания механизма действия этих мембраноактивных белков, играющих важную экологическую и алломональную роль в морском биоценозе. Дальнейшего изучения требует также феномен мультигенности актинопоринов, обнаруженный недавно у актинии Heteractis magnifica (Wang et al., 2008). В настоящее время перспективным и актуальным методом исследования является сайт-направленный мутагенез, который позволяет выяснить ключевую роль аминокислотных остатков (а.о.) актинопоринов в функционально значимых участках молекулы, вовлеченных в различные этапы парообразования (N-концевой а-спирализованный фрагмент, фосфорилхолиновый (РОС)-сайт связывания и RGD-мотив).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было установление структурно-функциональных взаимосвязей представителей мультигенных семейств пороформирующих токсинов актинии Heteractis crispa. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

(1) выделить и идентифицировать нативные актинопорины;

(2) получить нуклеотидные последовательности и установить на их основе аминокислотные последовательности актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S;

(3) создать генетические конструкции генов актинопоринов для гетерологичной экспрессии в бактериальной системе и получить рекомбинантные белки;

(4) определить физико-химические характеристики рекомбинантных белков и сравнить их с характеристиками нативных актинопоринов;

(5) выполнить сайт-направленный мутагенез функционально значимого участка молекулы актинопорина — RGD-мотива;

(6) провести структурно-функциональный и филогенетический анализ актинопоринов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В ходе работы выделен новый актинопорин из Н. crispa, последовательность N-концевого фрагмента которого (20 а.о.) отличалась от ранее установленной последовательности нативного актинопорина RTX-SII, выделенного из Я. crispa (=Radianthus macrodactylus). Методами молекулярной биологии установлены нуклеотидные последовательности и на их основе выведены аминокислотные последовательности представителей двух семейств актинопоринов, имеющих N-концевые остатки аланина (Hct-A семейство) и серина (Hct-S семейство). Получено семь рекомбинантных изоформ актинопоринов, различающихся значениями изоэлектрических точек, параметрами гидрофобности и количеством и локализацией заряженных а.о. N-концевых функционально значимых фрагментов, а также величиной гемолитической активности. Впервые проведен сайт-направленный мутагенез RGD-мотива актинопорина Я. crispa. Получены три мутантные формы актинопорина в виде телец включения. Выполнен структурно-функциональный анализ, который позволил установить важную роль для необратимого связывания с мембраной а.о.: Arg53, Туг113, Туг133, Туг138 и/или Туг137, участвующих в образовании водородных, ионных, С-Н...я-взаимодействий с фосфорилхолиновой головкой липидов, а также положительно и отрицательно заряженных остатков в N-концевом фрагменте актинопоринов для порообразующей активности белка. Полученные данные являются основой для дизайна новых структур молекул актинопоринов с заданной активностью с целью их биотехнологического получения и применения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Новый представитель актинопоринов актинии Н. crispa отличается от нативных актинопоринов, выделенных ранее из этого вида актинии, N-концевой аминокислотной последовательностью, молекулярной массой и значением изоэлектрической точки.

2. Семейства актинопоринов Hct-A и Hct-S актинии Н. crispa являются мультигенными.

3. Актинопорины Я. crispa на филогенетическом дереве группируются в несколько кластеров. Представители семейств актинопоринов Hct-A и Hct-S не формируют собственных, но входят в состав одних и тех же кластеров.

4. Рекомбинантные актинопорины Я. crispa отличаются друг от друга по величине гемолитической активности, что обусловлено различиями в количестве и локализации заряженных аминокислотных остатков в функционально значимом N-концевом фрагменте молекул.

5. Остатки Туг в положениях 113, 133, 138, входящие в РОС-сайт связывания актинопоринов, а также а.о. Arg53 и Serl05 вовлечены в процесс прочного связывания белков с цитоплазматической мембраной.

Апробация результатов. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XI Международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии, г. Владивосток, 2007; I Дальневосточном симпозиуме с международным участием «Науки о жизни», г. Владивосток, 2008; III Международной конференции «Химия, структура и функция биомолекул», г. Минск, 2008; VIII региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего востока России, г. Владивосток, 2008; XII и XIII Всероссийских молодежных школах-конференциях по актуальным проблемам \ химии и биологии, г. Владивосток, 2009 и 2010; Международном семинаре по

морским природным ресурсам, г. Ханой, 2010; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», г. Петрозаводск, 2011; 9-м Международном конгрессе по токсинологии, г. Владивосток, 2011.

Публикации. Соискателем опубликовано 14 работ, из них все по теме диссертации, в том числе 6 статей, из них 2 в журналах, определенных списком ВАК, 4 в сборниках научных трудов по материалам конференций и 8 тезисов докладов в сборниках трудов региональных, всероссийских и международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 181 цитируемую работу. Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста и содержит 8 таблиц и 43 рисунка.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.х.н., зав. лаб. Козловской Э.П., сотрудникам ЛХП: д.х.н. Монастырной М.М. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы и обсуждении результатов, к.х.н. Лейченко Е.В. за практическую помощь и постоянное внимание к работе и к.ф-м.н. Зелепуга Е.А. за проведение работ по молекулярному моделированию и участие в обсуждении результатов, а также сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н. Исаевой М.П. за неоценимую помощь в проведении экспериментов по молекулярной биологии, за критический анализ текста диссертации и автореферата. Автор также благодарен сотрудникам других лабораторий за помощь в выполнении отдельных этапов работы: к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., м.н.с. Гузеву К.В, к.б.н. Черникову О.В., к.х.н. Дмитренку П.С., к.х.н. Анастюку С.Д.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение и очистка белков. Гель-фильтрацию и обессоливание проводили на колонках с Акрилексом П-4 (Reanal, Венгрия), ионообменную хроматографию полипептидов - на колонке с целлюлозой КМ-32 (Whatman, Англия), ВЭЖХ белков — на колонке с обращенной фазой сорбента ZORBAX Eclipse® XDB-C8 (Agilent, США) на хроматографе Agilent 1100 (США) с УФ-детектором.

Концентрацию белка в пробах определяли по методу Лоури и др. (Lowry et al., 1951), в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин.

Молекулярную массу актинопорина определяли на времяпролетном масс-спектрометре ULTRAFLEXIIIТОРЯОР (Bruker Daltonic, Германия).

Аминокислотную последовательность N-концевого фрагмента актинопорина определяли на автоматическом твердофазном аминокислотном секвенаторе белков Precise 492 cLC (Applied Biosystems, США) по программе производителя.

Дизайн праймеров. Праймеры были спроектированы с применением программы Gene Runner. Синтез праймеров, используемых в работе, был осуществлен в НПО «Евроген», Россия.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для получения фрагментов, кодирующих сигнальную последовательность и зрелый актинонорин, проводили с использованием праймеров hct_sign (5'-TCGTTACc/aATGATA-3') и hct_notransl (5'-GATTCTCTATTTGTCTTC-3'), TagSE-полимеразы (НПО «Сибэнзим». Россия) и кДНК актинии Н. crispa.

Определение и анализ нуклеотидных последовательностей. ПЦР-фрагменты лигировали в плазмидный вектор pTZ57R/T (MBI Fermentas, Литва).

Полученными конструкциями трансформировали электрокомпетентные клетки Escherichia coli DH5a (Stratagene, США). Выделение плазмидной ДНК из клеток осуществляли методом щелочного лизиса (Sambrook and Russel, 2001). ДНК рекомбинантных плазмид секвенировали на ДНК-анализаторе ABI 3130xL (Applied Biosystems, США). Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей проводили с использованием пакета программ Vector NT! 8 (Invitrogen, США).

Филогенетический анализ актинопоринов. Аминокислотные последовательности актинопоринов анализировали, используя программу MEGA4 (Kumar et al., 2008). Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей проведен методом ближайших соседей (Neighbour-Joining) (Saitou and Nei, 1987). При построении филогенетического дерева использовали пи-дистанцию (p-distance). Достоверность филогенетического дерева оценивали «bootstrap» тестом (1000 реплик).

Создание экспрессионной конструкции гена актинопорииа с плазмидным вектором. Фрагменты ДНК размером 550 п.н., кодирующие зрелые актинопорины из Н. crispa, были получены с использованием ген-специфических праймеров hct-a(f), hct-s(f) и hct-(r) и рекомбинантных плазмид pTZ57R/T в качестве матриц. ПЦР-фрагменты клонировали в плазмиду рЕТ-41а(+) (Novagen, США). Полученными конструкциями трансформировали клетки штамма Rosetta (DE3) Е. coli (Novagen, США).

Экспрессия. Трансформированные клетки Rosetta (DE3) Е. coli культивировали в среде 2xYT, содержащей антибиотики канамицин и хлорамфеникол. Для индукции экспрессии добавляли ИПТГ (изопропил-p-D-тиогалактозид).

Рекомбинантиые белки выделяли методом аффинной хроматографии на Ni-CAM—агарозе (Batch-вариант). Для отделения рекомбинантного актинопорина от гибридной молекулы добавляли энтеропептидазу (New England BioLabs, Англия) из расчета 1 ед. фермента на 20 мкг гибридного белка. Белки клеточного лизата и рекомбинантные белки анализировали с помощью белкового электрофореза в полиакриламидном геле методом Лэммли (Laemmli, 1970).

Гемолитическую активность актинопоринов определяли на эритроцитах человека в среде, содержащей 0,9% NaCl.

Измерение электрических характеристик бислойных липидных мембран (БЛМ). Ток через БЛМ измеряли высокоомным вольтметр-электрометром ВК2-16 в режиме фиксации потенциала на мембране с помощью хлорсеребряных электродов (потенциал асимметрии 2-3 мВ). Регистрацию тока на выходе усилителя осуществляли потенциометром КПС-4.

Сайт-направленный мутагенез был выполнен согласно руководству «QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit» (Stratagene, США).

Расчет параметров гидрофобности и количества заряженных а.о. N-концевого фрагмента актинопоринов проводили с помощью программы HELIQUEST (http://heliquest.ipmc.cnrs.fr) для фрагмента последовательности длиной 18 а.о. (с 10 по 27 а.о.).

Получение теоретической модели трехмерной структуры актинопорина.

Модель пространственной структуры rHct-S3 генерировали с помощью программы SPDBV (http://expasy.org/spdbv) и сервера SWISS-MODEL. Модель оптимизировали в программе МОЕ м (http://www.chemcomp.com).

Белок-лигапдный докинг и молекулярную динамику комплексов актинопоринов с фосфорилхолином проводили с помощью сервера Docking Server (Bikadi and Hazai, 2009) и программы МОЕ соответственно._

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Выделение актинопоринов из актинии Н. crispa Для выделения нативных актинопоринов из 11. crispa ранее была разработана схема, основанная на осаждении гемолитически активных белков из водного экстракта актинии 80%-ым ацетоном. В результате ацетонового осаждения была получена белковая фракция, водный раствор которой был использован для дальнейшего хроматографического разделения. При гель-фильтрации этой фракции на Акрилексе П-4 было получено три фракции (рис. 1, А, пики 1-3), проявляющие гемолитическую активность. Для дальнейшего разделения гемолитически активных белков катионообменной хроматографией на КМ-32 целлюлозе была использована суммарная белковая фракция пика 3 (рис. 1, А), которая по данным электрофореза в градиенте плотности полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия содержала, главным образом, белки с молекулярной массой около 20 кДа. В результате ионообменной хроматографии белков этой фракции было получено пять гемолитически активных фракций (рис. 1, Б, пики 1-5). Фракция, соответствующая пику 1, обладала высокой гемолитической активностью, содержала, преимущественно, белки с молекулярной массой 20 кДа и была использована для дальнейшего исследования. Остальные фракции в данной работе не исследовали.

Рис. 1. (А) гель-фильтрация белков Н. crispa на колонке с Акрилексом П-4. (Б) катионообменная хроматография белковых фракций пика 3 (рис. 1, А) на колонке с целлюлозой КМ-32. (В) ВЭЖХ белков фракции 1 после катионообменной хроматографии. (Г) рехроматография белков фракции 7 (рис. 1, В) при тех же условиях. Отмечены границы объединения фракций, проявляющих гемолитичекую активность.

Белковая фракция 1 (рис. 1, Б) была собрана, обессолена на колонке с Акрилексом П-4 и использована для дальнейшего разделения высокоэффективной

жидкостной хроматографией на колонке с обращенной фазой сорбента ZORBAX Eclipse® XDB-C«. В результате ВЭЖХ были получены фракции, содержащие белки с молекулярными массами (по данным MALDI-масс-спектрометрии) от 4 до 6 кДа (пики 1-5) и 19,3-19,5 кДа (пики 6-8) (рис. 1, В). После рехроматографии гемолитически активной суммарной белковой фракции (рис. 1, В, пик 7) был получен гомогенный белок, названный Hct-S4 (рис. 1, Г), молекулярная масса которого, согласно данным MALDI-анализа, составила 19414 ± 10 Да.

С целью идентификации белка, полученного в результате ВЭЖХ (рис. 1, Г), была определена аминокислотная последовательность его N-концевого фрагмента (20 а.о.): SAALAGTIIEGASLGFQILD-. Полученная последовательность N-концевого фрагмента отличалась от последовательности RTX-SII (Klyshko et al., 2004) наличием в девятом положении изолейцина вместо треонина и в десятом положении остатка глутаминовой кислоты вместо лейцина. Таким образом, Hct-S4 является новым представителем семейства актинопоринов Н. crispa, имеющим N-концевой остаток серина.

2.2. Клонирование генов актинопоринов

Анализ ранее полученных последовательностей актинопоринов RTX-A (Il'ina et al., 2006) и RTX-SII Н. crispa (Klyshko et al., 2004) позволил предположить, что в ткани щупалец этой актинии могут существовать как минимум два семейства актинопоринов (с N-концевыми остатками серина и аланина). Для установления нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих зрелые актинопорины актинии Н. crispa, были сконструированы прямой hct_sign и обратный hct_notransl праймеры. Праймер hct_sign был создан на основе анализа сигнальных последовательностей известных актинопоринов, а ген-специфичный обратный праймер hct_notransl был сконструирован к нетранслируемой З'-области последовательностей rtx-a и rtx-sii.

В результате ПЦР с использованием в качестве матрицы полноразмерной кДНК Н. crispa получили фрагмент около 650 п.н., кодирующий часть сигнальной последовательности и зрелый актинопорин. Полученный ПЦР-фрагмент клонировали в плазмидный вектор pTZ57R/T. Рекомбинантными плазмидами трансформировали клетки Е. coli штамма DH5a. Наличие в отобранных клонах целевой вставки определяли с помощью метода ПЦР "на колониях" с использованием стандартных праймеров sTag и T7-terminator. Рекомбинантные плазмиды выделяли из клеток и секвенировали с помощью тех же праймеров.

При анализе более 100 клонов было обнаружено 44 различные нуклеотидньй последовательности, кодирующие часть сигнальной последовательности и зрелый белок. На основании нуклеотидных были выведены аминокислотные последовательности актинопоринов, и было отмечено, что последовательности зрелых белков отличаются N-концевым а.о. (Ser или Ala) (рис. 2). Это хорошо согласуется с экспериментальными данными по нативным актинопоринам (RTX-A и RTX-SII). На рисунке 2 приведены участок сигнальных последовательностей и N-концевые фрагменты зрелых белков некоторых представителей актинопоринов.

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов. Отмечены Ы-концевые а.о.

| сигнальный пептид I зрелый белок

Hct-A2 WTMICATIAVPSRKKLEDQKBQKR-"ÍIAGTIIAGA

Hct - аз

Hct-A4 WTWtCATXAVPSRKKLKDOKEQKÄ- -ШАвТГИйа»

Hct - A5 VVTM^CATIAVMRFKUSDQKEQKB -äLactXIAGA

Hct-S3 vvtM[Catiavpsheei,edqkei»^a)sjagtiiega

Hct-S5 WWrCATTAVPSRKKI,EDQKEH!a?^WASTIXAaA

Hct-S6

На основании отличий в N-концевых а.о. зрелых актинопоринов мы разделили полученные аминокислотные последовательности зрелых белков на два семейства. 17 последовательностей имели N-концевой остаток аланина (Hct-A-семейство) (рис. 3), а 25 последовательностей — N-концевой остаток серина (Hct-S-семейство) (рис. 4). Идентичность нуклеотидных последовательностей составила от 93 до 99%, идентичность аминокислотных последовательностей — от 88 до 99%. Наиболее представленными последовательностями оказались Hct-A2 - Hct-A5, Hct-S3, Hct-S5 и Hct-S6.

Расчетные значения молекулярных масс актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S составили 19,12-19,52 кДа, их изоэлектрические точки лежат в диапазоне значений 9,10-9,74, что соответствует значениям молекулярных масс и изоэлектрических точек нативных актинопоринов (Monastyrnaya et al., 2010).

Отличительным признаком аминокислотного состава актинопоринов, как считалось до последнего времени, является отсутствие остатков цистеина (Anderluh and Macek 2002). Согласно данным Вонга и соавторов, полученным в 2008 году, аминокислотные последовательности некоторых представителей актинопоринов актинии Heteractis magnifica, выведенные на основании 52 нуклеотидных последовательностей (Wang et al., 2008), содержат этот остаток в одном или нескольких положениях аминокислотных последовательностей. Практически все выведенные последовательности актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S не имеют остатков цистеина, за исключением последовательности Hct-S 19, в которой был обнаружен единственный остаток цистеина в 88 положении (рис. 3, 4).

Полученные данные свидетельствуют о том, что в ткани щупалец актинии Н. crispa, как и Actinio equina (Macek and Lebez, 1981; Anderluh et al., 1996) и H. magnifica (Wang et al., 2008), Stichodactyla helianthus (Lanio et al., 2001) синтезируется целый ряд изоформ актинопоринов, кодируемых, очевидно, генами мультигенных семейств. Как видно из рисунков 3 и 4, последовательности актинопоринов различаются единичными аминокислотными заменами, большинство из которых у актинопоринов обоих семейств приходится на N-концевой фрагмент молекулы, принимающий непосредственное участие в порообразовании (Kristan et al., 2004).

10

рз

зззэзззззз

ИТХ-А

НсЬ-А2

НсЬ-АЗ

Нс<:-А4

НсЬ-А5

НСй-Аб

НсЬ-А7

НсЪ-А8

НсЪ-А9

НсЬ-АЮ

НсЪ-А11

НсЬ-А12

нсъ-А13

НсЬ-АЛ*

НсЬ-А15

НсЬ-А16

НсЪ-А17

НсЪ-А18

КТХ-А

НсЪ-А2

Hct-A3

НСЪ-А4

НсЪ-А5

НсЬ-Аб

НсЬ-А7

НсЪ-А8

НсЬ-А9

НСЬ-АЮ

НсЬ-А11

НсЬ-А12

НсЬ-А13

НсЬ-А14

НсЪ-А15

НсЬ-А1б

НсЬ-А17

НсЬ-А18

„„1,0,,.,

„■■?.Л.....

--------к—Е--а—к

---------ЕА-

-А-Е-----Ь-

Р9 гзз

рю ри

эзвзз 333333

Р12

ззззэззз

ся/м •зотг!ШШс^окэтлг>гвькмка штз АСЕАХМЕ ХИХ ЭЙ

Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей зрелых актинопоринов

семейства Нсг-А. Рамками выделены И-концевые

фрагменты актинопоринов (1-29 а.о.) и РОС-сайт связывания (104-138 а.о.). Наиболее значимые для порообразования а.о. показаны на сером фоне. Буквами Н и Б показана длина а-спиралей и р-тяжей соответственно.

ктх-зи

НсЪ-ЗЗ НсЪ-37 Hct-Sll НсЪ-315

НсЪ-Зб

ксь-вв

Нс1:-39

НсЪ-ЗЮ

Нс1:-312

НсЪ-313

Нсй-314

Hct-S16

Нс1:-317

НсЬ-318

НсЪ-319

НсЬ-320

НсЬ-321

Нс^-322

НсЬ-323

НсЪ-в24

Hct-S25

Нс1;-326

НсЬ-327

НсЪ-328

ЯТХ-ЗИ

НсЪ-ЗЗ

НсЪ-37

НсЪ-ЗИ

НсЬ-315

НсЬ-55

НсЬ-Бб

НсЬ-39

нсь-зю

НсЬ-312

НсЪ-313

НсЬ-314

НсЬ-31б

Ней-317

НсЪ-318

НсЬ-319

НсЬ-320

НСЬ-Б21

Нс1:-322

НсС-323

НсЪ-324

НсЬ-325

НсЬ-32б

НсЬ-327

НсЬ-328

ЗЗЗЗЗЗЗ^ЗБ ЗЗЗЗЭЗЗЗЗ БББ БЗвЗввЗв БЗЗЗЗЗЗЗЗЗ ЗБ

30 40 50 60 70 80 90 100

ГSKKIAVGVDHESGGSVГГ^LNAYFRSGTTDVILPEFVPNQKALIJYSGRKDTGeVATGP.VkAFAYYKSNGHTЬ

—вЕ-

>7 р8 а2 р 9 РЮ Р11 р 12 ЗЗЗЙЗЗ зззззззз ЙНННННН эзэ гэггвз гвззвз ззэзззззз _11(2_122_12И_,140 150 160 170

ФА FSVPTDYmJYSl№ЮVK.IYSGKKRADQMІYEDliY ■сируя.сскв'токтаСУОьткактзАЮАн.ЕХктБк

А е

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей зрелых актинопоринов семейства НсЬА. Рамками выделены Ы-концевые фрагменты актинопоринов (1-29 а.о.) и РОС-сайт связывания (104-138 а.о.). Наиболее значимые для порообразования а.о. показаны на сером фоне. Буквами Н и Б показана длина а-спиралей и р-тяжей соответственно.

23. Филогенетический анализ последовательностей актинопоринов

Эволюционные взаимоотношения известных актинопоринов, а также представителей семейств Hct-A и Hct-S актинии Я. crispa отражены на филогенетическом дереве, согласно которому актинопорины формируют семь кластеров с "bootstrap''-поддержкой от 50% и выше (рис. 5). Высокая степень идентичности актинопоринов из семейств Hct-A и Hct-S Я. crispa с актинопоринами из Я. magnifica (86-99%) коррелирует с их принадлежностью к одному роду. Первые четыре кластера образованы актинопоринами семейства Stichodactylidae, в пятый и шестой кластеры вошли представители семейства Actiniidae, в седьмом кластере объединены актинопорины семейств Sargatiidae и Alisiidae. Основываясь на высокой степени идентичности последовательностей актинопоринов актиний Н. crispa и Я. magnifica, можно предположить, что дивергенция актинопоринов на кластеры (I-III) произошла до разделения видов на Н. crispa и Н. magnifica. При этом в каждом кластере появляются специфичные для видов группы. Более того, представители семейств актинопоринов Hct-A и Hct-S не формируют собственных, а входят в состав одних и тех же кластеров.

Кластер I включает 24 последовательности актинопоринов и делится на две ветви: первую образуют актинопорины Я. crispa и Я. magnifica, вторую -стихолизины Stnl и Stnll из 5. helianthus. Отличительной особенностью последовательностей, принадлежащих к первому кластеру, является наличие в 112 положении ароматического а.о., Phe или Тгр, входящего в состав РОС-сайта связывания, тогда как у остальных актинопоринов из Я. crispa и Я. magnifica в этом положении находится остаток Leu. Особенностью этого кластера является также наличие положительно заряженного остатка His в положении 98. Другие актинопорины (за исключением нативных Stnl и Stnll) имеют в этом положении незаряженный остаток Asn. Идентичность последовательностей кластера I составляет 87-99%. Кластер II включает в основном представителей актинопоринов Я. magnifica, которые формируют отдельную фуппу. Интересно, что эта группа представлена последовательностями, имеющими в своем составе остаток цистеина. Идентичность последовательностей этого кластера составляет 94-99%. Большинство актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S представлено, главным образом, в кластере III (идентичность 92-99%). Четвертый кластер включает только три последовательности: два актинопорина Я. crispa (RTX-A и цистеин-содержащую последовательность Hct-S 19 из семейства Hct-S) а также гигантоксин-4, нативный актинопорин, выделенный недавно из Stichodactyla gigantea (Ни et al., 2011). Кластеры V-VIII содержат последовательности нативных актинопоринов: Or-А и Or-G из Oulactis orientalis (Ильина и др., 2005) (кластер V), Eqtll, EqtIV и EqtV из A. equina, FraC из Actinia fragacea (Bellomio et al., 2009), образующие отдельную группу, Вр-1 из Anthopleura asiatica (Kohno et al., 2009) и Ucl из Urticina crassicornis (Razpotnik et al., 2009) (кластер VI), PsTX-20 из Phyllodiscus semoni (Nagai et al., 2002), Avt-I из Actineria villosa (Uechi et al., 2005) и Src-1 из Sagartia rosea (Jiang et al., 2002), находящийся на отдельной ветви (кластер VII).

Причина огромного разнообразия изоформ актинопоринов, полученных из одного вида актинии (A. equina, Я. magnifica, S. helianthus, Я crispa, О. orientalis), пока не ясна. Несомненно, этот феномен представляет большой научный интерес в связи с экологической и алломональной ролью представителей этой уникальной группы цитотоксинов в морском биоценозе, а также их различной активностью.

Кластер I

Кластер II

Кластер

Кластер IV

А Актинопорины Н.спвра Щ Магнификализины Н.тадпШса А Стихолизины Э.ЬеНапМиз Щ) Гигантоксин 5.д/'дал?ез ф Актинопорины О.оп'епМаНв | Эквинатоксины Аедо/'ла <ф> Фрагасиатоксин А1гадасеа Д Бандапорин А.а&айса Кластер V

# Уртицинатоксин и.сгазз/согп/з С Актинопорин З.говез А Актинопорин А.уШоэа | Актинопорин Р.зетоп/'

Кластер VI

Рис. 5. Филогенетическое дерево аминокислотных последовательностей актинопоринов, пос троенное методом ближайших соседей.

2.4. Экспрессия, выделение и гемолитическая активность рекомбинантных актинопоринов

Для создания экспрессионных конструкций генов актинопоринов Н. crispa, кодирующих зрелые белки, была выбрана рЕТ система, в частности, плазмидный вектор рЕТ-41а(+), предназначенный для экспрессии в Е. coli гибридных белков с белком-носителем - глутатионтрансферазой (GST).

С целью получения целевых фрагментов были сконструированы генспецифичные праймеры на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S. К 5'-концам прямых праймеров были добавлены по одному G для сохранения энтеропептидазного сайта. В обратный праймер был включен сайт рестрикции для Hindill (AAGCTT), совмещенный со стоп-кодоном (табл. 1).

Таблица 1. Олигонуклеогидные праймеры, использованные для ПЦР-амплификации

Праймер Аминокислотная последовательность Нуклеотидная последовательность (5' - 3')* Температура отжига, °С

hct-a(f) ALAGTIIAGA GGCTTTAGC TG G TAC А АТТАТ CGCGGGTGCA (31) 77,5

hct-s(f) SAALAGTITL GTCGGCGGCTTTAGCTGGCA СААТТАСТСТС (31) 77,1

hct-(r) ILQIKISRStopHindIII4N CCCCAAGCTTAGCGTGAGAT CTTAATTTGCAGTAT (35) 74,1

Примечание: * — полужирным шрифтом выделены дополнительные нуклеотиды, подчеркнут сайт рестрикции для рестриктазы Hind\\\.

В качестве матрицы были использованы рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты генов наиболее представленных в семействах Hct-A и Hct-S актинопоринов (hct-a2 - hct-a5, hct-s3, hct-s5 и hct-s6). Полученные ПЦР-фрагменты были лигированы в экспрессионный вектор рЕТ41 по сайтам рестрикции PshAX и Hindi II (рис. 6) и далее результирующими плазмидами были трансформированы клетки Е. coli штамма Rosetta (DE3).

fl ori

Hindin (190) stop

kan

het-abet-s

сайт для чнтеропептндаял

Psli Al (731) His-Tag GST Met

Рис. 6. Физическая карта генетической конструкции рЕТ41— hct-a/hct-s (Сконструирована в программе Vector NTI 8).

1яс-1

В ходе проведения экспрессии были оптимизированы условия для получения в препаративных количествах химерного белка: температура наращивания составила 30°С, концентрация ИПТГ - 1мМ, время наращивания - 3 часа. В результате экспрессии были получены предшественники рекомбинантных актинопоринов в виде химерных белков, включающих GST и шесть остатков гистидина на N-конце - His6-

tag (GST-His6-rHct-A/S). Присутствие химерных белков (52 кДа) подтверждали ДСН-электрофорезом в полиакриламидном геле белков клеточного лизата (рис. 7).

Рис. 7. Электрофореграммы белков клеточного лизата после экспрессии: 1 -контроль (рЕТ41//гс?-я2 без добавления ИПТГ); 2 - рЕТ41/йс/-о2; 3 - рЕТ41//гсг-дЗ; 4 - маркеры молекулярной массы; 5 — рЕТ411Ис1-а4\ 6 - рЕТ41//гс;-о5; 7 - контроль (рЕТ4І/Лсл-іЗ без добавления ИПТГ); 8 -рЕТ41/йсг-хЗ; 9 -рЕТ41//гсг-55; 10 -рЕТ41/Лс/-.у<5; ІІ - маркеры молекулярной массы.

Выделение рекомбинантных зрелых актинопоринов (гНс1-А2 - гНс!-А5, гНс1-БЗ, гНе1-85 и гНй-Зб) осуществляли с помощью аффинной хроматографии на смоле №-САМ (схема). Общий выход рекомбинантных белков составил в среднем 4 мг с 1 литра клеточной культуры.

Схема. Этапы выделения рекомбинантных актинопоринов.

На рисунке 8 показаны результаты ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле очищенных рекомбинантных белков, полосы на уровне 20 кДа соответствуют рекомбинантным актинопоринам.

Рис. 8. Электрофореграммы рекомбинантных актинопоринов. (А) семейства Нс1-А: I - гНй-А2, 2 - гНс!-АЗ, 3 - гНс»-А4, 4 - гНсЧ-А5, 5 -маркеры молекулярной массы. (Б) семейства НсЬЭ: 1 - гНсьБЗ, 2 - гНс1-Б5, 3 - гНа-Бб, 4 - маркеры молекулярной массы.

Для установления N-концевых фрагментов рекомбинантных актинопоринов были проведены электроблоттинг и секвенирование белков. Последовательности N-концевых фрагментов (15 а.о.) рекомбинантных белков оказались идентичными последовательностям, которые были выведены на основании нуклеотидных последовательностей актинопоринов (рис. 3 и 4). Рекомбинантные актинопорины имели близкие значения молекулярных масс и изоэлектрических точек (табл. 2). При сравнении гемолитической активности рекомбинантных белков было обнаружено, что только три из них, rHct-A2, rHct-АЗ и rHct-S3, имеют активность, сравнимую с активностями нативных белков (табл. 2).

Таблица 2. Физико-химические характеристики и биологическая активность рекомбинантных актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S, и нативных актинопоринов RTX-A (Monastyrnaya et ai., 2002), RTX-S11 (Klysliko et al., 2004), Eqtil (Macek and Lebez, 1981), Stnll (Lanio et al., 2001), HMgl и HMgll (Khoo et al., 1993)

Актинопорин Молекулярная масса, кДа Изоэлектрическая точка Гемолитическая активность. ГЕ/мг

RTX-A -20,0 -9,8 3,5хЮ4

rHct-A2 19,14* 9,76** (4,0±0,36)х104***

rHct-АЗ 19,20* 9,75** (2,0±0,49)х104***

rHct-A4 19,16* 9,50** (2,2±0,40)х102***

rHct-A5 19,23* 9 45** (1,0±0,26)х103***

RTX-S II 19,28 10 3,6х104

rHct-S3 19,39* 9,31** (3,3±0,31)х104***

rHct-S5 19,33* 9,33** (1,0±0,53)х103***

rHct-S6 19,39* 9,10** (4,2±0,52)х103***

Eqtll 19,0 10,5 3,6x104

Stnll 17,6 9,8 ЗДхЮ4

HMgl 19,0 9,4 3,6x104

HMgll 19,0 10,0 3,3x104

Примечания: * Расчетные значения по аминокислотной последовательности. ** Расчетные значения по программе РЯОРКА 3.0 (Оквоп а а1., 2011).

*** Средние значения из шести независимых экспериментов±стаидартное отклонение. Достоверность различий между показателями оценивали по однопараметрическому тесту АЫОУА.

Каналообразующую активность рекомбинантного актинопорина гНс1-А2 определяли на бислойных липидных мембранах (БЛМ), сформированных из моноолеина и сфингомиелина (1:3). Показано, что гНс1-А2 в концентрации 50 нг/мл вызывает дискретные флуктуации тока в мембране, что свидетельствует о появлении в ней проводящих структур - ионных каналов. Величины поводимое™ каналов, образуемых в БЛМ. были аналогичны таковым нативного актинопорина ЯТХ-А (рис. 9).

Рис. 9. Проводимость БЛМ, индуцированная актино-поринами Н. crispa: rHct-A2 (50 нг/мл) и RTX-A (5 нг/мл). Мембранный потенциал -20 мВ.

1LC rHct-A2

12ПА| л-ГЧ.

^у 1LC

12 пА ¡

20 MB

20 MB

Анализ проводимости каналов, индуцированных гНс1-А2. показал, что наиболее вероятная проводимость каналов в 0.1 М №С1 при значении рН 7.5 составляет 180±30 пСм (рис. 10).

rHct-A2

т

О 60 120 180 МО №0 420

Проводимость. пСм

RTX-A

0 60 120 ISO ЫО »00 J20 Проводимость. ПСм

Рис. 10. Гистограммы проводимости мембран, модифицированных рекомбинант-ным и нативным актино-поринами. гНс!-А2 и ЯТХ-А. Величина наиболее вероятной проводимости каналов составляет 180±30 пСм.

2.5. Сайт-направленный мутагенез

С целью изучения функциональной значимости а.о. в КОО-мотиве актинопорина. играющего важную роль в связывании ряда адгезивных белков и пептидов с мембранными интегринами. был выполнен сайт-направленный мутагенез. Для проведения мутагенеза была выбрана нуклеотидная последовательность /гс1-а2, кодирующая белок гНс1:-А2. обладающий высокой гемолитической активностью. Для получения мутаций в ГЮО-мотиве были сконструированы прямые (О и обратные (г) праймеры. содержащие различные варианты мутаций (табл. 3).

Таблица 3. Праймеры, использованные при проведении мутагенеза

Праймер Нуклеотидная последовательность (5' - 3')

hct-a-GGA(f) CAATCCATATGGAGGGGCCAATGGATGG (28)

hct-a-GGA(r) CCATCCATTGGCCCCTCCATATGGATTG (28)

hct-a-RGG(f) TCCATATCGAGGGGGCAATGGATGGCAC (28)

hct-a-RGG(r) GTGCCATCCATTGCCCCCTCGATATGGA (28)

hct-a-GGD(f) TGGCAATCCATATGGAGGGGACAATGGA (28)

hct-a-GGD(r) TCCATTGTCCCCTCCATATGGATTGCCA(28)

Для получения мутантных плазмид использовали клетки Е. coli штамма XL-1 Blue. Выделенные из клеток плазмиды секвенировали с праймерами sTag и Т7-terminator. Эффективность мутагенеза составила от 20 до 30%. Рекомбинантные плазмиды, содержащие мутации (pET4\-hct-a2-GGA, pET4\-hct-a2-RGG, рЕТ41-/;с/-a2-GGD), экспрессировали в Е. coli штамм Rosetta (DE3). Химерные белки (52 кДа). содержащие GST-His6, были обнаружены в тельцах включения (рис. 11).

В дальнейшем планируется получить функционально активные мутантные актинопорины и провести изучение их действия на искусственные (БЛМ) и биологические мембраны (эритроциты и яйцеклетки морского ежа S. intermedins), а также биосенсорный анализ связывания мутантных белков с интегрином aVß3 методом SPR (поверхностного плазмонного резонанса).

Рис. 11. Электрофореграмма белков клеточного лизата после экспрессии. 1 -химерный белок, содержащий трипептид йСА; 2 - химерный белок, содержащий трипептид ЯвС; 3 - химерный белок, содержащий трипептид вйО; 4 - маркеры молекулярной массы.

J 2 3 4

2.6. Структурно-функциональный анализ актинопоринов -представителей семейств Hct-A и Hct-S

2.6.1. Компьютерное моделирование рекомбинантного актинопорина

rHct-S3

Ввиду отсутствия кристаллографических данных для структур актинопоринов Н. crispa определение локализации функционально важных участков рекомбинантного актинопорина rHct-S3 (самого активного из полученных рекомбинантных белков представителя семейства Hct-S (табл. 2)) было проведено методами компьютерного моделирования.

В качестве прототипа для построения модели использовали кристаллическую структуру Stnll (PDB код lgwyA) из актинии S. helianthus. Согласно теоретической ЗО-модели актинопорин rHct-S3 содержит 12 (3-тяжей и две. расположенные на N- и С-концах молекулы, a-спирали, обрамляющие (3-кор. Антипараллельные р-тяжи соединены между собой и с сх-спирализованными фрагментами молекулы петлями

Рис. 12. Ленточная диаграмма 3D структуры rHct-S3, полученной методом гомологичного моделирования с помощью программ SPDBV (http://expasy.org/spdbv) и сервера SWISS-MODEL (Schwede et al., 2003). Параметры RMSD 175 Са-атомов генерированной 3D модели и прототипа.яе превышали 0,5 А. Элементы вторичной структуры получены с помощью программы МОЕ. N-концевая и С-концевая а-спирали показаны красным цветом, р-тяжи - голубым. Остатки, входящие в РОС сайт связывания актинопорина с мембраной, обозначены серыми стержнями, RGD-мотив - синими.

2.6.2. Выяснение функциональной значимости и.о. рекомбинантных актинопоринов при порообразовании

Известно, что большинство глобулярных белков, имеющих на Ы-конце амфифильные спирализованные фрагменты длиной около 18 а.о. и более, проявляет

мембранную (пороформирующую) активность (Saier et al., 1988). Ее количественную оценку дают параметры гидрофобности (средний гидрофобный момент <рН> и средняя гидрофобность <Н>), рассчитываемые по известному методу (Eisenberg et al., 1984), с помощью которых можно предсказать аффинность а-спирали по отношению к липидному гидрофобному кору мембраны. Согласно теоретическим и экспериментальным данным (Eisenberg et al., 1984; Hristova and White, 1998) значения среднего гидрофобного момента (<цН>) N-концевых спирализованных фрагментов белков, варьирующие в пределах значений 0,3-0,4, указывают на их способность включаться в гидрофобный кор мембраны. Для связывания амфифильных белковых структур с мембраной не менее важна сеть положительно заряженных а.о. (Seelig, 2004; Lee et al., 1998), благодаря которым происходит электростатическое взаимодействие белковых молекул с отрицательно заряженными фосфорилхолиновыми группами мембранных липидов.

Для визуализации трансмембранного а-спирального участка N-концевого фрагмента актинопорина, принимающего участие в пороформировании, применен графический подход, основанный на анализе так называемых «спиральных колец Шиффера-Эдмундсона» (Shiffer and Edmundson, 1967). Расчет параметров гидрофобности рекомбинантных актинопоринов Hct-A и Hct-S семейств проведен для N-концевых фрагментов молекул с 10 по 27 а.о. Согласно литературным данным именно этот фрагмент молекулы включается в мембрану и участвует в формировании ион-проницаемой поры с экспонированными в ее полость полярными а.о. (Mancheno et al., 2003; Malovrh et al., 2003). Установлено, что параметры гидрофобности N-концевых фрагментов рекомбинантных белков rHct-A2 - rHct-A5, rHct-S3, rHct-S5 и rHct-S6 находятся в пределах значений, необходимых для сильных гидрофобных взаимодействий с жирнокислотными остатками липидов (табл. 4).

При анализе «спиральных колец» было установлено, что у всех рекомбинантных молекул отрицательно заряженные а.о. на полярной поверхности N-концевых спирализованных фрагментов преобладают над положительно заряженными (табл. 4). Наличие высокоосновной петли 30SRK32 (рис. 12), соединяющей N-концевую а-спираль с Р-кором, и положительно заряженных остатков Lys21 (у rHct-S3, rHct-A2 и rHct-АЗ, как и у нативных Stnl и Stnll) и Lysl7 (у Hct-S5, Hct-S6, Hct-A4 и Hct-A5) определяют электростатическое взаимодействие этих молекул с мембранным интерфейсом (рис. 13). Одним из необходимых условий функциональной активности актинопоринов является, как показывают «спиральные кольца», наличие внутри формируемой полости поры нескольких отрицательно заряженных а.о., которые определяют ее катионную селективность и, соответственно, величину гемолитической активности белка. Последовательности N-концевых спирализованных фрагментов рекомбинантных белков обоих семейств соответствуют требованиям, необходимым для проявления порообразующей активности, т.к. имеют отрицательно заряженные а.о.: GlulO, Asp20, Glu25 (у rHct-S3), Asp20, Glu25 (у rHct-A2 и rHct-АЗ,) и Asp20, GIu21, GIu25 (y rHct-АЗ, rHct-A4, rHct-S5 и rHct-S6).

Более низкие значения гемолитической активности рекомбинантных актинопоринов rHct-A4, rHct-A5, rHct-S5 и rHct-S6, по сравнению с rHct-A2, rHct-АЗ, rHct-S3 и нативными белками (табл. 2) можно объяснить наличием положительно заряженного остатка Lysl7, частично блокирующего проницаемость поры для ионов 1С, тогда как у других актинопоринов в этом положении находятся либо отрицательно заряженные а.о. (у EqtH и Stnl), либо незаряженный остаток глутамина (у актинопоринов Hmglll, Stnll, rHct-A2, rHct-АЗ и rHct-S3) (рис. 13).

Таблиц» 4. Значения средней гидрофобное™ (<Н>) и среднего гидрофобного момента (<рН>), а также количества заряженных остатков И-концевого а-спирализованного

фрагмента актинопоринов*

Актинопорин <pH> <H> Количество заряженных a.o. на N-концевом фрагменте 10-27 Диаграмма «спиральных колец Шиффера-Эдмундсена»**

(-)заряд (+)заряд

RTX-A 0,349 0,563 2 1 ■sis«.

RTX-S1I 0,278 0,609 2 1 1» Щ ёмР

rHct-A2, rHct-A3 0,351 0,532 2 1 CJ Щт*

rHct-S3, 0,402 0,479 3 1 %i¿r

Hct-A4, Hct-A5, rHct-S5, rHct-S6 0,392 0,523 3 1

Примечание: * расчет произведен по программе HELIQUEST (http://heliquest.ipmc.cnis.fr/). '

** (Shiffer and Edmundson, 1967)

Ранее было показано, что остатки Trpl 12 и Trpl 16, локализованные на Р8 тяже РОС-сайта связывания функционально значимы для Eqtll II, т.к. их замена на Phe уменьшает способность белка связываться с мембраной и более чем на 90% снижает его гемолитическую активность (Hong et al., 2002).

HmglII Eqtll Stnl Stnll rHct-S3 arHct - A2 rHct-A3 rHct-A4 rHct-A5 rHct-S5

rHct-S6 (1

SSALAGTIIEGASLGFQILDKVLGELGKVSRK(32)

—DV—AV-D----S-D—KT—EA—N-K— (32)

•SE------D----T-EV--------------(31)

-------A----T—V-----E--------(30)

--------------------------------(32)

..-------A----------------------(30)

«.-------A----------------------(30,

».-------a----T-K---E-----------(30)

..-------a----T-K---E-----------(30)

.........A----T-K---E-----------(32)

---------A----T-K---E-----------(32)

Рис. 13. Множественное выравнивание N-концевых аминокислотных последовательностей актинопоринов. HmglII (Swiss-Prot, Q9U6X1) из Н. magnifica; Eqtll (Swiss-Prot, Р61914) из A. equina-, Stnl, Stoll (Swiss-Prot, P81662, P07845) из S. helianthus.

Однако этим фактам противоречат близкие величины гемолитической активности нативных Radianthus актинопоринов RTX-A, RTX-S, RTX-SII, Phyllodiscus актинопорина PsTX-20A и магнификализинов HMgll и HMglll, которые имеют в положении, эквивалентном EqtH-Trpl 12, остатки Leu или Phe. Недавно Бакраком с сотрудниками было установлено, что помимо Тгр112 для связывания со сфингомиелином мембраны необходим Tyrll3 (Bakrac et al., 2009) - остаток, имеющийся у всех известных актинопоринов и во всех последовательностях рекомбинантных белков семейств Hct-A и Hct-S (рис. 3 и 4).

2.6.3. In sittco исследование комплекса актинопорина с лигапдом, фософорилхолином

Оценку функциональной роли аминокислотных остатков, локализованных в области РОС-сайта связывания (Тгр112, Туг113, Туг133, Туг137 и Туг138), в образовании комплексов актинопоринов Stnll, rHct-S3 и rHct-S5, содержащих в 112 положении остатки Тгр, Phe или Ley соответственно, с фофорилхолином, проводили методами молекулярного моделирования (белок-лигандный докинг и молекулярная динамика). В качестве начального состояния комплекса rHct-S3 с фосфорилхолином (рис. 14, А) нами была принята архитектура комплекса, аналогичная таковой для стихолизина II (PDB ID 1072). Показано, что в результате молекулярной динамики (МД) комплекса rHct-S3 с фосфорилхолином (в вакууме и в водном окружении, 500 псек, Т=300°К) происходит прочное связывание лиганда с актинопорином, обусловленное образованием шести водородных связей, ионного и от одного до трёх С—Н...л-взаимодействий (рис. 14, Б). Следует отметить, что для исходного состояния характерно наличие только трех водородных связей и ионного взаимодействия (рис. 14, А).

Согласно результатам МД комплекса остатки Тут113, Туг133 и Туг138 РОС-сайта связывания, а также положительно заряженный Arg53 вносят значительный вклад во взаимодействие актинопорина с фосфорилхолином за счет образования водородных связей. При этом комплекс Hct-S3 с лигапдом стабилизируют не только эти четыре водородные связи, образующиеся непосредственно между белком и фосфорилхолином, но и водородные связи, возникающие между остатками Serl05 и Arg53 и фосфатной группой опосредовано через молекулы воды (рис. 14, Б).

Ранее Бакрак и соавторы отметили, что электростатические взаимодействия не играют важной роли в связывании Eqtll с мембраной (Bakrac et al., 2009). Однако асчетные данные МД показали, что положительно заряженный остаток Arg53 -азует ионную связь с атомами кислорода фосфорилхолина (рис. 14, Б). В процессе МД происходит уменьшение расстояния между гуанидиновой группой Arg53 и фосфатной группой лиганда с 6,60 А до 3,63 А. Это приводит к увеличению вклада электростатического взаимодействия в свободную энергию образования комплекса rHct-S3 и фосфорилхолина от -1,9 ккал/М до —14,1 ккал/М. Данный факт позволяет предположить, что электростатические взаимодействия всё-таки вносят существенный вклад в образование комплекса актинопорина с лигандом.

Установлено, что остаток Туг113 образует водородную связь с атомом кислорода фосфатной группы, а также участвует в формировании по крайней мере одного С-Н...71-взаимодействия между электронным облаком бензольного кольца и атомом водорода фосфорилхолина (рис. 14, Б). Как известно л-взаимодействия играют важную роль в межмолекулярном распознавании при образовании белок-белковых и белок-лигандных комплексов (Tayubi and Sethumadhavan, 2011). В ходе молекулярной динамики мы не обнаружили возникновения взаимодействий между

Тгр112 и фосфорилхолином. Аналогичные результаты МД были получены и для комплексов актинопоринов ЭйШ и гНс1-85 с лигандом. Расчетные методы показывают, что описанные выше молекулярные контакты, возникающие при взаимодействии актинопоринов с фосфорилхолиновой головкой, обеспечивают достаточно прочное связывание белка с лигандом.

Рис. 14. Схемы межмолекулярных взаимодействий rHct-S3 с фосфорилхолином в начальном состоянии (А) и в результате молекулярной динамики (Б), где:

...... Контакт с растворителем

...... Ионная связь

-<■ — Водородная связь ■ • С-Н...П-взаимодействие

Таким образом, наличие или отсутствие в молекуле остатка Тгр112 не играет принципиальной роли для проявления гемолитической активности актинопорина, поскольку остатки тирозина в положениях 113, 133, 137 и 138 обеспечивают молекуле возможность образования достаточно прочных контактов с фосфорилхолиновой головкой мембранного сфингомиелина (и/или фосфатидилхолина) посредством водородных связей, электростатических и С-Н...я-взаимодействий (рис. 14, Б). Это подтверждают также результаты кристаллографических исследований комплекса Stnll с фосфорилхолином (Mancheño et al., 2003) и экспериментальные данные, свидетельствующие о необратимости связывания актинопорина RTX-A с БЛМ (Чантурия и др., 1990). На величину гемолитической активности влияет не стольк-замена остатков в каком-то определенном положении молекулы, сколько наличие локализация положительно и отрицательно заряженных остатков в функциональ значимом N-концевом фрагменте актинопорина. *

ВЫВОДЫ

1. Из актинии Н. crispa выделен в индивидуальном состоянии новый актинопорин Hct-S4, молекулярная масса которого согласно данным MALDI TOFMS составляет 19414±10 Да. Определена аминокислотная последовательность его N-концевого фрагмента (20 аминокислотных остатков).

2. Установлены нуклеотидные последовательности генов и на их основе выведены аминокислотные последовательности 42 актинопоринов, принадлежащих к двум высокогомологичным мультигенным семействам, с N-концевыми остатками аланина (Hct-A семейство) и серина (Hct-S семейство).

3. Проведен филогенетический анализ всех известных аминокислотных последовательностей актинопоринов. Показано, что на филодереве они

объединяются в семь кластеров. Актинопорины Н. crispa группируются в четыре кластера. Представители семейств актинопоринов Hct-A и Hct-S не формируют собственных, но входят в состав одних и тех же кластеров. Предполагается, что дивергенция актинопоринов семейства Stichodactylidae произошла до разделения видов на Н. crispa и Н. magnifica.

4. Получено семь рекомбинантных форм актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S, отличающихся аминокислотными последовательностями, а также величинами гемолитической активности. Установлено, что рекомбинантный белок rHct-A2 также как и нативный актинопорин RTX-A вызывает дискретные флуктуации тока, характерные для проводящих структур - ионных каналов.

5. Проведен сайт-направленный мутагенез RGD-мотива, получены три мутантные формы актинопоринов в виде телец включения.

6. На основании структурно-функционального анализа определены ключевые для функциональной активности актинопоринов из Н. crispa заряженные аминокислотные остатки в N-концевых фрагментах и ароматические остатки РОС-связывающего сайта.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ткачева Е.С. Функциональная экспрессия актинопорина RTX-S3, нового цитолитического токсина актинии Heteractis crispa // Вестник ДВО РАН. -

2010. №4. -С. 134-137.

2. Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Исаева М.П., Зелепуга Е.А., Анастюк С.Д., Дмитренок П.С., Козловская Э.П. Новые актинопорины актинии Heteractis crispa: клонирование и функциональная экспрессия // Биохимия. -

2011.-Т. 76, вып. 10.-С. 1387-1397.

3. Gladkikh I.N., Leychenko E.V., Monastyrnaya M.M., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Eskov A.A., Chausova V.E., Tkacheva E.S., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from sea anemones: prospects of investigation // Intern, workshop on marine living resources of Vietnam. Hanoi. 2010. [proc.] - Hanoi: Inst. Nat. Prod. Chem.,Vietnam Acad. Sei. Technol., 2011. - P. 101-110.

4. Меньшов A.C., Ткачева E.C., Монастырная M.M. Новые актинопорины из актинии Heteractis crispa: выделение и частичная характеристика // Актуальные проблемы биологии, химии, физики: материалы международной заочной научно-практической конференции. (27 декабря 2011 г.) - Новосибирск: Изд. «ЭКОР-книга», 2011. - С. 98-106.

5. Ткачева Е.С. Гетерологичная экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка Hct-АЗ актинии Heteractis crispa II Актуальные проблемы биологии, химии, физики: материалы международной заочной научно-практической конференции. (27 декабря 2011 г.) - Новосибирск: Изд. «ЭКОР-книга», 2011. - С. 17-22.

6. Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Исаева М.П„ Зелепуга Е.А., Козловская Э.П. Получение нового рекомбинантного актинопорина актинии Heteractis crispa II Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы: сборник научных трудов по материалам Международной заочной научно-практической конференции. (26 декабря 2011 г.) - Тамбов: Изд. ТРОО «Бизнес-Наука-Общество», 2012.-С. 133-137.

7. Лейченко Е.В., Соболева (Ткачева) Е.С. Получение конструкции фрагмента гена, кодирующего зрелый актинопорин из актинии Radianthus macrodactylus с плазмидным вектором // XI Международная молодежная школа-конференция

9.

10.

11.

12.

13.

по актуальным проблемам химии и биологии: сб. тез. докл. - Владивосток, (1118 сент. 2007 г.) - Владивосток: ДВО РАН, 2007 - С. 26.

Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Исаева М.П., Еськов A.A., Ткачева Е.С., Козловская Э.П. Структурно-функциональные исследования актинопоринов // Химия, структура и функция биомолекул: сб. тез. докл. III Междунар. конф., Минск, (1-3 окт. 2008 г.) - Минск: Ин-т биоорган, химии HAH Беларуси, 2008.

- С. 145-146.

Tkacheva E.S., Eskov A.A., Leychenko E.V., Isaeva M.P., Gusev K.V., Monastymaya M.M., Kozlovskaya E.P. Cloning, sequencing and expression of actinoporin from the sea anemone, Radianthus macrodactilus II 1-st Far Eastern International Symposium on Life Science: proceed. - Vladivostok, (Sept. 2-7, 2008)

- Vladivostok: PIBOC FEB RAS, 2008. - P. 76.

Ткачева E.C., Лейченко E.B., Исаева М.П., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Получение рекомбинантного актинопорина, пороформирующего токсина, из актинии Radianthus macrodactilus И Актуальные проблемы экологии, морской биологии и биотехнологии: сб. тез. докл. VIII регион, конф. студентов, аспирантов вузов и науч. организаций Дальнего Востока России, Владивосток, (11-14 дек. 2008 г.) - Владивосток: ДВФУ, 2008 - С. 144. Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Исаева М.П., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Получение рекомбинантных форм актинопоринов и исследование их гемолитической активности // XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии: сб. тез. докл. -Владивосток, (7-14 сент. 2009 г.) - Владивосток: ДВО РАН, 2009 - С. 75. Ткачева Е.С., Еськов A.A., Лейченко Е.В., Исаева М.П., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Мультигенное семейство актинопоринов из актинии Heteractis crispa II XIII Всерос. молодеж. школа-конф. по актуал. проблемам химии и биологии: сб. тез. докл. - Владивосток, (7-14 сент. 2010 г.) - Владивосток: ДВО РАН, 2008 - С. 70.

Ткачева Е.С., Еськов A.A., Лейченко Е.В., Исаева М.П., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Новое мультигенное семейство актинопоринов (Hct-S) актинии Heteractis crispa II V Российский симп. «Белки и пептиды»: сб. тез. докл. - Петрозаводск, (7-11 авг. 2011 г.) - Петрозаводск: Карельский науч. центр РАН, 2011 - С. 310.

Tkacheva E.S., Leychenko E.V., Monastymaya M.M., Isaeva M.P., Kozlovskaya E.P. New multigene groups of the sea anemone actinoporins from Heteractis crispa II 9th 1ST Asia Pacific meet, on animal, plant and microbial toxins: proceed. -Vladivostok, (4-8 Sept. 2011) - Vladivostok: FEB RAS, 2011 - P. 57.

Соискатель

Ткачева E. С.

Ткачева Екатерина Сергеевна

Получение и структурно-функциональный анализ аісгинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispa

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 7.04.12 г. Формат 60x84/16. Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1.0. Заказ №15999.

Отпечатано в печатном салоне «Оперативная полиграфия». ИП Матусевич Ю. И. 690013, г. Владивосток, ул. Трамвайная 14Б., тел. (242)2694987

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ткачева, Екатерина Сергеевна, Владивосток

61 12-3/1102

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Ёлякова Дальневосточного отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Ткачева Екатерина Сергеевна

Получение и структурно-функциональный анализ актинопоринов мультигенных Hct-A и Hct-S семейств актинии Heteractis crispa.

03.01.04 - биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Козловская Э.П.

Владивосток, 2012 г.

Благодарности за научное сотрудничество и помощь в работе.

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.х.н., зав. лаб. Козловской Э.П., сотрудникам ЛХП: д.х.н. Монастырной М.М. за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы и обсуждении результатов, к.х.н. Лейченко Е.В. за практическую помощь и постоянное внимание к работе и к.ф-м.н. Зелепуга Е.А. за проведение работ по молекулярному моделированию и участие в обсуждении результатов, а также сотруднику лаборатории морской биохимии к.м.н. Исаевой М.П. за неоценимую помощь в проведении экспериментов по молекулярной биологии, за критический анализ текста диссертации и автореферата. Автор также благодарен сотрудникам других лабораторий за помощь в выполнении отдельных этапов работы: к.ф-м.н. Лихацкой Г.Н., м.н.с. Гузеву К.В, к.б.н. Черникову О.В., к.х.н. Дмитренку П.С., к.х.н. Анастюку С.Д.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................5

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................................................................7

1.1. Пороформирующие токсины. Классификация......................................................7

1.2. Актинопорины........................................................................................................10

1.2.1. Физико-химические характеристики и структура актинопоринов....................11

1.2.2. Механизм действия актинопоринов........................................................................14

1.2.3. Перспективы изучения механизма действия актинопоринов...............................21

1.2.4. RGD-мотив актинопоринов......................................................................................22

1.3. Связь структуры актинопоринов и функции. Сайт-направленный мутагенез.24

1.4. Мультигенные семейства актинопоринов...........................................................30

1.5. Актинопорин-подобные белки (АПБ).................................................................32

1.6. Фармакологические исследования актинопоринов............................................36

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................40

2.1. Материалы...............................................................................................................40

2.2. Методы.....................................................................................................................40

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................49

3.1. Выделение актинопоринов из актинии Heteractis crispa....................................50

3.2. Клонирование генов актинопоринов....................................................................54

3.3. Филогенетический анализ последовательностей актинопоринов.....................60

3.4. Экспрессия, выделение, функциональная активность рекомбинантных актинопоринов...................................................................................................................64

3.5. Сайт-направленный мутагенез..............................................................................71

3.6. Структурно-функциональный анализ актинопоринов - представителей семейств Hct-A и Hct-S.....................................................................................................73

3.6.1. Компьютерное моделирование рекомбинантного актинопорина rHct-S3..........73

3.6.2. Выяснение функциональной значимости а. о. рекомбинантных актинопоринов при порообразовании............................................................................................................74

3.6.3. In silico исследование комплекса актинопорина с лигандом, фософорилхолином

................................................................................................................................................81

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................................86

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

АПБ - актинопорин-подобный белок

БЛМ - бислойные липидные мембраны

БСА - Бычий сывороточный альбумин

ДСН - додецилсульфат натрия

ИПТГ (IPTG) - изопропил-р-Б-тиогалактозид

МД - молекулярная динамика

п,н. - пары оснований

ПААГ - полиакриламидный гель

ПФТ - пороформирующий токсин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СМ - сфингомиелин

ФХ -фосфатидилхолин

X - холестерин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

АР-1 и NF-кВ ядерные факторы - факторы транскрипции

GST - глутатион трансфераза

IOR С5 - раковый антиген толстого кишечника

IOR-T6 - антиген, экспрессируемый на зрелых Т-лимфоцитах

Р1(4,5)Р2 - фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата

РОС-связывающий сайт - фосфорил холиновый сайт связывания актинопорина с мембраной

RGD-мотив - трипептид (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота)

RMSD (root mean square deviation) - среднеквадратичное отклонение

SRP - поверхностный плазмонный резонанс

ТМ-домен - трансмембранный домен

X-Gal - 5 -бром-4-хлориндолил-(3-Д-галактозид

ВВЕДЕНИЕ

Актинопорины - белковые цитолизины (20 кДа), продуцируемые ядовитыми морскими кишечнополостными актиниями, принадлежат к группе а-пороформирующих токсинов (а-ПФТ) (Parker and Feil, 2005). Огромный интерес исследователей к этим белкам обусловлен наличием у них уникальной пространственной структуры - высоко консервативного фолда р-сэндвича и N-концевой a-спирали, способных претерпевать конформационные перестройки при переходе белка из водорастворимого в мембраносвязанное состояние, в котором он осуществляет свое пороформирующее действие. С мембранолитическим действием связывают широкий спектр биологической активности актинопоринов: противоопухолевой, кардиостимулирующей, дерматонекротической,

антипаразитарной (Turk, 1991). В последние годы а-ПФТ актиний используют для создания на их основе потенциальных фармакологических агентов - химерных молекул, представляющих собой иммуноконьюгаты актинопоринов (либо их фрагментов, например, N-концевого участка) с лигандами (моноклональными антителами, гормонами или факторами роста) (Tejuca et al., 2009). Действие этих конъюгатов направлено на биологические мишени, мембраны опухолевых и паразитарных клеток. а-ПФТ являются незаменимыми инструментами исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических и модельных мембран (Чантурия и др., 1990; Shnyrov et al., 1992; Parker and Feil, 2005). Проявляемые актинопоринами фармакологические эффекты свидетельствуют о том, что эти белки связываются не только с липидными, но и с белковыми компонентами мембран, интегринами, посредством RGD-мотива (трипептида: аргинин-глицин-аспарагиновая кислота), что может быть использовано для получения противоопухолевых агентов нового поколения.

Повышенный интерес к изучению взаимосвязи структуры и функции актинопоринов связан, в первую очередь, с необходимостью более глубокого понимания механизма действия этих мембраноакгивных белков, играющих важное экологическое значение и алломональную роль в морском биоценозе. Дальнейшего изучения требует также феномен мультигенности актинопоринов, обнаруженный недавно у актинии Heteractis magnifica (Wang et al., 2008). В настоящее время

перспективным и актуальным методом исследования является сайт-направленный мутагенез, который позволяет выяснить ключевую роль аминокислотных остатков актинопоринов в функционально значимых участках молекулы, вовлеченных в различные этапы порообразования (N-концевой а-спирализованный фрагмент, фосфорилхолиновый (РОС)-сайт связывания и RGD-мотив).

Целью данной работы было установление структурно-функциональных взаимосвязей представителей мультигенных семейств пороформирующих токсинов актинии Heteractis crispa. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

(1) выделить и идентифицировать нативные актинопорины;

(2) получить нуклеотидные последовательности и установить на их основе аминокислотные последовательности актинопоринов семейств Hct-A и Hct-S;

(3) создать генетические конструкции генов актинопоринов для гетерологичной экспрессии в бактериальной системе и получить рекомбинантные белки;

(4) определить физико-химические характеристики рекомбинантных белков и сравнить их с характеристиками нативных актинопоринов;

(5) выполнить сайт-направленный мутагенез функционально значимого участка молекулы актинопорина - RGD-мотива;

(6) провести структурно-функциональный и филогенетический анализ актинопоринов.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Пороформирующие токсины. Классификация

Взаимодействие живых организмов друг с другом и со средой обитания, а также многочисленные процессы функционирования любой клетки организма, включая биосинтез и секрецию белков, функционирование систем гормонального ответа и сигнальной трансдукции, биоэнергетические процессы и ряд других осуществляются посредством преодоления первичного барьера, которым являются клеточные мембраны. Эти сложные структурные образования ответственны также за защитную и коммуникативную функции, нарушение которых приводит к гибели клетки и/или всего организма. В процессе эволюции большинство организмов (включая человека) приобрело способность вырабатывать соединения белковой природы, которые организм-продуцент использует для защиты от внешних врагов и нападения на другие организмы благодаря способности этих соединений изменять проницаемость мембран клеток-мишеней (Parker and Feil, 2005). Наиболее интересными представителями таких соединений являются пороформирующие токсины (ПФТ), продуцируемые, помимо грамположительных бактерий, морскими кишечнополостными, актиниями. Встраиваясь в мембрану клетки-мишени, ПФТ образуют в ней пору, проницаемую для катионов, воды и небольших органических молекул (Андреева-Ковалевская, 2008). Образование трансмембранных пор в клеточных мембранах мишеней является эффективным путем уничтожения этих клеток.

Огромный интерес исследователей к ПФТ обусловлен их уникальной пространственной структурой, позволяющей им существовать как в водорастворимом, так и в мембраносвязанном состоянии, в которое они переходят благодаря конформационным перестройкам, претерпеваемым ими в присутствии цитоплазматических мембран. Способность ПФТ включаться в гидрофобный кор мембраны и формировать в ней поры, меняя тем самым ее проницаемость, дает возможность использовать эти белки в качестве инструментов исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических и модельных мембран (Чантурия, 1990; Shnyrov et al., 1992).

В соответствии со структурными элементами, включающимися в мембрану и формирующими пору, ПФТ принято классифицировать как а-ПФТ и ß-ПФТ (Рис. 1)

(Lesieur et al., 1997; Gouaux, 1997). Типичными представителями а-ПФТ являются колицины, бактериальные токсины Escherichia coli (Parker et al., 1989), экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa (Allured et al., 1986), инсектицидные 5-эндотоксины Cry типа грамположителыюй бактерии Bacillus thuringiensis (Li, 1991), дифтерийный токсин из Corynebacterium diphtheriae (Choe et al., 1992), апоптотические белки семейства Bcl-2 (Adams and Cory, 2001) и актинопорины из морских кишечнополостных, актиний (Anderluh and Macek, 2002) (рис. 1).

Рис. 1. Ленточные диаграммы ЗЭ-структур некоторых представителей а-ПФТ: (А) колицин la из Е. coli (Wiener et al., 1997), (Б) экзотоксин А из Р. aeruginosa (Allured et al., 1986), (В) Cry инсектицидный б-эндотоксин из В. thuringiensis (Li, 1991), (Г) дифтерийный токсин из С. diphtheriae (Choe et al., 1992), (Д) эквинатоксин II из Actinia equina (Athanasiadis et al., 2001). Темным цветом выделены сх-спирализованные пороформирующие домены (А - Г) и RGD-мотив эквинатоксина II (Д). Структуры получены с помощью компьютерной программы MOLSCRIPT (Kraulis, 1991).

Как правило, а-ПФТ содержат 3 домена: рецепторсвязывающий, энзиматический (ферментный) и трансмембранный (ТМ) (рис. 1, А-Г). Поры, формируемые траисмембранным доменом а-ПФТ, содержат несколько а-спирализованных шпилек (десять у колицинов А и N) (Parker and Feil, 2005), за исключением однодоменных актинопоринов, имеющих одну N-коицевую а-спираль (рис. 1, Д). Установлено, что а-спирализованные шпильки отвечают за начальную стадию проникновения токсина в мембрану по, так называемому, «зонтичному механизму» (рис. 2) (Parker and Feil, 2005).

А

Б

Рис. 2. Схема механизма формирования поры а-ПФТ. (А) «зонтичная» модель: включение ТМ домена колицина А в липидный бислой происходит в результате конформанионной перестройки двух a-спиралей (а8 и а9 - обозначенных на рисунке синим цветом). (Б) модель формирования поры актинопорином: N-концевая ос-спираль (показана синим цветом) претерпевает конформационые изменения, включается в липидный бислой и формирует совместно с липидами мембраны тороидальную пору (Anderluh and Lakey, 2008).

Полипептиды, относящиеся к группе р-ПФТ, состоят, как и большинство а-ПФТ, из нескольких доменов, но, в отличие от последних, при включении ТМ домена в мембрану их две а-спирализованные шпильки меняют конформацию и перестраиваются в (3-тяжи, которые затем образуют олигомерные поры р-баррельного типа (рис. 3).

а б

В

о

щ

Домен2

Домен 4

гробогащекная петля

Рис. 3. (А) механизм формирования пор ß-ПФТ (на примере холестерин-зависимого цитолизина). Четыре а-спирали ТМ домена (показаны синим цветом) ß-ПФТ трансформируются в две ß-шпильки которые встраиваются в липидный бислой. Этот процесс происходит после аггрегации молекул токсина, их олигомеризации и формирования состояния «предпоры» в плоскости мембраны и завершается формированием поры (Anderluh and Lakey, 2008). (Б) ленточная диаграмма перфринголизина О (Rossjohn et al., 1997). Черным цветом отмечены ТМ регионы в домене 3, темно-серым обозначен мембран-связывающий домен. Модель получена с помощью программы MOLSCRIPT (Kraulis, 1991).

ß-ПФ'Г включают аэролизин, который продуцируют три вида грамотрицательных бактерий семейства Aeromonas (Parker et al., 1994), а-гемолизин из Staphylococcus aureus (Song et al., 1996), цитотоксин из Pseudomonas aeruginosa

(Parker and Feil, 2005), защитный антиген сибирской язвы из Bacillus anthracis (Petosa et al., 1997), ряд инсектицидных 6-эндотоксинов из Bacillus thuringiensis (Cyt типа) (Li et al., 1996) и холестерин-зависимые цитолизины, продуцируемые грамположительными бактериями родов Clostridium. Bacillus, Streptococcus, Listeria и Arcanobacterium (Tweten et al., 2001). Характерная для ß-ПФТ высокая стабильность молекулы обеспечивается образованием водородных связей между ß-тяжами. ß-Баррельные поры, формируемые в липидной мембране, стабильны и обладают низкой проводимостью. В отличие от а-пороформирующих токсинов для формирования поры ß-пороформирующими токсинами требуется большее количество мономеров: от 6-8 молекул перфинголизина, стафиллококкового ПФТ до 40 молекул аэролизина и антигена сибирской язвы (Parker and Feil, 2005).

Поры, формируемые амфифильными а-спирализованными N-концевыми фрагментами а-ПФТ, представляют собой очень лабильные тороидальные структуры с внутренней гидрофильной и внешней гидрофобной стороной (Malovrh et al., 2003). Мульти-белковые структуры пор, образуемых в мембране ß-ПФТ, являются чрезвычайно стабильными за счет многочисленных гидрофобных взаимодействий а.о. внешней гидрофобной стороны ТМ доменов с липидным кором мембраны (рис. 4) (Iacovache et al., 2008).

ТЫ домен

Рис. 4. Поры, сформированные в липидной мембране Eqtll (а-ПФТ) (Kristan et al., 2009) и стафилококковым у-гемолизином (ß-ПФТ) (Joubert et al., 2006).

1.2. Актинопорины

Актинопорины - семейство эукариотических а-ПФТ, продуцируемых актиниями (Athanasiadis et al., 2001., Hinds et al., 2002., Mancheno et al., 2003). В отличие от большинства бактериальных трех- и двухдоменных а-ПФТ, актинопорины - небольшие (-20 кДа) однодоменные белки. Установлено, что они совместно с другими токсичными белками и полипептидами, такими как фосфолипазы А2 (40

кДа), нейротоксины (5 кДа), протеиназы (14 кДа), иигибиторы протеиназ (6 кДа) экспрессируются в нематоцистах актиний, специализированных ядовитых органеллах кишечнополостных (Cnidaria), находящихся в щупальцах актинии. Тем не менее, согласно некоторым данным (Meinardi et al., 1995), эти биологически активные белки обнаружены также и в их теле. Предполагают (Basulto et al., 2006), что физиологическая функция актипопоринов - защита от внешних врагов и нападение на жертв, а также участие в процессах пищеварения.

1.2.1. Физико-химические характеристики и структура актипопоринов

К настоящему времени из различных видов актиний выделено и охарактеризовано около трех десятков индивидуальных актипопоринов (Масек, 1992; Wang et al., 2000; Samejima et al., 2000; Jiang et al., 2002; Alegre-Cebollada et al., 2007b; Bellomio et al., 2009; Razpotnik et al., 2009; Monastyrnaya et al., 2010; Uechi et al., 2010; Hu et al., 2011). Полипептидная цепь актинопоринов (молекулярная масса ~20 кДа) содержит (кроме Oulactis актинопоринов) от 175 до 179 а.о. (рис. 5). За исключением кислого актинопорина Srcl из S. rosea (pl 4,7) все известные представители семейства являются основными белками, в аминокислотном составе которых обычно отсутствуют остатки цистеина (Масек, 1992; Anderluh and Масек, 2002; Alegre-Cebollada et al., 2007в). Белки обладают высокой гомологией аминокислотных последовательностей (от 60 до 80%) (рис. 5) и имеют ряд характерных особенностей. Рентгеноструктурным и ЯМР-спектроскопическим анализом эквинатоксина II и стихолизина II установлено (Athanasiadis et al., 2001; Hinds et al., 2002; Mancheño et al., 2003), что N-концевой участок мол�