Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

О роли мелатонина и дофамина в регуляции циркадианных ритмов сетчатки глаза крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поздеев, Никита Владимирович, Санкт-Петербург

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

им. И М. СЕЧЕНОВА

УДК 612.8.015+547.466

О РОЛИ МЕЛАТОНИНА И ДОФАМИНА В РЕГУЛЯЦИИ ЦИРКАДИАННЫХ РИТМОВ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА КРЫСЫ (03.00.04 - биохимия)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -Заслуженный деятель науки, профессор, доктор биологических наук Р.Н. Этингоф

Санкт-Петербург 1999

Содержание

Введение 6

Глава 1. Обзор литературы 12

1.1 Циркадианные ритмы 12

1.2 Циркадианные ритмы в сетчатке 15 1.3Мелатонин 18

1.3.1. Метаболические пути синтеза и деградации мелатонина 18

1.3.2. Мелатонин - основной ритмоводитель циркадианных ритмов, регулируемых центральным циркадианным осциллятором 20 1.3.3 Мелатонин в сетчатке 23

1.4. Дофамин в сетчатке. Антагонистические взаимодействия дофамина и мелатонина 27

1.5. Заключение 31 Глава 2. Методы исследования 33

2.1 Экспериментальные животные, условия их содержания 33

2.2. Условия экспериментов и методы фармакологических воздействий 33

2.3. Реактивы и оборудование 34

2.4. Метод выделения сетчатки глаза крысы 35

2.5. Подготовка проб для определения содержания биогенных аминов и аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 36

2.6. Определение катехоламинов и родственных соединений в сетчатке глаза крысы методом ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием 36

2.7. Определение мелатонина в сетчатке глаза крысы методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием 38

2.8. Определение содержания свободных аминокислот методом обращенно-фазовой высокоэффективной

жидкостной хроматографии с флюориметрическим детектированием 41

2.9. Определение индоламинов и норадреналина в ткани

эпифиза методом ион-парной обращенно-фазовой ВЭЖХ 46

•2

2.10. Метод исследования включения [ Н]-лейцина в белки сетчатки in vitro 46

2.11. Электроретинография 47

2.12. Статистическая обработка полученных данных 49 Глава 3. Результаты исследования 50

3.1. Суточный ритм содержания мелатонина в сетчатке глаза

крыс, находившихся в условиях циклического освещения 50

3.2. Суточный ритм содержания дофамина и его метаболитов в сетчатке глаза крыс, находившихся в условиях циклического освещения 50

3.3. Суточный ритм содержания дофамина и его метаболитов в сетчатке глаза крыс, находившихся в условиях постоянной темноты 53

3.4. Суточный ритм содержания дофамина и его метаболитов в сетчатке глаза крыс, находившихся в условиях постоянного освещения 55

3.5. Суточный ритм содержания свободных аминокислот, этаноламина и фосфоэтаноламина в сетчатке глаза крыс, находившихся в условиях циклического освещения 55

3.6. Суточный ритм содержания свободных аминокислот, этаноламина и фосфоэтаноламина в сетчатке глаза крыс, находившихся в условиях постоянной темноты 63

3.7. Влияние внутрибрюшинного введения мелатонина на содержание свободных аминокислот, дофамина и родственных им соединений в сетчатке глаза крысы в

фотофазу и скотофазу 67

3.8. Влияние мелатонина на содержание свободных аминокислот

на фоне ингибирования синтеза белка циклогексимидом 70

3.9. Влияние внутрибрюшинного введения L-ДОФА на содержание свободных аминокислот, дофамина и

родственных им соединений в сетчатке глаза крысы в

фотофазу и скотофазу 73

3.10. Содержание свободных аминокислот в гипоталамусе и стриатуме крыс в различное время суток у контрольных животных

и после внутрибрюшинного введения мелатонина или L-ДОФА 73

3.11. Исследование влияния мелатонина на скорость включения

[3Н]-лейцина в белки сетчатки in vitro 78

3.12. Содержание катехоламинов в сетчатке и индоламинов в эпифизе у крыс Campbell, больных наследственной дегенерацией сетчатки 80

Глава 4. Обсуждение полученных результатов 85

Выводы 99

Литература 101

Приложение. Таблицы первичных материалов исследований 114

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ала - аланин

Apr - аргинин

Асн - аспарагин

Асп - аспарагиновая кислота

Вал - валин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГАМК - у-аминомасляная кислота

ГВК - гомованилиновая кислота

Гли - глицин

Глн - глутамин

Глу - глутаминовая кислота

ДА - дофамин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота L-ДОФА - Ь-3,4-диоксифенилаланин ДОФУК- 3,4-диоксифенилуксусная кислота Иле - изолейцин

КОМТ - катехол-О-метилтрансфераза Лей - лейцин

М ± m - среднее арифметическое ± средняя ошибка среднего арифметического Мет - метионин НА - норадреналин

5-ОИУК - 5-оксииндолилуксусная кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

Сер -серин

Tay - таурин

Тир - тирозин

Тре - треонин

Три - триптофан

ЭРГ - электроретинограмма

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Суточные ритмы - широко распространенное явление среди живых организмов, проявляющееся на всех уровнях биологической организации. У млекопитающих функционирование большинства физиологических и биохимических систем претерпевает циклические изменения с периодом, приблизительно равным 24 часам.

Суточные ритмы подразделяются на две категории - это индуцируемые ритмически изменяющимися факторами внешней среды и циркадианные.

К первым относятся ритмы, проявляющиеся в результате прямого влияния ритмически изменяющегося фактора внешней среды на физиологические или биохимические процессы. В качестве примера можно привести суточные изменения содержания активированного светом родопсина. Очевидно, причиной этого ритма является то, что в светлое время суток родопсином поглощается большее количество фотонов, чем ночью. Подобные ритмы исчезают при отсутствии циклически изменяющихся условий освещения и не имеют приспособительного значения.

Часть суточных ритмов представляет собой просто реакции на циклические изменения условий освещения, температуры, влажности или других факторов окружающей среды. Однако многие ритмы определяются эндогенным осциллятором, способным генерировать колебания при отсутствии изменяющихся во времени условий окружающей среды - циркадианным осциллятором. Благодаря существованию циркадиан-ного осциллятора, организм приобретает способность определять астрономическое время и предвидеть изменения условий жизнедеятельности, связанные с динамикой условий окружающей среды в течение суток. Циркадианные ритмы - адаптационный механизм, играющий особенно большое значение в жизнедеятельности сетчатки. Это связано с тем, что деятельность сетчатки более чем какого-либо другого органа, зависит от циклически изменяющихся условий освещения (Этингоф, 1999).

У млекопитающих главный циркадианный осциллятор локализован в супрахи-азматическом ядре гипоталамуса (Сазвопе е1 а1. 1993). Повреждение этого ядра приводит к исчезновению большинства циркадианных ритмов (СаБзопе а1. 1990). Согласно классической схеме центральный осциллятор осуществляет регуляцию циркадианных ритмов в органах-мишенях посредством изменения в крови концентрации мелатонина, синтезируемого в эпифизе (Ког£ 1994).

У многих животных обнаружено существование нескольких циркадианных осцилляторов, работающих независимо друг от друга. Сетчатка глаза - один из органов, обладающих собственным циркадианным осциллятором, способным осуществлять свои функции независимо от супрахиазматического ядра гипоталамуса (ВеэЬагзе, 1983). Многие физиологические и биохимические процессы в сетчатке изменяются циркади-анно. Сетчатка крысы также как и эпифиз обладает способностью синтезировать мела-тонин. Скорость синтеза этого моноамина меняется в соответствии с фазой собственного циркадианного осциллятора сетчатки.

На основании вышеописанных фактов мы высказали предположение, что мела-тонин может являться тем посредником, с помощью которого циркадианный осциллятор осуществляет регуляцию циркадианных ритмов в сетчатке.

В сетчатке крысы присутствует также другой моноамин - дофамин, - концентрация которого изменяется в течение суток. Ритм содержания дофамина сдвинут по фазе относительно мелатонинового ритма на 12 часов. Существуют данные об антагонистическом взаимодействии между мелатонином и дофамином (ОиЬосстсЬ, 1983; 1иуопе, 1986). Вероятно, регуляция суточных ритмов в сетчатке осуществляется не только за счет изменения концентрации мелатонина, но и за счет изменения активности дофаминергических амакриновых и интерплексиформных нейронов, расположенных во внутреннем ядерном слое.

Систематическое исследование роли моноаминов (мелатонина и дофамина) в сетчатке как ритмоводителей циркадианных ритмов расширяет понимание механизмов, посредством которых сетчатка приспосабливается к циклически изменяющимся условиям освещения. Также очевидна необходимость изучения особенностей механизмов регуляции циркадианных ритмов осцилляторами в супрахиазматическом ядре и в сетчатке. Подтверждение участия мелатонина в регуляции циркадианных ритмов в сетчатке послужит еще одним доказательством филогенетической преемственности между системой супрахиазматическое ядро - эпифиз и сетчаткой глаза.

Цели и задачи исследования.

Цели настоящего исследования: 1) изучение способности мелатонина регулировать некоторые циркадианно изменяющиеся процессы в сетчатке глаза крысы; 2) исследование возможной роли дофамина как функционального антагониста мелатонина.

В соответствии с этим были определены задачи работы:

1. Подтвердить существование в сетчатке суточных изменений содержания ме-латонина и дофамина у крыс, находящихся в условиях циклического освещения.

2. Выяснить, является ли суточный ритм содержания дофамина и продуктов его инактивации - 3,4-диоксифенилуксусной и гомованилиновой кислот - истинно цирка-дианным.

3. Попытаться обнаружить влияние мелатонина и дофамина на функционально важный циркадианный ритм в сетчатке в различные фазы цикла свет/темнота. Мы полагали, что наиболее удобным объектами для подобного исследования являются суточные ритмы содержания свободных аминокислот в сетчатке.

4. Определить содержание дофамина и 3,4-диоксифенилуксусной кислоты в сетчатке, а также триптофана, серотонина, N-ацетилсеротонина, мелатонина и 5-оксииндолилуксусной кислоты в эпифизе крыс, страдающих наследственной дегенерацией сетчатки на ранних сроках постнатального развития.

Положения, которые выносятся на защиту.

1. Мелатонин и дофамин в сетчатке соответствуют требованиям, предъявляемым к ритмоводителю циркадианных ритмов: а) их уровни изменяются в течение суток; б) циркадианный осциллятор участвует в регуляции суточных ритмов содержания дофамина и его метаболитов - 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и гомованилиновой кислоты.

2. В сетчатке глаза крысы существуют суточные изменения уровней тех аминокислот, которые являются составными компонентами белков, с максимумом в светлый период цикла свет/темнота. Суточные изменения содержания Ала, Apr, Асн, Вал, Иле, Мет, Сер и Три сохраняются у животных, находящихся в условиях постоянной темноты, что свидетельствует об участии циркадианного осциллятора в их регуляции.

3. Мелатонин и дофамин оказывают разнонаправленное действие на ритмы содержания свободных аминокислот в сетчатке, и их влияние зависит от времени суток. Это подтверждает предположение о функции мелатонина и дофамина как ритмоводителей циркадианных ритмов в сетчатке.

4. Вероятнее всего, влияние мелатонина на уровни свободных аминокислот связано с изменением скорости синтеза белка в сетчатке.

Научная новизна работы.

Впервые установлено, что содержание свободных аминокислот, являющихся составными компонентами белков, в сетчатке глаза претерпевает циклические изменения с максимумом в фотофазу через 3-6 часов после включения света. Суточные ритмы содержания свободных аминокислот наблюдаются в сетчатке, но не в других, изученных нами отделах центральной нервной системы (стриатуме и гипоталамусе). Суточные изменения содержания Ала, Apr, Асн, Иле, Мет, Вал и Сер сохраняются после помещения животных в условия постоянной темноты, что свидетельствует об участии цирка-дианного осциллятора в генерировании этих ритмов.

Выявлена способность моноаминов - дофамина и мелатонина - антагонистически влиять на ритмы содержания свободных аминокислот в сетчатке глаза крысы. Характер оказываемого воздействия зависит от времени суток. Внутрибрюшинное введение мелатонина в фотофазу (когда эндогенная концентрация этого гормона в сетчатке мала) приводит к снижению дневных уровней Асн, Сер, Глн, Ала, Мет и Иле до ночного уровня. Дофамин оказывает противоположное действие. Внутрибрюшинное введение L-ДОФА (приводящее к повышению уровня дофамина в сетчатке) в скотофазу повышает содержание Гли, Тре и Вал до дневного уровня.

Впервые установлено, что влияние мелатонина на уровни свободных аминокислот в сетчатке исчезает на фоне ингибирования синтеза белка циклогексимидом. Выяв-

о

лена способность мелатонина увеличивать включение [ Н]-лейцина в белки сетчатки. На основании этих данных обоснована рабочая гипотеза о том, что действие мелатонина на уровни свободных аминокислот в сетчатке глаза обусловлено его влиянием на скорость синтеза белка.

Нами установлено, что суточные ритмы содержания дофамина и продуктов его инактивации - 3,4-диоксифенилуксусной кислоты и гомованилиновой кислоты в сетчатке глаза сохраняются у животных, находящихся в условиях постоянной темноты. Это свидетельствует об участии циркадианного осциллятора в регуляции суточного ритма активности дофаминэргических нейронов в сетчатке глаза крысы.

Обнаружено повышение содержания мелатонина, N-ацетилсеротонина и норад-реналина в эпифизе крыс линии Campbell, страдающих наследственной дегенерацией сетчатки, на ранних сроках постнатального развития (20-й день жизни). При этом в сетчатке у них содержание 3,4-диоксифенилуксусной кислоты снижено, что свидетель-

ствует о нарушении функции дофаминергических нейронов сетчатки при наследственной дегенерации сетчатки.

Практическая ценность работы.

Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о функционировании системы регуляции циркадианных ритмов в сетчатке млекопитающих. Многие фармакологические препараты, действующие на моноаминэргические нейрональные системы, обладают ретинотоксическим эффектом. Выяснение роли моноаминов в регуляции суточных ритмов сетчатки может прояснить причины побочных влияний этих препаратов. Обнаруженные нарушения метаболизма дофамина в сетчатке и мелатонина в эпифизе у крыс, больных наследственной дегенерацией сетчатки, раскрывают новые аспекты патогенеза этого заболевания. Возможно, полученные нами данные в дальнейшем будут способствовать разработке нейрофармакологических методов лечения. В процессе работы была разработана методика определения содержания мелатонина в сетчатке при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, был усовершенствован метод определения уровней свободных аминокислот.

Апробация работы.

Предзащита диссертации состоялась 26 февраля 1999 года на заседании секции «Молекулярных основ эволюции функций» Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН. Результаты проведенных исследований были доложены на конференции молодых ученых «Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций», состоявшейся в 1995 г. в Санкт-Петербурге; на I (XI) международном совещании по эволюционной физиологии в Санкт-Петербурге в 1996 г.; на XXXIII международном конгрессе по физиологическим наукам, проходившем в Санкт-Петербурге в 1997 г.; на 12 конференции Европейского нейрохимического общества в Санкт-Петербурге в 1998 г; на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» в Пущино в 1998 г.; дважды (в 1997 и 1998 г.г.) на заседании Ученого Совета Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН.

и

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и трех глав собственных исследований (в число которых входят методы исследования, результаты исследований и обсуждение полученных результатов), выводов, списка цитированной литературы и приложения, содержащего таблицы первичных материалов исследования. Основной текст диссертации изложен на 100 страницах, в число которых входят 14 таблиц и 20 рисунков. Библиографический указатель содержит 9 отечественных и 158 иностранных источников.

Опыты, проведенные с использованием электрофизиологических методов, осуществляли совместно с сотрудниками Института физиологии им. И.П. Павлова РАН А.К. Хараузовым и проф. Ю.Е. Шелепиным. Налаживание метода определения свободных аминокислот в сетчатке и отделах головного мозга осуществляли на базе разработок, произведенных сотрудником Института биохимии АН Беларуси (г. Гродно, Беларусь) Е.М. Дорошенко. Часть биохимических исследований выполнена совместно со