Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механической взаимодействие актина и миозина скелетных мышц в искусственных подвижных системах

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механической взаимодействие актина и миозина скелетных мышц в искусственных подвижных системах"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 577.353

Машанов Григорий Исаакс

V

МЕХАНИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АКТИНА И МИОЗИНА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ В ИСКУССТВЕННЫХ ПОДВИЖНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.02 - биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Екатеринбургском филиале инстит физиологии Уральского Отделения Российской Академии Наук.

Научные руководители:

доктор биол. наук B.C. Мархасин кандидат биол. наук С.Ю. Бершицкий

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук, профессор Н.Б. Гусев

доктор биол. наук

З.А. Подлубная

Ведущая организация: Государственный Научный Центр РФ -

Институт Медико-Биологических Проблем

Защита состоится 23 октября 1997 г. в 15 час. 30 мин. на заседании Диссертационного Совета К. 053.05.68 при Москова Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119899, г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологичеси факультет, кафедра биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологически факультета Московского Государственного Университета им. № Ломоносова.

Автореферат разослан

OS" OlMJMiA cLtf

'¡М 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биол. наук Б.А. Гуляев

Актуальность проблемы.

Взаимодействие актина и миозина лежит в основе подвижности многих биологических объектов. В мышечных клетках эти белки образуют трехмерную структуру - саркомер, состоящую из набора толстых нитей миозина, перекрывающихся с набором тонких нитей актина. Скольжение актиновых нитей вдоль миозиновых нитей происходит в результате циклического взаимодействия концевых частей молекул миозина, называемых поперечными мостиками, с актином. Этот процесс обеспечивается энергией гидролиза АТФ.

В настоящее время хорошо изучены основные характеристики сокращения мышц и волокон - в частности, зависимости длина-сила, сила-скорость и скорость-жесткость. Полученные данные позволили сформировать современную теорию мышечного сокращения, сформулированную в работах Хаксли, Симмонса и других авторов.

Однако для подтверждения теории потребовалось исследовать механические свойства отдельных молекул миозина, взаимодействующих с филаментом актина. Разработанные в последние годы уникальные методы искусственных подвижных систем (ИПС) и оптической ловушки позволили измерить длину силогенерирующего шага отдельных поперечных мостиков и развиваемое мостиками напряжение. Было исследовано движение филаментов актина по поверхности, покрытой молекулами миозина или его субфрагментами. Но попытки измерить дистанцию, на которую молекулы миозина сдвигают актин за один цикл гидролиза АТФ, дали противоречивые результаты.

Были предприняты попытки измерить эту дистанцию, используя импульсный фотолиз инактивированной АТФ в демембранизированных мышечных волокнах. В этом случае миозин способен начать цикл гидролиза АТФ только после фотолиза ее ультрафиолетовым светом. К сожалению, большое количество высвобождающейся АТФ и высокая концентрация мышечных белков в волокне затрудняют интерпретацию событий, связанных с одним циклом гидролиза АТФ.

Поэтому на сегодняшний день остается ряд вопросов, связанных < механохимическим циклом молекулы актомиозина. В частности, измерение характеристик отдельных молекул и согласование этих данных в рамка? модели взаимодействия миозина и актина.

Цель работы состояла в изучении молекулярного механизме механического взаимодействия актина и миозина и построении модели индивидуальных поперечных мостиков, взаимодействующих с филаментом актина.

Научная новизна:

- Новым методом была измерена дистанция, на которую молекулы миозина сдвигают филамент актина за один цикл гидролиза АТФ в изотонических условиях.

- Установлено, что за один цикл гидролиза АТФ миозин может совершить только один силогенерирующий шаг при нулевой нагрузке.

- Впервые было измерено время от момента связывания АТФ одиночной молекулой актомиозина до момента механического разрыва связи актин-миозин в условиях внешней нагрузки.

- Разработана математическая модель, основанная на описании взаимодействия индивидуальных поперечных мостиков (ПМ) с филаментом актина, позволяющая предсказать поведение актомиозиновых комплексов, которое в настоящее время невозможно проверить экспериментально.

- Предположено и доказано в модели, что гиперболическая форма зависимости сила-скорость возникает при взаимодействии небольшого (1520) числа молекул миозина с филаментом актина.

Научная и практическая ценность.

Настоящая работа носит экспериментальный и теоретический характер. Она посвящена одной из важных проблем биофизики - изучению молекулярного механизма взаимодействия актина и миозина. В результате

„з-

исследования получены принципиально новые данные, дополняющие современные представления о механизме мышечного сокращения.

Показано, что один цикл гидролиза АТФ связан с одним шагом поперечного мостика в изотонических условиях, что подвергалось сомнению в последние годы (Harada Y. et al., 1990; Irving M. et al., 1992; Ishijima A. et al., 1994).

С высокой точностью измерен размер шага поперечного мостика в условиях нулевой нагрузки.

Доказано, что между моментом связывания молекулы АТФ и механическим разъединением молекул актина и миозина существует определенная задержка (8-12 мс).

Разработан новый метод исследования механохимического цикла АТФ миозина в условиях ИПС, который может быть применен для широкого круга исследований свойств миозинов из различных типов мышц. Небольшие количества мышечной ткани, необходимые для приготовления белков, позволяют использовать этот метод для изучения мышечных белков, полученных при биопсии для изучении патологии скелетных мышц и сердца человека.

Разработан новый простой метод очистки тяжелого меромиозина непосредственно в рабочей камере, улучшающий качество экспериментов.

Разработанная модель адекватно воспроизводит результаты экспериментов in vitro и может быть применена без каких либо изменений для моделирования поведения мышечных волокон в различных механических условиях. Модель может быть использована для обучения студентов основам теории мышечного сокращения.

Апробаиия работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на XXIV Европейском Мышечном Конгрессе (Флоренция, 1995); XXV Европейском Мышечном Конгрессе (Монпелье, 1996); ученом совете института физиологии УрО РАН (Сыктывкар, 1996).

По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертаиии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и результатов экспериментов, описания модели и результатов ее тестирования, а также выводов. Диссертация изложена на 150 страницах, включая 24 рисунка и список литературы из 145 наименований.

Материал и методы исследования

Были исследованы механические свойства отдельных молекул актомиозина методами оптической ловушки и искусственных подвижных систем на установке в лаборатории доктора Моллоя в Йоркском Университете в Англии.

В экспериментах был использован растворимый в воде субфрагмент миозина - тяжелый меромиозин (ТММ), полученный частичным протеолизом миозина из быстрых скелетных мышц кролика. Проверка качества белков методом гель-электрофореза показала, что используемые растворы белков содержат только тяжелый меромиозин и глобулярный актин. Для визуализации отдельных филаментов актина, реполимеризованный актин был помечен флуоресцентным красителем -тетраметилродамин фаллоидином.

Перед экспериментом в проточную камеру, склеенную из предметного и покровного стекол (Рис. 1), заливали раствор ТММ, который оседал на покрытую нитроцеллюлозой поверхность. Для ингибирования поврежденных молекул, которые останавливают движение филаментов, был применен оригинальный метод: раствор глобулярного актина смешивали с раствором, содержащим АТФ (2 мМ) и хлорид калия (25 мМ), и заливали в камеру на несколько минут. Актин начинал полимеризоваться и взаимодействовать с миозином. Филаменты актина обратимо связывались с нормальными молекулами миозина и необратимо с испорченными молекулами. В результате испорченный миозин не мог влиять на меченые филаменты актина, применяемые в экспериментах.

Рис. 2 Изображение флуоресцирующих филаментов актина. Окружностью отмечена зона вспышек.

Для проведения экспериментов методом ИПС после очистки миозина в камеру заливали раствор меченых филаментов актина, которые оседали на поверхность и связывались с миозином в отсутствие АТФ. Изображение филаментов в поле зрения микроскопа показано на Рис. 2. Камеру устанавливали в микроскоп и добавляли раствор связанной АТФ, а именно диметоксибензоин эфир АТФ, сокращено ДМБ-АТФ.

Вспышки ультрафиолетового лазера подавали через объектив микроскопа (Рис. 3), который фокусировал луч в небольшое пятно диаметром 15-20 мкм, в центре поля зрения у поверхности стекла (окружность на рис. 2). Изображение движущихся филаментов было записано на видеопленку, а позже была измерена скорость движения каждого филамента актина в зоне вспышек.

После эксперимента для проверки качества актина и миозина в камеру заливали раствор, содержащий нормальную АТФ. Оценка производилась по скорости движения и фракции движущихся филаментов.

Было обработано 98 записей движения филаментов актина, вызванного вспышками лазера или добавлением в раствор обычной АТФ. Всего было измерено перемещение 460 филаментов.

Метод оптической ловушки был использован для измерения времени от момента связывания АТФ до момента разъединения молекул актина и миозина. Для этого также использовали раствор, содержащий только связанную АТФ. Для управления молекулой актина использовали шарики, покрытые испорченным миозином, который прочно связывал филамент актина. Шарики удерживались в нужной точке пространства давлением света, которое создавалось фокусированным через объектив микроскопа лучем инфракрасного лазера. Меняя позицию луча лазера и объектива, можно управлять положением шариков в трехмерном пространстве. Молекула меченого актина, плавающая в растворе, растягивалась между шариками в оптических ловушках и подводилась к шарику покрытому несколькими молекулами меромиозина на поверхности стекла (Рис. 4). В отсутствие свободной АТФ одна из молекул миозина связывалась с

лазер или 11У лазер

алогеновая лампа роточная камера •Ргт Манипулятор

^ "Объектив Зеркало 2

Телекамера 1

■Телекамера 2

^О^-Фотодиодная матрица

Рис. 3 Блок схема экспериментальной установки.

Рис. 4 Метод оптической ловушки. Молекула ТММ на поверхности шарика взаимодействует с филаментом актина, растянутым между двумя шариками, удерживаемыми в оптических ловушках.

актином. Для подачи вспышек ультрафиолетового света к месту соединения актина и миозина был использован кварцевый световод с диаметром кончика 5-10 мкм (Рис. 3). После одной из вспышек молекула миозина связывала АТФ и отсоединялась от актина. Взаимодействие молекулы актина и молекулы миозина регистрировали по положениюодного из шариков в оптической ловушке. Было измерено время от момента очередной вспышки до момента разъединения молекул. Также были измерены дистанция шага миозина и развиваемое напряжение в растворе, содержащем 2-10 мкМ обычной АТФ для сравнения наших результатов с полученными ранее.

Было обработано 12 записей взаимодействия одиночных молекул актина и миозина, полученных методом оптической ловушки.

Результаты

Разработанный нами метод ингибирования испорченных молекул миозина увеличивал фракцию движущихся филаментов с 30% до 95%, что очень важно при ограниченном числе филаментов, использовавшихся для анализа. Этот метод дает более высокие и стабильные результаты, чем применяемые ранее методы и не влияет на скорость движения актина.

Движение филаментов, инициированное фотолизом ДМБ-АТФ, было зарегистрировано только в пределах освещаемой ультрафиолетом области. Движение заканчивалось сразу после окончания периода вспышек. Была обнаружена линейная зависимость скорости движения филаментов от концентрации ДМБ-АТФ (рис. 5,а) при концентрации связанной АТФ до 1 мМ и от частоты вспышек (рис. 5,6). Вычисленная усредненная дистанция, на которую филамент актина смещался после каждой вспышки, не зависела от частоты вспышек и составила 10.5 нм в условиях, когда, по нашим нредноложениям, все молекулы миозина связывали АТФ после каждой вспышки.

Скорость движения филаментов актина в контрольных экспериментах при насыщающей концентрации свободной АТФ составила

0.35 1

0.3 -

0.25

о" 0.2 --

5

г —^

л

I-

о о о. о ы

О

0.15 --

0.1 --

0.05 --

0

0 1 2 Концентрация ДМБ-АТФ (мМ)

5 10 15 Частота вспышек (Гц)

Рис. 5 Зависимости скорости движения филаментов актина от:

(а)- концентрации ДМБ-связанной АТФ. (кружки,квадратики и треугольники соответствуют частоте вспышек 5,10 и 15 Гц). Вставка- зависимость дистанции, на которую смещается филамент актина после одной вспышки лазера, от концентрации ДМБ-АТФ. Дистания вычислена как расстояние, пройденное филаментами в

в среднем после вспышки при разной частоте вспышек;

(б) -частоты вспышек, (ромбы, квадратики, треугольники, крестики и кружки соответстсвуют концентрации ДМБ-АТФ

0.2, 0.5, 1, 1.5 и 2 мМ).

3.8±0.7 мкм с-' при 23°С, что совпадает с результатами других автор« Измеренные скорости движения филаментов в экспериментах со связанн АТФ и экпериментах с обычной АТФ не отличались значимо в разн] камерах и в разных участках одной и той же проточной камеры, ч свидетельствует о высокой повторяемости результатов экспериментов.

При изучении механических свойств отдельных молекул миози методом оптической ловушки было обнаружено, что миозин отсоединял от актина в среднем после 3-4 вспышки при концентрации ДМБ-АТФ С мМ. Следовательно, при данной концентрации 25-35% молекул миози! связывали АТФ после каждой вспышки. Время отсоединения актина ( миозина составило 8-12 мс. Также было замечено, что напряжение разрьи связи актин-миозин значительно меньше в растворе, содержащем ДМ! АТФ по сравнению с раствором, не содержащем нуклеотидов.

В растворе содержащем 2-10 мкМ обычной АТФ бьи зарегистрированы шаги мостиков длиной 10-15 нм и напряжение 1.8-2 п1 что совпадает с результатами, полученными ранее на этой же установке, свидетельствует о высокой воспроизводимости результатов экспериментов

Моделирование взаимодействия актина и поперечных мостиков

На основании литературных и полученных нами в экспериментах ь мышечных волокнах и ИПС данных была разработана модех взаимодействия индивидуальных мостиков с филаментом актин; Поведение каждого мостика определялось только набором условий дл совершения цикла гидролиза АТФ в зависимости от механических у слови! а именно, напряжением связи актин-миозин.

Получено хорошее количественное соответствие результате моделирования поведения 2-х и 3-х ПМ в условиях метода оптическо ловушки с результатами проведенных нами экспериментов (Рис. 6). Пр моделировании движения филаментов актина по поверхности, покрыто]

200 400

Время (мс)

1000 2000 3000 4000

Время (мс)

г3апись (15.08.95 N13)

1000 2000 3000 4000

Время (мс)

120 -Г Запись (11.08.95 N20)

1000 2000 3000 4000

Время (мс)

ы

н о о

X

ее О

200 -г

200 V

Запись (06.07.95 N13)

0 1000 2000 3000 4000

Д Время (мс)

1000 2000 3000 4000

Время (мс)

Модель

Эксперимент

о

Рис. 6 Результаты работы модели и результаты экспериментов с оптической ловушкой. По оси У дистанция, на которую шарик вытягивается из ловушки при взаимодействии с 1,2 и 3 ПМ соответственно.

молекулами миозина, средняя скорость движения составила 3.5 мкм с-', ч' близко к измеренной нами в экспериментах при 23°С.

Были имитированы эксперименты с фотолизом связанной АТФ, также получена линейная зависимость дистанции сдвига актина < фракции мостиков, связавших АТФ после вспышки. Усредненная дистанц] сдвига актина на один гидролиз АТФ составила 11 нм в условиях, когда в мостики связывают АТФ после вспышки, что близко к величине 10.5 н полученной нами в эксперименте.

Модель была исследована в условиях, когда к филаменту актина бы приложена внешняя нагрузка. Обнаружено, что зависимость сила-скорос имеет форму прямоугольной гиперболы (Рис. 7), характерную д] препаратов скелетных мышц и волокон. Гиперболическая зависимое сохранялась при уменьшении длины филамента до 0.5 мкм. При таю длине с филаментом актина взаимодействовали только 12-13 поперечнь мостиков одновременно.

Обсуждение

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что м применили новый метод - фотолиз инактивированной АТФ в искусственно подвижной системе для измерения дистанции, на которую молекул миозина сдвигают филамент актина за один цикл гидролиза АТФ. условиях, когда все мостики гидролизуют АТФ после каждой вспышки, внешняя и внутренняя нагрузки на филамент равны нулю. В этих у слови; перемещение филамента за одну вспышку составило 10.5 нм, что совпада« со значением шага мостика, измеренного методом оптической ловушки, данными других методов. Следовательно, один цикл гидролиза АТФ связа только с одним силогенерирующим шагом мостика, а не с несколькими, ка предполагают некоторые авторы.

При уменьшении концентрации ДМБ-АТФ мы наблюдали линейнс уменьшение дистанции, пройденной филаментами актина после каждо

Рис. 7 Моделирование движения филаментов с внешней нагрузкой. Зависимость сила-скорость при разной длине филамента актина. Толстая линия с кружками - гиперболическое уравнение Хилла с с параметрами а=0.25*Ро и Ь=0.25*Уо.

вспышки. В этой ситуации увеличивается фракция молекул миозш которые не связали АТФ и остались присоединенными к актину. Так молекулы создают внутреннюю нагрузку на филамент актиь Следовательно, дистанция смещения актина за один шаг мостика линей] зависит от внутренней нагрузки на филамент актина.

При анализе результатов, полученных методом оптической ловушь обнаружено существование задержки между моментом связывания АТ миозином и моментом разъединения филамента и мостш Предположительно, это связано с конформационными изменениями миозине до гидролиза АТФ, в результате которых уменьшается сродст миозина к актину. Следует отметить, что к филаменту актина бы. приложено определенное напряжение, которое, вероятно, влияет увеличение времени диссоциации актомиозина. Полученное значен задержки 8-12 мс хорошо согласуется с результатами, полученными п фотолизе АТФ в мышечных волокнах, в которых также существова определенное напряжение (70-100 кН м-2)- Учитывая уменьшение усил разрыва связи актин-миозин в растворе, содержащем нуклетид, мож предположить, что сродство миозина к актину уменьшается в два этапа: после связывания АТФ и 2 - перед гидролизом АТФ до АДФ неорганического фосфата, когда сродство уменьшается настолько, ч миозин отсоединяется от актина.

Разработанная нами модель основана на имитации поведен каждого мостика, взаимодействующего с общим филаментом актина. Так способ моделирования применен впервые. Полученные результа-количественно совпали с результатами наших экспериментов экспериментов других исследователей. Это позволило нам, использ модель, получить ответ на вопрос: как выглядит зависимость сила-скорос для небольших ансамблей из 15-20 мостиков. По результат; моделирования можно сделать вывод, что гиперболическая фор зависимости сила - скорость для мышечных волокон есть следств]

5заимодействия мышечных белков и не должна меняться при уменьшении эазмера препарата до уровня отдельного филамента актина.

Заключение

1. Разработан новый эффективный метод очистки миозина в 1скусственных подвижных системах, позволяющий увеличить фракцию даижущихся филаментов до 95%.

2. С использованием метода фотолиза связанной АТФ в искусственных юдвижных системах измерена дистанция, на которую молекулы миозина 1еремещают филамент актина за один цикл гидролиза АТФ в изотонических 'словиях. Она составила 10.5 нм.

3. Доказано, что гидролиз одной молекулы АТФ связан только с >дним силогенерирующим шагом поперечного мостика.

4. Получены данные о том, что дистанция, на которую мостики :мещают актин за один шаг, линейно зависит от внутренней нагрузки на зиламент актина.

5. Обнаружено существование задержки между моментом связывания П"Ф молекулой миозина и диссоциацией актомиозина в условиях, когда вязь актин-миозин имеет механическое напряжение. Задержка составила 82 мс при напряжении связи актин-миозин 1-2 пН.

6. Разработанная модель количественно воспроизводит результаты [роведенных экспериментов и позволяет исследовать поведение молекул шозина в различных режимах мышечного сокращения. В частности, модель .оказывает, что 15-20 молекул актомиозина в условиях in vitro обладают акими же свойствами, как мышечные волокна не только в изотонических словиях, но и в присутствии внешней нагрузки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Bershitsky S.Y., Tsaturyan А.К., Bershitskaya O.N., Mashanov С Brown P., Webb M., Ferenczi M.A. Mechanical and structural proper underlying contraction of skeletal muscle fibers after partial l-ethyl-3 dimethylaminopropyl) carbodiimide cross-linking// Biophys. J., 1996, V. 71 1462-1474.

2. Mashanov G.I. The cross-bridge model for the in vitro motility assa Journal of Muscle Research and Cell Motility, April 1997, V. 18, p. 265.

3. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K., Bershitskaya O.N., Mashanov С Brown P., Burns R., Ferenczi M.A. Muscle force is generated by myosin he stereospecifically attached to actin. // Nature, 10 July 1997, V. 388, p. 186-190.

4. Машанов Г.И. Модель поперечных мостиков для искусствен! подвижных систем. // Биофизика, 1997, Т. 42, № 4, С. 000-000.