Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинурениновый путь окисления мелатонина у животных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кинурениновый путь окисления мелатонина у животных"

5~0

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

РОЗОВ Станислав Владимирович

КИНУРЕНИНОВЫЙ ПУТЬ ОКИСЛЕНИЯ МЕЛАТОНИНА У

ЖИВОТНЫХ

Специальность 03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2008 г.

003457955

Работа выполнена в лаборатории сравнительной нейрохимии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель - кандидат биологических наук

Никита Владимирович Поздеев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

проф. Александр Вартанович Арутюнян

доктор биологических наук Евгений Георгиевич Скворцевич

Ведущая организация: Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится « 5 » февраля 2009 г. в'/бчасов на заседании совета Д 212.232.09 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9 ауд. 90).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. А. М. Горького, Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан » ноября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук, Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Мелатошш - продукт превращения аминокислоты триптофана - является биологически активным соединением, привлекающим в настоящее время внимание большого числа исследователей во всем мире. Мелатонин обнаружен практически у всех живых существ - от простейших до млекопитающих. У высших позвоночных мелатонин образуется ферментативно, в результате последовательного гидроксилирования, декарбокешшрования, N-ацетилировання и О-метилирования аминокислоты триптофана. Основным местом образования мелатошша является эпифиз, однако он вырабатывается также в сетчатке, слизистой оболочке кишечника, кожных покровах и других тканях (Cassone et al., 1993; Iuvone and Besharse, 1983; Huether et al., 1992; Fischer et al., 2006). В сетчатке и эпифизе его синтез имеет циклический характер с максимумом в ночное время, благодаря чему мелатонин выступает гормональным сигналом фазы суточных, а также сезонных ритмов (Cassone et al., 1993; Korf, 1994). Помимо этого, мелатонин выполняет локальные функции, регулируя синтез аминокислот и дофамина в сетчатке (Ribelayga et al., 2004), моторику кишечника (Lucchelli et al., 1998), активность ферментов антиоксидантной защиты (Mayo et al., 2002) и проч.

Основной механизм распада мелатонина заключается в его гидроксилировании цитохромами группы Р450 печени с образованием 6-гидроксимелатонина, который в виде конъюгатов с сульфатом или ппокуронидом поступает в почки и выводится с мочой (Kopin et al., 1961). По этому пути метаболизируется мелатонин, находящийся в крови.

Не исключалось также и существование других, отличных от основного, путей его катаболизма. Это предположение подтвердилось, коща в сетчатке лягушек была обнаружена система локального распада мелатонина, идущего с образованием 5-метоксииндолуксусной кислота и 5-метокситриптамина (Grace et al., 1991). Это интенсифицировало исследования по поиску альтернативных путей его деградации.

Образование кинурениновых продуктов рассматривалось как один из возможных механизмов распада мелатонина, так как известно, что кинурениновый путь занимает центральное место в катаболизме предшественника и структурно родственного мелатонину соединения - триптофана (Тусе, 1985). В начале 90-х г. появились данные по взаимодействию мелатонина с активными формами кислорода и некоторыми

ферментами in vitro, приводящему к образованию кинурешшовых продуктов (Stasica et al., 2000). Эти вещества были выделены в чистом виде: ими оказались N-aucinii-N-формил-5-метоксикинуренамин (АФМК) и >1-ацетил-5-метохсикинуренамин (АМК) (Tan et al, 2000). На культурах клеток была показана способность АФМК и АМК ингибировать синтез простагаандинов, экспрессию провоспалительного фактора циклооксигеназы-2, подавлять образование TNF-a и IL-8, индуцированное липополисахаридом в нейтрофилах и проч. (Mayo et al., 2005; Tan et al., 2007). Установили также, что при добавлении мелатонина в культуру нейгрофилов или макрофагов основным продуктом его распада являлся АФМК, затем трансформирующийся в АМК (Rodrigues М., et al., 2003).

Однако прямые доказательства образования этих соединений ш vivo, отсутствовали, что обусловило наш интерес к данному предполагаемому пути распада мелатонина. В соответствии с этим были сформулированы цели и задачи исследования.

Дели и задачи исследования. Целью данной работы являлась проверка существования кинурегашового пути окисления мелатонина идущего с образованием АФМК и АМК in vivo у представителей двух классов позвоночных, цыплят и крыс. В соответствии с выбранной целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Синтез АФМК и его идентификация.

2. Разработка методов экстракции и определения АФМК и АМК в биологическом материале (сыворотка, сетчатка) с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

3. Определение АФМК и АМК в сетчатке, сыворотке крови и эпифизе цыплят и сетчатке и сыворотке крови крыс

4. Исследование кинуренинового пути метаболизма мелатонина в спинномозговой жидкости крыс с помощью метода микродиализа на свободно движущемся животном

Научная новизна работы. Впервые показана окислительная деградация мелатонина по кииурениновому пути in vivo-, у цыплят и крыс определен вклад кинуренинового пути в общий катаболизм мелатонина в крови и сетчатке этих видов; прослежена кинетика образования и убыли АФМК и АМК в сыворотке крови и сетчатке цыплят при введении мелатонина.

Разработан пригодный для серийных измерений метод анализа кинурениновых производных мелатонина - АФМК и АМК в биологическом материале с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ с различными вариантами детектирования.

Впервые показано, что в сетчатке крыс кинурениновый путь является одним из основных механизмов распада мелатонина.

Разработан метод мониторинга содержания АФМК в спишюмозговой жидкости крысы методом микродиализа in vivo на свободно движущемся животном.

Научно-практическая ценность работы. Теоретическое значение работы состоит в доказательстве существования кинуренинового пути распада мелатонина у представителей двух классов позвоночных - цыплят и крыс, и сравнительном анализе его вклада в общий пул метаболитов мелатонина в разных тканях.

Как показали наши исследования, до 35% мелатонина в сетчатке крыс может трансформироваться по кинурениновому пути. Это делает необходимым учет возможных эффектов АФМК и АМК при применении мелатонина как фармакологического агента.

Благодаря простоте, высокой чувствительности и экономичности, разработанный в настоящем исследовании метод определения АФМК и АМК с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ может быть использован в серийных исследованиях содержания данных соединений в биологическом материале. Примером практической реализации разработанного метода является использование его в сочетании с техникой микродиализа для определения продуктов распада мелатонина в спинномозговой жидкости на свободно движущемся животном.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в форме докладов и презентаций на VI Международной конференции "Бноантиоксиданг" (Москва, 2002 г.), 5-й Российской медико-биологической молодежной конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2002), X Международной конференции молодых исследователей "Ломоносов-2003" (Москва, 2003), а также дважды - на заседаниях Ученого Совета Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова РАН (в 2002 и 2003 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ - 3 тезисов докладов, представленных на Международных и Российских конференциях и

2 полнотекстовые статьи, из которых 1 - в отечественном журнале и 1 - в международном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, в которые входят методы исследований, результаты исследований и обсуждение полученных результатов, выводов и списка цитированной литературы. Основной текст диссертации изложен на 73 стр., включая 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 10 отечественных и 174 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтез и анализ АФМК. АФМК синтезировали по причине коммерческой недоступности этого соединения. АФМК получали при реакции 30% водного раствора Н202 с мелатонином (Tan et al., 2000; Burkhardt et al., 2001). Мелатонин предварительно растворяли в 5% метаноле в концентрации 10 мМ, затем необходимое количество этого раствора смешивали с Н202 до достижения конечной концентрации 1 мМ и инкубировали в темноте, при температуре 20±2°С, в присутствии кислорода.

Идентификацию синтезированного соединения проводили по спектру его поглощения в диапазоне длин волн 190-700 им с использованием спектрофотометра Specord М-40 (Karl Zeiss, ГДР), а также флюоресценции в диапазоне длин волн эмиссии 350-700 нм при длине волны возбуждения 340 нм при помощи спекгрофлюориметра RF-1501 (Shimadzu, Япония). Для установления молекулярной массы проводили масс-спектрометрический анализ на спектрометре МХ-1303 (Россия) с прямым вводом пробы и ионизацией электронным ударом (энергия 70 эВ).

По результатам спектрометрических исследований, образующееся соединение имеет максимумы экстинкции и эмиссии 340 и 480 нм соответственно. Отношение m/z для молекулярного иона составило 264 [(М)1, 30%], другие фрагменты: 192 [(М-72)+, 50%], 178 [(М-88)+, 100%] и 150 [(М-114)+, 50%]. На основании спектров поглощения и флюоресценции, а также установленной молекулярной массы и характера фрагментации исследуемого соединения, выявленной при масс-спектрометрическом анализе мы сделали вывод, что основной продукт реакции мелатонина с Н202 идентичен АФМК.

Экстракция и ВЭЖХ-анализ АФМК и АМК. После синтеза АФМК, необходимо

было разработать методы экстракции и определения продуктов окисления мелатонина в биологических средах, к которым помимо АФМК, относится также получающееся при его деформилировании производное - АМК.

При работе на цыплятах применяли твердофазную экстракцию анализируемых компонентов с использованием системы Manifold (Waters, USA) для вакуумной экстракции, а на крысах - жидкофазную экстракцию. В обоих случаях использовали неполярные фазы - хлористый метилен и С^-модифицироваиный силикагель. Исследования проводились на крысах-самцах, (Rattus norvegicus, линия Wistar), возраст 3 месяца, а также на цыплятах-самцах (Gallus gallus, порода White Leghom), возраст 2 недели. Отбор сыворотки проводили в середину темновой фазы цикла. Кровь инкубировали при +4°С до образования тромба, затем центрифугировали 10 Mini при 2200 g и отбирали сыворотку (верхняя фракция). До анализа пробы хранили при -85°С.

Эффективность жидкофазной экстракции определяли, используя 0.1 М калий-фосфатный буферный раствор (pH 7.4) и пробы сыворотки крови, с предварительно добавленными стандартными количествами АФМК или АМК. Пробы смешивали с хлористым метиленом в соотношении 1:2 в течение 30 сек, и центрифугировали 1 мил при 8000 g. Водную фазу удаляли, оставшуюся часть высушивали в токе азота, ресуспендировали в 100 мкл 20% ацетонитрила и 80% 50 мМ калий-фосфатного буфера (pH 7) (об/об). Эффективность жидкофазной экстракции для обоих анализируемых компонентов составляла 75-85%.

Для проверки эффективности твердофазной экстракции (рис. 1) использовали следующие стандартные количества реактивов: 59, 118, 236, 432 и 944 пг для АМК и 0.625, 1.25, 2.5, 5 и 10 нг для АФМК, растворенные в 1 мл 0.1 М калий-фосфатного буфера (pH 7.4) или в сыворотке крови. Для ТФЭ использовали картриджи с неполярной С18-привитой фазой (J.T.Baker, США).

Перед проведением экстракции картриджи пре кондиционировали 1+1 мл абсолютного метанола и 1+1 мл воды, далее наносили пробы исследуемого материала и проводили экстракцию. По окончании экстракции картриджи повторно промывали 1 мл 7% метанола для удаления примесей, затем 300+300 мкл абсолютного метанола для элюции исследуемых соединений с картриджа. Элюат высушивали под током азота, сухой остаток ресуспендировали в 100 мкл 17.5% ацетонитрила и 82.5% 50 мМ

калий-фосфатного буфера (рН 7) (об/об). Эффективность экстракции для АФМК составляла 79.5%, для АМК - 84%.

02468 10 12 0 1 2

нг (стандарт) нг (стандарт)

рис. 1. Графики твердофазной экстракции различных количеств исследуемых соединений. А. АФМК. Б. АМК. Условные обозначения: • - стандартный раствор, о -экстракция из стандартного раствора, Т - экстракция из сыворотки.

Оценку содержания исследуемых веществ, экстрагированных из стандартных растворов или сыворотки крови с добавлением их стандартных количеств проводили с помощью ВЭЖХ. Анализ АФМК проводили с использованием системы Agilent Technologies 1100 series (Agilent Technologies, USA) с флюориметрическим детектором с установленными максимумами ^=280 нм, А<.ш=340 нм для мелатонина и ^=340 нм, Хет=480 нм для АФМК. Для определения АМК применяли электрохимический детектор ESA Coulochem III с кулонометрической ячейкой 5011 (Chelmsford, США). На основании построенной гидродинамической вольтаммограммы (рис.2), потенциал рабочего электрода устанавливали равным 450 мВ. В обоих случаях использовали аналитическая обращенно-фазовая колонка С^ ODS Ultrasphere 5 цм 4.6x250 мм (Beckmann-Coulter, США) с предколоночным картриджем NewGuard RP-18, 7 рм 3.2x15 (PerkinElmer, США). Анализ проводили

300 250 -200 150 100 -so о

рис. 2. Гидродинамическая вольтаммограмма АМК, построенная с использованием аналитической кулонометрической ячейки. Каждая точка на графике соответствует 232 пг АМК.

250 300 350 400 450 500 550 600

при 23°С. Мобильная фаза состояла из 20 % ацетонитрила и 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7) (об/об).

Определение АФМК и АМК в сыворотке крови, сетчатке и эпифизе цыплят и изучение их кинетики. В контрольной группе цыплят (без инъекции мелатонина) 18 эпифизов были отобраны в середине темновой фазы цикла и заморожены при -85°С. Перед анализом 18 проб объединяли в одну и гомогенизировали в 0.2 Н НСЮ4 для осаждения белков.

Кровь и сетчатки отбирали как в группе животных, не инъецированной мелатонином, так и в группе с мелатонином, введенным внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг. Отбор проб в опытных и контрольных группах животных производили через 5, 10, 20, 30 и 60 мин после инъекции. Перед анализом 3 сетчатки объединяли в одну пробу и гомогенизировали при +4°С в 800 мкл 66 мМ раствора калий-фосфатного буфера (рН 7.4). Кровь инкубировали при +4°С до образования сгустка, затем центрифугировали 10 мин при 2200 g. Сыворотку отбирали и хранили при -85°С.

Пробы сетчаток и эпифизов центрифугировали 10 мин при 15000 g при +4°С, и отбирали верхнюю фаза из которой проводили твердофазную экстракцию АФМК и АМК как описано выше. После экстракции пробы повторно центрифугировали 4 мин при 15000 g при +4°С для осаждения микрочастиц и 75 мкл полученного раствора анализировалось хроматоргафически.

Определение АФМК и АМК в крови и сетчатке крыс. Мелатонин (10 мг) растворяли в 1 мл 5% этанола (об/об) и вводили животным внутрибрюшинно в дозе 15 мг/кг. Отбор проб крови и сетчаток в опытных и контрольных группах животных проводили через 30 мин после инъекции, в середину темновой или световой фазы цикла. Подготовку проб для хроматографического анализа осуществляли аналогично описанной выше. Проводили жидкофазную экстракцию анализируемых веществ. После экстракции для удаления микрочастиц пробы фильтровали через 0.44 мкм фильтр центрифугированием 5 мин при 10000 g при +4°С и проводили их хроматографический анализ.

Определение содержания АФМК в спинномозговой жидкости крыс методом микродиализа in vivo. Для проведения диализа спинномозговой жидкости использовали мнкроднализпую канюлю, при изготовлении которой применяли диализную трубку (материал гемофан; GAMBRO, Stockholm, Sweden) с

избирательной проницаемостью для веществ (не более 6 кДа) и наружным диаметром 0.2 мм.

Операцию проводили за 2 часа до окончания световой фазы цикла. Для наркотизирования применяли нембутал (50 мг/кг, внутрибрюшинно). Через 15-20 минут после наркотизирования животное фиксировали в стереотаксическом аппарате. После иссечения мягких тканей и перфорации черепной коробки, используя атлас мозга крысы (Pellegrino et al., 1979) проводили имплантацию канюли в третий желудочек мозга по координатам А, 5.6 мм от брегмы; L, 1.76 мм от сагиттального шва; V, 3.5 мм от поверхности черепа, с последующей жесткой фиксацией на черепной коробке с помощью стоматологического цемента и опорных винтов.

Подключение животного к системе диализа проводили через 1 сутки после вмешательства. В качестве жидкости для перфузии использовался раствор Рингера, аналогичный по составу искусственной спинномозговой жидкости. В экспериментах с предварительно введенным внутрибрюшинно мелатонином, использовали дозировку 40 мг/кг. Отбор проб производили каждые 15 мин. Скорость потока диализной жидкости составляла 2 мкл/шш. Локализацию диализной поверхности канюли проверяли гистологическим контролем срезов мозга.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Наше исследование было направлено на разработку высокочувствительного метода анализа пригодного для серийного определения М'-ацетил-Н2-формил-5-метоксикинуренамина (АФМК) и К'-ацетил-З-метоксикинуренамипа (АМК) в биологических образцах и проверку наличия кинуренинового пути распада мелатонина in vivo у представителей двух классов позвоночных - цыплят и крыс.

Для синтеза АФМК был выбран метод, не использующий агрессивных сред, простой в применении и не трудоемкий, так как не требует множественной перекристаллизации. Мы не рассматриваем выбранный синтез как наиболее оптимальный (выход реакции в нашем случае составлял 24%), так как не ставили задачей разработку или усовершенствование метода получения АФМК. Тем не менее, выход можно существенно увеличить при добавлении в среду металлов переменной валентности и насыщая реакционную смесь кислородом (Fowler et al., 2003). Для идентификации синтезированного соединения использовали

ю

спекгрофотометрический, спектрофлюориметрический и масс-спекгрометрнческий методы анализа. При сопоставлении результатов этих исследований с литературными данными мы идентифицировали синтезированное вещество как АФМК.

В работах по выделению АФМК и АМК из биологического материала используются жидкофазные методы экстракции, демонстрирующие эффективность 80-90% (Ma et al., 2006; Almeida et al., 2004). Сходные значения также была показаны в нашей работе - 76-85%. Помимо этого мы применили твердофазную экстракцию, которая не уступая по эффективности жидкофазной (80-85%), позволяет значительно упростить и ускорить анализ, а также проводить одновременную экстракцию исследуемых веществ из большого количества проб; потенциально метод может быть автоматизирован.

Примените ВЭЖХ для анализа кинурениновых метаболитов мелатонина оправдано из-за высокой временной и концентрационной разрешающей способности метода, широкого диапазона способов детекгировапия, возможности проведения серийных анализов и экономичности.

После разработки методов экстракции и определения АФМК и АМК с помощью ВЭЖХ, мы исследовали их наличие в сетчатке и сыворотке крови цыплят и крыс, а также в эпифизе цыплят и спинномозговой жидкости крыс.

У птиц сетчатка и эпифиз являются основными местами синтеза мелатонина, поэтому для поиска возможных кинурениновых продуктов были выбраны эти ткани. В случае, если АФМК и АМК образуются где-либо в другой ткани, исследовалась также сыворотка крови. Для определения эндогенного АМК 18 эпифизов были отобраны в середину темновой фазы цикла, когда содержание мелатонина в них максимально и объединены в одну пробу. Количество мелатонина в этой пробе составляло около 50 нг и было высоким также в сыворотке 1фОвн и сетчатке цыплят; однако эндогенных АФМК и АМК в эпифизе обнаружить не удалось (рис.3). Это связано, вероятно с тем, что содержание мелатонина в этой железе на два порядка ниже, чем его предшественников - триптофана и серотонина; основным механизмом образования АФМК и АМК из мелатонина считается его взаимодействие с активными формами кислорода, а его предшественники обладают сходной с мелатонином активностью по отношению к ним.

рис. 3. Хроматограммы пробы, объединенной из 18 эпифизов в сравнении со стандартами АМК и мелатонина (потенциал рабочего электрода 0.45 В).

600 ¡(сек)

В экспериментах по изучению кинетики распада мелатонина, предварительно введенного цыплятам внутрибркшшнно в дозе 10 мг/кг, АФМК и АМК регистрировали в сыворотке крови, АМК определялся также в сетчатке (рис. 5Б). Содержание АФМК в сыворотке достигало своего максимума (4.8 нг/мл) менее, чем через 5 мин после инъекции мелатонина и падало до значений, лежащих за пределами детектирования за 1 час (рис.4).

35

мелзтонин АФМК ' 30

25 е рис 4 Содержание АФМК и мелатонина

201 в сыворотке крови цыплят с

I предварительно введенным мелатонином

15 | в дозе 10 мг/кг. Данные представлены

ю | как среднее -х, п=4-5.

30 40 {(мин)

Количество АМК в сыворотке достигало максимума (2 нг/мл) через 20 мин, медленно снижаясь в течение часа (рис. 5А) после введения мелатонина.

Эндогенные АФМК и АМК в сетчатке цыплят также не регистрировались. При инъекции мелатонина АМК был обнаружен в количестве 60 пг/сетчатку, при этом доля АМК в сетчатке составила 0.01% от содержания в ней мелатонина. Исходя из этого можно сделать вывод, что кинурениновый путь, по-видимому не играет существенной роли в локальном распаде мелатонина в сетчатке цыплят; что согласуется с данными по существованию в этом органе системы ферметнативной деградации мелатонина идущей с образованием 5-метоксииндолуксусной кислоты и 5-метокситриптофола.

1 (мин) , (мин)

рис. 5. А. Кинетика образования и распада АМК и мелатонина в сыворотке крови (А) и сетчатке (Б) цыплят с предварительно введенным мелатонином в дозе 10 мг/кг в середине темновой фазы цикла. Данные представлены как среднее ±х., п= 4-5.

Для сравнительной характеристики рассматриваемого пути распада мелатонина

у птиц и млекопитающих наряду с цыплятами мы использовали крыс линии \У1з1аг.

Материал для анализа (сыворотку и сетчатки) отбирали у группы интактных крыс

(контроль) в середину темновой фазы цикла, когда содержание мелатонина

максимально и световой фазы - при минимальном его количестве, а также у

инъецированных мелатонином животных.

В сыворотке контрольной группы крыс АФМК не регистрировался вне

зависимости от времени суток (рис. ба).

В сетчатке крыс мы регистрировали образование АФМК как в группе интактных

з 2.5 -2 1.5 1

0.5

70

во

>ч

I 60

у

I 40

5 30 5 % 20

ночь день+мелатонкн

ночь день+мелатонин

рис. 6. Содержание АФМК в сыворотке крови (А) и сетчатке (Б) инъецированной мелатонином (доза 15 мг/кг) и контрольной группах крыс в середину темновой и световой фаз цикла. При инъекции мелатонина пик, соответствующий АФМК регистрировался на хроматограмме экстракта сыворотки животного, при этом количество его составило 1.9+-0.9 нг/мл сыворотки. * - достоверные различия между группами (данные представлены как среднее ±х, п=4, Р<0.01, Ьтест).

крыс, так и при введении мелатонина в дозе 15 мг/кг (рис. 66) как ночью, так и днем.

пг/сетчатку в световую фазу цикла и 56 пг/сетчатку в темновую. Соотношение мелатонин/АФМК, как уже указывалось, составляло днем 2/1, ночью 3.5/1, т.е. количество АФМК в зависимости от времени суток колебалось в пределах 30% - 20% от содержания мелатонина в сетчатке крысы. При введении мелатонина в дозе 15 мг/кг, уровень АФМК в сетчатке возрастал в 1.6 раза по сравнению с дневным.

Для отслеживания динамики синтеза АФМК in vivo, а также исключения его образования post moriem или в процессе подготовки проб мы исследовали его содержание методом микродиализа спинномозговой жидкости на свободно движущемся животном. Мелатонин и АФМК определяли в диализном растворе, полученном при имплантации канюли в третий желудочек мозга крыс, с предварительно введенным внутрибрюшинно мелатонином в дозе 40 мг/кг массы тела.

Из характера изменения содержания мелатонина и АФМК в диализате спинномозговой жидкости видно (рис. 7), что в отличие от сыворотки крови, где разница в максимумах уровней мелатонина и АФМК составляет несколько минут, этот же показатель в спинномозговой жидкости равен 10-15 мил. Другими словами, вероятно, в отличии от сыворотки образование АФМК идет более медленно.

В общем катаболизме экзогенного мелатонина у цыплят и крыс доли

рис. 7. Микродиализный профиль мелатонина (А) и АФМК (Б). Приведены типичные кривые изменения количества исследуемых соединений от времени, после инъекции мелатонина. Каждая кривая приведена по одному животному. Значение 100% соответствует наибольшей концентрации, определенной для каждого соединения; 0 -количествам, лежащим за пределами детектирования.

Абсолютные значения содержания этого соединения составили в среднем 36

0 15 30 45 60 75 90 105 120 время после i.р. заедания мелзтешна

0 15 30 45 6Q 75 90 105 120 время после i.р. введения мелатонина

кинуренинового пути составляют 0.04% и 0.01% соответственно, что было подтверждено на мышах и крысах (НагШе е1 а1., 2003). Следует отмстить, что количества эндогенно синтезируемых АФМК и АМК у обоих изученных видов животных, за исключением сетчатки крыс, в нашей работе находились за пределами детектирования. В исследованиях, проведенных на крысах и других объектах эти соединения также не удалось определить (НагМе с1 а!., 2003). У рассмотренных видов уровень мелатонина даже в ночное время не превышает 350 пг/мл сыворотки, кроме того, образование АФМК и АМК в значительной степени связано с реакцией мелатонина с активными формами кислорода (А11е^а е1 а1., 2003). Мелатонин, поэтому, имеет ограниченные возможности для взаимодействия с ними за счет наличия в крови эффективных систем антиокислительной защиты и хелатирования металлов переменной валентности (Зенков и соавт., 2000).

Сравнительный анализ содержания кинурешшовых метаболитов мелатонина в сыворотке крови у двух классов позвоночных показал, что количество АФМК, образованное при внутрибрюшинной инъекции мелатонина в дозах 10-15 мг/кг равны: у цыплят 4.8±1.3 нг/мл сыворотки, у крыс - 1.9±0.8 нг/мл сыворотки. Количество АМК в тех же пробах у цыплят составляет 1.8±0.3 нг/мл. Максимальное содержание АФМК в сыворотке крови цыплят регистрировали менее, чем через 5 мин после инъекции мелатонина, в то время, как количество АМК достигало максимума через 15-20 мин. Быстрое падение концентрации обоих метаболитов может быть связано с выведением их из организма, что подтверждается исследованиями в которых АФМК и АМК регистрировали в моче мышей с предварительно введенным подкожно мелатошшом (Ма еь а1., 2006).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основным результатом нашей работы явилось прямое доказательство существования кинуренинового пути распада мелатонина у представителей двух классов животных - млекопитающих и птиц. Соотношение мелатошш/АФМК и мелатонин/АМК в сыворотке крови у обоих объектов составляло 0.01-.0.04% от содержания мелатонина, что говорит о незначительном вкладе этого пути в общий катаболизм мелатонина в организме. Однако, в отличие от сыворотки крови и спинномозговой жидкости, соотношение мелатонин/АФМК в сетчатке составляло 2/1, что убедительно свидетельствует о локальном пути распада мелатонина в этой ткани.

Так, в наших экспериментах по микродиализу было показано повышение уровня кинурениновых продуктов распада мелатонина в спинномозговой жидкости и крови при его внутрибрюшинном введении. Сравнительно недавно наши исследования получили подтверждение на людях, больных вирусным менингитом, у которых концентрация АФМК в спинномозговой жидкости составляла до 500 нМ, при том, что в нормальных условиях он не регистрируется (Silva de Oliveira et al., 2005).

Другим направлением исследований является изучение кинуренинового пути распада мелатонина в местах его локального синтеза. Мы показали, что подобный путь имеет место в сетчатке крыс. Кроме того, в экспериментах на культурах нейтрофилов и макрофагов - клеток, принимающих участие в развитии локального воспаления также было показано образование АФМК (Carrillo-Vico et al., 2004).

Все эти факты делают очевидной необходимость дальнейшего изучения кинуренинового пути катаболизма мелатонина как на уровне целого организма, так и в локальных местах его синтеза.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод экстракции и определения содержания Ы-ацетил-Ы-формил-5-метоксикинуренамиа (АФМК) и 1Ч-ацетил-5-метоксикинурснамина (АМК) в биологическом материале с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с различными способами детектирования

2. Показано, что в организме крыс и цыплят существует возможность распада мелатонина по кинурениновому пути с образованием АФМК и АМК.

3. В сетчатке интактных крыс содержание АФМК составляет 30% от количества мелатонина в этой ткани, хо. кинурениновый путь является одним из основных механизмов деградации мелатонина в этой ткани.

4. При внутрибрюшинном введении мелатонина крысам и цыплятам в дозе 10-15 мг/кг наличие АФМК и АМК в крови животных регистрируется менее, чем через 5 мин, однако их содержание составляет 0.01 и 0.04% соответственно от содержания мелатонина в крови, т.о. кинурениновый путь является минорным в катаболизме экзогенного мелатонина.

5. Метод микродиализа на свободно движущемся животном показал, что при введении мелатонина в дозе 40 мг/кг кинурениновый продукт его окисления - АФМК - присутствует в спинномозговой жидкости крыс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Розов C.B., Волкова A.B., Поздеев Н.В. Новый метаболический путь окисления мелатонина. VI международная конференция «Биоантиоксидант», Москва, 16-19 апреля 2002 г., с. 490-491.

2. Розов C.B., Волкова A.B., Поздеев Н.В. К-ацетил-Ы-формил-5-метоксикинурашш и N-ацетил- 5-метоксикинурамин - продукты окисления мелатонина in vivo, V Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2002, с.211-212.

3. Розов С. В., Филатова Е. В, Орлов А. А., Волкова А. В., Жлоба А. А., Ьлажко Э. Л, Поздеев Н. В.

i о

N -ацстил-N -формил-5-метоксикмнуренамин - продукт окисления мелатонина in vivo. тез. докл. конф. «X международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2003»». - Москва, 2003

4. Filatova,E.V. Orlov,A.A. Volkova,A.V. Zhloba,A.R. BIashko,E.L. Pozdeyev.N.V N1-acctyl-N2-formyl-5-methoxykynuraminç is a product of melatonin oxidation in rats. J. Pineal Res. - 2003. - V.35(4) - P.245-250

5. Розов C.B. Особенности катаболизма мелатонина у цыплят II Нейрохимия, 2008, Т.25, №3, С. 1-5

Подписано в печать 11.11.2008г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 959.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http ://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Розов, Станислав Владимирович

Список сокращений.

Введение.

1 Обзор литературы

1.1 Синтез мелатонина.

1.2 Мелатонин - мультифункциональное соединение.

1.3 Локальные функции мелатонина.

1.3.1 Сетчатка.

1.3.2 Слизистая оболочка кишечника.

1.3.3 Кожные покровы.

1.3.4 Клетки крови.

1.4 Мелатонин - как фармакологический агент.

1.5 Распад.

1.5.1 Структура молекулы мелатонина.

1.5.2 Активированные кислородные метаболиты

1.5.2.1 Супероксид-анион радикал (02*~).

1.5.2.2 Перекись водорода (Н202).

1.5.2.3 Гидроксильный радикал (НО*).

1.5.2.4 Синглетный кислород ('02).

1.5.3 Другие окислители неферменгативной природы.

1.5.4 Окислители ферментативной природы

1.5.4.1 Индоламин-2,3-диоксигеназа (ИДО).

1.5.4.2 Миелопероксидаза (МПО).

1.5.4.3 Цитохром С.

1.5.5 Системы ex vivo.

1.6 АФМК и АМК - факты и перспективы.

1.7 Резюме.

2 Материалы и методы

2.1 Экспериментальные животные.

2.2 Реактивы.

2.3 Оборудование.

2.4 Методы

2.4.1 Синтез, очистка и идентификация АФМК.

2.4.2 Определение содержания мелатонина, АФМК и АМК с помощью ВЭЖХ.

2.4.3 Методы экстракции анализируемых веществ.

2.4.4 Определение АФМК и АМК в крови и сетчатке крыс.

2.4.5 Определение содержания АФМК в спинномозговой жидкости крыс методом микродиализа т vivo.

2.4.6 Определение мелатонина АФМК и АМК в крови, сетчатке и эпифизе цыплят и изучение их кинетики.

2.5 Получение и обработка данных.

3 Результаты

3.1 Определение спектральных характеристик продукта окисления мелатонина перекисью водорода.

3.2 Масс-спектрометрический анализ.

3.3 Экстракция и анализ предполагаемых метаболитов мелатонина в биологическом материале с помощью ВЭЖХ.

3.4 Определение содержания мелатонина, АФМК и АМК в крови, сетчатке и эпифизе цыплят и изучение их кинетики.

3.5 Определение содержания АФМК в крови и сетчатке крыс.

3.6 Определение содержания АФМК в спинномозговой жидкости крыс методом микродиализа in vivo.

4 Обсуждение.

5 Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинурениновый путь окисления мелатонина у животных"

Актуальность темы

Мелатонин - продукт превращения аминокислоты триптофана - является биологически активным соединением, привлекающим в настоящее время внимание большого числа исследователей во всем мире. Мелатонин обнаружен практически у всех живых существ - от простейших до млекопитающих.

Функции мелатонина разнообразны и во-многом определяются тканью, синтезирующей это соединение. У высших позвоночных мелатонин образуется ферментативно, в результате последовательного гидроксилирования, декарбоксилирования, N-ацетилирования и О-метилирования аминокислоты триптофана. Основным местом образования мелатонина является эпифиз, однако он вырабатывается также в сетчатке, слизистой оболочке кишечника, кожных покровах и других тканях (Cassone et al., 1993; luvone and Besharse, 1983; Huether et al., 1992; Fischer et al., 2006). В сетчатке и эпифизе его синтез имеет циклический характер с максимумом в ночное время, благодаря чему мелатонин выступает гормональным сигналом фазы суточных, а также сезонных ритмов (Cassone et al., 1993; КогГ, 1994). Помимо этого, мелатонин выполняет локальные функции, регулируя синтез аминокислот и дофамина в сетчатке (Ribelayga et al., 2004), моторику кишечника (Lucchelli et al., 1998), активность ферментов антиоксидантной защиты (Mayo et al., 2002) и проч.

Благодаря широкому спектру модулирующих эффектов и низкой токсичности (Sugden, 1983) в некоторых странах мелатонин используется как биологически активная добавка при коррекции различных нарушений сна и как вспомогательный препарат в лечении онкологических заболеваний и патологий нервной системы (Sainz et al., 2003; Pappolla et al., 2000). Дозы мелатонина, применяемые в клинике на несколько порядков превышают физиологические (Dollins et al., 1994), что делает необходимым изучение путей его катаболизма. Между тем, этой проблеме пока не уделяется должное внимание.

Основной механизм распада мелатонина заключается в его гидроксилировании цитохромами группы Р450 печени с образованием 6гидроксимелатонина, который в виде конъюгатов с сульфатом или глкжуронидом поступает в почки и выводится с мочой (Kopin et al., 1961). По этому пути метаболизируется мелатонин, находящийся в крови.

Не исключалось также и существование других, отличных от основного, путей его катаболизма. Это предположение подтвердилось, когда в сетчатке лягушек была обнаружена система локального распада мелатонина, идущего с образованием 5-метоксииндолуксусной кислота и 5-метокситриптамина (Grace et al., 1991). Это интенсифицировало исследования по поиску альтернативных путей его деградации.

Образование кинурениновых продуктов рассматривалось как один из возможных механизмов распада мелатонина, так как известно, что кинурениновый путь занимает центральное место в катаболизме предшественника и структурно родственного мелатонину соединения -триптофана (Тусе, 1985). В начале 90-х г. появились данные по взаимодействию мелатонина с активными формами кислорода и некоторыми ферментами ш vitro, приводящему к образованию кинурениновых продуктов (Stasica et al., 2000). Эти вещества были выделены в чистом виде: ими оказались N-anemn-N-формил-5-метоксикинуренамин (АФМК) и Ы-ацетил-5-метоксикинуренамин (АМК) (Tan et al, 2000). На культурах клеток была показана способность АФМК и АМК ингибировать синтез простагландинов, экспрессию провоспалительного фактора циклооксигеназы-2, подавлять образование TNF-a и IL-8, индуцированное липополисахаридом в нейтрофилах и проч. (Mayo et al., 2005; Tan et al., 2007). Установили также, что при добавлении мелатонина в культуру нейгрофилов или макрофагов основным продуктом его распада являлся АФМК, затем трансформирующийся в АМК (Rodrigues М., et al., 2003).

Однако прямые доказательства образования этих соединений in vivo, отсутствовали, что обусловило наш интерес к данному предполагаемому пути распада мелатонина. В соответствии с этим были сформулированы цели и задачи исследования.

Цели и задачи исследования

Целью нашей работы являлась проверка существования кинуренинового пути окисления мелатонина идущего с образованием АФМК и АМК in vivo у представителей двух классов позвоночных, цыплят и крыс. В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи исследования:

1. Синтез АФМК и его идентификация.

2. Разработка методов экстракции и определения АФМК и АМК в биологическом материале (сыворотка, сетчатка) с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3. Определение АФМК и АМК в сетчатке, сыворотке крови и эпифизе цыплят и сетчатке и сыворотке крови крыс

4. Исследование кинуренинового пути метаболизма мелатонина в спинномозговой жидкости крыс с помощью метода микродиализа на свободно движущемся животном.

Положения, которые выносятся на защиту В организме крыс и цыплят существует кинурениновый путь распада мелатонина, идущий с образованием АФМК и АМК.

Разработанный метод определения АФМК и АМК с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии является высокочувствительным и может быть использован для серийного количественного анализа этих соединений в биологическом материале.

Научная новизна работы Впервые показана окислительная деградация мелатонина по кинурениновому пути in vivo; у цыплят и крыс определен вклад кинуренинового пути в общий катаболизм мелатонина в крови и сетчатке этих видов; прослежена кинетика образования и убыли АФМК и АМК в сыворотке крови и сетчатке цыплят при введении мелатонина.

Разработан пригодный для серийных измерений метод анализа кинурениновых производных мелатонина - АФМК и АМК в биологическом материале с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ с различными вариантами детектирования.

Впервые показано, что в сетчатке крыс кинурениновый путь является одним из основных механизмов распада мелатонина.

Разработан метод мониторинга содержания АФМК в спинномозговой жидкости крысы методом микродиализа in vivo (на свободно движущемся животном).

Научно-практическая ценность работы

Теоретическое значение работы состоит в доказательстве существования кинуренинового пути распада мелатонина у представителей двух классов позвоночных - цыплят и крыс, и сравнительном анализе его вклада в общий пул метаболитов мелатонина в разных тканях.

Как показали наши исследования, до 35% мелатонина в сетчатке крыс может трансформироваться по кинурениновому пути. Это делает необходимым учет возможных эффектов АФМК и АМК при применении мелатонина как фармакологического агента.

Благодаря простоте, высокой чувствительности и экономичности, разработанный в настоящем исследовании метод определения АФМК и АМК с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ может быть использован в серийных исследованиях содержания данных соединений в биологическом материале.

Примером практической реализации разработанного метода является использование его в сочетании с техникой микродиализа для определения продуктов распада мелатонина в спинномозговой жидкости на свободно движущемся животном.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены в форме докладов и презентаций на VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002 г.), 5-й Российской медико-биологической молодежной конференции "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2002), X Международной конференции молодых исследователей "Ломоносов-2003" (Москва, 2003), а также дважды - на заседаниях Ученого Совета Института Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И.М.Сеченова РАН (в 2002 и 2003 гг.)

Струкгура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, в которые входят методы исследований, результаты исследований и обсуждение полученных результатов, выводов и списка цитированной литературы. Основной текст диссертации изложен на 73 стр., в число которых входят 27 рисунков. Библиографический указатель содержит 10 отечественных и 174 иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Розов, Станислав Владимирович

Выводы

1. Разработан метод экстракции и определения содержания Ы-ацетил-К-формил-5-метоксикинуренамиа (АФМК) и Ы-ацетил-5-метоксикинуренамина (АМК) в биологическом материале с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с различными способами детектирования

2. Показано, что в организме крыс и цыплят существует возможность распада мелатонина по кинурениновому пути с образованием АФМК и АМК.

3. В сетчатке интактных крыс содержание АФМК составляет 30% от количества мелатонина в этой ткани, т.о. кинурениновый путь является одним из основных механизмов деградации мелатонина в этой ткани.

4. При внутрибрюшинном введении мелатонина крысам и цыплятам в дозе 1015 мг/кг наличие АФМК и АМК в крови животных регистрируется менее, чем через 5 мин, однако их содержание составляет 0.01 и 0.04% соответственно от содержания мелатонина в крови, т.о. кинурениновый путь является минорным в катаболизме экзогенного мелатонина.

5. Метод микродиализа на свободно движущемся животном показал, что при введении мелатонина в дозе 40 мг/кг кинурениновый продукт его окисления -АФМК - присутствует в спинномозговой жидкости крыс.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Розов, Станислав Владимирович, Санкт-Петербург

1. Болдырев А.А. Роль активных форм кислорода в жизнедеятельности нейрона. Успехи Физиол. Наук, 2003, г.34, с.21-34

2. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. Свободные радикалы в живых системах. Итоги науки и техники. М., 1989, с. 1-176

3. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Санкт-Петербург, «Медицинская пресса», 2006

4. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный сгресс. М., МАИК «Наука/Интерпериодика», 2000

5. Островский М. А. Молекулярные механизмы повреждающего действия света на структуры глаза и системы защиты от такого повреждения. Успехи биологической химии, 2005, т. 45, с. 173-204.

6. Поздеев Н.В. О роли мелатонпна и дофамина в регуляции циркадианных ритмов сетчатки глаза крысы. Дисс. Санкт-Петербург, 1999

7. Пюльман Б., Пюльман А. Квантовая биохимия. М., «Мир», 1965

8. Разумовский С.Д. Кислород элементарные формы и свойства. М., «Химия», 1979

9. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.? «Мир», 2000

10. Ю.Шинкаренко Н.В. Химические свойства сингле шого молекулярного кислорода и значение его в биологических системах. Успехи химии. 1982, т.51, №5, с.713-735

11. Absi Е., Ayala A., Machado A. and Parrado J. Protective effect of melatonin against the 1 -methyl-4-phenylpyridinium-induced inhibition of complex i of the mitochondrial respiratory chain. J. Pineal Res., 2000, v. 29, p.40- 47.

12. Aldhous M., Franey C., Wright J. and Arendt J. Plasma concentrations of melatonin in man following oral absorption of different preparations. Br. J. Clin. Pharmacol., 1985, v. 19, p.517-521.

13. Allain D., Thebault R. J., Rougeot J. and Martinet L. Biology of fibre growth in mammals producing fine fibre and fur in relation to control by day length: relationship with other seasonal functions. Eur. Fine Fibre Network, 2007, v. 2, p.23-39.

14. Allegra M., Furtmuller R G., Regelsberger G., Turco-Liveri M. L., Tesoriere L., Perretti M., Livrea M. A. and Obinger C. Mechanism of reaction of melatonin with human myeloperoxidase. Biochcm. Biophys. Res. Commun., 2001, v. 282, p.380-386.

15. Allegra M., Reiter R. J., Tan D. X., Gentile C., Tesoriere L. and Livrea M. A. The chemistry of melatonin's interaction with reactive species. J. Pineal Res., 2003, v. 34, p.1-10.

16. Bast A., Haenen G. R. and Doelman C. J. Oxidants and antioxidants: state of the art. Am. J. Med., 1991, v. 91, p.2S-13S.

17. Beman E. R. Biochemistry of the eye. Plenum Press, 1991, p. 1-480.

18. Bertazzo A., Ragazzi E., Biasiolo M., Costa C. V. and Allegri G. Enzyme activities involved in tryptophan metabolism along the kynurenine pathway in rabbits. Biochim. Biophys. Acta, 2001, v. 1527, p. 167-175.

19. Beyer C. E., Steketee J. D. and Saphier D. Antioxidant properties of melatonin— an emerging mystery. Biochem. Pharmacol., 1998, v. 56, p. 1265-1272.

20. Borjigin J., Li X. and Snyder S. H. The pineal gland and melatonin: molecular and pharmacologic regulation. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1999, v. 39, p.53-65.

21. Brotto L. A. and Gorzalka B. B. Melatonin enhances sexual behavior in the male rat. Physiol Behav., 2000, v. 68, p.483-486.

22. Bubenik G. A., Pang S. F., Hacker R. R. and Smith P. S. Melatonin concentrations in serum and tissues of porcine gastrointestinal tract and their relationship to the intake and passage of food. J. Pineal Res., 1996, v. 21, p.251-256.

23. Bubenik G. A. Gastrointestinal melatonin: localization, function, and clinical relevance. Dig. Dis. Sci., 2002, v. 47, p.2336-2348.

24. Budu A., Peres R., Bueno V. B., Catalani L. H. and Garcia C. R. Nl-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine modulates the cell cycle of malaria parasites. J. Pineal Res., 2007, v. 42, p.261-266.

25. Burnside B. and Nagle W. Retinomotor movements of photoreceptor and retinal pigment epithelium: mechanisms and regulation. In: Progress in Retinal Research(Edited by Osborne N.and Chader G.), Pergamon Press, Oxford, 1983, p. 67

26. Cagnoli C. M., Atabay C., Kharlamova E. and Mancv H. Melatonin protects neurons from singlet oxygen-induced apoptosis. J. Pineal Res., 1995, v. 18, p.222-226.

27. Carlberg C. Gene regulation by melatonin. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2000, v. 917, p.387-396.

28. Cassone V. M., Warren W. S., Brooks D. S. and Lu J. Melatonin, the pineal gland, and circadian rhythms. J. Biol. Rhythms, 1993, v. 8 Suppl, p.S73-S81.

29. Chan T. Y. and Tang P. L. Characterization of the antioxidant effects of melatonin and related indoleamines in vitro. J. Pineal Res., 1996, v. 20, p. 187-191.

30. Cheung R. T. The utility of melatonin in reducing cerebral damage resulting from ischemia and reperfusion. J. Pineal Res., 2003, v. 34, p. 153-160.

31. Claustrat B., Brun J., David M., Sassolas G. and Chazot G. Melatonin and jet lag: confirmatory result using a simplified protocol. Biol. Psychiatry, 1992, v. 32, p.705-711.

32. Cogburn L. A., Wilson-Placentra S. and Letcher L. R. Influence of pinealectomy on plasma and extrapineal melatonin rhythms in young chickcns (gallus domesticus). Gen. Comp. Endocrinol., 1987, v. 68, p.343-356.

33. Cohen L. H. and Noell W. K. Glucose catabolism of rabbit retina before and after development of visual function. J. Neurochem., 1960, v. 5, p.253-276.

34. Conti A., Conconi S., Hertens E., Skwarlo-Sonta K., Markowska M. and Maestroni J. M. Evidence for melatonin synthesis in mouse and human bonemarrow cells. J. Pineal Res., 2000, v. 28, p. 193-202.

35. Csaba G. and Barath P. Morphological changes of thymus and the thyroid gland after postnatal extirpation of pineal body. Endocrinol. Exp., 1975, v. 9, p.59-67.

36. Dellegar S. M., Murphy S. A., Bourne A. E., DiCesare J. C. and Purser G. PI. Identification of the factors affecting the rate of deactivation of hypochlorous acid by melatonin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, v. 257, p.431-439.

37. Di W. L., Kadva A., Johnston A. and Silman R. Variable bioavailability of oral melatonin. N. Engl. J. Med., 1997, v. 336, p. 1028-1029.

38. Doyle S. E., Grace M. S., Mclvor W. and Menaker M. Circadian rhythms of dopamine in mouse retina: the role of melatonin. Vis. Neurosci., 2002, v. 19, p.593-601.

39. Drijfhout W. J. Melatonin On-line. Development of trans pineal microdialysis and its application in and chronobiological studies. Thesis/Dissertation, 1996,

40. Dubocovich M. L. Characterization of a retinal melatonin receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1985, v. 234, p.395-401.

41. Dubocovich M. L., Cardinali D. P., Guardiola-Lemaitre B., Hagan R. M., Krause D. N., Sugden D., Yocca F. D. and Vanhoutte R. M. Melatonin receptors. 1998, p.187-193.

42. Finocchiaro L. M. and Glikin G. C. Intracellular melatonin distribution in cultured cell lines. J. Pineal Res., 1998, v. 24, p.22-34.

43. Fischer T. W., Sweatman T. W., Semak I., Say re R. M., Wortsman J. and Slominski A. Constitutive and uv-induced metabolism of melatonin in keratinocytes and cell-free systems. FASEB J., 2006, v. 20, p. 1564-1566.

44. Foote C. S. Definition of type i and type ii photosensitized oxidation. Photochem. Photobiol., 1991, v. 54, p.659

45. Fourtillan J. B., Brisson A. M., Gobin P., Ingrand I., Decourt J. P. and Girault J. Bioavailability of melatonin in humans after day-time administration of d(7) melatonin. Biopharm. Drug Dispos., 2000, v. 21, p. 15-22.

46. Fowler G., Daroszewska M. and Ingold K. U. Melatonin does not "directly scavenge hydrogen peroxide": demise of another myth. Free Radic. Biol. Med., 2003, v. 34, p.77-83.

47. Freeman B. D. Sites and mechanisms of free radical production. In: Free Radicals Molecular Biology, Aging and Disease Raven Press, New York, 1984, p. 43

48. Fujiwara M., Shibata M., Watanabe Y., Nukiwa T., Hirata F., Mizuno N. and Hayaishi O. Indoleamine 2,3-dioxygenase. formation of L-kynurenine from L-tryptophan in cultured rabbit pineal gland. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, p.6081-6085.

49. Garcia J. J., Reiter R. J., Pie J., Ortiz G. G., Cabrera J., Sainz R. M. and Cuna-Castroviejo D. Role of pinoline and melatonin in stabilizing hepatic microsomal membranes against oxidative stress. J. Bioenerg. Biomembr., 1999, v. 31, p.609-616.

50. Gonzalez-Haba M. G., Garcia-Maurino S., Calvo J. R., Goberna R. and Guerrero J. M. High-affinity binding of melatonin by human circulating T-lymphocytes (CD4+). FASEB J., 1995, v. 9(13), p. 1331-1335.

51. Grace M. S., Cahill G. M. and Besharse J. C. Melatonin deacetylation: retinal vertebrate class distribution and Xenopus laevis tissue distribution. Brain Res., 1991, v. ,p.56-63.

52. Green D. R. and Reed J. C. Mitochondria and apoptosis. Science, 1998, v. 281, p.1309-1312.

53. Guardiola-Lemaitre B. Toxicology of melatonin. J. Biol. Rhythms, 1997, v. 12, p.697-706.

54. Halliwell B. Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause, or consequence? Lancet, 1994, v. 344, p.721-724.

55. Hardeland R., Reiter R. J., Poeggeler B. and Tan D. X. The significance of the metabolism of the neurohormone melatonin: antioxidative protection and formation of bioactive substances. Neurosci. Biobehav. Rev., 1993, v. 17, p.347-357.

56. Harthe C., Claudy D., Dechaud H., Vivien-Roels B., Pevet P. and Claustrat B. Radioimmunoassay of N-acetyl-N-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK): a melatonin oxidative metabolite. Life Sci., 2003, v. 73, p. 1587-1597.

57. Hartter S., Grozinger M., Weigmann H., Roschke J. and Hiemke C. Increased bioavailability of oral melatonin after lluvoxamine coadministration. Clin. Pharmacol. Ther., 2000, v. 67, p. 1-6.

58. Hartter S., Nordmark A., Rose D. M., Bertilsson L., Tybring G. and Laine K. Effects of caffeine intake on the pharmacokinetics of melatonin, a probe drug for CYP1A2 activity. Br. J. Clin. Pharmacol., 2003, v. 56, p.679-682.

59. Hirata F. and Hayaishi O. New degradative routes of 5-hydroxytryptophan and serotonin by intestinal tryptophan 2,3-dioxygenase. Biochem. Biophys. Res. Commun, 1972, v. 47, p. 1112-1119.

60. Hirata F., Hayaishi O., Tokuyama T. and Seno S. In vitro and in vivo formation of two new metabolites of melatonin. J. Biol. Chem., 1974, v. 249, p. 1311-1313.

61. Huether G. The contribution of extrapineal sites of melatonin synthesis to circulating melatonin levels in higher vertebrates. Experientia, 1993, v. 49, p.665-670.

62. Iuvone P. M., Bernard M., Alonso-Gomez A., Greve P., Cassone V. M. and Klein D. C. Cellular and molecular regulation of serotonin N-acetyltransferase activityin chicken retinal photoreceptors. Biol. Signals, 1997, v. 6, p.217-224.

63. Iuvone P. M. and Besharse J. C. Regulation of indoleamine N-acetyltransferase activity in the retina: effects of light and dark, protein synthesis inhibitors and cyclic nucleotide analogs. Brain Res., 1983, v. 273, p.111-119.

64. Iuvone P. M„ Tosini G., Pozdeyev N., Haque R., Klein D. C. and Chaurasia S. S. Circadian clocks, clock networks, arylalkylamine N-acetyltransferase, and melatonin in the retina. Prog. Retin. Eye Res., 2005, v. 24, p.433-456.

65. James S. P., Sack D. A., Rosenthal N. E. and Mendelson W. B. Melatonin administration in insomnia. Neuropsychopharmacology, 1990, v. 3, p. 19-23.

66. Jankovic B. D., Isakovic K.and Petrovic S. Effect of pinealectomy on immune reactions in the rat. Immunology, 1970, v. 18, p. 1-6.

67. Kanofsky J. R., Sima P. D. and Richter C. Singlet-oxygen generation from A2E. Photochem. Photobiol., 2003, v. 77, p.235-242.

68. King M. C. Antioxidant and photophysical properties of melatonin: a radical perspective. Thesis/Dissertation, 1997, p. 1-109.

69. Klebanoff S. J. Metabolites from phagocytes. In: Basic principles and clinical con-elates. Raven Press, N .Y., 1992, p. 541-588

70. Kopin 1. J., Pare C. M., Axelrod J. and Weissbach H. The fate of melatonin in animals. J. Biol. Chem., 1961, v. 236, p.3072-3075.

71. Korf H. W. The pineal organ as a component of the biological clock, phylogenetic and ontogenetic considerations. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1994, v. 719, p. 13-42.

72. Kurz-Isler G. and Wolburg H. Gap junctions between horizontal cells in the cyprinid fish alter rapidly their structure during light and dark adaptation. Neurosci. Lett., 1986, v. 67, p.7-12.

73. La Vail M. M. Rod outher segment disk shedding in rat retina: relationship to cyclic lighting. Science, 1976, v. 194, p. 1071-1073.

74. Lane E. A. and Moss H. B. Pharmacokinetics of melatonin in man: first pass hepatic metabolism. J. Clin. Endocrinol. Metab, 1985, v. 61, p.1214-1216.

75. Lerner A. B., Case J. D., Takahashi Y., Lee T. H. and Mori W. Isolation of melatonin, the pineal gland factor, that lightens melanocytes. J. Am. Chem. Soc., 1958, v. 80, p.2587

76. Lucchelli A., Santagostino-Barbone M. G. and Tonini M. Investigation into the contractile response of melatonin in the guinea-pig isolated proximal colon: the role of 5-HT4 and melatonin receptors. Br. J. Pharmacol., 1997, v. 121, p. 17751781.

77. Ma X., Idle J. R., Krausz K. W. and Gonzalez F. J. Metabolism of melatonin by human cytochromes p450. Drug Metab Dispos., 2005, v. 33, p.489-494.

78. Ma X., Idle J. R., Krausz K. W., Tan D. X., Ceraulo L. and Gonzalez F. J. Urinary metabolites and antioxidant products of exogenous melatonin in the mouse. J. Pineal Res., 2006, v. 40, p.343-349.

79. MacPhee A. A., Cole F. E. and Rice B. F. The effect of melatonin on steroidogenesis by the human ovary in vitro. J. Clin. Endocrinol. Metab, 1975, v. 40, p.688-696.

80. Mahal H. S., Sharma H. S. and Mukherjee T. Antioxidant properties of melatonin: a pulse radiolysis study. Free Radic. Biol. Med., 1999, v. 26, p.557-565.

81. Maharaj D. S., Anoopkumar-Dukie S., Glass B. D., Antunes E. M., Lack B., Walker R. B. and Daya S. The identification of the UV-degradants of melatonin and their ability to scavenge free radicals. J. Pineal Res., 2002, v. 32, p.257-261.

82. Matuszak Z., Reszka K. and Chignell C. F. Reaction of melatonin and related indoles with hydroxyl radicals: EPR and spin trapping investigations. Free Radic. Biol. Med., 1997, v. 23, p.367-372.

83. Matuszak Z., Bilska M. A., Reszka K. J., Chignell C. F. and Bilski P. Interaction of singlet molecular oxygen with melatonin and related indoles. Photochem. Photobiol., 2003, v. 78, p.449-455.

84. Mayo J. C., Sainz R. M., Antoli I., Herrera F., Martin V. and Rodriguez C. Melatonin regulation of antioxidant enzyme gene expression. Cell Mol. Life Sci., 2002, v. 59, p.1706-1713.

85. Menendez-Pelaez A. and Reiter R. J. Distribution of melatonin in mammalian . tissues: the relative importance of nuclear versus cytosolic localization. J. Pineal Res., 1993, v. 15,p.59-69.

86. Menendez-Pelacz A., Poeggeler B., Reiter R. J., Barlow-Walden L., Pablos M. I. and Tan D. X. Nuclear localization of melatonin in different mammalian tissues: immunocytochemical and radioimmunoassay evidence. J. Cell Biochem., 1993, v. 53, p.373-382.

87. Messner M., Hardeland R., Rodenbeck A. and Huether G. Tissue retention and subcellular distribution of continuously infused melatonin in rats under near physiological conditions. J. Pineal Res., 1998, v. 25, p.251-259.

88. Mor M., Silva C., Vacondio F., Plazzi P. V., Bertoni S., Spadoni G., Diamantini

89. G., Bedini A., Tarzia G., Zusso M., Franceschini D. and Giusti P. Indole-based analogs of melatonin: in vitro antioxidant and cytoprotective activities. J. Pineal Res., 2004, v. 36, p.95-102.

90. Morera A. L. and Abreu P. Existence of melatonin in human platelets. J. Pineal Res., 2005, v. 39, p.432-433.

91. Murrell G. A., Francis M. J. and Bromley L. Modulation of fibroblast proliferation by oxygen free radicals. Biochem. J., 1990, v. 265, p.659-665.

92. Pang S. F., Li L., Ayre E. A., Pang C. S, Lee P. P., Xu R. K., Chow P. H., Yu Z.

93. H. and Shiu S. Y. Neuroendocrinology of melatonin in reproduction: recent developments. J. Chem. Neuroanat., 1998, v. 14, p. 157-166.

94. Pawlak A., Wrona M., Rozanowska M., Zareba M., Lamb L. E., Roberts J. E., Simon J. D. and Sarna T. comparison of the aerobic photoreactivity of A2E with its precursor retinal. Photochem. Photobiol., 2003, v. 77, p.253-258.

95. Pellegrino L. G., Pellegrino A. S. and Cushman A. J. A stereotaxic atlas of the rat brain. Plenum Press, 1979, p. 1-122.

96. PoeggeIer, B. Actions and redox properties of melatonin and other aromatic amino acid metabolites. (Edited by Hardeland R), Verlag, , 2001, p. 67

97. Poon A. M. and Pang S. F. Constant light exposure increases 2125i.iodomelatonin binding sites in the guinea pig spleen. Neurosci. Lett., 1992, v. 146, p.41-44.

98. Pozdeyev N. V. and luvone P. M. Novel mechanism of light-induced degradation of melatonin in the retina. J. Neurochem., 2001, v. 78 (Suppl. I), p. 156

99. Pryor W. A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and reactions. Annu. Rev. Physiol, 1986, v. 48, p.657-667.

100. Radi R., Thomson L., Rubbo H. and Prodanov E. Cytochrome c-catalyzed oxidation of organic molecules by hydrogen peroxide. Arch. Biochem. Biophys., 1991, v. 288, p.112-117.

101. Reiter R. J. Pineal melatonin: cell biology of its synthesis and of its physiological interactions. Endocr. Rev., 1991, v. 12, p. 151-180.

102. Reiter R. J. Functional diversity of the pineal hormone melatonin: its role as an antioxidant. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 1996, v. 104, p. 10-16.

103. Reiter R. J. Oxidative damage in the central nervous system: protection by melatonin. Prog. Neurobiol., 1998, v. 56, p.359-384.

104. Reppert S. M. and Sagar S. M. Characterization of the day-night variation of retinal melatonin content in the chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci., 1983, v. 24, p.294-300.

105. BO.Ribelayga C., Wang Y. and Mangel S. C. A circadian clock in the fish retina regulates dopamine release via activation of melatonin receptors. J. Physiol, 2004, v. 554, p.467-482.

106. Rodrigues M. R., Rodriguez D., Henrique C. L., Russo M. and Campa A. Interferon-gamma independent oxidation of melatonin by macrophages. J. Pineal Res., 2003, v. 34, p.69-74.

107. Rodriguez C., Mayo J. C., Sainz R. M., Antolin I., Herrera F., Martin V. and Reiter R. J. Regulation of antioxidant enzymes: a significant role for melatonin. J. Pineal Res., 2004, v. 36, p. 1-9.

108. Roky R., Kapas L., Taishi T. P., Fang J. and Krueger J. M. Food restriction alters the diurnal distribution of sleep in rats. Physiol Behav., 1999, v. 67, p.697-703.

109. Rousseau A., Petren S., Plannthin J., Eklundh T. and Nordin C. Serum and cerebrospinal fluid concentrations of melatonin: a pilot study in healthy male volunteers. J. Neural Transm., 1999, v. 106, p.883-888.

110. Rozov S. V., Filatova E. V., Orlov A. A., Volkova A. V., Zhloba A. R., Blashko E. L. and Pozdeyev N. V. Nl-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine is a product of melatonin oxidation in rats. J. Pineal Res., 2003, v. 35, p.245-250.

111. Ruthven C. R. J. and Sandler M. In: Diagnosis of Disease (Edited by Brown S. S., Mitchell F. L. and Young D. S.), Elsevier, Amsterdam, 1979, p. 1217

112. Sainz R. M., Mayo J. C., Rodriguez C., Tan D. X., Lopez-Burillo S. and Reiter R. J. Melatonin and cell death: differential actions on apoptosis in normal and cancer cells. Ceil Mol. Life Sci., 2003, v. 60, p. 1407-1426.

113. Samokyszyn V. M., Thomas C. E., Reif D. W., Saito M. and Aust S. D. Release of iron from ferritin and its role in oxygen radical toxicities. Drug Metab Rev., 1988, v. 19, p.283-303.

114. Semak I., Naumova M., Ivorik E., Terekhovich V., Wortsman J. and Slominski A. A novel metabolic pathway of melatonin: oxidation by cytochrome c. Biochemistry, 2005, v. 44, p.9300-9307.

115. Shimizu T., Nomiyama S., Hirata F. and Hayaishi O. Indoleamine 2,3-dioxygenase. purification and some properties. J. Biol. Chem., 1978, v. 253, p.4700-4706.

116. Silva S. O., Rodrigues M. R., Ximenes V. E, Bueno-da-Silva A. E., Amarante-Mendes G. P. and Campa A. Neutrophils as a specific target for melatonin and kynuramines: effects on cytokine release. J. Neuroimmunol., 2004, v. 156, p. 146152.

117. Siu A. W., Reiter R. J. and To C. H. Pineal indoleamines and vitamin e reduce nitric oxide-induced lipid peroxidation in rat retinal homogenates. J. Pineal Res., 1999, v. 27, p. 122-128.

118. Siwicka A., Reiter R. J. and Tan D. X. The synthesis and the structure elucidation of N,0-diacetyl derivative of cyclic 3-hydroxymelatonin. Central Eur J Chem,2004, v. 2, p.425-433.

119. Slominski A., Tobin D. J., Shibahara S. and Wortsman J. Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation. Physiol Rev., 2004, v. 84, p. 11551228.

120. Slominski A., Wortsman J. and Tobin D. J. The cutaneous serotoninergic/melatoninergic system: securing a place under the sun. FASEB J.,2005, v. 19, p.176-194.

121. Smimov A. N. Nuclear melatonin receptors. Biochemistry (Mosc.), 2001, v. 66, p.19-26.

122. Stasica P., Ulanski P. and Rosiak J. M. Melatonin as a hydroxyl radical scavenger. J. Pineal Res., 1998, v. 25, p.65-66.

123. Stasica P., Paneth P. and Rosiak J. M. Hydroxyl radical reaction with melatonin molecule: a computational study. J. Pineal Res., 2000, v. 29, p.125-127.

124. Stone T. W. Kynurenines in the CNS: from endogenous obscurity to therapeutic importance. Prog. Neurobiol., 2001, v. 64, p. 185-218.

125. Sugden D. Psychopharmacological effects of melatonin in mouse and rat. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1983, v. 227, p.587-591.

126. Sugden D., Pickering H., Teh M. T. and Garratt P. J. Melatonin receptor pharmacology: toward subtype specificity. Biol. Cell, 1997, v. 89, p.531-537.

127. Sun X., Deng J., Liu T. and Borjigin J. Circadian 5-HT production regulated by adrenergic signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2002, v. 99, p.4686-4691.

128. Takikawa O., Yoshida R. and Hayaishi O. Monooxygenase activities of dioxygenases. benzphetamine demethylation and aniline hydroxylation reactionscatalyzed by indoleamine 2,3-dioxygenase. J. Biol. Chem., 1983, v. 258, p.6808-6815.

129. Tan D. X., Chen L.-D., Poeggeler B., Manchester L. C. and Reiter R. J. Melatonin a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocrine J., 1993, v. 1, p.57-60.

130. Tan D. X., Poeggeler B., Reiter R. J., Chen L. D., Chen S., Manchester L. C. and Barlow-Walden L. R. The pineal hormone melatonin inhibits dna-adduct formation induced by the chemical carcinogen safrole in vivo. Cancer Lett., 1993, v. 70, p.65-71.

131. Tan D. X., Manchester L. C., Terron M. P., Flores L. J. and Reiter R. J. One molecule, many derivatives: a never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species? J. Pineal Res., 2007, v. 42, p.28-42.

132. Test S. T. and Weiss S. J. Quantitative and temporal characterization of the extracellular H2O2 pool generated by human neutrophils. J. Biol. Chem., 1984, v. 259, p.399-405.

133. Torrielli M. V. and Dianzani M. U. Radicals in inflamatory disease, in: Radicals in Molecular biology, Aging and Disease. Raven Press, N.Y., 1984, p. 355-379

134. Turjanski A. G., Rosenstein R. E. and Estrin D. A. Reactions of melatonin and related indoles with free radicals: a computational study. J. Med. Chem., 1998, v. 41, p.3684-3689.

135. Tyce G. M. In: Serotonin and the Cardiovascular System (Edited by Van Houtte P. M.), Raven Press, N.Y., 1985, p. 1

136. Uchida K., Enomoto N., Itakura K. and Kawakishi S. Formation of diastereoisomeric 3a-hydroxypyrroloindoles from a tryptophan residue analog mediated by iron (II)-EDTAa and L-ascorbate. Arch. Biochem. Biophys., 1990, v. 279, p. 14-20.

137. Urata Y., Honma S., Goto S., Todoroki S., iida T., Cho S., Honma K. and Kondo T. Melatonin induces gamma-glutamylcysteine synthetase mediated by activator protein-1 in human vascular endothelial cells. Free Radic. Biol. Med., 1999, v. 27, p.838-847.

138. Vakkuri O., Rintamaki FI. and Leppaluoto J. Plasma and tissue concentrations of melatonin after midnight light exposure and pinealectomy in the pigeon. J. Endocrinol., 1985, v. 105, p.263-268.

139. Van Tassel D. L., Roberts N., Lewy A. and O'Neill S. D. Melatonin in plant organs. J. Pineal Res., 2001, v. 31, p.8-15.

140. Vaughan G. M. and Reiter R. J. Pineal dependence of the Syrian hamster's nocturnal serum melatonin surge. J. Pineal Res., 1986, v. 3, p.9-14.

141. Weiss S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med., 1989, v. 320, p.365-376.

142. Wever R. A. Characteristics of circadian rhythms in human functions. J. Neural Transm. Suppl, 1986, v. 21, p.323-373.

143. Wiechmann A. F. Regulation of gene expression by melatonin: a microarray survey of the rat retina. J. Pineal Res., 2002, v. 33, p. 178- 185.

144. Winchester R. V. and Lynn K. R. X- and gamma-radiolysis of some tryptophan dipeptides. Int. J. Radiat. Biol. Relat Stud. Phys. Chem. Med., 1970, v. 17, p.541-548.

145. Witt-Enderby P. A., Bennett J., Jarzynka M. J., Firestine S. and Melan M. A. Melatonin receptors and their regulation: biochemical and structural mechanisms. Life Sci., 2003, v. 72, p.2183-2198.

146. Ximenes V. F., Silva S. O., Rodrigues M. R., Catalani L. H., Maghzal G. J., Kettle A. J. and Campa A. Superoxide-dependent oxidation of melatonin by myeloperoxidase. J. Biol. Chem., 2005, v. 280, p.38160-38169.

147. Yamamoto H. and Tang H. W. Antagonistic effect of melatonin against cyanide-induced seizures and acute lethality in mice. Toxicol. Lett., 1996, v. 87, p. 19-24.

148. Yamamoto S. and Hayaishi O. Tryptophan pyrrolase of rabbit intestine. D- and L-tryptophan-cleaving enzyme or enzymes. J. Biol. Chem., 1967, v. 242, p.5260-5266.

149. Yamazaki F., Kuroiwa T., Takikawa O. and Kido R. Human indolylamine 2,3-dioxygenase. its tissue distribution, and characterization of the placental enzyme. Biochem. J., 1985, v. 230, p.635-638.

150. Yasin S. A., Costa A., Besser G. M., Hucks D., Grossman A. and Forsling M. L. Melatonin and its analogs inhibit the basal and stimulated release of hypothalamic vasopressin and oxytocin in vitro. Endocrinology, 1993, v. 132, p. 1329-1336.

151. Yeleswaram K., McLaughlin L. G., Knipe J. O. and Schabdach D. Pharmacokinetics and oral bioavailability of exogenous melatonin in preclinical animal models and clinical implications. J. Pineal Res., 1997, v. 22, p.45-51.

152. Yeleswaram K., Vachharajani N. and Santone K. Involvement of cytochrome p-450 isozymes in melatonin metabolism and clinical implications. J. Pineal Res., 1999, v. 26, p. 190-191.

153. Young I. M., Leone R. M., Francis P., Stovell P. and Silman R. E. Melatonin is metabolized to N-acetyl serotonin and 6-hydroxymelatonin in man. J. Clin. Endocrinol. Metab, 1985, v. 60, p. 114-119.

154. Young R. W. Visual cells and the concept of renewal. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1976, v. 15, p.700-725.

155. Yu B. P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species. Physiol

156. Rev., 1994, v. 74, p. 139-162.

157. Zhang H., Squadrito G. L., Uppu R. and Pryor W. A. Reaction of peroxynitrite with melatonin: a mechanistic study. Chem. Res. Toxicol., 1999, v. 12, p.526-534.