Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеиназа Escherichia coli А2, специфически расщепляющая актин

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеиназа Escherichia coli А2, специфически расщепляющая актин"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

УСМАНОВА Айслу Миркасымовна

ПРОТЕИНАЗА Escherichia coli А2, СПЕЦИФИЧЕСКИ РАСЩЕПЛЯЮЩАЯ АКТИН

ОЗ. 00. 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1991

Работа выполнена в Институте цитологии АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ -

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ХАЙТЛИНА СОФЬЯ ЮРЬЕВНА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ - доктор биологических наук,

профессор

БЕЛОЗЕРСКИЙ МИХАИЛ АНДРЕЕВИЧ

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ГОНЧАРОВА ВАЛЕНТИНА ПАВЛОВНА

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Всесоюзный кардиологический центр

АМН СССР (Москва)

Защита состоится " /I " ¿V 199^ года в 16 часов на заседании Специализированного совета К 063.57.09 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Санкт-Петербургском университете по адресу: 199034 САНКТ-Петербург, Университетская наб., 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета .

Автореферат разослан " _1991 года

Ученый.секретарь Специализированного совета

А.Г.Марков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы стало очевидным, [то цротеолитические ферменты не только участвуют в обмене ве-[еств, но и играют фундаментальную роль во внутриклеточной рефляции на посттрансляционном уровне. Для понимания этих прокосов необходимо изучение внутриклеточных протеаз и тех реакций, которые они катализируют. С другой стороны, протеолитиче-:кие ферменты все более активно применяются в промышленности, гедицине и в различных биохимических исследованиях. Особенно 1ерспективным является применение ферментов бактерий, так как ¡актерии обладают широким набором различающихся по субстратной зпецифичности протеаз. Так из клеток Escherichia coli- класси-iecKoro объекта микробиологии и генной инженерии, выделено жоло 20 протеиназ, но, по-видимому, они не охватывают все 1ротеолитические процессы, протекающие в клетке. Поэтому при яспользовании в качестве субстратов различных белков или синтетических пептидов можно ожидать обнаружение новых протеаз, что, /читывал большую потребность в них, является актуальной проблемой.

Особый интерес вызывают протеиназы, обладающие узкой субстратной специфичностью. Подобные ферменты находят применение, в частности, в структурно-функциональных исследованиях белков с помощью метода ограниченного протеолиза. Примером такого использования протеиназ может служить исследование структуры и функций актина, одного из основных сократительных белков клетки. Актин обладает несколькими функциональными центрами, локализованными на разных частях молекулы. Одним из возможных подходов к изучению локализации этих центров на молекуле актина является исследование функциональных свойств фрагментов молекулы, полученных с помощью разных протеиназ. В ходе такого исследования был обнаружен ограниченный протеолиз актина протеазой бактериального происхождения (Мантуленко и др., 1983). Позднее бактерия продуцент была выделена и идентифицирована как штамм Escherichia coli А2 (ХаЙГЛИНа И др., 1988).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы является изучение специфической протеиназы е.coli а2 и возможности ее

- 2 -

использования для исследования актина.

Решались следующие экспериментальные задачи:

1. Разработка метода выделения и очистки протеиназы

2. Изучение основных биохимических свойств протеиназы

3. Получение с помощью протеиназы "расщепленного актина" - продукта ограниченного протеолиза нагивного актина

4. Изучение некоторых физико-химических свойств "расщепленного актина".

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые обнаружена новая внутриклеточная протеиназа е.coli А2, специфически гидролизущая нативный актин. Разработан метод выделения и очистки фермента. Показано, что фермент относится к классу нейтральных термолабильных металлопротеиназ. Протеиназа расщепляет молекулу актина на два стабильных фрагмента с молекулярной массой 36 и 8 кДа, вызывает гидролиз связи Гли 42 -Вал 43, что отличает ее от действия известных протеиназ, которые гидролизуют в актине иные, пептидные связи. Расщепление связи Гли 42-Вал 43 приводит к образованию комплекса 36 и 8 кДа фрагментов ("расщепленного актина"), который отличается от описанных ранее в литературе расщепленных актинов полной потерей способности полимеризоваться в присутствии о.1 м kci.

Практическое значение работы. Новый фермент может быть использован для ограниченного протеолиза актина с целью изучения его свойств и, в первую очередь, механизма процесса полимеризации, лежащего в основе функционирования актина в клетке, а также при исследовании внутриклеточных функций актина. Кроме того, возможно использование новой протеиназы при изучении структуры и функции других белков.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международном симпозиуме "Механизмы адаптации мышц" (Сегед, Венгрия, 1986), на УШ и IX Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии мышечного сокращения (Пущино, 1987; Тбилиси, 1990), на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печач ных работ, получено одно авторское свидетельство СССР.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования .и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 рисунками и 9 таблицами. В списке литературы приведено 204 источника.

Автор выражает благодарность зав.каф.микробиологии КГУ, проф. И.В.Ленинской за консультации и плодотворное обсуждение работы.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования

Бактерии Escherichia coli А2 BKUM-3697 (Хайтлина И др.', 1988) выращивали в колбах объемом 750 мл, содержащих 250 мл среды, на качалках при 35°. Использовали среду следующего состава (%):пептон 2.0, дрожжевой экстракт - 0.5 (или автолизат -1.0), NaCi - 1.0, рН 7.5.

Для выделения протеинази клетки отмывали и суспендировали в буфере А (20 мМ трис-HCi , рН 7.5). Разрушали клетки ультразвуком с частотой 22 кГц при токе 0.2 А в ультразвуковом генераторе УЗД-1.

Очистка протеина зы включала 4 стадии хроматографии в следующем порядке: ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ-52 (20 мМ трис-HCl, рН 7.5, белок элюировали 0.0-0.3 М iraCl), q сефарозе Fast Plow (20 Ш трис-HCi, рН 7.5; белок элюировали 0.0-0.3 М NaCi),фенил-сефа-роза CL-4B (20 мМ трис-HCl, 1.25 М (ш4>2304 , рН 7.5; белок элюировали нисходящим градиентом (HH4)2S04 1.25-0.0 М), Mono Q HR 5/5 (система РРЬС фирмы Pharmacia , 20 мМ трис-HCl , рН 7.5; белок элюировали линейным градиентом 0.0-0.3 М NaCi).

Для определения специфической дротеолитической активности фракции, полученные при хроматографии, разбавляли буфером А и добавляли к равному объему Г-актина с концентрацией I мг/мл. Смесь инкубировали в течение 30-60 мин при 20°С, после чего анализировали электрофореигчески. Активность регистрировали по интенсивности зоны, соответствующей 36 кДа фрагменту актина. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое превращало 100 мкг актина в 36 кДа фрагмент за 60 мин при 20°.

Актин скелетных мышц кролика выделяли из ацетонового порок да, полученного стандартным способом (Spudich, Watt, 1971) и очищали одним циклом полимеризации-деполимеризации. При хранении в раствор актина добавляли NaN, до 0.02%.

aesans-Актин. Актин, меченный 110 Цис-374 N-iodoacetyl-N-(5-sulfo-1-naplrtyl)ethylene diamine (1,5-1aedans), получали по методу, описанному Такаш (Takashi, 1979). После электрофореза гели, содержащие aedaiis-актин и меченые пептиды, фотографировали в ультрафиолетовом свете при Л = 380 нм.

Для получения сФеропластов клетки лизировали оомотическим шоком (Regnier, Thang, 1972).

Электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия проводили по методу Лаэмли при концентрации акриламида в геле 12.5 и 1Ъ% Cbaemly, 1970). Нагивний электрофорез проводили в бу ферной системе Лаэмли без р-меркаптоэтанола и додецилсульфата натрия при концентрации акриламида в геле равной 7.5$ (Laemly, 1970).

и-концевую последовательность 36, 39 и 40 кДа фрагментов мо лекулн актина в гидролизатах нативного и инактивированного акти на определяли по методу (Cray, Hartly, 1963; Cray, 1972) на сек венаторе модели 477 А, оснащенном аминокислотным анализатором модели 120 АР ТН без разделения фрагментов •

Активность ДНКазы и способность расщепленного актина инги-бировать эту активность определяли по гиперхромному эффекту при А= 260 НМ (Lindberg, lazaridee, 1964 ).

Для получения комплекса ДНКаза I-актин ДНКазу смешивали с актином в отношении 2:1 (моль:моль).

Гельфильтрацию расцепленного актина проводили на колонке 1x60 см с сефакрилом s 300.

Собственную Флуоресценцию актина определяли по методу, описанному Туроверовым с соавт. (Туроверов и др., 1975).

Концентрацию белка определяли .по микробиуретовому методу (itzhahi, 1964) или по поглощению раствора белка при 280 нм.

К-конце®ая последовательность фрагментов актина определена совместно с доктором Д.Коллинзом на базе Мэрилендского университета (США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биосинтез протеиназы

При определении активности протеиназы на разных стадиях роста культуры оказалось, что фермент начинает синтезироваться на поздней стадии экспоненциального роста и накапливается в клетках в стационарной фазе роста, что, видимо, связано с внутриклеточной функцией фермента. Учитывая полученные результаты, в последующи опытах для получения протеиназы, использовали клетки, культивированные в течение 36-40 ч.

В референтном штамме Б.coli № 5172 (Коллекция микроорганизмов Института ветеринарной медицины, Брно, ЧССР), штаммах в. coli K-I2 и H-I0I специфическая протеолитическая активность не обнаружена.

Далее была изучена возможность секреции протеиназы~в периплазму. С этой целью отмытые двухсуточные клетки É.coli А2 подвергали осмотическому шоку для получения фракции периплазмати-ческих белков и сферопластов. Сферопласты, в свою очередь, были разрушены ультразвуком для получения фракции цитоплазматических белков. Показано, что в отличие от белков цитоплазмы, белки периплазма тического пространства не обладают специфической протео-литической активностью, то есть протеиназа локализована в цитоплазме.

2. Выделение и очистка протеиназы

В результате разрушения клеток ультразвуком выход цитоплазматических белков составлял 3-4% от веса сырой биомассы. Аналогичные результаты получены, например, при разрушении клеток с помощью French пресса. В этом случае выход цитоплазматических белков составлял 4-5$ от веса сырой биомассы (Goldberg et al., 1983). Полученный внутриклеточный экстракт использовали как "грубый" препарат протеиназы для дальнейшей очистни.

Результаты очистки приведены в таблице I.

lb данным электрофореза после хроматографии на ДЕАЕ-целлю-лозе ДЕ-52 препарат протеиназы мало отличался от исходного клеточного экстракта. Фракции с максимальной протеолитической активностью остаются гетерогенными и на двух следующих стадиях очистки. Перед хроматографией на Mono q hr 5/5 препарат протеи-

назы содержал три мажорные зоны с молекулярной массой 24.0, 32.0 и 32.5 кДа и несколько минорных зон.

Таблица I

Очистка протеИНЭЗИ Escherichia coli А2, специфически расщепляющей актин

ая ss- ssr« sk

оелок, очистки ность, птх

мг ед

Стадии очистки

ность, сти, ед/мг

Внутриклеточный экстракт

Хроматография на ДЕАЕ-целлшозе

Хроматография на

QSFF

Хроматография на Фенил сефаро-зе СХ-4В

Хроматография на Mono q hr 5/5

3760.0

900.0

1.0

4.2 Х05000 116.6

33.6 112.0 70000 2083.0

3.0 1253.0 54000 18000.0

0.6 6266.0 20000 33333.0

100

66

51

19

Результаты хроматографии на колонке Mono q hr 5/5 представлены на рис. I, из которого видно, что шк активности соответствует пику белка. Фермент элюируется с колонки 0.II-0.I3 M HaCi. По данным электрофореза в денатурирующих условиях, 80-85% препарата фракции с максимальной активностью составляет полипептид с молекулярной массой 32.0 кДа. Кроме того, препарат содержит минорные зоны в области 42-46 и 18-21 кДа.

Рехроматография на Mono q hr 5/5 . в тех же условиях позволила повысить относительное содержание полипептида с молекулярной массой 32.0 кДа до 93-95$.

В связи с тем, что препарат протеиназы после хроматографии на Mono q hr 5/5 содержал минорные примеси, встал вопрос о функциональной гомогенности полученного препарата фермента. При на-

тивном электрофорезе с последующим определением локализации специфической протеолитической активности, активность обнаруживается только в области миграции основного полипептида,. содержащегося в препарате. Кроме основного полипептида, препарат содержит три минорные примеси, мигрирующие выше, чем основной белок. На уровне миграции минорных зон специфическая активность не обнаружена. Эти данные подтверждают предположение о том, что протеина-за имеет субъединичную молекулярную массу 32.0 кДа.

К Ю II 12 13 М 15 16 I? 18 19 20 21 22 23 14 2S 26 2?

Рис. I. Ионнообменная хроматография на Mono q hr 5/5.

Объем колонки I мл; объем собираемых фракций 0.5 мл; количество нанесенного белка 2.8 мг. Белок элюировали с колонки градиентом концентраций Nací (0.0-0.3 М) в 20 мМ трис-HG1 буфере, рН 7.5.

А: I - профиль элюции; 2 - концентрация Nací; 3 - протео-лигическая активность.

Б: Электрофорез в 12.5$ ПМГ в присутствии додецилсульфата натрия. Для определения протеолитической активности фракции разбавляли буфером А в 1000 раз, добавляли к равному объему актина с концентрацией 1.0 мг/мл и инкубировали в течение 45 мин при 20°С, после чего подвергали электрофорезу.

Таким образом, в результате очистки из клеток ь\со11 А2 выделен препарат прогеиназы с субъединичной молекулярной массой 32.0 кДа, являющийся функционально гомогенным.

3. Характеристика протеиназы

Для классификации фермента в первую очередь необходимо было определить к каким специфическим ингибиторам чувствительна про-теиназа. Препарат протеиназы перед добавлением к актину инкубировали с ингибитором в течение 30 мин. Протеиназа не чувствительна к действию ингибиторов сериновых протеаз (ФМСФ, соевый ингибитор трипсина), аспарагиновых протеаз (пепстагин) и цистеиновых протеаз (ПХМБ, N-этилмалеимид), а также химостатина, лейпелти-на и антипаина в концентрации 0.5«Ю-3 мг/мл. Протеиназа не чувствительна к действию 0.25-1.0 мМ ЭДТА и ЭГТА, но полностью ин-гибируется 0.5-5.0 мМ о-фенантролином, специфическим ингибитором металлоферментов.

Для изучения способности, ионов двухвалентных металлов активировать протеиназу препарат фермента перед добавлением к актину инкубировали 20 мин с ионами Япг+, Са2+, Си2+, Ы£2+, Мп2+, Со2+, Зп2+, м2+, С(12+, после чего определяли его активность. Оказалось, что ни один из проверенных металлов в концентрации 0.0010.1 мМ не активировал дополнительно натавную протеиназу. Подучить неактивную форму фермента цутем удаления металла не удалось из-за способности протеиназы почти полностью (на 90-95%) восстанавливать активность после удаления о-фенантролина.

В связи с этим изучали восстановление протеолитической активности ионами двухвалентных металлов в присутствии о-фенантролина (0,6 мМ). о-Фенантролинсодержащий препарат протеиназы пре-инкубировали 20 мин с ионом металла, после чего определяли его активность. Оказалось, что в црисутствии 0,6 мМ о-фенантролина Са2+(0.1-0.3 мМ), Си2+ (0.02-0.3 мМ), Зп2+ (0,05-0.5 мМ), С<12+ (0.02-0.3 мМ), (0.05-0.3 мМ), Мп2+(0.1-0.5 мМ), не восстанавливают протеолигическую активность. 2п2+ (0.02-0.3 мМ) восстанавливает около 40% активности. и±2+(0.3-0.5 мМ) восстанавливает активность фермента на 85-90$, а Со2+(0.3-0.5 мМ) - на 80$ от исходной.

Протеиназа стабильна при рН 4.3-8.5 и имеет широкий рН оп-

тимум при гидролизе Г-актина (7.0-7.8), что характерно для многих металлопротеиназ. Так как при pH ниже 6.0 актин полимеризу-ется и протеиназой не расцепляется, дая исследования действия протеиназы в более широком диапазоне pH в качестве субстрата был использован гистон Н5. При этом цротеиназа обнаружила два пика активности при pH 5.4-5.6 и 7.0-7.4. По-видимому, это связано со спецификой используемого белкового субстрата.

Протеиназа полностью теряет активность при 56°С в течение 30 мин или при 65°С в течение 5 мин и является, следовательно, термолабильным ферментом.

Подводя итоги сказанному, можно сделать вывод, что новая протеиназа, выделенная из клеток E.coii А2, является термолабильной нейтральной металлопротеиназой.

В клетках E.coii хорошо охарактеризованы две металлопро-теиназы: ci - цитошгазматический фермент о молекулярной массой 125 кДа и Pi (Ш) - периплазматический фермент о молекулярной массой НО кДа (Goldberg et ai., 1983). Отличия наблюдаются также в чувствительности к ингибиторам и к действию разных ионов двухвалентных металлов. Кроме того, в отличие от протеиназы Е. coll А2, имеющей широкий pH оптимум, протеиназы Ci и Pi имеют узкий оптимум pH.

Клеточный экстракт E.coii А2 расщепляет актин ограниченно с образованием 36 и 8 кДа фрагментов. Ограниченный характер про-теолиза сохраняется и после очистки протеиназы. Из рисунка 2 видно, что при весовом соотношении протеиназа:актин от 1:50 до 1:3000 (инкубация 60 мин при 20°С) образуются 36 и 8 кДа фрагменты (см. также рис. 3), при добавлении протеиназы к актину в отношении 1:5 протеолиз актина идет дальше с образованием 33.7 и 30.0 кДа фрагментов.

При протеолизе инактивированного актина наряду с 36 кДа фрагментом образуются фрагменты с молекулярной массой 40 и 39 кДа и, кроме того, большое количество фрагментов с меньшей молекулярной массой.

Была определена N-концевая аминокислотная последователь-' носгь 36, 39 и 40 кДа фрагментов актина. Аминокислотная последовательность актина известна (Eisinga et al., 1973), благодаря чему стала возможно локализовать эти пептиды в структуре актина.

43 кДа

30 кДа

20 кДа

• 14.4 кДа

I 2 34567 89 10

Рис. 2. Прогеолиз нативного актина протеиназой е.coli А2 при разном соотношении фермент:белок.

Время инкубации 60 мин при 20°С. I - актин. 2-8 -соотношение протеиназа:актин 1:5, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:3000, соответственно. 9 - маркеры. 10 - протеиназа.

и-концевая последовательность 36 кДа фрагмента представля ет собой полипептид Вал-Мет-Вал-Гли-Мет, что соответствует гидролизу связи Гли 42-Вал 43.

ы-концевая последовательность 39 кДа фрагмента - Вал-Фен-Про-Сер-Иле, что соответствует гидролизу связи Ала 29-Вал 30.

N-концевая последовательность 40 кДа фрагмента - Иле-Вал-Гли-Арг-Про, что соответствует гидролизу связи Сер 33-Иле 34.

Таким образом, видно, что первичная специфичность протеиназа определяется природой того остатка, которому принадлежит

, I Ii

аминогруппа гидролизуемой связи (i1 позиция; р2-р1-р1-р2). Протеиназа гидролизует пвптидные связи, включаицие остатки с гидрофобной боковой цепью. Подобная специфичность характерна для многих бактериальных металлопротеиназ, в том числе, например, для терыолизина (Heinrikson, 1977).

Если сопоставить картину протеолиза нативного и инактиви-рованного актина с данными по третичной структуре, видно, что пептидная связь, чувствительная в нативном актине, Гли 42- Вал 43 находится на петлеобразной структуре (38-52), экспонированно

-Ilia поверхности молекулы (Kabsch et al., 1990). Связи 29-30 и 33-34, недоступные в нативном актине для действия протеиназы, расположены внутри белковой глобулы. Инактивация актина прогреванием, очевидно, ведет к появлению этих связей на поверхности молекулы.

Исследуемая протеиназа расщепляет актин ограниченно, что может быть связано как с устойчивостью третичной структуры акг-тина к действию протеиназы, так и со специфичностью фермента к определенным связям. Поэтому было интересно проверить действие протеиназы на другие белки.

Препарат протеиназы, полученный после хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52, в концентрациях, достаточных для полного переваривания актина в 36 кДа фрагмент, не действует на следующие нативные белки: казеин, РНКаза, лизоцим, белки сократительного аппарата (миозин, тропомиозин, тропонин Г, С, I, «¿-акти-нин),.Однако фермент в тех же условиях способен расщеплять некоторые белки, предварительно подвергшиеся частичной протеоли-тической деградации. Так, протеиназа расщепляет частично гидро-лизованные тропонин Т, кальдесмон.

Очищенная протеиназа при соотношении фермент:белок от 1:25 до 1:1250 (60 мин инкубации при 20°С) не гидролизует следущие белки: нативный и денатурированный бычий сывороточный альбумин, овальбумин, РНКаза, лизоцим, в то время как .актин полностью превращается в 36 кДа фрагмент. Однако, в тех же условиях протеиназа неспецифически гидролизует гисгоноподобный белок E.coli ни, гистоны HI, Н2А, Н2В, НЗ, Н4, Н5.

Для выяснения функциональной роли протеиназы необходим поиск эндогенных субстратов протеиназы и изучение характера поведения протеиназы in vivo. Очевидно, что протеолитическая активность фермента in vitro на предложенных неэндогенных субстратах может не отражать реального поведения фермента in vivo.

4. Физико-химические свойства актина, расщепленного

ПРОТеИНаЗОЙ E.coli А2

Нативный актин расщепляется протеиназой на два пептида с молекулярной массой 36 и 8 кДа, которые являются стабильными и не деградирующими в течение длительного времени. Фибриллярный актин протеиназой не расщепляется.

- 12 -

Анализ смеси фрагментов с помощью гельфильтрации показал, что в присутствии ионов Са2+, а также в 50 мкМ %2+, I мМ ЭГТА (условия, в которых происходит замещение прочно связанного кальция на магний) 8 кДа фрагмент коэлшруется с 36 кДа фрагментом (рис. 3), что свидетельствует об ассоциации фрагментов после расщепления актина протеиназой.

А Б

43 кДа 36 кДа

— ш

.8 кДа

А РА I 2 3

Рис. 3. Гельфильтрация расщепленного актина в разных условиях (А) и электрофорез белковых пиков в 15% ДААГ в денатурирующих условиях (Б).

I - гельфильтрация в растворе Риса-Янга (0.2 мМ Са2+, 0.5 мМ АТФ, 2.0 мИ.трис-нс1, рН7.5); 2 - в растворе Риса-Янга, 50 мдМ % , I мМ ЭГТА; 3 - в растворе Риса-Янга, I. мМ-ЭДТА. А - актин. РА - расщепленный актин.

В присутствии I мМ ЭДТА в пике обнаружен только 36 кДа фрагмент. Очевидно, комплекс 36 кДа-8 кДа фрагментов в присутствии ЭДТА диссоциирует, после чего, возможно, происходит агрегация 36 кДа фрагментов.

Таким образом, в результате гидролиза нативного актина образуется "расщепленный актин", который представляет собой комплекс двух пептидов с молекулярной массой 36 и 8 кДа.

36 кДа фрагмент, полученный цри гидролизе актина, меченого 1,5-1АБШ.из, содержит флуоресцентную метку, то есть 36 кДа фрагмент сохраняет С-концевую аминокислотную последовательность.

Одним из способов оценки нативносги структуры актина является определение положения спектра собственной флуоресценции, которое характеризуется параметром А. Известно, что значения парамет-

ра А для нативного и инактивированного актина равны 2.5-2.6 и 1.3, соответственно (Туроверов и ДР«> 1975). Оказалось, что параметр А для расщепленного актина равен 2.40-2.47, что близко к его значениям для нативного актина. Таким образом, расщепление актина протеиназой е. coli а2 не приводит к существенным изменениям в конформации молекулы.

Известно, что актин, ограниченно расщепленный субтилизином и химотрипсином, способен полимеризоваться или сополимеризовать-ся в 0.1 М KCl (Korrno, 1987; Schwyter et al., 1989). В этой связи встал вопрос о способности актина, расщепленного протеиназой E.coii А2, к полимеризации.

Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что расщепленный актин в концентрации 0.72-3.6 мг/мл не полимеризуется в 0.1 KCl.

. Таблица 2

Полимеризация расщепленного актина в 0.1 м KCl

Концентрация Концентрация бел- Количество белка Ä расщепленного актина, мг/мл

1 3.60

2 2.20

3 1.60

4 0.72

ка в супеонатан- в супернатанге

те, мг/мл %

3.20 89

2.10 95

1.43 90

0.72 100

Отсутствие полимеризации расщепленного актина в КС1 подтверждено также методами вискозиметрии, электронной микроскопии и флуоресценцией актина, меченого пиренилиодоацетамидом (Khait-lina et al., 1991).

В недавно опубликованных работах по изучению третичной структуры актина и актиновых филаментов предполагается, что аминокислотные остатки 41-45, участвуют в межмолекулярном взаимодействии в процессе полимеризации (Holmes et al., 1990). Видно, что расщепление связи Гли 42-Вал 43, затрагивающее непосредственно аминокислотные остатки, участвующие в межмолекулярном взаимодействии мономеров актина, хотя и не приводит к существенным изменени-

ям в структуре актина, является критическим для его способности к полимеризации. Расщепление субгилизином связи Мет 4?-Гли 48 не имеет таких серьезных последствий. Образущийся комплекс 35 кДа-10 кДа фрагментов способен полимеризоваться, хотя и с меньшей эффективностью, чем нативный актин (Schwyter et al.,1989)« Химотрипсин расщепляет связь Мет 44-Вал 45, что приводит к значительным изменениям свойств расщепленного актина, но тем не менее он способен к сополимеризации с нативный актином ( Коппо, 1987).

Таким образом, разница в месте локализации гидролизущейся связи на 2-5 аминокислотных остатков является причиной значительного изменения в свойствах расщепленного актина.

Известно, что актин является природным ингибитором ДНКазы I благодаря своей способности образовывать с ней комплекс (lazari-des, idndberg, 1974). Оказалось, что расщепленный актин, добавленный к ДНКазе I в количестве, вдвое большем, чем нативный актин, не ингибирует ДИКазу I, й то время как интактный актин полностью подавляет ее активность. Следовательно, расщепление связи Гли 42-Вал 43 приводит к полной потере способности расщепленного актина к взаимодействию с ДНКазой I. В сравнении с этим расщепление оубтилизином связи Мет 47-Гли 48, хотя и значительно снижает связывание актина с ДНКазой I, однако не приводит к полной потере ЭТОЙ способности (Schwyter et al., 1989)«

Таким' образом, с помощью ограниченного протеолиза протеина-зой E.coli А2 был получен "расщепленный актин", отличающийся от ранее описанных "расщепленных актинов", полученных с помощью химотрипсина и субтилизина,полной потерей способности полимеризоваться в 0.1 М КС1 и взаимодействовать с ДНКазой X. Новый расщепленный актин может быть использован при изучении структурных и функциональных свойств актина, в том числе механизмов процесса его полимеризации.

ВЫВОДЫ

I. В штамме бактерий Escherichia coli А2 обнаружена новая протеиназа. Разработан метод выделения и очистки протеиназы, который дает возможность очистить фермент в 6200 раз с выходом по активности 19$.

2. Фермент локализован в цитоплазме и имеет субъединичную молекулярную массу 32.0 кДа, не чувствителен к действию ингибиторов сериновых, цистеиновых и карбоксильных протеаз, ингибиру-ется о-фенантролином. Ионы £n2+, Со2+, ш.2+ восстанавливают активность протеиназы, ингибированной о-фенантролином. Фермент термолабилен, имеет широкий pH оптимум (7.0-7.8) при гидролизе актина и два pH оптимума (5.4-5.6'и 7.0-7.4) при гидролизе ги-стона Н5. Фермент классифицирован как металлопротеиназа.

3. Гидролиз нативного актина протеиназой сохраняет ограниченный характер в широком диапазоне соотношений фермент ¡белок (1:50-1:3000). Образующиеся 36 и 8 кДа фрагменты стабильны и не гидролизуются в течение длительного промежутка времени. Гидролиз инактивированного актина неограничен.

Протеиназа не гидролизует овальбумин, нативный и денатурированный бычий сывороточный альбумин, РНКазу, но способна неограниченно расщеплять гистоноподобный белок Escherichia coli ни и гистоны HI, Н2А, Н2В, НЗ, Н4, Н5.

4. Протеиназа расщепляет в нативном актине связь Гли 42-Вал 43, не совпадающую с сайгами расщепления актина другими протеазами. В инактивированном актине, кроме того, расщепляются связи Ала 29-Вал 30 и Сер 33-Иле 34. Таким образом, протеиназа специфична к аминокислотным остаткам с гидрофобной боковой цепью в позиции Р-, в гидролизуемой пептидной связи.

5. В результате гидролиза связи Гли 42-Вал 43 образуется "расщепленный актин" - комплекс 36 и 8 кДа фрагментов. Расщепленный актин диссоциирует на два пептида в присутствии I мМ ЭДТА.

6. По данным собственной УФ-фдуоресценции, расщепленный актин сохраняет конформацию, близкую к конформации нативного белка. Однако, в отличие от ранее описанных расщепленных актинов, полученных с помощью химотрипсина и субтилизина, новый расщепленный актин полностью теряет способность полимеризовать-ся в присутствии 0.1 М KCl и ингибировать активность ДНКазы I.

7. Таким образом, актин, расщепленный новой .бактериальной протеиназой, является удобной моделью для изучения функциональных свойств актина и, в частности, механизмов его полимеризации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Khaitlina S.Yu., Smirnova T.D., Usmanova a.m. The limited proteolysis of various isoactiris by a specific bacterial protease // Abstr. Intern. Symp. on Adaptive mechanisms of muscle, Szeged, Hungary, 1986, p. 352. Усманова A.M., Матвеев B.B., Хайтлина С.Ю. Свойства бактериальной протеазы, специфически расщеплящей актин // Тез. УШ Всесоюзн. симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Пущино, 1987, с. 36. ■ 3. Хайтлина С.Ю., Усманова A.M. Ограниченный протеолиз новой бактериальной протеазой // Тез. УШ Всесоюзн. симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Пущино, 1987, с. 38-39.

4. Хайтлина С.Ю., Смирнова Т.Д., Федорова З.Ф., Усманова A.M. Штамм бактерий Escherichia coli - продуцент нейтральной протеиназы. Авт. свид. J£ I39024I СССР, Билл, изобр. 1988, 15, с. 12.

5. Khaitlina S.Yu«, Smirnova T.D., Usmanova A.M. Limited proteolysis of actin by a specific bacterial protease // FEBS ■ Letters. - 1988. - Y. 228. - I. 172-1746. Усманова A.M., Хайтлина С.Ю. Протеаза из штамма бактерии

E.coii А2, специфически расщепляющая актин // Биохимия. -

1989. - Т. 54. - С. I308-I3I4.

7. Khaitlina S.Yu., Usmanova A.M., Matveyev V.V., Sinakevich I.G., Tsvetkov A.G. A new bacterial protease as an instrument for estimation of actin structure and function // Abstr. Intern. . Symp. "Molecular organization of biological structures". Moscow, 1989, p. 176.

8. Усманова A.M., Матвеев B.B., Морозова А.В., Хайтлина С.Ю. Дальнейшее изучение протеиназы из штамма бактерий E.coii А2, специфически расщеплящей актин // Тез. IX Всесоюзн. симп. "Биофизика и биохимия биологической подвижности", Тбилиси,

1990, с. 42.

9. Khaitlina S.Yu., Collins J.H., Kuznetsowa I.M., Pershina V.P., Sinakevich I.G., Turoverov K.K., Usmanova A.M. Physiсо-chemical properties of actin cleaved with bacterial protease from E.coii A2 strain // FEBS Letters. - 1991- - V. 279- - P.49-51.