Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление дофаминэргических структур головного мозга с использованием антител к конъюгированному дофамину

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Выявление дофаминэргических структур головного мозга с использованием антител к конъюгированному дофамину"

Р16 од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ

На правах рукописи

АЖИПА Ольге Ярославовна

УДК 612.577.23

ВЫЯВЛЕНИЕ ДОФАМИНЭРГИЧЕСКИХ СТРУКТУР ГОЛОВНОГО МОЗГА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ К КОНЫЗГИРОВАННОМУ ДОФАМИНУ.

03.00.13 - физиология человека и животных 14.00.36 - иммунология и аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидате биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН и Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения ИЗ РФ-

Научжа руководители » доктор биологических наук,

профессор Косицын Н-С-,

кандидат медицинских наук Макарове О-В.

Официальные оппоненты = доктор медицинских наук,

профессор Кругликов Р.И., кандидат биологических наук Сологуб В-К.

Ведущая организация : биологический факультет МГУ

т. ИВЛомоносова

Защита диссертации состоится на заседании Специализированного Ученого Совета Д.СЮЗ.10.01 Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г.Москва, ул. Бутлерова, Ба) июня 1993 г. в часов

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь С пециализированного совета доктор биологических наук

О^Каитоянц ах.

Актуальность тем* Изучение дофвшшвртичвсзеих структур центральной нервной системы имеет большое значение для понимания нейрохимических механизмов функционирования мозга, а также механизмов развитая таких

заболеваний как паркинсонизм, эпилепсия, шизофрения (e*es* i., Frasmr СЛ., 1967, Horn A.S., Korf J., 1979). Визуализация ЗТШ. структур в норгле и при патологии определяется наличием высокоселективного маркера, позволяющего дифференцировать дофамин от .других близкородственных биогенных моноамшов гаорадреналин, адреналин, L-ДОФА). ШирОКОПрКМбНЯеМЫЙ метод гистофлуоресценции (Falck 8. et al., IS62), использование антител к ферментам метаболизма нейротрансмитге-ров (Chen-Palay et л!., 1984), В T3K2G М6Т0ДО. ОСНОВЯННЫЭ На транспорте тченньз аналогов (оаысагпея l., IS83) и пероксидвзы хрена (Fhiiiipion d.t., 1979) не дают возможности избирательно картировать нейрон» имендие различные иледияторы.

Комбинирование зтах методов, тем не менее, позволило проанализировать основные моноаминаргические системы головного мозга. Однако при обнэругении нервных терминале^ а также при исследовали зон со смешанной иннервацией высокой плотности использование вьиеперечис-ленных методов приводит к небесспорньм результатам. Трудности, свя-~с::ные с недостатком специфичности зтах методов, мохно преодолеть, используя антитела непосредственно к самм нейротрансмиттерам.

Нкзксмолекулярнда соединения эндогенного происхо&цения, в тем числа и катехоламмя* образует сешйства структурноподобных соединений. Этим обуславливается более строгие требования к специфичности и аффинности ивдуцируешх ¡ж антител- Получение такого рода антител требует создания высококммуногенныг конызгировянных препаратов, способных индуцировать синтез специфичных к гаптену антител. Известно, что антитела, индуцированные конъпгатом гаптен-носитель, могут существенно различаться в зависимости от характера, размера и положения ковалентной связи, соединяющей его с носителем < white a. et.ai., 1985). Поэтому возникает необходимость выбора оптимального способа синтеза коньигированного антигена-

Целью настоящей работы явилось получение вьюоковффинных и специфичных антител к дофамину для имиуногистохимического выявления дофаминэрги-ческих структур головного мозга.

Поставленная цель предполагала решение следупцих задач:

- синтез препаратов дофамин-белок с различной плотностью апитопа и оценка их имщуногенноси?

- получение поли- и моноклональных антител к коньпгированному до-

фамину и исследование их специфичности и аффинитета с помоиью конкурентного им*уноферментаого анализа;

- ю«уногистохимическое выявление дофаминэргических структур головного мозга крыс с использованием полученных антител. Научная новизна и практическая ценность работа. Получены поли- и мо-ноклональные антитела к коньюгированному дофамину- В ходе работы были синтезированы с помощью глутарового альдегида препараты дофамин-белок и определена оптимальная для этих коньпгатов плотность эпигона, при которой индуцируется наилучший иммунный ответ- Полученные антитела распознавали антигенную детерминанту дофамин-остаток глутарового альдегида, что послужило основой для использования их при им-муногистохимическом выявлении дофамина в головном мозге, фиксированном глутаровым альдегидом-

С помощью конкурентного и*иуноферментного анализа было показано, что антитела дискриминируют дофамин, норадреналин, 1--ДОФА. характеризующиеся как незначительными различиями функциональных групп боковой цепи молекул (Н дофамина и ОН норадреналина), так и более сущест-венньыи (Н дофамина и СООН 1--Д0ФА). Антитела к дофамину, коньюгиро-ванному глутаровьм альдегидом, селективно связывались с эндогенньм дофамином на срезах головного мозга, фиксированного глутаровьм альдегиде«.

Полученные антитела к дофамину могут быть использованы для детального изучения дофаминэргических структур головного мозга на световом и электронномикроскопическом уровне--

Апробация работы. Результаты работы были доложены на меидабораторной конференции в НИИ канцерогенезе РАМН ( Москва, 1990) и на ежегодной научной конференции НИИ морфологии человека РАМН " Актуальные вопросы современной гистопатологии" ( Москва, 1993). Объем и структура диссертации- Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части содержащей результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 4-*% страницах машинописного текста, содержит 19, рисунков и 9 таблиц. Список сокращений. БСА - бычий сывороточный альбумин ИФА - имщуноферментаый анализ НА - норадреналин

ДА-ГА-БСА. ДА-БСА - дофамин, конылтированный с БСА с помощью . глутарового альдегида

ГА-БСА - БСА, модифицированный глутаровьм альдегидом

- 3 -Материалы и метода.

Коньпгирование дофамина проводили с помощью глутарового альдегида по аминогруппе боковой цепи в условиях, обеспечивающих сохранность катехольного компонента молекулы. За основу взята методика (Geffard м. ct ai., 1985). Включение дофамина в молекулу белка контролировали с помощью 2,5,6-3Н/дофам5ша. Методика приготовления коньюгатов норад-ренапин-белок и L-ДОФА-белок в основном следовала методике (Geffam м. et ai., 1986). В опытах по изучению №Э4уногенноста препаратов дофамин-белок с различной плотностью впитопа использовали самок млпей линии balb/c массой тела 18-20 г, полученных из питомника "Столбовая" АШ СССР. Зивотных кмм5визировали конызгвтами дофвмин-бвлок внутриб-рппинно с интервале»! в три недели в дозе 100 мкг на пыль в течение 34 месяцев- Отбор крови производили из хвостовой вены животных.- Перед определением титров антител сыворотку адсорбировали на модифицированном глутаровьм альдегидом носителе в целях удаления антител, специфичных к носителю. Для определения титров специфических антител в сыворотке и асцитных жидкостях животных, отбора позитивных гибридом анализа специфичности полученных антител и субизотапирования антител использовали непрямой ИФА, модифицированный для низкомолекулярных моноаминов (Geffard М. et al., 1985; Geffard М. et al-, 1986). В КЭ-честзэ субстрата для перокевдйэы использовали 2,2-азйноди-/3-втил-бензтаазол1щ-6-сульфонат^н2(serva, ФРГ) и 0,01'/. HgOn- Все стадии им^унофермонтного анализа до ферментатавной, в тем числе и промывки, проводили в присутствии шросульфита натрия, предотвращапцего окисление катехольного компонента катеюламинов-

Гибрид см>1 получали по методу Келлера и Милштейна (1976) слиянием лимфоцитов иммунных мьшей с клетками яееекретарупцей миеломной линии sp2/OAg8, которые устойчивы к 8-азагуанину в концентрации 25 мкг/мл. Слияние клеток нв®4унной селезенки и ликфоузлов с клетками миеломной линии проводили по методу Дэвидсона (1976) в присутствии 50% полиэ-таленгликоля 4000 (Merck, ФРГ) и 10"/. диметилсульфоксвда- Отбор позитивных гибридом производили в дифференциальном варианте с использованием в качестве сорбентов коньпгированного дофамина и модифицированного носителя.-

Селекцию гибридных клонов осуществляли в селективной системе Литлфилда (1966). Клонирование гибридом проводили как методом предельных разведений, так и в 0,3% агаре, используя в качестве фидерного слоя кыаиные спленоциты или макрофаги.

Для получения асцитных жидкостей гибридные клетки в количестве 5-Ю6 вводили млам линии ваив/с, предваритаяьно сенсибидизированньм внутрибршинной инъекцией 0,5 мл приставам Асцитаые жидкости брали через 10-14 дней.

Анализ специфичности получения антител и определение их относительного СрОДСтаа ОСУЩеСТВЛЯЛИ В КОНКУреНТНОМ Ш (1_агт»оп л, Ахв1ьвоп В., 1991).

Локализацию специфических антител выявляли вмунопероксвдазнм методом с использованием комплекса пероксидаза-антипероксидаза ш комплекса биотан-авидин (Полак Дь, Ван Норден О, 1967 ) на криостат-

НЫХ Срезах ГОЛОВНОГО МОЗГа КрЫС Вргасдо/ Оам1ву.

Статистическую обработку полученных данных провода« с использованием критериев Фишера и Стъвдента (Лакин ГА, 1973).

Результаты и обсуждение.

I. Получение поди- и моноклональных антител к коньцтщоввнному дофамину.

Синтез иммуногена. Целесообразность выбора глутарового альдегида в качестве коньигирупцего агента быха обусловлена следуицаи обстоятельствами. КоньпгироЕ-:г!9 дофамина с белком таким способом не приводит к оккупации функциональных групп дофамина, участвущих в формировании его иммунологической специфичности.

CH^CHg-NH-C^KCH^g-CHg-NH- БЕЛОК

В литературе также отмечается значимость степени удаленности гаптен-ной группировки от молекулы носителя для индуцирования высокоаффинных антител и формирования антигенной детерминанты (Bu»nat» Rittenberg MB., 1991» Morel ЙА et aL, 1990). НвЛЬЗЯ HQ УЧИТЫВАТЬ тот факт, что глутаровый альдегид как фиксирущий агент обеспечивает хорошую сохранность гистологического материала и в атом отношении конкурирует с другими фиксаторами.

При синтезе иммуногена иы учитывали также то, что ншиучвий им-

- Б -

мунный ответ раввивавтся у животных, вмунизированных конызгатом гвптен-белок, тещин оптамвльную эштопную плотность гаптена- Поэтому №1 варьировали условия синтеза конызгата ( продолжительность реакции, концентрация глутарового альдегида), добиваясь различного вклшения дофамина в молекулу белка Уровень нагрузки белка дофамином повьшался пропорционально времени инкубации ( рис.1).

Количество коньюгир.

время

инкубации глутарового концентрация ( М )

альдегида с дофамином глутарового альдегида

Рис.1 Влияние условий синтеза коньюгата дофамин-белок на включение дофамина в молекулу белка.

Использование глутарового альдегида в 4-кратаом молярном избытке по отношению к дофамину увеличивало выход связавшегося катехоламина, однако приводило к полимеризации белка. В результате проведенного синтеза были получены коньюгата дофамин-белок с плотностью эгоггопа (количество остатков дофамина на молекулу белка) 4.0, 5.8, 8.6, 8.8, 10.0, 14.0, 18.0, 22.0, которые затем были использованы для иммунизации животных в целях выяснения их иммуногенных свойств. Коньюгаты с очень низким включением ( меньше трех молекул) дофамина в молекулу белка для ижунизации не использовались.

Для выяснения тонкой специфичности полученных антител были синтезированы коньюгаты норадреналин-бвлок и ь-ДОФА-белок в качестве конкурирующих агентов.

Исследование иммуногенных свойств препаратов дофамин-белок с разной плотностью эпитопа- Логика получения антигаптеновых антител требует учета классических представлений о зависимости иммуногенности получаемых препаратов гаптен-носитель от апитопной плотности остатков гап-тена на молекуле носителя, а также от полимерности молекулы носителя. Коньюгаты дофамин-белок с уровнем нагрузки белка гаптеном в диапазоне 4-22 молекулы дофамина на молекулу БСА внутрибрппинно вводили мыпам в дозе 100 мкг коньюгата на мыпь в сопровождении адыванта Фрейнда в течение 3-4 месяцев с интервале»« в три недели. Титры антител определяли в сыворотке животных каждые три недели. Перед определением титров сыворотку истощали на нативном и модифицированном БСА. На рис-2 представлены данные по иммуногенньм свойствам коньюгатов дофамин-белок с различной степенью включения гаптена в молекулу носителя- Препарата ДАд д-БСА и ДА14~БСА индуцировали наиболее выраженный первичный иммунный ответ. Характер ответа на препараты ДАд 6~БСА и ДА10 6-БСА бьш таким же, как и на ДАд д-БСА и ДА-^-БСА . Наибольшей эффективностью среди них "отличался коньюгат ДА14-БСА. Интенсивность первичного иммунного ответа при его введении соответствовала интенсивности ответа при гипериммунизации препаратами ДА^-БСА. Коньюгаты с низкой плотностью гаптена (ДА4-БСА и ДА^ д-БСА) и высоковалентны© коньюгаты (ДА18_22~БСА) практически не различались по способности индуцировать первичный иммунный ответ. Титры антител в сыворотке мышей, однократно иммунизированных ДА4~БСА и ДАд д-БСА, Оьши более чем в три раза ниже, чем у мьшюй, иммунизированных ДА^-БСА. Более существенно различался первичный ответ мыпей, иммунизированных ДА-^^-БСА и ответ животных, получивших одну инъекцию коньюгата ДА14-БСА. Титры антител в сыворотке последних были более чем в четыре раза выпе.

При работе с конызгатами ДАХд_22~БСА мы учитывали то обстоятельство, что их синтез осуществлялся при 4-кратном молярном избытке глутарового альдегида в отношении гаптена, что составило 670-кратный избыток его в отношении белка- Это приводило к заметной полимеризации белка. Поэтому представлялось целесообразным использовать две иммуни-зирущие дозы коньюгата 100 и 10 мкг/мыпь. Однако уменьшением дозы препарата не удалось улучшить иммуногенные свойства ДА18_22_БСА. Тенденции, выявленные при однократном введении препаратов, сохранялись и при повторных иммунизациях с одним лишь исключением, что иммунный ответ на препараты ДА§ д-БСА после гипериммунизации (4 инъекции препарата) практически достигал уровня иммунного ответа на коньюгаты ДАд д-БСА и ДА14-БСА.

- ? -

я

10000 -

в:

§ 8000 -

®

V ш 6000 -

К

СО 4000 -

О)

1 2000 -

га 0

о о

18000 .16000 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2С00 0

40-00 -2000 0

I

-1- Т

^вДж

1 2 3 4 5

1

Д Е

г3Нт!' М т., 1 I

гЧ I N I гЧ ! • I

12 3 4 5 число иммунизаций

Рис.2 Динамика образования антител при иммунизации препаратами дофамин-белок с разной плотностью эпитопа. Молярное соотношение гаптен-белок:А - 4:1; Б - 5,8:1; В - 8,8:1; Г - 14:1; Д - (18-22): 1; Е -(18-22):1. Доза препарата на мышь: А,Б,В,Г,Д - 100 мкг; Е - 10 мкг.

Таким образом, коньюгаты ДА-БСА с разной эпитопной плотностью вызывали иммунный ответ различной интенсивности. Иммуногенность препаратов дофамин-белок возрастала в ряду ДА^-БСА - ДА^ 8-БСА -ДА-^-БСА и уменьшалась при дальнейшем росте валентности гагггена. Индивидуальные различия иммунного ответа среди животных были небольшими. Известно, что оптимальный иммунный ответ при иммунизации антигенами гаптен-носитель развивается в том случае, когда основные параметры этих антигенов (плотность гагггена и молекулярная масса) лежат в определенных пределах (01пйг1а ил. et аь, 1989). Эти параметры взаимосвязаны,: и их существенные изменения влияют на иммуногенность коньюгатов гаптен-носитель независимо от природы молекулы носителя. При работе с коньюгатами гаптен-белок, которые как правило используются для получения антител к низкомолекулярньм соединениям, аффекты связанные с изменением их основных параметров, неоднозначны. Для ти-мус-зависикых антигенов типа дофамин-белок В-клеточное распознавание и аффективная индукция Т-хелперных клонов требуют потенциала макромолекулы как носителя, зависящего, в свою очередь, от плотности гаптена и его ориентации. Следует также отметить, что при получении коньюгатов гаптен-белок не исключается гетерогенность препаратов по эпитопной плотности, особенно при использовании бифункциональных агентов типа глутарового альдегида. Поэтому в низкозамещенных конызгатах ( в наш«« случае ДА^-БСА) возможно присутствие молекул с еще более низкой валентностью гаптена. Вероятно этим можно объяснить то, что ДА^-БСА при многократных введениях в достаточно больших дозах (100 мкг/иыпь) вызывал ответ гораздо меньшей интенсивности, чем ДА^-БСА. Иммуногенность антигенов гаптен-белок зависит также от способа приготовления коньпгата- Ковалентное коньпгирование гаптенных детерминант с белком может приводить к конформационньм изменениям, маскировке эпи-топов, появлению новых антигенных детерминант на носителе, а также неэффективной презентации требующихся апитопов (калпауь1ду! е.: еъ а1„1989). Эту закономерность можно выявить на примере препаратов ДА18_22-бса*' э™ коньюгаты вызывали имщунный ответ даже несколько меньшей интенсивности, чем коньюгаты ДА^-БСА. Коньюгирование в присутствии большого избытка глутарового альдегида могло приводить к полному замещению свободных ю^-групп ( модификация белка), а следовательно, к изменению его антигенности- В результате в процессе иммунизации ответ развивается в большей степени на детерминанту ГА-БСА. В-клеточное распознавание обычно зависит от общей конформации молекулы и может быть существенно изменено внутренней конкуренцией антиген-

ных детерминант (детерминанта ДА-ГА и ГА-БСА). Можно предположить, что для тимус-зависимлс антигенов типа дофамин-белок частичная толе-рогенность обусловлена как специфическими процессами (более характерно для низкозамещенных антигенов), так и неспецифическими, связан-ньми с изменением физикомолекулярных характеристик антигена. Последнее непосредственно связано со способом приготовления конызгата. Для' препаратов ДА^^-БСА частичные толерогенные свойства приобретались в большей степени за счет неспецифических механизмов, чем из-за специфической блокада рецепторов- В пользу последнего, однако, говорит то, что эти конызгаты проявляли толерогенностъ и в меньших на порядок дозах. Считается, что чем выше эпитопная плотность коньпгатов гап-тен-белок, тем при меньшей их молярности индуцируется толерогенез (Pike в. et ai., 1981). С другой стороны, валентность гаптена - 22 молекулы дофамина на молекулу БСА не должна являться критической для иммуногенности коньюгата. Поэтому мы связываем толерогенностъ этих препаратов с модификационными изменениями носителя.

Таким образом, оптимальный говцунный ответ для наших препаратов дофамин-белок развивался при валентности гаптена в диапазоне 5,&-14. Конызгаты с такой плотностью апитопа мы использовали для иммунизации животных при получении антител к дофамину. Получение гибридом и отбор моноклональных антител. Поликлона льна я неистощенная антасыворотка, индуцированная конызгатом ДА-ГА-ВСА, обнаруживала реактивность в отношении ДА-ГА-БСА, модифицированного БСА, немодифицированного БСА, ДА-ГА-человеческий сывороточный альбумин, но не в отношении ГА-человеческий сывороточный альбумин и немодифицированного человеческого сывороточного альбумина. Эти предварительные данные позволили нам судить о направленности ответа в основном против детерминанты ДА-ГА и считать возможным получить моно-клональныв антитела к ней.

Учитывая тот факт, что высокий уровень циркулирующих антител перед гибридизацией клеток на поздних стадиях иммунного ответа снижает ВЫХОД гибридом, продуцирующих специфические антитела (Rathjen О. et ai., 1986), мы сравнивали две схемы иммунизации. Для гибридизации использовали в одном случае спленоциты млпей с наивысшим титром специфических антител, прошедших курс гипериммунизации конызгатом ДА-ГА-БСА. В другом случае гибрвдизировали лимфоциты регионарных узлов (подколенных и паховых), изолированных у мышей, подучивших две инъекции коньюгата с интервалом в II дней в подушки задних лап. Специфическая эффективность габридизации оценивалась как процент гибри-

док продуцирующих специфические антитела к коньпгированному дофамину, от общего числа выросших гибридом. Наибольшая специфическая эффективность (29,2%) достигалась двухкратный введением животаьм достаточно больших количеств конызгата ДА-ГА-БСА с интервалом в II дней. Гибридомы полученные при использовании гиперимцунизированных животных, продуцировали дофамин-реактивные антитела, но с низкой частотой (3,4%).

В результате клонирования, пассщхэвания на животных, повторного тестирования в ИФА в работе оставили 4 клона (условно обозначенные Бо7, 5в2, 3^2, 4о9), сохранивших продукции антител. Все четыре клона происходили от кыпей, прошедших короткий курс иммунизации. Гибридом^ индуцировали у сингенных животных образование асцитвых опухолей с высоким уровнем содержания антител к коньпгированному дофамину. Субклассовую принадлежность полученных моноклональных антител определяли

С ПОМОЩЬЮ СубИЗОТИПСПеЦИфИЧеСКИХ КрОЛИЧЬИХ СЫВОРОТОК (Са1ЫосЬет).

Денные этого эксперимента позволили сделать вывод о гомогенности полученных антител. Клоны 5о7 и Зр2 синтезировали реактивные к коньюги-рованному дофамину антитала субкласса 1д01, а клоны 4о9 и 5В2 - субкласса 1дВЗ.

2. Изучение специфичности полученных антител методом конкурентного имщуноферментного анализа.

Наличие в семействе катехоламинов структурноподобных соединений (дофамин, норадреналин, 1--Д0ФА, адреналин), различающихся по одной функциональной груше, создает предпосылки для перекрестных серологических реакций, индуцируемых этими веществами.

СИ - сн - мн.

I

1

ДО? АМИН НОРДОЕНАЛИН 1_-Д0*А

??.,«■ Н

Кг

■ ОН ; ■ Н - Н ; чг - соон

н

При частичном соответствии конфигурации гаптена и активного центра антитела комплекс между ними образуется, но меньшей прочности чем в

случае их полной комплементарное™. В этой связи в случае низкомолекулярных соединений одного класса принято говорить об относительном сродстве антител к гаптенньм группировкам. Специфичность и аффинитет антител к коньюгированному дофамину оценивали с помощью конкурентного имчуноферментного метода с использованием в качестве конкурирующих агентов родственные дофамину катеюламины. Для этого политональную антасыворотау и моноклональные антитела асцитныг жидкостей предварительно инкубировали в течение 16 часов при 4°С со следующими соединениям» коньюгированньми дофамином, норадреналином, 1.-Д0ФА, неконызги-рованньм дофамином, ортохиновдным производнъм дофамина в коньюгиро-ванной форме и мо/цфицированным БСА, Инкубацию вели в диапазоне концентраций этих соединений от Ю-5 до Ю-*0 М (концентрация конызгиро-ванных соединений по белку). Затем инкубационную смесь переносили в лунки планшеты с иммобилизованным ДА-ГА-БСА в концентрации 10 мкг/ил.-Концентрацию антител, связавшихся с сорбированных коньюгированньм дофамином, определяли непряма» иммуноферментным методом. Для оценки относительного сродства полученных антител строили калибровочные кривые (кривые вытеснения) по типу В/В0 при разных концентрациях конкурирующих агентов. Выбор оптимального разведения связыващего агента позволил повысить специфичность и чувствительность данного анализа. Для этого строили стандартные кривые титрования, полученные из экспериментов з непрямом ЙФА в отсутствие конкуренции, при строго фиксированных условиях. При использовании в качестве компонента субстратной смеси 2-кратного количества 2,2-азиноди-/3-этилбензтиазолин-6-сульфо-нэта линейность зависимости оптической плотности от концентрации ан-тхтел осуществляется при оптической плотности 0,6-0,8. Для контроля качества с.-стезды тестирования (коррекция неспецн*чческого связывания) проводили тр:-т тгоследовательные инкубации антител в выбранных разведе-княа Iря етавдэртнзированных условиях на иммобилизованном ДА-ГА-БСА. ПояучекЕЬЭ соотношения В0"/В0* были >, 0,9, что свидетельствует о приемлемости системы

Хрквые вытеснения для двух антасывороток (полученных при иммунизации конызгатом ДА-ГА-БСА с оптимальной и избыточной плотностью гаптена) и моноклональных антител были построены на основании четырех тестирований для каждой пробы антител. Из анализа кривых вытеснения (рисЗ,4) следует, что поликлональные сыворотки и асцитные авдкости зивотаых содержат высокоаффинные антитела к коньюгированному дофамину (табл. I). Наилучшими характеристиками в плане специфич-

В

концентрации конкурирующего агента

Рис 3. Кривые вытеснения, полученные из экспериментов по конкуренции мевду сорбированным ДА-ГА-БСА и конкурирующими агентами: ДА-ГА-БСА (1), НА-ГА-БСА (2), Ь-ДОФА-ГА-БСА (3), неконыогиро-• ванным ДА (+), БСА-ГА-БСА (5), о-хиновдньм производньм дофамина в коныогированной форме (Б), ДА=ГА=БСА (7), предварительно проинкубированными с:

(А) поликлональными антителами, индуцированными коныогатами ДА-ГА-БСА с оптимальной плотностью эпитопа (разведение 1:5000).

(Б) поликлональными антителами, индуцированными коньюгатами ДА-ГА-БСА с избыточной плотностью эпитопа (разведение 1:1000).

в

концентрации конкурирующего агента

Рис 4. Кривые вытеснения, полученные из экспериментов по конкуренции между сорбированным ДА-ГА-БСА и конкурирующими агентами: ДА-ГА-БСА (1), НА-ГА-БСА (2), Ь-ДОФА-ГА-БСА (3), неконьюгиро-ванным ДА (4-), БСА-ГА-БСА (5), о-хиноидны* производным дофамина в коньюгированной форме (Б), ДА=ГА=БСА (7), предвари тельно проинкубированными с: САЗ МКА клона 51)7 (разведение 1:10000) (Б) МКА клона 5В2 (разведение 1:10000)

Таблица I.

Сродство антител к конызгированному дофамину.

Антитела

Концентрация конкурирующего агента ДА-ГА-ВСА. вызывающая 50х ингиби-рование связывания антител с гамо-билизованньм ДА-ГА-БСА.

политональная антесьворотка моноклональные антитела клона 5Д7

3,2-10 9

5В2 4Д9 ЗР2

2,0-Ю-7 2,0-Ю-6 2,0-Ю-8 2,0- ИТ8

ности отличались поликлональные внтителв, индуцированные ДА-ГА-БСА с оптимальной плотностью епитопа и моноклональные антитела клона 5о7. Для этих антител наблвдалась гораздо меньшая реактивность в отношении конызгированного норадреналина и совсем незначительная реактивность в отношении конызгированного |_-Д0ФА (табиь2). Свободный дофамин не распознавался совсем.. Модифицированный БСА также не влиял на связывание антител с иммобилизованным ДА-ГА-БСА.. Последние два обстоятельства указывают на существенный вклад остатка глутарового альдегида в формирование антигенной детерминанты. Моноклональные антитела клонов 5В2, 4оэ и Зр2 практически не различались по своим дискриминирующим характеристикам в отношении использованных препаратов. Поэтому кривые вытеснения представлены только для одного клона 5В2 (рис.4). Чтобы оценить вклад катехольного компонента в образование распознаваемого апитопа, использовали окисленное производное дофамина в конызгированной форме. Результаты конкурентного анализа указывают на низкую реактивность антител в отношении этого препарата-

Сравнение относительного сродства антадофаминовых антител по отношению к дофамину и его аналогам позволило охарактеризовать тонкую специфичность этих антител. В результате коньюгирования дофамина с белком по аминогруппе боковой цепи с помощью глутарового альдегида остаток дофамин-глутаровый альдегид приобретает свойства сильной антигенной детерминанты. Это имеет особое значение при использовании

Таблица 2

Специфичность анти-дофаминовых антител.

Антатала Конкурирующие Перекрестная

агенты реактивность

Поликлональна я

антисыворотка ДА-ГА-БСА I

ДА=ГА=БСА 1:3.1

ПА- ГА БСА 1:625

L-ДОФА-ГА-БСА <1:20000

ДА :1:50000

о-ХПДА* <1:15000

Моноклоняльные

антатала ДА-ГА-БСА I

клона 5Д7 ДА=ГА=БСА 1:2,6

НА-ГА-БСА 1:153

L-ДОФА-ГА-БСА 1:1538

ДА <1:50000

о-ХПДА 1:3125

* - о-ХПДА - о-хиноидное производное ДА в конызгированной форме

антител на срезах мозга, фиксированного глутаровым альдегидом поскольку антитела распознают именно ту структуру, которая индуциро-эана фиксацией-

С.тенгауичность и аффинитет антител, индуцированных антигенной де-терминянтой дофамин-глютаровый альдегид, обуславливается следующими йактссями. Зо-пеовых, после коньюгирования остаток дофамина остается экспонированным за счет удлинения связи дофамин-белок. Это обеспечивает, ;ю- видимому, ¿альаую доступность гаптена для рецепторов имму-нокомпетентиых клеток. Другой фактор, обуславливающий специфичность кндуцируемых антител, касается структурных особенностей гаптена. Ка теюламины являются полярными заряженными соединениями- Следовательно, Ван-дер-Ваальсово взаимодействие, а также водородные связи опре деляют формирование комплекса дофамина с комплементарньми сайтами антител. Иммунологическая специфичность дофамина определяется прежде всего наличием ароматичности в моле куле (как правило, специфичность анти-катехоламиновых антител бывает направлена именно против этой структуры), а такие двух гидрокскзаместителей в ¡сольце (источник во-

. -16 -

дородных связей). Однако замены груш Н/ОН в латеральной цепи кате-холамина характеризуют различия в молекулах дофамин/норадреналин соответственна' Поэтому способность антител дискриминировать именно эти различия приобретает большое значение в связи с наличием смешанной иннервации во многих областях мозга Участие латеральной цепи дофамина в формировании антигенной детерминанты усиливалось за счет удлинения ковалентной связи дофамин-белок на 4 метальных остатка. Появление в боковой цепи заместителей стерически затрудняет взаимодействие. На это указывает снижение реактивности антител в 150-600 раз в отношении норадреналина (специфичньми считаются антителе, связывающие родственные исходному гаптену соединения в 100-1000 раз хуже). l-ДОФА, имеющий сильно заряженную карбоксигруппу в боковой цепи, фактически не распознавался. Таким образом, наиболее выгодная ориентация для взаимодействия гаггген-антитело формируется при удлинении ковалентной связи дофамин-белок.

З-Имчуногистохимическая оценка способности антител к связыванию с дофамином, локализованные в структурах головного мозга крыс.

При использовании антител в икмуноцитохимических исследованиях, ключевую роль играют ряд факторов: концентрация антител; аффинитет и специфичность антител по отношению к субстанциям, фиксированный в тканях; концентрация субстанций в тканях; специфичность антител к данной субстанции.

Использование твердофазного ИФА для выяснения специфичности антител, используемых в иммуноцитохимии, должно основываться на допущении, что физико-химические характеристики связывания этих антител с нативньм антигеном и антигеном, фиксированные в тканях, одинаковые. Использование антител, распознающих структуру дофамин-остаток глутарового альдегида для иммуноцитохимического обнаружения дофамина позволило нам рассчитывать на положительный результат.

При обнаружении низкомсшекулярньп соединений в тканях эффективность фиксации in vivo определяет результат всей дальнейшей имчуно-цитохимической процедуры. Возможность использования высоких концентраций глутарового альдегида в нашем случае позволила эффективно предотвратить диффузию дофамина. Нами подбирались условия перфузии мозга, обеспечивающие максимальный выход коньюгированного дофамина Оптимальными оказались следующие условия. Самцов крыс линии sprague-Dawiey (5 животных) весом 180-220 г., анестезированных гексе-налом, перфузировали в течение 30 секунд через левое предсердие сначала 20-30 мл подогретого до 37°С физиологического раствора, содержа-

щего 2Q ЕД/мл гепарина и 0,1* нитрита натрия в качестве сосудорасширяющего средства. Далее перфузию продолжали в течение 10-15 мин 400-500 мл (в зависимости от массы тела животного) охлажденного раствора глутарового альдегида в 0.05 M какодилатном буфэре(рН 7.5), содержащем пиросульфита натрия (Na^SgOg). Головной мозг быстро извлекали и дофиксировали в течение 2 часов при комнатной температуре в растворе глутаральдегида, использованном для перфузии. Мозг замораживали в петролейном эфире, охлавденном до -30-50°С. Серийные фронтальные срезы головного мозга изготавливали на криостата при температуре -15-20°С. Исследовали область переднего и среднего отделов головного мозга, богатых дофаминэргическими нейронами и волокнами. Толщина срезов составляла 20-30 мкм. Срезы помещали на предметные стекла, покрытые Tj-полилизином. Затем срезы обрабатывали 0.1 M боргидридом натрия и отмывали. Всо стадии отмывок до ферментативной проводили троекратно в Трис-буфере, содержащем пиросульфит натрия и 0.1% Тритон Х-100,

При выборе концентраций антител для иммуноцитохимического офса-ружения дофамина мы исходили из следующего. По результатам конкурентного ИФА поликлональная антисыворотка в разведении 1:5000 и монокло-нальные антитела клона 5Д7 в разведении 1:10000 обнаруживали довольно слабую перекрестную реактивность с коньюгированным норадреналином. В то же время антитела высокоаффинно связывали коньюгированный дофамин. Специфичность иммуноцитохимической реакции при выявлении дофамина определялась высоким аффинитетом полученных антител, а также высокой разрешающей способностью самого ПАП-метода. Инкубацию срезов с полик-лональными антителами в разведении 1:5000 и моноклональными антителами в разведении 1:10000 проводили в течение 16-18 часов при 4°С. Затем срезы инкубировали в одних случаях с кроличьими антителами против IgG мыши в разведении 1:2000, в других случаях - с биотинилированными (Pab)2 фрагментами козьих антител против igG мыши (Amersham, Великобритания ) в разведении 1:100 в течение 45 мин при комнатной температуре. После отмывки проводили инкубацию срезов либо с ПАП-комплексом (НИИЭМ "Препарат", г.Горький) в разведении 1:10, либо с авидином, меченым пероксидазой (Amersham, Великобритания ) в разведении 1:200 в течение 45 мин при комнатной температуре. Пероксидазу проявляли в течение 30-G0 мин при 37°С по методу Грэхема-Карновского (Дж.Полак, С.Ван Норден, 1987), используя в качестве субстратной смеси 0.05$ 3,3'-диаминобензидин• 4НС1 (Sigma) и 0.01% перекись водорода. Эндогенную пероксидазу ингибировали на стадиях первоначальных отмывок 0.1% Hg02. Срезы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, просвет-

ляли в о-ксилоле и заключали в канадский бальзам. Визуализацию дофаминэргических структур осуществляли в световом микроскопе opton. Топографию срезов контролировали по стереотаксическому атласу мозга

КрЫСЫ (Paxinos Б., Watson С., 1982).

Контроли на специфичность реакции.' Срезы обрабатывали в течение ночи при 4°С антителами, предварительно адсорбированным конызгиро-ванньм дофамином и норадреналином в концентрации ICT^M по амину. С целью контроля использованных реактивов часть срезов подвергали обработке, минуя стадию первых специфических антител.

При гистологическом исследовании микропрепаратов головного мозга, обработанных поликлональной антисывороткой к дофамину и моноклональ-ньми антителами клона 507, продукт галцунопероксидазной реакции выявлялся в нейронах вентральной области покрышш и черной субстанции. Популяции дофаминсодерхащих нейронов вентрального мезенцефалона образует континуум (SN-VTA комплекс), что согласуется с общими представлениями о распределении дофаминэргических нейронов в этой области. Она соответствует А9 группе клеток компактной зоны и наиболее существенной по численности клеток группе АЮ (Domesick v.B., 1983):

Срезы, обработанные антителами, преадсорбированньми избытком дофамина, не обнаруживали окрашивания. Продукт пероксидазной реакции отсутствовал также и на срезах, которые не инкубировали с антидофа-миновьми антителами.

При обработке серийных срезов этой зоны антителами, преадсорбированньми с коньюгированньм норадреналином, окрашивание вентральной области покрышки и черьой субстанции сохранялось. Результаты проведенных контролей позволяют судить о специфическом окрашивании звдо-генного дофамина в нейронах.

Областью медиолатеральных эфферентных проекций из А9 группы черной субстанции является стриатум- Вентральный стриатум (пс. accumbens) отличается наиболее плотной сетью дофаминэргических окончаний (Fickei v.M. et ai., 1961). Специфическое окрашивание дофаминэргических окончаний стриатума выявлялось при обработке срезов головного мозга моноклональными антителами клона Бо7.

Таким образом иммуноцитохимическая оценка способности антител к связыванию с дофамином локализованньм в структурах головного мозга крыс позволила установить, что полученные антитела способны специфически с высоким разрешением связываться с андогенньм дофамине»«. Данные, полученные при иммуноцитохимическом исследовании, коррелируют с результатами иммуноферментного анализа. Полученные антитела по аффи-

нитету и специфичности отвечают требованиям. предъявляемом к антителам, используемы в иммуногистогимшь и могут бьггь использованы для детального исследования дофаминэргических структур центральной нервной СИСТ9№4

Выводы.

I- Подучен высокоселективный маркер эндогенного дофа>йша - поли-и моноклональные антитела к конькгкровянноку дофамину, позволяющей дифференцировать при кадмуноцитохимическом исследовании дофамин от родственных моноаминов (норадреналина и и-ДОФА).

2. Для получения антител синтезированы с помощью глутарового альдегида квк сшиващзго агента препарата дсфемик-бвлок с различной эпитопной плотностью дофамина (от 3 до 22 молекул) на белке.

3. "пучены иг^уютенные свойства препаратов дофзмкн-балок с различной степенью включения гаптена в молекулу балка. Установлено, что оптимальной иммунизирупцей способностью обладали коньюгаты дофа-мин5 8-14_<5елок" Препараты с более низкой (менее 5) и более высокой (более 14) валентностью обладали частичной толерогенностью.

4- Получены политональные и моноклональные антитела к дофамину, коньюгированному с носителем с помощью глутарового альдегида. Антитела не обладали реактивностью в отношении модифицированного носителя. Показана возможность использования сокращенных схем иммунизации (14 дней) для получения антигаптеновых (антидофаминовых) антител.

5. Специфичность и аффинитет полученных антител к дофамину исследовали с использованием конкурирующих родственных соединений: норадреналина и 1--Д0ФА. Антитела распознавали как значительные (водород/ карбоксигруппа 1--Д0ФА), так и незначительные (водород/гидрокслгруппа норадреналина) замены в боковой цепи катехоламина. Полученные поли- и моноклональные антитела обладали высоким сродством к антигенной детерминанте дофамин-остаток глутарового альдегида, что позволяет использовать их для гоодногистохимического выявления дофамина в ткани мозга, фиксированного глутаровьм альдегидом.

6. При иумуногистохимическом исследовании головного мозга крыс, фиксированного глутаровьм альдегидом, показано, что антитела специфически с высоким разрешением связываются с эндогенным дофамином. Дофамин выявляется как в нейронах (комплекс вентральная область покрышки - черная субстанция), так и в нервных терминалях (вентральный стриа-тум).

- 20 -

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Ахипа ОЛ, Макарова О-В- - Получение антител к дофамину, коньпги-рованному с носителем с помощью глутарового альдегида." Биотехнология, 1991, 5, с. 46-50.

2. Ахипа ОД, Косицын ЕС., Макарова О-В. " Имчуногистохимическая характеристика и возможности диагностического использования антител к дофамину." В сб. Актуальные вопросы современной гистопатологии. Москва, 1993, с-120.

3. Малайцев В-В., Ахипа ОА " Влияние плотности апитопа на давцуно-генные свойства коньпгатов гаптен-белок." Бил. экстр* биол. и мед, 1993, N 6 ( в печати).

4. Ахипа 0-Я-, Макарова а В- "Получение антител к дофамину и оценка

их специфичности гаиуноферментаьы и имиуногистохшичесгавд методами." В сб-= Труды Пермского мед. ин-та, 1993, с.57-58.

Подписано к печати 08.04.93 Объем 1,25 пл. Формат 60x841/16 Заки)1 Тираж 60 ТОО "Нерей". ВНИРО. 107140, Москва, В.Красосельская, 17