Исследование цитоскелетных механизмов взаимодействия дофамина с живыми клетками

Шубина, Виктория Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование цитоскелетных механизмов взаимодействия дофамина с живыми клетками
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование цитоскелетных механизмов взаимодействия дофамина с живыми клетками"

Шубина Виктория Сергеевна

На правах рукописи

003478568

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОСКЕЛЕТИЫХ МЕХАНИЗМОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ДОФАМИНА С ЖИВЫМИ КЛЕТКАМИ

Биофизика 03.00.02 Физиология 03.00.13

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

- 1 ОКТ 2009

г. Пущино 2009

003478568

Работа выполнена в Пущинском государственном университете и в Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Мошков Дмитрий Алексеевич, доктор биологических наук Павлик Любовь Леоновна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Буданцев Аркадий Юстианович

доьстор биологических наук, профессор Мурашев Аркадий Николаевич

Ведущая организация:

Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится « 28 » октября 2009 г. в 13-30 на заседании совета Д 002.093.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Учреждении Российской академии наук Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 3, ИТЭБ РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физико-математических наук

Ланина Надежда Федоровна

Актуальность проблемы.

Дофамин по химической структуре относится к биогенным аминам, конкретно к катехоламинам. Как гормон, выделяемый эндокринными железами и другими тканями, дофамин оказывает сложное и многогранное гуморальное регулирующее воздействие на организм в целом либо на определённые органы и системы-мишени (Goldstein et. al., 1995; Missale et al., 1998; Mezey et. al., 1998, 1999). Поэтому гормональные нарушения носят системный и комплексный характер, их вред проявляется на организменном уровне. В центральной нервной системе дофамин, играя роль нейротрансмиттера и нейромодулятора, участвует в контроле двигательной активности (Clark et al., 1991; Furmidge et al., 1991; Pereda et al., 1992, 1994), эмоций (Nieoullon, Coquerel, 2003; Salqado-Pineda et al., 2005), нормального поведения (Toates, 1998; Ikemoto, Panksepp, 1999; Ahn, Salamone et. al., 2003; Phillips, 2007). Нарушение функционирования дофаминергической системы в мозге приводит к развитию различных патологических состояний, таких как наркомания, паркинсонизм, шизофрения, сумеречные состояния и некоторые другие (Угрюмов, 2007, Nestler, 2004). Согласно классической и общепринятой точки зрения, широко освещенной и интенсивно исследуемой в настоящее время, мишенью действия дофамина считаются специфические рецепторы, расположенные на плазматической мембране нейрона (Раевский 1976; Missale et al., 1998; Шабанов, 2004). Лигандные взаимодействия нейротрансмиттера с ними влечет за собой изменение баланса ионов в цитоплазме, приводящее к активации клетки. Согласно другой точке зрения нейротрансмитгеры, в частности, дофамин, способны в дополнение к их взаимодействию с рецепторами влиять на клетку трофическим образом, минуя рецепторы. Предполагается, например, что, растворяясь в липидах плазматической мембраны, они могут изменять ее физико-химические свойства, в том числе влиять на лигандные и канальные характеристики встроенных в нее рецепторов (Cantor, 2003; Milutinovic et al., 2007). Взаимодействуя с некоторыми цитозольными белками, такими как aß-пептид, а-синуклеин или актин, катехоламины могут вызывать изменения функциональной активности клеток, влияющей на их жизнеспособность (Павлик и др., 2004; Li et al., 2004). Гипотеза о трофическом взаимодействии дофамина с определенными субстратами клетки тока разработана крайне слабо, большинство ее аспектов лишь теоретически обозначено, все они требуют экспериментальной проверки и подтверждения с привлечением комплексных подходов, использующих применение различных методов и разных объектов исследований.

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы было комплексное морфофункциональное исследование влияния дофамина на живые клетки и на искусственные модельные системы для определения клеточной мишени действия нейротрансмиттера. Были поставлены следующие задачи: 1. Изучить морфофункциональные эффекты аппликации на маутнеровские нейроны золотой рыбки дофамина и определить его внутриклеточные мишени. 2. Изучить биофизическими методами поведение дофамина в модельных системах, в частности, его взаимодействие с выделенным глобулярным (Г-) актином, влияние на плоскую билипидную мембрану, способность воздействовать на агрегатное состояние актина, предварительно заключенного в тонкостенные липосомные везикулы. 3. Изучить взаимодействие дофамина с культивируемыми фибробластоподобными клетками линии ВНК-21, определить его эффект на выживаемость и ультраструктуру клеток, а также выявить внутриклеточную локализацию с помощью цитохимической реакции Фалька для выявления катехоламинов.

Научная новизна. Впервые поставлен вопрос о трофическом действии дофамина на живую клетку и получены комплексные экспериментальные доказательства того, что в качестве основной клеточной мишени дофамина выступает цитозольный актин. Об этом свидетельствуют следующие установленные фундаментальные факты. При аппликации на живой нейрон дофамин вызывает гипертрофию синаптических специализированных контактов, построенных из филаментозного (Ф-) актина. Такой же эффект оказывает на нейроны аппликация дигидропиримидинтиона, производного дофамина, обладающего таким же, как и дофамин, полимеризующим эффектом на Г-актин. При этом есть основание

считать, что дигидропиримидинтион, по-видимому, не обладает сродством к дофаминовым рецепторам и переносчикам из-за того, что его наиболее важные для взаимодействия с рецепторами функциональные группы (ОН и NHi) максимально заблокированы, а также стерически затруднены. Блокада дофаминовых рецепторов не предотвращает вызванную дофамином полимеризацию актина. При взаимодействии in vitro с дофамином Г-актин превращается в Ф-актин. Впервые показано, что дофамин проникает через искусственную фосфолипидную мембрану, в принципе не имеющую ни рецепторов, ни переносчиков, причем в концентрации, способной вызвать полимеризацию актина по другую сторону мембраны. Впервые с помощью цитохимической реакции Фалька, параллельного ультраструктурного анализа и метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определено, что дофамин способен проникать в живую клетку и полимеризовать цитозольный актин, встраиваясь в структуру формируемых нитей.

Научно-практическая значимость работы. Проведенное исследование имеет важное общебиологическое значение, расширяя представления о взаимодействии биогенных аминов с клеткой. Дофамин химически очень близок по структуре и свойствам к таким катехоламинам как адреналин и норадреналин, которые являются гормонами системного действия. По аналогии с дофамином, можно предположить, что биогенные амины помимо своего лигандного взаимодействия с рецепторами также обладают свойством трофически влиять на цитозольный актин клеток. Попадая в кровь, они способны изменять функциональную активность ее форменных элементов. При общей оценке гормонального статуса организма этот ранее не известный эффект теперь представляется необходимым учитывать, во всяком случае, намечена перспектива исследовать такое влияние катехоламинов на клетки, ткани и органы. Просматривается прикладной аспект обнаруженного свойства дофамина взаимодействовать с актином живой клетки. Этот катехоламин можно использовать в качестве молекулярного инструмента для исследования роли актина в функциональных проявлениях клетки. В том числе, в патологически измененной функции, учитывая данные о повреждающем действии дофамина на клетки ВНК-21, которые являются трансформированными и могут рассматриваться как модель опухолевой клетки.

Апробация диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на V международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения -2006» (Санкт-Петербург, 21-23 мая 2006г); на XX юбилейном съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 4-8 июня 2007г); на 11-й Пущинской конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 29 октября - 2 ноября 2007г); на школе-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Биомедицинская инженерия - 2007» (Пущино, 10-12 декабря 2007г); на 3-м и 4-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 12-20 июня 2007г и 10-20 июня 2008г); на 9-ой и 10-ой международной конференции «Центральные и периферические механизмы вегетативной нервной системы». (Донецк, 23-25 мая 2007г и июнь 2008г); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2-4 июня 2009г); XV международной конференции по Нейрокибернетике. (Ростов-на-Дону, 2325 сентября 2009г).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 5 статей в рецензируемых журналах, 4 из которых входят в регламентированный список ВАК, и 3 статьи в сборниках работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка

литературы. Диссертация изложена на_страницах, содержит_таблиц и_рисунков.

Список литературы включает_наименований отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили Маутнеровские нейроны золотых рыбок Carassius auratus L. породы шубункин, вакин или оранда 3-4 месячного возраста, весом около 2г, длиной 2,53,0см и культура клеток ВНК-21, представляющих собой трансформированные фибробласты почки золотистого хомячка.

Физиологические эксперименты. Дофамин и блокаторы Д1 и Д2-рецепторов дофамина (галоперидол и SCH23390, соответственно, растворенные в физиологическом растворе для холоднокровных) вводили микрошприцем в область расположения МН по ранее описанной методике (Безгина и др., 2006). В качестве контроля инъецировали физраствор. Концентрации препаратов подбирали с расчетом, чтобы в месте расположения МН они составляли около Ю М (Pereda, 1994, 2004). Применяли исходную дозу дофамина 10"3М в 5мкл раствора, а блокаторов - 10~3 М для галоперидола и 5-10"6М для SCH23390. (Cook-Mills et al., 1995; Yan et al., 2007; Zhang et al., 2009). Замещенный 3,4-дигидро-2(1Н)-пиримидинтион (дигидропиримидинтион), синтезированный на основе дофамина и любезно предоставленный проф. A.C. Фисюком (ОмГУ), применяли в 80%-м растворе диметилсульфоксида. Контролем служили рыбки, на МН которых апплицировали среду разведения препарата.

Оценку функционального состояния обоих МН проводили косвенно по величине моторной активности рыбки в виде числа поворотов в обе стороны (Михайлова, 2006), пропорциональной электрической активности МН (Тирас и др., 2002, 2004). При изучении последствий аппликаций препаратов в ряде случаев их сочетали с билатеральной естественной стимуляцией МН, для чего рыбок вращали одновременно в двух плоскостях в специальной установке (Мошков, 1985).

Морфологические исследования маутнеровских нейронов. После проведения физиологических экспериментов у рыбок на льду (для анестезии) вскрывали черепную коробку, выделяли мозг и готовили препараты для электронной микроскопии. Применяли методику совмещения гистологического и ультраструктурного анализа одних и тех же участков нейронов. Мозг фиксировали в смеси 5% глутаральдегида и 2% формальдегида на 0,1М какодилатном буфере в течение 17ч, затем в 2%-ном растворе четырехокиси осмия на том же буфере (pH 7,4) в течение 4ч по принятому в лаборатории методу (Мошков, 1985). Препараты обезвоживали в растворах спиртов возрастающей концентрации, заливали в эпоксидную смолу Эпон-812 и резали на серийные гистологические Юмкм срезы на пирамитоме LKB (Швеция). После предварительного отбора под оптическим микроскопом срезы, содержащие нужные участки нейрона, переклеивали на отдельные блоки, из них готовили ультратонкие срезы на ультратоме LKB-III (Швеция) или Leica UC6 (Германия), которые контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали в электронном микроскопе TESLA BS-500. Состояние ультраструктуры синапсов, цитоплазматических органоидов и цитоскелета анализировали сначала визуально качественно, а затем количественно. Оценивали и подвергали морфометрическому анализу число и длину индивидуальных профилей десмосомоподобных контактов (ДПК), активных зон (A3) и щелевых контактов (ЩК) химических и смешанных синапсов, число транссинаптических мостиков в щели ДПК смешанных синапсов (Рис. 1 а, а'). Достоверность различий данных по критерию Стьюдента представляли как среднее ± доверительный интервал или как среднее ± ошибка среднего, что специально оговаривается в каждом конкретном случае.

Рис. 1. Примеры структур в МН, подвергаемых анализу.

а, а1 - специализированные контакты в афферентных синапсах смешанного (а) и химического (а1) типа. Обозначение: A3 - активная зона, ДПК - десмосомоподобный контакт, ЩК - щелевой контакт. Масштабный отрезок 0,25мкм.

б, б1 - участки глубинной области цитоплазмы МН в контроле (б) и при действии дофамина (б1). П - пучок актиновых микрофиламентов. Масштабный отрезок 0,5мкм.

Изучение взаимодействия Г-актина с дофамином и дигидропиримидинтионом in vitro.

Результаты взаимодействия дофамина (концентрацией 2,4-10"4; 2,4-10"3 и 2,4-10"2М) и, раздельно, дигидропиримидинтиона (концентрацией 10"5, Ю^1, 10~3 М) с мышечным Г-актином (концентрацией 2,4-10"5М) оценивали в негативно окрашенном препарате визуально по формированию нитей Ф-актина. Препараты просматривали после 30 мин, 1, 3 и 4час инкубации при комнатной температуре или после Зсут при 4°С. Г-актин, выделенный по стандартному методу (Pardee, Spudich, 1982) в лаборатории структуры и функции мышечных белков ИТЭБ РАН, в буферном растворе, содержащем 2мМ ТРИС, 0,2мМ NaATP, 0,2мМ СаС12, меркаптоэтанол и ЮмМ KCl (рН=7,4), был любезно предоставлен д.б.н., профессором З.А. Подлубной. Способность Ф-актина деполимеризоваться под влиянием глутамата и некоторых других препаратов оценивали в аналогичных условиях в том же буфере, содержащем 1 ООмМ KCl.

При изучении (совместно с А.Д. Софиным, ИБК РАН) встраивания дофамина в Ф-актин в процессе его взаимодействия с Г-актином использовали молярные соотношения Г-актин/дофамин 1:10, 1:100, 1:350, 1:1000 и 1:1500. После суточной инкубации смеси Г-актина и дофамина образовавшиеся нити Ф-актина осаждали центрифугированием при 4500 об/мин в течение 40мин, применяя концентраторы с порами, отсекающими молекулы массой выше ЮкДа. В фильтрате методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, колонка NUCLEOGEL GFC 300-8, буфер 2мМ ТРИС, 0,2мМ СаС12, 150мМ NaCl, рН=7,4, детектирование оптической плотности при ^=280нм) определяли количество дофамина, не связавшегося с актином. Осадок на концентраторе солюбилизировали либо 4M мочевиной (1ч), либо 5 ' 10"2М глутаматом (4ч) при комнатной температуре, после чего, используя метод ВЭЖХ, определяли количество мономерного актина и аффинно-связанного с ним дофамина. В качестве контроля использовали Г-актин и Ф-актин, сформированный действием ЮОмМ KCl. Предварительно определяли молярное соотношение актин/дофамин, исходя из отношения свободного и аффинно-связанного количества ДА.

Изучение взаимодействия дофамина с модельными фосфолипидными мембранами. Для формирования фосфолипидных искусственных мембран использовали коммерческий препарат азолектин (Sigma), смесь липидов из соевых бобов, аналог фосфолипидов мозга (Modesto et al., 1996), а также общие липиды мозга быка (любезно предоставленные к.б.н. Е.Н. Гриценко, ИТЭБ РАН). Работу по влиянию дофамина на электрическую проводимость плоской билипидной мембраны проводили совместно с к.б.н. П.А. Григорьевым (ИБК РАН). Измеряли токи плоской билипидной мембраны (БЛМ) после добавления дофамина (10"3М) с одной стороны мембраны при фиксированном напряжении 50мВ, меняющемся с частотой 1Гц. Мембрану предварительно модифицировали добавлением с обеих сторон амфотерицина Б концентрацией 0,1мкМ, который встраивается в нее и формирует ионные каналы, обладающие хлорной проводимостью. Они служили молекулярными датчиками, чувствительными к положительно заряженному (при рН 6,0) дофамину. Для регистрации в БЛМ трансмембранного тока в этих условиях использовали ранее разработанную методологию и аппаратуру (Grigoriev et al., 1990).

Липосомы готовили из пленки, полученной высушиванием в вакууме растворенной в хлороформ/метаноле смеси азолектина и кардиолипина, который добавляли для размягчения липидов (Miyata, Hotani, 1992). Пленку размачивали при 0°С в течение 2сут в растворе, содержащем 2мМ Трис-HCl, 0,2мМ СаС12, 0,2мМ АТФ, 0,2мМ NaN3, 5мМ димеркаптоэтанола, ЮОмМ сахарозы, 0,4мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) (все препараты Sigma) и ЮОмкМ Г-актина, рН 8,0 (Miyata et al., 1999). Массивные липосомы, образовавшиеся после набухания, измельчали ультразвуком в течение 2-4ч при температуре 4°С. Для изготовления липосом с большой внутренней полостью и тонкой стенкой из одной-трех билипидных мембран, их разбавляли в 5 раз гипотоническим внешним раствором, содержащим 2мМ Трис-HCl, 0,2мМ СаС12, 0,2мМ АТФ, 0,2мМ NaN3, 5мМ димеркаптоэтанола, 50мМ глюкозы, ЮмМ КС1; 0,2 мг/мл БСА; рН 8,0. Раствор дофамина и 10"9М валиномицина (Sigma) добавляли к разбавленной суспензии тонкостенных липосом с заключенным внутри Г-актином и оставляли при 4°С на 1-3 суток. Валиномицин использовали для нейтрализации трансмембранной разности потенциалов, создаваемой проникающим внутрь дофамином. В качестве контролей использовали инкубацию препаратов в отсутствие дофамина, нагрев липосом с захваченным Г-актином при 30°С для индукции его тепловой (самопроизвольной) полимеризации во внутренней полости (Miyata, Hotani, 1992), замену в липосомах Г-актина белком БСА, не способным к полимеризации. Морфологию липосом изучали каждые сутки в электронном микроскопе, используя для визуализации метод негативного контрастирования препаратов 3%-м (изотоническим) раствором молибденовокислого аммония.

Культивирование клеток ВНК-21 и оценка их выживаемости. Трансформированные фибробласты почки сирийского хомячка (клетки ВНК-21) культивировали в стандартных условиях в чашках Петри или флаконах Карреля. Для предотвращения окисления дофамина в культуральную среду добавляли метабисульфит натрия (Pedresa, Soares-da-Siva, 2002). Дофамин концентрацией 10'5, 10"4 и 10"3М вносили в клеточную суспензию либо одновременно с посевом (до распластывания клеток), либо спустя 6 часов культивирования после прикрепления и распластывания клеток. Галоперидол в концентрации 10"5М (Cook-Mills et al., 1995) добавляли в среду непосредственно перед внесением в нее клеток. Выживаемость (В) оценивали в камере Горяева на 1, 2 и 3 сутки после введения дофамина подсчетом живых и погибших клеток, окрашивая их раствором трипанового синего, по формуле: В (%) = К2 ' 100/К,

где Ki - количество посеянных клеток, К2 - количество клеток на 1,2 и 3 сутки в контроле и в присутствии дофамина.

Морфологические исследования клеток ВНК-21. Для гистологического исследования и электронной микроскопии клетки ВНК-21 отмывали от культуральной среды, фиксировали и

получали препараты по методике, описанной ранее для изучения МН, уменьшая время фиксации до 1-2-х часов (Мошков, 1985).

Распластанные клетки фиксировали и заливали плоскопараллельно и просматривали под световым микроскопом без резки, клетки в суспензии предварительно осаждали при 1000об/мин и осадки фиксировали.

Цитохимическая визуализация дофамина внутри клеток ВНК-21. Клетки, находящиеся в суспензии, осаждали при 1000об/мин, однократно отмывали от культуральной среды ресуспендированием в растворе, содержащем 0,9% NaCl, 5мМ HEPES, 5мМ глюкозу, 1мМ СаСЬ, 1мМ MgCh и 200мкМ метабисульфита натрия, (рН=7,2). Затем их переносили в тот же буфер, содержащий дофамин в концентрации 10", 10"4 и 10"3М, и инкубировали в течение 30 мин, 1, 2, 3, 4 и 5 ч в чашках Петри при 37°С в атмосфере 95% Ог и 5% СО2. На дно чашек Петри клали покровное стекло, к нему клетки прикреплялись в процессе инкубации. По окончании инкубации клеток с дофамином неприкрепленные клетки осаждали центрифугированием, и осадок трижды отмывали от дофамина ресуспендированием в чистом буферном растворе. Промытые клетки наносили в виде мазка на предметное стекло и изучали под флуоресцентным микроскопом. Клетки, прикрепившиеся к покровному стеклу, изучали прямо на нем, промыв их трехкратным погружением в буфер. В ряде экспериментов дофамин добавляли к клеткам на Зсут их роста в стандартных условиях после формирования монослоя на покровном стекле. В качестве контроля использовали клетки ВНК-21, инкубированные в буферном растворе без дофамина. Цитохимическую реакцию на биогенные амины осуществляли по методу Фалька (Lindvall et al., 1975), для чего полученные мазки или монослои клеток высушивали 2сут над концентрированной серной кислотой, и нагревали до 80°С над параформальдегидом. Изохинолины, образовавшиеся в процессе конденсации катехоламинов и паров формальдегида, визуализировали по флуоресценции при 490-500нм = 330, 375нм). Использовали флуоресцентный микроскоп Люмам-ИЗ (ЛОМО, Россия), любезно предоставленный проф. B.C. Акатовым. Интенсивность флуоресценции оценивали денситометрией цифровых фотографий и последующим вычислением с помощью программы Total Lab относительной оптической плотности электронного изображения по следующей формуле:

Количество ДА (%) = К2' 100/Кь

где Ki и Кг - средние значения относительной оптической плотности в контроле и после действия дофамина, соответственно. Для оценки статистической достоверности различий сравниваемых величин использовали t-критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфофункциональные эффекты аппликации дофамина на МН.

Аппликация дофамина на МН золотой рыбки усиливает функциональную активность нейронов, проявляющуюся как возрастание двигательной активности рыбок и повышение сопротивляемости длительной сенсорной (вестибулярной) стимуляции, и стабилизирует размеры МН. Отмеченный эффект сохраняется после предварительной блокады Д2 и Д1 дофаминовых рецепторов галоперидолом или SCH23390, соответственно. Аппликация другого нейротрансмитгера, глутамата, частично подавляет, а в сочетании с длительной билатеральной стимуляцией полностью угнетает функцию МН (Табл. 1).

Ультраструктурный анализ МН после аппликации дофамина представлен в табл. 2. Видно, что протяженность сечений десмосомоподобных контактов, состоящих из Ф-актина (Павлик и др., 2003, 2004), в химических синапсах проявляет тенденцию к росту, в среднем увеличивается почти на 17%, а в смешанных синапсах - достоверно возрастает более чем на 38% по сравнению с контролем. Кроме этого в глубине цитоплазмы МН появляются пучки актиновых микрофиламентов (рис. 1 б, б1). Последующая сенсорная стимуляция

нормализует размеры контактов, однако, блокада дофаминовых рецепторов заметно не влияет на индуцированные дофамином изменения ультраструктуры, связанные с полимеризацией актина (табл. 3). Аппликация глутамата на МН, особенно в сочетании со стимуляцией, сильно повреждает ДПК в синапсах обоих типов, затрудняя их идентификацию, что не позволяет адекватно измерить протяженность сечений. Кроме этого дезинтегрируется цитоскелет, и исчезают пучки микрофиламентов.

Таблица 1. Влияние на функциональную активность маутнеровских нейронов (МН) аппликаций различных препаратов и последующей длительной стимуляции

Препараты Функциональная активность МН (в % от интактного уровня) Функциональная активность МН после стимуляции

физраствор 100 ± 17,6 8,4 ± 1,7

дофамин 169,9 ±18,9* 56,9 ± 12,5*

галоперидол 3,5 ± 0,7* -

Галоперидол + дофамин 183,9 ±33,6* -

8СН23390 157,3 ±24,6* 9,8 ± 2,5

8СН23390 + дофамин 156 ±20,7* 33 ± 6,2*

диметилсульфоксид 79, 3± 15,8 7,1 ± 1,2

дигидропиримидинтион 104,7 ±22,0 21,4 ±4,2*

глутамат 68,6 ± 12,8* 0

Данные представлены как среднее ± доверительный интервал; * Отличия от контроля достоверны при р < 0.05; п>30.

Таблица 2. Влияние на ультраструктуру МН аппликации дофамина и стимуляции.

Препараты Размер контактов в химических синапсах, хЮО мкм Размер контактов в смешанных синапсах, хЮО мкм Количество мостиков в ДПК СС

ДПК АЗ ДПК АЗ

физраствор 21,4 ± 1,7 20,7 ± 0,5 27,9 ± 0,9 28,5 ± 1,3 2,0 ±0,1

физраствор +стимуляция 25,9 ± 1,7 24,3 ± 1,6 24,6 ± 0,8 25,9 ± 1,4 -

дофамин 25,0 ± 1,8 27,0 ± 0,8* 38,6 ± 2,4* 31,9 ± 2,1* 2,7 ± 0,2*

дофамин + стимуляция 23,6 ± 0,8 24,0 ± 0,8 28,2 ± 0,9 26,0 ± 1,0 1,7 ±0,1*

Обозначения: ДПК - десмосомоподобный контакт; АЗ - активная зона; СС - смешанный синапс. Данные представлены как среднее ± ошибка среднего; * - отличия от контроля достоверны прир < 0,05; п>30.

Таблица 3. Влияние на ультраструктуру смешанных синапсов МН блокады Д2 и Д1 рецепторов галоперидолом (ГП) и 5СН23390 (8СН) и аппликации дофамина (ДА)._

Препараты Размер контактов в СС, мкм Число контактов на СС

ДПК ЩК АЗ ДПК ЩК АЗ

физраствор 27,9±0,9 25,1±1,8 28,5±1,3 1,3±0,1 2,0±0,2 1,4±0,1

ГП 21,7±0,9* 24,2±1,6 19,2±1,1* 2,0±0,2* 1,5±0,2 1,4±0,2

ГП + ДА 20,0±0,8* 23,9±1,4 25,8±2,1 3,0±0,2* 2,0±0,1 1,5±0,1

БСН 22,3±1,0* 26,0±1,9 24,9 ± 3,3 2,3±0,4 2,7±0,6 1,3±0,2

8СН + ДА 27,5±1,2 25,7±2,0 27,6±4,0 3,4±0,4* 1,7±0,2 1,4±0,3

Данные представлены как среднее ± ошибка среднего; *Отличия от контроля достоверны при р < 0,05; п>30.

Ультраструктурный анализ смешанных синапсов МН показал (табл. 3), что аппликация одного ГП и в сочетании с дофамином приводит к уменьшению длины отдельного ДПК в смешанных синапсах, тогда как число данных контактов на смешанный синапс увеличивается (примерно на 50 % и 130 % при действии ГП и ГП с дофамином, соответственно). Таким образом, совместное действие ГП с дофамином в конечном итоге приводит к увеличению степени полимерного актина в ДПК в расчете на один смешанный синапс по сравнению с действием одного ГП. Подобный эффект наблюдается после аппликаций одного SCH23390 и в сочетании его с дофамином. Полученные данные свидетельствуют о том, что блокада дофаминовых рецепторов заметно не влияет на индуцированную дофамином полимеризацию актина в нейронах. В то же время видно, что ДА-рецепторы сами по себе разнонаправлено влияют на морфофункциональное состояние МН. В деталях роль рецепторов сложно однозначно изучить, блокируя рецепторы in situ, но можно подойти к проблеме с другой стороны, используя вместо дофамина дигидропиримидинтион. Он аналогично дофамину вызывает полимеризацию Г-актина в условиях in vitro (см. ниже), но не обладает подобным сродством к соответствующим рецепторам.

Морфофункционалъные изменения МН под влиянием дигидопиримидинтиона.

Предположение о том, что дигидропиримидинтион не является специфическим агонистом или антагонистом дофаминовых рецепторов, обусловлено тем, что его наиболее важные для взаимодействия с рецепторами функциональные группы (ОН и NH2) максимально заблокированы, а также стерически затруднены (Kalani, et. al., 2004; Zhang et al., 2009). Результаты исследований показали, что эффект дигидопиримидинтиона на МН напоминает эффект дофамина. Он повышает резистентность нейронов к утомительной стимуляции (табл. 1) и увеличивает протяженность и число акгин-содержащих контактов (ДПК) в синапсах обоих типов, число фибриллярных мостиков в щели ДПК смешанных синапсов (табл. 4), а также вызывает появление пучков актиновых волокон в цитозоле МН.

Таблица 4. Влияние на ультраструктуру МН 3,4-дигидро-2(1Н)-пиримидинтиона (ДГПТ).

Аппликация Размер контактов, хЮО мкм

Химический синапс Смешанный синапс

ДПК A3 ДПК щк A3

ДМСО 24,7±2,0 20,2±1,3 23,7±1,3 25,6±2,0 25,0±1,3

ДГПТ 32,9±1,9* 24,0±0,2 27,9±0,9* 28,4±1,3 21,9±0,7*

Число специализированных контактов в пересчете на синапс.

ДМСО 1,1 ±0,08 1,0±0,1 1,7±0,2 1,6±0,2 1,2±0,09

ДГПТ 1,3±0,09 1,3±0,2 2,3±0,1* 1,9±0,1 1,3±0,07

Суммарная длина специализированных контактов на синапс

ДМСО 2б,4±0,6 20,2±0,3 43,0±3,0 37,3±0,9 27,9±0,4

ДГПТ 43,9±0,4* 29,1±2,3* 65,9±0,3** 53,0±3,0* 28,2±0,2

ДМСО - диметилсульфоксид; Данные представлены как среднее ± ошибка среднего; "'Отличия от контроля достоверны при р < 0,05; ** при р < 0,001; каждое среднее значение подсчитано после обработки не менее 30 индивидуальных показателей.

Длина отдельного сечения ДПК в химических синапсах увеличивается на 33%, а в смешанных синапсах - в среднем на 18%, число трансмембранных мостиков в ДПК смешанных синапсов возрастает на 33% (3,0±0,3 в контроле, 4,0±0,2 после аппликации пиримидинтиона) по сравнению с контролем. В целом, суммарная длина специализированных контактов в синапсах, построенных из Ф-актина, существенно возрастает. Сходство морфофункциональных эффектов на МН производного дофамина, предположительно не являющегося лигандом для дофаминовых рецепторов, и самого ДА свидетельствует в пользу их трофического влияния на стабилизацию и полимеризацию

цитоскелетного актина за счет проникновения в постсинаптический нейрон, что затем подтвердили эксперименты по взаимодействию дофамина с Г-актином в условиях in vitro.

2. Исследования взаимодействия дофамина с Г-актином и модельными мембранами.

Для осуществления предполагаемого прямого взаимодействия экзогенного дофамина с цитозольным актином живой клетки должно выполняться, по крайней мере, два необходимых условия: дофамин должен изменять агрегатное состояние актина, и для этого ему нужно проникнуть через плазматическую мембрану. Эти вопросы исследовали, используя модельные системы, проводя соответствующие эксперименты в условиях in vitro.

Влияние дофамина на состояние актина.

Анализ электронно-микроскопических данных показывает, что дофамин при совместной инкубации с выделенным мышечным Г-актином вызывает его дозо-зависимую полимеризацию уже после ЗОмин инкубации, в то время как в контроле полимеризации актина не наблюдается в течение 4ч и более (Рис. 2). С ростом концентрации дофамина растет число нитей и их протяженность в случайно выбранных полях зрения микроскопа.

Рис. 2. Ультраструктура препаратов Г-актина при его инкубации в различных средах, а - Г-актин (контрольный препарат) после 4ч инкубации в присутствии 10мМ KCl; б - Г-актин в присутствии ЮмМ KCl после 1,5ч взаимодействия с ДА; в - Г-актин после 1,5ч взаимодействия с пиримидинтионом. Наблюдается практически полное превращение Г-актина (глобулы) в Ф-актин (филаменты). Негативный контраст. Масштабная линейка 0,1 мкм.

Г-актин i

АТФ

дофамин ♦

дофамин t

б Й

Г-актин АТФ ♦ t

0 5 10 15 20 25 30

время удерживания, мин

Рис. 3. Хроматографические данные по связыванию дофамина с Г-актином. а - хроматограмма, полученная при введении в колонку буферного раствора, содержащего Г-актин; б - хроматограмма, полученная при введении в колонку дофамина; в - хроматограмма солюбилизата, образующегося после деполимеризации нитей Ф-актина, сформированных под влиянием дофамина, 4M мочевиной.

Аналогичным эффектом обладает дигидропиримидинтион. Для сравнения, глутамат, в отличие от дофамина, деполимеризует Ф-актин, сформированный действием как ЮОмМ KCl, так и дофамина, а также предотвращает образование нитей Ф-актина в присутствии ЮОмМ KCl. По данным высоко эффективной жидкостной хроматографии разрушение мочевиной или глутаматом Ф-актиновых филаментов, сформированных взаимодействием Г-актина с дофамином, приводит к высвобождению дофамина в среду инкубации (рис. 3). При этом по предварительным подсчетам, молярное соотношение дофамин/актин составляет около 100/1. Это свидетельствует о включении ДА в структуру полимерного актина.

Полученные данные позволяют предположить, что наблюдаемые нами ультраструктурные изменения в маутнеровских нейронах при взаимодействии их с дофамином в виде гипертрофии структур, содержащих актин, можно объяснить тем, что нейротрансмиттер из экстраклеточного пространства проникает в цитозоль нейрона, вызывает дополнительную полимеризацию мономерного актина и, по-видимому, встраивается в нити Ф-актина. Известно, что такая стабилизация актина сопровождается усилением резистентности клеток к повреждающим факторам, в том числе, к стимуляции (Korichneva, Hämmerling, 1999), что и наблюдается в наших экспериментах с МН. Необходимым условием для описанного поведения дофамина является его гипотетическое проникновение внутрь клети через плазматическую мембрану. Подтвердить такое поведение дофамина помогли исследования на модельных мембранах.

Изучение взаимодействия ДА с искусственными фосфолипидными мембранами.

Результаты исследования взаимодействия дофамина с плоской билипидной мембраной представлены на рис. 4. Видно, что при добавлении в раствор электролита ДА с внешней (цис-) стороны ток мембраны увеличивался примерно на 20%. Этот эффект был симметричным, а именно, возрастал при обеих полярностях мембранного потенциала, что объясняется проникновением ДА в липидный бислой, быстрым распределением его внутри мембраны и выходом на ее другую сторону. Об этом же свидетельствуют данные о коэффициенте распределения вода/октанол для ДА (-0,98, Hansch, Leo, 1979).

Рис. 5. Ультраструктура тонкостенных липосом, наполненных Г-актином до и после добавления дофамина (ДА) во внешний раствор.

а - липосома из контрольного препарата после Зсут инкубации без ДА. Актин во внутренней полости сохраняет глобулярное состояние, б - липосома из контрольного препарата (без добавления ДА), подвергнутого нагреву, в, г - липосомы после воздействия дофамина. Образовавшиеся внутри актиновые нити вызывают палочкообразную деформацию липосомы. В момент формирования филаментов часть актиновых нитей способна перфорировать стенку (г). Масштабная линейка - 0,1 мкм.

Рассматриваемые совместно, эти данные показывают, что дофамин способен растворяться и диффундировать в гидрофобной области и легко переходить с поверхности мембраны в электролит и обратно, иными словами, создавать трансмембранный поток при наличии концентрационного градиента. При этом дофамин не только проникает сквозь липидную мембрану, но и достигает эффективной концентрации для полимеризации Г-актина. Об этом свидетельствуют эксперименты на липосомах с заключенным в них Г-актином.

Взаимодействие дофамина слипосомами, наполненными Г-актином.

При взаимодействии дофамина с тонкостенными липосомами, наполненными Г-актином, наблюдается появление отдельных нитей или пучков Ф-актина, характерно изменяющих морфологию липосом (рис. 5). Это указывает на проникновение ДА через липидную мембрану в полость липосомы в концентрации достаточной для полимеризации актина.

Рис. 4. Изменение тока через БЛМ, модифицированную амфотерицином Б, при добавлении дофамина (ДА).

Стрелка указывает на момент введения ДА в цис-кювету. Среда 40мМ КС1, рН 4,8; концентрация дофамина 10"3 М; напряжение на мембране (диаметр мембраны 0,5мм) ±50мВ, частота изменения полярности 1гЦ.

3. Влияние ДА на выживаемость и ультраструктуру клеток ВНК-21.

Из-за неконтролируемости многих деталей функционального и структурного характера, связанных со сложной организацией головного мозга, сложностью устройства нейронального цитоскелета, различиями структуры и функции клеток в микрообъеме ткани и др., однозначно оценить результаты по взаимодействию дофамина с живым нейроном в условиях in situ достаточно сложно. В частности, невозможно контролировать внутреннюю среду и состояние самих веществ, которые изменяются в процессе последовательных аппликаций на одни и те же нейроны, как в случае использования блокаторов. Решению этой и некоторых сопутствующих проблем могут способствовать клеточные культуры, допускающие инкубацию клеток в среде, в которую последовательно или одновременно вводятся различные физиологические вещества или смесь веществ (Cook-Mills et al., 1995).

Рис. 6. Влияние ДА на выживаемость клеток ВНК-21 спустя 24, 48 и 72ч инкубации. 1 - контроль, 2 - в присутствии 10"5М ДА, 3 - в присутствии 10"4М ДА, 4 - в присутствии 10"3М ДА. ДА добавляли к неприкрепленным клеткам ВНК-21. Вертикальные отрезки -доверительный интервал. Звездочки - различия по сравнению с контролем значимы при р < 0,05.

Дальнейшая работа была проведена на клеточной линии ВНК-21, клетки которой хорошо прикрепляются к подложке и быстро распластываются на ней, формируя контакты, с окружающими клетками и субстратом. Находясь в суспензии (до прикрепления и распластывания) клетки ВНК-21 имеют слабо развитый актиновый цитоскелет по сравнению с прикрепившимися клетками, в которых сформирован мощный цитоскелет в виде актиновых стресс-волокон. Таким образом, эта клеточная модель дает возможность исследовать взаимодействие дофамина с клетками с кардинально различающимся состоянием актинового цитоскелета (\У6]Ыак-81о1Ьаг(1 е! а1., 1995; ОЬизЬапкоуа е1. а1., 1997; ЦцЬага е1 а1., 2008).

В присутствии ДА в инкубационной среде жизнеспособность клеток ВНК-21 понижается и повреждается их морфология. Нарушения наблюдаются в большей мере в суспензии, чем в монослое, и усиливаются с увеличением концентрации дофамина и продолжительности его действия (рис. 6).

Ультраструктурные изменения затрагивают главным образом участки клетки с высоким содержанием актина - межклеточные ДПК, микроворсинки и примембранный кортикальный слой. У контрольных клеток, находящихся в суспензии, он представлен узким пучком актиновых филаментов, располагающимся непосредственно под плазматической мембраной параллельно ей и в микроворсинках. В глубине цитоплазмы цитоскелет в основном состоит из отдельных, немногочисленных и не имеющих видимой ориентации актиновых нитей. В клетках, подвергшихся действию дофамина, цитоскелет представлен мощным кортикальным слоем. Он в несколько раз более широкий, чем в контроле. В глубине цитоплазмы расположены поперечные рыхлые пучки актиновых волокон, оттесняющие митохондрии и вакуолярные включения на свою периферию. В околоядерном пространстве обнаруживается множество хаотично расположенных нитей, формирующих довольно густую сеть (рис 7 б, б1). У клеток, сформировавших монослой, профили примембранных уплотнений ДПК становятся более электронно-плотными, гипертрофируются, в цитоплазме появляются хаотично направленные нити Ф-актина, в микроворсинках нарушается структура актиновых

Рис.7. Ультраструктура клеток ВНК-21, подвергшихся действию дофамина, а, а1 - структура контрольных клеток ВНК-21 (в присутствии метабисульфита натрия). Актиновый цитоскелет представлен главным образом узким кортикальным слоем, расположенным под плазматической мембраной, б - клетки ВНК-21 на 3 сутки их роста в присутствии 10"3М ДА. Видны кортикальный слой и устремляющиеся вглубь цитоплазмы пучки актиновых волокон (П). Вставки: б1 - сеть актиновых волокон в глубине цитоплазмы; б" - отдельные волокна (стрелки) возле ядерной оболочки (на рис. 7, б место, отмеченное рамкой при большем увеличении). ЯП - ядерная пора, в, г -десмосомоподобные контакты в контрольных и подвергшихся действию ДА клеток, д -регулярно расположенные отдельные короткие актиновые нити, выходящие из верхушечной части микроворсинки в сторону другой клетки (стрелки). Масштабная линейка на рис. 7 а - г - 0,5мкм, на рис. 7 а1 - 0,25мкм, на рис. 7 б1, б '. д - ОЛмкм.

нитей, что сопровождается повреждением морфологии микроворсинок. Наблюдаются перфорирование их апикальной мембраны ворсинки, а также плазматической мембраны между ворсинками нитями актина, формирование межклеточных мостиков (рис. 7).

Предварительная блокада дофаминовых (Д2) и альфа - адренергических рецепторов галоперидолом (ГП) сама по себе не влияла на выживаемость и ультраструктуру клеток и не предотвращала последующего эффекта на них дофамина. Действие дофамина более выражено в клетках, которые еще не прикрепились к субстрату, чем в распластанных клетках. Данные согласуются с полученными ранее на маутнеровских нейронах результатами и свидетельствуют о том, что мишенью действия ДА является актиновый цитоскелет культивируемых клеток и что наблюдаемое действие ДА тем сильнее, чем больше пропорция Г-актина в их цитоплазме, что соответствует результатам, полученным в условиях in vitro.

Следующим этапом настоящей работы было исследование возможности дофамина проникать внутрь живой клетки (прикрепившейся и находящейся в суспензии) с помощью визуализации его цитохимическим методом, а также определение характера распределения дофамина внутри цитоплазмы клеток в зависимости от его концентрации.

Цитохимическое исследование накопления дофамина внутри клеток ВНК-21.

Результаты по визуализации дофамина внутри клеток ВНК-21 в разных экспериментальных ситуациях представлены на рис. 8. Как находящиеся в суспензии, так и прикрепившиеся к поверхности субстрата контрольные клетки ВНК-21 обладают собственной небольшой флуоресценцией в данном диапазоне длин волн. По-видимому, она обусловлена присутствием собственных эндогенных катехоламинов и индоламинов, для выявления которых и разработана реакция Фалька. Инкубация клеток в течение 5ч в среде, содержащей дофамин в концентрации 10"3М, приводит к значительному повышению интенсивности флуоресценции. Сильное свечение цитоплазмы свободноплавающих и прикрепившихся клеток свидетельствует о присутствии значительного количества дофамина, который, безусловно, проник внутрь клеток из буферного раствора. Инкубация клеток ВНК-21 в среде, содержащей ГП, не приводит к заметным морфологическим изменениям, отличающим их от контрольных клеток. Клетки, оставшиеся в суспензии, как и клетки, прикрепившиеся к подложке, обладают собственной небольшой флуоресценцией в данном диапазоне длин волн. В то же время, блокада рецепторов с помощью ГП не препятствует усилению

Рис.8. Контрольные и подвергшиеся действию дофамина (ДА) клетки ВНК-21, окрашенные по реакции Фалька.

Контрольные препараты, находящихся в суспензии (а) и прикрепившихся к поверхности субстрата (в) клеток; свободно-плавающие (б) и прикрепившиеся к подложке (г) клетки ВНК-21 спустя 5ч инкубации с ДА в концентрации 10"3М. Клетки после действия ГП в течение 5ч прикрепившиеся к субстрату (д). Прикрепившиеся к подложке клетки после совместной инкубации клеток с ДА и ГП (е). Клетки на Зсут их роста в стандартных условиях после формирования монослоя на покровном стекле в контроле (ж) и спустя 5ч инкубации с 10"3М ДА в буферном растворе (з). Масштабная линейка Юмкм.

интенсивности флуоресценции, индуцированному присутствием дофамина в среде инкубации, хотя вызывает перераспределение областей свечения внутри цитозоля. На обзорных снимках видно, что наибольшая интенсивность флуоресценции в присутствии одного дофамина наблюдается в кортикальном слое и ядре клеток, то есть в локусах клетки с наибольшим содержанием актина (Павлик и др., 1997, ЦрЬага е1 а!., 2008). При совместном его воздействии с ГП интенсивность свечения кортикального слоя ослабляется до уровня глубинных областей цитоплазмы. На этом фоне выделяется повышенная интенсивность флуоресценции ядра. Исследования причины такого эффекта не входили в планы нашей работы, однако в дальнейшем они будут изучены более детально.

Сравнительные исследования результатов гистохимической окраски методом Фалька клеток ВНК-21 в различных экспериментальных условиях выявили прямую зависимость интенсивности флуоресценции клеток от времени взаимодействия их с дофамином и от его концентрации. Наиболее наглядна она при использовании дофамина в концентрации 10"3М, когда уже через ЗОмин инкубации клеток наблюдается возрастание интенсивности флуоресценции в области кортикального слоя, которая по мере дальнейшей инкубации постепенно распространяется вглубь цитозоля клеток, а затем в ядро.

Способность дофамина проникать внутрь цитоплазмы обнаруживается не только у клеток, находящихся в суспензии, но и у клеток, подвергнутых его действию на последних стадиях роста культуры, уже после того, как они сформировали монослой. И в этом случае видно, что интенсивность свечения цитоплазмы клеток после воздействия дофамина многократно повышается. В то же время сравнение интенсивности свечения клеток, подвергнутых воздействию дофамина в разных экспериментальных условиях, с очевидностью показывает, что клетки до прикрепления к субстрату, при условиях равенства концентрации и длительности его действия, обладают существенно большей интенсивностью флуоресценции, чем клетки в монослое.

Рис. 9. Зависимость интенсивности флуоресценции клеток ВНК-21 от концентрации ДА в среде после 5ч инкубации.

Прикрепившиеся (а) и не прикрепившиеся (б) клетки.

1 - контроль; 2 - в присутствии 10"5М ДА; 3 - в присутствии 10"4М ДА; 4 - в присутствии 10"3М ДА. Вертикальные отрезки - доверительный интервал (р < 0,05). Во всех случаях различия между опытом и контролем значимы.

Полуколичественный анализ относительной интенсивности флуоресценции клеток после их взаимодействия с дофамином различной концентрации (рис. 9) показывает, что данная величина пропорциональна его концентрации, и что прикрепившиеся клетки менее чувствительны к воздействию дофамина, чем те, которые подвергались его влиянию, находясь в суспензии.

Таким образом, определено, что главным ультраструктурным отличием контрольных клеток и клеток, подвергшихся действию дофамина, является возникновение в цитоплазме мощных ориентированных пучков и густой сети актиновых нитей. Их топография на ультраструктурных снимках соответствует распределению интенсивности флуоресценции дофамина, наблюдаемой на гистологическом уровне. Совпадает также плотность расположения индуцированных нитей Ф-актина и интенсивность свечения отдельных локусов клетки в случаях изучения временной и концентрационной динамики взаимодействия дофамина с клетками ВНК-21. Все это при совместном рассмотрении позволяет предположить, что появление наблюдаемых в цитозоле клеток нитей актина индуцировано взаимодействием дофамина, проникшим внутрь клетки, с цитоплазматическим Г-актином. Вызвав образование нитей Ф-актина, дофамин, по всей вероятности, остается встроенным в них, о чем свидетельствует неоднородность областей свечения цитоплазмы и эксперименты, проведенные в условиях in vitro с выделенным актином (см. выше). Последние показали, что молекулы дофамина служат скрепами между молекулами Г-актина, соединяющими их в полимерные нити.

Заключение

находящегося вне живой клетки, с актиновым цитоскелетом, стали эксперименты, проведенные на культуре фибробласто-подобных трансформированных клеток ВНК-21. С их помощью удалось более глубоко продемонстрировать некоторые детали взаимодействия, получить которые на нейронах, расположенных в глубине мозга, не представлялось возможным из-за того, что они окружены массой не нейрональных (глиальных) клеток, имеющих иную природу, и функцию которых нельзя контролировать. Известно, что фибробласты, не прикрепившиеся к субстрату, имеют слабо развитый актиновый цитоскелет, основная масса цитозольного актина представлена глобулярной его формой (Wojciak-Stothard et al., 1995; Ujihara et al., 2008). В нашей работе установлено, что взаимодействие этих клеток с дофамином губительно для них, и обусловлен такой эффект избыточной и беспорядочной полимеризацией цитозольного актина, которая обнаружена ультраструктурными исследованиями. Наконец, применение реакции Фалька (Lindvall et al., 1975), разработанной для визуализации в клетках катехоламинов, к которым относится дофамин, позволило доказать, что инкубация клеток ВНК-21 в присутствии дофамина приводит к многократному усилению флуоресценции цитоплазмы и ядер, местах наибольшей концентрации актина. Это свидетельствует об одновременном накоплении в тех же локусах значительных количеств дофамина. Было предположено, что свечение обусловлено дофамином, встроенным во вновь образовавшиеся микрофиламенты. На это указывали два обстоятельства. Во-первых, свечение не исчезало после многократной отмывки препаратов. Во-вторых, по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии, примененной для анализа состава Ф-актина, сформированного индуцированным взаимодействием Г-актина с дофамином in vitro, дофамин встраивается в нити, становясь их компонентом. На это указывает тот факт, что при дезинтеграции таких нитей актина мочевиной дофамин выделяется в значительных количествах, в соотношении около 100 молекул на одну молекулу актина. Иными словами, молекулы дофамина являются своеобразными скрепами, соединяющими мономерные молекулы актина в нити. Таким образом, в дополнение к ранее известному и ставшему общепризнанным механизму, основанному на действии дофамина на клетку через рецепторы, получены доказательства существования нового механизма, в котором центральное место занимает прямое трофическое взаимодействие дофамина с актиновым цитоскелетом, возможное благодаря проникновению дофамина внутрь живой клетки. Этот механизм может оказаться полезным при оценке влияния на клетки и ткани других биогенных аминов, в частности, гормонов адреналина и норадреналина, химическая структура которых близка к структуре дофамина.

Выводы

1. Показано, что аппликация дофамина на маутнеровские нейроны золотой рыбки вызывает увеличение размеров актин-содержащих десмосомоподобных контактов и появление пучков актиновых нитей в цитоплазме. Определено, что предварительная блокада Д2 и Д1 дофаминовых рецепторов не влияет на эффект, вызванный дофамином.

2. Установлено, что дофамин вызывает полимеризацию мономерного актина в условиях in vitro. Этот процесс полимеризации прямо коррелирует с соотношением дофамина и актина и с длительностью их взаимодействия.

3. Показано, что трансмембранные токи через модифицированную плоскую билипидную мембрану в условиях фиксации напряжения переменной полярности при добавлении дофамина с наружной ее стороны увеличиваются симметрично. Это свидетельствует о симметричном распределении дофамина по обе стороны мембраны, что предполагает его прохождение через гидрофобную область.

4. Добавление дофамина к суспензии липосом вызывает полимеризацию Г-актина, заключенного в их внутренних полостях. Это означает проникновение дофамина внутрь липосом через фосфолипидные мембраны.

5. Определено, что дофамин, вводимый в культуральную среду, пропорционально концентрации и продолжительности действия понижает жизнеспособность клеток ВНК-21.

6. Установлено, что экзогенно вводимый дофамин вызывает гипертрофию актин-содержащих десмосомоподобных межклеточных контактов и кортикального актинового слоя, повреждает микроворсинки, индуцирует формирование в цитоплазме хаотически ориентированных микрофиламентов, способных локально пронизывать плазматическую мембрану клеток ВНК-21. Определено, что морфофункциональный эффект более заметен у клеток, находящихся в суспензии, чем в монослое, существенно различающихся по содержанию глобулярного актина, субстрата для формирования филаментов.

7. Цитохимическая визуализация методом Фалька катехоламинов в клетках ВНК-21 после инкубации с дофамином выявила многократное по сравнению с контролем усиление интенсивности их флуоресценции в кортикальном слое и ядре, то есть в локусах клетки с наибольшим содержанием актина, что согласуется с данными ультраструктурных исследований.

8. Рассматриваемые вместе, эти комплексные данные свидетельствуют об обнаружении нового механизма взаимодействия дофамина с живыми клетками благодаря его прямому вовлечению в реорганизацию актинового цитоскелета за счет вызванной полимеризации актина.

Список публикаций по теме диссертации

1. Безгина E.H., Павлик JI.JL, Михайлова Г.З., Тирас Н.Р., Удальцов С.Н., Шубина B.C., Мошков Д.А. Морфофункциональные эффекты аппликации глутамата и дофамина на маутнеровские нейроны золотой рыбки. Нейрофизиология. 2006, т. 38, № 4, с. 320-330.

2. Павлик Л.Л., Безгина E.H., Шубина B.C., Шаталин Ю.В., Поцелуева М.М., Д.А.Мошков. Изменения ультраструктуры и функции маутнеровских нейронов золотых рыбок под влиянием 3,4-дигидро-2(1Н)-пиримидинтиона. Морфология, 2007, т. 131, №1, с. 31-36.

3. Павлик Л.Л., Григорьев П.А., Шубина B.C., Бледжянц Д.А., Мошков Д.А. Исследование взаимодействия дофамина с искусственными фосфолипидными мембранами. Биофизика, 2008, т. 53, №1, с. 66-72.

4. Шубина B.C., Абрамова М.Б., Лавровская В.П., Павлик Л.Л., Лежнев Э.И., Мошков Д.А. Влияние дофамина на ультраструктуру клеток ВНК-21. Цитология. 2009, т. 51, № 12, с.

5. Шубина B.C., Лавровская В.П., Безгина E.H., Павлик Л.Л., Мошков Д. А. Цитохимическая и ультраструктурная характеристика клеток ВНК-21, подвергнутых воздействию дофамина. Морфология, 2009, принята в печать.

6. Павлик Л.Л., Безгина E.H., Шубина B.C. Морфофункциональное исследование эффекта аппликации синтетического производного дофамина на маутнеровские нейроны золотой рыбки. Морфология. Колосовские чтения-2006. (Тезисы V-й Международной конференции по функциональной нейроморфологии). 2006, т. 129, № 2, с. 70-71.

7. Павлик Л.Л., Шубина B.C., Безгина E.H., Григорьев П.А., Мошков Д.А. Изучение трофического действия дофамина на нейрональный цитоскелет. Тезисы конференции. Нейронауки: теоретичш та клшчш аспекта. 2007, ДонДМУ, т. 3, №1, с. 33.

8. Павлик Л.Л., Шубина B.C., Григорьев П.А., Безгина E.H., Тирас Н.Р., Осипова Д.А., Мошков Д.А. Исследование взаимодействия дофамина с маутнеровскими нейронами, модельными мембранами и мономерным актином. Тезисы докладов XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова. 2007, Москва, «Русский врач», с. 364-365.

9. Шубина B.C., Григорьев П.А., Бледжянц Д.А., Павлик Л.Л., Мошков Д.А. Взаимодействие дофамина с модельными фосфолипидными мембранами. Третий Международный междисциплинарный конгресс «Нейронаука для медицины и психологии». 2007, М.: «Макс-пресс», с. 272-273.

10. Шубина B.C., Григорьев П.А., Бледжянц Д.А. Дофамин способен проникать через искусственные фосфолипидные мембраны. Материалы 11-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2007, ГП Серпуховская типография, с. 24.

11. Шубина. B.C., Абрамова М.Б. Изучение трофического действия дофамина на культуру клеток ВНК-21. В сб. «Материалы школы-конференции молодых ученых, аспирантов и студентов». 2007, Пущино, ИБП РАН, с. 16-20.

12. Шубина B.C., Павлик В.Д., Павлик Л.Л. Влияние антагониста дофаминовых Д2 рецепторов на структуру цитоскелета. Тезисы четвертого Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». 2008, М.: «Макс-пресс», с. 334-335.

13. Шубина B.C., Павлик Л.Л. Действие антагониста дофаминовых Д2-рецепторов галоперидола на актиновый цитоскелет нейрона. Тезисы конференции. Нейронауки: теоретичш та кшшчш аспекта. 2008, ДонДМУ, т. 4, №1, с. 72.

14. Шубина B.C., Софин А.Д., Лавровская В.П., Вихлянцев И.М., Безгина E.H., Павлик Л.Л., Мошков Д.А. Цитохимические и биофизические свидетельства взаимодействия дофамина с цитоскелетом. В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». 2009, Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, т. 1, с. 401-406.

15. Шубина B.C. Дофамин способен прямо взаимодействовать с акгиновым цитоскелетом живой клетки. В сб.: Проблемы нейрокибернетики (материалы XV Международной конференции по Нейрокибернетике), 2009, Ростов-на-Дону, ООО «ЦВВР»,

16. Павлик Л.JI., Шубина B.C., Павлик В.Д., Михеева И.Б. Взаимодействие дофамина с маутнеровскими нейронами золотых рыбок. В сб.: Проблемы нейрокибернетики (материалы XV Международной конференции по Нейрокибернетике), 2009, Ростов-на-Дону, ООО «ЦВВР»,

Работа финансировалась грантами поддержки научных школ НШ № 4981.2006.4 и № 217.2008.4, РФФИ №05-04-48281, Федерального Агентства по Образованию РФ (проект № 1.2.2007), Аналитической ведомственной целевой программой «Развитие научного потенциала высшей школы», проект № 3840, и Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» Федерального агентства по науке и инновациям, номер государственного контракта 02.740.11.0301.

Заказ № 81-а/09/09 Подписано в печать 14.09.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

^pvN. ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30; (495) 778-22-20 i Г^г)] www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шубина, Виктория Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Анатомическая структура дофаминергической системы мозга и ее функции.:.

1.2. Локализация и функции дофамина в других тканях организма.

1.3. Роль катехоламинов в эмбриогенезе.

1.41 Биосинтез и метаболизм катехоламинов.

1.4.1. Биосинтез катехоламинов.

1.4.2. Метаболизм катехоламинов.

1.5. Дофаминовые рецепторы.

1.5.1. Классификация дофаминовых рецепторов.

1.5.2. Структура дофаминовых рецепторов.

1.5.3. Фармакологические свойства дофаминовых рецепторов.

1.5.4. Трансдукция сигнала дофаминовыми рецепторами.

1.6. Дофаминовые транспортеры.

1.6.1. Регуляция транспорта дофамина.

1.6.2. Роль дофаминовых транспортеров при наркотической зависимости.

1.7. Пространственно-временное распределение дофамина.

1.8. Неклассическое влияние катехоламинов на клетку.

1.8.1. а-синуклеин и сф-пептид - как внутриклеточные мишени действия катехоламинов.

1.8.2. Десенсибилизация рецепторов нейротрансмиттерами.

1.8.3. Диффузия дофамина через мембраны (в условиях нормы и патологии).

II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Физиологические эксперименты.

2.3. Электронно-микроскопическое исследование маутнеровских нейронов.

2.4. Морфометрическое исследование контактов МН.

2.5. Изучение взаимодействия Г-актина с дофамином и дигидропиримидинтионом in vitro.

2.6. Негативное контрастирование.

2.7. Изучение взаимодействия дофамина с модельными фосфолипидными мембранами.

2.8. Эксперименты с липосомами, захватившими в свою полость Г-актин.1.

2.9. Культивирование клеток ВНК-21 и оценка их выживаемости.

2.10. Морфологические исследования клеток ВНК-21.

2.11. Цитохимическая визуализация ДА внутри клеток ВНК-21.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование ультраструктуры маутнеровских нейронов.

3.1.1. Морфофункциональные эффекты аппликации дофамина на МН и влияние на них блокады ДА рецепторов.

3.1.2. Морфофункциональные изменения МН под влиянием дигидропиримидинтиона.

3.2. Исследования взаимодействия дофамина с Г-актином и модельными мембранами.

3.2.1. Влияние дофамина на состояние актина.

3.2.2. Изучение взаимодействия дофамина с искусственными фосфолипидными мембранами.

3.3. Влияние ДА на выживаемость и ультраструктуру клеток ВНК-21.

3.3.1. Влияние дофамина на выживаемость клеток ВНК-21.

3.3.2. Действие дофамина на ультраструктуру клеток ВНК-21.

3.3.3. Цитохимическое исследование накопления дофамина внутри клеток ВНК-21.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование цитоскелетных механизмов взаимодействия дофамина с живыми клетками"

Дофамин по химической структуре относится к биогенным аминам, конкретно к катехоламинам. Как гормон, выделяемый эндокринными железами и другими тканями, дофамин оказывает сложное и многогранное гуморальное регулирующее воздействие на организм в целом либо на определённые органы и системы-мишени (Goldstein et. al., 1995; Missale et al., 1998; Mezey et. al., 1998, 1999). Поэтому гормональные нарушения носят системный и комплексный характер, их вред проявляется на организменном уровне. В центральной нервной системе дофамин, играя роль нейротрансмиттера и нейромодулятора, участвует в контроле двигательной активности (Clark et al., 1991; Furmidge et al., 1991; Pereda et al., 1992, 1994), эмоций (Nieoullon, Coquerel, 2003; Salgado-Pineda et al., 2005), нормального поведения (Ikemoto, Panksepp, 1999; Grace et. al., 2007; Phillips, 2007). Нарушение функционирования дофаминергической системы в мозге приводит к развитию различных патологических состояний, таких как наркомания, паркинсонизм, шизофрения, сумеречные состояния и некоторые другие (Угрюмов, 2007, Nestler, Malenka, 2004). Согласно классической и общепринятой точки зрения, широко освещенной и интенсивно исследуемой в настоящее время, мишенью действия дофамина считаются специфические рецепторы, расположенные на плазматической мембране нейрона (Раевский 1996; Missale et al., 1998; Шабанов, 2004). Лигандные взаимодействия нейротрансмиттера с ними влечет за собой изменение баланса ионов в цитоплазме, приводящее к активации клетки. Согласно другой точке зрения нейротрансмиттеры, в частности, дофамин, способны в дополнение к их взаимодействию с рецепторами влиять на клетку трофическим образом, минуя рецепторы. Предполагается, например, что, растворяясь в липидах плазматической мембраны, они могут изменять ее физико-химические свойства, в том числе влиять на лигандные и канальные характеристики встроенных в нее рецепторов (Cantor, 2003; Milutinovic et al., 2007). Взаимодействуя с некоторыми цитозольными белками, такими как арпептид, а-синуклеин или актин, катехоламины могут вызывать изменения функциональной активности клеток, влияющей на их жизнеспособность (Павлик и др., 2004; 1л е1 а1., 2004). Гипотеза о трофическом взаимодействии дофамина с определенными субстратами клетки пока разработана крайне слабо, большинство ее аспектов лишь теоретически обозначено, все они требуют экспериментальной проверки и подтверждения с привлечением комплексных подходов, использующих применение различных методов и разных объектов исследований.

Целью настоящей работы было комплексное морфофункциональное исследование влияния дофамина на живые клетки и на искусственные модельные системы для определения клеточной мишени действия нейротрансмиттера.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфофункциональные эффекты аппликации на маутнеровские нейроны золотой рыбки дофамина и определить его внутриклеточные мишени.

2. Изучить биофизическими методами поведение дофамина в модельных системах, в частности, его взаимодействие с выделенным глобулярным (Г-) актином, влияние на плоскую билипидную мембрану, способность воздействовать на агрегатное состояние актина, предварительно заключенного в тонкостенные липосомные везикулы.

3. Изучить взаимодействие дофамина с культивируемыми фибробластоподобными клетками линии ВНК-21, определить его эффект на выживаемость и ультраструктуру клеток, а также выявить внутриклеточную локализацию с помощью цитохимической реакции Фалька для выявления катехоламинов.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Шубина, Виктория Сергеевна

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Механизм внутриклеточного действия дофамина невозможно определить без решения главного вопроса о его клеточной мишени. Приведенные в настоящей работе данные дают основания полагать, что дофамин может оказывать эффект на клетку иной, чем предполагает классическое лигандное взаимодействие с рецепторами различного типа (их в настоящее время насчитывается 5, не считая множества подтипов), играющее роль в организации нормального функционирования мозга. Как оказалось, дофамин способен прямо влиять на актиновый компонент цитоскелета. На это указывает набор экспериментальных фактов. Последовательный ряд экспериментов поэтапно привел к однозначному заключению о том, что трофическое действие дофамина при взаимодействии с живой клеткой действительно имеет место. Началось все со случайно обнаруженного закономерного качественного и количественного изменения внутриклеточных структур, построенных из Ф-актина, после аппликации дофамина на маутнеровские нейроны золотой рыбки (Павлик и др., 2004). Дальнейшие исследования показали, что это не артефакт и не систематическая ошибка. Было определено, что дофаминовые рецепторы, играющие исключительно важную и доказанную роль в возбуждении нейронов (Раевский 1996; Missale et al., 1998; Шабанов, 2002), по всей видимости, не оказывают существенного влияния на наблюдаемые изменения актинового цитоскелета, индуцированные дофамином, поскольку их блокада не влияет на эффект самого дофамина. Кроме того, аппликация на нейроны пиримидинтиона, производного дофамина, по-видимому, не обладающего сродством к ДА-рецепторам (Kalani, et. al., 2004; Zhang et al., 2009) оказывала эффект, аналогичный тому, который вызывает дофамин. Далее, было установлено, что молекулы дофамина, гидрофильные по своей природе, способны проникать через гидрофобную сердцевину искусственных фосфолипидных мембран, что было предсказано теоретически (Hansch, Leo, 1979; Wallace, Connell, 2008). Экспериментально проницаемость фосфолипидных мембран для дофамина удалось показать теперь с помощью экспериментов на плоской билипидной мембране, методология и аппаратура для проведения которых была разработана ранее (Grigoriev et al., 1990), и на липосомах, наполненных Г-актином, идея использовать которые почерпнута из литературы (Miyata, 1992, 1999). Толчком для реализации последней послужили ранее полученные данные о полимеризации Г-актина под влиянием дофамина при их взаимодействии in vitro (Павлик и др., 2004). Заключительным этапом в исследованиях, показавшим прямое взаимодействие дофамина, находящегося вне живой клетки, с актиновым цитоскелетом, стали эксперименты, проведенные на культуре фибробласто-подобных трансформированных клеток ВНК-21. С их помощью удалось более глубоко продемонстрировать некоторые детали взаимодействия, получить которые на нейронах, расположенных в глубине мозга, не представлялось возможным из-за того, что они окружены массой не нейрональных (глиальных) клеток, имеющих иную природу, и функцию которых нельзя контролировать. Известно, что фибробласты, не прикрепившиеся к субстрату, имеют слабо развитый актиновый цитоскелет, основная масса цитозольного актина представлена глобулярной его формой (Wojciak-Stothard et al., 1995; Ujihara et al., 2008). В нашей работе установлено, что взаимодействие этих клеток с дофамином губительно для них, и обусловлен такой эффект избыточной и беспорядочной полимеризацией цитозольного актина, которая обнаружена ультраструктурными исследованиями. Наконец, применение реакции Фалька (Lindvall et al., 1975), разработанной для визуализации в клетках катехоламинов, к которым относится дофамин, позволило доказать, что инкубация клеток ВНК-21 в присутствии дофамина приводит к многократному усилению флуоресценции цитоплазмы и ядер, местах наибольшей концентрации актина. Это свидетельствует об одновременном накоплении в тех же локусах значительных количеств дофамина. Было предположено, что свечение обусловлено дофамином, встроенным во вновь образовавшиеся микрофиламенты. На это указывали два обстоятельства. Во-первых, свечение не исчезало после многократной отмывки препаратов. Во-вторых, по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии, примененной для анализа состава Ф-актина, сформированного индуцированным взаимодействием Г-актина с дофамином in vitro, дофамин встраивается в нити, становясь их компонентом. На это указывает тот факт, что при дезинтеграции таких нитей актина мочевиной дофамин выделяется в значительных количествах, в соотношении около 100 молекул на одну молекулу актина. Иными словами, молекулы дофамина являются своеобразными скрепами, соединяющими мономерные молекулы актина в нити. Таким образом, в дополнение к ранее известному и ставшему общепризнанным механизму, основанному на действии дофамина на клетку через рецепторы, получены доказательства существования нового механизма, в котором центральное место занимает прямое трофическое взаимодействие дофамина с актиновым цитоскелетом, возможное благодаря проникновению дофамина внутрь живой клетки. Этот механизм может оказаться полезным при оценке влияния на клетки и ткани других биогенных аминов, в частности, гормонов адреналина и норадреналина, химическая структура которых близка к структуре дофамина.

122

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шубина, Виктория Сергеевна, Пущино

1. Буданцев А.Ю. Моноаминергические системы мозга. М., «Наука». 1976. 192 с.

2. Бузников Г.А., Безуглов В.В. 5-гидрокситриптамиды и 3-гидрокситирамиды полиеновых жирных кислот в изучении донервных функций биогенных моноаминов. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2000. 86(9): 1093-1108.

3. Бузников Г.А. Донервные трансмиттеры как регуляторы эмбриогенеза. Современное состояние проблемы. Онтогенез. 2007. 38(4):262 —270.

4. Гайер Г. Электронная гистохимия. М., «Мир». 1974. 488 с.

5. Глебов Р.Н., Крыжановский Г.Н. Функциональная биохимия синапсов. М.: Медицина. 1978. 326 с.

6. Дзебан Д.А., Мухтасимова Н.Ф., Павлик JLJL, Мошков Д.А. Ультраструктура десмосомоподобных контактов смешанных синапсов маутнеровских нейронов при долговременной потенциации. Морфология. 2003. 123(2):33 -38.

7. Зефиров A.JL, Черанов С.Ю., Гиниатуллин, Г.Ф. Ситдикова, С.Н. Гришин. Медиаторы и синапсы. Учебное пособие. Казань (Казанский государственный медицинский университет). 2003. 67 с.

8. Исмайлова, Х.Ю., Агаев, Т.М., Семенова, Т.П. Индивидуальные особенности поведения: моноаминергические механизмы. Баку: «Нурлан». 2007. 228 с.

9. Ю.Михайлова Г.З., Павлик В.Д., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Корреляция размеров маутнеровских нейронов с предпочтением золотых рыбок поворачиваться вправо или влево. Морфология. 2005. 127(2):16 19.

10. П.Михайлова Г.З., Арутюнян A.B., Санталова И.М., Павлик В.Д., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Асимметрия моторного поведения золотой рыбки в узком канале. Нейрофизиология. 2005. 37(1):52 60.

11. Мошков Д. А. Адаптация и ультраструктура нейрона. М.: Наука. 1985. 200 с.

12. Мошков Д.А., Безгина E.H., Павлик Л.Л., Мухтасимова Н.Ф., Мавлютов Т.А. Распределение ионов кальция в смешанных синапсах маутнеровских нейронов золотой рыбки в норме, при утомлении и при адаптации к нему. Морфология. 2003. 124(6):41 -46.

13. Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Мошков Д.А. Актин в маутнеровских нейронах золотых рыбок после действия фаллоидина и адаптации к длительной стимуляции. Цитология. 1997. 39(12): 1109 1115.

14. Павлик Л.Л., Тирас Н.Р., Мухтасимова Н.Ф., Пахотин П.И., Дзебан Д.А., Мошков Д.А. Участие актина в электротонической проводимости смешанных синапсов маутнеровских нейронов золотой рыбки. Морфология. 2003. 123(1):41 -45.

15. Павлик Л.Л., Безгина Е.С., Тирас Н.Р., Михеева И.Б., Удальцов С.Н., Мошков Д.А. Структура смешанных синапсов маутнеровских нейронов при воздействии веществ, изменяющих проводимость щелевых контактов. Морфология. 2004. 125(2):26 31.

16. Раевский К.С., Сотникова Т.Д. Гайнетдинов P.P. Дофаминергические системы мозга: рецепторная гетерогенность, функциональная роль, фармакологическая регуляция. Успехи физиологических наук. 1996. 27(4):3 29.

17. Репина В.П. Механизмы влияния катехол аминов на регуляцию иммунного гомеостаза. Автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2008. Архангельск.

18. Рощина В.В. Биомедиаторы в растениях. Ацетилхолин и биогенные амины. Пущино, ПНЦ АН СССР. 1991. 192 с.

19. Сотников О.С. Состав и структурная кинетика живых асинаптических дендритов. СПб.: Наука. 2008. 397 с.

20. Тирас Н.Р., Мошков Д. А. Поведенческое и ультраструктурное исследование влияния аппликации колхицина на маутнеровские нейроны золотой рыбки Carassius auratus. Ж. эволюц. биох. и физиол. 1978. 14(5):486-491.

21. Тирас Н.Р. Морфологические корреляты функциональной пластичности маутнеровских нейронов. Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук. 2007. Пущино.

22. Шабанов П.Д., Лебедев А.А., Мещеров Ш.К. Нейробиологические механизмы подкрепления, активируемые психостимуляторами и глюкокортикоидами. Наркология. 2002. 1:19-26.

23. Agnati L.F., Zoli M., Strômberg I., Fuxe К. Intercellular communication in the brain: wiring versus volume transmission. Neuroscience. 1995. 69(3):711-26.

24. Albert P.R., Neve K.A., Bunzow J.R., Civelli O. Coupling of a cloned rat dopamine-D2 receptor to inhibition of adenylyl cyclase and prolactin secretion. J. Biol. Chem. 1990. 265(4):2098-104.

25. Amara S.G., Kuhar M.J. Neurotransmitter transporters: recent progress. Annu. Rev. Neurosci. 1993. 16:73-93.

26. Anitole-Misleh K.G., Brown K.M. Developmental regulation of catecholamine levels during sea urchin embryo morphogenesis. Сотр. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2004. 137(l):39-50.

27. Asghari V., Sanyal S., Buchwaldt S., Paterson A., Jovanovic V., Van Toi H.H. Modulation of intracellular cyclic AMP levels by different human dopamine D4 receptor variants. J. Neurochem. 1995. 65(3): 1157-65.

28. Baba M., Nakajo S., Tu P.H., Tomita T., Nakaya K., Lee V.M., Trojanowski J.Q., Iwatsubo T. Aggregation of alpha-synuclein in Lewy bodies of sporadic Parkinson's disease and dementia with Lewy bodies. Am. J. Pathol. 1998. 152(4):879-84.

29. Barak L.S., Yocum R.R., Nothnagel E.A., Webb W.W. Fluorescence staining of the actin cytoskeleton in living cells with 7-nitrobenz-2-oxa-l,3-diazole-phallacidin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. 77(2):980-4.

30. Bergmann M., Sautner T. Immunomodulatory effects of vasoactive catecholamines. Wien Klin. Wochenschr. 2002. 114(17-18):752-61.

31. Birkmayer W., ICnoll J., Riederer P., Youdim M.B., Hars V., Marton J. Increased life expectancy resulting from addition of L-deprenyl to Madopar treatment in Parkinson's disease: a longterm study. J. Neural. Transm. 1985. 64(2): 113-27.

32. Blalock J.E. Production of peptide hormones and neurotransmitters by the immune system. Chem. Immunol. 1992. 52:1-24.

33. Bruns D., Riedel D., Klingauf J., Jahn R. Quantal release of serotonin. Neuron. 2000. 28(l):205-20.

34. Brunzell D.H., Russell D.S., Picciotto M.R. In vivo nicotine treatment regulates mesocorticolimbic CREB and ERK signaling in C57B1/6J mice. J. Neurochem. 2003. 84(6): 1431-41.

35. Bungay P.M., Newton-Vinson P., Isele W., Garris P.A., Justice J.B. Microdialysis of dopamine interpreted with quantitative model incorporating probe implantation trauma. J. Neurochem. 2003. 86(4):932-46.

36. Cantor R.S. Receptor desensitization by neurotransmitters in membranes: are neurotransmitters the endogenous anesthetics? Biochemistry. 2003. 42(41): 11891-7.

37. Cass W.A., Larson G., Fitzpatrick F.A., Zahniser N.R. Inhibitors of arachidonic acid metabolism: effects on rat striatal dopamine release and uptake. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991. 257(3):990-6.

38. Chen CJ., Apparsundaram S., Lokhandwala M.F. Intrarenally produced angiotensin II opposes the natriuretic action of the dopamine-1 receptor agonist fenoldopam in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991. 256(2):486-91.

39. Chio C.L., Drong R.F., Riley D.T., Gill G.S., Slightom J.L., Huff R.M. D4 dopamine receptor-mediated signaling events determined in transfected Chinese hamster ovary cells. J. Biol.Chem. 1994. 269(16):11813-9.

40. Civelli O., Bunzow J.R., Grandy D.K., Zhou Q.Y., Van Tol H.H. Molecular biology of the dopamine receptors. Eur. J. Pharmacol. 1991. 207(4):277-86.

41. Clements J.D., Lester R.A., Tong G., Jahr C.E., Westbrook G.L. The time course of glutamate in the synaptic cleft. Science. 1992. 258(5087):1498-501.

42. Cohen A.I., Todd R.D., Harmon S., O'Malley K.L. Photoreceptors of mouse retinas possess D4 receptors coupled to adenylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89(24): 12093-7.

43. Conway K.A., Rochet J.C., Bieganski R.M., Lansbury P.T. Jr. Kinetic stabilization of the alpha-synuclein protofibril by a dopamine-alpha-synuclein adduct. Science. 2001. 294(5545): 1346-9.

44. Cook-Mills J.M., Cohen R.L., Perlman R.L., Chambers D.A. Inhibition of lymphocyte activation by catecholamines: evidence for a non-classical mechanism of catecholamine action. Immunology. 1995. 85(4):544-9.

45. Dardenne M., Savino W. Interdependence of the endocrine and immune systems. Adv. Neuroimmunol. 1996. 6(4):297-307.

46. De Camilli P., Macconi D., Spada A. Dopamine inhibits adenylate cyclase in human prolactin-secreting pituitary adenomas. Nature. 1979. 278(5701):252-4.

47. De Marco F., Perluigi M., Marcante M.L., Coccia R., Foppoli C., Blarzino C., Rosei M.A. Cytotoxicity of dopamine-derived tetrahydroisoquinolines on melanoma cells. Biochem. Pharmacol. 2002. 64(10):1503-12.

48. Dilger J.P. The effects of general anaesthetics on ligand-gated ion channels. Br. J. Anaesth. 2002. 89(1):41-51.

49. Dugue G.P., Dumoulin A., Triller A., Dieudonne S. Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses. J. Neurosci. 2005. 25(28):6490-8.

50. Einhorn L.C., Oxford G.S. Guanine nucleotide binding proteins mediate D2 dopamine receptor activation of a potassium channel in rat lactotrophs. J. Physiol. 1993. 462:563-78.

51. Eisenhofer G., Coughtrie M.W., Goldstein D.S. Dopamine sulphate: an enigma resolved. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 1999. 26:S41-53.

52. Ermishkin L.N., Kasumov K.M., Potseluyev V.M. Properties of amphotericin B channels in a lipid bilayer. Biochim. Biophys. Acta. 1977. 470(3):357-67.

53. Ferencik M., Stvrtinova V. Is the immune system our sixth sense? Relation between the immune and neuroendocrine systems. Bratisl. Lek. Listy. 1997. 98(4): 187-98.

54. Floor E., Leventhal P.S., Wang Y., Meng L., Chen W. Dynamic storage of dopamine in rat brain synaptic vesicles in vitro. J. Neurochem. 1995. 64(2):689-99.

55. Forno L.S. Neuropathology of Parkinson's disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1996. 55(3):259-72.

56. Fredriksson A., Plaznik A., Sundstrom E., Archer T. Effects of D1 and D2 agonists on spontaneous motor activity in MPTP treated mice. Pharmacol. Toxicol. 1994. 75(1):36-41.

57. Furmidge L., Tong Z.Y., Petry N., Clark D. Effects of low, autoreceptor selective doses of dopamine agonists on the discriminative cue and locomotor hyperactivity produced by d-amphetamine. J. Neural. Transm. Gen. Sect. 1991. 86(l):61-70.

58. Gainetdinov R.R., Jones S.R., Fumagalli F., Wightman R.M., Caron M.G. Reevaluation of the role of the dopamine transporter in dopamine system homeostasis. Brain Res. Brain Res. Rev. 1998. 26(2-3): 148-53.

59. Galkin V.E., Orlova A., Lukoyanova N., Wriggers W., Egelman E.H. Actin depolymerizing factor stabilizes an existing state of F-actin and can change the tilt of F-actin subunits. J. Cell Biol. 2001. 153(l):75-86.

60. Garris P.A., Ciolkowski E.L., Pastore P., Wightman R.M. Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain. J. Neurosci. 1994. 14(10):6084-93.

61. Garris P.A., Christensen J.R., Rebec G.V., Wightman R.M. Real-time measurement of electrically evoked extracellular dopamine in the striatum of freely moving rats. J. Neurochem. 1997. 68(1):152-61.

62. Gams P.A., Kilpatrick M., Bunin M.A., Michael D., Walker Q.D., Wightman R.M. Dissociation of dopamine release in the nucleus accumbens from intracranial self-stimulation. Nature. 1999. 398(6722):67-9.

63. Gicquaud C. Actin conformation is drastically altered by direct interaction with membrane lipids: a differential scanning calorimetry study. Biochemistry. 1993. 32(44): 11873-7.

64. Giros B., Caron M.G. Molecular characterization of the dopamine transporter. Trends Pharmacol. Sci. 1993. 14(2):43-9.

65. Gloushankova N.A., Krendel M.F., Alieva N.O., Bonder E.M., Feder H.H., Vasiliev J.M., Gelfand I.M. Dynamics of contacts between lamellae of fibroblasts: essential role of the actin cytoskeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95(8):4362-7.

66. Goedert M. Parkinson's disease and other alpha-synucleinopathies. Clin. Chem. Lab. Med. 2001. 39(4):308-12.

67. Goldstein D.S., Eisenhofer G., Kopin I.J. Sources and significance of plasma levels of catechols and their metabolites in humans. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. 305(3):800-l 1.

68. Goldstein D.S., Holmes C. Neuronal source of plasma dopamine. Clin. Chem. 2008. 54(11):1864-71.

69. Gonon F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 1997. 17(15):5972-8.

70. Gonon F., Burie J.B., Jaber M., Benoit-Marand M., Dumartin B., Bloch B. Geometry and kinetics of dopaminergic transmission in the rat striatum and in mice lacking the dopamine transporter. Prog. Brain Res. 2000. 125:291-302.

71. Grace A.A., Floresco S.B., Goto Y., Lodge D.J. Regulation of firing of dopaminergic neurons and control of goal-directed behaviors. Trends Neurosci. 2007. 30(5):220-7.

72. Griffon N., Pilon C., Sautel F., Schwartz J.C., Sokoloff P. Two intracellular signaling pathways for the dopamine D3 receptor: opposite and synergistic interactions with cyclic AMP. J. Neurochem. 1997. 68(1): 1-9.

73. Grigoriev P.A., Dornberger K., Schlegel R. Studia biophysica. 1990. 138:237244.

74. Grigoriev P.A., Tarahovsky Y.S., Pavlik L.L., Udaltsov S.N., Moshkov D.A. Study of F-actin interaction with planar and liposomal bilayer phospholipid membranes. IUBMB Life. 2000. 50(3):227-33.

75. Groves P.M., Linder J.C., Young S.J. 5-hydroxydopamine-labeled dopaminergic axons: three-dimensional reconstructions of axons, synapses and postsynaptic targets in rat neostriatum. Neuroscience. 1994. 58(3):593-604.

76. Hansch C., Leo A. Substutuent constants for correlation analysis in chemistry and biology. J. Wiley and Sons. New-York, Chichester, Brisbone. Toronto. 1969. 235 p.

77. Harty T.P., Manis P.B. Kinetic analysis of glycine receptor currents in ventral cochlear nucleus. J. Neurophysiol. 1998. 79(4): 1891-901.

78. Heacock R.A., Powell W.S. Adrenochrome and related compounds. Progress in Medicinal Chemistry/Ed. by G.P. Ellis, G.B. West. Amsterdam, London, N.Y.: North-Holland Publishing Company. 1973. 9:275-340.

79. Hegde S.S., Chen C.J., Lokhandwala M.F. Involvement of endogenous dopamine and DA-1 receptors in the renal effects of atrial natriuretic factor in rats. Clin. Exp. Hypertens A. 1991. 13(3):357-69.

80. Hemmings H.C. Jr., Akabas M.H., Goldstein P.A., Trudell J.R., Orser B.A., Harrison N.L. Emerging molecular mechanisms of general anesthetic action. Trends Pharmacol. Sci. 2005. 26(10):503-10.

81. Hestrin S. Activation and desensitization of glutamate-activated channels mediating fast excitatory synaptic currents in the visual cortex. Neuron. 1992. 9(5):991-9.

82. Horn A.S. Dopamine uptake: a review of progress in the last decade. Prog. Neurobiol. 1990. 34(5):387-400.

83. Ikemoto S., Panksepp J. The role of nucleus accumbens dopamine in motivated behavior: a unifying interpretation with special reference to reward-seeking. Brain Res. Brain Res. Rev. 1999. 31(1):6-41.

84. Ingham C.A., Hood S.H., Taggart P., Arbuthnott G.W. Plasticity of synapses in the rat neostriatum after unilateral lesion of the nigrostriatal dopaminergic pathway. J. Neurosci. 1998. 18(12):4732-43.

85. Jahn K., Mohammadi B., Krampfl K., Abicht A., Lochmtiller H., Bufler J. Deactivation and desensitization of mouse embryonic- and adult-type nicotinic receptor channel currents. Neurosci. Lett. 2001. 307(2):89-92.

86. Johnson R.G., Carty S.E., Hayflick S., Scarpa A. Mechanisms of accumulation of tyramine, metaraminol, and isoproterenol in isolated chromaffin granules and ghosts. Biochem. Pharmacol. 1982. 31(5):815-23.

87. Jonas P., Bischofberger J., Sandkiihler J. Corelease of two fast neurotransmitters at a central synapse. Science. 1998. 281(5375):419-24.

88. Jones M.V., Westbrook G.L. Desensitized states prolong GABAA channel responses to brief agonist pulses. Neuron. 1995. 15(1): 181-91.

89. Jucaite A. Dopaminergic modulation of cerebral activity and cognitive functions. Medicina. 2002. 38(4):357-62.

90. Kawagoe K.T., Garris P.A., Wiedemann D.J., Wightman R.M. Regulation of transient dopamine concentration gradients in the microenvironment surrounding nerve terminals in the rat striatum. Neuroscience. 1992. 51(1):55-64.

91. Kazmi M.A., Snyder L.A., Cypess A.M., Graber S.G., Sakmar T.P. Selective reconstitution of human D4 dopamine receptor variants with Gi alpha subtypes. Biochemistry. 2000. 39(13):3734-44.

92. Kimura K., White B.H., Sidhu A. Coupling of human D-l dopamine receptors to different guanine nucleotide binding proteins. Evidence that D-l dopamine receptors can couple to both Gs and G(o). J. Biol. Chem. 1995. 270(24): 14672-8.

93. Kulagina N.V., Zigmond M.J., Michael A.C. Glutamate regulates the spontaneous and evoked release of dopamine in the rat striatum. Neuroscience. 2001. 102(1): 121-8.

94. Lange K.W., Rausch W.D., Gsell W., Naumann M., Oestreicher E., Riederer P. Neuroprotection by dopamine agonists. J. Neural. Transm. Suppl. 1994. 43:183-201.

95. Lazarides E. Immunofluorescence studies on the structure of actin filaments in tissue culture cells. J. Histochem. Cytochem. 1975. 23(7):507-28.

96. Lazaro-Dieguez F., Aguado C., Mato E., Sanchez-Ruiz Y., Esteban I., Alberch J., Knecht E., Egea G. Dynamics of an F-actin aggresome generatedby the actin-stabilizing toxin jasplakinolide. J. Cell Sci. 2008. 121(Pt 9):1415-25.

97. Lee F.J., Xue S., Pei L., Yukusic B., Chery N., Wang Y., Wang Y.T., Niznik H.B., Yu X.M., Liu F. Dual regulation of NMD A receptor functions by direct protein-protein interactions with the dopamine D1 receptor. Cell. 2002. 111(2):219-30.

98. Lee M.R. Dopamine and the kidney: ten years on. Clin. Sci. 1993. 84(4):357-75.

99. Levant B. The D3 dopamine receptor: neurobiology and potential clinical relevance. Pharmacol. Rev. 1997. 49(3):231-52.

100. Lezcano N., Mrzljak L., Eubanks S., Levenson R., Goldman-Rakic P., Bergson C. Dual signaling regulated by calcyon, a D1 dopamine receptor interacting protein. Science. 2000. 287(5458): 1660-4.

101. Li J., Zhu M., Manning-Bog A.B., Di Monte D.A., Fink A.L. Dopamine and L-dopa disaggregate amyloid fibrils: implications for Parkinson's and Alzheimer's disease. FASEB J. 2004. 18(9):962-4.

102. Li M., Bermak J.C., Wang Z.W., Zhou Q.Y. Modulation of dopamine D(2) receptor signaling by actin-binding protein (ABP-280). Mol. Pharmacol. 2000. 57(3):446-52.

103. Li W.C., Soffe S.R., Roberts A. Glutamate and acetylcholine corelease at developing synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. 101(43):15488-93.

104. Lindvall O., Bjorklund A., Falck B., Svensson L.A. Letters to the editor: New principles for microspectrofluorometric differentiation between DOPA, dopamine and noradrenaline. J. Histochem. Cytochem. 1975. 23(9):697-9.

105. Lledo P.M., Legendre P., Zhang J., Israel J.M., Vincent J.D. Effects of dopamine on voltage-dependent potassium currents in identified rat lactotroph cells. Neuroendocrinology. 1990. 52(6):545-55.

106. Lledo P.M., Homburger V., Bockaert J., Vincent J.D. Differential G proteinmediated coupling of D2 dopamine receptors to K+ and Ca2+ currents in rat anterior pituitary cells. Neuron. 1992. 8(3):455-63.

107. Lotharius J., Brundin P. Pathogenesis of Parkinson's disease: dopamine, vesicles and alpha-synuclein. Nat. Rev. Neurosci. 2002. 3(12):932-42.

108. Lu Y., Peters J.L., Michael A.C. Direct comparison of the response of voltammetry and microdialysis to electrically evoked release of striatal dopamine. J. Neurochem. 1998. 70(2):584-93.

109. Maguire P.A., Druse M.J. The influence of cholesterol on synaptic fluidity and dopamine uptake. Brain Res. Bull. 1989. 22(2):431-7.

110. Mc Laughlin S. In: Current topics in membrane and transport. Academic Press. New York. 1977. 9:71-135.

111. Meiergerd S.M., Patterson T.A., Schenk J.O. D2 receptors may modulate the function of the striatal transporter for dopamine: kinetic evidence from studies in vitro and in vivo. J. Neurochem. 1993. 61(2):764-7.

112. Meiergerd S.M., Schenk J.O. Striatal transporter for dopamine: catechol structure-activity studies and susceptibility to chemical modification. J. Neurochem. 1994. 62(3):998-1008.

113. Mezey E., Eisenhofer G., Harta G., Hansson S., Gould L., Hunyady B., Hoffman B.J. A novel nonneuronal catecholaminergic system: exocrine pancreas synthesizes and releases dopamine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93(19):10377-82.

114. Mezey E., Eisenhofer G., Hansson S., Hunyady B., Hoffman B.J. Dopamine produced by the stomach may act as a paracrine/autocrine hormone in the rat. Neuroendocrinology. 1998. 67(5):336-48.

115. Mezey E., Eisenhofer G., Hansson S., Harta G., Hoffman B.J, Gallatz K., Palkovits M., Hunyady B. Non-neuronal dopamine in the gastrointestinal system. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 1999. 26:S14-22.

116. Michikawa M., Gong J.S., Fan Q.W., Sawamura N., Yanagisawa K. A novel action of alzheimer's amyloid beta-protein (Abeta): oligomeric Abeta promotes lipid release. J. Neurosci. 2001. 21(18):7226-35.

117. Miller G.W., Gainetdinov R.R., Levey A.I., Caron M.G. Dopamine transporters and neuronal injury. Trends Pharmacol. Sci. 1999. 20(10):424-9.

118. Miller K.W. The nature of sites of general anaesthetic action. Br. J. Anaesth. 2002. 89(1): 17-31.

119. Missale C., Nash S.R., Robinson S.W., Jaber M., Caron M.G. Dopamine receptors: from structure to function. Physiol. Rev. 1998. 78(1):189-225.

120. Miyata H., Hotani H. Morphological changes in liposomes caused by polymerization of encapsulated actin and spontaneous formation of actin bundles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89(23): 11547-51.

121. Miyata H., Nishiyama S., Akashi K., Kinosita K. Jr. Protrusive growth from giant liposomes driven by actin polymerization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96(5):2048-53.

122. Miyazaki I., Asanuma M. Dopaminergic neuron-specific oxidative stress caused by dopamine itself. Acta. Med.Okayama. 2008. 62(3): 141-50.

123. Modesto E., Lampe P.D., Ribeiro M.C., Spray D.C., Campos de Carvalho A.C. Properties of chicken lens MIP channels reconstituted into planar lipid bilayers. J. Membr. Biol. 1996. 154(3):239-49.

124. Muralikrishnan D., Mohanakumar K.P. Neuroprotection by bromocriptine against 1 -methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced neurotoxicity in mice. FASEB J. 1998. 12(10):905-12.

125. Muto S., Tabei K., Asano Y., Imai M. Dopaminergic inhibition of the action of vasopressin on the cortical collecting tubule. Eur. J. Pharmacol. 1985. 114(3):393-7.

126. Nagatsu T. The catecholamine system in health and disease Relation to tyrosine 3-monooxygenase and other catecholamine-synthesizing enzymes — Proc. Jpn. Acad. 2006. Ser. B 82:388 - 414.

127. Nestler E.J., Malenka R.C. The addicted brain. Sci. Am. 2004. 290(3):78-85.

128. Nicholson C., Tao L. Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging. Biophys. J. 1993. 65(6):2277-90.

129. Nicholson C. Interaction between diffusion and Michaelis-Menten uptake of dopamine after iontophoresis in striatum. Biophys. J. 1995. 68(5): 1699-715.

130. Nieoullon A., Coquerel A. Dopamine: a key regulator to adapt action, emotion, motivation and cognition. Curr. Opin. Neurol. 2003. 16 Suppl. 2:S3-9.

131. Nishimaru H., Restrepo C.E., Ryge J., Yanagawa Y., Kiehn O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. 102(14):5245-9.

132. Niznik H.B. Dopamine receptors and transporters: pharmacology, structure, and function. CRC. 1994. 677 p.

133. Pardee J.D., Spudich J.A. In: Methods in cell Biology. Acad. Press. New York. London. 1982. 24 (part A): 271-289.

134. Partilla J.S., Dempsey A.G., Nagpal A.S., Blough B.E., Baumann M.H., Rothman R.B. Interaction of amphetamines and related compounds at the vesicular monoamine transporter. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2006. 319(1):237-46.

135. Pastuszko A., Gordon-Majszak W., Dabrowiecki Z. Dopamine uptake in striatal synaptosomes exposed to peroxidation "in vitro". Biochem. Pharmacol. 1983. 32(1): 141-6.

136. Pedrosa R., Soares-da-Silva P. Oxidative and non-oxidative mechanisms of neuronal cell death and apoptosis by L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) and dopamine. Br. J. Pharmacol. 2002. 137(8):1305-13.

137. Pereda A., Triller A., Korn H., Faber D.S. Dopamine enhances both electrotonic coupling and chemical excitatory postsynaptic potentials at mixed synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89(24): 12088-92.

138. Pereda A.E., Nairn A.C., Wolszon L.R., Faber D.S. Postsynaptic modulation of synaptic efficacy at mixed synapses on the Mauthner cell. J. Neurosci. 1994. 14(6):3704-12.

139. Peters J.L., Michael A.C. Modeling voltammetry and microdialysis of striatal extracellular dopamine: the impact of dopamine uptake on extraction and recovery ratios. J. Neurochem. 1998. 70(2):594-603.

140. Phillips P.E., Walton M.E., Jhou T.C. Calculating utility: preclinical evidence for cost-benefit analysis by mesolimbic dopamine. Psychopharmacology. 2007. 191(3):483-95.

141. Salgado-Pineda P., Delaveau P., Blin O., Nieoullon A. Dopaminergic contribution to the regulation of emotional perception. Clin. Neuropharmacol. 2005. 28(5):228-37.

142. Picard J.J. Utrastructure of the cement gland of Xenopus laevis. J. Morphol. 1976. 148(2): 193-208.

143. Pires A., Croll R.P., Hadfield M.G. Catecholamines Modulate Metamorphosis in the Opisthobranch Gastropod Phestilla sibogae. Biol. Bull. 2000. 198 (3):319-31.

144. Potenza M.N., Graminski G.F., Schmauss C., Lerner M.R. Functional expression and characterization of human D2 and D3 dopamine receptors. J. Neurosci. 1994. 14(3 Pt 2):1463-76.

145. Rajagopalan S., Andersen J.K. Alpha synuclein aggregation: is it the toxic gain of function responsible for neurodegeneration in Parkinson's disease? Mech. Ageing. Dev. 2001. 122(14):1499-510.

146. Reith M.E., Xu C., Chen N.H. Pharmacology and regulation of the neuronal dopamine transporter. Eur. J. Pharmacol. 1997. 324(1):1-10.

147. Rice M.E., Nicholson C. Diffusion characteristics and extracellular volume fraction during normoxia and hypoxia in slices of rat neostriatum. J. Neurophysiol. 1991. 65(2):264-72.

148. Richards C.D. Anaesthetic modulation of synaptic transmission in the mammalian CNS. Br. J. Anaesth. 2002. 89(l):79-90.

149. Rochet J.C., Conway K.A., Lansbury P.T. Jr. Inhibition of fibrillization and accumulation of prefibrillar oligomers in mixtures of human and mouse alpha-synuclein. Biochemistry. 2000. 39(35): 10619-26.

150. Rolandi R., Robello M., Mao C., Mainardi P., Besio G. Adsorption of gamma-aminobutyric acid to phosphatidylserine membranes. Cell Biophys. 1990. 16(l-2):71-83.

151. Sam P.M., Justice J.B. Jr. Effect of general microdialysis-induced depletion on extracellular dopamine. Anal. Chem. 1996. 68(5):724-8.

152. Sanyal S., Van Tol H.H. Dopamine D4 receptor-mediated inhibition of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate production does not affect prolactin regulation. Endocrinology. 1997. 138(5): 1871-8.

153. Scherman D., Henry J.P. Effect of drugs on the ATP-induced and pH-gradient-driven monoamine transport by bovine chromaffin granules. Biochem. Pharmacol. 1980. 29(3): 1883-90.

154. Selkoe D.J. Alzheimer's disease: genotypes, phenotypes, and treatments. Science. 1997. 275(5300):630-l.

155. Sherer N.M., Mothes W. Cytonemes and tunneling nanotubules in cell-cell communication and viral pathogenesis. Trends Cell Biol. 2008. 18(9):414-20.

156. Sidhu A., Kimura K., Uh Mi, White B.H., Patel S. Multiple coupling of human D5 dopamine receptors to guanine nucleotide'binding proteins Gs and Gz. J. Neurochem. 1998*. 70(6):2459-67.

157. Vindis C., Seguelas M.H., Lanier S., Parini A., Cambron C. Dopamine induces ERK activation in renal epithelial cells through H202 produced by monoamine oxidase. Kidney Int. 2001. 59:76-86.

158. Vizi E.S. Role of high-affinity receptors and membrane transporters in nonsynaptic communication and drug action in the central nervous system. Pharmacol. Rev. 2000. 52(l):63-89.

159. Wallace L.J., Connell L.E. Mechanisms by which amphetamine redistributes dopamine out of vesicles: a computational study. Synapse. 2008. 62(5):370-8.

160. Watts V.J., Lawler C.P., Gonzales A.J., Zhou Q.Y., Civelli O., Nichols D.E., Mailman R.B. Spare receptors and intrinsic activity: studies with D1 dopamine receptor agonists. Synapse. 1995. 21(2): 177-87.

161. Weiss S., Sebben M., Garcia-Sainz J.A., Bockaert J. D2-dopamine receptor-mediated inhibition of cyclic AMP formation in striatal neurons in primary culture. Mol. Pharmacol. 1985. 27(6):595-9.

162. Wiedemann DJ., Garris P.A., Near J.A., Wightman R.M. Effect of chronic haloperidol treatment on stimulated synaptic overflow of dopamine in the rat striatum. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992. 261(2):574-9.

163. Wightman R.M., Robinson D.L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 2002. 82(4):721-35.

164. Witt T., Hock F.J., Lehmann J. 7-Methyl-6,7,8,9,14,15-hexahydro-5H-benzd.indolo[2,3-g]azecine: a new heterocyclic system and a new lead compound for dopamine receptor antagonists. J. Med. Chem. 2000. 43(10):2079-81.

165. Wojciak-Stothard B., Curtis A.S., Monaghan W., McGrath M., Sommer I., Wilkinson C.D. Role of the cytoskeleton in the reaction of fibroblasts to multiple grooved substrata. Cell Motil. Cytoskeleton. 1995. 31(2):147-58.

166. Yamaguchi I., Harmon S.K., Todd R.D., O'Malley K.L. The rat D4 dopamine receptor couples to cone transducin (Galphat2) to inhibit forskolin-stimulated cAMP accumulation. J. Biol. Chem. 1997. 272(26): 16599-602.

167. Yamakura T., Bertaccini E., Trudell J.R., Harris R.A. Anesthetics and ion channels: molecular models and sites of action. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2001. 41:23-51.

168. Yan D., Cheng L.F., Song H.Y., Turdi S., Kerram P. Electrophysiological effects of haloperidol on isolated rabbit Purkinje fibers and guinea pigs papillary muscles under normal and simulated ischemia. Acta. Pharmacol. Sin. 2007. 28(8): 1155-60.

169. Yang H., Peters J.L., Michael A.C. Coupled effects of mass transfer and uptake kinetics on in vivo microdialysis of dopamine. J. Neurochem. 1998. 71(2):684-92.

170. Young S.D., Michael* A.C. Voltammetry of extracellular dopamine in rat striatum during ICSS-like electrical stimulation of the medial forebrain bundle. Brain Res. 1993. 600(2):305-7.

171. Zhang J., Xiong B., Zhen X., Zhang A. Dopamine D1 receptor ligands: where are we now and where are we going. Med. Res. Rev. 2009. 29(2):272-94.1471. БЛАГОДАРНОСТИ

172. В заключение я хочу искренне поблагодарить моих научных руководителей профессора, д.б.н. Мошкова Дмитрия Алексеевича и д.б.н. Павлик Любовь Леоновну за постоянную помощь в проведении работы и подготовке диссертации, ценные советы и рекомендации.

173. Выражаю глубокую признательность профессору, д.б.н. Зое Александровне Подлубной и сотрудникам её лаборатории Вихлянцеву И.М. и Марсагишвили Л.Г.

174. Я благодарна своим родителям за постоянную поддержку и помощь, а так же моему мужу Шаталину Юрию Викторовичу за неоценимые советы и участие.

Информация о работе

Шубина, Виктория Сергеевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование цитоскелетных механизмов взаимодействия дофамина с живыми клетками - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы