Характеристика фактора аутоагглютинации возбудителя чумы

Рыкова, Виолетта Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Характеристика фактора аутоагглютинации возбудителя чумы
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика фактора аутоагглютинации возбудителя чумы"

На травах, рукописи

004600097

РЫКОВА ВИОЛЕТТА АЛЕКСАНДРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРА АУТОАГГЛЮТИНАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 АПР 2010

Ставрополь-2010

004600097

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: кандидат химических наук

Подладчикова Ольга Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Буравцева Нина Пантелеймоновна;

доктор биологических наук, профессор Майский Виктор Григорьевич.

Ведущая организация: ФГУЗ «Иркутский научно-

исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится » 2010 г. в ^ часов

на заседании диссертационного совета ДМ 212.256.09 в Ставропольском государственном университете по адресу: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, д. 1, корпус 2, комната 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ставропольского государственного университета.

Автореферат разослан » ^20 ю г.

Ученый секретарь диссертационного совета

И.В. Ржепаковский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большинство бактерий окружает клеточная стенка, играющая важную роль в их жизнедеятельности. Она предохраняет микробы от механических повреждений и факторов внешней среды, противодействует внутреннему осмотическому давлению, обеспечивает способность бактерий поглощать питательные вещества, взаимодействовать друг с другом. У патогенных бактерий многие поверхностные компоненты являются факторами вирулентности, обусловливающими взаимодействие с клетками -хозяина и защиту от бактерицидного действия систем врожденного иммунитета. Некоторые из этих компонентов имеют видоспецифическую структуру, и их идентификация имеет большое значение для создания диагностических препаратов.

У чумного микроба (Yersinia pestis) видоспецифичным антигеном, на выявлении которого основана серодиагностика чумы, является капсульный антиген Cafl. Для создания иммуноглобулиновых и антигенных диагностикумов используется препарат (фракция 1, Fl), метод выделения которого был предложен еще в 1952 году (Baker Е.Е., Sommer H., Foster L.E. et al., 1952). В настоящее время известно, что основным компонентом Fl является специфичный для возбудителя чумы белок Cafl, который кодируется плазмидой рМТ, экспрессируется при 37°С и образует капсулу на поверхности бактерий. Однако в препарате Fl могут присутствовать и перекрестно реагирующие антигены (ПРА), поэтому диагностикумы на основе Fl не обладают строгой специфичностью (Коссе JI.B., 1992; Andrews G.P., Heath D.G., Anderson G.W.Jr. et al., 1996; Федорова BA, Девдариани 3.JI., 2002). В разные годы были предложены диагностические препараты на основе различных антигенных фракций, выделенных из клеток Y pestis: мембранных белков (Щербаков A.A., Анисимов П.И., Кондрашин Ю.И., Солодовникова Т.Н., 1984), фракции II (Рыбкин B.C., Кулаков М.Я., Волков Е.А., Свистунов В.М., 1982), фракции V (Божко Н.В., Лебедева С.А., Бичуль ОХ и др., 2005). Диагностические препараты были получены и на основе очищенных антигенов Y.pestis: ЛПС (Вейнблат В.И., Дальвадянц С.М., Меньшов П.И., 1983), белка S-слоя (Дятлов И.А., Волох O.A., 2004), «мышиного» токсина (Соколов П.Н., Свиридов Г.Г., Степанов В.М. и др., 1992), активатора плазминогена (Вейнблат В.И., 1989). Диагностикумы на основе ЛПС, белка S-слоя, фракции II, фракции V взаимодействовали также с возбудителем псевдотуберкулеза. Препараты на основе «мышиного» токсина и активатора плазминогена были специфичны, однако они не пригодны для выявления вирулентных штаммов Y. pestis, лишенных этих антигенов (Hinnebusch J., Cherepanov P., Du Y. et al., 2000; Lathem W.W., Price P.A., Miller VJL., Goldman W.E., 2007). До настоящего времени единственным сертифицированным методом серодиагностики чумы остается детекция Cafl и антител к нему (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней, 2009). В то же время выявление Cafl неэффективно для обнаружения Y. pestis в объектах внешней среды и в переносчиках чумы блохах. Более того, в конце эпизоотии и в некоторых природных очагах чумы выделяются штаммы, не

синтезирующие CafI, но вызывающие заболевание чумой у лабораторных животных и людей (Анисимов А.П., 2002). Создание диагностических препаратов, способных детектировать и такие атипичные штаммы, является актуальной задачей, решению которой будет способствовать поиск и оценка специфичности новых стабильно экспрессируемых поверхностных антигенов Y. pestis.

О присутствии на поверхности Y. pestis неидентифицированных компонентов можно судить по способности разных штаммов к аутоагглютинации (АА) -самопроизвольной агрегации клеток в жидкой среде. Известно, что АА бактерий обычно связана с присутствием на их поверхности гидрофобных или способных к агрегации белков, которые участвуют в адгезии микробов к поверхностям и образовании биопленок (Van Houdt R., Michiels C.W., 2005). У патогенных видов эти белки играют существенную роль в вирулентности, поскольку обусловливают прикрепление бактерий к клеткам хозяина и защищают микробы от фагоцитоза и комплемента (Collyn F., Lety М.-А., Nair S. et al., 2002; Bamhart M.M., Chapman M.R., 2006; Fexby S., Bjarnsholt Т., Jensen O.P. et al., 2007). Признак АА характерен как для К pestis, так и для энтеропатогенных видов иерсиний: Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica (Laird W.J., Cavanaugh D.C., 1980). У двух последних видов АА проявляется только при 37°С и обусловлена белком YadA (Skurnik М., Bolin I., Heikkinen H. et al., 1984). Фактор аутоагглютинации (ФА) клеток Y. pestis, которые не экспрессируют YadA (Rosqvist R., Skurnik M., Wolf-Watz. H., 1988), до нашего исследования оставался неизвестным. Различия в АА трех видов иерсиний позволяют предположить, что АА Y. pestis, которая участвует в проявлении вирулентности возбудителем чумы (Брюханова Г.Д., Акиев А.К., Бейер А.П., 1995), может быть обусловлена компонентом, отсутствующим у энтеропатогенных видов. В связи с этим идентификация и характеристика ФА представляет интерес как в плане изучения молекулярных механизмов патогенности Y. pestis, так и для выявления антигена, который может быть полезен при создании новых препаратов для диагностики и профилактики чумы.

Цель исследования: идентификация, выделение, характеристика и оценка диагностической значимости ФА Y. pestis.

Задачи исследования:

1. Получить мутанты Y. pestis EV76, не проявляющие АА, и идентифицировать компонент, ответственный за проявление этого свойства.

2. Создать штамм К pestis -продуцент ФА и разработать метод выделения ФА.

3. Охарактеризовать препарат ФА по физико-химическим и иммунохимическим свойствам.

4. Получить диагностические препараты для выявления ФА и антител к нему.

5. Провести анализ распространенности ФА-подобных антигенов у различных бактерий и анти-ФА антител в сыворотках крови млекопитающих.

6. Оценить возможность использования ФА К pestis и антител к нему для диагностических целей.

Научная иовизиа исследования. Впервые идентифицирован фактор, обусловливающий АА клеток возбудителя чумы, и разработан метод его выделения. Впервые получена характеристика нового антигена чумного микроба по физико-химическим и иммунохимическим свойствам.

Установлено, что ФА является перекрестно реагирующим антигеном возбудителя чумы, антитела к которому присутствуют в нормальных и иммунных сыворотках крови млекопитающих, а также в иммуноглобулиновых диагностических препаратах для серодиагностики различных инфекционных заболеваний. Впервые показано, что наличие ФА-подобных антигенов в анализируемых образцах и антител к ним в диагностических сыворотках может обусловливать ложноположительные серологические реакции.

Теоретическая значимость. Выявлен и охарактеризован новый поверхностный антиген У. реьНй, обусловливающий способность клеток к АА, которая у патогенных бактерий связана с проявлением вирулентности. Дальнейшее изучение ФА будет способствовать выявлению его физиологической роли и механизмов его возможного участия в проявлении вирулентных свойств возбудителя чумы.

Значительное количество ФА на поверхности клеток К рехИз и выработка антител к нему при иммунизации животных живыми и убитыми бактериями свидетельствуют о том, что исследование протективных свойств ФА может способствовать выявлению нового кандидата для включения в химическую противочумную вакцину.

Обнаруженное в работе изменение количества и качества анти-ФА антител у животных и людей при различных патологических состояниях представляет интерес для дальнейших исследований возможности использования этих антител в качестве неспецифического маркера инфекционного процесса.

Практическая значимость. Получен штамм-продуцент ФА (У. рехИя ЕУ76 б/п), который не содержит автономных или интегрированных с хромосомой плазмидных репликонов. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под названием У. КМ 1279 (положительное решение от 14.12.2007, протокол № 22). Этот штамм может быть использован не только для выделения ФА, но и для выделения других белков, кодируемых хромосомными генами.

Разработан простой метод выделения и очистки ФА с поверхности клеток У. реяНх ЕУ76 б/п с целью получения препаративных количеств ФА. Полученный препарат может быть применен для оценки роли ФА в реализации патогенных и протективных свойств возбудителя чумы, а также для адсорбции неспецифических анти-ФА антител из иммунных сывороток.

рекомендации «Способ устранения неспецифических серологических реакций с помощью перекрестно реагирующего антигена возбудителя чумы» (протокол № 4 от 27.06.02). Предложенный метод может быть полезен при конструировании новых препаратов для серодиагностики различных инфекционных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Возбудитель чумы имеет на своей поверхности ранее неизвестный антиген -фактор аутоагглюпшации (ФА), представляющий собой комплекс 17,5 кДа белка с низкомолекулярным компонентом.

2. ФА Y pestis является перекрестно реагирующим антигеном: ФА-подобные антигены обнаружены у Yersinia pseudotuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris.

3. Антитела к ФА присутствуют в сыворотках крови млекопитающих: у здоровых людей и животных - в форме неполных антител, а у больных людей с клинической картиной инфекционного заболевания, а также у животных, иммунизированных различными антигенами, выявляются и полные антитела.

4. ФА-подобные антигены в анализируемых образцах могут быть инактивированы с помощью нормальной кроличьей сыворотки. Анти-ФА антитела могут быть удалены из иммунных сывороток с помощью препарата ФА или клеток штамма - продуцента Y. pestis EV76 б/п.

Апробация работы. Материалы диссертации были неоднократно доложены на конференциях и иа заседаниях Ученого Совета в РостНИПЧИ, представлены на 7 Международном конгрессе по проблемам иерсиний в Нимегене (Нидерланды, 1998), на 9 Международном конгрессе по проблемам иерсиний в Лексингтоне (США, 2006), на научной конференции в Институте гигиены и медицинской микробиологии им. Макса фон Петтенкофера в Мюнхене (Германия, 2007), на VII межвузовской биохимической конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано в соавторстве 10 работ, из них 3 - в периодических изданиях из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертащи на соискание искомой ученой степени, 2 - в зарубежной печати.

План диссертационной работы утвержден Ученым советом РостНИПЧИ 28.08.2008 (протокол № 10). Исследования выполнены в рамках плановых тем: «Фактор аутоагглютинации как возможная причина неспецифических реакций при серодиагностике чумы» (№ гос. регистрации 0120.00 00371) и «Характеристика нового сидерофора возбудителя чумы» (№ гос. регистрации 0120.0 410668).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (1 глава), изложения материалов и методов (1 глава), результатов собственных исследований (2 главы), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками. Библиографический указатель содержит 94 отечественных и 182 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Штаммы и питательные среды. В работе был использован штамм Y. pestis EV76 (Phe-, Met-, Glp-, Hms-, Ybt-, Cafl+, Cad+, Pst+), а также его моноплазмидный (Y. pestis EV76 pYP^) и бесплазмвдный (X pestis EV76 б/п) варианты. Штаммы 10 видов рода Yersinia (К pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. bercovieri, Y. rodei, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. ruckeri, Y. aldovae) и 14 видов гетерологичных бактерий (Pasteurella mullocida, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis, Citrobacter Jreundii, Francisella tularensis, Francisella novicida, Legionella pneumophila, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus) были получены из музея живых культур РостНИПЧИ и выделены от больных людей в Диагностическом центре при РостНИПЧИ. Бактерии выращивали при 26°С и 37°С на плотной или жидкой среде LB, NB, BHI (Difco, США) или среде Хотгингера (рН 7,2).

Диагностикумы. Авторские диагностикумы конструировали на основе формалинизированных таннизированных эритроцитов барана производства Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций им. Масгута Айкимбаева (Казахский НЦКЗИ). Для агглютинационных тестов использовали следующие диагностикумы:

1) тшуноглобултовый эритроцитарный чумной на основе гипериммунной лошадиной сыворотки (Казахский НЦКЗИ), иммуноглобулиновый эритроцитарный анти-ФА диагностикум на основе кроличьих антител к препарату ФА Y. pestis (получен автором);

2) иммуноглобулиновые диагностикумы на полимерных микросферах (туляремийный, легион сллезный, псевдотуберкулезный, чумной антифракционный) на основе сывороток к убитым кипячением бактериям референтных штаммов и к F1 Y. pestis (РостНИПЧИ);

3) антигенные эритроцитарные диагностикумы на основе препарата F1 Y. pestis (Казахский НЦКЗИ), протеинлипополисахаридного комплекса Y. pseudotuberculosis (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток), водорастворимого антигена F. tularensis (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва; Ставропольский НИПЧИ), препарата ЛПС F. novicida (РостНИПЧИ), препарата ФА (получен автором);

4) антигенный легионеллезный на полимерных микросферах на основе клеточного лизата референтного штамма L pneumophila I с/в (РостНИПЧИ).

Сыворотки крови. В работе были проанализированы следующие сыворотки:

1) нормальные сыворотки мышей, морских свинок, барана (виварий РостНИПЧИ), свиней (Ростовский-на-Дону мясокомбинат) и людей (Ростовская-на-Дону станция переливания крови);

2) иммунные кроличьи сыворотки, полученные сотрудниками РостНИПЧИ при иммунизации животных препаратом F1 X pestis, клетками Y. pseudotuberculosis I, III, V с/в, клетками F. tularensis, F. novicida и L, pneumophila I с/в, а также,

полученные автором кроличьи сыворотки к препарату ФА и к убитым ацетоном клеткам Y. pestis EV76, Y. pestis EV76 б/п;

3) гипериммунные чумная и туляремийная лошадиные сыворотки, полученные иммунизацией животных живыми бактериями Y. pestis EV76 НИИЭГ (РосНИПЧИ «Микроб») и вакцинным штаммом F. tularensis 15/10 (Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока);

4) сыворотки больных людей с симптомами инфекционного заболевания (Диагностический центр при РостНИПЧИ) и больных лейкозом (отделение гематологии Ростовской-на-Дону областной клинической больницы № 1).

Методы. 1. Микробиологические методы. Признак АА клеток определяли по характеру роста в жидкой питательной среде и по способности бактерий образовывать агрегаты на стекле в 0,5 М растворе сульфата аммония. Гидрофобность бактерий определяли методом разделения фаз (Rosenberg М., Gutnic D., Rosenberg Е., 1980) и агглютинации на стекле в растворах сульфата аммония различной концентрации (Lindahl М., Farris А., Wadstrom Т., Hjerten S., 1981), а фагонейтрализующую активность ФА - в соответствии с методом, описанным J. Nesper et al. (2000).

2. Генетические методы. Плазмидный состав Y. pestis определяли методом C.I. Kado et al. (1981), хромосомную ДНК выделяли в соответствии с рекомендациями М.А Serghini et al. (1989), ПЦР проводили по методу R.K. Saiki et al. (1988). В работе использовали праймеры, комплементарные генам hmsF (предоставлены доктором R.D. Репу, Университет Кентукки, США), irp2 (предоставлены доктором A.B. Ракиным, Институт гигиены и медицинской микробиологии им. Макса фон Петтенкофера, Германия) и плазмидным генам cafl, IcrV, pla (Neubauer H., Meyer H., Prior J. et al., 2000).

3. Биохимические методы. ЛПС выделяли методом О. Westphal (1965) с последующей очисткой фенолом, Cafl получали методом Е.Е Baker et al. (1952) из смыва антигена с поверхности неразрушенных клеток физиологическим раствором; концентрацию белка определяли модифицированным методом О.Н. Lowry et al. (Марцишаускас Р.П., Тарасявиченс Л.Э., Канопкайте С.И., 1975), нейтральных углеводов - методом М. Dubois et al. (1956). Электрофорез белков в ДСН-ПААГ проводили методом U.K. Laemmli (1970). Для гель-фильтрации использовали колонки биогеля TSK-20, для обращеннофазовой ВЭЖХ - колонки Vydac С-18, масс-спектрометрию препарата ФА осуществляли в НИИ биомедицинской химии РАМН им. В.Н. Ореховича на масс-спектрометре Vision 2000.

4. Иммунохимические методы. Реакцию диффузионной преципитации (РДП) проводили по О. Ouchterlony (1949), агглютинационные тесты (РИГА, РАО, Р1111 А, РНАт, РНАг) - в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей диагностических препаратов и Практического руководства по лабораторной диагностике возбудителей опасных инфекционных болезней (Самойлова JI.B., Донская Т.Н., Вейнблат В.И. и др., 1998). Иммуноферментный анализ (Towbin Н., Gordon J., 1984) проводили в двух вариацях метода: дот-иммуноанализ и

иммуноблот с использованием нитроцеллюлозных фильтров (Amersham, США; Shleicher and Schuell, Германия). ЛПС выявляли с помощью МКА к ЛПС У. pestis (из криобанка РостНИПЧИ), и меченного пероксидазой хрена стафилококкового белка А. Для выявления ФА использовали авторские анти-ФА кроличьи сыворотки и меченные пероксидазой хрена вторичные антитела к иммуноглобулинам кролика классов G, М и A (Sigma, США). Меченые вторичные антитела или белок А визуализировали с помощью 3,3'-диаминобензидина (Serva, США).

5. Статистические методы. Расчет средней геометрической величины титра антител (Х8) в сыворотках крови млекопитающих и коэффициента вариации (Cv) среднегеометрических значений проводили с помощью компьютерной программы Excel 7,0.

Результаты исследований и их обсуждение

Идентификация фактора аутоагглютинацни возбудителя чумы. С целью идентификации компонента(-ов), обусловливающего АА возбудителя чумы, необходимо было получить мутанты Y. pestis, не проявляющие этот признак, и выявить компонент(ы), отсутствующий или измененный у мутантов. Для получения мутантов был использован вакцинный штамм Y. pestis EV76, содержащий в качестве маркера одну плазмиду pYP. Этот штамм не продуцировал антиген Cafl, который, как известно, экранирует поверхностные компоненты Y. pestis (Liu F., Chen H., Galvan E. M. et al., 2006; Sebbane F, Jarrett C, Gardner D. et al., 2009). Критерием для отбора спонтанных мутантов служила утрата ими R-формы колоний, которая у грамотрицательных бактерий коррелирует с АА (Argenio D.A.D, Calfee M.W., Rainey Р.В., Pesci E.C., 2002). Сравнительный анализ родительских и мутантных клеток приведен на рисунке 1.

Характеристика АА+ АА-

Характер роста в жидких средах «Комок ваты» на дне, пленка на поверхности Равномер-ный рост

Поверхностная гидрофобность (%) 50±8 22±5

Мин. концентрация сульфата аммония для АА на стекле (М) 0,25 3

Чувствительность к бактериофагу Л-41 Зс + -

РПГА с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом +

Рисунок 1 - Характеристика АА+ и АА" клонов штамма У. ре$Ш ЕУ76.

а. Сравнение свойств ААТ и АА" клонов У. резИя ЕУ76.

б. Электрофореграмма в 15 % ДСН-ПААГ белков щелочных смывов АА+ и АА" клеток У. рейИя ЕУ76. Окраска Кумасси 11-250.1 -АА+-клетки; 2-АА"-клетки; 3- СаП, Юмкт.

Этот анализ показал, что утрата АА сопровождается снижением поверхностной гадрофобности, утратой чувствительности к чумному бактериофагу JI-413c и активности в РПГА с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом. При этом мутанты не отличались от родительского штамма по элекгрофоретической подвижности и иммунохимической активности ЛПС, который мог бы отвечать за все четыре свойства. Однако в смывах с поверхности мутантов раствором 10 мМ NaOH отсутствовал 17 кДа белковый компонент (рис. 16, трек 2), который присутствовал у родительского штамма (рис. 16, трек 1). Смывы с поверхности АА+, но не АА" клеток, реагировали с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом и нейтрализовали чумной бактериофаг JI-413с. Эти данные позволяли предположить, что за все эти свойства отвечает 17 кДа белок. Дм подтверждения того, что именно этот компонент является фактором аутоаггаотинации (ФА) чумного микроба необходимо было его выделить и охарактеризовать. Для этого желательно было иметь штамм Y. pestis, на поверхности которого, помимо предполагаемого ФА, присутствовало бы минимальное количество других компонентов.

Выделение ФА из клеток возбудителя чумы. Для выделения ФА нами был получен штамм F. pestis EV76 б/п, не содержащий трех резидентных плазмид как в автономном, так и в интегрированном состоянии, и не синтезирующий кодируемые ими антигены. Штамм сохранял признак АА, а также культурально-морфологические и биохимические свойства родительского штамма, был чувствителен к фагам Покровской и Лариной (Л-413с) и реагировал с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом до концентрации 10 м.кл./мл. Для разработки метода выделения ФА была использована отмытая физраствором и высушенная ацетоном бакмасса этого штамма, выращенного при 26°С в течение 48 часов. При этом применяли простой способ тестирования иммунохимической активности всех фракций с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом, а отдельные фракции проверяли на фагонейтрализующую активность. С клеточной поверхности ФА смывали 10 мМ раствором NaOH (pH 9,0), при котором происходил наиболее полный смыв антигена без разрушения бактерий. Попытки использовать хроматографические методы для выделения ФА из щелочного смыва, освобожденного от клеток, не увенчались успехом. Гель-фильтрация и обращеннофазовая ВЭЖХ показали, что компонент, обладающий иммунохимической и фагонейтрализующей активностью, присутствовал в различных фракциях. Поэтому в схему выделения ФА (таблица 1) были включены этапы осаждения из растворов компонента, реагирующего в РПГА с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом и нейтрализующего бактериофаг Л-413с. В трех независимых экспериментах с помощью такой схемы из 1 г сухой бакмассы штамма Y. pestis EV76 б/п было выделено от 80 до 100 мг сухого препарата ФА, что свидетельствовало о его присутствии на поверхности клеток Y. pestis в значительных количествах.

Таблица 1 - Схема выделения ФА из клеток У. реяШ ЕУ76 б/п

№ Название этана Содержание этапа

1. Смыв поверхностных компонентов Клетки суспендируют в 10 мМ ЫаОН, выдерживают, периодически встряхивая, при 2б°С 2 часа и отделяют центрифугированием (20°С, 8000об/мин, 15 мин).

2. Освобождение от бактерий Супернатант фильтруют через нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.

3. Осаждение ФА сульфатом аммоння К фильтрату добавляют сульфат аммония до 25% насыщения, выдерживают 20 час при 4°С. Осадок отделяют центрифугированием (4°С, 10000 об/мин, 30 мин).

4. Освобождение от сульфата аммоння Осадок растворяют в 10 мМ №ОН и диализуют против ЮмМК'аОН при +4°С в течение 24 часов.

5. Трехкратное изоэлектрическое осаждение ФА К диализовакному раствору добавляют НС1 до рН 4,6 и выдерживают 20 час при +4°С. Осадок отделяют центрифугированием (4°С, 10000 об/мин, 30 мин).

б. Осаждение ФА ацетоном Осадок растворяют в 10 мМ №ОН и добавляют три объема холодного ацетона, выдерживают при -20°С 20 часов. Осадок отделяют центрифугированием (как в п.5).

7. Лнофнльное высушивание Осадок суспендируют в денонизовагаюй дистиллированной воде и лиофильно высушивают.

Препарат ФА обладал способностью нейтрализовать чумной бактериофаг Л-413с, а также повышал поверхностную гидрофобность и способствовал АА клеток АА" мутантов У. рей\$ ЕУ76. Так, после инкубации мутантов с выделенным препаратом при 26° в течение 1 часа они повышали свою гидрофобность с 22 до 42 % и, так же как родительский штамм, начинали проявлять АА в 0,25 М растворе сульфата аммония.

Анализ физико-химических свойств ФА. Препарат ФА растворялся в щелочных растворах и не растворялся в воде, что свидетельствовало о его гидрофобности. Определение химического состава ФА выявило в нем присутствие 80 % белка и 2-10 % нейтральных углеводов. Вариабельность углеводного состава в нескольких сериях препарата могла быть связана с примесями клеточных полисахаридов. Исследование препарата на наличие ЛПС, который часто контаминирует препараты из грамотрицательных бактерий, с помощью иммуноблотгинга с МКА к ЛПС У. ре$Ш не выявило в нем примесей ЛПС.

Анализ ФА методом гель-электрофореза в ДСН-ПААГ показал, что на электрофореграммах он представлен множественными полосами, что могло бы указывать на присутствие разных, в том числе и высокомолекулярных, белков (рис. 2а, трек 2). Однако сохранение в препарате одной полосы с подвижностью на уровне 17 кДа после обработки гидрохлоридом Данидина, разрушающим водородные связи, свидетельствовало о наличии в препарате только одного белка

(рис. 2а, трек 3). Наличие множества высокомолекулярных белков не подтверждалось и при масс-спектрометрическом анализе ФА. Максимальная молекулярная масса, зарегистрированная в препарате этим методом, составляла 17,485 кДа. Исходя из этого можно было заключить, что 17,5 кДа белок способен образовывать агрегаты, устойчивые к действию 2-меркаптоэтанола и ДСН, поэтому при гель-электрофорезе ФА выявляется в виде множественных полос.

12 3 12

Рисунок 2 - Гель-электрофорез препарата ФА.

а. Электрофореграмма препарата ФА в 12,5 % ДСН-ПААГ. Окраска Кумасси R-250. 1 - маркеры м.м. белков (кДа); 2 - препарат ФА, 50 мкг; 3 - препарат ФА после обработки 6 М гидрохлоридом гуанидина и осаждения ацетоном, 50 мкг.

б. Электрофореграмма препарата ФА в 15 % ДСН-ПААГ. Окраска серебром. )-препарат ФА, прогретый при 80°С 5 минут, 30 мкг; 2 - маркеры м.м. белков (кДа).

Анализ препарата ФА различными методами привел нас к заключению, что ФА, помимо 17,5 кДа белка, содержит еще и низкомолекулярный компонент. Так, УФ-спектроскопия препарата показала, что он имеет дополнительный максимум поглощения при 250-260 нм, что свидетельствовало о наличии в нем небелковых примесей. И действительно, при гель-фильтрации препарата ФА, прогретого при 80°С 5 минут в кислой среде, в нем был выявлен низкомолекулярный компонент. Гель-электрофорез прогретого препарата в ДСН-ПААГ показал, что этот компонент выявлялся только при окрашивании гелей серебром (рис. 26).

Таким образом, физико-химическая характеристика препарата позволила заключить, что ФА Y. pestis образует агрегаты, устойчивые к действию денатурирующих агентов, и представляет собой комплекс 17,5 кДа белка и низкомолекулярного компонента. ФА по ряду свойств (самоагрегация, м, м. субъединицы, устойчивость к денатурирующим агентам) сходен с агрегативными фимбриями патогенных кишечных палочек и сальмонелл (Barnhart М.М., Chapman M.R., 2006). Эти белки вызывают АА бактерий, а также участвуют в проявлении их адгезивных и инвазивных свойств и образовании биопленок.

| Иммунохимическая характеристика ФА. Взаимодействие ФА с чумной

! гипериммунной лошадиной сывороткой свидетельствовало о выработке анти-ФА антител при иммунизации животных живыми бактериями. Нами были получены кроличьи сыворотки к убитым ацетоном клеткам штамма У. реэИэ ЕУ76 и его бесплазмидного варианта, а также к препарату ФА. Анализ полученных сывороток показал, что анти-ФА антитела вырабатываются при иммунизации и убитыми клетками и препаратом, что говорило об антигенных свойствах ФА.

Иммунохимическая характеристика ФА была проведена в сравнении с диагностическим антигеном возбудителя чумы - СаП. Эти антигены имеют ряд общих свойств: они локализованы на поверхности клеток, имеют белковую природу, способны к самоагрегации, сходны по м. м. субъединицы (около 17 кДа), а антитела к обоим антигенам присутствуют в сыворотках животных, иммунизированных живыми и убитыми клетками К реяИв. Однако в отличие от СаП, ФА экспрессируется независимо от присутствия плазмид и температуры выращивания бактерий. При гель-электрофорезе ФА выявляется в виде ! множественных полос, а СаП - в виде одной полосы с подвижностью на уровне белка с м. м. 17 кДа (рис. За).

1 2 12 12

Рисунок 3 - Сравнительный анализ препаратов ФА и СаП методом гель-электрофореза и иммуноблоттинга.

I а. Электрофорез белков в 12,5 % ДСН-ПААГ с окраской Кумасси Л-250.

б. Иммуноблот с кроличьей анти-ФА сывороткой.

в. Иммуноблот с нормальной кроличьей сывороткой.

1. Препарат ФА, 20 мкг. 2. Препарат СаП, 5 мкг.

Сравнение препаратов разными иммунохимическими методами (РДП, РПГА, РНАт и иммуноблоттинг) также выявило их различие. В РДП с чумной гипериммунной лошадиной сывороткой препараты давали по одной неперекрещивающейся линии преципитации. При этом истощение сыворотки препаратом ФА приводило к сохранению анти-СаП, но не анти-ФА антител. Оба препарата реагировали в РПГА с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом, при этом реакция с ФА тормозилась анти-ФА кроличьей сывороткой, а реакция с

а б в

Cafl тормозилась анти-СаЯ сьтороткой. В отличие от Cafl, ФА не выявлялся в РНАт, в которой используется разбавленная до двух агглютинирующих единиц чумная гипериммунная сыворотка и эритроцитарный чумной антигенный диагностикум на основе F1. Это свидетельствовало о том, что в чумной гипериммунной лошадиной сыворотке шгги-Cafl антитела значительно преобладают над анти-ФА антителами. В иммуноблоте с иммунной кроличьей анти-ФА сывороткой (рис. 36) ФА выявлялся в виде множественных полос, как и на окрашенных Кумасси электрофореграммах (рис. За). При этом Cafl с этой сывороткой не реагировал.

Таким образом, было установлено, что ФА является антигеном, который, несмотря на ряд общих свойств, отличается по физико-химическим свойствам и иммунохимической специфичности от Cafl антигена Y. pestis.

Оценка специфичности ФА для Г. pestis. Для оценки специфичности ФА-антигена для К pestis были исследованы 24 вида бактерий в РПГА с полученным нами иммуноглобулиновым анти-ФА диагностикумом. ФА-подобный антиген был выявлен у всех исследованных штаммов Y. pestis (30 шт.) и Y. pseudotuberculosis (40 шт.), а также у К pneumoniae, P. aeruginosa и P. vulgaris. При этом культуры К. pneumoniae и P. vulgaris, выделенные от больных, снижали экспрессию ФА-подобного антигена (до полной утраты) при пересевах, что свидетельствовало об активации его синтеза у этих бактерий in vivo. Экспрессия ФА-подобного антигена у гетерологичных бактерий не коррелировала с признаком АА, что могло означать отличие ФА-подобных антигенов от ФА Y. pestis по гидрофобности. Также было выявлено, что, в отличие от Y. pestis и К pseudotuberculosis, активность антигена К. pneumoniae, P. aeruginosa и P. vulgaris не проявлялась после кипячения бактерий в течение 10 минут или инкубации в течение часа в 4 % формалине, а после прогревания культур при 56°С в течение 30 минут с мертиолятом наггрия (1:10000) она исчезала у К. pneumoniae и P. aeruginosa.

При выделении ФА-подобных антигенов из гетерологичных бактерий методом, разработанным для выделения ФА К pestis, оказалось, что они осаждались при 50% насыщении раствора сульфатом аммония, что свидетельствовало об их меньшей гидрофобности по сравнению с ФА Y. pestis. Полученные препараты реагировали в РПГА с анти-ФА диагностикумом и с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом, а также в дот-иммуноанализе с кроличьей сывороткой, полученной к ФА Y. pestis. При гель-электрофорезе в ДСН-ПААГ все препараты были представлены множественными белковыми полосами, которые отличались у разных препаратов по подвижности. Наибольшее сходство с ФА Y. pestis имел антиген Y. pseudotuberculosis, который, тем не менее, не проявлял АА при 26°С, несмотря на экспрессию ФА-подобного антигена. Возможным объяснением этому может быть два факта. С одной стороны, У. pseudotuberculosis, в отличие от Y. pestis (Knirel Y.A., Dentovskaya S.V., Senchenkova S.N. et al, 2006), при 26°C синтезирует О-полисахаридные цепи ЛПС, которые могут экранировать ФА. С другой стороны, мы обнаружили, что у К pseudotuberculosis ФА-подобный

антиген выделяется в культуральную среду, а у К pestis он связан с клеточной поверхностью, обусловливая АА клеток.

Полученные результаты позволили заключить, что ФА является перекрестно реагирующим антигеном Y. pestis. Иммунохимически сходные, но не идентичные антигены, присутствуют и у других бактерий. Хотя ФА-подобный антиген выявлен у немногих гетерологичных бактерий, нельзя исключить, что расширение круга исследуемых организмов и поиск оптимальных условий его экспрессии позволит выявить и другие виды бактерий, экспрессирующие ФА-подобный антиген.

Поиск антител к ФА в сыворотках крови млекопитающих. Для исследования сывороток нами был получен антигенный диагностикум на основе препарата ФА. Этот диагностикум использовали для выявления полных антител к ФА в РПГА, специфичность которой контролировали в РТПГА с анти-ФА кроличьей сывороткой. Неполные антитела к ФА выявляли в РНАг с помощью раствора препарата ФА Y. pestis, разбавленного до двух антигенных единиц, и антительного анти-ФА диагностикума. Анализ нормальных сывороток крови млекопитающих показал, что анти-ФА антитела присутствовали в них в форме неполных антител (таблица 2, № 1 - 5), и только у отдельных животных выявлялись полные анти-ФА антитела. Высокий коэффициент вариации (18,3 - 38 %) титра неполных анти-ФА антител у одного вцца млекопитающих являлся показателем значительной вариабельности их количества у разных особей. При этом коэффициент вариации титров этих антител между видами был незначительным (Xg -1:374; Су-6,6 %), т.е. уровень их продукции не зависел от вида животных.

Все иммунные сыворотки содержали полные антитела к ФА (таблица 2, № 6 -12). При этом титры антител в РНАг превышали титры антител в РПГА, что указывало на присутствие в иммугащх сыворотках как полных, так и неполных антител к ФА. Интересно, что анти-ФА антитела были выявлены и в сыворотках животных, иммунизированных бактериями, не экспрессирующими ФА-подобный антиген (F. tularensis, F. novicida, L. pneumophila). Можно предположить, что появление полных антител к ФА в иммунных сыворотках является ответом организма на иммунизацию, а количество и качество анти-ФА антител может изменяться при различных - состояниях организма. Это предположение подтверждалось при исследовании сывороток крови людей: у здоровых людей присутствовали только неполные анти-ФА антитела, а у больных с клинической картиной инфекционной или онкологической патологии выявлялись полные антитела к ФА в высоких титрах (Х8-1:640; Су- 21 %) (таблица 2, № 5,13 -15).

Таким образом, исследование сывороток крови животных и людей показало, что у здоровых млекопитающих присутствуют неполные анти-ФА антитела, что позволяет отнести их к нормальным иммуноглобулинам. У иммунных животных и больных людей выявляются как неполные, так и полные антитела к ФА. Для ответа на вопрос, являются ли полные анти-ФА антитела показателем иммунного, инфекционного или любого воспалительного процесса в организме, необходимы дальнейшие исследования.

Таблица 2 - Титры анти-ФА антител в сыворотках крови млекопитающих

№ пп Сыворотка РПГА РНАг

Кол-во* Титр** Y *** AS Су*4** (%) Кол-во* Титр** Vм Cv**** (%)

1. Баранья нормальная 1/4 1:640 - - 4/4 1:1601:640 1:380 38

2. Свиная нормальная 1/10 1:640 - - 10/10 1:1601:640 1:394 18,3

3. Кроличья нормальная 2/11 1:201:80 - - 11/11 1:801:1280 1:410 25,8

4. Морской спинки нормальная 1/5 1:320 - - 5/5 1:3201:640 1:422 21

5. Человеческая нормальная 0/10 0 - - 10/10 1:401:640 1:298 28Д

6. Кроличья к У. pseudotuberculosis 3/3 1:801:160 1:127 - 3/3 1:6401:1280 1:1020

7. Кроличья к L pneumophila 2/2 1:401:80 1:57 - 2/2 1:3201:640 1:452

8. Кроличья к F. novicida 1/1 1:160 - - 1/1 1:320 -

9. Кроличья к F.tularensis 1/1 1:80 - - 1/1 1:320 -

10. Кроличья к препарату F1 Y. pestis 2/2 1:3201:640 1:452 - 2/2 1:80001:16000 1:11350

И. Лошадиная к У. pestis (гипериммунная) 3/3 1:640 1:1280 1:1020 - 3/3 1:320001:64000 1:40400

12. Лошадиная к F. tularensis (гипериммунная) 1/1 1:160 - - 1/1 1:640 -

13. Больные с лихорадкой 2/2 1:6401:1280 1:905 50,7 2/2 1:6401:1280 -

14. Больные с лимфаденитом 3/3 1:3201:1280 1:640 55,9 - не опред. -

15. Больные лейкозом 10/10 1:3201:1280 1:595 14,9 - не опред. -

♦количество положительно реагирующих сывороток / количество исследованных сывороток; "приведены минимальные и максимальные величины; ***Х8- значение среднегеометрической величины титра; ****С,- коэффициент вариации.

Использование ФА и анти-ФА антител для повышения специфичности серологических реакций. Наличие в сыворотках анти-ФА антител предполагало возможность их присутствия и в иммуноглобулиновых диагностикумах. Действительно, проверка способности ФА Y. pestis реагировать в РАО с такими диагностикумами (чумным антифракционным, туляремийным, легионеллезным, псевдотуберкулезным) показала, что они также содержат анти-ФА антитела. Тест-системы, содержащие примеси анти-ФА антител, могут реагировать и с ФА-подобными антигенами бактерий, присутствующими в окружающей среде (Р. aeruginosa, P. vulgaris) и в организме млекопитающих (К. pneumoniae, P. vulgaris). Устранить реакции, вызванные ФА-подобными антигенами, можно было при

помощи предварительной часовой инкубации бактериальных образцов в 1% кроличьей анти-ФА сыворотке или 10%-ной нормальной кроличьей сыворотке (ИКС). В течение многих лет 1% ИКС применяется в качестве разводящей жидкости для РПГА и РАО. Наши исследования показали, что ИКС может способствовать повышению специфичности этих реакций за счет инактивации ФА-подобных антигенов в анализируемых пробах нормальными анти-ФА антителами.

Анти-ФА антитела из иммунных сывороток можно было удалить путем их адсорбции препаратом ФА или клетками Y. pestis EV76 б/п. Так, анализ четырех иммунных (к Y. pseudotuberculosis, к F. tularensis, к F. novicida, к L. pneumophila) и двух гипериммунных (к Y. pestis и к F. tularensis) сывороток показал, что в результате адсорбции из них удалялись перекрестно реагирующие анти-ФА антитела, а специфические антитела сохранялись в неизменном титре.

Результаты нашего исследования позволили заключить, что ФА не является специфичным для возбудителя чумы и не может использоваться в качестве диагностического антигена. Однако ФА может быть применен для повышения специфичности иммунных сывороток при создании иммуноглобулиновых диагностических препаратов для выявления различных инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Аутоагглютинация Y. pestis обусловлена присутствием на поверхности клеток ранее неизвестного гидрофобного компонента белковой природы, названного фактором аутоагглютинации (ФА).

2. Методом последовательной элиминации плазмид получен штамм-продуцент ФА (Y. pestis EV76 б/п), сохраняющий культурально-морфологические и биохимические свойства родительского штамма, но не синтезирующий кодируемые плазмид ами гены.

3. Разработана схема выделения ФА из штамма-продуцента, основанная на смыве ФА с поверхности клеток щелочным раствором, осаждении белка при 25% насыщении сульфатом аммония и изоэлектрическом осаждении при pH 4,6. Получен лиофилизированный препарат ФА.

4. Изучены физико-химические свойства ФА, который представляет собой комплекс белка м. м.17,5 кДа и низкомолекулярного компонента.

5. Сконструированы эритроцитарные диагностикумы для определения ФА-антигена и анти-ФА антител в реакции пассивной гемагглютинации.

6. ФА является перекрестно реагирующим антигеном, обнаруженным не только у К pestis, но и у Y. pseudotuberculosis, К. pneumoniae, P. aeruginosa и Р. vulgaris, которые синтезируют сходный, но не идентичный антиген.

7. Антитела к ФА присутствуют в нормальных и иммунных сыворотках крови млекопитающих: у здоровых людей и животных они регистрируются в форме неполных антител, а у иммунных животных и больных людей с клинической картиной инфекционной патологии- в форме полных антител.

8. Иммуноглобулиновые диагностические препараты, содержащие анти-ФА

антитела, кроме специфических диагностических антигенов, выявляют и перекрестно реагирующие ФА-подобные антигены, которые инактивируются с помощью нормальной кроличьей сыворотки.

9. Анти-ФА антитела удаляются из иммунных сывороток путем адсорбции препаратом ФА или клетками Y. pestis EV76 б/п.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Podladchikova, O.N. Genetic and biochemical aspects of Yersinia pestis autoagglutination / O.N. Podladchikova, V.A Rykova, G.G. Dikhanov II 7-th Intern. Congress on Yersinia. - Nijmegen, 1998. - P. 16-17.

2. Подладчикова, O.H. Фактор аутоагтлютинации как возможная причина иеспецифических серологических реакций / О.Н. Подладчикова, В.А. Рыкова, JI.K. Лысова, MB. Цимбалистова // Метод, докум. и отчеты по сан.-элид. охране территории РФ: Реф. сб. - Саратов, 2002. - С. 33-34.

3. Рыкова, В.А. Способ повышения специфичности серодиагностики инфекций с помощью перекрестно реагирующего антигена возбудителя чумы / ВА. Рыкова, О.Н. Подладчикова II Метод, док. и отчеты по сан.-эпид. охране территории РФ: Реф. сб. - Саратов, 2003. - С. 14.

4. Podladchikova, O.N. Autoagglutination factor of Yersinia pestis I O.N. Podladchikova, V.A. Rykova // 9-th Intern. Symp. on Yersinia. - Lexington, Kentucky, 2006.-P. 78.

5. Подладчикова, O.H. Идентификация фактора аутоагтлютинации HMS- клеток возбудителя чумы / О.Н. Подладчикова, В.А. Рыкова II Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 2006. - № 2. - С. 25-29. •

6. Подладчикова, О.Н. Выделение и характеристика фактора аутоагтлютинации HMS- клеток Yersinia pestis / О.Н. Подладчикова, В.А. Рыкова // Биохимия. - 2006. -Т. 71, вып. 11. -С. 1469-1478.

7. Рыкова, В.А. Диагностическая значимость перекрестно реагирующего антигена возбудителя чумы / В.А. Рыкова, О.Н. Подладчикова II Современ. аспекты зпид. надзора за особо опас. инф. забол. на Юге России: матер, науч.-практ. конф. -Ставрополь, 2007. - Ч. 2.- С. 74-76.

8. Рыкова, В .А. Антитела к перекрестно реагирующему антигену возбудителя чумы как неспецифический маркер воспалительного процесса / ВА. Рыкова, Л.К. Лысова, B.C. Шамрай, О.Н. Подладчикова // Обмен веществ при адаптации и повреждении: матер. VII межвуз. конф. с международным участием. - Ростов-на-Дону, 2008. - С. 113-116.

9. Рыкова, В.А. Иммунохимическая характеристика фактора аутоагтлютинации возбудителя чумы / В.А. Рыкова, Л.К. Лысова, О.Н. Подладчикова II Клин. лаб. диагн. - 2009.-№3.-С. 19-22.

10. Рыкова, В А. Фактор аутоагтлютинации возбудителя чумы - перекрестно реагирующий антиген / В А Рыкова, Л.К. Лысова, О.Н. Подладчикова // Клин. лаб. диагн. -2009. - № 7. - С. 22-24,33.

Подписано в печать 12 марта 2010 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 27.

Отпечатано в компьютерно - множительном центре ИП Булатовой В.И. 344006, г. Ростов-на-Дону, пр. Соколова, 21. Лицензия ПЛД № 65-133 от 27. 05. 98 г. Тел. 218-08-48.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рыкова, Виолетта Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ПОВЕРХНОСТНЫЕ АНТИГЕНЫ

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ (обзор литературы).

1.1.Общая характеристика поверхностных компонентов грамотрицательных бактерий.

1.2. Поверхностные антигены возбудителя чумы.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Использованные в работе материалы.

2.1.1. Штаммы.

2.1.2. Питательные среды.

2.1.3. Химические реактивы.

2.1.4. Диагностические препараты.

2.1.5. Сыворотки крови.

2.2. Используемые в работе методы.

2.2.1. Микробиологические методы.

2.2.2. Генетические методы.

2.2.3. Биохимические методы.

2.2.4. Иммунохимические методы.

2.2.5. Статистические методы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ВЫДЕЛЕНИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРА АУТОААГЛЮТИНАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ

ЧУМЫ.

3.1. Идентификация фактора аутоагглютинации возбудителя чумы.

3.1.1. Получение и анализ мутантов Y. pestis, различающихся по АА.

3.1.2. Сравнительный анализ препаратов ЛПС, выделенных из клеток, различающихся по признаку А А.

3.1.3. Поиск фактора, обусловливающего АА клеток Y. pestis EV76.

3.2. Выделение ФА из клеток возбудителя чумы.

3.2.1. Получение и характеристика штамма-продуцента ФА

Y. pestis EV76 б/п.

3.2.2. Разработка метода выделения ФА возбудителя чумы.

3.3. Анализ физико-химических свойств ФА.

ГЛАВА 4. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФАКТОРА АУ ТО АГГЛЮТИНАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.

4.1. Получение препаратов для выявления ФА и анти-ФА антител.

4.2. Сравнительная характеристика ФА и Cafl.

4.3. Оценка специфичности ФА для Y. pestis.

4.4. Поиск антител к ФА в сыворотках крови млекопитающих.

4.4.1. Анализ нормальных сывороток крови различных видов животных.

4.4.2. Поиск анти-ФА антител в иммунных сыворотках.

4.4.3. Антитела к ФА в сыворотках крови людей.

4.5. Оценка возможности использования ФА и анти-ФА антител для повышения специфичности серологических исследований.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика фактора аутоагглютинации возбудителя чумы"

Актуальность проблемы. Большинство бактерий окружает клеточная стенка, играющая важную роль в их жизнедеятельности. Она предохраняет микробы от механических повреждений и факторов внешней среды, противодействует внутреннему осмотическому давлению, обеспечивает способность бактерий поглощать питательные вещества, взаимодействовать друг с другом. У патогенных бактерий многие поверхностные компоненты являются факторами вирулентности, обусловливающими взаимодействие с клетками хозяина и защиту от бактерицидного действия систем врожденного иммунитета. Некоторые из этих компонентов имеют видоспецифическую структуру, и их идентификация имеет большое значение для создания диагностических препаратов.

Меньшов П.И., 1983), белка S-слоя (Дятлов И.А., Волох О.А., 2004), «мышиного» токсина (Соколов П.Н., Свиридов Г.Г., Степанов В.М. и др., 1992), активатора плазминогена (Вейнблат В.И., 1989). Диагностикумы на основе ЛПС, белка S-слоя, фракции II, фракции V взаимодействовали также с возбудителем псевдотуберкулеза. Препараты на основе «мышиного» токсина и активатора плазминогена были специфичны, однако они не пригодны для выявления вирулентных штаммов Y. pestis, лишенных этих антигенов (Hinnebusch J., Cherepanov P., Du Y. et al., 2000; Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E., 2007). До настоящего времени единственным сертифицированным методом серодиагностики чумы остается детекция Cafl и антител к нему (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней, 2009). В то же время выявление Cafl неэффективно для обнаружения Y. pestis в объектах внешней среды и в переносчиках чумы -блохах. Более того, в конце эпизоотий и в некоторых природных очагах чумы выделяются штаммы, не синтезирующие Cafl, но вызывающие заболевание чумой у лабораторных животных и людей (Анисимов А.П., 2002). Создание диагностических препаратов, способных детектировать и такие атипичные штаммы, является актуальной задачей, решению которой будет способствовать поиск и оценка специфичности новых стабильно экспрессируемых поверхностных антигенов Y. pestis.

Признак АА характерен как для Y. pestis, так и для энтеропатогенных видов иерсиний: Y pseudotuberculosis и Y enterocolitica (Laird WJ., Cavanaugh D.C., 1980). У двух последних видов АА проявляется только при 37°С и обусловлена белком YadA (Skurnik М., Bolin I., Heikkinen H. et al., 1984). Фактор аутоагглютинации (ФА) клеток Y. pestis, которые не экспрессируют YadA (Rosqvist R., Skurnik M., Wolf-Watz. H., 1988), до нашего исследования оставался неизвестным. Различия в АА трех видов иерсиний позволяют предположить, что АА Y. pestis, которая участвует в проявлении вирулентности возбудителем чумы (Брюханова Г.Д., Акиев А.К., Бейер А.П., 1995), может быть обусловлена компонентом, отсутствующим у энтеропатогенных видов. В связи с этим идентификация и характеристика ФА представляет интерес как в плане изучения молекулярных механизмов патогенности Y. pestis, так и для выявления антигена, который может быть полезен при создании новых препаратов для диагностики и профилактики чумы.

Цель исследования: идентификация, выделение, характеристика и оценка диагностической значимости ФА Y. pestis.

Задачи исследования:

2. Создать штамм Y. pestis - продуцент ФА и разработать метод выделения ФА.

3. Охарактеризовать препарат ФА по физико-химическим и иммунохимическим свойствам.

4. Получить диагностические препараты для выявления ФА и антител к нему.

6. Оценить возможность использования ФА Y. pestis и антител к нему для диагностических целей.

Научная новизна исследования. Впервые идентифицирован фактор, обусловливающий АА клеток возбудителя чумы, и разработан метод его выделения. Впервые получена характеристика нового антигена чумного микроба по физико-химическим и иммунохимическим свойствам.

Теоретическая значимость. Выявлен и охарактеризован новый поверхностный антиген Y. pestis, обусловливающий способность клеток к АА, которая у патогенных бактерий связана с проявлением вирулентности. Дальнейшее изучение ФА будет способствовать выявлению его физиологической роли и механизмов его возможного участия в проявлении вирулентных свойств возбудителя чумы.

Значительное количество ФА на поверхности клеток Y. pestis и выработка антител к нему при иммунизации животных живыми и убитыми бактериями свидетельствуют о том, что исследование протективных свойств ФА может способствовать выявлению нового кандидата для включения в химическую противочумную вакцину.

Практическая значимость. Получен штамм-продуцент ФА {Y. pestis EV76 б/п), который не содержит автономных или интегрированных с хромосомой плазмидных репликонов. Штамм депонирован в

Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под названием Y. pestis КМ 1279 (положительное решение от 14.12.2007, протокол № 22). Этот штамм может быть использован не только для выделения ФА, но и для выделения других белков, кодируемых хромосомными генами.

Разработан простой метод выделения и очистки ФА с поверхности клеток Y. pestis EV76 б/п с целью получения препаративных количеств ФА. Полученный препарат может быть применен для оценки роли ФА в реализации патогенных и протективных свойств возбудителя чумы, а также для адсорбции неспецифических анти-ФА антител из иммунных сывороток.

В работе предложены способы повышения специфичности серологических реакций при диагностике инфекционных заболеваний. Одобрены Ученым Советом и утверждены директором ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (РостНИПЧИ) методические рекомендации «Способ устранения неспецифических серологических реакций с помощью перекрестно реагирующего антигена возбудителя чумы» (протокол № 4 от 27.06.2002). Предложенный метод может быть полезен при конструировании новых препаратов для серодиагностики различных инфекционных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Возбудитель чумы имеет на своей поверхности ранее неизвестный антиген - фактор аутоагглютинации (ФА), представляющий собой комплекс 17,5 кДа белка с низкомолекулярным компонентом.

2. ФА К pestis является перекрестно реагирующим антигеном: ФА-подобные антигены обнаружены у Yersinia pseudotuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris.

3. Антитела к ФА присутствуют в сыворотках крови млекопитающих: у здоровых людей и животных - в форме неполных антител, а у больных людей с клинической картиной инфекционного заболевания, а также у, животных, иммунизированных различными антигенами, выявляются и полные антитела.

Апробация работы. Материалы диссертации были неоднократно доложены на конференциях и заседаниях Ученого Совета в РостНИПЧИ, представлены на 7 Международном конгрессе по проблемам иерсиний в Нимегене (Нидерланды, 1998), на 9 Международном конгрессе по проблемам иерсиний в Лексингтоне (США, 2006), на научной конференции в Институте гигиены и медицинской микробиологии им. Макса фон Петтенкофера в Мюнхене (Германия, 2007), на VII межвузовской биохимической конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано в соавторстве 10 работ, из них 3 - в периодических изданиях из Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, 2 -в зарубежной печати.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Рыкова, Виолетта Александровна

ВЫВОДЫ

1. Аутоагглютинация Y pestis обусловлена присутствием на поверхности клеток ранее неизвестного гидрофобного компонента белковой природы, названного фактором аутоагглютинации (ФА).

2. Методом последовательной элиминации плазмид получен штамм-продуцент ФА (Г. pestis EV76 б/п), сохраняющий культурально-морфологические и биохимические свойства родительского штамма, но не синтезирующий кодируемые плазмидами антигены.

3. Разработана схема выделения ФА из штамма-продуцента, основанная на смыве ФА с поверхности клеток щелочным раствором, осаждении белка при 25 % насыщении сульфатом аммония и изоэлектрическом осаждении при рН 4,6. Получен лиофилизированный препарат ФА.

4. Изучены физико-химические свойства ФА, который представляет собой комплекс белка м. м. 17,5 кДа и низкомолекулярного компонента.

6. ФА является перекрестно реагирующим антигеном, обнаруженным не только у Y. pestis, но и у 7. pseudotuberculosis, К. pneumoniae, P. aeruginosa и P. vulgaris, которые синтезируют сходный, но не идентичный антиген.

8. Иммуноглобулиновые диагностические препараты, содержащие анти-ФА антитела, кроме специфических диагностических антигенов, выявляют и перекрестно реагирующие ФА-подобные антигены, которые инактивируются с помощью нормальной кроличьей сыворотки.

9. Анти-ФА антитела удаляются из иммунных сывороток путем адсорбции препаратом ФА или клетками Y. pestis EV76 б/п.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение поверхностных структур патогенных бактерий имеет важное значение как для выявления еще неизвестных факторов вирулентности, так и для идентификации антигенов, которые могут быть использованы при создании новых препаратов для диагностики и профилактики инфекционных заболеваний. В результате проведенного нами исследования идентифицирован ранее неизвестный поверхностный компонент, обусловливающий АА Y pestis. Известно, что у других патогенных бактерий АА вызывают гидрофобные или склонные к самоагрегации белки, которые принимают участие в адгезии бактерий к различным поверхностям, в образовании биопленок, а также участвуют в инвазии, являются мощными индукторами воспалительного ответа и играют важную роль в вирулентности (Van Houdt R., Michiels C.W., 2005; Ramboarina S., Fernandes P.J., Daniell S. et al., 2005; Klemm P., Vejborg R.M., Sherlock O, 2006). В связи с этим идентификация и характеристика фактора аутоагглютинации (ФА) возбудителя чумы представляла несомненный интерес.

Сравнительный анализ АА+ бактерий и АА" мутантов Cafl" штамма Y. pestis EV76 показал, что экспрессия этого признака коррелирует с такими свойствами бактерий, как повышенная поверхностная гидрофобность, чувствительность к чумному фагу Л-413с и активность в РПГА с чумным иммуноглобулиновым диагностикумом. АА" - мутанты, которые утрачивали все три свойства, отличались от родительского штамма отсутствием на поверхности клеток 17 кДа белкового компонента, названного нами фактором аутоагглютинации (ФА).

На модели бесплазмидного штамма Y. pestis EV76 б/п нами была разработана схема выделения ФА. Первым этапом выделения ФА из слабощелочного (10 мМ NaOH, рН 9,0) смыва с поверхности клеток было осаждение сульфатом аммония при 25 % насыщении. Такая концентрация соли была использована Е.Е. Baker et al. (1952) для очистки от примесных белков препарата капеульного антигена F1 Y. pestis, осаждающегося из раствора при

33 % насыщении солью. В результате высаливания при 25 % насыщении сульфатом аммония и трехкратного осаждения в изоэлектрической точке (pi 4,6), мы получили препарат, который по данным масс-спекторометрии и иммуноблоттинга с анти-ЛПС МКА не содержал примесей других белков и ЛПС.

Характеристика выделенного препарата по физико-химическим свойствам позволила установить, что ФА является комплексом белка м. м. 17,5 кДа с низкомолекулярным компонентом. Этот комплекс образует полимеры, устойчивые к нагреванию в присутствии 2-меркаптоэтанола и ДСН, поэтому при электрофорезе в ПААГ ФА выявляется в виде множественных полос. Это свойство, а также м. м., сближают ФА с обнаруженными на поверхности грамотрицательных бактерий белковыми комплексами, устойчивыми к нагреванию и действию детергентов и протеаз (Hammer N.D., Schmidt J.C., Chapman M.R., 2007). У Е. coli эти структуры, образованные субъединицами мажорного белка CsgA и минорного белка CsgB, м. м. около 15 кДа, получили название curli (Hammer N.D., Schmidt J.C., Chapman M.R., 2007), а у Salmonella spp - тонкие агрегативные фимбрии (Barnhart M.M., Chapman M.R., 2006). Эти белки участвуют в адгезии бактерий к различным поверхностям, а также обусловливают АА бактерий (Van Houdt R., Michiels C.W., 2005). Таким образом, физико-химическая характеристика ФА показала, что он является поверхностным белком Y. pestis, который имеет сходство с белками энтеробактерий, обеспечивающими признак АА.

Иммунохимическая характеристика ФА показала, что антитела к нему присутствуют в чумной гипериммунной лошадиной сыворотке, в которой доминируют антитела к Cafl. Сравнительный анализ ФА и Cafl выявил у них ряд общих свойств: оба антигена локализованы на поверхности клеток Y. pestis, имеют белковую природу, способны к самоагрегации и сходны по м. м. субъединицы (около 17 кДа). В отличие от Cafl, синтез которого определяется плазмидой рМТ и индуцируется при 37°С, ФА экспрессируется независимо от присутствия плазмид и температуры выращивания бактерий. Антигены также имеют различную иммунохимическую специфичность, что было показано в РДП с чумной гипериммунной лошадиной сывороткой и в иммуноблоте с анти-ФА кроличьей сывороткой.

Для изучения специфичности ФА-антигена для возбудителя чумы мы проанализировали 24 вида бактерий в РПГА с полученным нами иммуноглобулиновым анти-ФА диагностикумом. Имунохимически сходные с ФА Yersinia pestis антигены были выявлены у Yersinia pseudotuberculosis, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris. Однако ФА-подобные антигены гетерологичных бактерий отличались от ФА Y. pestis по гидрофобности и чувствительности к ряду факторов (кипячение, 4 % формалин, мертиолят натрия). Полученные результаты свидетельствовали о принадлежности ФА к ПРА, которые сходны по иммунохимической специфичности, но не идентичны по структуре. Несмотря на не очень большое количество выявленных нами бактерий, продуцирующих ФА, нельзя исключить, что расширение круга исследуемых организмов и поиск оптимальных условий экспрессии изучаемого антигена позволит выявить и другие виды микроорганизмов, экспрессирующие ФА-подобный антиген.

Существование ПРА у возбудителя чумы известно давно (Glosnicka R., Gruszkiewicz Е., 1980; Гонтарь И.П., Ефременко В.И., Фарбер С.М., 1980; Ходаковская В.Н., Мишанькин Б.Н., Некляев В.Н., Бичуль O.K., 1994; Таран О.И., Таран И.М., Скоморохин Ю.В. и др., 1998). Однако исследований по идентификации, выделению и характеристике этих антигенов не проводилось. Первый шаг в этом направлении был сделан JI.B. Коссе (1992), обнаружившей в препаратах F1 Y. pestis, помимо Cafl (м. м. 18 кДа), еще и неспецифические компоненты м. м. 43, 28 и 17 кДа, совпадающие с Cafl по иммунохимической активности. Подобные белки (м. м. 43 и 28 кДа) выделяются методом Baker из оболочки ряда грамотрицательных бактерий

Косее JI.B., 1992; Федорова В.А., Девдариани З.Л., 2002). По м. м. субъединицы (около 17 кДа), хромосомной природе детерминированности, независомой от температуры выращивания экспрессии, ФА Г. pestis имел наибольшее сходство с одним из компонентов F1, выявленных Л.В. Коссе (1992). Однако описанные авторами свойства этого 17 кДа белка (сходная с Cafl иммунохимическая специфичность, гидрофильные свойства и неспособность к агрегации) позволяют судить о том, что ФА не является этим белком.

Поскольку ФА-подобный антиген был обнаружен у бактерий {К. pneumoniae, P. vulgaris), присутствующих в организме здоровых людей и животных (Коршунов В.М., Володин Н.Н., Ефимов Б.А. и др., 1997), можно было ожидать, что антитела к нему могут присутствовать в любых сыворотках крови млекопитающих. И действительно, анализ нормальных и иммунных сывороток крови млекопитающих показал, что все они содержали антитела к ФА. Эти результаты согласуются с данными многих авторов, выявивших антитела к антигенам Y. pestis в нормальных сыворотках крови лабораторных животных и людей (Басова Н.Н., Кравцов Ф.Е., Наумович Л.С. и др., 1982; Белкин З.П., Егорова Т.Н., Нартикова В.Ф. и др., 1991; Некляев В.Н., Гамлешко Х.П., Рожков К.К., 1995; Li В., Jiang L., Song О. et al., 2005), однако, идентификации и изучения этих антигенов не проводилось. Анализ полученных нами данных позволил заключить, что наличие нормальных антител к ФА-подобным антигенам обусловлено иммунизацией макроорганизма представителями естественной микрофлоры. При этом было выявлено, что в нормальных сыворотках крови млекопитающих анти-ФА антитела присутствовали в форме неполных антител, и только у отдельных животных выявлялись полные антитела к ФА. Это могло свидетельствовать о том, что именно неполные анти-ФА антитела являются нормальными иммуноглобулинами млекопитающих. Известно, что неполные антитела образуются первыми при контакте организма с антигеном или при контакте с малой дозой антигена (Gaines S., Currie J.A., Tully J.G., 1965). Присутствие в организме здоровых млекопитающих ФА-экспреесирующих бактерий {К. pneumoniae, P. vulgaris) в небольшой (до 104 м. кл./г фекалий) дозе (Коршунов В.М., Володин Н.Н., Ефимов Б.А. и др., 1997) позволяет предположить, что в норме к их антигенам вырабатываются неполные антитела.

Все иммунные сыворотки содержали полные антитела к ФА. При этом титры антител в РНАг превышали титры антител в РПГА, что указывало на присутствие в иммунных сыворотках как полных, так и неполных антител к ФА. При этом полные анти-ФА антитела были выявлены и в сыворотках животных, иммунизированных бактериями, не экспрессирующими ФА-подобный антиген (например, F. tularensis, F. novicida, L. pneumophila). Эти данные позволяли предположить, что появление полных антител к ФА в иммунных сыворотках может быть обусловлено не только наличием ФА-подобных антигенов у бактерий, к которым получены сыворотки, но и являться ответом организма на иммунизацию. Известно, что при различных патологических состояниях (иммунизация, инфекция, снижение активности иммунной системы, гормональные дисфункции, эндогенное воспаление) непатогенные обитатели кожи и слизистых оболочек млекопитающих интенсивно размножаются (Лиходед В.Г., Каверина К.Г., Кочурко Л.И., Лобова Е.А., 1999; Авдеева М.Г., Шубич М.Г., 2003; Титов В.Н., 2004; Бойков С.С., Мороз А.Ф., Бабаева Е.Е., 2005). При этом увеличение их концентрации может вести к индукции синтеза антител к их поверхностным структурам, в том числе, к ФА-подобному антигену.

Выявленное нами присутствие полных анти-ФА антител в отдельных нормальных сыворотках животных могло быть связано с наличием у них на момент исследования какого-либо патологического процесса. В пользу этого свидетельствовали результаты четырехкратного анализа с интервалом 2-6 месяцев сыворотки одного и того же барана, у которого только один раз были обнаружены полные антитела к ФА. Полученные результаты позволяли предположить, что количество и качество анти-ФА антител может изменяться при различных состояниях организма. Это предположение подтверждалось при исследовании сывороток крови людей: у здоровых людей выявлялись только неполные анти-ФА антитела, а у больных с клинической картиной инфекционной или онкологической патологии выявлялись полные антитела к ФА в высоких титрах. Для ответа на вопрос, являются ли эти антитела показателем иммунного, инфекционного или любого воспалительного процесса в организме, необходимы дальнейшие исследования. Изучение динамики появления этих антител представляется перспективным для поиска новых маркеров воспаления, которые, наряду с такими общепринятыми маркерами как С-реактивный белок и прокальцитонин (Castelli G.P., Pognani С., Meisner М. et al., 2004; Слободина Е.В., Румянцев В.А., Суворов К.В., 2009), могут быть полезны при диагностике инфекционных заболеваний. Выяснение этого вопроса, на наш взгляд, представляет несомненный интерес.

Наличие анти-ФА антител в иммунных сыворотках предполагало возможность их присутствия и в диагностических препаратах, полученных на основе этих сывороток без дополнительной очистки от неспецифических антител. И действительно, исследование различных иммуноглобулиновых диагностикумов выявило присутсвие в них анти-ФА антител. Тест-системы, содержащие примеси анти-ФА антител, могут выявлять и ФА-подобные антигены бактерий, присутствующих в окружающей среде {P. aeruginosa, Р. vulgaris) и в организме млекопитающих (К. pneumoniae, P. vulgaris), что может обусловливать ложноположительные реакции при серологических исследованиях. В наших экспериментах предварительная обработка бактериальных образцов формалином или кипячением приводила к устранению иммунохимической активности ФА-подобных антигенов К. pneumoniae, P. aeruginosa, P. vulgaris. Такая обработка регламентирована (Самойлова JI.B., Донская Т.Н., Вейнблат В.И., 1998) для серодиагностики возбудителей особо опасных (7. pestis, F. tularensis, V. cholerae), но не других инфекций. Наши исследования показали, что устранить реакции, вызванные

ФА-подобными антигенами, можно было при помощи предварительной часовой инкубации бактериальных образцов в 1 % кроличьей анти-ФА сыворотке или 10 % НКС. В течение многих лет 1 % НКС используется в качестве разводящей жидкости при постановке РПГА и РАО. По данным В. Н. Ходаковской и Б. Н. Мишанькина (2002), повышение концентрации НКС при постановке серологических реакций способствовало по неизвестным причинам повышению специфичности реакций. Полученные нами данные позволяют судить о возможных механизмах этого феномена: неполные анти-ФА антитела, присутствующие в НКС, могут блокировать детерминанты неспецифических ФА-подобных антигенов в анализируемых пробах.

Анти-ФА антитела из иммунных сывороток можно было удалить путем их адсорбции препаратом ФА или клетками Y. pestis EY76 б/п. Так, анализ пяти иммунных (к F1 Y. pestis, к Y. pseudotuberculosis, к F. tularensis, к F. novicida, к L. pneumophila) и двух гипериммунных (к Y. pestis и к F. tularensis) сывороток показал, что в результате адсорбции из них удалялись анти-ФА антитела, а специфические антитела, выявляемые гомологичными антигенными диагностикумами, сохранялись в неизменном титре.

Адсорбция из иммунных сывороток перекрестно реагирующих антител культурами гетерологичных бактерий в течение многих лет используется для повышения специфичности препаратов для диагностики особо опасных инфекций. Так, для получения туляремийного антительного диагностикума сыворотки адсорбировали убитыми культурами P. pseudomallei, P. mallei, В. abortus bovis (Пекшев А.В., Елагин Г. Д., Пятков В. А., 1998). Диагностическую сыворотку V. cholerae с/в Инаба очищали от неспецифических антител клетками V. cholerae с/в Огава (Аленкина Т.В., Данилина И.В., 2002). Для приготовления антительного чумного диагностикума иммунную сыворотку адсорбировали клетками Y. pseudotubercidosis (Рябушко Е.А., Кузьмин Ю.А., Югай М.М., Айтабаева Ж.Т., 1994). Способ удаления неспецифических антител из иммуноглобулиновых препаратов адсорбцией не потерял своей практической ценности, несмотря на то, что разработаны методы получения моноспецифических сывороток иммуносорбцией на колонках с очищенным антигеном. Из-за высокой стоимости и трудоемкости эти методы редко используются при получении диагностических препаратов в промышленном масштабе. Предложенный нами способ повышения специфичности иммунных сывороток с помощью адсорбции анти-ФА антител препаратом ФА или клетками Y. pestis EV76 б/п может быть использован на стадии получения диагностических антительных препаратов. Использование абсолютно непатогенного штамма Y. pestis EV76 б/п, который стабильно, в отличие от выявленных нами условно-патогенных бактерий, экспрессирует большие количества ФА, делает процедуру адсорбции простой и безопасной.

Таким образом, проведенное исследование позволило идентифицировать, выделить и охарактеризовать новый поверхностный антиген Y. pestis - ФА, обусловливающий феномен АА, которая у патогенных бактерий коррелирует с вирулентностью. Анализ этого антигена показал, что он не является специфичным для возбудителя чумы и не может быть использован для создания новых чумных диагностических препаратов. Однако ФА и полученный в работе его штамм-продуцент могут быть применены для адсорбции анти-ФА антител из иммунных сывороток с целью создания более специфичных иммуноглобулиновых диагностических препаратов. Разработка метода выделения и получение препаративных количеств ФА могут стать основой для изучения его возможной физиологической роли и участия в патогенезе чумы. Иммуногенные свойства ФА и его присутствие на поверхности клеток возбудителя чумы в значительных количествах представляют несомненный интерес для дальнейшего изучения протективных свойств этого антигена с целью выявления возможного кандидата для включения в химическую противочумную вакцину

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыкова, Виолетта Александровна, Ростов-на-Дону

1. Авдеева, М.Г. Патогенетические механизмы инициации синдрома системного воспалительного ответа (обзор литературы) / М.Г. Авдеева, М.Г. Шубич // Клин. лаб. диагн. 2003. -№ 6. - С. 3-10.

2. Акиев, А.К. О механизме блокообразования у чумных блох / А.К. Акиев // Природно-очаговые инфекции и их профилактика. Саратов, 1991. — С. 118-122.

3. Анисимов, А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 / А.П. Анисимов // Мол. генет., микробиол. и вирусол. -2002.-№3.-С. 3-23.

4. Антонова, О. А. Выявление, изучение структуры и иммунобиологических свойств S-слоя чумного микроба: автореф. дис.канд. биол. наук / Антонова Оксана Александровна. Саратов, 1999. - 20 с.

5. Бахрах, Е.Э. Соматические полисахаридсодержащие антигены чумного микроба / Е.Э. Бахрах, В.И. Вейнблат // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1972. - № 3. - С. 12-16.

6. Бахтеева, И.В. Исследование функциональной активности рН6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов : автореф. дис. .канд. мед. наук / Бахтеева Ирина Викторовна. Москва, 2008. - 24 с.

7. Белкин, З.П. Иммуногенные свойства белка эндотоксина: сывороточные антитела у животных и человека / З.П. Белкин, Т.Н. Егорова, В.Ф. Нартикова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991. - № 7. - С. 73-76.

8. Божко, Н.В. Первичная характеристика свойств и диагностической ценности антигенного комплекса «фракция V» чумного микроба // Н.В. Божко, С.А. Лебедева, O.K. Бичуль и др. // Клин. лаб. диагн. -2005.-№6.-С. 45-49.

9. Бочко, Г.М. Перекрестно реагирующие антигены микроорганизмов и их значение в инфекционном иммунитете / Г.М. Бочко // Иммунол. и иммунопроф. чумы и холеры: тез докл. Всесоюзн. конф. -Саратов, 1980. С. 26-27.

10. Брюханова, Г.Д. Аггрегированность чумного микроба / Г.Д. Брюханова, А.К. Акиев, А.П. Бейер // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. -1995.-№4.-С. 3-9.

11. Бухарин, О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика / О.В. Бухарин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -2000. № 4. - С. 4-7.

12. Ванюшин, К.Е. Секретируемые белоксодержащие антигены Klebsiella pneumoniae в системе адаптивного иммунитета / К.Е. Ванюшин, А.В. Тришин, Ф.В. Доненко и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - № 1. - С. 51-56.

13. Васюхина, Л.В. О возможности использования некоторых неспецифических реакций для определения формы существования чумного и псевдотуберкулезного микробов / Л.В. Васюхина // Извест. Иркут. ПЧИ Сибири и Дальн. Вост. 1954. - Т. 12. - С. 23-30.

14. Видяева, Н.А. Перекрестно реагирующие антигены возбудителя чумы и человека / Н.А. Видяева, В.В. Кутырев, Л.Н. Шанина, О.А. Проценко // Генет. и биохим. вирул. возб. особо опас. инф.: матер. Росс. науч. конф. -Волгоград, 1992.-С. 80.

15. Вейнблат, В.И. Конструирование суспензионного диагностикума для изучения эндотоксина возбудителя чумы и гомологичных антител // В.И. Вейнблат, С.М. Дальвадянц, П.И. Меньшов // Лаб. дело. 1983. - № 8. - С. 43-45.

16. Водопьянов, С.О. Пили адгезии у Yersinia pestis / С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1985. - № 6. - С. 13-17.

17. Водопьянов, С.О. Изучение протективной активности пил ей адгезии Yersinia pestis / С.О. Водопьянов, А.А. Рыбянец, Л.М. Веркина и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. - № 5. — С. 26-30.

18. Волох, О.А. Свойства клеточной поверхности чумного микроба, определяемые S-слоем / О.А. Волох, И.А. Дятлов // Пробл. особо опас. инф. — 2003. Вып. 85. - С. 55-62.

19. Герасюк, Л.Г. Сенсибилизация эритроцитов токсином и анатоксином чумного микроба / Л.Г. Герасюк, Х.П. Гамлешко, А.А. Канчух // Пробл. особо опас. инф. 1970. - № 3. - С. 187-189.

20. Гонтарь, И.П. Антигенная общность возбудителей чумы, холеры, псевдотуберкулеза, туляремии, бруцеллеза, сапа, мелиоидоза / И.П. Гонтарь,

21. B.И. Ефременко, С.М. Фарбер // Иммунол. и иммунопроф. чумы и холеры: тез. докл. Всесоюзн. конф. Саратов, 1980. - С. 27-28.

22. Дальвадянц, С.М. Иммуногенные и аллергенные свойства соматического антигена чумного микроба, изолированного по методу Буавена / С.М. Дальвадянц // Пробл. особо опас. инф. 1968. - № 2. - С. 139142.

23. Дидик, Г.М. Антигенное сходство микроорганизмов с группоспецифическими факторами крови человека и иммунный ответ у лиц с разной АВО-принадлежностью / Г.М. Дидик, Е.А. Федоровская, И.А.

24. Балахнина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1986. - № 9. — С. 57-60.

25. Дмитровский, A.M. Токсический компонент патогенеза чумного инфекционного процесса / A.M. Дмитровский // Матер, межгос. науч. конф. «Профилакт. и меры борьбы с чумой», посвящ. 100-лет. откр. возб. чумы. — Алматы, 1994. С. 15-17.

26. Домарадский, И.В. Перекрестный иммунитет: состояние, проблемы, перспективы / И.В. Домарадский // Иммунология. 1993. - № 3. -С. 6-9.

27. Дятлов, И.А. Выявление и характеристика антигена Yersinia pestis, проявляющего свойства белков S-слоя / И.А. Дятлов, О.А. Антонова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 4. - С. 90-91.

28. Дятлов, И.А. Получение S-слоя чумного микроба и возможности его применения / И.А. Дятлов, О.А. Волох // Биотехнология. 2004. - № 1. -С. 20-25.

29. Жуков-Вережников, Н.Н. Гетерогенные антигены чумного и холерного микроба, сходные с антигенами тканей человека и животных / Н.Н. Жуков-Вережников, А.К. Адамов, П.И. Анисимов и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 1972. - № 4. - С. 63-65.

30. Жуков-Вережников, Н.Н. О гетерогенных антигенах возбудителей особо опасных инфекций и тканей кишечника человека / Н.Н. Жуков-Вережников, П.И. Анисимов, Н.И. Рыбаков и др. // Бюл. экспер. биол. и мед. 1974. - № 10.-С. 67-69.

31. Зайцев, А. А. Теоретическое и научно-методическое использование белковых фракций чумного микроба при создании новых диагностических препаратов и тест-систем : автореф. дис.докт. мед. наук / Зайцев Александр Алексеевич. Ставрополь, 2006. - 39 с.

32. Иванова, И.А. Применение детергентов для устранения неспецифи-ческого реагирования моноклональных антител / И.А Иванова,

33. А.О.Монаенков, В.Г. Пешкова, Н.А. Медведева // Клин. лаб. диагн. 2004. -№ 1. - С. 36-39.

34. Ильина, Т.С. Системы коммуникаций у бактерий и их роль в патогенности // Т.С. Ильина, Ю.М. Романова, A.JL Гинцбург // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2006. - № 3. - С. 22-29.

35. Канатов, Ю.В. Использование моноклональных антител для производства чумного антительного эритроцитарного диагностикума / Ю.В. Канатов, М.И. Леви, М.Ф. Шмутер и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1985. - № 8 (2). - С. 73-78.

36. Каральник, Б.В. Эритроцитарные диагностикумы / Б.В. Каральник. М.: Мед., 1976. - 164 с.

37. Книрель, Ю.А. Структура липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А. II. Структура области кора / Ю.А. Книрель., Н.К. Кочетков // Биохимия. 1993. - Т. 58, № 2. - С. 166-201.

38. Книрель, Ю.А Структура липополисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов / Ю.А. Книрель, Н.К. Кочетков // Биохимия. 1994. - Т. 59, № 12. - С. 1784-1851.

39. Коршунов, В.М. Нормальная микрофлора кишечника / В.М. Коршунов, Н.Н. Володин, Б.А. Ефимов и др. // Диагностика, профилактика и лечение дисбактериозов кишечника: пособие для врачей и студентов. М.: МЗ РФ., 1997.-40 с.

40. Косее, Л.В. Характеристика препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из генетически различающихся штаммов-продуцентов : автореф. дис.канд. биол. наук / Косее Людмила Владимировна. Саратов, 1992. - 18 с.

41. Куклева Л.М. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза / Л.М. Куклева, О.А. Проценко, В.В. Кутырев // Мол. генет., микробиол. и вирусол. — 2002. № 1. - С. 3-7.

42. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: практическое руководство / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. М.: Мед., Шико, 2009. - 471 с.

43. Леви, М.И. Реакция пассивной гемагглютинации и реакция нейтрализации антител при некоторых инфекциях / М.И. Леви, Н.Н. Басова, Ю.Г. Сучков и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1962. -№ 10.-С. 40-45.

44. Лиходед, В.Г. Микробиологическая характеристика дисбактериозов кишечника у детей и взрослых в г. Москве / В.Г. Лиходед, К.Г. Каверина, Л.И. Кочурко, Е.А. Лобова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 4. - С. 65-67.

45. Лобашевский, А.Л. Гидрофобность грамотрицательных бактерий, выделенных у больных с воспалительными и гнойно-деструктивными заболеваниями легких / А.Л. Лобашевский // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. - № 9-10. - С. 24-26.

46. Макаренко, Т.А. Иммунологическое изучение белков клеточной стенки Pseudomonas aeruginosa / Т.А. Макаренко, Е.С. Станиславский // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - № 2. - С. 7-9.

47. Мартынов, Ю.В. Перекрестно реагирующие внутривидовые антигены Neisseria meningitidis. Сообщение И. Динамика противоменингококковых антител к перекрестно реагирующим антигенам при различных формах менингококковой инфекции / Ю.В. Мартынов, A.M.

48. Грачева, И.М. Самсонова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1984. - № 11 (2). - С. 60-65.

49. Мареев В.И. Морфологические особенности течения чумы у грызунов, обусловленные естественной и приобретенной резистентностью к этой инфекции : автореф. дис.канд. мед. наук / Мереев Виктор Иванович. — Саратов, 1982 24 с.

50. Марцишаускас, Р.П. Определение белка по методу Лоури в разных модификациях / Р.П. Марцишаускас, Л.Э. Тарасявиченс, С.И. Канопкайте // Методы в биохимии: матер, ко II съезду биохимиков Лит. СССР. Вильнюс, 1975. - С. 5-12.

51. Мишанькин, М.Б. Структурно-функциональная характеристика «мышиного» токсина чумного микроба : автореф. дис.канд. мед. наук / Мишанькин Михаил Борисович. Ростов-на-Дону, 1997. - 20 с.

52. Мотовкина, Н.С. Гетерогенные антигены Yersinia pseudotuberculosis в эритроцитах и органах человека / Н.С. Мотовкина, В.Б. Туркутюков, В.П. Малый // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1983.-№6.-С. 39-42.

53. Негина, Ю.П. Сравнительное изучение аутоантителообразования при иммунизации различными видами брюшнотифозных вакцин / Ю.П. Негина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1980. - № 5. - С. 6972.

54. Некляев, В.Н. Изучение гетерогенных антигенов чумного микроба штамма ЕВ : автореф. дис.канд. мед. наук / Некляев Владимир Николаевич. Саратов, 1984. - 18 с.

55. Некляев, В.Н. Сравнительное изучение методом иммуноблоттинга серологического ответа у белых мышей и морских свинок, привитых против чумы / В.Н. Некляев, Х.П. Гамлешко, К.К. Рожков // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. - № 6. - С. 75-76.

56. Оноприенко, Н.Н. Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Francisella : автореф. дис.канд. биол. наук / Оноприенко Наталья Николаевна. Саратов, 2001. - 22 с.

57. Пивень, Н.Н. Перекрестно-реагирующие антигены патогенных буркхолдерий и некоторых опасных возбудителей инфекционных болезней / Н.Н. Пивень, В.И. Илюхин, В.Б. Тимошин и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - № 2. - С. 14-19.

58. Подладчикова, О.Н. Характеристика признака аутоагглютинации у различных штаммов возбудителя чумы / О.Н. Подладчикова, В.А. Рыкова, B.C. Иванова, С.А. Лебедева // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 2006. - № 2 (92).-С. 48-51.

59. Подоплелов, И.И. Иммунобиологическое изучение роли гетерогенных антигенов уропатогенных штаммов E.coli / И.И. Подоплелов, А.С. Самойленко, Н.И. Щипкова и др. // Бюлл. экспер. биологии и медицины. -1981.-№6.-С. 708-709.

60. Портнягина, О.Ю. Бактериальные порины как перспективные антигены для диагностики и вакцинопрофилактики инфекционных заболеваний / О.Ю. Портнягина, О.Д. Новикова, О.П. Вострикова и др. // Вестник ДВО РАН. 2004. - № 3. - С. 35-44.

61. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М,: Мир, 2000.-581 с.

62. Самойлова, Л.В. Чума / Л.В. Самойлова, Т.Н. Донская, В.И. Вейнблат и др. // Лаб. диагн. возб. опас. инф. бол. Саратов, 1998. —Т. 1. - С. 3-49.

63. Сварваль, А.В. Липополисахарид иерсиний и его биологическая активность / А.В. Сварваль, Г.Я. Ценева, О.А. Шендерович // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - № 8. - С. 100-104.

64. Сидорова, Е.В. Антигензависимые неспецифические иммунглобулины. Природа и возможные механизмы образования / Е.В. Сидорова// Успехи совр. биол. 1993. - Т. 113, № 6. - С. 675-701.

65. Соколов, П.Н. К вопросу об использовании серодиагностики клещей при эпизоотологическом обследовании на чуму / П.Н. Соколов, Г.Г. Свиридов, В.М. Степанов и др. // Организ. эпиднадзора при чуме и меры ее профилакт.- Алма-Ата, 1992. Т. 2. - С. 272-273.

66. Соколова, Е.П. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба : автореф. дис.канд. биол. наук / Соколова Елена Павловна. Ростов-на-Дону, 2002. - 18 с.

67. Тараненко, Т.М. Современные представления о структуре О-соматического антигена чумного микроба / Т.М. Тараненко, В.И. Вейнблат // Иммунохим. и лаб. диагн. особо опас. инф. 1985. - С. 10-16.

68. Тараненко, Т.М. Особенности структуры и функции основного соматического антигена чумного микроба / Т.М. Тараненко, С.М. Дальвадянц, М.Н. Киреев и др. // Пробл. особо опас. инф. 2005. - Вып. 1 (89).-С. 51-54.

69. Тимченко, Н.Ф. Протективные свойства порина из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis / Н.Ф. Тимченко, О.Д. Новикова, Т.Н. Павлова и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. - № 11. - С. 48-50.

70. Титов, В.Н. Экзогенные и эндогенные патологические факторы (патогены) как причина воспаления / В.Н. Титов // Клин. лаб. диагн. 2004. -№5.-С. 3-10.

71. Тынянова, В.И. Токсичность препаратов липополисахаридов из культуры Y.pestis EV76, выращенной при 28° и 37° // В.И. Тынянова, В.П. Зюзина, Г.В. Демидова и др. // Биотехнология. — 2003. № 6. - С. 10-17.

72. Федорова, В.А. Иммунохимическая характеристика фракции 1 штаммов Yersinia pestis, дефектных по гену CaflM / В.А. Федорова, 3.JI. Девдариани // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002. - № 1. - С. 11-17.

73. Ходаковская, В.Н. Перекрестно реагирующие антигены чумного микроба и представителей микрофлоры носоглотки человека / В.Н. Ходаковская, Б.Н. Мишанькин, В.Н. Некляев, O.K. Бичуль // Акт. вопр. проф. чумы и др. инф. забол. Ставрополь, 1994. - С. 99-100.

74. Черепанов, П.А. рН6 антиген как один из основных факторов вирулентности чумного микроба и его протективные свойства / П.А.

75. Черепанов, Г.А. Каримова, Т.Г. Михайлова и др. // Акт. вопр. профилакт. опас. инф. забол.: тез. докл. Межвед. науч. конф. Киров, 1991. - С. 207-208.

76. Щербаков, А.А. Диагностикум эритроцитарный антигенный на основе мембранных белков чумного микроба / А.А. Щербаков, П.И. Анисимов, Ю.И. Кондрашин, Т.Н. Солодовникова // Генет. и микробиол. природноочаг. инф. Саратов, 1984. - С. 22-27.

77. Achtman, M. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently ' emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis / M. Achtman, K. Zurth, G. Morelli et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 14043-14048.

78. Aliprantis, A.O. Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2 / A.O. Aliprantis, R.B. Yang, M.R. Mark et al. // Science. 1999. - Vol. 285. - P. 736-739.

79. Anderson, G.G. Intracellular bacterial biofilm-like pods in urinary tract infections / G.G. Anderson, J.J. Palermo, J.D. Schilling et al. // Science. 2003. -Vol. 301.-P. 105-107.

80. Anisimov, A.P. The subcutaneous inoculation of pH6 antigen mutants of Yersinia pestis does not affect virulence and immune response in mice / A.P.

81. Anisimov, I.V. Bakhteeva, E.A. Panfertsev et al. // J. Med. Microbiol. 2009. -Vol. 58. - P. 26-36.

82. Argenio, D.A.D. Autolysis and autoaggregation in Pseudomonas aeruginosa colony morphology mutants / D.A.D. Argenio, M.W. Calfee, P.B. Rainey, E.C. Pesci // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, № 23. - P. 6481-6489.

83. Baker, E.E. Studies on immunization against plague. 1. The isolation and characterization of the soluble antigen of Pasteurella pestis / E.E. Baker, H. Sommer, L.E. Foster et al. // J. Immunol. 1952. -Vol. 68, № 2. - P. 131-145.

84. Barnhart, M.M. Curli biogenesis and function / M.M. Barnhart, M.R. Chapman // Ann. Rev. Microbiol. 2006. - Vol. 60. - P. 131-147.

85. Barua, S. Involvement of surface polysaccharides in organic acid resistance of Shiga toxin-producing Escherichia coli 0157:H7 / S. Barua, T. Yamashino, T. Hasegawa et al. // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 43. - P. 629-640.

86. Beher, M.G. Major heat-modifiable outer membrane protein in gram-negative bacteria: comparison with the OmpA protein of Escherichia coli / M.G. Beher, C.A. Schnaitman, A.P. Pugsley // J. Bacteriol. 1980. - Vol. 143, № 8. - P. 906-913.

87. Bishop, R.E. The bacterial lipocalins / R.E. Bishop // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1482, № 1-2. - P. 73-83.

88. Blocker, A. Type III secretion systems and bacterial flagellar insights into their function from structural similarities / A. Blocker, K. Komoriya, S. Aizawa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100. - P. 3027-3030.

89. Bohin, J.-P. Osmoregulated periplasmic glucans in Proteobacteria / J.-P. Bohin//FEMS Microbiol. Lett. 2000. - Vol. 186.-P. 11-19.

90. Bouveret, E. In vitro characterization of peptidoglycan-associated lipoprotein (PAL)-peptidoglycan and PAL-TolB interactions / E. Bouveret, H. Benedett, A. Rigal et al. // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, № 20. - P. 6306-6311.

91. Brade, H. Common lipopolysaccharide specificity: a new type of antigen in LPS of gram-negative bacteria / H. Brade, C. Galanos, E.T. Rietschel, L. Brade // Immunobiol. 1983. - Vol. 165, № 3-4. - P. 245-249.

92. Brubaker, R.R. Interleukin-10 and inhibition of innate immunity to Yersiniae: roles of Yops and LcrV (V antigen) / R.R. Brubaker // Infect. Immun. -2003. Vol. 71. - P. 3673-3681.

93. Campanacci, V. The crystal structure of the Escherichia coli lipocalin Blc suggests a possible role in phospholipid binding / V. Campanaccia, D. Nurizzob, S. Spinellia et al. // FEBS Lett. 2004. - Vol. 562. - P. 183-188.

94. Campanacci, V. The membrane bound bacterial lipocalin Blc is a functional dimer with binding preference for lysophospholipids / V. Campanacci, R.E. Bishop, S. Blangy et al. // FEBS Lett. 2006. - Vol. 580, № 20. - P. 48774883.

95. Cascales, E. Pal lipoprotein of Escherichia coli plays a major role in outer membrane integrity / E. Cascales, A. Bernadac, M. Gavioli et al. // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184, № 3. - P. 754-759.

96. Cascales, E. The type VI secretion toolkit / E. Cascales // EMBO Rep. 2008. - Vol. 9. - P. 735-741.

97. Castelli, G.P. Procalcitonin and C-reactive protein during systemic inflammatory response syndrome, sepsis and organ dysfunction / G.P. Castelli, C. Pognani, M. Meisner et al. // Critical care. 2004. - Vol. 8, № 4. - P. 234-242.

98. Chakraborty, R. Molecular mechanism of ferricsiderophore passage through the outer membrane receptor proteins of Escherichia coli / R. Chakraborty, E. Storey, D. van der Helm // Biometals. 2007. - Vol. 20. - P. 263-274.

99. Chain, P.S.G. Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole-genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis / P.S.G. Chain, E. Carniel, F.W. Larimer et al. /PNAS. -2004. Vol. 101, № 38. -P. 13826-13831.

100. Charbonneau M.-E. Functional organization of the autotransporter adhesin involved in diffuse adherence / M.-E. Charbonneau, M. Mourez // J. Bacteriol. 2007. - Vol. 189, № 24. - P. 9020-9029.

101. Cherepanov, P.A. Cloning and detailed mapping of the fra-ymt region of the Yersinia pestis pFra plasmid / P.A. Cherepanov, T.G. Mikhailova, G.A. Karimova et al. //Mol. Gen. Microbiol. Virusol. 1991. - Vol. 12. - P. 19-26.

102. Chiang, S.L. Single amino acid substitutions in the N-terminus of Vibrio cholerae TcpA affect colonization, autoagglutination, and serum resistance / S.L. Chiang, R.K. Taylor, M. Koomey, J.J. Mekalanos // Mol. Microbiol. 1995. -Vol. 17.-P. 1133-1142.

103. Chimento, D.P. Comparative structural analysis of TonB-dependent outer membrane transporters: implications for the transport cycle / D.P. Chimento, R.J. Kadner, M.C. Wiener // Proteins. 2005. - Vol. 59. - P. 240-251.

104. Claus, H. Molecular organization of selected prokaryotic S-layer proteins / H. Claus, E. Ак?а, Т. Debaerdemaeker et al. // Can. J. Microbiol. 2005. - Vol.51,№9.-P. 731-743/

105. Clavel, T. TolB protein of E. coli K-12 interacts with the outer membrane peptidoglycan-associated proteins Pal, Lpp and OmpA / T. Clavel, P. Germon, A. Vianney et al. //Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 359-367.

106. Collyn, F. Yersinia pseudotuberculosis harbors a type IV pilus gene cluster that contributes to pathogenicity / F. Collyn, M.-A. Lety, S. Nair et al. // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, № 11. - P. 6196-6205.

107. Cornelis, G.R. The virulence plasmid of Yersinia, an antihostgenome / G.R. Cornelis, A. Boland, A.P. Boyd et al. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. -Vol. 62.-P. 1315-1352.

108. Cornelis, G.R. Assembly and function of type III secretory systems / G.R. Cornelis, F. Van Gijsegem // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P. 735-774.

109. Cowan, C. Invasion of epithelial cells by Yersinia pestis'. evidence of a Y. ^ayfrj-specific invasion / C. Cowan, H.A. Jones, I.H. Kaya et al. // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 4523- 4530.

110. Daniel, A. Interaction and localization studies of enteropathogenic Escherichia coli type IV bundle-forming pilus outer membrane components / A. Daniel, A. Singh, L.J. Crowther et al. // Microbiol. 2006. - Vol. 152. - P. 24052420.

111. Desvaux, M. The autotransporter secretion system / M. Desvaux, N.J. Parham, I.R. Henderson // Res. Microbiol. 2004. - Vol. 155. - P. 53-60.

112. Donlan, R.M. Biofilms: microbial life on surfaces / R.M. Donlan // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8, № 9. - P. 881-890.

113. Drozdov, I.G. Virulent non-capsulate Yersinia pestis variants constructed by insertion mutagenesis / I.G. Drozdov, A.P. Anisimov, S.V. Samoilova et al. // J. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 42, № 4. - P. 264-268.

114. Du, Y. Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis / Y. Du, R. Rosqvist, A. Forsberg // Infect. Immun. 2002. — Vol. 70. - P. 1453-1460.

115. Dubois, M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances / M. Dubois, K.A. Gilles, J.K Hamilton et al. // Anal. Chem. -1956.-Vol. 28.-P. 350-356.

116. Dunne, W.M.Jr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? / W.MJr. Dunne // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15, № 2. - P. 155-166.

117. Ebaid, H. Antibodies against Citrobacter braakii 037 cells recognize the N-glycan of the band 3 glycoprotein of human erythrocyte membrane / H. Ebaid, M. Duk, A. Gamian // FEMS Immun. Med. Microbiol. 2008. - Vol. 52, №3.-P. 352-361.

118. Engelhardt, H. Are S-layers exoskeletons? The basic function of protein surface layers revisited / H. Engelhardt // J. Struct. Biol. 2007. - Vol. 160, №2.-P. 115-124.

119. Fadl, A.A. Murein lipoprotein is a critical outer membrane component involved in Salmonella enterica serovar Typhimurium systemic infection / A.A. Fadl, J. Sha, G.R. Klimpel et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 1081-1096.

120. Feodorova, V.A. Antigenic and phenotipic modifications of Yersinia pestis under calcium and glucose concentrations simulating the mammalian blood stream environment / V.A. Feodorova, A.B. Golova // J. Med. Microbiol. 2005. — Vol. 54.-P. 435-441.

121. Fexby, S. Biological trojan horse: antigen 43 provides specific bacterial uptake and survival in human neutrophils / S. Fexby, T. Bjarnsholt, P. O. Jensen et al. // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75, № 1. - P. 30-34.

122. Fields, K.A. Virulence role of V antigen of Yersinia pestis at the bacterial surface / K.A. Fields, M.L. Nilles, C. Cowan, S.C. Straley // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 5395-5408.

123. Gaines, S. Factors affecting formation of incomplete Vi antibody in mice / S. Gaines, J.A. Currie, J.G. Tully // J. Bacteriol. 1965. - Vol. 90, № 3. - P. 635-642.

124. Galvan, E.M. Capsular antigen Fraction 1 and Pla modulate the susceptibility of Yersinia pestis to pulmonary antimicrobial peptides such ascathelicidin / E.M. Galvan, M.A. Lasaro, D.M. Schifferli //Infect. Immun.- 2008. -Vol. 76, №. 4. P. 1456-1464.

125. Garcia, E. Molecular characterization of KatY (antigen 5), a thermoregu-lated chromosomally encoded catalase-peroxidase of Yersinia pestis / E. Garcia, Y.A. Nedialkov, J. Elliott et al. //J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181, № 10. -P. 3114-3122.

126. Gettner, S. Cross-agglutination reaction in Candida albicans and enteric bacilli / S. Gettner, H.R. Rezai // Appl. Microbiol. 1970. - Vol. 19, № 1. p.44-46.

127. Glosnicka, R. Chemical composition and biological activity of the Y.pestis anvelope substance / R. Glosnicka, E. Gruszkiewicz // Infect. Immun. -1980. Vol. 30, № 2. - P. 506-512.

128. Gomes-Solecki, M.J. LcrV capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Yersinia pestis from human samples / M.J. Gomes-Solecki, A.G. Savitt, R. Rowehl et al. // Clin. Diagn. Lab. Immun. 2005. - Vol. 12, № 2. -P. 339-346.

129. Hammer, N.D. The curli nucleator protein, CsgB, contains an amyloidogenic domain that directs CsgA polymerization / N.D. Hammer, J.C. Schmidt, M.R. Chapman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - Vol. 104, № 30. -P. 12494-12499.

130. Han, Y. Physiological and regulatory characterization of KatA and KatY in Yersinia pestis / Y. Han, J. Geng, Y. Qiu et al. // DNA Cell Biol. 2008. -Vol. 27, № 8. - P. 453-462.

131. Hare, J.M. High-freguency RecA-dependent and independent mechanisms of Congo red binding mutations in Yersinia pestis / J.M. Hare, K.M. McDonough // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 4896-4904.

132. Hinnebusch, J. Murine toxin of Yersinia pestis shows phospholipase D activity but is not required for virulence in mice / J. Hinnebusch, P. Cherepanov, Y. Du et al. // Int. J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 290. - P. 483-487.

133. Huang, X-Z. The pH6 antigen is an antiphagocytic factor produced by Yersinia pestis independent of Yersinia outer proteins and capsule antigen / X-Z. Huang, L.E. Lindler // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72, № 12. - P. 7212-7219.

134. Kado, C.I. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids / C.I. Kado, S.T. Liu // J. Bacteriol. 1981. - Vol. 145, № 3. - P. 1365-1373.

135. Kajimura, J. Assembly of cyclic enterobacterial common antigen in Escherichia coli K-12 / J. Kajimura, A. Rahman, P.D. Rick // J. Bacteriol. 2005. -Vol. 187.-P. 6917-6927.

136. Kajimura, J. O-acetylation of the enterobacterial common antigen polysaccharide is catalyzed by the product of the yiaH gene of Escherichia coli K-12 / J. Kajimura, A. Rahman, J. Hsu et al. // J. Bacteriol. 2006. - Vol. 188, № 21.-P. 7542-7550.

137. Kawahara, K. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature / K. Kawahara, H. Tsukano, H. Watanabe et al. // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70, № 8. - P. 40924098.

138. Keasey, S.L. Extensive antibody cross-reactivity among infectious gram-negative bacteria revealed by proteome microarray analysis / S.L. Keasey, K.E. Schmid, M.S. Lee et al. //Mol. Cell Proteomics. 2009. - Vol. 8, № 5. - P. 924-935.

139. Kervella, M. Immunological cross-reactivity between outer membrane pore proteins of Campylobacter jejuni and Escherichia coli / M. Kervella, J.L. Fauchere, D. Fourel, J.M. Pages//FEMS Microbiol. Lett. 1992. - Vol. 78, № 2-3.-P. 281-285.

140. Khushiramani, R. Characterization of outer membrane proteins of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis strains isolated from India / R. Khushiramani, U. Tuteja, J. Shukla, H.V. Batra // Indian. J. Exp. Biol. 2004. -Vol. 42, №5.-P. 508-514.

141. Klemm, P. Self-associating autotransporters, SAATs: functional and structural similarities/ P. Klemm, R.M. Vejborg, O. Sherlock. // Int. J. Med. Microbiol.-2006.-Vol. 296.-P. 187-195.

142. Knirel, Y.A. Structural features and structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plague / Y.A. Knirel, S.V. Dentovskaya, S.N. Senchenkova et al. // J. Endotoxin Res. 2006. - Vol. 12, № 1. -P. 3-9.

143. Krasny, S.A. Immunologic cross-reaction between enterobacterial common antigen and rat tissue / S.A. Krasny, E.A. Gorsynski // Immunopharmacology. — 1979. Vol. 2, № 1. - P. 1-8.

144. Krewulak, K.D. Structural biology of bacterial iron uptake / K.D. Krewulak, H.J. Vogel // Biochim. Biophys. Acta. 2008. - Vol. 1778, № 9. - P. 1781-1804.

145. Kukkonen, M. Lack of O-antigen is essential for plasminogen activation by Yersinia pestis and Salmonella enterica / M. Kukkonen, M. Suomalainen, P. Kyllonen et al. // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 51. - P. 215225.

146. Kukkonen, M. The omptin family of enterobacterial surface proteases/adhesins: from housekeeping in Escherichia coli to systemic spread of Yersinia pestis / M. Kukkonen, Т.К. Korhonen // Int. J. Med. Microbiol. 2004. -Vol. 294.-P. 7-14.

147. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227, № 17. -P. 680-685.

148. Lahteenmaki, K. The Pla surface protease/adhesion of Yersinia pestis mediates bacterial invasion into human endothelial cells / K. Lahteenmaki, M. Kukkonen, Т. K. Korhonen // FEBS Lett. 2001. - Vol. 504. - P. 69-72.

149. Laird, W.J. Correlation of autoagglutination and virulence of Yersiniae / W.J. Laird, D.C. Cavanaugh // J. Clin. Microbiol. 1980. - Vol. 11, № 4. - P. 430432.

150. Lathem, W.W. A plasminogen-activating protease specifically controls the development of primary pneumonic plague / W.W. Lathem, P.A. Price, V.L. Miller, W.E. Goldman // Science. 2007. - Vol. 315. - P. 509-513.

151. Li, В. Protein microarray for profiling antibody responses to Yersinia pestis live vaccine / B. Li, L. Jiang, O. Song et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, №6.-P. 3734-3739.

152. Lindahl, M. A new test based on "salting out" to measure relative surface hydrophobicity of bacterial cells / M. Lindahl., A. Farris, T. Wadstrom, S. Hjerten // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - Vol. 677. - P. 471-476.

153. Lindler, L.E. Yersinia pestis pH6 antigen: genetic, biochemical, and virulence characterization of a protein involved in the pathogenesis of bubonic plague / L.E. Lindler, M.S. Klempner, S.C. Straley // Infect.Immun. 1990. - Vol. 58.-P. 2569-2577.

154. Liu, F. The effects of Psa and F1 on the adhesive and invasive interactions of Yersinia pestis with human respiratory tract epithelial cells / F. Liu, H. Chen, E. M. Galvan et al. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74, № Ю. - P. 56365644.

155. Lugowski, C. Identification of a trisaccharide repeating-unit in the enterobacterial common antigen / C. Lugowski, E. Romanowska, L. Kenne, B. Lindberg//Carbohydr.Res. 1983.-Vol. 118.-P. 173-181.

156. Maclntyre, S. Structure, assembly and applications of the polymeric F1 antigen of Yersinia pestis / S. Maclntyre, S.D. Knight, L.J. Fooks // Yersinia. Mol. and cell, biology: Eds. E. Carniel, B.J. Hinnebusch Horizon Bioscience, UK, 2004.-P. 363-407.

157. Macnab, R.M. How bacteria assemble flagella / R.M. Macnab // Annu. Rev. Microbiol. -2003. Vol. 57. - P. 77-100.

158. Madan Babu, M. DOLOP—database of bacterial lipoproteins / M. Madan Babu, K. Sankaran / Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - P. 641-643.

159. Makela, H.P. Enterobacterial common antigen / H.P. Makela, H. Mayer // Bacteriol. Rev. 1976. - Vol. 40, № 3. - P. 591-632.

160. Makoveichuk, E. pH6 antigen of Yersinia pestis interacts with plasma lipoproteins and cell membranes / E. Makoveichuk, P. Cherepanov, S. Lundberg et al. // J. Lipid. Res. 2003. - Vol. 44. - P. 320-330.

161. Malkamaki, M. Antibodies to the enterobacterial common antigen: standardization of the passive hemagglutination test and levels in normal human sera / M. Malkamaki // J. Clin. Microbiol. 1981. - Vol. 13, № 6. - P. 1074-1079.

162. Marenne, M-N. The pYV plasmid and the Ysc-Yop type III secretion system / M.-N. Marenne, l.J. Mota., G.R. Cornelis // Yersinia. Mol. and cell, biology: Eds. E. Carniel, B.J. Hinnebusch Horizon Bioscience, UK, 2004. - P. 319-348.

163. Marganstern, M.A. Immunogenic cross-reactivity between human tissues and enterobacterial antigen / M.A. Marganstern, E.A. Gorzynski // Infect. Immun. 1977. - Vol. 17, № 1. - P. 36-42.

164. Meredith, T.C. Modification of lipopolysaccharide with colanic acid (M-antigen) repeats in Escherichia coli / T.C. Meredith, U. Mamat, Z. Kaczynski et al. // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282, № 11. - P. 7790-7798.

165. Miethke, M. Siderophore based iron acquisition and pathogen control / M. Miethke, M.A. Marahiel // Microb. Mol. Biol. Rev. - 2007. - Vol. 71, № 3. -P. 413-451.

166. Misawa, N. Detection and characterization of autoagglutination by Campylobacter jejuni / N. Misawa, M.J. Blaser // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. -P. 6168-6175.

167. Moore, D.G. Bacteriostatic enterochelin-specific immunoglobulin from normal human serum / D.G. Moore, R.J. Yancey, C.E. Lankford, C.F. Earhart // Infect. Immun. 1980. - Vol. 27. - P. 418-423.

168. Neubauer, H. Mapping of B-cell epitopes of the Al capsular antigen of Y.pestis / H. Neubauer, S. Aleksis, H. Meyer et al // Med. Microbiol. (Nederlands Tijdschrift voor). 1998. - Vol. 6. - P. 10-11.

169. Neubauer, H. A combination of different polymerase chain reaction (PCR) assays for the presumptive identification of Yersinia pestis / H. Neubauer, H. Meyer, J. Prior et al. // J. Vet. Med. 2000. - B. 47. - P. 573-580.

170. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability / H. Nikaido, M. Vaara // Microbiol. Rev. 1985. - Vol. 49. - P. 1-32.

171. Nikaido, H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited / H. Nikaido // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - Vol. 67, № 4. - P. 593-656.

172. Otte, L. Molecular basis for the binding polyspecificity of an anti-cholera toxin peptide 3 monoclonal antibody / L. Otte, T. Knaute, J. Schneider-Mergener, A. Kramer // J. Mol. Recognit. 2006. - Vol. 19, № 1. - P. 49-59.

173. Ouchterlony, O. Antigen-antibody reaction in gels / O. Ouchterlony // Acta Pathol. Microbiol. Immunol. 1949. - Vol. 26, № 4. - P. 507-513.

174. Overheim, K.A. LcrV plague vaccine with altered immunomodulatory properties / K.A. Overheim, R.W. Depaolo, K.L. Debord et al. // Infect. Immun. -2005.-Vol. 73.-P. 5152-5159.

175. Parent, M.A. Yersinia pestis V protein epitopes recognized by CD4 T cells / M.A. Parent, K.N. Berggren, I.K. Mullarky et al. // Infect. Immun. 2005. -Vol. 73, № 4. - P. 2197-2204.

176. Payne, D. The ph6 antigen of Yersinia pestis binds to pi-linked galactosyl residues in glycosphingolipids / D. Payne, D. Tatham, E.D. Willamson, R.W. Titball // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 4545-4548.

177. Peabody, C.R. Type II protein secretion and its relationship to bacterial type IV pili and archaeal flagella / C.R. Peabody, Y.J.Chung, M.R. Yen et al. // Microbiol. 2003. - Vol. 149. - P. 3051-3072.

178. Perry, R.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague / R.D. Perry, J D. Fetherston// Clin. Microbiol. Rev. - 1997.- Vol. 10. - P. 35-66.

179. Pettersson, J. The V antigen of Yersinia is surface exposed before target cell contact and involved in virulence protein translocation / J. Pettersson, A. Holmstrom, J. Hill et al. // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 32. - P. 961-976.

180. Podladchikova, O.N. Identification of Yersinia pestis pigment receptor / O.N. Podladchikova , G.G. Dikhanov // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - Vol. 529. -P. 121-124.

181. Prior, J.L. Characterization of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis / J.L. Prior, P.G. Hitchen, E.D. Williamson et al. // Microb. Pathogen. 2001. -Vol. 30.-P. 49-57.

182. Prior, J.L. Monoclonal antibodies against Yersinia pestis lipopolysaccharide detect bacteria cultured at 28°C or 37°C / J.L. Prior, R.W. Titball // Mol. Cell. Probes. 2002. - Vol. 16. - P. 251-256.

183. Pugsley, A.P. Recent progress and future directions in studies of the main terminal branch of the general secretory pathway in Gram-negative bacteriaa review / А.Р. Pugsley, О. Francetic, О.М. Possot et al. // Gene. 1997. - Vol. 192.-P. 13-19.

184. Pugsley, A.P. Getting out: protein traffic in prokaryotes / A.P. Pugsley,

185. Francetic, A.J. Driessen, V. de Lorenzo // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 52, №1.-P. 3-11.

186. Pukatzki, S. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system / S. Pukatzki, A.T. Ma, D. Sturtevant et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. -Vol. 103.-P. 1528-1533.

187. Rabbi, F. Analysis of immune responses and serological cross reactivities among Vibrio cholerae Ol, Shigella flexneri 2a and Haemophilus influenzae b / F. Rabbi, N. Sultana, T. Rahman et al. / Cell. Mol. Immunol. 2008. -Vol. 5, №5.-P. 393-396.

188. Raetz, C.R.H. Lipopolysaccharide endotoxins / C.R.H. Raetz, C. Whitfield // Annu. Rev. Biochem. 2002. - Vol. 71. - P. 635-700.

189. Raetz, C.R.H. Lipid A modification systems in gram-negative bacteria / C.R.H. Raetz, C.M. Reynolds, M.S. Trent, R.E. Bishop // Annu. Rev. Biochem. -2007. Vol. 76. - P. 295-329.

190. Ramboarina, S. Structure of the bundle-forming pilus from enteropathogenic Escherichia coli / S. Ramboarina, P.J. Fernandes, S. Daniell et al. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280, № 48. - P.40252-40260.

191. Ramos-Morales, F. Role for Salmonella enterica enterobacterial common antigen in bile resistance and virulence / F. Ramos-Morales, A.I. Prieto, C.R. Beuzon et al. // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185. - P. 5328-5332.

192. Reisner, A. Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms / A. Reisner, J.A.J. Haagensen, M.A. Schembri et al. // Mol. Microbiol. -2003. Vol. 48. - P. 933-946.

193. Rinno, J. Localisation of enterobacterial common antigen: Proteus mirabilis and its various L-forms / J. Rinno, J. Gmeiner, J.H. Colecki, H. Mayer // J. Bacteriol. 1980. - Vol. 141, № 2. - P. 814-821.

194. Rosenberg, M. Adherence of bacteria to hydrocarbons: a simple method for measuring cell-surface hydrophobicity / M. Rosenberg, D. Gutnic, E. Rosenberg // FEMS Microbiol. Lett. 1980. - Vol. 9. - P. 29-33.

195. Rosqvist, R. Increased virulence of Yersinia pseudotuberculosis by two independent mutations / R. Rosqvist, M. Skurnik, H. Wolf-Watz // Nature. -1988. Vol. 334.- P. 522-525.

196. Rudolph, A.E. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member / A.E.

197. Rudolph, J.A. Stuckey, Y. Zhao et al. // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 11824-11831.

198. Saiki, R.K. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R.K. Saiki, D.H. Gelfand, S. Stoffel et al. // Science. 1988. - Vol. 239. - P. 486-491.

199. Sara, M. S-layer proteins / M. Sara, U.B. Sleytr // J. Bacteriol. 2000. -Vol. 182.-P. 859-868.

200. Sasidharan, S. Antibody response to Helicobacter pylori excretory antigen and the cross reaction study / S. Sasidharan, A.M. Uyub // J. Immunoassay Immunochem. 2009. - Vol. 30, № 1. - P. 70-81.

201. Schembri, M.A. Capsule shields the function of short bacterial adhesions / M.A. Schembri, D. Dalsgaard, P. Klemm // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186, №5.-P. 1249-1257.

202. Schembri, M.A. Capsule and fimbria interaction in Klebsiella pneumoniae / M.A. Schembri, J. Blom, K.A. Krogfelt, P. Klemm // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, № 8. - P. 4626-4633.

203. Sebbane, F. The Yersinia pestis caflMlAl fimbrial capsule operon promotes transmission by flea bite in a mouse model of bubonic plague / F. Sebbane, C. Jarrett, D. Gardner et al. // Infect. Immun. 2009. - Vol. 77, № 3. - P. 1222-1229.

204. Serghini, M.A. A rapid and efficient miniprep for isolation of plasmid DNA / M.A Serghini, C. Ritzentheler, L. Pinck // Nucl. Acids Res. 1989. - Vol. 17, №9. - P. 3604.

205. Sha, J. Braun lipoprotein (Lpp) contributes to virulence of Yersiniae: potential role of Lpp in inducing bubonic and pneumonic plague / J. Sha, S.L. Agar, W.B. Baze et al. // Infect. Immun. 2008. - Vol. 76, № 4. - P. 1390-1409.

206. Sherlock, O. The TibA adhesin/invasin from enterotoxigenic Escherichia coli is self recognizing and induces bacterial aggregation and biofilm formation / O. Sherlock, R. M. Vejborg, P. Klemm // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73,№4.-P. 1954-1963.

207. Sidorova, E.V. Role of different B-cell subsets in the specific and polyclonal immune response to T-independent antigens type 2 / E.V. Sidorova, L. Li-Sheng, B. Devlin et al. // Immunol. Lett. 2003. - Vol. 88, № 1. - P. 37-42.

208. Simpson, W.J. Recombinant capsular antigen (fraction 1) from Yersinia pestis induces a protective antibody response in balb/c mice / W.J. Simpson, R.E. Thomas, T.G. Schwan // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1990. - Vol. 43, №4.-P. 389-396.

209. Sing, A. A hypervariable N-terminal regionof Yersinia LcrV determines Toll-like receptor 2-mediated IL-10 induction and mouse virulence / A. Sing, D. Reithmeier-Rost, K. Granfors et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - Vol. 102. -P. 16049-16054.

210. Singh, S.P. Antigenic determinants of the OmpC porin from Salmonella typhimurium / S.P. Singh, S.R. Singh, Y.U. Williams et al. // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, № 12. - P. 4600-4605.

211. Skurnik, M. Virulence plasmid-associated autoagglutination in Yersinia spp / M. Skurnik, I. Bolin, H. Heikkinen et al // J. Bacteriol. 1984. - Vol. 158. -P.1033-1036.

212. Sleytr, U. Crystalline surface layers in prokaryotes / U. Sleytr, P. Messner // J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170. - P. 2891-2897.

213. Sleytr, U.B. Nanobiotechnology with S layer proteins / U.B. Sleytr, C. Huber, D. Pum et al. // FEMS Microbiol. Lett. 2007. - Vol. 267. - P. 131-144.

214. Sodeinde, O.A. A surface protease and the invasive character of plague / O.A. Sodeinde, Y.V. Subrahmanyam, K. Stark et al. // Science. 1992. - Vol. 258, №6 -P. 1004-1007.

215. Spinosa, M.R. The Neisseria meningitidis capsule is important for intracellular survival in human cells / M.R. Spinosa, C. Progida, A. Tala et al. // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75, № 7. - P. 3594-3603.

216. Straley, S.C. Adhesins in Yersinia pestis / S.C. Straley // Trends Microbiol. 1993. - Vol. 1. - P. 285-286.

217. Suomalainen, M. Using every trick in the book: the Pla surface protease of Yersinia pestis / M. Suomalainen, J. Haiko, P. Ramu et al. // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - Vol. 603. - P. 268-278.

218. Thanassi, D.G. Ushers and secretins: channels for the secretion of folded proteins across the bacterial outer membrane / D.G. Thanassi // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 4. - P. 11-20.

219. Titball, R.W. Second and third generation plague vaccines / R.W. Titball, E.D. Williamson // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. -Vol. 529. - P. 397-406.

220. Towbin, H. Immunoblotting and dot immunobinding. Current status and outlook / H. Towbin, J. Gordon // J. Immunol. Methods. 1984. - Vol. 72. -P. 313-340.

221. Tzeng, Y.-L. Translocation and surface expression of lipidated serogroup В capsular polysaccharide in Neisseria meningitid.es / Y.-L. Tzeng, A.K. Datta, C.A. Strole et al. // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73, № 3. - P. 1491-1505.

222. Ulett, G.C. Antigen-43 mediated autoaggregation impairs motility in Escherichia coli / G.C. Ulett, R.I. Webb, M.A. Schembri // Microbiol. 2006. -Vol. 152.-P. 2101-2110.

223. Van Houdt, R. Role of bacterial cell surface structures in Escherichia coli biofilm formation / R. Van Houdt, C.W. Michiels /Ж-es. Microbiol. 2005. -Vol. 156.-P. 626-633.

224. Vinogradov, E.V. The structure of the cyclic enterobacterial common antigen (ECA) from Yersinia pestis / E.V. Vinogradov, Y.A. Knirel, J.E. Thomas-Oates et al. // Carbohydr. Res. 1994. - Vol. 258. - P. 223-232.

225. Wandersman, C. TolC, an Escherichia coli outer membrane protein required for hemolysin secretion / C. Wandersman, P. Delepelaire // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 4776^1780.

226. Wang, W. A group of Escherichia coli and Salmonella enterica О antigens sharing a common backbone structure / W. Wang, A.V. Perepelov, L. Feng et al. // Microbiology. 2007. - Vol. 153, № 7. - P. 2159-2167.

227. Wells, TJ. Autotransporter proteins: novel targets at the bacterial cell surface / T.J. Wells, J.J. Tree, G.C. Ulett, M.A. Schembri // FEMS Microbiol. Lett. 2007. - Vol. 274. - P. 163-172.

228. Westphal, O. Bacterial lipopolysaccharrides: extraction with phenol-water and further application of the procedure / O. Westphal, K. Jahn // Methods Carbohydr. Chem. 1965. - Vol. 5. - P. 83-91.

229. Whang, H.Y. Immunological studies of a heterogenic enterobacterial antigen (Kunin) / H.Y. Whang, E. Neter // J. Bacteriol. 1962. - Vol. 84, № 6. - P. 1245-1250.

230. Whitfeld, C. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli / C. Whitfeld, I.S. Roberts // Mol. Microbiol. 1999. -Vol. 31, №5.-P. 1307-1319.

231. Williams, K.M. Identification of murine B-cell and T-cell epitopes of Escherichia coli outer membrane protein F with synthetic polypeptides / K.M. Williams, E.C. Bigley, R.B. Raybourne // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 2535-2545.

232. Yamaguchi, H. Yersinia enterocolitica immunodominant 60 kDa antigen, common to a broad range of bacteria, is a heat-shock protein / H. Yamaguchi, T. Yamamoto, H. Taguchi et al. // J. Gen. Microbiol. 1990. - Vol. 136,№6.-P. 1091-1097.

233. Yen, Y.T. Identification and characterization of autotransporter proteins of Yersinia pestis / Y.T. Yen, A. Karkal, M. Bhattacharya et al. // Mol. Membr. Biol. 2007. - Vol. 24, №1.-P. 28-40.

234. Zavialov, A.V. Structure and biogenesis of the capsular F1 antigen from Yersinia pestis: preserved folding energy drives fiber formation / A.V. Zavialov, J. Berglund, A.F. Pudney et al. // Cell. 2003. - Vol. 113, № 5. - P. 587596.0 h

235. Zhang, H. Bacterial lipoprotein and lipopolysaccharide act synergistically to induce lethal shock and proinflammatory cytokine production / H. Zhang, J.W. Peterson, D.W. Niesel, G.R. Klimpel // J. Immunol. 1997. - Vol. 159, № 10. -P. 4868-4878.

236. Zhang, H. Lipoprotein from Yersinia enterocolitica contains epitopes that cross-react with the human thyrotropin receptor / H. Zhang, I. Kaur, D.W. Niesel et al. // J. Immunol. 1997. - Vol. 158, № 4. - P. 1976-1983.

237. Zhang, H. Lipoprotein release by bacteria: potential factor in bacterial pathogenesis / H. Zhang, D.W. Niesel, J.W. Peterson, G.R. Klimpel // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 5196-5201.

Информация о работе

Рыкова, Виолетта Александровна
кандидата биологических наук
Ростов-на-Дону, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Характеристика фактора аутоагглютинации возбудителя чумы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы