Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование дофамина как молекулярного инструмента для визуализации и количественной оценки содержания Г-актина в клетках

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование дофамина как молекулярного инструмента для визуализации и количественной оценки содержания Г-актина в клетках"

На правах рукописи

005048382

Парнышкова Екатерина Юрьевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ДОФАМИНА КАК МОЛЕКУЛЯРНОГО ИНСТРУМЕНТА ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ Г-АКТИНА В КЛЕТКАХ

Биофизика 03.01.02

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

1 и ЯНВ 2013

Пущино - 2013

005048382

Работа выполнена в лаборатории ультраструктуры нейрона Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Мотков Дмитрий Алексеевич,

доктор биологических наук

Павлпк Любовь Леоповна

доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович

(зав. лаб. тканевой инженерии ИТЭБ РАН)

доктор биологических наук, профессор Лебедев Олег Евгеньевич

(Санкт-Петербургский государствешшй университет) Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук

Защита диссертации состоится « »_2013 г. в _ на

заседании совета Д 002.093.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук, созданном на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Л

кандидат физико-математических наук Ланина Надежда Федоровна

Актуальность проблемы. Актин существует в клетке в фибриллярном (Ф-) и глобулярном (Г-) состояниях и составляет 5-15% от ее сухого веса (Страйер, 1984). Актин участвует в построении актинового цитоскелета и, тем самым, играет важную роль в выполнении ряда важнейших функций: организации пространственного расположения внутриклеточных структур, взаимодействии клетки с внешней средой, генерации силы, обеспечивающей движение клетки и ее формообразование (Fletcher, Mullins, 2010). Кроме этого, актин служит основой внутриклеточного и межклеточного транспорта и сигнализации, формирования и хранения структурных следов адаптации и памяти (Крутецкая и др., 2003; Павлик, 2004; Корее et al., 2006; Тирас, 2007; Bestman, Cline 2008; Bressloff, Earnshaw 2009). Изменение соотношения Г- и Ф-актина вызывает изменение всех выше приведенных клеточных функций, в том числе и внутриклеточного транспорта (Weisswange et al., 2006). Состояние актина в клетке может изменяться под влиянием эндогенных процессов, сопряженных с действием внешних факторов (Браун, Моженок 1987), поэтому крайне важно выявлять такие изменения. Существенный вклад в исследованиях роли актина в жизнедеятельности клеток занимает микроскопия. Существующие методы, использующие белки и пептиды, меченные флуо-рофорами, пероксидазой, флуоресцирующими белками или коллоидным золотом, оптическую регистрацию двухфотонной микроскопией флуоресценции резонансного переноса энергии между акгиновыми мономерами, позволяют избирательно и раздельно визуализировать Г- и Ф-актин внутри живых и фиксированных клеток и изучать динамику актинового цитоскелета (Moshkov et al., 1980; Tiras et al., 1992; Cao et al., 1993; Shaffer et al., 1998; Hodgson et al, 2000; Reddy 2001; Okamoto, Hayashi, 2006; Anderi, Schmid, 2007; Koestler et al., 2009; Uttamapinant et al., 2010; Riedl et al., 2010; Kiuchi et al., 2011; Du, Ren, 2011; Do vas et al., 2011; Fan et al., 2012; Gunewardene et al., 2012; Thon, Italiano, 2012). К сожалению, из-за непроницаемости плазматической мембраны для меченых конъюгатов, как правило, их приходится инъецировать в клетку или пермеабилизировать ее, нарушая шггактность. Неконтролируемость степени связывания меток с Г-актином не позволяет провести его количественную оценку. Атомно-силовая и электронная микроскопия выявляют субклеточную локализацию только микрофиламенгов, но не Г-актина (Jung et al., 2010; Pavlik, Moshkov, 1992; Павлик и др., 2003). Прямая оценка последнего как субстрата для формирования Ф-актина при функционировании клеток является актуальной нерешенной задачей. Для визуализации и количественной оценки Г-актина, по-видимому, можно использовать дофамин, который, как недавно установлено, прямо проникает в клетку (Павлик и др., 2004; Безгина и др., 2006; Павлик и др., 2008), стехиометрически связывается с Г-актином и превращает его в фила-менты, визуализируемые флуоресцентной и электронной микроскопией (Мошков и др., 2010).

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование возможности использования дофамина для визуализации и количественной оценки содержания Г-актина в клетках различной природы. Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить на примере трансформированных клеток BALB/3T3 и 3T3B-SV40 применимость дофамина для цитохимической визуализации и оценки содержания Г-акгина и выявления его на ультраструкгурном уровне.

Используя те же подходы:

2. Изучить, влияние дофамина и его производного пиримидинтиона in vitro на прикрепляющиеся культуры, па примере рака гортани человека (Нер-2).

3. Изучить действие дофамина in vitro на суспензионные культуры, на примере острой моноцитарной лейкемии человека (ТНР-1 ).

4. Изучить взаимодействие дофамина с клетками в условиях in vivo, на примере асцит-ной карциномы Эрлиха мышей.

Научная новизна. Впервые показано, что флуоресцирующим субстратом в цитозоле клеток, подвергнутых воздействию дофамина в процессе инкубации и затем обработанных по методу Фалька для выявления катехоламинов (изохинолинов), является филаментозный актодо-фаминовый комплекс, наблюдаемый при исследовании в электронном микроскопе в виде

сформированных нитей в локусах, где ранее выявлялись лишь глобулярные структуры. Такие же нити формируются при взаимодействии Г-акгина с дофамином в модельных экспериментах in vitro, причем их диаметр почти на 30% больше, чем у Ф-актина, что соответствует представлению о встраивании дофамина как ингредиента в филаментозный актодофамино-вый комплекс. Об этом же говорят данные по интенсивности флуоресценции таких препаратов, пропорциональной концентрации Г-актина. Впервые установлена закономерная взаимосвязь между дофамин-индуцированной интенсивностью флуоресценции определенных локу-сов цитозоля живых клеток и концентрацией в них Г-актина. Показано, что по интенсивности люминесценции можно прямо судить о количестве Г-актина в них. Показано, что сам по себе Г-актин является слабым звеном в поддержании функционального состояния клетки. Определена концентрация дофамина, практически безвредная для нормальных клеток, но губительная для трансформированных клеток с разной степенью малигнизации или злокачественности. Это может способствовать разработке нового фундаментального подхода к онко-терапии, основанного на использован™ в качестве терапевтической мишени цитозольного Г-актина, стойко повышенная концентрация которого характерна для опухолевых клеток, а в качестве терапевтического средства - проникающее в клетки вещество, например, дофамин или пиримидинтион, полимеризующие Г-актин.

Научно-практическая значимость работы. Проведенное исследование кроме своего фундаментального значения — расшифровки механизма взаимодействия дофамина с клетками-мишенями - имеет ярко выраженный прикладной аспект. В пользу научно-прикладной значимости работы свидетельствует то, что ее результаты расширяют представления об использовании дофамина как проникающего в клетку вещества, полимеризующего актин, как молекулярного инструмента для исследования роли этого цитоскелетного белка в морфофунк-циональной организации живых клеток различной природы. Флуоресцентная визуализация актодофаминового комплекса внутри клеток имеет практическое значение для количественной оценки Г-актина внутри клеток, но также, что немаловажно, может служить диагностическим признаком злокачественности клеток. Дофамин может быть рекомендован для использования в терапевтических целях в медицинской практике как цитостатик для раковых клеток человека, и как средство для лечения злокачественных асцитных опухолей, на что получены соответствующие патенты. Применение препаратов природного происхождения открывает перспективу в медицине не только благодаря их высокой биологической активности и низкой токсичности, но также позволяет видеть в них прототип для создания нового класса веществ схожего механизма действия, но стойких к биодеградации, следовательно, имеющих пролонгированное действие и больший эффект на патологически измененные клетки. Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на XIII-ой Всероссийской научно-технической конференции «Нейроинформатика — 2011» (Москва, 24-28 января 2011 г), 15-й и 16-й Международной Путинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011г и 16-21 апреля 2012г); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 24-26 мая 2011г); на конкурсе У.М.Н.И.К. (1-2 июня 2011), на 7-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 3-13 июня 2011г); на IV Международном молодежном медицинском конгрессе "Санкт-Петербургские научные чте-ния-2011" (Санкт-Петербург, 7-9 декабря 2011); на International Symposium "Biological Motility: Fundamental and Applied Science" (Пущино, 11-15 мая 2012); Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика», 22-24 октября 2012, Пущино. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах, входящих в регламентированный список ВАК, 3 статьи в сборниках работ, 2 патента Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка

литературы. Диссертация изложена на_страницах, содержит_рисунков. Список литературы включает_наименования отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований.

Объектами исследования служили клеточные культуры, культивированные in vitro: минимально трансформированные фибробласты одного происхождения (эмбрион мыши), линии BALB/3T3 и линии B3T3-SV40, зараженные вирусом; злокачественные клетки 2-х видов, прикрепляющиеся (НЕр-2, рак гортани человека) и растущие в суспензии (ТНР-1, острая мо-ноцитарная лейкемия человека), а также клетки перевиваемой опухоли, растущие in vivo (АКЭ, асцитная карцинома Эрлиха мышей).

Изучение взаимодействия Г-актина с дофамином in vitro. Результаты взаимодействия дофамина (концентрацией 3,57х10~3М) с мышечным Г-актином (концентрацией 3,57х10"5М) после суточной инкубации при 4°С визуализировали в электронном микроскопе. Препараты Г-акгина, выделенного по стандартному методу (Pardee, Spudich, 1982) получали в лаборатории структуры и функции мышечных белков (зав. проф., д.б.н. ЗА. Подлубная) ИТЭБ РАН, в буферном растворе, содержащем 2мМ ТРИС, 0,2мМ NaATP, 0,2мМ СаСЬ, меркаптоэтанол и ЮмМ KCl (рН=7,4). Способность Ф-актина деполимеризоваться под влиянием глутамата или цитохалазина В оценивали в аналогичных условиях в том же буфере, содержащем ЮОмМ KCl.

Для негативного контрастирования каплю (5мкл) инкубируемой смеси препаратов наносили на клистронную сеточку-подложку, покрытую пленкой из формвара или пиолоформа, укрепленную углеродным напылением. Через 1 мин избыток жидкости отсасывали фильтровальной бумагой, и на сеточки наносили и тут же удаляли каплю 2% раствора уранилацетата. После высушивания на воздухе сеточки изучали в электронном микроскопе Tesla BS 500 при увеличении 29000х. Диаметр филаментов Ф-актина и актодофаминового комплекса определяли непосредственно на фотонегативах. Их предварительно увеличивали с помощью прибора Микрофот в 17,5 раз. Диаметр нитей, измеренный микрометром по их длине в нескольких местах в мм, с учетом увеличения изображения на негативе, переводили в нм по формуле:

d (нм) = (Д:Мф:29)х1000,

где d - диаметр нити в нм, Д - диаметр нити в мм, Мф - увеличение Микрофота. Культивирование клеток in vitro и оценка их выживаемости. Клетки культивировали в чашках Петри при стандартных условиях в течение одних, двух и трех суток, комплексно исследуя их морфофункциональное состояние после каждого периода. Для предотвращения окисления дофамина в культуральную среду добавляли антиоксидант - метабисульфит натрия (200 мкМ) (Pedrosa, Soares-da-Silva, 2002). Для оценки действия дофамина концентрацией от 10 5 до 10 3М на клетки с разной организацией актинового цитоскелета его вносили в культуру либо одновременно с посевом (до распластывания клеток), либо спустя 5ч после их прикрепления и распластывания. Подсчет клеток в суспензии проводили с помощью камеры Горяева, окрашивая их 0,5% раствором трипанового синего. Выживаемость клеток (В, %) оценивали по соотношению:

B=K2-100/Ki,

где Ki - количество посеянных клеток, Кг - количество клеток после инкубации в контроле или в присутствии ДА. Подсчет выживаемости прикрепившихся к подложке клеток оценивали по морфолог ическим данным, основываясь на состоянии индивидуальных клеток в центре и по краям колоний, а также по плотности (конфлюэнтности) монослоя в нескольких случайно выбранных полях зрения микроскопа. В диссертации приводятся функциональные и структурные данные по влиянию на клетки всех изученных концентраций дофамина и сроков инкубации. В автореферате мы ограничились описанием эффекта наиболее адекватной концентрации дофамина Ю^М.

Культивирование in vivo клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). Эксперименты in vivo проводили на 140 самцах беспородных мышей линии SHK возрастом около 3 месяцев, весом 28 - 36 г. Работа на животных проводилась в соответствии с принятыми мировым научным сообществом этическими нормами. Инокуляцию опухоли производили инъекцией в брюшную полость мыши 10б клеток АКЭ в 0,1 мл физиологического раствора для инфузий. На предварительных стадиях работы использовали физраствор с 200 мкМ метабисульфита, однако впоследствии установили, что добавление метабисульфита никак не влияло на результаты экспериментов, поэтому от него отказались. Величина инокулята была выбрана в предварительных экспериментах с учетом ранее описанной методологии работы с АКЭ (Ин-жеваткин, 2004) и результатов предшествующих опытов in vitro. Выбор концентраций дофамина в инъецируемом растворе рассчитывали так, чтобы количества дофамина внутри брюшины хватало для полного взаимодействия с суммарным количеством Г-актина всех клеток инокулята. При этом исходили из расчета, что этот белок составляет 10% сухого веса клетки, а также, что стехиомегрическое соотношение ДА/Г-актин в актодофаминовом комплексе составляет 100/1 (Мошков и др., 2010). Мышам инъецировали дофамин внутрибрюшинно первый раз через 18 часов после инокуляции опухоли и далее в течение 6 суток 2 раза в день с интервалом между инъекциями 5 час. Контрольным мышам вместо дофамина инъецировали равный объем физраствора. Часть мышей с перевитой опухолью оставляли интакгными до конца эксперимента. По завершении экспериментов мышей забивали методом цервикальной дислокации, извлекали асцитную жидкость, производили подсчет количества клеток с помощью камеры Горяева.

Морфологические исследования культур клеток. Для гистологии и электронной микроскопии клетки отмывали от культуральной среды и обрабатывали по принятому в лаборатории методу совмещения светооптического и ультраструктурного исследования одних и тех же клеток (Мошков, 1985). Клетки фиксировали в смеси 2,5 % глутаральдегида и 4% формальдегида на 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,4) в течение 2ч при комнатной температуре, затем 1ч в 2%-ном растворе четырехокиси осмия на том же буфере, обезвоживали в растворах спиртов возрастающей концентрации, заливали в эпоксидную смолу Эпон-812. В случае распластанных клеток культуры фиксировали в тех же чашках Петри, в которых проводили инкубацию. Распластанные клетки заливали плоскопараллельно и просматривали под световым микроскопом без резки сквозь заливочную смолу и дно чашки. В случае клеток, находящихся в суспензии, их осаждали в пенициллиновых флаконах центрифугированием при 1000 об/мин и фиксировали осадки. В некоторых случаях для морфологического анализа асцит-ных клеток использовали мазки, изготовленные на предметных стеклах, высушенные на воздухе, фиксированные в этаноле и окрашенные по Романовскому. Серийные гистологические 10мкм срезы изготовляли на пирамитоме ЛКБ (Швеция) и без дополнительной окраски изучали под световым микроскопом NU-2E (Карл Цейс, ГДР), оборудованным цифровой камерой Nikon D5100 (Япония). Ультратонкие срезы получали на ультратоме Leica UC6 (Германия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свшща (Гайер, 1974) и исследовали в электронном микроскопе TESLA BS-500 (Брно, Чехословакия) при 90кВ. Цитохимическая визуализация ДА внутри клеток. Клетки, находящиеся в суспензии, осаждали при ЮООоб/мин, однократно отмывали от культуральной среды ресуспендирова-нием в растворе, содержащем 0,9% NaCl, 5мМ HEPES, 5мМ глюкозу, 1мМ СаСЬ, 1мМ MgCl2 и 200мкМ метабисульфита натрия, (рН=7,2). Затем их переносили в тот же буфер, содержащий дофамин в концентрации 10"3М, и инкубировали в течение 30 мин и 5ч в чашках Петри при 37°С в атмосфере 95% Ог и 5% СОг. На дно чашек Петри клали покровное стекло, к нему клетки прикреплялись в процессе инкубации. По окончании инкубации клеток с дофамином неприкрепленные клетки осаждали центрифугированием, и осадок трижды отмывали от дофамина ресуспендированием в чистом буферном растворе. Промытые клетки наносили в виде мазка на предметное стекло и изучали под флуоресцентным микроскопом. Клетки, прикрепившиеся к покровному стеклу, изучали прямо на нем, промыв их трехкратным погружением в буфер. Галоперидол в концентрации 10"5М добавляли в среду инкубации

непосредственно перед внесением дофамина. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные в буферном растворе без ДА. Цитохимическую реакцию на биогенные амины осуществляли по методу Фалька (Falck-Hillarp) (Falck, Ovvman, 1965), для чего полученные мазки или монослои клеток высушивали 2 сут над концентрированной серной кислотой, и нагревали до 80°С над параформальдегидом. Изохшюлины, образовавшиеся в процессе конденсации катехоламинов и паров формальдегида, визуализировали по флуоресценции при 490-500 нм (Я*, = 330, 375нм). Использовали микроскоп AXIO Imager ZI (Carl Zeiss), любезно предоставленный В.А. Яшиным (ИБК РАН).

Деполимеризация актина под действием цитохалазина В или глутамата. Клетки, цито-зольный актин которых предварительно был полимеризован взаимодействием с дофамином, в течении 2 часов инкубировали с глутаматом, деполимеризующим Ф-актин (Безгина и др., 2006), конечная концентрация которого составляла 2 мг/мл, или с цитохалазином В концентрацией 1 мг/мл. Далее клетки готовили к исследованию в мазках, или фиксировали по стандартной методике, обезвоживали, заливали в смолу Эпон и изучали их гистологию и ультраструктуру в срезах как описано выше.

Взаимодействие дофамина с выделенным Г-актином в модельных экспериментах. Взаимодействие дофамина с выделенным мышечным Г-акгином изучали в модельных системах двух разновидностей: на не флуоресцирующем фильтре (структурная модель «плоской клетки») и в полиэлектролитных микрокапсулах, приготовленных по методике (Казакова и др., 2012) (структурная модель «объемной клетки»), В случае модели «плоской клетки» выделенный Г-акгин с известной концентрацией предварительно полимеризовавали взаимодействием с дофамином, взятом в стехиометрическом (1:100) соотношении. Готовый препарат наносили на фильтр в виде капли объёмом 1 мкл. Контролями служили препараты чистого Г-актина, препараты Ф-актина, образованного в ЮОтМ KCl, не обработанного и предварительно обработанного дофамином с последующей отмывкой, и фильтр, на который помещали каплю раствора дофамина. Далее все фильтры с подопытными и контрольными препаратами обрабатывали по методу Фалька (Falck-Hillarp). Для того чтоб унифицировать данные количества и свечения актина, связанных в одной плоскости известного объёма, при съёмке образцы покрывали клистронной сеточкой с размером одной ячейки 150 мкм (структурная модель «плоской клетки»), В случае структурной модели «объемной клетки», представляющей собой полиэлектролитные микрокапсулы, использовали разные случаи: Подопытные образцы были представлены капсулами, наполненными Г-актином, в последующем инкубированные с дофамином. Контролями служили капсулы без актина; капсулы, наполненные Г-актином, пустыми капсулами, обработанными дофамином. Далее подопытные и контрольные образцы обрабатывали по методу Фалька (Falck-Hillarp) для визуализации образовавшихся актодофаминовых комплексов.

Статистические расчеты. Статистическую обработку результатов проводили в программе Microsoft Excel (Microsoft Office 2003). Значимость различий данных определяли при помощи t-теста Стьюдента. Количественные данные представлены значениями среднего арифметического ± ошибка среднего при уровне значимости доверительного интервала 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЛИЯНИЕ ДОФАМИНА НА СОСТОЯНИЕ АКТИНА В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ

Одним из условий исследования воздействия экзогенного дофамина на цитоскелет живой клетки является доказательство специфической и избирательной способности актина изменять свое агрегатное состояние под действием этого катехоламина. Этот вопрос исследовали на минимально (BALB/3T3) и сильно трансформированных (3T3B-SV40) мышиных фиброб-ластах (Камерон, Пул, 1985). Клетки обеих линий отличаются разным стабильным состоянием актина. Это подтверждается также сравнительными исследованиями клеток этих линий и свежевыделенных фибробластов с точки зрения структуры их актинового цитоскелета (Bereiter-Hahn, Munnich, 1998). Основное внимание в работе акцентировали на состояние матрикса клеток (цитозоль), представляющего собой комплекс структурированного актино-

рохроматиновым, перинуклеарное пространство заметно расширяется и просветляется

вого цитоскелета в виде микрофиламентов и пучков нитей и бесструктурной гиалоплазмы, места локализации Г-актина. Изучали также модельные системы, основанные на выделенном Г-актине.

1.1. Ультраструктурное исследование изменения состояния актина под воздействием дофамина в трансформированных клетках ЗТЗ и 3T3B-SV40

Анализ ультраструктуры клеток ЗТЗ в контроле показала, что фибробласты обладают сформированным цитоскелетом, пронизывающим всю строму клетки от поверхности до ядра (рис. 1, а-в).

Он представлен толстым кортикальным слоем, пучками актиновых нитей (стресс-волокнами) и густой сетью разрозненных нитей, заполняющими практически все пространство между плазматической мембраной и ядром. Помимо этого клетки содержат слабо развитый шероховатый эндоплазматический ретикулум (ШЭР), фаголизосомы и лизисные лакуны, массу свободных полисом и малочисленные митохондрии с весьма темным матрик-сом. Ядро имеет округлую форму, гетерохроматиновую структуру и узкое перинуклеарное пространство, заполненное фибриллярным материалом.

После 40 час культивирования клеток в среде, содержащей дофамин концентрацией 10 4 М, их ультраструктура изменяется незначительно. Так же как и в контрольных клетках, ци-тоскелет подопытных фибробластов хорошо выражен и представлен заметными легко идентифицированными актиновыми структурами (рис. \г)\ толстым кортикальным слоем и густой сетью актиновых филаментов из одиночных нитей и из пучков нитей. В цитоплазме структурных отклонений не отмечено. Ядра клеток остаются округлыми, а их матрикс - ге-

Рис. 1. Ультраструктура фибробластов ЗТЗ до и после воздействия ДА. а - обзорный снимок участка поверхности и цитоплазмы контрольной клетки; 6 - участок ядра с прилегающей цитоплазмой; в — участок цитоплазмы непосредственно под поверхностью клетки; г — фибробласты после воздействия ДА; д - увеличенный участок цитоплазмы. Обозначения здесь и далее: пф - пучки филаментов; сф - сеть филаментов; ШЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум; в - фаголизосомная вакуоль: лл - лизисная лакуна; кс - кортикальный слой; м - митохондрия; я - ядро; пп - перинуклеарное пространство; мв - микровилли; кк - клеточный контакт. Масштабная линейка 1 мкм.

Ультраструктура клеток ЗТЗ-ЗУ40 имеет, напротив, вид недифференцированных клеток (рис. 2а), наблюдается практически полное отсутствие развитых хорошо сформированных

выраженных цитоскелетных актиновых структур. Кортикальный слой весьма узкий, кое-где в области непосредственно под плазматической мембраной он структурно не выявляется. В некоторых клетках можно встретить протяженные узкие пучки актиновых филаментов, пересекающие весь цитозоль. По своему строению, длине, ширине и расположению они являются, по-видимому, срезами стресс-волокон, наблюдаемых в этих клетках при флуоресцентно-микроскопическом исследовании (Bereiter-Hahn, Munnich, 1998). Ядра клеток имеют округлую форму, матрикс представлен гетерохроматином, перинуклеарное пространство практически не выражено. Редкие митохондрии имеют, как правило, такой же вид, как у здоровых клеток, в целом же они в срезах плохо идентифицируются.

После инкубации с дофамином, ультраструктура трансформированных клеток 3T3-SV40 сильно изменяется (рис. 26). Заметно уменьшается число рибосом, локусы, прежде занятые ими, занимает густая сеть актиновых филаментов и многочисленные вакуоли (рис. 26). Кортикальный слой расширен, часто прямо под ним формируются пучки актиновых филаментов, следующие параллельно плазматической мембране, тут же появляется сеть филаментов. Пучки филаментов встречаются также в глубине цитоплазмы, здесь они чаще расположены поперек матрикса, иногда упираются в ядро или вдоль ядерной оболочки, как бы окаймляя ядро (рис. 2в). Появляются лизисные лакуны. Гетерохроматиновые ядра клеток в целом сохраняют округлую форму, вместе с тем, в некоторых случаях ядерная оболочка имеет выраженные локальные инвагинации в кариоплазму или же, наоборот, эвагинации в цитоплазму. В обоих случаях становится заметной ассоциация изменений очертаний ядерной оболочки с расположенными в этих областях в непосредственной близости от ядра пучками филаментов

Рис. 2. Ультрасгрукгура трансформированных фибробластов ЗТЗВ-5У40 до и после культивирования с дофамином, а - обзорный снимок клетки в контроле, б - снимок после воздействия ДА. Видно, что вся строма клетки заполнена густой сетью актиновых филаментов; в -участки околоядерной цитоплазмы клеток с продольно расположенными пучками актиновых филаментов. Стрелки показывают раздвоение пучка, одно из ответвлений следует параллельно ядерной оболочке, повторяя ее контур. Масштабная линейка 1 мкм.

1.2. Цитохимическая визуализация ДА внутри клеток ВАЬВ/ЗТЗ и У13Н-Н\ '4() При визуализации изохинолина в клетках после их культивирования в среде, содержащей дофамин, и последующей обработки по Фальку выявлено не исчезающее после тщательной отмывки препаратов многократное усиление флуоресценции цитозоля и кариоплазмы, мест с

наибольшей концентрацией глобулярного актина (рис. 3). Отметим, что в клетках ЗТЗ после обработки ДА цитозоль светится диффузно. Между тем, общеизвестно (Bereiter-Hahn, 1998), что именно у таких клеток в цитоплазме присутствуют мощные стресс-волокна, видимые в люминесцентном микроскопе после окраски их меченым фаллоидином, высокоспецифично взаимодействующим только с Ф-актином. Равномерная окраска цитозоля в нашем случае позволяет предположить, что дофамин не взаимодействует с предсуществующими микрофила-ментами, а встраивается только во вновь формируемые фибриллы.

Рис.3. Клетки ВАЬВ/ЗТЗ (а, б) и сильно трансформированные клетки ЗТЗВ-8У40 (в, г), а, в-контроль; б, г - после инкубации с дофамином [10"3М] в течение 5 ч. Для фотографической яркости снимков интенсивность возбуждающего света снижали со 100% (а, в) до 20% (б) и 2% (г). Окраска по Фальку.

Интенсивность свечения клеток контрольных препаратов, до воздействия дофамином, в целом, была очень низкой и была обусловлена лишь изначально присутствующими эндогенными катехоламинами. При представлении в виде снимка эту интенсивность возбуждающего света в контроле принимали за 100% (рис. За, в). Из-за чрезвычайно высокой интенсивности свечения клеток ВАЬВ/ЗТЗ, подвергнутых действию дофамина для выравнивания ее с контрольным уровнем, интенсивность возбуждающего света приходилось ослаблять до 20% (рис. 36). В то же время для снижения интенсивности свечения трансформированных клеток после инкубации в среде, содержащей дофамин (рис. Зг) требовалось ослаблять её до уровня 2% (в 50 раз).

Степень свечения цитоплазмы клеток, обработанных по методу Фалька, как известно, прямо коррелирует с содержанием в ней катехоламина, в нашем случае, дофамина. А количество дофамина, в свою очередь, обусловлено стехиометрическим содержанием в цитоплазме Г-актина, являющегося его клеточной мишенью (Мошков и др., 2010). Предположено, что флуоресцирующим субстратом в цитозоле являются филаменгозный актодофамино-вый комплекс, наблюдаемый ультраструктурно, и что по интенсивности флуоресценции можно прямо судить о количественном содержании актина в образце. Это предположение проверили в модельных экспериментах.

2. ВЛИЯНИЕ ДОФАМИНА НА СОСТОЯНИЕ ВЫДЕЛЕННОЕО Г-АКТИНА 2.1. Ультраструктура препаратов актина.

Анализ электронно-микроскопических данных показывает, что дофамин при совместной инкубации с выделенным мышечным Г-актином вызывает его полимеризацию уже после ЗОмин инкубации, в то время как в контроле актин сохраняет свое глобулярное состояние в течение 4ч и более (рис. 4а).

Электронно-микроскопическое исследование препаратов Ф-актина и актодофаминового комплекса показывает, что первый представляет собой классические полимерные прямолинейные в своей массе нити с равномерной толщиной 7,0 ± 0,2 им (р<0,05) и гладкой поверхностью (рис. 46). Второй тоже представлен нитями, имеющими в своей массе выраженную извилистость и толщину 9,0±0,3 нм (р<0,05), неравномерную за счет заметной шероховатости поверхности (рис. 4в). Единственным объяснением такой морфологии нитей является предположение, что она обусловлена наличием встроенных в актиновый полимер множества молекул дофамина.

1 2.2. Визуализация актодофаминового комплекса

Для визуализации актодофаминового комплекса использовали структурную модель «объемной клетки», полиэлектролитные капсулы с предварительно заключенным в них Г-актином, а также структурную модель «плоской клетки», каплю актина известной концентрации на не флуоресцирующем фильтре, накрытой сеточкой с круглыми 150 мкм перфорациями.

При флуоресцентно-микроскопическом исследовании моделей выявлено, что у контрольных капсул светятся только оболочки (рис. 5а,б), а у содержащих актодофаминовый комплекс заметно окрашена сердцевина (рис. 5в).

Рис. 5. Флуоресцентно-микроскопическая визуализация актодофаминового комплекса в полиэлектролитных микрокапсулах, а, 6 — контрольные пустые капсулы, обработанные дофамином (б), и капсулы с Г-актином (а); в - капсулы с Г-актином, обработанные дофамином. Отчётливо видно заполненная и пустая капсулы; г-д - ультраструктура микрокапсул пустой (г) и с актодофаминовым комплексом (д). Масштабная линейка: (а-в) 5 мкм; (г-д) 1 мкм.

При флуоресцентно-микроскопическом исследовании структурной модели «плоской клетки» контрольный препарат Г-актина не светился (рис. 6а), а интенсивность окраски актодофаминового комплекса была значительной (рис. 66) и изменялась пропорционально концентрации Г-актина (рис. 6в).

(а) (б) (в)

Рис. 6. Флуоресцентно-микроскопическая визуализация актодофаминового комплекса на фильтре, а - участок капли Г-актина, прикрытый сеткой с ячейками (контроль); б - такой же участок капли актодофаминового комплекса, видимый через ячейки; в — интенсивность флуоресценции в у.е. актодофаминового комплекса концентрацией 2,3 мкг/мкл, 1,15 мкг/мкл и 0,23 мкг/мкл (3-й, 4-й и 5-й столбики, соответственно). 1 -й и 2-й столбики - контроль.

Рис. 4. Ультрасгруктура Г-актина (а), Ф-актина (б), актодофаминового комплекса (в) и Г-актин после 1,5ч взаимодействия с пиримидинтионом (г). Негативное контрастирование. Масштабная линейка: 0,5 мкм (а); 0,1 мкм (б-г).

2.3. Подсчёт количества Г-актина Подсчет количества Г-актина в образце, соответствующего его диффузному свечению, исходя из его концентрации в растворе, площади растекшейся капли, площади отверстий в сетке, молекулярной масса актина (42000Да), показал, что на площади диаметром 150 мкм содержится около 1,1х10"6 мкМ Г-актина. Очевидно, учитывая полученные комплексные данные, по светимости цитозоля клеток возможно оценить содержание в них Г-актина в мкМ, которое, как известно, прямо коррелирует с содержанием в ней дофамина.

Наши эксперименты дают возможность увидеть минимальную чувствительность метода визуализации Г-акгана с помощью дофамина, которая составляет около 1 мкг/мкл на площади диаметром 1мм, или 2,7х10"5 мкМ. В отверстии диаметром 150 мкм она составляет около 5x10"7 мкМ, что ниже той, которая по предположениям присутствует в живой клетке [100 мкМ] (Kiuchi, 2011). Максимальную чувствительность метода, возможно, удастся определить в последующем, используя соответствующие концентрации Г-акгина. На основании модельных экспериментов, ультрасгруктурных данных и люминесценции можно сделать вывод, что флуоресцирующим субстратом в клетке являются актодофаминовые нити, образующиеся в цитозоле. Существенно, что предсуществующие Ф-актиновые пучки (стресс-волокна) не метятся. Не флуоресцировал также Г-акгин, и натуральный Ф-актин, затем обработанный дофамином. Можно однозначно говорить о том, что дофамин является специфическим веществом, связывающимся с Г-актином. На этом этапе наших исследований можно утверждать, что дофамин полимеризует и визуализирует АТФ-Г-актин (Koestler, 2009), поскольку именно этот комплекс образуется в модельных экспериментах с выделенным Г-актином и по данным ВЭЖХ содержит АТФ (Мошков и др., 2010). Влияет ли дофамин так же на АТФ-Г-актин в комплексе с тимозином-|34, тоже способный полимеризоваться, и на не полимеризующийся АДФ-Г-актин в комплексе с кофилином (Kiuchi, 2011), нужны будут специальные эксперименты, проведение которых не входило в задачу нашей работы.

3. ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ КЛЕТОК РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОСТИ ПРИ ДЕЙСТВИИ ДОФАМИНА

Учитывая способность дофамина взаимодействовать с Г- актином и полимеризовать его in vitro и in situ, можно предположить, что с помощью дофамина можно вмешиваться в состояние цитозольного актина и направленно изменять структуру акгинового цитоскелета, тем самым исследовать роль Г-актина в функции клетки. Такое вмешательство особенно актуально при исследовании опухолевых клеток. В их цитозоле пропорция Г-акгина существенно и необратимо возрастает (Pawlak, Helfman, 2001). Повышение его содержания увеличивает пластичность злокачественных клеток, с чем связывают способность к метастазиро-ванию (Katira et al., 2012). Исследованию этого вопроса посвящен следующий раздел работы.

3.1 Влияние дофамина на жизнеспособность и морфологию прикрепляющихся и суспензионных культур Анализ выживаемости клеточных культур ЗТЗ и 3T3-SV40, существенно различающихся состоянием актинового цитоскелета (Bereiter-Hahn, Munnich, 1998), при действии дофамина концентрацией 1 (Г'М, показывает, что у нормальных ЗТЗ клеток, имеющих дифференцированный акгиновый цитоскелет, она практически не изменяется. В то же время дофамин проявляет заметную цитотоксичность при взаимодействии со слабо опухолеобразующими клетками 3T3-SV40, снижая ее на 44% (рис. 7). Напомним, что цитоскелет этих клеток развит слабо. Ранее было показано, что похожие на клетки ЗТЗ прикрепившиеся фибробластопо-добные клетки ВНК-21 под действием дофамина такой же концентрации тоже практически не снижали жизнеспособности, однако у этих же клеток в суспензии при добавлении дофамина она снижалась на 37% (Мошков и др., 2010). Это значение близко к тому, которое наблюдается у клеток 3T3-SV40. Вместе со схожестью эффекта на разные по происхождению прикрепившиеся фибробласты (ЗТЗ и ВНК-21) эти данные свидетельствует о том, что пропорции Г-актина в цитозоле суспендированных нормальных фибробластах ВНК-21 и при-

крепившихся трансформированных слабо опухолеобразующих фибробластов 3T3-SV40 в принципе одинаковы.

lii

I

200 180 160 140 120 i 00 80 60 40 20

(б)

| ¡ Контроль

i Пирнмндннтнон

3T3-SV40 НЕр-2

Рис. 7. Влияние дофамина на выживаемость культур клеток, а - клеточные культуры разной степени малигнизации; б - асцитная карцинома Эрлиха.

Изучение жизнеспособности злокачественных культивированных клеток в контроле и после аналогичного воздействия дофамина показало, что у клеток НЕр-2, растущих на субстрате, она составила 12%, а у растущих в суспензии клеток ТНР-1 - всего 9% от 100% контрольного уровня, соответственно. Особо отметим, что пиримидинтион, синтетический аналог дофамина также, хотя и слабее, губителен для клеток. Изучение жизнеспособности перевиваемых раковых клеток в условиях in vivo (клеток АКЭ), подвергнутых действию дофамина, показало, что она составила всего 4% (рис. 7).

Таким образом, наблюдается зависимость между степенью злокачественности культивируемых клеток и негативным действием на них дофамина. Отмеченные различия в чувствительности клеток к дофамину, возможно, объясняются разной пропорцией в них Г-акгина. Эти данные позволяют предположить, что увеличение содержания Г-актина в цитозоле повышает чувствительность клеток к дофамину. Это подтверждают наши последующие гистологические исследования.

Данные гистологии выявили корреляцию между выживаемостью клеток и их морфологическим состоянием после воздействия дофамина. Было показано, что с увеличением злокачественности клеток усиливается их повреждение, вызванное дофамином (рис. 8).

Рис. 8. Гистологическая структура клеток до и после воздействия дофамина, а, в, д - контрольные клетки НЕр-2 (а), ТНР-1 (в), АКЭ (д); б, г, е - те же клетки после действия дофамина. Масштабная линейка: а, б, д 20 мкм; в, г, е 10 мкм.

Эффект дофамина выражается в нарушении целостности монослоя, в сильном искажении индивидуальной морфологии клеток. Они гипертрофировались в результате слияния нескольких клеток, имели протяженные многочисленные выросты, направленные в сторону просветов, в зависимости от степени малигнизации клеток заметно усиливается вакуолизация цитоплазмы и пикноз ядер, существенно уменьшался размер клеток.

Прямым доказательством вовлечения Г-актина в цитотоксическое действие дофамина могут служить данные по изменениям размеров клеток, растущих в суспензии (ТНР-1 и АКЭ), сделанные по мазкам и гистологическим срезам. Выявлено, что их диаметр после действия дофамина уменьшается на 25 и 35%, | | Контроль соответственно (рис. 9), но после обработки

- Дофамин цитохалазином или глутаматом восстанав-

- Глутамат ливается практически до контрольного значения (клетки АКЭ), свидетельствуя, что уменьшение размера клеток вызвано полимеризацией цитозольного Г-актина дофамином. Эти данные согласуются с представлением о прямой связи объема клеток со степенью полимеризации цитозольного актина и формированием Ф-актинового ци-тоскелета (Реёегееп, 2001).

АКЭ

ТНР-1

Рис. 9. Размеры растущих в суспензии

раковых клеток до и после воздействия дофамина.

3.2. Ультраструктура злокачественных клеток до и после воздействия дофамина Главным отличительным признаком нормальных и злокачественных клеток в культуре является состояние их актинового цитоскелета. В нормальных прикрепившихся клетках полимерная форма актина (Ф-актин) распределена главным образом в виде тонкого слоя по всему периметру клетки под плазматической мембраной (в кортикальном слое) (Ujihara et al., 2008), а также в микроворсинках, в межклеточных десмосомоподобных контактах (ДПК) и в фокальных контактах клетки - матрикс (Gloushankova, 1998). Кроме того, в глубине цитоплазмы он образует пересекающие цитоплазму пучки, так называемые стресс-фибриллы (Lazarides, 1975; Barak et al., 1980). Следует иметь в виду, что для поддержания динамического равновесия в локусах, обогащенных Ф-актином, определенная доля приходится на Г-актин. Основная масса Г-актина (олигомерная форма актина) в основном расположена в ци-тозоле (dos Remedios et al., 2003) и ультраструктурно не идентифицируется. Поэтому при исследовании структурных изменений в клетках под воздействием дофамина мы особое внимание уделяли состоянию ДПК, микроворсинок, кортикального слоя и глубинной цитоплазмы, содержащей элементы актинового цитоскелета.

3.2.1. Исследование ультраструктуры раковых клеток НЕр-2 in vitro Электронно-микроскопическое изучение клеток рака гортани человек НЕр-2 (растущих в прикрепившемся состоянии в монослое) в контроле и опыте выявило, что клетки в норме довольно далеко отстоят друг от друга, отделенные широкими просветами, соединяясь в монослой с помощью немногочисленных и коротких десмосомоподобных контактов (рис. 10а). Типичны многочисленные просветы цитоплазмы разной ширины, что заметно и на гистологическом уровне. В целом, опухолевые клетки выглядят жизнеспособными, неповрежденными, имеют обычную для них морфологию, характеризующуюся узким кортикальным слоем, построенным из актиновых филаментов, и практически полным отсутствием цитоскелет-ных фибрилл в толще цитоплазмы.

Действие дофамина приводит к заметному повреждению тонкой структуры опухолевых клеток. Обращает внимание появление характерных муаровых узоров в цитоплазме и обширных просветов в виде лакун лизисного происхождения, захватывающих цитоплазматиче-ский и ядерный матрикс, имеющих прямое отношение к переходу Г-актина в Ф-актин под влиянием дофамина (Шубина и др., 2009). Митохондрии выглядят не поврежденными. В цитоплазме появляются многочисленные хаотически направленные микрофиламенты, иногда они собираются в пучки, частично ассоциированные с лакунами (рис. 106).

Рис. 10. Ультраструктура раковых клеток НЕр-2 после 3-суточной инкубации с дофамином в концентрации 2x10-4 М. а — контрольная клетка, часть поверхности с десмосомоподобным контактом (ДПК) и кортикальным слоем (КС); М — митохондрия; 6-д — клетки, подвергнутые действию дофамина; б — участок цитозоля в глубине клетки при большем увеличении, видны многочисленные актиновые филаменты (АФ), ассоциированные с лакунами; в - увеличенный фрагмент нитей; г — повреждения контактов двух соседних клеток со слиянием смежных микроворсинок (MB); д - шунтирование двух клеток через плазмолеммы актино-вым мостиком (d = 9 нм). Масштабная линейка: 1 мкм (а), 0,5 мкм (б-г), 0,1 мкм (е).

Кортикальный слой таких клеток значительно расширяется благодаря появлению дополнительных рыхло расположенных актиновых филаментов, следующих вдоль плазматической мембраны или вглубь цитоплазмы и иногда перфорирующих плазматическую мембрану. Размер десмосомоподобных контактов заметно не изменялся, однако выявлены многочисленные случаи локального слияния цитоплазмы двух соседних клеток вблизи от таких специализированных контактов. В качестве других примеров укажем полное слияние микроворсинок, принадлежащих двум разным клеткам (рис. Юг), а также шунтирование смежных микровыростов актиновым мостиком, пронизывающим поверхностные мембраны и следующим затем вглубь цитоплазмы (рис. 10d).

3.2.2. Исследованиеулыпраструктуры раковых клеток ТНР-1 in vitro

Электронно-микроскопическое изучение клеток лейкемии ТНР-1, растущих в суспензии, показало, что в отличие от прикрепляющихся клеток, свободноживущие клетки имеют ещё менее развитый цитоскелет. Кортикальный слой у них узкий, отсутствуют стресс-волокна и слабо развита сеть филаментов в цитозоле. Результаты электронно-микроскопических исследований (рис. 11) показывают, что в контрольных клетках поверхность по всему периметру,

но не однородно, покрыта клазматозными выростами и узкими короткими микроворсинками

Рис. 11. Ультраструктура лейкемических клеток до и после суточной инкубации с ДА.

а —часть контрольной клетки, обзорный снимок, включающий поверхность, цитозоль и ядро; в - участок околоядерной зоны; г - часть клетки после воздействия дофамина концентрацией 10"4 М, обзорный снимок, включающий поверхность, цитозоль и ядро; д - участок поверхности с инвагинацией, перемкнутой актиновым мостиком (ё=9 нм); е - участок поверхности с группой митохондрий вблизи апоптозного тельца. Обозначения мв - микровилли, пф - пучки актиновых филаментов, сф - сеть актиновых филаментов, м — митохондрии, ц — цитоплазма, я - ядро, ат - апоптозное тельце. Масштабная линейка на а, д, е:\ мкм; на 6, в, г\ 0,5 мкм.

Сразу под плазматической мембраной располагается еле различимый узкий кортикальный слой, развитый неравномерно, в виде островков, между которыми цитозоль выходит непосредственно к мембране. Изредка под мембраной встречаются фагоцитозные вакуоли небольшого размера. Остальную часть цитоплазмы занимают немногочисленные митохондрии с конденсированным матриксом, редкие фрагменты одиночных цистерн шероховатого рети-кулума и свободно лежащие рибосомы.

Изучение раковых клеток ТНР-1, подвергнутых воздействию дофамина, показало, что в ультраструктуре наблюдаются характерные повреждения, связанные специфическим эффектом дофамина. В первую очередь отметим сглаживание поверхности клеток за счет почти полного исчезновения клазматозных пузырей, прореживание рибосом, появление мелких фа-гоцитозных вакуолей и встречающиеся в инвагинациях на поверхности актиновые мостики (рис. 11д), перемыкающие два смежных участка плазматической мембраны. Ультраструктура митохондрий не нарушается. Основным отличием таких клеток от контрольных является возникновение повсеместно (рис. 11 г) в локусах, не занятых органоидами, заметной сети, а

иногда и небольших пучков актиновых нитей. Митохондриальный матрикс, в целом остающийся конденсированным, вакуолизируется. Ядра становятся типично гетерохроматиновыми.

Следует отметить ультраструктурную особенность клеток ТНР-1 при воздействии дофамина. В некоторых из них, особенно если проследить за их состоянием в более отдаленные сроки или оценить реакцию на дофамин более высоких концентраций, ядра распадаются на апоптозные тела (рис. 11 е), довольно часто ядра отсутствуют при морфологической сохранности органоидов, в частности митохондрий, сохраняющих интактную структуру. Эти наблюдения позволяют предположить, что гибель клеток наступает как из-за возможного нарушения транспорта и проницаемости мембран, вызванных принудительной полимеризацией актина, так и за счёт апоптоза.

Разная ориентация органоидов клетки в суспензии по сравнению с клеткой, прикрепившейся к субстрат}', затрудняет визуализацию компонентов цитоскелета в электронном микроскопе. Тем не менее, и в случае с ТНР-1 видно, что главным структурным признаком действия ДА является появление сети актиновых филаментов в цитозоле, как и в распластанных культивированных фибробластоподобных и раковых клетках НЕр-2. Новым представляется факт появления пучков нитей в кариоплазме, искажающих форму ядра, приобретающих ярко выраженные угловатые очертания, типичные для вызванной дофамином полимеризации Г-актина, заключенного внутри липосом (Павлик, 2008). Появление отмеченных морфологических изменений коррелирует с выявлением апоптозных тел в фазе резкой гибели клеток, что может свидетельствовать о причинно следственной связи этих явлений, внутриядерной полимеризации актина и апоптозом клеток.

3.2.3. Исследование ультраструктуры раковых клеток АКЭ in vivo

В экспериментах in vivo на асцитной карциноме Эрлиха (АКЭ) также прослеживались общие выше описанные признаки после воздействия дофамина. Результаты ультраструктурных исследований клеток асцита показывают (рис 12), что в интактном контроле (рис. 12а) они имеют вид типичных клеток, живущих в суспензии и не способных формировать конгломераты.

Поверхность округлых или имеющих угловатую форму клеток опухоли по всему периметру покрыта частично деформированными узкими и короткими микроворсинками. Сразу под плазматической мембраной располагается узкий кортикальный слой, представляющий собой скопление множества актиновых нитей, расположенных параллельно поверхности. Кортикальный слой развит неравномерно, чаще в виде островков, между которыми цитозоль выходит непосредственно к мембране. Изредка под мембраной встречаются фагоцитозные вакуоли небольшого размера. Остальную часть цитоплазмы занимают многочисленные митохондрии ортодоксальной конформации, одиночные цистерны шероховатого ретикулума и свободно лежащие рибосомы, густо расположенные между плазматической мембраной и ядром. Характерной особенностью цитоплазмы клеток АКЭ является наличие аденогранул (липидных капель), рудиментарного признака секретируемого эпителия молочной железы, из которых произошел этот тип раковых клеток. Они служили нам идентификационным признаком опухолевых клеток. Другой особенностью интактных клеток АКЭ был их угловатый контур (рис. 126). Ядра интактных клеток АКЭ имеют ярко выраженную гетерохроматиновую структуру и, как правило, содержат весьма крупные ядрышки. Клетки из асцита мышей из групп «солевого» контроля ультраструктурно почти полностью идентичны интактным клеткам АКЭ. Цитоплазма некоторых клеток под действием инъекций физиологического раствора претерпевает сильную вакуольную дистрофию. На ее фоне элементы цитоскелета, за исключением актиновых нитей под мембраной практически полностью отсутствуют (рис. 12в). Другие органоиды, в частности митохондрии, имеют относительную сохранность.

Рис. 12. Влияние ДА на ультраструктуру клеток АКЭ. а - в - вид опухолевых клеток из асцита интактных (а, 6) и контрольных (в) мышей в ультратонких срезах, г — д — вид опухолевых клеток после воздействия ДА концентрацией 10"1М. Наблюдаются значительные изменения структуры поверхности (г), заполнение всего пространства между плазматической мембраной и ядерной оболочкой сетью актиновых филаментов (г), возникновение грибовидных микровиллей (е). Обозначения: МВ - микровилли, Ц - цитозоль, Я - ядро, М - митохондрия, ЖК - жировая капля (аденогранула), КС - кортикальный слой, У - угловатость, ФВ -фагоцитарная вакуоль.

Иную картину наблюдали при изучении клеток АКЭ, подвергаемых периодическим воздействиям дофамина. В первую очередь их отличает состояние микровиллей. Они становятся существенно шире и длиннее, внутри них часто можно видеть крупные вакуоли, свидетельствующие о возросшей фагоцитарной активности клеток (рис. 12г), или же микровилли при-

обретают грибовидную форму (рис. \2д). Иногда несколько фагоцитарных вакуолей располагаются друг под другом и вдаются глубоко вглубь цитоплазмы. Изменяется и кортикальный слой, он становится гораздо толще, чем в контроле. Митохондрии приобретают конденсированный вид, цистерны гранулярного ретикулума представлены редкими короткими фрагментами, но рибосомы большей частью исчезают и цитозоль существенно просветляется. На этом фоне становится отчетливо видно, что вся толща цитоплазмы от плазматической мембраны до ядерной оболочки заполнена густой сетью актиновых нитей (рис 12г,д).

Следует отметить сходство реакции асцитных клеток на воздействие дофамина и лейке-мических клеток. В части клеток встречаются апоптозные тела вместо ядер, свидетельствующие о повышенной гибели клеток по апоптозному типу.

Проведя анализ ультраструктурных данных исследуемых злокачественных культур, очевидно, что мишенью действия дофамина является Г-актин, локализованный в субкортикальном слое, ДПК и в глубине цитоплазмы, который после взаимодействия с дофамином приобретает вид пучков и сети актиновых нитей, отсутствующих в контроле.

3.2.4. Визуализация актодофаминового комплекса в злокачественных клетках различного типа

Исследуя ультраструктуру, трудно прямо утверждать, что вновь образовавшиеся актино-вые нити являются результатом воздействия дофамина, однако сделать именно такой вывод позволяют эксперименты по выявлению этого биогенного амина в цитозоле клеток с помощью флуоресцентной микроскопии, используя для визуализации метод Фалька (Ра1ск, 0\¥тап, 1965). Установлено, что в клетках в процессе их культивирования в среде, содержащей дофамин, многократно усиливается флуоресценция цитозоля в локусах с наибольшей концентрацией Г-актина. Обращает внимание, что интенсивность флуоресценции у клеток с разным функциональным статусом различается (рис. 13), но во всех случаях гораздо выше, чем у контрольных клеток, не подвергнутых действию дофамина.

_ _ г д _ _

а 6 в е ж

Рис. 13. Флуоресцентно-микроскопические снимки клеток разной степени малигнизации, до (а, г, е) и после (в, д, ж) воздействия дофамином и (б) инкубации с галоперидолом обработанных по Фальку, а, б, в — НЕр-2; г, д - ТНР-1; е, ж - АКЭ. Масштабная линейка: (г, д) 10 мкм; (а, б, в, е, ж) 20 мкм.

Видно, что проведённые воздействия не повреждали морфологии клеток, которая остается полностью идентичной интактным клеткам, обработанным обычными гистологическими методами. В отличие от клеток НЕр-2, прикрепившихся к поверхности субстрата (рис. 1 За), и асцита (рис. 13е) суспензионная культура ТНР-1 в контроле обладает небольшой выраженной собственной флуоресценцией. По-видимому, она обусловлена присутствием каких-то собственных эндогенных катехоламинов (рис. 13г). В то же время инкубация клеток всех представленных культур в течение 5ч в среде, содержащей дофамин, приводит к значительному повышению интенсивности их флуоресценции. Сильное свечение цитоплазмы суспензионных и прикрепившихся клеток свидетельствует о присутствии значительного количества дофамина, который, безусловно, проник внутрь клеток в процессе инкубации из буферного раствора. Разную интенсивность окраски культур можно объяснить разным содержанием Г-актина в клетках вне зависимости от их злокачественности. Малая светимость свидетельствует о меньшем содержании Г-актина.

Для проверки того, что дофамин проходит сквозь мембрану, минуя дофаминовые рецепторы, проводилась их блокада галоперидолом. Такая обработка не приводила к заметным морфологическим изменениям по сравнению с контролем. Блокада рецепторов не препятствует усилению интенсивности флуоресценции, индуцированному присутствием в среде инкубации дофамина, и приводит к росту интенсивности свечения по всему объему клеток, показывающему высокое содержание дофамина в цитоплазме и ядрах. Однако в препаратах клеток, подвергнутых действию одного галоперидола, заметная люминесценция выявлена исключительно на периферии клеток (рис 136), в полном соответствии с представлением о блокаде им дофаминовых рецепторов, расположенных на плазматической мембране, благодаря лигандным взаимодействиям.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, результаты показывают, что при взаимодействии с живыми малигнизи-рованными клетками дофамин проявляет цитотоксический эффект, подтверждаемый гистологическими и ультраструктурными данными. Этот эффект связан с появлением в цитозоле сети волокон, по структуре, диаметру и по сопутствующим модельным экспериментам идентифицированных как актиновые нити, являющихся, по-видимому, субстратом люминесценции. Отмечена взаимосвязь высокой смертности клеток с появлением аномального количества акгиновых филаменгов. Учитывая данные о способности дофамина прямо полимеризовать актин и интегрироваться с актиновыми филаментами, можно предположить, что механизм цитотоксичности связан с индуцированной полимеризацией молекул актина внутри клеток. Все это свидетельствует в пользу того, что цитозольный Г-актин является важным звеном в поддержании функционального состояния клетки, особенно, злокачественных клеток. Индуцированный перевод его в полимерное состояние тем губительнее для клетки, чем более она малигнизирована. Поэтому можно предположить, что Г-актин представляет собой терапевтическую мишень, воздействие на которую с помощью, например, дофамина или пирими-динтиона, можно снижать жизнеспособность или вызывать гибель таких клеток, не затрагивая при этом здоровые клетки.

Проблема регуляции актинового цитоскелета в распространяющихся раковых клетках является одной из самых главных и обсуждаемых в современной онкологии (Olson, Sahai, 2009). По мнению авторов в настоящее временя растет число известных молекул, которые способствуют полимеризации актина, но фактически только два регулятора, ARP2/3 и кофи-лин, интенсивно изучаются на раковых моделях. Заманчивым считается исследование гомологов формина и других нуклеаторов актина, таких как spire и cordon bleu, в миграции раковых клеток. В этом плане дофамин является новым претендентом на роль молекулярного инструмента - промотора полимеризации актина для исследования его значения в регуляции функции опухолей, в раковой биологии в целом. Во-первых, сам дофамин является проникающим полимеризующим внутриклеточный актин веществом, которое можно использовать для исследования роли актина в клетках. Во-вторых, его можно рассматривать как прототип нового класса противоопухолевых соединений и диагностических средств, прямо воздействующих на Г-акгин клеток. Использование дофамина (или созданных на его основе препаратов) в последнем качестве обещает быть не только эффективным, но и избирательным. Это связано с преимущественной чувствительностью к нему только первичных малигнизирован-ных клеток, богатых глобулярным актином. В целом, дофамин можно рассматривать как вещество, обладающим полимеризующим актин механизмом действия. В этом он близок к уже известным веществам с такими же свойствами, бициклогептапептиду фаплоидину и цикло-депсипептиду джасплакинолиду (Виланд, 1978; Holzinger, 2001).

Вместе с тем, он существенно отличается от них. Фаллоидин сам по себе и меченный флуоресцентным красителем в клетку не проникает, его инъецируют (Cooper, 1987). Джасп-лакинолид, кстати, используемый и как противоопухолевый препарат (Takeuchi, 1998), метиться не способен, из-за чего работать с ним приходится вслепую, проникает он в клетку только после растворения в спирте или диметилсульфоксиде и проявляет неоднозначный,

часто противоположный эффект на внутриклеточный актин, что ограничивает его применение (Bubb, 2000; Ou, 2002). Дофамин же легко проникает в клетку, проявляет одинаковые свойства in vitro и in vivo и прямо визуализируется в клетке, что делает его перспективным для исследований в клеточной биологии.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что дофамин вызывает полимеризацию мономерного актина в условиях in vitro, при этом диаметр нитей актодофаминового комплекса увеличивается на треть по сравнению с естественным Ф-актином, и препарат становится флуоресцирующим.

2. Определено, что дофамин вызывает патологическую полимеризацию цитозольного актина, нарушая морфофункциональную организацию клеток.

3. Показано, что содержание Г-актина не коррелирует со степенью злокачественности клеток, но сам по себе Г-актин является слабым звеном в поддержании функционального состояния клетки.

4. Цитохимическая визуализация методом Фалька катехоламинов в клетках после воздействия дофамина выявила многократное усиление интенсивности флуоресценции их цитозоля. Установлено, что субстратом флуоресценции являются вновь образованные нити актодофаминового комплекса. В связи со стехиометрическим соотношением дофамин/актин в актодофаминовом комплексе, интенсивность его флуоресценции указывает на содержание Г-актина в цитозоле.

5. Полученные результаты действия дофамина на клетки в разных состояниях показывают, что он обладает цитотоксической активностью. Определено, что дофамин в концентрации 10-4 М способен вызывать in vitro и in vivo гибель клеток разной природы.

Список публикаций по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах

1. Мошков Д.А., Павлик JI.J1., Шубина B.C., Парнышкова Е.Ю., Михеева И.Б. Цитоскелет-иая регуляция клеточной функции дофамином // Биофизика. 2010. Т. 55, № 5. С.: 850 -856.

2. Парнышкова Е.Ю., В.П. Лавровская, E.H. Безгина, Л.Л. Павлик, Э.И. Лежнев, Д А. Мошков. Морфологические основы влияния дофамина на жизнеспособность опухолевых клеток НЕр-2 // Морфология. 2011. Т. 140, № 6. С.: 69 - 74.

3. Парнышкова Е.Ю., Лавровская В.П., Л.Л. Павлик, Э.И. Лежнев, Д А. Мошков. Цитохимическая визуализация дофамина как способ оценки содержания глобулярного актина в цитозоле живых клеток//Биологические мембраны. 2012. Т. 29, № 3. С.: 209-214.

4. Парнышкова Е.Ю., Безгина E.H., Казакова Л И., Вихлянцев И.М., Тирас Н.Р., Павлик Л.Л., Мошков Д.А. Дофамин как возможное вещество для онкотерапии и для количественной оценки цитозольного Г-акгина // Биофизика. 2012. Т. 57, № 5. С.: 796 - 804.

5. Мошков Д.А., Романченко С П., Парнышкова Е.Ю., E.H. Безгина, Заичкина С И., Павлик Л.Л. Эффект дофамина на клетки асцитной карциномы Эрлиха // Бюллетень Экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т. 154, № 12. С.: 646 - 651.

6. Парнышкова Е.Ю., Безгина E.H., Лавровская В.П., Павлик Л.Л., Лежнев Э.И., Мошков Д.А. Морфологические исследования раковых клеток ТНР-1 in vitro под действием дофамина // Морфология. 2012. Т. 142, № 6. С.: 41 - 47.

Тезисы докладов и сборники 1. Парнышкова Е.Ю., Безгина E.H., Павлик Л.Л., Лавровская В.П., Мошков Д.А. Использование обнаружешюго цитоскелетного механизма взаимодействия дофамина с нейронами в разработке подхода к онкотерапии // XIII Всероссийская научно-техническая конференция «Нейроинформатика-2011». 24-28 января 2011, Москва. Ч. 1. С.: 246-253.

2. Парнышкова Е.Ю., Лавровская В.П. Цитохимическая визуализация глобулярного актина при малигнизации клеток // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Международная конференция. 24-26 мая 2011, Пущино. Т. 1. С.: 420-426.

3. Parnyshkova Е. У и., Pavlik L.L., Moshkov D.A. Cytosolic G-actin as a supposed therapeutic target for dopamine action // International Symposium "Biological Motility: Fundamental and Applied Science". 11-15 may 2012, Pushchino. C.: 158 - 162.

4. Парнышкова Е.Ю. Ультраструктурные исследования токсического действия дофамина на опухолевые клетки // 15-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". 18-22 апреля 2011, Пущино. С.: 154.

5. Парнышкова Е.Ю. Исследование структурных механизмов и молекулярной мишени воздействия на клетки дофамина как онкотерапевтического препарата // VII Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». 3-13 июня 2011, Судак, Крым, Украина. С.: 332.

6. Парнышкова Е.Ю. Взаимодействие дофамина со злокачественными клетками, растущими в суспензии // IV Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения-2011». 7-9 декабря 2011, Санкт-Петербург. С.: 149.

7. Парнышкова Е.Ю. Действие дофамина на злокачественные культуры клеток // 16-я Международная Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". 16-21 апреля 2012, Пущино. С.: 435.

8. Парнышкова Е.Ю. Цитотоксическое действие дофамина на опухолевые клетки // Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика», 22-24 октября 2012, Пущино, С.: 23.

Патенты

1. Мошков Д А., Парнышкова Е.Ю. «Средство, обладающее цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам человека в культуре» (RU 2453309 С1), 2012 г.

2. Мошков Д А., Парнышкова Е.Ю., Романченко С.П. «Средство для лечения злокачественных асцитных опухолей» (RU 2464974 С1), 2012 г.

По данной тематике также:

Получен У.М.Н.И.К. по теме: «Разработка новой концепции в создании онкотерапевтиче-

ских препаратов», автор: Парнышкова Е.Ю.

Подписано в печать:

17.12.2012

Заказ № 7988 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Парнышкова, Екатерина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Дофаминовые рецепторы 7 1.1.1. Локализация дофаминовых рецеторов

1.2. Актин: глобулярная и фибриллярная формы

1.2.1. Динамика актина в клетке

1.2.2. Ядерный актин

1.3. Актин: содержание катионов

1.4. Полимеризация актина

1.4.1. Скорость и степень полимеризации актина

1.4.2. Актин связывающие белки

1.4.3. Г-актин связывающие белки

1.4.4. Влияние цитохалазинов и фаллоидина на полимеризацию актина

1.5. Цитоскелет трансформированной клетки

1.6. Существующие микроскопичесике подходы для визуализации актина

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 45 Объекты исследования

2.1. Изучение взаимодействия Г-актина с дофамином in vitro

2.2. Культивирование клеток in vitro и оценка их выживаемости

2.3. Культивирование in vivo клеток асцитной карциномы Эрлиха

2.4. Морфологические исследования культур клеток

2.5. Цитохимическая визуализация ДА внутри клеток

2.6. Деполимеризация актина под действием цитохолазина В и глутамата

2.7. Взаимодействие дофамина с выделенным Г-актином в модельных экспериментах

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5, а в гене D4 — 3 (гены человека) (Grandy et al., 1989; Sokoloff et al., 1990; Van et al., 1991). Известно, что рецепторы D2 и D3 существуют в нескольких формах, что является результатом альтернативного сплайсинга их пре-мРНК (Giros et al., 1989; Monsma et al., 1989; Giros et al., 1991). Структурно D2-подобные рецепторы отличаются тем, что их С-концевые домены в 7 раз короче, чем у Dl-подобных рецепторов (Rondou et al., 2010).

Предполагается наличие рецепторов D6 и D7, но их существование пока не доказано.

Альтернативная классификация, предложенная в 1983 (Goldberg, Kohli, 1983), подразделяет рецепторы по их эффектам: активация рецепторов группы DA1 вызывает релаксацию мышц и расширение сосудов; для этих рецепторов (Я)-сульпирид является сильным антагонистом, апоморфин — слабым агонистом, а домперидон на них не действует. Активация DA2 рецепторов ингибирует действие норадреналина, апоморфин — их сильный агонист, а сильные антагонисты — (З)-сульпирид и домперидон. Дофаминовые рецепторы центральной нервной системы, по-видимому, относятся к этому классу (Альберт, 1989).

1.1.1. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДОФАМИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Дофаминовые рецепторы присутствуют как в центральной нервной системе, так в периферических органа. Относительная доля дофаминергических нейронов в головном мозге невелика (менее 1/100 000 всех нейронов) (Rondou et al., 2010). Эти нейроны формируют несколько основных дофаминергических путей: нигростриарный, мезолимбический, мезокортикальный и тубероинфундибулярный (Missale et al., 1998).

Дофаминовый рецептор D1 является самым широко распространённым дофаминовым рецептором в головном мозге, он синтезируется в большем количестве чем другие рецепторы. Он обнаруживается в высокой концентрации в нигростриарном, мезолимбическом и мезокортикальном путях, а именно в лобных долях, полосатом теле, чёрной субстанции, прилежащем ядре, обонятельном бугорке и миндалевидном теле. Также в меньшей концентрации он присутствует в гиппокампе, мозжечке, таламической и гипоталамической областях (Fremeau et al., 1991; Weiner et al, 1991; Hurd et al., 2001; I-Iuang et al, 1992).

Рецептор D2 в высокой концентрации присутствует в полосатом теле, обонятельном бугорке, прилежащем ядре, чёрной субстанции, гипоталамусе, вентральной области покрышки и миндалевидном теле, то есть примерно в тех же участках мозга, где обнаруживается и рецептор Dl (Meador-Woodruff et al, 1989; Le Moine et al, 1990; Missale et al, 1998). Тем не менее, дополнительные исследования помогли установить, что только 5—15% проекционных нейронов дорсальной части полосатого тела экспрессируют оба рецептора одновременно. Остальные нейроны могут быть разделены на две группы, в зависимости от того, какой из рецепторов они содержат (Beaulieu, Gainetdinov, 2011).

Рецептор D3 имеет более узкий профиль распространения, чем рецепторы, описанные выше. В наибольшей концентрации он присутствует в прилежащем ядре, обонятельном бугорке и островках Калеха. В существенно более низких концентрациях рецептор D3 обнаруживается в компактной части чёрной субстанции, вентральной области покрышки и мозжечке (Bouthenet et al, 1991; Le Moine, Bloch, 1996; Lövesque et al, 1992).

Уровень экспрессии рецептора D4 в мозге существенно ниже, чем рецептора D2. Доказано, что рецептор D4 присутствует в коре больших полушарий, гиппокампе, полосатом и миндалевидном телах (Rondou et al, 2010).

Рецептор D5 синтезируется в небольшом количестве в разных участках мозга: в пирамидальных нейронах префронтальной коры, поясной коре, энторинальной коре, чёрной субстанции, зубчатой извилине, гиппокампе и гипоталамусе (Beaulieu, Gainetdinov, 2011).

Все пять типов рецепторов дофамина встречаются и за пределами головного мозга. Так рецепторы Dl, D2 и D4 были обнаружены в сетчатке, а рецептор D2 — в гипофизе (Goldman, Kebabian, 1984; Cohen et al., 1992; Titeler et al., 1981). Дофаминовые рецепторы синтезируются в разных пропорциях в клетках почек, надпочечников, симпатических ганглиев, кровеносных сосудов, сердца и пищеварительного тракта (Beaulieu, Gainetdinov, 2011).

Изменение дофаминергической функции отмечается в ряде нейрологических и психических расстройств, а сами рецепторы являются мишенями для множества лекарственных препаратов. Подавляющее большинство антипсихотиков — антагонисты рецепторов дофамина, а психостимуляторы зачастую косвенно их активируют.

На данный момент получены свидетельства того, что помимо специфического взаимодействия с рецепторами, нейротрансмиттеры способны оказывать неспецифическое влияние на клетку.

1.2. АКТИН: ГЛОБУЛЯРНАЯ И ФИБРИЛЯРНАЯ ФОРМЫ

Многие структуры цитоскелета могут легко разрушаться и вновь возникать, меняя свое расположение или морфологию. В основе этих особенностей цитоскелета лежат реакции полимеризации-деполимеризации основных структурных цитоскелетных белков и их взаимодействие с другими белками, как структурными, так и регуляторными.

Цитоплазма эукариотических клеток пронизана трехмерной сеткой из белковых нитей (филаментов), формируемых цитоскелет. В зависимости от диаметра филаменты разделяются на три группы: микротрубочки (около 25 нм), промежуточные волокна (около 10 нм) и микрофиламенты (около 7 нм). Все эти волокна представляют собой полимеры, состоящие из субъединиц особых глобулярных белков. Микрофиламенты (актиновые нити) состоят из актина — белка, наиболее распространенного в эукариотических клетках (1015% сухого веса).

Актин - главный компонент системы микрофиламентов клетки

Sheterline et al., 1998; Pollard et al., 2000). Он обнаружен практически во всех типах клеток эукариотов и может составлять более 20% от всего клеточного белка (Cooper, 1991; Korn, 1982).

С актиновыми структурами цитоскелета связано поддержание формы, движение и делении клеток, эндо- и экзоцитоз, передача медиаторов и гормонов, свертывание крови, а также процессы, происходящие в эмбриогенезе (Крутецкая и др, 2003; Павлик JI.JI. 2004; Kopec C.D., 2006; Nishita M., 2006; Goetze В., 2006; Bestman J.E., 2008; Bressloff P.C., 2009Pollard Cooper, 1976; Egea et al., 2006; Malacombe et al., 2006). Предполагается участие цитоскелета в регуляции активности ионных каналов (Negulyaev et al., 1996, 2000; Shumilina et al.; Mazzocci et al., 2006), передаче внутриклеточного сигнала в геном (DeLanerolle, Cole, 2002), транспорте мРНК и транскрипции (Bassell, Singer, 1997; Grummt, 2006; Mírales, Visa; Percipalle, Visa, 2006), в передаче медиаторов (Rosenmund, Westbrook, 1993; Prekeris et al., 1996; Dillon, Goda, 2005) и регуляции активности ферментов (Su et al., 2005). Характерной осебенностью актиновых структур цитоскелета является их динамичность. В отличие от актиновых нитей стабильного сократительного аппарата скелетных мышц, образующихся однократно, микрофиламенты цитоскелета способны собираться и разбираться в зависимости от физиологического состояния клетки. Наиболее ярко это проявляется при распластывании клетки на субстрате (Moreau, Way, 1999; Small et al., 1999; Borisi, Svitkina 2000; Faix, Rottner, 2006), в акросомальной реакции сперматозоидов (Tilney et al., 1973, 1983), при перемещении патогенных бактерий внутри клетки (Cossart, Sansonetti 2004). Нарушение процессов сборки и разборки актиновых структур приводит к нарушению нормальной жизнедеятельности клетки, в том числе к её опухолевой трансформации (Janmey, Chaponnier, 1995; Prasad, 2005; Yamaguchi, Condeelis, 2007).

По существу, актин - количественно превалирующий белок во многих типах клеток. Часть актина в немышечных клетках полимеризуется с образованием микрофиламентов, напоминающих тонкие нити мышечного

Большинство актинов (существует несколько изомеров актина, наиболее распространены а-, р- и у-изомеры состоит из 375 аминокислотных остатков, в том числе одного остатка необычной аминокислоты — 3-метилгистидина (His68), который образуется посттрансляционно. При анализе аминокислотной последовательности актина обращает на себя внимание большое количество отрицательно заряженных групп, особенно на N-конце цепи. Так, из пяти N-концевых аминокислотных остатков четыре содержат в боковых цепях карбоксильные группы, а среди первых 25 аминокислотных остатков отрицательно заряжены 7. Различия в аминокислотной последовательности у разных актинов, как в пределах одного вида, так и межвидовые, крайне незначительны. Они составляют не более 25 аминокислотных замен. Таким образом, актин является одним из наиболее консервативных белков в эволюции эукариотов (Bershadsky et al.,1988), ещё более консервативным, чем гистон Н4 (Vandekerckhove, Weber, 1984).

Структурные исследования актиновой молекулы показали, что Г-актин представляет собой глобулярный белок слегка вытянутой формы с линейными размерами 5,5x5,5x3,5 нм. (Smith et al., 1983). Трехмерная структура актина была определена для актина в комплексе с белками, предотвращающими его полимеризацию - ДНКазой I (Kabsch et al., 1990), гельзолином (McLaughlin et al., 1993; Robinson et al., 1999) и профилином (Schutt et al., 1993), а также для АДФ-актина, модифицированного тетраметилродамин-5-малемидом (Otterbein et al., 2001). По данным рентгеноструктурного анализа комплекса Г-актина с ДНКазой I, молекула актина состоит из двух доменов с глубокой выемкой между ними (рис. 2.). Как N-, так С-конец полипептидной цепи находятся в малом домене. Каждый домен состоит из двух субдоменов. Малый домен в свою очередь состоит из субдомена I (остатки 1-32, 70-144 и 338-372) и субдомена II (остатки 33-69), а большой домен - из субдомена III (остатки 145-180 и 270-337) и субдомена IV (остатки 181-269).

Элементами структуры малого домена являются пять ß-складчатых структур, окруженных пятью a-спиралями (в субдомене I), и три антипараллельных ß-складчатых листа с а-спиралыо, соединяющей концы двух ß-листов (в субдомене II). В субдомене III большого домена имеется пять ß-складчатых структур, окруженных тремя a-спиралями, в субдомене IV - два антипараллельных ß- слоя и четыре a-спирали. Домены разделены глубокой щелью. В щели между доменами расположены одна молекула АТФ (или АДФ) и прочно связанный двухвалентный катион Mg2+ (рис. 2). In vitro Mg обычно замещен на

Ca . Все четыре субдомена расположены относительно компактно и стабилизированы в основном солевыми мостиками и водородными связями с фосфатными группами нековалентно связанного аденин-нуклеотида и с двухвалентным катионом, локализованным в центре молекулы актина (Kabsch et al., 1990).

В условиях, близких к физиологическим, Mg форма актина значительно преобладает над Ca" формой, и мономерный актин имеет в качестве лиганда либо Mg-АТФ, либо Mg-АДФ (Carlier, Pantaloni, 1994).

Важным свойством мономерного актина является его способность к полимеризации с образованием линейного полимера - Ф-актина (Straub, 1942). Электронная микроскопия показывает, что актиновая нить представляет собой упорядоченную двухстартовую (двухтяжевую) спираль, каждый тяж которой является правосторонней спиралью с 13 молекулами актина на 6 поворотов вправо (то есть поворот молекулы актина составляет 166) и шагом 71,5 нм. Тяжи в свою очередь закручены один вокруг другого, образуя левую спираль с 13 молекулами актина на 6 левосторонних поворотов и с шагом 5,9 нм. Таким образом, большой домен каждой молекулы актина находится ближе к центру нити, а малый домен - на ее периферии (Egelman, 1985). В отличие от актина образованного in vivo длина нитей актина, заполимеризованного in vitro, колеблется от 0,2 до 10 - 15 мкм, причем распределение по длинам экспоненциально.

-)-конец

Рис. 2. Пространственная структура молекулы актина.

Показаны триптофановые остатки {красным), тирозиновые остатки {синим), катион Са2+ {желтым) и молекула АТФ {зеленым). 1,11,III и IV - субдомены актина (Поварова О.И. и др., 2005).

В 1990 году Holmes и др. путём совмещения атомной структуры актинового мономера с рентгенограммой ориентированных Ф-актиновых гелей была построена структурная модель актинового филамента с атомным разрешением. Согласно этой модели основное взаимодействие между мономерами актина вдоль двухстартовой спирали осуществляется за счет контакта между субдоменом IV одного мономера и субдоменом III лежащего выше мономера. В середине нить упакована неплотно. Контакты вдоль левой спирали образуются остатками 195 - 197 субдомена IV и остатками 110 - 112 субдомена I. Кроме того, петля одного тяжа (266 - 269), по-видимому, внедряется в гидрофобный карман, образованный остатками 166, 169, 171, 285, 289, 63 - 64 и 40 - 45 другого тяжа. Предполагается, что мономеры удерживаются в полимере благодаря образованию гидрофобного ядра между соседними субъединицами вдоль двухстартовой спирали, в которое вклинивается "шпилька", состоящая из остатков 269 - 272, принадлежащих мономерам другого тяжа. Кроме того, взаимодействие между мономерами может поддерживаться и солевыми мостиками. Существуют, вероятно, и водородные связи. Таким образом, в атомной модели актинового филамента 24 аминокислоты на субъединицу вовлечены в контакт внутри правосторонней спирали, и только 15 участвуют в более слабых контактах между двумя правыми спиралями. Максимальный диаметр такой модельной нити равен 90-95 ангстрем (Holmes et al., 1990).

Благодаря строго упорядоченному распределению асимметричных субъединиц внутри полимера, Ф-актин является полярной структурой.

Мономер актина, расположенный на одном конце филамента, будет контактировать с растворителем своими субдоменами I и III, а мономер актина, расположенный на противоположном конце филамента, будет контактировать с растворителем своими доменами II и IV. Конец актинового филамента, на котором находятся субдомены II и IV, называется острым или минус-концом филамента, а противоположный ему конец, на котором в контакте с растворителем находятся субдомены I и III, называют тупым или плюс-концом. Структурно различить концы актинового филамента можно с помощью субфрагментов мышечного миозина, содержащих головку миозиновой молекулы (Ishikawa et al., 1969; Moshkov et al., 1990). Декорированный S-l фрагментами миозина актиновый филамент образует характерные колосковые структуры: заострённый конец колоска соответствует минус-концу актинового филамента, а "оперенный" - плюс-концу.

1.2.1. ДИНАМИКА АКТИНА В КЛЕТКЕ

Динамика микрофиламентов цитоскелета основана на двух фундаментальных свойствах актина. Первое - это способность к обратимой трансформации из глобулярного состояния (Г-актин) в полимер (Ф-актин) и обратно. Второе - это взаимодействие с актинсвязывающими белками, которые могут ускорять или ингибировать полимеризацию, фрагментировать актиновые нити или связывать их в пучки и прикреплять к клеточной мембране (Pantaloni et al. 2001; Dos Remedios et al., 2003; Pollard, Borisy, 2003;

Winder, Ayscough, 2005). Это означает, что динамика разных микрофиламентных структур в значительной степени определяется свойствами самого актина. Актин представлен в клетках разными изоформами. Миофибриллы скелетных мышц и сердца содержат аизоформы актина, микрофиламенты цитоскелета состоят из ß- и у-изоактинов

Vandekerckhove, Weber, 1978). Специфические изоформы актина обнаружены в гладких мышцах, тканях беспозвоночных животных, в растениях и одноклеточных организмах. В клетке поддерживается определенное соотношение между разными изоформами актина. Они компартментализованы, топографически разделены внутри цитозоля и, повидимому, выполняют разные задачи. Сопоставление данных о распределение изоформ актина в разных сократительных системах и разных частях клетки, с одной стороны, с данными о различиях в полимеризации изоактинов - с другой стороны, указывают на то, что свойства изоактинов соответствуют функциональным способностям тех сократительных систем, в которые они входят: мышечный а-актин способен к образованию более стабильных филаментов, в то время как филаменты ß- и у-актинов труднее образуются и легче диссоциируют (Khaitlina, 2001).

Активный край считается основной зоной полимеризации микрофиламентов в клетке. В настоящее время общепризнанной является теория постоянного тока, или круговорота актина в клетке между клеточным краем и эндоплазмой (Dunn G., 1980; Theriot J.A., Mitchison T.J., 1991).

Актиновая сеть формируется на клеточном крае движущейся клетки и перемещается центростремительно, в то время как деполимеризованный актин двигается в обратном направлении к краю клетки. Этот факт нашел свое подтверждение во многих экспериментальных моделях (Abercrombie et al., 1970; Fisher et al., 1988; Forscher et al., 1988; Theriot, Mitchison, 1991).

Активное движение вперед клеток также часто сопровождается центростремительным транспортом внутриклеточного содержимого, а также частиц, расположенных на поверхности клеток и связанных с актиновым цитоскелетом через мембранные гликопротеиновые рецепторы. В экспериментах по визуализации потока актина в клетке часто используют связанные с конканавалином микросферы диаметром 0.5 мкм (Kucik, 1991).

Частицы, спонтанно или при помощи лазерной ловушки прикрепленные к поверхности клетки, двигаются центростремительно. Скорость движения частиц коррелирует со скоростью центростремительного транспорта актинсодержащих структур в цитоплазме (Fisher et al., 1988). Подобное движение наблюдается только у клеток, способных к локомоции. Эти наблюдения показывают особую функциональную роль активного края ламеллы. Если частица прикреплена к какой-либо другой части ламеллы за пределами активного края, ее движение ограничивается медленным диффундированием на одном месте. Использование латексных частиц для исследования оказалось очень продуктивным, т.к. таким образом можно оценивать направление сил натяжения в актиновом цитоскелете, а также их изменения во время различных процессов, таких как, например, установление межклеточного контакта.

Хорошо известно, что мигрирующая или изменяющая форму клетка постоянно формирует различные динамичные структуры на своей поверхности. Так, культивируемые клетки часто образуют множество жёстких выступов плазматической мембраны толщиной около 0,1 мкм и длиной 5-10 мкм, называемых микрошипами. Более длинные микрошипы -филоподии - могут достигать в длину до 50 мкм. Тонкие пластинчатые выросты плазматической мембраны на поверхности клетки, достигающие толщины 200 нм и ширины 5-15 мкм (Small and Resch, 2005), называются ламеллоподиями и могут рассматриваться как двумерный вариант филоподии (Блиох, Смолянинов, 1977). Обе эти структуры образованы актиновыми филаментами, направленными своими "+"- концами к плазматической мембране (Svitkina et al, 2003).

Как правило, мигрирующая клетка имеет удлиненную поляризованную форму с плоским ведущим передним краем, адгезивным к субстрату, и стабильным задним краем. На активном крае формируются псевдоподии различных форм: от нитеобразных филоподии до плоских ламеллоподии. Все псевдоподии весьма подвижны и действуют подобно щупальцам, которыми клетка исследует окружающее пространство. Те псевдоподии, которые прикрепляются к субстрату, направляют клетку к этому наиболее адгезивному участку, а те, которым не удалось прикрепиться, перемещаются по верхней стороне клетки назад и там втягиваются. Этот процесс напоминает движение волн по поверхности в сторону, противоположную направлению перемещения клетки, и называется раффлингом (Блиох, Смолянинов, 1977; Small, 1988; Bray, White, 1988; Lee et al, 1994; Oliver et al, 1994).

В восьмидесятые годы рядом исследователей было показано, что молекулярный механизм описанной клеточной подвижности сводится к строго упорядоченной и регулируемой полимеризации актина в клетке. Так, было продемонстрировано, что движение ламеллоподии может быть парализовано цитохалазином, в то время как блокаторы микротрубочек не оказывали никакого эффекта на формирование псевдоподий и движение клетки (Malawista, De Boisfleury, 1982).

С использованием флуоресцентно-меченого актина было выяснено, что в ламеллоподии клетки происходит быстрый круговорот актина. При этом новые актиновые субъединицы встраиваются преимущественно в передний край ламеллоподии шириной менее 1 мкм, а затем перемещаются к её основанию, где имеет место деполимеризация филаментов (Wang 1985; Symons, Mitchison, 1991). Было показано, что большинство актиновых филаментов в ламеллоподии ориентировано своими плюс-концами по направлению к плазматической мембране клетки (Small et al., 1978), формируюч ортогональную сеть (Small et al. 1995), при этом градиент актина падает с конца к основанию ламеллоподии.

В 1996 году Александр Могильнер и George Oster предложили модель, позволяющую объяснить, каким образом вставочная полимеризация актина может создавать механическое усилие, толкающее вперёд ламеллоподию клеток эукариотов. Согласно этой модели, названной авторами «Elastic Brownian Ratchet», филаменты в ламеллоподии эукариотической клетки заякорены своими минус-концами в ортогональной актиновой сети, в то время как их свободные плюс-концы находятся в непосредственном контакте с поверхностью плазматической мембраны.

Вставочная полимеризация актина на быстро растущих плюс-концах филаментов становится возможной благодаря тепловым колебаниям актиновых филаментов, отклоняющихся от своего равновесного положения на углы, достаточные для вставки мономера актина в пространство между плюс-концом отклонившегося филамента и мембраной клетки. Обратное движение удлинившегося на один мономер филамента и создаёт механическое усилие, толкающее мембрану вперёд. Отсюда максимальная скорость движения ламеллоподии близка к скорости полимеризации актина на плюс-конце филаментов переднего края актиновой сети (Mogilner, Oster, 1996).

Таким образом, на сегодняшний день считается, что движение клеточной мембраны вперёд обусловлены процессом тредмиллинга, обеспечиваемым ростом актиновых филаментов на плюс-конце, организацией их в механически прочную сеть и последующей регулируемой разборкой филаментов на минус-конце (Wang, 1985). Типичная скорость тредмиллинга актина в клетке составляет около 5 мкм/мин (Symons, Mitchison, 1991), что на два порядка превышает скорость оборота чистого актина in vitro (Korn et al., 1987; Amann, Pollard, 2000). Этот факт является следствием того, что в клетке существуют механизмы контроля динамики актина, поддерживающие стационарную концентрацию мономеров на уровне, значительно превышающем критическую концентрацию чистого актина. Так, во многих клетках концентрация мономерного актина может доходить до 200 мкМ, что составляет 50% от всего актина клетки и превышает содержание актина in vitro (Korn et al., 1987).

1.2.2. ЯДЕРНЫЙ АКТИН

Наличие и роль актина в ядре долгое время оставалась неясной. Однако после идентификации мономерного актина как ключевого компонента ремоделирующих хроматин-комплексов (Papoulas et al., 1998; Zhao et al.,

1998; Shen et al., 2000), a также обнаружения в ядре актиноподобных и актинсвязывающих белков (Blessing et al., 2004) ситуация изменилась.

Использование спецефических антител к определённым участкам молекулы актина позволило выявить различные, в том числе нетрадиционные, конформации ядерного актина (Gonsior, 1999; Schoenenberger et al., 2005;

Jockusch et al., 2006). Применяя несколько вариантов моноклональных антител, способных связываться с различными эпитопами (часть макромолекулы антигена, распознаваемая иммунной системой) молекулы актина (Milankov, De Boni, 1993; Gonsior et al., 1999), показало, что антитела по-разному распознают ядерный и цитоплазматический актин. В последнее время появляется все больше публикаций, свидетельствующих о том, что актин в ядре существует не только в виде мономеров (Боголюбова, 2009), но и в олиго- и полимерной формах (Pederson, Aebi, 2005; Percipalle, Visa, 2006; Vartiainen, 2007; Pederson, 2008; Бенкен, Сабанеева, 2011). Помимо этого, актин в соматических клетках, видимо, формирует новые, ранее не наблюдавшиеся олигомерные структуры, которые не распознаются фаллоидином (de Lanerolle et al., 2005). В силу своих размеров (42 кДа) мономерный актин, не имеющий сигнала ядерной локализации, может проникнуть в ядро путём диффузии через ядерные поровые комплексы. Наличие у актина двух сигнальных последовательностей экспорта, с которыми связываются экспортины, препятствует его накоплению в ядре (Wada et al., 1998). По-видимому, степень полимеризации актина в ядре, так же как и в цитоплазме, зависит от его концентрации и активности ряда связывающих актин белков. Их присутсвие в ядре было показано неоднократно (Nowak et al., 1997; Gettemans et al., 2005; Dingova et al., 2009).

Представления о функциях актина в ядре также претерпели существенные изменения. Первоначально предполагалось, что этот белок является компонентом ядерного матрикса и выполняет исключительно структурную функцию, однако к настоящему времени перечень функций ядерного актина существенно расширился. Мономерный актин учавствует в модулировании структуры хроматина (Zhao et al., 1998), а в виде олигомера необходим для эффективной транскрипции РНК-полимеразами 1 (Fomproix and Percipalle, 2004, Philimonenko et al., 2004; Kisela et al., 2005), 2 (Hofmann et al., 2004; Kukalev et al., 2005) и 3 (Hu et al., 2004). В частности, предполагается, что актин играет роль в сборке комплекса инициации транскрипции (Miralles, Visa, 2006) и на стадии элонгации (Hofmann et al., 2004), а также формирует и поддерживает структуру ядра (Krauss et al., 2002; Bohnsack et al., 2006).

1.3. АКТИН: СОДЕРЖАНИЕ КАТИОНОВ

Молекула актина содержит также один прочно связанный ион двухвалентного металла. В природном актине это, по-видимому, В процессе выделения актина

§2+ обычно замещается на Са2+, так как сродство актина к Са2+ в 3 - 5 раз выше, чем к

§2+ (в интервале рН 7,0 - 8,0 КБ = 2-8 нМ и 10-30 нМ для ионов Са2+ и соответственно). Кроме того, молекула актина имеет 5-9 центров слабого связывания катионов (КБ = 0,15 мМ для ионов Са2+ и

§2+ и 10 мМ для ионов К+). Ион Са24, обнаруженный на карте электронной плотности Г-актина, находится в глубоком гидрофильном кармане, образованном фосфатными группами АТФ и остатками А^-11, С1п-137 и Азр-154. Предполагается, что этот Са2+ является прочно связанным ионом, локализованным в высокоаффинном центре связывания катионов. Один из центров слабого связывания катионов, по-видимому, локализован в Ы- концевом сегменте полипептидной цепи молекулы актина. Локализация остальных центров слабого связывания неизвестна.

Показано, что замещение прочно связанного Са~ на вызывает конформационные изменения в субдомене I и субдомене II малого домена молекулы актина. Однако являются ли эти изменения локальными или трехмерная структура

§-актина в целом отличается от структуры актина, содержащего Са24, неизвестно.

Так же, как АТФ, прочно связанный катион легко обменивается со средой. При удалении катиона уменьшается константа связывания нуклеотида с актином, что приводит к быстрой диссоциации АТФ. Диссоциация Са2+ происходит медленнее, чем диссоциация АТФ, и лимитирует скорость всего процесса. При замещении прочно связанного Са2+ на обмен нуклеотидов ускоряется.

Потеря катиона и нуклеотида приводит к инактивации актина, т.е. к потере его способности к полимеризации. Инактивации можно избежать, если АТФ и Са2+ удаляются из раствора актина в присутствии сахарозы.

Поэтому предполагается, что прочно связанные нуклеотид и катион необходимы для поддержания нативной структуры актина.

Инактивация актина сопровождается изменением спектра его собственной флуоресценции и увеличением количества реакционноспособных SH-групп. Кроме того, происходит агрегация мономеров, поэтому инактивация актина необратима.

1.4. ПОЛИМЕРИЗАЦИЯ АКТИНА

Важным свойством актина является его способность к полимеризации с образованием линейного полимера - Ф-актина (Bershadsky et al., 1988; Korn et al., 1987). In vitro мономерный актин может существовать в растворе с низкой ионной силой. Полимеризация индуцируется добавлением 1 мМ кальция или магния или повышением ионной силы за счет добавления 100 мМ КС1 (Хайтлина, 1985; Pollard, 1982; Craig, 1982). Способность актина полимеризоваться in vitro позволяет детально изучить условия этого процесса.

Процесс полимеризации актина включает в себя две стадии: нуклеацию и элонгацию (Хайтлина, 1985; Bershadsky et al., 1988). На первой, более медленной стадии - нуклеации, происходит объединение небольшого числа мономеров в агрегат, называемый затравкой или зародышем, имеющим глобулярную форму. Затравками обычно служат тримеры или тетрамеры актина (Barden et al., 1982). Вторая, более быстрая стадия - элонгация, заключается в присоединении новых мономеров к образовавшимся затравкам с образованием нитчатых структур.

Полимер актина является полярной структурой благодаря упорядоченному распределению асимметричных единиц. Два противоположных конца актинового филамента различаются по скорости присоединения к ним новых субъединиц (Pollard, Craig, 1982). Структурно различить концы актинового филамента можно с помощью субфрагментов мышечного миозина, содержащих головку миозиновой молекулы (Ishikawa et стабильным, поэтому на (-)-конце идёт деполимеризация. После этого молекула АДФ, связанная с мономером актина, заменяется на АТФ и цикл повторяется (рис. 4) (Pollard, 1986; Wegner, 1982). barbed end pointed end

Xjw л,. л Г' j l—L^j^-./

Lj "S

ZZ7 y^ ZZZ/^

ATP ADP /~~7 ATP-actin

7 ADP.P.-actin y ADP-actin

Рисунок 4. Цикл полимеризации-деполимеризации актина (Pollard, 1986; Wegner, 1982).

Описанный выше цикл является результатом различия критических концентраций G актина для двух концов: 0,1 мкМ для (+)-конца и 0,7 мкМ для (-)-конца. Между этими концентрациями система находится в стабильном состоянии, когда скорости полимеризации и деполимеризации равны, а концентрация свободного актина остаётся близкой к 0,1 мкМ. (Pollard, 1986, 2000, 2003).

1.4.1. СКОРОСТЬ И СТЕПЕНЬ ПОЛИМЕРИЗАЦИИ АКТИНА

Скорость полимеризации актина на разных концах нитей различна. Быстро растущим является конец нити, соответствующий "оперенному" концу стреловидных структур, образованных Ф-актином и фрагментами миозина. Конец, соответствующий основанию стрелы, является медленнорастущим. Используя в качестве зародыша полимеризации пучок актиновых нитей, с помощью электронной микроскопии измеряют скорость

Различия в константах скорости реакции означают, что при концентрации актина 0,5 мг/мл в физиологических условиях на "быстром" конце нити за секунду добавляется 70 молекул, а диссоциирует 2, на "медленном" конце добавляется 20 мономеров, диссоциирует 1. При концентрации актина 4-5 мг/мл нить длиной 3 мкм может образоваться за 10 - 12 секунд.

Предполагается, что транслокационный характер полимеризации актина связан с гидролизом АТФ, который сопровождает полимеризацию, но происходит медленнее, чем добавление мономеров. При высокой концентрации мономеров скорость удлинения нити намного превышает скорость гидролиза АТФ, в результате чего на обоих концах нити накапливается значительное количество субъединиц, содержащих АТФ или сравнительно долго живущий промежуточный комплекс АДФ-Ф. В равновесном состоянии концентрация мономеров и соответственно скорость их добавления резко падают, субъединицы, содержащие АТФ или АДР-Ф остаются только на "быстром" конце нити. Критическая концентрация полимеризации актина на концах нити, содержащих АТФ, снижается, причем на "быстром" конце сильнее, чем на "медленном", и такая "блокировка" "быстрого" конца нити создает условия как для деполимеризации на "медленном" конце, так и для регуляции динамики полимеров. Возможно, молекулярной основой подобной регуляции являются конформационные изменения актина при превращении АТФ в АДФ.

Критическая концентрация актина при полимеризации и степень полимеризации, или длина нитей, зависят не только от условий в растворе, но и от особенностей структуры актина.

Показано, что при неоптимальных условиях полимеризации критическая концентрация полимеризации (3- и у-изоактинов выше, чем критическая концентрация полимеризации а-актина. Кроме того, полимеры, образованные и у-актином, менее стабильны, чем полимеры а-актина. Причиной разной стабильности полимеров могут быть различия в С-концевой части полипептидной цепи актина и в области "шпильки".

В отличие от ситуации in vitro, в клетке регулируются не только скорость и степень полимеризации актина, но и переход от одной стадии полимеризации к другой. Эта регуляция осуществляется с помощью ряда актинсвязывающих белков.

1.4.2. АКТИН-СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ

Более 50 белков в цитоплазме связываются с актином выполняя различные функции: регулируют объем Г-актинового пула (профилин), влияют на скорость полимеризации (виллин), стабилизируют концы нитей фрагин, а-актинин), сшивают филаменты друг с другом, или с другими компонентами (виллин, а-актин, спектрин, MARCKS, фимбрин), разрушают двойную спираль Ф-актина (гельзолин). Кроме того, специальные актинсеквестирующие белки связывают мономеры актина, высвобождая их для полимеризации по мере необходимости. В отсутствии таких белков концентрация Г-актина в клетке составляла бы 100 мкМ, что значительно превышает критические концентрации (Kiuchi et al, 2011). Активность белков 2+ регулируется Са и протеинкиназами (таблица 2).

Таблицы 2. Белки, связывающие F-актин

Белок M,kD Локализация и действие на Е-актин

Фасцин 55 филлоподии, ламелоподии, стресс-фибриллы, микроворсинки,акросома

Тропомиозин 2x35 стабилизирует Б-актин, предотвращая фрагментацию

Миозин 2x260 скольжение нитей

Минимиозин 150 движение пузырьков

Профилин 15 запасение в-актина

Скруин 102 Акросома

Вилин 92 микроворсинки

Дематин 48 кортикальная сеть эритроцитов

Фимбрин 68 адгезион. контакты, микроворсинки связ в пучки

Актинин 2x102 адгез контакты, микроворсинки связ в пучки

Спектрин 2x265+2x260 кортик сеть эритроц прикрепление к ПМ

Дистрофии 427 корт.сеть мыш волокон

АВР 120 92 Псевдоподии

Фмламин 2x280 Псевдоподии, стрессфибриллы сшивает в сети

Имеется пять мест действия белков: с мономером актина, с (+)-концом (оперенный), с (-)-концом (заостренный), с боковой поверхностью. Актин-связывающие белки могут быть чувствительны или нечувствительны к Са

1. Белки связывающиеся с мономером актина - подавляют нуклеацию (профилин, фрагментин - чувствительны к Са ). Профилин с мономером способны надстраивать Б-актин, а фрагментин нет, блокируя и нуклеацию и

2"Ь ТТ о элонгацию. Не чувствительные к

Са ДНКаза и белок связывающийся с витамином Д - функционируют вне клетки.

2. Кепирующие (закрывают концы актиновых филаментов, предотвращая полимеризацию-деполимеризацию, способствуют прикреплению филамента к мембране) (+)-конец может быть блокирован кепирующими белками -блокирование элонгации и стыковки, способствуют нуклеации - появление укороченных филаментов (гельзолин, виллин, фрагмин). Кэпирующие-фрагментирующие белки - фрагментируют Ф-актин, вызывая переход геля в золь (гельзолин 90Ш. активируясь Са2+ 10-6М разрывает Ф-актин и связывается с его концами).

3. (-)-конец - инициирование нуклеации, подавление стыковки и элонгации -увеличение числа и уменьшение длины фрагментов. Акументин в макрофагах, бревин - сывороточный белок вызывает быстрое снижение вязкости раствора Ф-актина. Оба белка не чувствительны к Са2+. профиллином фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат (PIP2) один из ключевых участников фосфатидилинозитольного пути передачи сигнала с поверхности клетки. Связывается с прфиллином и PIPI. Эти взаимодействия, по-видимому, обеспечивает связь между трансмембранной передачей сигнала и актиновым цитоскелетом. Важная роль профиллина в жизнедеятельности клетки следует из резкого нарушения клеточных функций в Saccharomyces cerevisiae, искусственно дефектных по профиллину (Haarer et al., 1990).

Панкреатическая дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I): ДНКаза I представляет собой эндонуклеазу, гидролизующую как одно-, так и двухцепочечную ДНК с образованием сложной смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих 5'-фосфатные группы. В присутствии ионов Mg ДНКаза I независимо атакует каждую цепь ДНК, при этом места разрывов располагаются статистически вдоль молекулы, а в присутствии ионов Мп расщепляет обе цепи ДНК приблизительно напротив друг друга.

Фермент поджелудочной железы - ДНКаза I - образует очень прочный комплекс с G-актином (Mannhers et al., 1980). При этом теряется как активность ДНКазы, так и способность актина к полимеризации. ДНКаза I может также связываться с F-актином и индуцировать его деполимеризацию. При взаимодействии актина с ДНКазой I ингибируется не только способность актина к полимеризации, но и способность ДНКазы I гидролизовать ДНК. Это позволило разработать удобный метод определения количества мономерного актина в клетке. Кроме того, комплекс актина с ДНКазой I был успешно использован для кристаллизации и изучения трехмерной структуры актина. Однако физиологическая роль взаимодействия G-актина с ДНКазой I не ясна.

Тимозин бета-4: Это небольшой белок, выделенный из тромбоцитов.

Как и профиллины, он связывается с G-актином и ингибирует его полимеризацию (Safer et al., 1991). Высокое содержание тимозина бетаобнаружено в тромбоцитах и макрофагах. Так же, как профилин и белок, связывающий витамин Д, тимозин бета-4 поддерживают уровень глобулярного актина, играя роль буфера. Предполагается также, что освобождение тимозина из комплекса с актином и появление его в плазме крови может быть сигналом, запускающим иммунную систему клетки.

Активность актин-связывающих белков может регулироваться липидами вообще и Р1Р2 в особенности (обзор Janmey, 1994). Например, в некоторых условиях in vitro можно диссоциировать кэппируюшие белки гельзолин или CapZ от актиновых филаментов, что приводит к быстрой полимеризации актина (Janmey, 1987; Heiss, 1991). Более того, добавление фосфоинозитидов к тромбоцитам, в мембране которых предварительно были сделаны поры, приводит к декэппированию актиновых филаментов (Hartwig, 1995). В то же время производство избыточных количеств Р1Р5-киназы приводит к массовой полимеризации актина в фибробластах (Shibasaki, 1997). На основе неспособности белка Rae приводить к изменениям в актиновом цитоскелете фибробластов мышей, лишенных гена гельзолина, было сделано предположение о возможности регуляции гельзолина белком Rae (Azuma, 1998). Все эти данные привели к появлению модели, согласно которой постоянное взаимодействие GTPa3 семейства Rho с Р1Р5-киназой приводит, при стимуляции клетки, к усиленному производству PIP2, который в свою очередь декэппирует актиновые филаменты и таким образом запускает их удлинение вблизи плазматической мембраны (Carpenter, 1999; Janmey, 1998).

Для поддержания пула актиновых мономеров и постройки новых актиновых структур необходима быстрая деполимеризация ненужных филаментов. Единственным семейством белков, выполняющих эту задачу, является АДФ/кофилины. Это небольшие белки, состоящие из одного АДФ-Г актин деполимеризирующий фактор) домена, присутствующие во всех эукариотических клетках и присоединяющиеся и к Ф- и к Г-актину. Они предпочтительно связываются с АДФ-актином, стимулируя диссоциацию неорганического фосфата из Ф-актина, и в то же время индуцируют поворот в структуре филамента, что приводит к деполимеризации (Paavilainen et al.,

2004). АДФ/кофилины остаются связанными с диссоциировавшими мономерами, постепенно освобождая их для взаимодействия с другими актин-связывающими белками. Они также препятствуют спонтанной нуклеотидной замене в мономерах актина, поддерживая их в неподходящем для полимеризации состоянии.

1.4.4. ВЛИЯНИЕ ЦИТОХАЛАЗИНОВ И ФАЛЛОИДИНА НА ПОЛИМЕРИЗАЦИЮ АКТИНА

При полимеризации Г-актина в Ф-актин ориентация всех мономеров одинакова, поэтому Ф-актин обладает полярностью. Волокна актина имеют два разноимённо зараженных конца (+ и -), которые полимеризуются с различной скоростью. Эти концы не стабилизированы специальными белками (как, например, в мышечных клетках), и при критической концентрации Г-актина «+»-конец будет удлиняться, а «-»-конец укорачиваться. В условиях эксперимента этот процесс может быть ингибирован токсинами грибов, связывающимися с актином и блокирующими его полимеризацию, нарушая тем самым подвижность клеток, фагоцитоз и цитокинез: цитохалазины, фаллоидин, латрункулин и толитоксин (рис. 5).

Цитохалазины - группа родственных по химической структуре метаболитов плесневых грибов (Tanenbaum, 1978). Функционально цитохалазины напоминают кэпирующие белки. Они связываются с (+)-концом (быстро растущим) актинового филамента и блокируют как присоединение, так и отсоединение субъединиц на этом конце, хотя блокирование может быть неполным (Bonder, Mooseker, 1986; Brown, Spudich, 1982; Maclean-Fletcher, Pollard, 1980). На процесс элонгации актинового филамента с острого (медленно растущего) конца цитохалазины не влияют (Bonder, Mooseker, 1986; Maclean-Fletcher, Pollard, 1980). Цитохалазины могут также разрезать актиновоые филаменты. Наиболее активным является цитохалазин D (Urbanic, Ware, 1989). ассоциация.'- -N пиеепиііаиия деполимеризация полимеризация

F-актин, спирализованный полимер, іилптср, микрофиламент (фрагмент)

42кДа

G-актим мономер, с=зЭ=£ цитохалазин

-конец: преимущественно диссоциация

З^конец: преимущественно полимеризация

Рис. 5. Полимеризация и деполимеризация актина (Кольман, Рем, 2000).

Сходство цитохалазинов с кэпирующими белками подтверждается тем, что ряд белков конкурирует с цитохалазином за связывание с актиновыми филаментами. Такие белки обнаружены у акантамебы, тромбоцитов, фибробластов (Grumet, Lin, 1980; Magargal, Lin, 1986;-Pollard, Cooper, 1986). Другие кэпактины, например, виллин и гельзолин, не конкурируют с цитохалазинами.

Цитохалазины широко используются для исследования живых клеток благодаря тому, что они способны проникать через клеточную мембрану. Помимо связывания с актином, цитохалазин А и цитохалазин В ингибируют также транспорт моносахаридов через плазматическую мембрану, а цитохалазин С, цитохалазин D, цитохалазин Е, цитохалазин H и 21,22 -дигидроцитохалазин В не влияют на транспорт моносахаридов и являются специфическими для актина агентами ( Small, 1988).

Латрункулин морских губок (Spector et al, 1989) и толитоксин сине-зелёных водорослей (цианобактерий) (Patterson et al, 1993) как и цитохалазины останавливают полимеризацию актина.

В противоположность цитохалазинам Фаллоидин (циклический олигопептид бледной поганки Amanita phalloides) (Cooper, 1987) стабилизирует актиновые филаменты, препятствуя как полимеризации, так и деполимеризации (Coluccio, Tilney, 1984; Low et al., 1975). Связывание фаллоидина является стехиометрическим - 1 молекула фаллоидина на 1 субъединицу актина. Связывание фаллоидина уменьшает константы диссоциации мономеров с концов филамента, что способствует сохранению или даже увеличению длины филамента, а также защищает Ф-актин от фрагментирующих воздействий, таких как режущие белки, цитохалазины, механические факторы (Cooper, 1987; Low et al., 1975).

Актин-связывающих белков, стабилизирующих актиновые филаменты аналогично тому, как это делает фаллоидин, пока не обнаружено. Действие тропомиозинов имеет наибольшее сходство с эффектами фаллоидина, однако, тропомиозин не увеличивает скорость элонгации актиновых филаментов. Отличается также стехиометрия связывания этих двух агентов.

Фаллоидин, в отличие от цитохалазинов, не способен проникать через плазматическую мембрану клетки, поэтому для опытов на живых клетках нужны специальные подходы для преодоления этого барьера. Фаллоидины, меченные флуорохромами, широко используются для выявления Ф-актина в пермеабилизованных клетках (Barak et al., 1980).

1.5. ЦИТОСКЕЛЕТ ТРАНФОМИРОВАННОЙ КЛЕТКИ

Согласно существующим представлениям интегрирующим звеном, объединяющим разные части клетки, придающим клеткам форму и размер, а также обеспечивающим передачу сигналов как внутри одной клетки, так и между разными клетками, является цитоскелет (Welsh et al., 1995; Cowin and

Burke, 1996; Hortsch et al., 1998). Цитоскелет представляет собой сложную трехмерную сеть белковых нитей, которая обеспечивает способность эукариотических клеток сохранять определенную форму, а также осуществлять направленные и координированные движения, как самих клеток, так и отдельных органелл. Основными компонентами цитоскелета являются актиновые филаменты, микротрубочки и промежуточные филаменты. В состав цитоскелета входит и так называемый примембранный цитоскелет, открытый впервые в эритроцитах. В начале 70-х годов при исследовании механических свойств мембран эритроцитов было обнаружено, что после разрушения мембраны, вызванного экстракцией липидов неионными детергентами, остается плотная ячеистая структура, сохраняющая форму эритроцита (Уи е1 а1., 1973). Эта структура получила название примембранного цитоскелета, построенный из фибриллярного белка спектрина.

Каждый тип цитоскелетных структур образует в клетке собственную систему со своими главными и минорными белками. Эти системы не являются абсолютно независимыми, а взаимодействуют друг с другом и с другими компонентами клетки - мембраной, ядром, органоидами.

Цитоскелет у трансформированных клеток изменен, часто редуцирован, из-за чего они имеют более или менее округлую форму. Такие клетки могут содержать несколько ядер, не типичных по форме и размерам.

Изменение формы (морфологии) - характерное свойство трансформированных клеток, позволяющее при микроскопическом исследовании диагносцировать злокачественную трансформацию. В основе морфологических нарушений лежат связанные между собой изменения цитоскелета, адгезионных взаимодействий клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом. Вкратце они выражаются в нарушении формирования фокальных контактов и в ухудшении прикрепления клеток к матриксу, дезорганизации системы актиновых микрофиламентов. Это приводит к изменениям активности псевдоподий и характера перемещения клеток. В целом наблюдаемая картина напоминает изменения, возникающие в нормальных клетках при действии мотогенных цитокинов - факторов, стимулирующих передвижение клеток. Однако так называемый локомоторный фенотип в неопластических клетках, как правило, сильно утрирован, что позволяет отличать по морфологии опухолевую клетку от движущейся нормальной клетки.

Изменение функционирования актинового цитоскелета в трансформированных клетках может объясняться рядом механизмов. Активация миозиновой АТФазы зависит от фосфорилирования легкой цепи миозина зависимой от кальция и кальмодулина киназой легкой цепи миозина. Поскольку содержание кальмодулина в трансформированных клетках повышено, это может приводить к стимуляции киназы и, следовательно, АТФазы миозина. Против этой гипотезы свидетельствует координированное понижение уровня MLCK (киназа лёгких цепей миозина) в трансформированных фибробластах. Другая возможность заключается в повышении концентрации свободных ионов кальция за счет изменения в фосфатидилинозитольном пути передачи сигнала или из-за увеличенного поглощения Са2+ через кальциевые каналы плазматической мембраны. Увеличение же кальция влияет на активность гельзолина, что может менять статут актиновых филаментов в клетке. Активность миозина может регулироваться также протеинкиназой С, фосфорилирование которой уменьшает активность АТФазы миозина. В трансформированных клетках активность протеинкиназы С часто понижена, что приводит к усилению функций миозина (Starkley, 1990).

В целом, цитоскелет - это высокодинамичная система цитоплазмы. Многие структуры цитоскелета могут легко разрушаться и вновь возникать, меняя свое расположение или морфологию. В основе этих особенностей цитоскелета лежат реакции полимеризации-деполимеризации основных структурных цитоскелетных белков и их взаимодествие с другими белками, как структурными, так и регуляторными.

1.6. СУЩЕСТВУЮЩИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ АКТИНА В КЛЕТКАХ

Для визуализации в клетках Ф-актина детально разработаны разнообразные методы микроскопии (Sturmer et al, 1998; Peruski et al, 2003).

Среди них, такие как декорирование микрофиламентов фрагментом S миозина, окрашивание фаллоидином, меченным флуорохромами или коллоидным золотом (Barak et al., 1980, Павлик и др., 2004), иммунофлуоресцентные метки (Pavlik et al., 1990; Tiras et al., 1990; 1992; Uttamapinant et al., 2010). Идентификация же, тем более количественная, хотя бы косвенная, оценка глобулярного (Г-) актина внутри клеток такими способами практически невозможна. Клетки перемещаются путем полимеризации мономерного Г- в полимерный Ф-актин на переднем краю ламелаподий. Нити актина деполимеризуются в направлении к задней части ламелоподий, тем самым дополняя пул Г-актина для нового этапа полимеризации. В этом случае концентрации Ф- и Г-актина являются основным параметром, однако до сих пор непосредственно их определить не удается. Лишь недано наметился некоторый прогресс в этом направлении, но он пока ограничивается визуализацией процесса и качественным определением перехода одной агрегатной формы актина в другую в условных единицах (Kiuchi et al., 2011).

Для понимания основных принципов оборота актина и для моделирования молекулярных механизмов, лежащие в основе движения клетки (Novak et al., 2008) в естественных условиях, должны быть установлены концентрации Ф- и Г-актина в ламелоподиях. Глобальные оценки соотношения Ф-и Г-актина получены фракционированем клеточных экстрактов (Heacock et al., 1984; Hartwig et al., 1986; Fechheimer et al., 1983;) и использованием ДНКазы (Blikstad et al., 1978). Анализ показал, что есть приблизительно эквивалентное количество полимеризованного актина и неполимеризованного в немышечных клетках, оценка концентрации мономерного актина в широких пределах показала наличие его в пределах от

12 до 300 мкм (Pollard et al., 2000). Лишь недавно были разработаны методы непосредственного количественного определения локальной концентрации белков в живых клетках, а именно в делящихся дрожжах. Относительные концентрации Ф- и Г-актина, однако, было невозможно определить.

Используя электронную микроскопию (Hoglund et al., 1980), с помощью метки фаллоидином актиновых филаментов в одной фиксированной клетке было показано, что их концентрация в области ламеллоподий составила от 700 мкм, до 1600 мкм. Авторы (Abraham et al., 1999) показали, что локальная концентрация Г-актина в ламеллоподии составляет около 150 мкм, что на несколько порядков выше, чем критическая концентрация для полимеризации.

Полимеризация актиновых филаментов из мономерного Г-актина имеет важное значение для миграции клеток и в морфогенезе. Она контролируется в клетке пространственно и во времени с помощью различных регуляторных белков актина. Движение клетки осуществляется за счёт богатых Ф-актином ламеллоподий, в которых за счёт полимеризации строятся актиновые филаменты с быстрорастущего острого конца вблизи мембраны.

Мономерный актин в цитоплазме пополняется за счет разборки актиновых филаментов в острых концах ламелаподий, чему способствует деполимеризирующий актин-фактор АДФ/кофилин (Bamburg et al., 1999;

Pollard and Borisy, 2003). В большинстве живых клеток, цитоплазматическая концентрация Г-актина (ЮОцМ) выше критической концентрации актиновых филаментов (0,1 цМ) (Pollard et al., 2000). Такая высокая концентрация Гактина поддерживается за счет разборки Ф-актина АДФ/кофилин, и через спонтанное образование Г-актина от Г-актин-связывающих белков, профилина и тимозина-[34, и блокированием полимеризации Ф-актина Фактин-кэпирующими белками (Pantaloni and Carlier, 1993; Barkalow et al.,

1996; Bamburg et al., 1999; Pollard et al., 2000). Основной компонент цитоплазматического Г-актина это пул свободного АТФ-Г-актина, АТФ-Гактин в комплексе с тимозин-(34 и профилин, АДФ-Г-актин в комплексе с

АДФ/кофилином. Между тем тимозин~р4 изолирующий АТФ-Г-актин и

АДФ-Г-актин в комплексе с АДФ/кофилином являются не способными к полимеризации (Safer and Nachmias, 1994; Kang et al., 1999; Carlier and

Pantaloni, 2007). Несмотря на большое число клеточного Г-актина, состоящего из неспособного к полимеризации АТФ-Г-актина в комплексе с тимозином-(34, этот комплекс находится в равновесии со свободным АТФ-Гактином и является своеобразным резервуаром (депо) для поставки свободного АТФ-Г-актина, когда идет расход на стимул-индуцированную сборку актина (Safer and Nachmias, 1994; Carlier и Pantaloni, 2007). Роль Гактина и белков, регулирующих динамику актиновых филаментов, были тщательно изучены в бесклеточной системе. Так как скорость полимеризации актина пропорциональна концентрации Г-актина в клетке (Pollard, 1986), предполагается, что концентрация цитоплазматического Г-актина является критическим параметром для скорости внутриклеточной полимеризации актина. Тем не менее, некоторые предыдущие исследования уделяли мало внимания роли концентрации Г-актина в стимул-индуцированной полимеризации актина, цитоплазматические концентрации Г-актина, как правило, гораздо выше, чем критическая концентрация актиновых филаментов (Cramer, 1999; Chan et al., 2000). Чтобы понять механизм, регулирующий сборку и разборку актина во время миграции клеток и морфогенеза, очень важно иметь возможность измерения пространственновременных изменений и определения соотношения Г- к Ф-актину.

Предыдущие исследования также оценивали отношение Г- к Ф-актину в ламеллоподиях по контрастированию DNase-I или путем сравнения FDAP снижения флуоресценции после фотоактивации) или FRAP (восстановление флуоресценции после фотообесцвечивания) GFP -актина (актина, меченного зеленым флуоресцирующим белком) до и после отмывки клетки детергентом

Cramer et al., 2002; Koestler et al., 2009). Иногда в качестве флуоресцентной метки используют белок Dronpa или Желтый флуоресцирующий белок.

Однако эти подходы не в состоянии измерить изменения в концентрации Г- и

Ф-актина в отдельных живых клетках, и развитие нового метода способного количественно пространственно определять концентрации Г-актин с высоким разрешением в живых клетках в настоящее время необходим. Как сказал Kiuchi с соавторами (Kiuchi et al., 2011) «Однако эти подходы не в состоянии измерить временную зависимость изменений концентрации Г-и Ффункционировании клеток является актуальной нерешенной задачей. Для визуализации и количественной оценки Г-актина, по-видимому, можно использовать дофамин, который, как недавно установлено, прямо проникает в клетку (Павлик и др., 2004; Безгина и др., 2006; Павлик и др., 2008), стехиометрически связывается с Г-актином и превращает его в филаменты, визуализируемые флуоресцентной и электронной микроскопией (Мошков и др., 2010а; 20106). Поэтому поиск нового вещества способного проникать в клетку и прямо, без посредников и одношагово связываться с Г-актином в строго определенной пропорции (с четкой стехиометрией), с помощью которого возможно качественного и количественного определять содержание Г-актина, очень важно на данный момент.

И. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили клеточные культуры, культивированные in vitro: минимально трансформированные фибробласта одного происхождения (эмбрион мыши), линии BALB/3T3 и линия ВЗТЗ-SV40, зараженных вирусом; злокачественные клетки 2-х видов, прикрепляющиеся (НЕр-2, рак гортани человека) и растущие в суспензии (ТНР-1, острая моноцитарная лейкемия человека), а также клетки перевиваемой опухоли, растущие in vivo (АКЭ, асцитная карцинома Эрлиха мышей).

2.1. Изучение взаимодействия Г-актина с дофамином in vitro

Результаты взаимодействия дофамина (концентрацией 3,57x10" М) с мышечным Г-актином (концентрацией 3,57х10~5М) в виде формирования нитей Ф-актина после сут или 2сут инкубации при 4°С визуализировали в электронном микроскопе. Препараты Г-актина, выделенного по стандартному методу (Pardee, Spudich, 1982) получали в лаборатории структуры и функции мышечных белков (зав. проф., д.б.н. З.А. Подлубная) ИТЭБ РАН, в буферном растворе, содержащем 2мМ ТРИС, 0,2мМ NaATP, 0,2мМ СаСЬ, меркаптоэтанол и ЮмМ КС1 (рН=7,4). Способность Ф-актина деполимеризоваться под влиянием глутамата или цитохалазина В оценивали в аналогичных условиях в том же буфере.

Для негативного контрастирования каплю (5мкл) инкубируемой смеси препаратов наносили на клистронную сеточку-подложку, покрытую пленкой из формвара или пиолоформа, укрепленную углеродным напылением. Через

1 мин избыток жидкости отсасывали фильтровальной бумагой, и на сеточки наносили и тут же удаляли каплю 2% раствора уранилацетата. После высушивания на воздухе сеточки изучали в электронном микроскопе Tesla

BS 500 при увеличении 29000х. Диаметр филаментов Ф-актина и актодофаминового комплекса определяли непосредственно на фотонегативах. Их предварительно увеличивали с помощью прибора

Микрофот в 17,5 раз. Диаметр нитей, измеренный микрометром по их длине в нескольких местах в мм, с учетом увеличения изображения на негативе, переводили в нм по формуле: d (нм) = (Д:Мф:29)х1000, где d - диаметр нити в нм, Д - диаметр нити в мм, Мф - увеличение Микрофота.

2.2. Культивирование клеток in vitro и оценка их выживаемости

Клеточные культуры были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург). Клетки культивировали в чашках Петри (12 см2/2 мл) при 37 °С и 5% СОг в среде, содержащей RPMI-1640 или DMEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и гентамицина (80мкг/мл) в течение одних, двух и трех суток, комплексно исследуя их морфофункциональное состояние после каждого периода. Во флаконы и чашки вносили 300000 и 100000 клеток на поверхность, соответственно.

Введение ДА. Для предотвращения окисления дофамина в культуральную среду добавляли антиоксидант - метабисульфит натрия (200 мкМ) (Pedrosa, Soares-da-Siva, 2002). Для оценки действия на клетки с разной организацией актинового цитоскелета дофамин концентрацией от 10"5 до 10" М вносили в культуру либо одновременно с посевом (до распластывания клеток), либо спустя 5ч после их прикрепления и распластывания. Выживаемость клеток В (%) оценивали по следующему соотношению:

В (%) =Kr100/Kh где Ki - количество посеянных клеток, К2 - количество клеток после инкубации в контроле или в присутствии ДА. Подсчет клеток проводили с помощью камеры Горяева на 1, 2 и 3 сутки после введения ДА, окрашивая их 0,5% раствором трипанового синего. В случаях, когда ДА вводили в культуральную среду после прикрепления клеток к подложке, выживаемость оценивали по морфологическим данным, основываясь на состоянии индивидуальных клеток в центре и по краям колоний, а также по плотности (конфлюэнтности) монослоя в нескольких случайно выбранных полях зрения микроскопа.

2.3. Культивирование in vivo клеток асцитпой карциномы Эрлиха (АКЭ)

Работа с животными осуществлялась в соответствии с международнопризнанными правилами и этическими нормами. В экспериментах использованы 140 самцов беспородных мышей линии SHK возрастом около

3 месяцев, весом 28 - 36 г. Объектом исследования был штамм ELD перевиваемой асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ). Инокуляцию опухоли производили инъекцией в брюшную полость мыши 10б клеток АКЭ в 0,1 мл физиологического раствора для инфузий. Величина инокулята была выбрана в предварительных экспериментах с учетом ранее описанной методологии работы с АКЭ (Инжеваткин, 2004) и результатов предшествующих опытов in vitro. Дофамин (ДА) на начальных этапах вводили мышам внутрибрюшинно в объеме 1 мл. Использовали аптечный препарат ДА из ампул, содержащих

4% (или примерно 0,2 М) раствор с метабисульфитом (Pedrosa, Soares-da

Siva, 2002) (ОАО «Биохимик», РФ и Orion, Pharma, Финляндия), разбавленный аптечным физиологическим раствором (ФР) для инъекций до рабочих концентраций 0,017 М, 0,17 М или неразведенный. Выбор концентраций дофамина в инъецируемом растворе рассчитывали так, чтобы количества дофамина внутри брюшины хватало для полного взаимодействия с суммарным количеством Г-актина всех клеток инокулята. При этом исходили из расчета, что этот белок составляет 10% сухого веса клетки, а также, что стехиометрическое соотношение ДА/Г-актин в актодофаминовом комплексе составляет 100/1 (Мошков и др., 2010). Мышам через 18 часов после инокуляции опухоли инъецировали ДА и далее в течение 6 суток 2 раза в день с интервалом между инъекциями 5 час. Контрольным мышам инъецировали одновременно с инъекцией ДА равный по объему физраствор.

Часть мышей с перевитой опухолью оставляли интактными до конца эксперимента. По завершении экспериментов мышей забивали методом цервикальной дислокации, извлекали асцитную жидкость, производили подсчет количества клеток с помощью камеры Горяева. Статистическую обработку результатов проводили в программе Microsoft Excel (Microsoft Office 2003). Значимость различий данных определяли при помощи t-теста Стыодента. Количественные данные представлены значениями среднего арифметического ± ошибка среднего при уровне значимости доверительного интервала 0,05.

2.4. Морфологические исследования культур клеток

Для гистологии и электронной микроскопии клетки отмывали от культуральной среды, погружали в фиксатор, состоящий из 4% параформа на

0,1М какодилатном буфере (5,6мл), 25 % глутаральдегида (2мл), диметилсульфоксида (0,25мл), 1М какодилатного буфера (0,44 мл), дистиллированной воды (1,57мл), рН=7,2 (Picard, 1976). Фиксирование продолжалось в течение 2ч при комнатной температуре. Затем следовала промывка в 0,1М какодилатном буфере 5 мин, постфиксация в 2% растворе четырехокиси осмия на таком же буфере в течение 1 ч. Далее препараты обезвоживали в спиртах возрастающей крепости от 50 до 100, затем в 100% ацетоне, а затем пропитывали в смеси 100% ацетона и Эпона 812. В эту же смолу проводили заливку материала. Распластанные клетки заливали плоскопараллельно и просматривали под световым микроскопом без резки сквозь заливочную смолу и дно чашки. В случае клеток, находящихся в суспензии, их предварительно осаждали при 1000об/мин и осадки фиксировали. В некоторых случаях для морфологического анализа асцитных клеток использовали мазки, изготовленные на предметных стеклах, высушенные на воздухе, фиксированные в этаноле и окрашенные по

Романовскому. Серийные гистологические Юмкм срезы изготовляли на пирамитоме ЛКБ (Швеция) и без дополнительной окраски изучали под световым микроскопом NU-2E (Carl Zeiss, Германия), оборудованным цифровой камерой Nikon D5100 (Япония). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Leica UC6 (Германия), собирали на клистронные сеточки, контрастировали в насыщенном водном растворе уранилацетата в течение 2ч, при температуре 37°С и затем в течение 20мин в растворе цитрата свинца при комнатной температуре (Гайер, 1974) и исследовали в электронном микроскопе TESLA BS-500 (Брно, Чехословакия) при 90кВ. Состояние ультраструктуры синапсов, цитоплазматических органоидов и цитоскелета анализировали сначала визуально качественно, а затем количественно.

2.5. Цитохимическая визуализация ДА внутри клеток Клетки, находящиеся в суспензии, осаждали при 1000об/мин, однократно отмывали от культуральной среды ресуспендированием в растворе, содержащем 0,9% NaCl, 5мМ HEPES, 5мМ глюкозу, 1мМ СаС12, 1мМ MgCl2 и 200мкМ метабисульфита натрия, (рН=7,2). Затем их переносили в тот же буфер, содержащий ДА в концентрации 10" М, и инкубировали в течение 30 мин и 5ч в чашках Петри при 37°С в атмосфере 95% 02 и 5% С02. На дно чашек Петри клали покровное стекло, к нему клетки прикреплялись в процессе инкубации. По окончании инкубации клеток с ДА неприкрепленные клетки осаждали центрифугированием, и осадок трижды отмывали от дофамина ресуспендированием в чистом буферном растворе. Промытые клетки наносили в виде мазка на предметное стекло и изучали под флуоресцентным микроскопом. Клетки, прикрепившиеся к покровному стеклу, изучали прямо на нем, промыв их трехкратным погружением в буфер. Галоперидол в концентрации добавляли в среду инкубации непосредственно перед внесением ДА. В качестве контроля использовали клетки, инкубированные в буферном растворе без ДА. Цитохимическую реакцию на биогенные амины осуществляли по методу Фалька (Falck, Owman, 1965), для чего полученные мазки или монослои клеток высушивали 2 сут над концентрированной серной кислотой, и нагревали до 80°С над параформальдегидом. Изохинолины, образовавшиеся в процессе конденсации катехоламинов и паров формальдегида, визуализировали по флуоресценции при 490-500 нм (Хек = 330, 375нм). Использовали микроскоп AXIO Imager ZI (Carl Zeiss), любезно предоставленный В.А. Яшиным (ИБК РАН).

2.6. Деполимеризация актина под действием цитохалазииа В и глутамата

Клетки, цитозольный актин которых предварительно был полимеризован взаимодействием с дофамином, в течении 2 часов инкубировали с глутаматом, деполимеризующим Ф-актин (Безгина и др., 2006), конечная концентрация которого составляла 2 мг/мл, или с цитохалазином В концентрацией 1 мг/мл. Далее клетки готовили к исследованию в мазках, или фиксировали по стандартной методики, обезвоживали и заливали в смолу Эпон. Препараты изучали в стационарном (напольном) световом микроскопе NU-2E (Carl Zeiss, Германия), снабженном цифровым фотоаппаратом Nikon D5100 (Япония). Ультратонкие срезы исследовали в электронном микроскопе TESLA BS-500 (Брно, Чехословакия) при 90кВ.

2.7. Взаимодействие дофамина с выделенным Г-актином в модельных экспериментах

Взаимодействие дофамина с выделенным мышечным Г-актином изучали в модельных системах двух разновидностей: на не флуоресцирующем фильтре (структурная модель «плоской клетки») и в полиэлектролитных микрокапсулах, приготовленных по методике (Казакова и др., 2012) (структурная модель «объемной клетки»). В случае структурной модели «плоской клетки» выделенный Г-актин с известной концентрацией предварительно полимеризовавали взаимодействием с дофамином, взятом в стехиометрическом (1:100) соотношении. Готовый препарат наносили на фильтр в виде капли объёмом 1 мкл. Контролями служили препараты чистого Г-актина, препараты Ф-актина, образованного в ЮОтМ KCl, не обработанного и предварительно обработанного дофамином с последующей отмывкой, и фильтр, на который помещали каплю раствора дофамина. Далее все фильтры с подопытными и контрольными препаратами обрабатывали по методу Фалька (Falck, Owman, 1965). Для того чтоб унифицировать данные количества и свечения актина, связанных в одной плоскости известного объёма, при съёмке образцы покрывали клистронной сеточкой с размером одной ячейки 150 мкм (структурная модель «плоской клетки»). В случае структурной модели «объемной клетки», представляющей собой полиэлектролитные микрокапсулы, использовали разные случаи: Подопытные образцы были представлены капсулами, наполненными Г-актином, в последующем инкубированные с дофамином. Контролями служили капсулы без актина; капсулы, наполненные Г-актином и пустые капсулы, обработанные дофамином. Далее подопытные и контрольные образцы обрабатывали по методу Фалька (Falck, Owman, 1965) для визуализации образовавшихся актодофаминовых комплексов.

Статистические расчеты. Статистическую обработку результатов проводили в программе Microsoft Excel (Microsoft Office 2003). Значимость различий данных определяли при помощи t-теста Стыодента. Количественные данные представлены значениями среднего арифметического ± ошибка среднего при уровне значимости доверительного интервала 0,05.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3. Влияние дофамина на состояние актина в живых клетках

Одним из условий исследования воздействия экзогенного дофамина на цитоскелет живой клетки является доказательство специфической и избирательной способности актина изменять свое агрегатное состояние под действием этого катехоламина. Этот вопрос исследовали на минимально

BALB/3T3) и сильно трансформированных (3T3B-SV40) мышиных фибробластах (Камерон, Пул, 1985). Клетки обеих линий отличаются разным стабильным состоянием актина. Это подтверждается также сравнительными исследованиями клеток этих линий и свежевыделенных фибробластов с точки зрения структуры их актинового цитоскелета (Bereiter-Hahn, Munnich,

1998). Основное внимание в работе акцентировали на состояние матрикса клеток (цитозоль), представляющего собой комплекс структурированного актинового цитоскелета в виде микрофиламентов и пучков нитей и бесструктурной гиалоплазмы, места локализации Г-актина. Изучали также модельные системы, основанные на выделенном Г-актине.

3.1. Ультраструктурное исследование изменения состояния актина под воздействием дофамина в трансформированных клетках

Клетки в культуре тканей отличаются по одному или более цитоплазматическим признакам, которые вполне определяемы и потому могут служить в качестве индикаторов нормального и трансформированного состояния клеток. Изменения числа и организации микрофиламентов и микротрубочек, как утверждалось, коррелирует с трансформацией.

Фибробласты имеют изначально сформированный актиновый цитоскелет (рис. 6): толстый кортикальный слой, стресс-волокна в виде пучков актиновых нитей и густую сеть разрозненных нитей (Ефремова и др., 2004; Гамалей и др., 2006). Клетки характеризуются слабо развитым шероховатым эндоплазматическим ретикулумом (ШЭР) в виде повсеместно разбросанных коротких цистерн, основная белоксинтезирующая система представлена многочисленными свободными полисомами. Типичными являются вакуоли, в виде фаголизосом или лизисных лакун, и редкие митохондрии, имеющие удлиненную несколько изогнутую форму и весьма темный матрикс. Ядро округлое с умеренно выраженным гетерохроматином и узким перинуклеарным пространством, заполненным фибриллярным материалом. фибробластов хорошо выражен и представлен заметными легко идентифицируемыми актиновыми элементами (рис. 1а). Кортикальный слой толстый, под ним в глубине цитозоля расположена густая сеть актиновых филаментов, сформированная как из одиночных нитей (рис. 1а, в), так и из пучков нитей (рис. 1г). Цитоплазма клеток, также как и в контрольных препаратах, содержит множество вакуолей и редкие вытянутые узкие митохондрии с плотным матриксом. У части из них кристы имеют заметно набухший вид и выглядят как мелкие вакуоли. Шероховатый ретикулум практически отсутствует, он представлен одиночными цистернами, количество рибосом резко снижено, все пространство, ранее занятое ими, теперь заполнено сетью коротких актиновых нитей или вакуолями разного типа. Ядра клеток остаются округлыми, их матрикс представлен типичным гетерохроматином, перинуклеарное пространство заметно расширяется и просветляется.

Рис. 24а. Ультраструктура лейкемических клеток в контроле, а - часть контрольной клетки, обзорный снимок, включающий поверхность, цитозоль и ядро. На вставках участок околоядерной зоны и поверхности с микроворсинками. Масштабная линейка 1 мкм, на вставках 0,5 мкм. Обозначения: мв - микровилли, ф - филаменты, пф - пучки актиновых филаментов, сф - сеть актиновых филаментов, шэр - шероховатый эндоплазматический ретикулум, м - митохондрии, ц -цитоплазма, я - ядро.

Разная ориентация органоидов клетки в суспензии по сравнению с клеткой, прикрепившейся к субстрату, затрудняет визуализацию компонентов цитоскелета в электронном микроскопе. Тем не менее, и в случае с TITP-1 видно, что главным структурным признаком действия ДА является появление сети актиновых филаментов в цитозоле, как и в распластанных культивированных фибробластоподобных и раковых клетках НЕр-2 (Парнышкова, 2011, 2012). Новым стал факт появления пучков нитей в кариоплазме, искажающих форму ядра, приобретающих ярко выраженные угловатые очертания, типичные в случае полимеризации под действием дофамина Г-актина, заключенного внутри липосом (Павлик, 2008). Появление отмеченных морфологических изменений коррелируют с выявлением апоптозных тел в фазе резкой гибели клеток, что может свидетельствовать о причинно следственной связи этих явлений, внутриядерной полимеризации актина и апоптозом клеток.

3.4.3. Исследование ультраструктуры раковых клеток АКЭ in vivo

В экспериментах in vivo на асцитной карциноме Эрлиха (АКЭ) также прослеживались общие выше описанные признаки после воздействия дофамина. Результаты ультраструктурных исследований клеток асцита представлены на рис 25. Видно, что клетки АКЭ, развивающиеся весь срок эксперимента без дальнейших вмешательств (интактный контроль, рис. 25а), имеют типичный вид клеток, живущих в суспензии и не способных формировать конгломераты. Поверхность округлых или имеющих заметно угловатую форму клеток опухоли интактных мышей по всему периметру покрыта частично деформированными узкими и короткими микроворсинками. Сразу под плазматической мембраной располагается узкий кортикальный слой, представляющий собой скопление множества актиновых нитей, расположенных параллельно поверхности. Кортикальный слой развит неравномерно, чаще в виде островков, между которыми цитозоль выходит непосредственно к мембране. Изредка под мембраной встречаются галоперидола, заметная люминесценция выявлена исключительно на периферии клеток (рис 266), в полном соответствии с представлением о его блокаде дофаминовых рецепторов, расположенных на плазматической мембране, благодаря лигандным взаимодействиям.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Парнышкова, Екатерина Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что дофамин вызывает полимеризацию мономерного актина в условиях in vitro, при этом диаметр нитей актодофаминового комплекса увеличивается на треть по сравнению с естественным Ф-актином, и препарат становится флуоресцирующим.

2. Определено, что дофамин вызывает патологическую полимеризацию цитозольного актина, нарушая морфофункциональную организацию клеток.

3. Показано, что содержание Г-актина не коррелирует со степенью злокачественности клеток, но сам по себе Г-актин является слабым звеном в поддержании функционального состояния клетки.

4. Цитохимическая визуализация методом Фалька катехоламинов в клетках после воздействия дофамина выявила многократное усиление интенсивности флуоресценции их цитозоля. Установлено, что субстратом флуоресценции являются вновь образованные нити актодофаминового комплекса. В связи со стехиометрическим соотношением дофамин/актин в актодофаминовом комплексе, интенсивность его флуоресценции указывает на содержание Г-актина в цитозоле.

5. Полученные результаты действия дофамина на клетки в разных состояниях показывают, что он обладает цитотоксической активностью. Определено, что дофамин в концентрации 10-4 М способен вызывать in vitro и in vivo гибель клеток разной природы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Парнышкова, Екатерина Юрьевна, Пущино

1. Альберт А. Избирательная токсичность / Под ред. проф. В. А. Филова. -М.: Медицина, 1989. (1): 228.-432.

2. Албертс А., Брей Д., Льюис Р., Рафф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, (в 3 томах) пер. с англ. М. Мир. 1994. 2: 274.

3. Безгина E.H., Павлик Л.Л., Михайлова Г.З., Тирас Н.Р., Удальцов С.Н., Шубина B.C., Мошков Д.А. Морфофункциональные эффекты аппликации глутамата и дофамина на маутнеровские нейроны золотой рыбки. Нейрофизиология. 2006. 38 (4): 320 330.

4. Бенкен К.А., Сабанеева Е.В. Фибриллярный актин в ядерном аппарате инфузорий Paramecium caudatum. Цитологияж. 2011. 53 (6): 528 536.

5. Блиох Ж.Л., Смолянинов В.В. Кинематика распластывания фибробластов. 2 Индивидуальная локомоторная активность. Биофизика. 1977. 22 (4): 631 -639.

6. Боголюбова Н., Боголюбова И. Локализация актина в ядрах двуклеточных зародышей мыши. Цитология. 2009. 51 (8): 663 669.

7. Браун А.Д., Моженок Г.П. Неспецифический адаптационный синдром клеточной системы. Л., «Наука». 1987.

8. Буданцев А.Ю. Моноаминергические системы мозга. М., «Наука». 1976. 192с.

9. Виланд Т., Фаулыитих X. Фаллоидин. В кн. «Итоги и перспективы развития биоорганической химии и молекулярной биологии». Москва, «Наука». 1978. с. 98- 110.

10. П.Ефремова Т.Н., Кирпичникова K.M., Хайтлина С.Ю., Гамалей И.А. Перестройки актинового цитоскелета в клетках ЗТЗ и 3T3-SV40 в присутствии антиоксидантов. Цитология. 2004. 46 (5): 395 -403.

11. Инжеваткин Е.В. Практикум по экспериментальной онкологии на примере асцитной карциномы Эрлиха: метод, разработка. 2004. 10 с.

12. И.Казакова Л.И., Дубровский A.A., Санталова Л.И., Мошков Д. А., Аполонник Н.В., Шабарчина Л.И. Распределение белка внутри полиэлектролитных капсул в зависимости от pH среды. Биоорганическая химия. 2012.38(1): 64-69.

13. Мошков Д.А. 1985. Адаптация и ультраструктура нейрона. М.: Наука. 200с.

14. Мошков Д.А., Абрамова М.Б., Шубина B.C., Лавровская В.П., Павлик Л.Л., Лежнев Э.И. Влияние дофамина на жизнеспособность клеток ВНК-21. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2010. 149 (3): 335-339.

15. Мошков Д.А., Павлик Л.Л., Шубина B.C., Парнышкова Е.Ю., Михеева И.Б. Цитоскелетная регуляция клеточной функции дофамином. Биофизика. 2010. 55 (5): 850 856.

16. Павлик Л.Л., Безгина Е.С., Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Удальцов С.Н., Мошков Д.А. Структура смешанных синапсов маутнеровских нейронов при воздействии веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов. Морфология. 2004. 125 (2): 26-31.

17. Павлик Л.Л., Григорьев П.А., Шубина B.C., Бледжянц Д.А., Мошков Д.А. Исследование взаимодействия дофамина с искусственными фосфолипидными мембранами. Биофизика. 2008 53 (1): 66 72.

18. Парнышкова Е.Ю., В.П. Лавровская, E.H. Безгина, Л.Л. Павлик, Э.И. Лежнев, Д.А. Мошков. Морфологические основы влияния дофамина на жизнеспособность опухолевых клеток НЕр-2. Морфология, 2011. 140 (6): 69 74.

19. Парнышкова Е.Ю., Лавровская В.П., JI.JT. Павлик, Э.И. Лежнев, Д.А. Мошков. Цитохимическая визуализация дофамина как способ оценки содержания глобулярного актина в цитозоле живых клеток. Биологические мембраны. 2012. 29 (3): 209 214.

20. Репина В.П. Механизмы влияния катехоламинов на регуляцию иммунного гомеостаза. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2008. Архангельск.

21. Тирас Н.Р. Морфологические корреляты функциональной пластичности маутнеровских нейронов. Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук. 2007. Пущино.

22. Филатова Н.А., Кирпичникова К.М., Гамалей И.А. 2008. Реорганизация актинового цитоскелета в клетках 3T3-SV40 и их чувствительность к литической активности естественных киллерных клеток. Цитология. 50 (3): 261-267.

23. Хайтлина С.Ю., 1985; Хайтлина С.Ю. Полимеризация актина и молекулярные механизмы ее регуляции. В кн. "Механизмы контроля мышечной деятельности" под ред. Г.П.Пинаева и В.Б.Ушакова. Л., "Наука", стр. 171-190, 1985.

24. Шубина B.C., Абрамова М.Б., Лавровская В.П., Павлик Л.Л., Лежнев Э.И., Мошков Д.А. Влияние дофамина на ультраструктуру клеток ВНК-21. Цитология. 2009. 51 (12): 996 1004.

25. Abercrombie М., Heaysman J.E.M., Pegrum S.M. The locomotion of fibroblasts in culture. III. Movements of particles on the leading lamella. Exp. Cell Res. 1970. 62:389-398.

26. Abraham V.C, Krishnamurthi V., Taylor D.L., Lanni F. The actin-based nanomachine at the leading edge of migrating cells. Biophys J. 1999. 77: 1721 1732.

27. Anderie I., Schmid A. In vivo visualization of actin dynamics and actin interaction by BiFC. Cell Biol. Int. 2007.31 (10): 1131 1135.

28. Amann K.J., Pollard T.D. Cellular regulation of actin network assembly. Curr. Biol. 2000. 10 (20): 728 730.

29. Bamburg J.R., McGough A., and Ono S. Putting a new twist on actin: ADF/coflins modulate actin dynamics. Trends Cell Biol. 1999. 9:364-370.

30. Barak L.S., Jocum R.R., Nothnagel E.A., Webb W.W. Fluorescence staining of the actin cytoskeleton in living cells with 7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazole-phallacidin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. 77: 980 984.

31. Barkalow K., Witke W., Kwiatkowski D.J., and Hartwig J.H. Coordinated regulation of platelet actin flament barbed ends by gelsolin and capping protein. J. Cell Biol. 1996. 134: 389-399.

32. Barden I.A., Grant N.J., dos Remendios C.G. Identification of the nucleus of actin polymerization. Biochem. Intern. 1982. 5: 685 692.

33. Bassell C. G., Singer R. H. 1997. mRNAs and cytoskeletal filaments. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 109-115.

34. Beaulieu J.M., Gainetdinov R.R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol. Rev. 2011. 63 (1): 182 217.

35. Bergmann M., Sautner T. Immunomodulatory effects of vasoactive catecholamines. Wien Klin. Wochenschr. 2002. 114 (17-18):752 61.

36. Bereiter-Hahn J, Munnich A, Woiteneck P. Dependence of energy metabolismon the density of cells in culture. Cell Struct Funct. 1998. 23: 85 93.

37. Bershadsky A.D., Vasiliev J.M. Cytoskeleton. Plenum Press, NY and London. 1988. 298 pp.

38. Blalock J.E. Production of peptide hormones and neurotransmitters by the immune system. Chem. Immunol. 1992. 52:1 24.

39. Blessing C. A., Urginova G. T., Goodson H. V. Actin and ARPs: action in the nucleus. Trends Cell Biol. 2004. 14 : 435 442.

40. Blikstad I., Markey F., Carlsson L., Persson T., Lindberg U. Selective assay of monomeric and filamentous actin in cell extracts, using inhibition of deoxyribonuclease I. Cell. 1978. 15:935-943.

41. Bohnsack M. T., Stuven T., Kuhn C., Cordes V. C., Golrich D. A selective block of nuclear actin export stabilizes the giant nuclei of Xenopus oocytes. Nat. Cell Biol. 2006. 8 : 257 263.

42. Bonder E.M., Mooseker M.S. Cytochalasin B slows but does not prevent monomer addition at the barbed end of the actin filament. J.Gell Biol. 1986. 102:282-288.

43. Borgundvaag B., George S.R. Dopamine inhibition of anterior pituitary adenylate cyclase is mediated through the high-affinity state of the D2 receptor. Life Sci. 1985. 37 (4): 379-386.

44. Borisi G. G., Svitkina T. M. Actin machinery: pushing he envelope. Cur. Opin. Cell Biol. 2000. 12: 104- 112.

45. Bray D., White J.G. Cortical flow in animal cells. Science. 1988. 239 (4842): 883 -888.

46. Brown S.S., Spudich J.A. Mechanism of action of cytochalasin: evidence that it binds to actin filament ends. J.Cell Biol. 1982. 88: 487 491.

47. Bubb M.R., Spector I., Beyer B.B. and Fosen K.M. Effects of jasplakinolide on the kinetics of actin polymerization. J.Biol.Chem. 2000. 275 (7): 5163 -5170.

48. Carlier M.F., Pantaloni D. Actin assembly in response to extracellular signals: role of capping proteins, thymosin beta 4 and profilin. Semin. Cell. Biol. 1994. 5(3): 183-191.

49. Carlier M.F., and Pantaloni D. Control of actin assembly dynamics in cell motility. J. Biol. Chem. 2007. 282: 23005-23009.

50. Carlsson L., Nystrom L.E., Sundkvist I., Lindberg U. Actin polymerization is influenced by profilin, a low molecular weight protein in non-muscle cells. J.Mol.Biol. 1977. 115:465-483.

51. Carpenter C.L., Tolias K.F., van Vugt, A., and Hartwig J. Adv. Enzyme Regul. 1999. 39: 299-312.

52. Chan A.Y., Bailly M., Zebda N., Segall J.E., and Condeelis J.S. Role of coflin in epidermal growth factor-stimulated actin polymerization and lamellipod protrusion. J. Cell Biol. 2000. 148: 531 542.

53. Coluccio L.M., Tilney L.C. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. J.Cell Biol. 1984. 99: 529 535.

54. Cooper J.A. Effect of cytochalasin and phalloidin on actin. J.Cell Biol. 1987. 105: 1473- 1478.

55. Cooper J.A. The role of actin polymerization in cell motility. Annu Rev. Physiol. 1991.53:585-605.

56. Cossart P., Sansonetti P. J. 2004. Bacterial invasion: the paradigm of enteroinvasive pathogens. Science. 304: 242 248.

57. Cowin P., Burke B. Cytoskeleton-membrane interactions. Curr. Opin. Cell Biol. 1996.8:56-65.

58. Cramer L.P. Role of actin-flament disassembly in lamellipodium protrusion in motile cells revealed using the drug jasplakinolide. Curr. Biol. 1999. 9: 1095 -1105.

59. Cramer L.P., Briggs L.J., and Dawe H.R. Use of fuorescently labeled deoxyribonuclease I to spatially measure G-actin levels in migrating and non-migrating cells. Cell Motil. Cytoskeleton. 2002. 51: 27 38.

60. Grummt I. Actin and myosin as transcription factors. Curr. Opin. Genet. Develop. 2006. 16: 191 196.

61. Dardenne M., Savino W. Interdependence of the endocrine and immune systems. Adv. Neuroimmunol. 1996. 6 (4): 297 307.

62. DeLanerolle P., Cole A. B. Cytoskeletal proteins an gene regulation. Sci. STKE. 2002. 139: PE30.

63. Dingova H., Fukalova J., Maninova M., Philimonenko V., Hozak P. Ultrastructural localization of actin and actin-binding proteins in the nucleus. Histochem. Cell Biol. 2009. 131: 425-434.

64. Dillon C., Goda Y. 2005. The actin cytoskeleton: integrating form and function at the synapse. Annu. Rev. Neurosci. 28: 25 55.

65. Dos Remedios C. G., Chhabra D., Kekic M., Dedova I. V., Tsubakihara M., Berry D. A., Nosworthy N. J. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiol. Rev. 2003. 83 : 433-473.

66. Du R., Development and application of probes for labeling the actin cytoskeleton in living plant cells. 2011. 248 (2): 239 250.

67. Dunn G. Mechanisms of fibroblast locomotion. In: "Cell Adhesion and Motility". A. Curtis & J. Pitts. Cambridge Univ. Press. 1980. pp. 409 423.

68. Egea G., Lazaro-Dieguez F., Vilella M. Actin dynamics at the Golgi complex in mammalian cells. Curr. Opin. Cell Biol. 2006. 18: 168 178.

69. Egelman E.H. The structure of F-actin. J. Muscle Res. Cell Motil. 1985. 6 (2): 129-51.

70. Eisenhofer G., Coughtrie M.W., Goldstein D.S. Dopamine sulphate: an enigma resolved. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 1999. 26: 41 53.

71. Falck B.5 Owman C. A detailed methodological description of the fluorescence method for the cellular localization of biogenic monoamines. Acta Univ. Lundensds. 1965. 11:7-49.

72. Faix J., Rottner K. 2006. The making of filopodia. Curr. Opin Cell Biol. 18: 18 -25.

73. Fechheimer M, Zigmond S.H. Changes in cytoskeletal proteins of polymorphonuclear leukocytes induced by chemotactic peptides. Cell Motil. 1983.3:349-361.

74. Ferencik M., Stvrtinova V. Is the immune system our sixth sense? Relation between the immune and neuroendocrine systems. Bratisl. Lek. Listy. 1997. 98 (4): 187-98.

75. Fisher G.W., Conrad P.A., DeBiasio R.L., Taylor D.L. Centripetal transport of cytoplasm, actin, and the cell surface in lamellipodia of fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 1988. 11: 235-247.

76. Fomproix, N., and P. Percipalle. An actin-myosin complex on actively transcribing genes. Exp Cell Res. 2004. 294: 140-8.

77. Forshner P., Smith S.J. Actions of cytochalasins on the organization of actin filaments and microtubules in a neuronal growth cone. J. Cell Biol. 1988. 107: 1505- 1517.

78. Furmidge L., Tong Z.Y., Petry N., Clark D. Effects of low, autoreceptor selective doses of dopamine agonists on the discriminative cue and locomotor hyperactivity produced by d-amphetamine. J. Neural. Transm. Gen. Sect. 1991. 86(1): 61 -70.

79. Gainetdinov R.R., Jones S.R., Fumagalli F., Wightman R.M., Caron M.G. Reevaluation of the role of the dopamine transporter in dopamine system homeostasis. Brain Res. Brain Res. Rev. 1998. 26 (2-3): 148 53.

80. Gettemans J., Van Impe K., Delanote V., Hubert T. Vandekerckhove J., De Corte V. Nuclear actin-binding proteins as modulators of gene transcription. Traffic. 2005. 8: 847 857.

81. Gloushankova N.A., Krendel M.F., Alieva N.O., Bonder E.M., Feder H.H., Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Dynamics of contacts between lamellae of fibroblasts: essential role of the actin cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95 (8): 4362-4367.

82. Goldstein D.S., Eisenhofer G., Kopin I.J. Sources and significance of plasma levels of catechols and their metabolites in humans. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003.305 (3): 800- 11.

83. Goldstein D.S., Holmes C. Neuronal source of plasma dopamine. Clin. Chem. 2008. 54(11): 1864-71.

84. Gonsior S., Platz S., Buchmeier S., Scheer U., Jockusch B., Hinssen H. Conformational difference between nuclear and cytoplasmic actin as detected by a monoclonal antibody J. Cell Sci. 1999. 112 : 797 809.

85. Giros B., Sokoloff P., Martres M.P., Riou J.F., Emorine L.J., Schwartz J.C. Alternative splicing directs the expression of two D2 dopamine receptor isoforms. Nature. 1989. 342 (6252): 923 926.

86. Giros B., Martres M.P., Pilon C., Sokoloff P., Schwartz J.C. Shorter variants of the D3 dopamine receptor produced through various patterns of alternative splicing. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. 176 (3): 1584- 1592.

87. Grace A.A., Floresco S.B., Goto Y., Lodge D.J. Regulation of firing of dopaminergic neurons and control of goal-directed behaviors. Trends Neurosci. 2007.30(5): 220-7.

88. Grumet M., Lin S. A platelet inhibitor protein with cytochalasin-like activity against actin polymerization in vitro. Cell. 1980. 21: 439 444.

89. Haarer B.K., Lillie S.H., Adams A.E.M., Magdolen V., Bandlow W., Brown S.S. Purification of profilin from Saccharomyces cerevisiae and analysis of profilin-deficient cells. J.Cell Biol. 1990. 110: 105 114.

90. Hartwig J.H, Shevlin P. The architecture of actin filaments and the ultrastructural location of actin-binding protein in the periphery of lung macrophages. J Cell Biol. 1986. 103: 1007 1020.

91. Hartwig, J.H., Bokoch, G.M., Carpenter, C.L., Janmey, P.A., Taylor, L.A., Toker, A., and Stossel, tP. Cell. 1995. 82: 643 653.

92. Heacock R.A., Powell W.S. Adrenochrome and related compounds. Progress in Medicinal Chemistry/Ed. by G.P. Ellis, G.B. West. Amsterdam, London, N.Y.: North-Holland Publishing Company. 1973. 9: 275 340.

93. Heacock C.S, Eidsvoog K.E, Bamburg J.R. The influence of contact-inhibited growth and of agents which alter cell morphology on the levels of G-and F-actin in cultured cells. Exp Cell Res. 1984. 153: 402 412.

94. Hegde S.S., Chen C.J., Lokhandwala M.F. Involvement of endogenous dopamine and DA-1 receptors in the renal effects of atrial natriuretic factor in rats. Clin. Exp. Hypertens A. 1991. 13 (3): 357 69.

95. Heiss, S.G., and Cooper, J.A. Regulation of capZ an actin capping protein of chicken muscle anionic phospholipids. Biochemistry. 1991. 30: 8753 8758.

96. Hoglund A.S, Karlsson R., Arro E., Fredriksson B.A., Lindberg U. Visualization of the peripheral weave of microfilaments in glia cells. J Muscle Res Cell Motil. 1980. 1: 127-146.

97. Holmes K.C., Popp D., Gebhard W., Kabsch W. Atomic model of the actin filament. Nature. 1990. 347 (6288): 44 49.

98. Hortsch M., Homer, D., Malhotra, J.D., Chang, S., Frankel, J., Jeffors, G., and Dubreuil, R.R. J. Cell Biol. 1998. 142:251 -261.

99. Holzinger A. 2001. «Jasplakinolide. An Actin-Specific Reagent that Promotes Actin Polymerization». In Cytoskeleton Methods and Protocols, Ray H. Gavin, ed., SpringerLink. 161 (3): 109- 120.

100. Hu, P., S. Wu, and N. Hernandez. A role for beta-actin in RNA polymerase III transcription. Genes Dev. 2004. 18: 3010 5.

101. Hurd Y.L., Suzuki M., Sedvall G.C. D1 and D2 dopamine receptor mRNA expression in whole hemisphere sections of the human brain. J. Chem. Neuroanat. 2001. 22 (1-2): 127- 137.

102. Ikemoto S., Panksepp J. The role of nucleus accumbens dopamine in motivated behavior: a unifying interpretation with special reference to reward-seeking. Brain Res. Brain Res. Rev. 1999. 31 (1): 6 41.

103. Isenberg G., G.Isenberg . Actin-binding proteins lipid interactions. J.Muscle Res. Cell Motil. 1991. 12: 136 - 144.

104. Ishikawa H., Bischoff R., Holtzer H. Formation of arrowhead complexes with heavy meromyosin in a variety of cell types. J. Cell. Biol. 1969. 43 (2): 312-28.

105. Janmey P.A., lida K., Yin H.L, and Stossel T.P. J. Biol. Chem. 1987. 262: 12228- 12236.

106. Janmey, P.A. Annu. Rev. Phvsiol. 1994. 56: 169 191.

107. Janmey P.A., Chaponnier C. Medical aspects of the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell Biol. 1995. 7:111 117.

108. Janmey, P.A. Physiol. Rev. 1998. 78: 763 781.

109. Jockusch B. M., Schoenenberger C.A., Stetefeld J., Aebi U. Tracking down the different forms of nuclear actin. Trends Cell Biol. 2006. 16: 391 -396.

110. Kabsch W., Mannherz H. G., Suck D., Pai E. F., Holmes H. C. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature. 1990. 347: 37 44.

111. Kang F., Purich D.L., and Southwick F.S. Proflin promotes barbedend actin flament assembly without lowering the critical concentration. J. Biol. Chem. 1999. 274: 36963-36972.

112. Katira P., M.N. Zaman and R.T. Bonnecaze. How Changes in Cell Physical Properties Induce Cancerous Behavior. Phys. Rev. Lett. 2012. 108 (2): 028103

113. Kebabian J.W., Calne D.B. Multiple receptors for dopamine. Nature. 1979. 277 (5692): 93 96.

114. Khaitlina S. Yu. Functional specificity of actin isoforms. Int. Rev. Cytol. 2001.202: 35-98.

115. Kiuchi T., Nagai Tomoaki, Ohashi K., and Mizuno K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. J. Cell Biol. 2011. 193 (2): 365-380.

116. Kisela K., Philimonenko A., Philimonenko V., Janacek J., Kahle M., Hozak P. Nuclear distribution of actin and myosin I depends on transcriptional activity of the cell. Histochem. Cell Biol. 2005. 124: 347 358.

117. Korn, 1982 Korn E.D. Actin polymerization and its regulation by proteins from nonmuscle cells. Physiol. Rev. 1982. 62 (2): 672 737.

118. Korn E.D., Carlier M.-F., Pantaloni D. Actin polymerization and ATP hydrolysis. Science. 1987. 238 (4827): 638-644.

119. Koestler S.A., Rottner K.} Lai F., Block J., Vinzenz M., and Small J.V. Fand G-actin concentrations in lamellipodia of moving cells. PLoS ONE. 2009. 4: e4810.

120. Krauss S. W., Heald R., Lee G., Nunomura W., Gimm J. A., Mohandas N., Chasis J. A. Two distinct domains of protein 4.1 critical for assembly of functional nuclei in vitro. J. Biol. Chem. 2002. 277: 44 339 44 346.

121. Kucik D.F., Kuo C.S., Elson E.L., Sheets M.P. Preferential attachment of membrane glycoproteins to the cytoskeleton at the leading edge of lamella. J. Cell Biol. 1991. 114: 1029- 1036.

122. Kukalev A., Nord Y., Palmberg C., Bergman T., Percipalle P. Actin and hnRNP U cooperate for productive transcription by RNA polymerase II. Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. 12: 238-244.

123. Le Moine C., Normand E., Guitteny A.F., Fouque B., Teoule R., Bloch B. Dopamine receptor gene expression by enkephalin neurons in rat forebrain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1990. 87 (1): 230 234.

124. Le Moine C., Bloch B. Expression of the D3 dopamine receptor in peptidergic neurons of the nucleus accumbens: comparison with the D1 and D2 dopamine receptors. Neuroscience. 1996. 73 (1): 131 143.

125. Lee J., Leonard M., Oliver T., Ishihara A., Jacobson K. Traction forces generated by locomoting keratocytes J. Cell Biol. 1994. 127: 1957 1964.

126. Li J., Zhu M., Manning-Bog A.B., Di Monte D.A., Fink A.L. Dopamine and L-dopa disaggregate amyloid fibrils: implications for Parkinson's and Alzheimer's disease. FASEB J. 2004. 18 (9): 962 4.

127. Low I., Dancker P., Wieland T. Stabilization of F-actin by phalloidin reversal of the destabilizing effect of cytochalasin. B. FEBS lett. 1975. 54: 253 -265.

128. Maclean-Fletcher S., Pollard T.D. Mechanism of action of cytochalasin B on actin. Cell 1980. 20: 329 341.

129. Magargal W.W., Lin S. Transformation-dependent increase in endogenous cytochalasin-like activity in chicken embryo fibroblasts infected by Rous sarcoma virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. 83: 8201 8205.N

130. Maguire P.A., Druse M.J. The influence of cholesterol on synaptic fluidity and dopamine uptake. Brain Res. Bull. 1989. 22 (2): 431 7.

131. Malacombe M., Bader M. F., Gasman S. Exocytosis in neuroendocrine cells: new tasks for actin. J. Histochem. Cytochem. 2006. 32: 973 981.

132. Malawista S.E., De Boisfleury Chevance A. The cytokineplast: purified, stable, and functional motile machinery from human blood polymorphonuclear leukocytes. J. Cell Biol. 1982. 95 (3): 960 973.

133. Mannhers H.G., Goody R.S., Konrad M., Nowak E. Interaction of bovine pancreatic deoxyribonuclease I and skeletal muscle actin. Eur. J. Biochem. 1980. 104: 367-379.

134. Mazzocci C., Benos D. J., Smith P. R. Interaction of epithelial ion channels with the actin-based cytoskeleton. Amer. J. Physiol. Renal Physiol. 2006. 291: F1113 -F1122.

135. McLaughlin P.J., Gooch J.T., Mannherz H.G., Weeds A. G. Structure of gelsolin segment 1-actin complex and the mechanism of filament severing. Nature. 1993.364:685-692.

136. Meador-Woodruff J.H., Mansour A., Bunzow J.R., Van Tol H.H., Watson S.J., Civelli O. Distribution of D2 dopamine receptor mRNA in rat brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989. 86 (19): 7625 7628.

137. Mezey E., Eisenhofer G., Harta G., Hansson S., Gould L., Hunyady B., Hoffman B.J. A novel nonneuronal catecholaminergic system: exocrine

138. Novak I.L, Slepchenko B.M, Mogilner A. Quantitative analysis of G-actin transport in motile cells. Biophys J. 2008. 95: 1627 1638.

139. Negulyaev Yu. A., Vedernikova E. A., Maximov A. V. Disruption of actin filaments increases the activity of sodium-conducting channels in human myeloid leukemia cells. Mol. Biol. Cell. 1996. 7: 1857 1864.

140. Negulyaev Yu. A., Khaitiina S. Yu., Hinssen H., Shumilina E. V., Vedernikova E. A. Na channel activity in leukemia cells is directly controlled by actiripolymerization. J. Biol. Chem. 2000. 275: 40933 -40937.

141. Nieoullon A., Coquerel A. Dopamine: a key regulator to adapt action, emotion, motivation and cognition. Curr. Opin. Neurol. 2003. 2: S3 9.

142. Oberbeck R. Therapeutic implications of immune-endocrine interactions in the critically ill patients. Curr. Drug. Targets Immune Endocr. Metabol. Disord. 2004.4(2): 129-39.

143. Oberbeck R. Catecholamines: physiological immunomodulators during health and illness. Curr. Med. Chem. 2006. 13 (17): 1979 89.

144. Oliver T., Lee J., Jacobson K. Forces exerted by locomoting cells. Semin. Cell Biol. 1994. 5 (3): 139- 147.

145. Otterbein L.R., Graceffa P., Dominquez R. The crystal structure of uncomplexed actin in the ADP state. Science. 2001. 293: 708 -711.

146. Ou G.S., Chen Z.L., Yuan M. Jasplakinolide reversibly disrupts actin filaments in suspension-cultured tobacco BY-2 cells. Protoplasma. 2002. 219 (3-4): 168- 175.

147. Paavilainen V.O., E. Bertling S. Falck and P. Lappalainen. Regulation of cytoskeletal dynamics by actin-monomer-binding proteins. Trends Cell Biol. 2004. 14:386-94.

148. Pantaloni D., and Carlier M.F. How proflin promotes actin flament assembly in the presence of thymosin beta 4. Cell. 1993. 75: 1007-1014.

149. Pantaloni D., Le Clainche C., Carlier M.F. Mechanism of actin-based motility. Science. 2001. 292: 1502- 1506.

150. Pardee J.D., Spudich J.A. In: Methods in cell Biology. Acad. Press. New York. London. 1982. 24 (part A): 271 289.

151. Papoulas O., Beck S. J., Moseley S. L., McCallum C. M., Sarte M., Shearn A., Tamkun J. W. The Drosophila trithorax group proteins BRM, ASH1 and ASH2 are subunits of distinct protein complexes. Development. 1998.125: 3955 -3966.

152. Pastuszko A., Gordon-Majszak W., Dabrowiecki Z. Dopamine uptake in striatal synaptosomes exposed to peroxidation "in vitro". Biochem. Pharmacol. 1983.32(1): 141 -6.

153. Patterson M.L., Smith C.D., Kimura L.H. , Britton B.A. , Carmeli S. Action of tolitoxin on cell morphology, cytoskeletal organization, and actin polimerization. Cell Motil. Cytoskel. 1993. 24: 39 48.

154. Pawlak G. and D.M. Helfman. Cytoskeletal changes in cell transformation and tumorigenesis. Curr. Opin. Genet. Dev.2001. 11 (1): 41 47.

155. Pederson T., Aebi U. Nuclear actin extends, with no contraction in sight. Mol. Biol. Cell. 2005. 16: 5055 5060.

156. Pederson T. As functional nuclear actin comes into view, is it globular, filamentous, or both? J. Cell Biol. 2008. 180: 1061 1064.

157. Pedrosa R., Soares-da-Silva P. Oxidative and non-oxidative mechanisms of neuronal cell death and apoptosis by L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and dopamine. Br. J. Pharmacol. 2002. 137 (8): 1305 13.

158. Percipalle P., Visa N. Molecular functions of nuclear actin in transcription. J. Cell Biol. 2006. 172: 967-971.

159. Pereda A., Triller A., Korn H., Faber D.S. Dopamine enhances both electrotonic coupling and chemical excitatory postsynaptic potentials at mixed synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89 (24): 12088 92.

160. Pereda A.E., Nairn A.C., Wolszon L.R., Faber D.S. Postsynaptic modulation of synaptic efficacy at mixed synapses on the Mauthner cell. J. Neurosci. 1994. 14 (6): 3704-12.

161. Peruski A.H., Peruski L.F. Immunological methods for detection and identification of infection disease and biological warfare agents. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. 10: 506-513.

162. Phillips P.E., Walton M.E., Jhou T.C. Calculating utility: preclinical evidence for cost-benefit analysis by mesolimbic dopamine. Psychopharmacology. 2007. 191 (3): 483-95.

163. Philimonenko V.V., Zhao J., Iben S., Dingova H., Lanerolle P., Kysela K., Hozak P., Kahle M. Grummt I. Nuclear actin and myosin I are required for RNA polymerase I transcription. Nat. Cell Biol. 2004. 6: 1165 1172.

164. Picard J.J. Utrastructure of the cement gland of Xenopus laevis. J. Morphol. 1976. 148 (2): 193-208.

165. Pollard T.D, Blanchoin L., Mullins R.D. Molecular mechanisms controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2000. 29: 545-576.

166. Pollard T.D., and Borisy G.G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin flaments. Cell. 2003. 112: 453-465.

167. Pollard T. D., Cooper J. A. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Annu Rev. Biochem. 1976. 55: 987 -1035

168. Pollard T.D., Cooper J.A. Actin and actin-binding proteins. A critical evaluation of mechanisms and functions. Ann. Rev. Biochem. 1986. 55: 987 -1035.

169. Pollard, Mooseker. The Journal of Cell Biology 1981.88 (3): 654 659.

170. Pollard T.D., Craig S.W. Mechanism of actin polymerization. Trends Biochem. Sci. 1982. 7: 55 58.

171. Pollard T.D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. J Cell Biol. 1986. 103:2747-2754.

172. Pollard T.D., Blanchoin L., Mullins R.D. Molecular mechanism controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000. 20: 545 576.

173. Pollard T.D., Borisy G.G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 2003. 113: 453 465.

174. Prasad G.L. Regulation of the expression of tropomyosin and actin cytoskeleton by ras transformation. Methods Enzymol. 2005. 407: 410 422.

175. Robinson R.G., Mejillano M., Le V.P., Burtnick L.D., Yin H.L., Choe S. Domain movement in gelsolin: a calcium-activated switch. Science. 1999. 286: 1939-1942.

176. Rondou P., Haegeman G., Van Craenenbroeck K. The dopamine D4 receptor: biochemical and signalling properties. Cell. Mol. Life Sci. 2010. 67 (12): 1971 -1986.

177. Rosenmund C., Westbrook G.L. Calcium-induced actin depolymerization reduces NMDA channel activity. Neuron. 1993. 10: 805 814.

178. Safer D., Elzinga M., Nachmias V.T. Thymosin B4 and Fx, an actin sequestering peptide, are indistinguishable. J. Biol. Chem. 1991. 266: 4029 -4032.

179. Safer D., and Nachmias V.T. Beta thymosins as actin binding peptides. Bioessays. 1994. 16:473-479.

180. Salgado-Pineda P., Delaveau P., Blin O., Nieoullon A. Dopaminergic contribution to the regulation of emotional perception. Clin. Neuropharmacol. 2005.28 (5): 228-37.

181. Schoenenberger C.A., Buchmeier S., Boerries M., Sutterlin R., Aebi U., Jockusch B. Conformation-specific antibodies reveal distinct actin structures in the nucleus and the cytoplasm. J. Struct. Biol. 2005. 152: 157 168.

182. Schutt C.E., Myslik J.C., Rozycki M.D., Goonesekere N.C., Lindberg U. The structure of crystalline profiling-á-actin Nature. 1993. 365: 810 816.

183. Shen X., Mizuguchi G., Hamiche A., Wu C. A chromatin remodelling complex involved in transcription and RNA processing. Nature. 2000. 406: 541 -544.

184. Sheterline P., Clayton J., Sparrow J. Actin. Protein Profile. Oxford: Oxford Univ. Press. 1998. 271 p.

185. Shibasaki Y., Ishihara H., Kizuki N., Asano T., Oka Y. and Yazaki Y. J. Biol. Chem. 1997. 272: 7578 7581.

186. Shumilina E.V., Negulyaev Yu.A., Morachevskaya E.A., Hinssen H., Khaitlina S.Yu. Regulation of sodium channel activity by capping of actin filaments. Mol. Biol. Cell. 2003. 14: 1709 1716.

187. Sokoloff P., Giros B., Martres M.P., Bouthenet M.L., Schwartz J.C. Molecular cloning and characterization of a novel dopamine receptor (D3) as a target for neuroleptics. Nature. 1990. 347 (6289): 146 151.

188. Small J.V., Isenberg G., Celis J.E. Polarity of actin at the leading edge of cultured cells. Nature. 1978. 272 (5654): 638 639.

189. Small J.V. The actin cytoskeleton. Electron. Microsc. Rev. 1988. 1 (1): 155 -174.

190. Small J.V., Herzog M., Anderson K. Actin filament organization in the fish keratocyte lamellipodium. J. Cell Biol. 1995. 129 (5): 1275 1286.

191. Small J. V., Rottner K., Kaverina I. Functional design in the actin cytoskeleton. Curr. Opin. Cell. Biol. 1999. 11: 54 60.

192. Small, J.Y., and G.P. Resch. The comings and goings of actin: coupling protrusion and retraction in cell motility. Curr Opin Cell Biol. 2005. 17: 517 — 23.

193. Smith P.R., Fowler W.E., Pollard T.D., Aebi U. Structure of the actin molecule determined from electron micrographs of crystalline actin sheets with a tentative alignment of the molecule in the actin filament. J. Mol. Biol. 1983. 167 (3): 641 -660.

194. Spector I., Shochet N.R., Blasberger D., Kashman Y. Latrunculins: Novelmarine macrolides that disrupt microfilament organization and affect cell113growth. I. Comparison with cytochalasin D. Cell Motil. 1989. Cytoskel. 13: 127 -144.

195. Starkley J.R. Cell-matrix interactions during tumor invasion. Cancer Metastasis Rev. 1990. 3: 127- 141.

196. Stone T.W. CNS neurotransmitters and neuromodulators: dopamine. CRC Press LLC. Florida. 1996. 258 p.

197. Straub F.B. In studies from the Institute of Medical Chemistry University Szeged / F.B. Straub // Szent-Gyorgyi A. ed., S. Krager. Basel. 1942. V. II. P. 3 -15.

198. Sturmer K., Baumann O. Immunolocalization of a putative unconventional myosin on the surfaceof motile mitochondria in locust photoreceptors. Cell Tissue Res. 1998. 292: 219-227.

199. Su Y., Kondrikov D., Block E. R. Cytoskeletal regulation of nitric oxide synthase. Cell Biochem. Biophys. 2005. 43: 439 449.

200. Sunahara R.K., Niznik H.B., Weiner D.M., Stormann T.M., Brann M.R., Kennedy J.L., Gelernter J.E., Rozmahel R., Yang Y.L., Israel Y. Human dopamine D1 receptor encoded by an intronless gene on chromosome 5. Nature. 1990. 347 (6288): 80 83.

201. Svitkina, T.M., E.A. Bulanova, O.Y. Chaga, D.M. Vignjevic, S. Kojima, J.M. Vasiliev, and G.G. Borisy. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendric network. J Cell Biol. 2003. 160: 409 21.

202. Symons M.H., Mitchison T.J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J. Cell Biol. 1991. 114 (3): 503-513.

203. Takeuchi H., Ara G., Sausville E., Teicher B. Jasplakinolide: interaction with radiation and hyperthermia in human prostate carcinoma and Lewis lung carcinoma. Cancer Chemother. Pharmacol. 1998. 42 (6): 491 -496.

204. Tanenbaum S.E. Cytochalasin: biochemical and cell biological aspects. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam. 1978. 326 pp.

205. Tilney L.G., Bonder E.M., Colluccio L.M., Mooseker M.S. Actin from Thyone sperm assembles on only one end of an actin filament. A behavior regulated by profilin. J. Cell. Biol. 1983. 97: 112 124.

206. Tilney L.G., Hatano S., Ishikawa H., Moosiker M.S. The polymerization of actin: its role in the generation of the acrosome process in certain echinoderm sperm. J. Cell Biol. 1973. 59: 109- 126.

207. Theriot J.A., Mitchison T.J. Actin microfilament dynamics in locomoting cells. Nature. 1991. 352: 126- 131.

208. Ujihara Y., Miyazaki H., Wada Sh. Morphological study of fibroblasts treated with cytochalasin D and colchicine using a confocal scanning microscopy. J. Physiol. Sci. 2008. 58: 499 506.

209. Urbanic E., Ware B.R. Actin filament capping and cleaving activity of cytochalasing B, D, E and H. Arch. Bioch. Bioph. 1989. 269: 181 187.

210. Uttamapinant C., White K.A., Baruah H., Thompson S., Fernandez-Suarez M., Puthenveetil S., Ting A.Y. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2010. 107 (24): 1091410919.

211. Van Tol H.H., Bunzow J.R., Guan H.C., Sunahara R.K., Seeman P., Niznik H.B., Civelli O. Cloning of the gene for a human dopamine D4 receptor with high affinity for the antipsychotic clozapine. Nature. 1991. 350 (6319): 610 -614.

212. Vandekerckhove J., Weber K. Actin amino-acid sequences. Comparison of actins from calf thymus, bovine brain, and SV40-transformed mouse 3T3 cells with rabbit skeletal muscle actin. Eur. J. Biochem. 1978. 90 (3): 451 -462.

213. Vandekerckhove J., Weber K. Chordate muscle actins differ distinctly from invertebrate muscle actins. The evolution of the different vertebrate muscle actins. J. Mol. Biol. 1984. 179 (3): 391-413.

214. Vindis C., Seguelas M.H., Lanier S., Parini A., Cambron C. Dopamine induces ERK activation in renal epithelial cells through H202 produced by monoamine oxidase. Kidney Int. 2001. 59: 76 86.

215. Vizi E.S. Role of high-affinity receptors and membrane transporters in nonsynaptic communication and drug action in the central nervous system. Pharmacol. Rev. 2000. 52 (1): 63 89.

216. Wada A., Fukuda M., Mishima M., Nishida E. Nuclear export of actin: a novel mechanism regulating the subcellular localization of a major cytoskeletal protein. EMBO J. 1998. 17: 1635 1641.

217. Wang Y.L. Exchange of actin subunits at the leading edge of living fibroblasts: possible role of treadmilling. J. Cell Biol. 1985. 101 (2): 597 602.

218. Weiner D.M., Levey A.I., Sunahara R.K., Niznik H.B., O'Dowd B.F., Seeman P., Brann M.R. D1 and D2 dopamine receptor mRNA in rat brain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991.88 (5): 1859- 1863.

219. Wegner, A. Treadmilling of actin at physiological salt concentration I An analysis of the critical concentrations of actin filaments. J Mol. Biol. 1982. 161: 607-615.

220. Welsh C.F., Zhu, D., and Bourguignon, L.Y. Interaction of CD44 variant isoforms with hyaluronic acid and the cytoskeleton in human prostate cancer cells. J. Cell Physiol. 1995. 164: 605 612.

221. Winder S. J., Ayscough K. R. Actin-binding proteins. J.Cell Sci. 2005. 118: 651 -654.

222. Yamaguchi H., Condeelis J. Regulation of the actin cytoskeleton in cancer cell migration and invasion. Biochim. Biophys acta. 2007. 1773: 200 220.

223. Yu J., Fischman, D.A., and Steck, T.L., J. Supramolec. Struct. 1973. 1: 233 -248.

224. Zhao K., Wang W., Rando O. J., Xue Y., Swiderek K.> Kuo A., Crabtree G. R. Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling. Cell. 1998. 95: 625 -636.

225. Список публикаций по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах

226. Мошков Д.А., Павлик JT.JL, Шубина B.C., Парнышкова Е.Ю., Михеева И.Б. Цитоскелетная регуляция клеточной функции дофамином // Биофизика. 2010. Т. 55, № 5. С.: 850 856.

227. Парнышкова Е.Ю., В.П. Лавровская, E.H. Безгина, Л.Л. Павлик, Э.И. Лежнев, Д.А. Мошков. Морфологические основы влияния дофамина на жизнеспособность опухолевых клеток НЕр-2 // Морфология. 2011. Т. 140, №6. С.: 69-74.

228. Парнышкова Е.Ю., Лавровская В.П., Л.Л. Павлик, Э.И. Лежнев, Д.А. Мошков. Цитохимическая визуализация дофамина как способ оценки содержания глобулярного актина в цитозоле живых клеток // Биологические мембраны. 2012. Т. 29, № 3. С.: 209 214.

229. Е.Ю. Парнышкова, E.H. Безгина, Л.И. Казакова, И.М. Вихлянцев, Н.Р. Тирас, Л.Л. Павлик, Д.А. Мошков. Дофамин как возможное вещество для онкотерапии и для количественной оценки цитозольного Г-актина // Биофизика. 2012. Т. 57, № 5. С.: 796 804.

230. Мошков Д.А., Романченко С.П., Парнышкова Е.Ю., E.H. Безгина, Заичкина С.И., Павлик Л.Л. Эффект дофамина на клетки асцитной карциномы Эрлиха // Бюллетень Экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т. 154, № 11, С. 646-651.

231. Е.Ю. Парнышкова, E.H. Безгина, В.П. Лавровская, Л.Л. Павлик, Э.И. Лежнев, Д.А. Мошков. Морфологические исследования раковых клеток ТНР-1 in vitro под действием дофамина // Морфология. 2012. Т. 142,,№ 6, С. 41-471. Статьи в сборниках

232. Париышкова Е.Ю., Лавровская В.П. Цитохимическая визуализация глобулярного актина при малигнизации клеток // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: Международная конференция. 24-26 мая 2011, Пущино. Т. 1.С.: 420-426.

233. Париышкова Е.Ю. Ультраструктурные исследования токсического действия дофамина на опухолевые клетки // 15-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология наука XXI века". 18-22 апреля 2011, Пущино. С.: 154.

234. Париышкова Е.Ю. Взаимодействие дофамина со злокачественными клетками, растущими в суспензии // IV Международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения-2011». 7-9 декабря 2011, Санкт-Петербург. С.: 149.

235. Париышкова Е.Ю. Действие дофамина на злокачественные культуры клеток // 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология наука XXI века". 16-21 апреля 2012, Пущино. С.: 435.

236. Париышкова Е.Ю. Цитотоксическое действие дофамина на опухолевые клетки // Международная конференция молодых ученых

237. Экспериментальная и теоретическая биофизика», 22-24 октября 2012, Пущино. С.: 23.1. Патенты

238. Мошков Д.А., Парнышкова Е.Ю. «Средство, обладающее цитотоксической активностью по отношению к раковым клеткам человека в культуре» (Яи 2453309 С1).

239. Мошков Д.А., Парнышкова Е.Ю., Романченко С.П. «Средство для лечения злокачественных асцитных опухолей» (БШ 2464974 С1)1. По данной тематике также:

240. Получен У.М.Н.И.К. по теме: «Разработка новой концепции в созданиионкотерапевтических препаратов» автор: Парнышкова Е.Ю.1. БЛАГОДАРНОСТИ

241. В заключение я хочу искренне поблагодарить моих научных руководителей профессора, д.б.н. Мошкова Дмитрия Алексеевича и д.б.н. Павлик Любовь Леоновну за постоянную помощь в проведении работы и подготовке диссертации, ценные советы и рекомендации.

242. Хочу поблагодарить зав. лаборатории цитотехнологии профессора,д.т.н. Лежнева Энрика Ивановича и сотрудницу его лаборатории Лавровскую

243. Заичкиной Светлане Игоревне и ее сотруднику Романченко Сергею

244. Я благодарна своим родителям и родным за постоянную поддержку и помощь, а также моим друзьям Шаталину Юрию Викторовичу и Шубиной Виктории Сергеевне за инеоценимые советы.