Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные особенности инсерционного элемента IS100 чумного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные особенности инсерционного элемента IS100 чумного микроба"

V Ь О*

^ ц да4

На правах рукописи

Трукачев Алексей Леонидовнч

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИНСЕРДИОННОГО ЭЛЕМЕНТА ШОО ЧУМНОГО МИКРОБА

03. 00. 07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону - 1998

Работа выполнена в Ростовском государственном научно-исследовательском

противочумном институте.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук, ст. научный сотрудник Подладчикова О.Н.

доктор медицинских наук, ст. научный сотрудник Яговкин Э.А.

кандидат медицинских наук, ст. научный сотрудник Сучков И.Ю.

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится " " ^бЖ'Я1998 г. в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 084.53.01 в Ростовском государственном медицинском университете (344022, г.Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер.29)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ

Автореферат разослан " 22. 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент Корганов Н.Я

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Чума является тяжелым инфекционным заболеванием человека, для которого характерна высокая контагиозность и летальность. Существование множественных природных очагов и эпидемическая опасность этой инфекции обусловливают неослабевающий интерес исследователей к изучению возбудителя чумы (Yersinia pestis). В настоящее время охарактеризованы многие факторы вирулентности Y. pestis, выявлены их генетические детерминанты, обнаружена важная роль инсерционных последовательностей (IS-элементов) в их инактивации, приводящей к снижению или потере возбудителем чумы патогенных свойств.

IS-элементы представляют собой небольшие по размеру фрагменты ДНК, способные к самостоятельной репликации и перемещению (транспозиции) в геноме несущих их клеток. Большинство известных в настоящее время бактериальных IS-последовательностей имеет широкий круг хозяев в микробном мире, однако у целого ряда патогенных бактерий обнаружены специфические элементы, участвующие в регуляции экспрессии факторов патогенности. Одним из таких мобильных элементов является IS100, обнаруженный у Y. pestis^ а также у близкородственных бактерий возбудителя псевдотуберкулеза ^.pseudotuberculosis). Известно, что у возбудителя чумы транспозиция IS100 является причиной высокочастотных инсерционных и делецион-ных мутаций по признакам, коррелирующим с вирулентностью бактерий: зависимость роста при 37°С от наличия в среде ионов кальция (Portnoy& Falkow, 1981; Filippov et al., 1995, 1998) и способность сорбировать экзогенные пигменты при 26°С (Felherston et al., 1992,1994; Buchrieser et al., 1998). Однако механизмы активации транспозиции этого элемента в настоящее время неизвестны. Для раскрытия этих механизмов необходимы - данные о структурной и функциональной организации IS100, которые могут дать в руки исследователям ключ к пониманию процессов, лежащих в основе регуляции вирулентности одного из наиболее патогенных видов бактерий - возбудителя чумы.

Анализ последовательности нуклеотндов IS 100 (Podladchikova et al., 1994; Filippov et al., 1995; Hare et al., 1996) выявил одну его структурную особенность: IS100 не имеет промотора для экспрессии содержащихся в нем двух открытых рамок считывания (orfl и orf2). Такая молекулярная организация предполагает, что транспозиция элемент1 должна зависеть от наличия внешнего промотора, расположенного в последовательностях ДНК, окружающих этот элемент. Экспериментальные данные, подтверждающие это предположение, в

литературе отсутствовали. Вместе с тем решение этого вопроса является необходимым для понимания того, какие регуляторные факторы заставляют IS100 перемещаться в геноме Y.pestis и инактивировать важные для вирулентности гены. В геноме Y.pestis IS]00 имеет большое число копий (более 20) в хромосоме и по крайней мере по одной копии - в каждой из трех плазмид чумного микроба. Хотя теоретически любая из копий может служить донором при транспозиции IS100, имеющиеся в литературе данные (см. обзоры Хесин, 1985; Galas & Chandler, 19S9) свидетельствуют о том, что мелкие плазмиды являются предпочтительными донорами при транспозиции IS-элементов. Эти данные позволяли предположить, что наиболее вероятным донором IS 100 при его транспозиции в геноме Y.pestis может быть 9,5 kb-плазмида pYP, кодирующая бакгериоцин лестицин и активатор ллазминогена. Поэтому в качестве объекта экспериментального исследования роли внешних промоторов в функционировании IS 100 мы выбрали именно плазмиду pYP.

В ходе исследования была обнаружена еще одна особенность IS100: помимо генов, необходимых для транспозиции, он несет информацию, экспрессия которой влияет на поверхностные свойства хозяйских клеток. Подобное явление не было описано ни для одного IS-элемента. Более того, общепризнанным считается мнение, что IS-элементы, в отличие от транспозонов, содержат только генетическую информацию, необходимую для их перемещения в геноме, и влияют на хозяйскую клетку исключительно за счет последствий транспозиции, приводящих к реорганизации генома. Поэтому доказательство того факта, что IS 100 действительно содержит гены, экспрессия которых влияет на фенотип хозяйской клетки, представляло интерес не только в плане выяснения роли IS 100 в физиологии возбудителя чумы, но и в плане расширения представлений о биологических функциях мобильных генетических элементов.

Цель работы. Целью исследования явилось выявление структурно-функциональных особенностей инсерциондаго элемента IS 100 и на его основе разработка теста для внугриродовой дифференциации иер-сииий.

Задачи исследования. Для достижения цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Определить влияние внешних промоторов на экспрессию генов IS 100 с помощью метода молекулярного клонирования в клетках кишечной палочки.

2. Осуществить поиск регуляторных элементов транскрипции, способных обеспечивать экспрессию генов IS100, на участке плазмиды pYP, предшествующем двум большим открытым рамкам считывания этого элемента. «

3. Оценить возможность использования праймеров, комплементарных IS100, для детекции возбудителей чумы и псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Научная новизна. В работе впервые проведено экспериментальное исследование структурно-функциональных особенностей IS 100: выявлено влияние внешних промоторов на транспозиционную активность и способность IS100 вызывать делеции ДНК, в том числе и своих собственных последовательностей; при секвенировании участка ДНК плазмиды pYP, предшествующего IS 100, выявлены последовательности, позволяющие предположить наличие оригинального механизма регуляции экспрессии генов IS 100 в этой плазмиде. При изучении IS 100 получено экспериментальное свидетельство в пользу гипотезы о том, что функции IS-элементов не ограничены их транспозиционной активностью,' а могут' быть связаны и с наличием в них генетической информации, влияющей на фенотипические свойства хозяйских клеток. Практическая значимость. В результате проведенных исследований получен набор рекомбинантных плазмид, содержащих гены IS 100 под контролем регулируемых промоторов. Рекомбинантные плазмиды могут быть использованы для изучения роли IS 100 в физиологии возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. В работе предложен тест для детекции и идентификации Y.pestis и Y.pseudotuberculosis I серовари-анта с помощью ПЦР с праймерами, комплементарными IS100. Тест может быть применен для совершенствования схемы диагностики возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и их дифференциации от других иерсиний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. С помощью метода молекулярного клонирования получен набор рекомбинантных плазмид, различающихся наличием и расположением внешнего промотора по отношению к IS 100.

2. Для проявления транспозиционной активности IS 100 необходим внешний промотор, направляющий транскрипцию двух крупных открытых рамок считывания элемента.

3. Транспозиционная активность IS 100 г. .оставе рекомбинантных плазмид приводит к образованию делеций как в векторной ДНК, так и в ДНК самого элемента.

4. В плазмиде pYP Y.pestis перед IS100 имеются последовательности, потенциально способные регулировать транскрипцию генов IS100.

5. IS 100 содержит генетическую информацию, экспрессия которой определяет изменение фенотипических свойств рекомбинантных штаммов E.coli.

6. Олигонуклеотиды, полученные на основе последовательностей IS 100, можно использовать для детекции Y.pestis и Y.pseudotuberculosis I серотипа методом ПЦР.

Апробация работы. Материалы работы неоднократно докладывались на научных конференциях и конкурсах молодых ученых и специалистов Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, представлялись на Конгрессе микробиологических обществ в г. Иерусалиме, Израиль (1996г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, список которых приводится в конце автореферата. Структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописи, состоит из введения, заключения, выводов и трех глав, включающих: обзор литературы, описание материалов, методов и результатов собственных исследований. Текст иллюстрирован 6 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 189 печатных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Клонирование 1S100 в клетках кишечной палочки. Анализ нук-леотидной последовательности IS 100 позволил сделать предположение, что для проявления транспозиционных свойств этот элемент нуждается во внешнем промоторе. Подтвердить это предположение можно было после клонирования IS100 под контролем внешнего промотора в клетках кишечной палочки. Для клонирования IS 100 была использована копия элемента, полученная из плазмиды pYP моноплазмидного штамма Y.pestis 106 Otten, в которой этот элемент был локализован и секвенирован ранее (Podladchikova et al., 1994). На основании генетической и физической карты плазмиды pYP (рис.1), IS100 был выделен с помощью рестриктаз Hindlll и Smal. Полученный при этом фрагмент содержал дополнительную последовательность ДНК длиной о ко.', о 2 т.п.н., расположенную перед 5'-концом цепи IS100, содержащей oifl и orf2. Этот фрагмент был встроен в плазмиду pUC129, обработанную теми же рестриктазами, в результа-

EcoRi

EcoRV EcoRI

Hindlll

EcoRI • Smal

ВашШ

oriV

Clal

Рис.1. Генетическая и физическая карта плазмиды pYP Y.peslis. Условные обозначения: pst-ген, кодирующий пестицин, pía- ген активатора плазминогена, pim-тен иммунности к пестицину, oriV- область начала репликации, orfl и orf2 - открытые рамки считывания IS100. Стрелками показано направление транскрипции генов.

те чего должна была получиться рекомбинантная плазмида, в которой векторный промотор Piac способствовал бы транскрипции orfl и orß. В качестве штамма-реципиента рекомбинантной плазмиды был использован штамм E.coli JM103, производный E.coli К-12, в котором IS100 не обнаружен. Отбор ISlOO-содержащих клонов проводился' с помощью гибридизации рекомбинаптных клонов с радиоактивным зондом длиной 140 п.н., комплементарным orfl . Из 300 проанализированных рекомбинантных клонов только один гибридизовался с зондом. Рекомбинантная плазмида, выделенная из этого клона, была названа pIS 1. Для подтверждения того, что клонирован необходимый фрагмент, был проведен анализ рекомбинантной плазмиды с помощью рестрикгаз, сайты узнавания которых присутствуют в IS100 и в векторной плазмиде pUC129. Анализ показал, что рекомбинантная плазмида pISl гидролизовалась рестриктазами Pstl и BglII, сайты узнавания которых находятся в области ог£2, и не гидролизовалась EcoRV, сайт узнавания которой расположен в orfl (рис.1), а также BamHI, Hindlll, Smal, сайты узнавания которых имеются в полилинкере вектора. Эти результаты позволили предположить, что

р!Б1 имеет делеции как в векторной ДНК, так и в ДНК ШОО-содержащего фрагмента. Подтверждением этого предположения стал результат гидролиза р1Б1, р11С129 и рУР мелкошепящей рестрикта-зой МБр1 (рис.2, а), который показал, что в рШ отсутствуют фрагменты векторной ДНК с двух сторон от места встраивания 15100, а также фрагменты ДНК самого элемента вплоть до последовательности, комплементарной ДНК-зонду. Известно, что основным механизмом образования ¡Б-индуцированных делений является появление второй копии элемента на близлежащем участке ДНК, с последующей рекомбинацией между двумя копиями. Если копии находятся в прямой ориентации, то после гомологичной рекомбинации исчезает заключенная между ними ДНК, но сохраняется одна из копий элемента, а если в обратной ориентации - то в процессе репликации

1 2 3 1 2 3 4 5

Рис. 2. Анализ рекомбинантных плазмид с помощью рестриктазы Мзр1: а. 1 - рУР, 2 - рШ, 3 - риС129. б. 1 - рШ, 2 - р^З, 3 - р1Б4, 4 -рВ5, 5 - риС 129

могут элиминироваться обе копии вместе с заключенной между ними ДНК. При этом величина делений должна отражать расстояние между двумя копиями IS-элемента. Наличие делений в структуре самого элемента может быть вызвано его транспозицией на свои собственные последовательности, что может приводить к удалению части элемента. Именно этим обстоятельством, на наш взгляд, можно объяснить то, что при клонировании IS100 в pUC129 из большого числа рекомбинантных клонов был обнаружен только один, гибридизовав-шийся с зондом. Остатыше же рекомбинантные клоны содержали плазмиды, которые, судя по картине их гидролиза рестриктазой Mspl (рис.2, б, плазмиды, pIS2-pIS5), несли различные короткие вставки или делеции векторной ДНК. Тот факт, что в рекомбинантных плаз-мидах были делегированы различные фрагменты вектора, указывает на отсутствие строгой специфичности в выборе ДНК-мишени этим элементом, способным перемещаться в том числе и на свои собственные последовательности. Полученные результаты свидетельствовали о том, что векторный промотор может вносить определенный вклад в транспозиционную активность IS100, которую можно легко зарегистрировать по образованию делеций в рекомбинантных плаз-мидах. Используя этот тест, мы исследовали влияние внешнего промотора на транспозицию IS100.

Изучение влияния внешнего промотора на транспозиционную активность IS100. Для выяснения влияния внешнего промотора на транспозиционную активность IS100 мы клонировали этот элемент в составе различных векторных плазмид в клетках E.coli. По наличию внешнего промотора для IS-элемента все полученные рекомбинантные плазмиды можно разделить натри группы (рис.3).

Первую группу составили плазмиды, в которых последовательности IS100 либо не находились под контролем внешнего промотора, либо находились под контролем "выключенного" промотора. Плаз-мида, в которой последовательности элемента не находились под контролем векторного промотора (pYPQ) была полученана при клонировании в E.coli плазмиды пестициногенности Y.pestis после введения в нее интерпозона Q, несущего п.н устойчивости к спектино-мицину. Рекомбинантные плазмиды, к которых последовательности IS100 находились под контролем "выключенного" векторного промотора, были получены при клонировании элемента в векторе рТ7-5, содержащем промотор, узнаваемый РНК-полимеразой фага Т7, при отсутствии которой экспрессия генов, контролируемых Рп, не

s

Hindlll

П-

spc

pYPQ

IS100

pla

psty

Hindlll

Clal

CU1

pirn

Clal

Smal

СЫ

Chi

Smal

Snuil C|al

HinclIII

dill

dill

EcoRI

PT7-5-1

Hindlll

Hindlll

IS100

pYPD-2

Hindlll

pUCIS

pim

Plac

Pst X/ Hindlll

Smal

pT7-5 -2

Рис. 3. Рекомбинантные плазмиды, полученн:\; при клонировании IS 100 в клетках кишечной палочки.

происходит. В векторе рТ7-5 был клонирован С1а1-фрагмент плазмиды рУР 1 длиной 5 т.п.н. (рис.1), содержащий ШОО и дополнительно около 3 т. п. п., следующих за З'-концом цепи элемента, несущей огП и огО. В результате встраивания этого фрагмента в С1а1-сайт рТ7-5 были получены две рекомбинантньге плазмиды: в одной из них (рТ7-5-1) под контролем Ртт находились огП и ог£2, в другой (рТ7-5-2) - комплементарная им цепь 18100.

Во вторую группу вошли плазмиды, в которых векторный промотор контролировал цепь ДНК 18100, содержащую огП и от12: рУРГЫ, р19-1 и рТ7-5-1 (после "включения" векторного промотора). Плазмида рУРП-1 была получена путем введения в рУРО по НтёШ-сайту плазмиды рЬтС18 в ориентации, при которой векторный промотор Р)ас контролировал огЛ и огО. Плазмида р19-1 получена при клонировании Нт<Ш1/8та1 фрагмента рУР, содержащего К100, в составе векторной плазмиды риС19. "Включение" промотора фага Т7 осуществляли путем введения в клетку второй плазмиды -рСР1-2, несущей ген Т7-РНК-полимеразы и термоиндукции последней при 42° С.

Третий тип плазмид: рУРФ-2, р18-2, рТ7-5-2 (после "включения" векторного промотора) имел конструкцию, при которой векторный промотор направлял транскрипцию цепи ДНК 18100, комплементарной огП и 01^2. Плазмида рУРП-2 конструировалась аналогично плазмиде рУРСЫ, с той лишь разницей, что риС18 в рУРО-2 имела противоположную ориентацию. Плазмида р18-2 получена при клонировании 18100 в составе НнкШ1/8та1-фрагмента рУР в векторе р11С 18.

Из всех рекомбинантных плазмид только плазмиды второй группы характеризовались нестабильностью, проявляющейся с делеционных перестройках векторной и рекомбинантной ДНК, включая делеции и внутри самого 18100. Так, плазмида рУРГЫ содержала делешпо около 300 п.н. в области огП. При клонировании элемента в риС19 большинство рекомбинантных клонов содержало плазмиды с короткими вставками или делениями векторной ДНК. Только четыре клона содержали рекомбинантные плазмиды, гибридизующиеся с ДНК-зондом, полученным из 18100. Рестрикционный анализ этих плазмид показал, что три из них имели делеции участка ДНК 15100, содержащего огЛ. Четвертая рекомбинантная плазмида, хотя и содержала две противоположно направленные копии К100 на расстоянии около 300 п.н. друг от друга, имела делецию векторного фрагмента ДНК, несущего 1ас-промотор. Все четыре плазмиды были стабильными, что могло быть связано с тем, что они содержали дефектный 18100 или не содержали промотора для транскрипции ог£ Оба этих фактора, по-видимому, способны предотвра-

тить транспозицию 15100 и образование вызванных им делеций. Нестабильность, проявляющаяся в утрате клетками одной или обеих плазмид, наблюдалась и при «включении» промотора в плазмиде рТ7-5-1.

Таким образом, полученные результаты позволили заключить, что для транспозиционной активности и связанной с нею способности образовывать делеции ДНК 18100 действительно нуждается во внешнем промоторе, направляющем транскрипцию его двух больших открытых рамок считывания. Определение нуклеотидной последовательности участка ДНК плазмиды р\7Р, предшествующего ¡БЮО. Выявленная зависимость транспозиции КЮО от наличия внешнего промотора позволяла предположить, что стабильность 15100 в плазмиде рУРП в Е.соН связана с отсутствием в ней промотора, способствующего транскрипции огП и огП элемента. Для проверки этого предположения мы определили первичную структуру участка ДНК рУР, предшествующего К100 (рис.4).

-35

ГАГ.ААСАТТССТТААСТТСАОООСАТТСССТОТСТТССАТТТТС - 10

ТСАТТАОТСГОАААСТТССОААССТООАТААСАССССОТАТТТ

-- 1 --

ТТТТССТСАСАТАААСССССТССТТСАСССАСАСССССТТТТТ -- 2 "-

СТТТСССАССАСАТААААААСССССТСАСАССАССТСГТСТС

-к з „-

ТСАССОСОТАТС... 20 н. ...ОШОТССШАСТТТГССАТСТСССАА

ТАТААААСССТОТТТААСОСАТОСААААССААААААТААА ААТ

ОШАСАТСОСААТОССАОАХААТАТШАСОСАЩАСССААТОС г- КЮО " 4 "

СТАССССОАССССТСТОТААСОААСОААСООТОСААТАОТСАТС

САСАСССААССССТСАААТСАСАТССАОССССТААТСТССТСТС

Г* ОЯР1

СТСАТТСЛСОАСАСТТТАЮОТСЛСТ...

Рис.4. Нуклеотидная последовательность, предшествующая ">100 в плазмиде рУР У. ранйк. Стрелками показаны обращенные повторы, содержащие рибосом-связывающие участки (выделены жирным шрифтом). Подчеркнуты предполагаемые промоторные последовательности («-35», «-10»), а также инициирующие и терминирующие кодоны в области обращенных повторов. Отмечено начало 15100 и огП.

Анализ структуры этой области показал, что перед IS100 имеется последовательность нуклеотидов, гомологичная каноническому промотору E.coli. За этой последовательностью следуют четыре обращенных повтора, которые могли бы служить терминаторами или аттенюаторами транскрипции, начинающейся с этого предполагаемого промотора. Интересно, что в структуре всех четырех обращенных повторов имеются рибосом-связывающие участки (RBS), за которыми либо не следует стартовый кодон (в случае повторов 1 и 2), либо вслед за стартовым имеется стоп кодон (через 6 кодонов, в случае повтора 4). Хотя последовательность приблизительно 20 п. н., расположенная за стартовым кодоном повтора 3, неизвестна, анализ следующих за этой областью последовательностей показывает, что они также содержат стоп-кодоны, причем во всех трех рамках считывания. Это может свидетельствовать о том, что RBS выполняют функцию, не связанную с инициацией трансляции каких-либо белков, а возможно, служат мишенью для связывания рибосом, снижающих способность обращенных повторов к образованию шпилечных терминаторных структур. Следовательно, чем больше в клетке рибосом, а это происходит при максимальной скорости роста, тем большая вероятность прохождения транскрипции через аттенюаторы. Подобная структурная организация позволяет предположить, что транспозиция ISI00 с плазмиды pYP на другие участки генома возбудителя чумы может стимулироваться повышением скорости клеток. Такой механизм регуляции не характерен для бактериальных IS-элементов, транспозиция которых активируется при остановке роста клеток. Поэтому экспериментальное подтверждение этого предположения нуждается в специальном исследовании, которое может способствовать выявлению оригинальных свойств IS100. Влияние IS100 на фенотип рекомбшшнтных штаммов. При клонировании IS100 в клетках E.coli мы обнаружили, что плазмиды (рис.3), в которых промотор направлял транскрипцию цепи ДНК IS100, комплементарной огП и orf2 (pYPQ-2, р18-2, рТ7-5-2 после индукции промотора Т7), придавали клеткам свойство аутоагглготинации (АА). Такие клетки в жидкой питательной среде росли в виде "комочка ваты" на дне пробирки и пленки на поверхности среды и проявляли ярко выраженную гидрофобность клеточной поверхности. Гидрофобность рекомбинантных штаммов оценивали по трем критериям: характер роста в жидкой питательной среде, минимальная концентрация сульфата аммония, способствующая агглютинации клеток на стекле, и процент уменьшения оптической плотности культуры после экстракции ее ксилолом (табл.1). Сравнительный анализ различных рекомбинантных, плазмид по их способности придавать E.coli НВ101 свойство АА, показал,

Таблица 1

Аутоагглютинация штамма E.coli НВ101 с рекомбинантными плазмидами, содержащими IS100.

Плазмиды AAP3 AC6 ПГ±1Э5

- - И - И

РУРП - - 4 4 13±1,0 12±0,5

PYPil-1 - - >4 >4 14±0,5 15±1,5

PYPQ-2 + + 1 0,25 15+2,5 23±2,5

PUC19 - - >4 >4 11 ±0,4 9±0,5

p19-1 - - 4 4 10 ±0,6 14±1,0

p18-2 + + 1 0,25 25±6,0 31±8,0

р18-Д2 - - 4 4 12±1,0 13±0,6

pT7-5+pGP1-2 - - >4 >4 19±2,0 23±1,5

pT7-5-1+pGP1-2 - - 2 2 17±3,0 22±2,0

pT7-5-2+pGP1-2 - + 2 0,5 24±2,5 32±1,0

а. AAP - аугоагглютинативный рост клеток рекомбинантных штаммов в жидкой питательной среде LB при 37°С;

б. АС - минимальная концентрация сульфата аммония, вызывающая агглютинацию клеток на стекле (в М);

в. ПГ - процент уменьшения оптической плотности культуры при 600 нм. после экстракции ее ксилолом;

г. И - индукцию промотора Piac осуществляли добавлением в среду ИПТГ, а Рт7 - выращиванием при 37°С;

I95 - доверительный интервал.

что плазмида pYPQ, не содержащая промотора перед IS100, не вызывала проявления этого признака. Появление в pYPQ промотора Plac в составе плазмиды pUC18, причем только в той ориентации, которая способствует транскрипции цепи ДНК IS100, комплементарной orfl и orß (pYPQ-2), приводило к экспрессии свойства АА. В случае противоположной ориентации промотора (pYPQ-1), АА не проявлялась. Аналогичные результаты наблюдались и при сравнении плазмид р19-1 и р18-2 - только плазмида р18-2, в которой векторный промотор направлял транскрипцию той же цепи 1S100, что и в

плазмиде pYPQ-2, способствовала АА. Делеция в этой плазмиде с помощью рестриктазы EcoRI 2,6 т.п.н., содержащих IS100 (плазмида р18-А2), приводила к неспособности этой плазмиды вызывать АА, что подтверждает роль последовательностей IS100 в экспрессии данного признака. Различия в экспрессии АА между штаммами, содержащими плазмиды pYPQ, pYPQ-1, р19-1 и pYPfi-2, р18-2 свидетельствовало о влиянии на это свойство промотора, контролирующего транскрипцию цепи ДНК IS100, комплементарной orfl и orf2. Влияние Р|ас на АА подтверждается и тем, что при повышении активности промотора в результате индукции ИПТГ степень гидрофобности штаммов, экспрессирующих свойство АА, увеличивалась (табл.1). Более того, в штаммах с рекомбинантными плазмидамн, содержащими IS100 под контролем строго регулируемого промотора фага Т7, АА также зависела от транскрипции только одной цепи ДНК IS100 и проявлялась только при включении промотора в результате индукции синтеза РНК-полимеразы фага Т7. Так, сравнение векторной плазмиды рТ7-5 и двух рекомбинантных плазмид, в которых промотор определял транскрипцию разных цепей ДНК IS100 (рТ7-5-1 и рТ7-2), показало, что при отсутствии в клетке гена Т7-РНК-полимеразы все три плазмиды не обеспечивали экспрессию АА. После трансформации этих штаммов плазмидой pGPl-2, несущей ген Т7-РНК-полимеразы, и индукции синтеза этого фермента при 37°С только у плазмиды рТ7-5-2, имеющей такую же ориентацию IS100 по отношению к промотору, как и в плазмидах pYPfi-2 и р18-2, была отмечена способность придавать штамму E.coli НВ101 аутоагглютинативные свойства (табл.1).

Во время изучения свойства АА было замечено, что штаммы, имеющие большую степень гидрофобности, росли медленнее по сравнению со штаммами с меньшей степенью гидрофобности. На рис.5 приведены кривые роста штамма E.coli Ш3101, содержащего четыре рекомбинантные плазмиды, полученные при клонировании IS100 в векторах pUC19 и pUCIS. Наибольшую скорость роста имел штаммм с векторной плазмидой pUC19. Несколько медленнее росли штаммы, содержащие делетированную копию (pl 9-1) или не содержащие IS100 (р18-А2). Наименьшей скоростью роста обладал штамм с плазмидой р18-2, экспрессирующий свойство АА. Аналогичные результаты были получены и при сравнении штаммов с плазмидами pYPQ, pYPQ-1 и pYPQ-2, а также с плазмидами рТ7-5, рТ7-5-1 и рТ7-5-2. Отмеченная закономерность свидетельствовала о корреляции скорости роста штаммов с АА. Возможно, ччо экспрессия эгого признака, характерного для всех штаммов чумного микроба, вносит свой вклад в низкую скорость роста, проявляемую Y.pestis на искусственных питательных средах.

t

Рис. 5. Скорость роста штаммов E.coli НВ101, содержащих рекомбинант-ные плазмиды: 1. pUC19; 2. р19-1; 3. р18-Д2; 4. р18-2. Т% - изменение оптической плотности культуры (% log OD); t - время роста рекомбипантных штаммов (час).

Сравнение признака АА, экспрессируемого Y.pestis и рекомбинантными штаммами E.coli, выявило целый ряд их общих свойств: у обоих видов признак связан с гидрофобностыо клеток, определяется компонентом, который может быть экстрагирован с клеточной поверхности, и зависит от одинаковых факторов среды. Анализ гидрофобности двух штаммов Y.pestis (EV76 и 106 Otten) и трех рекомбинантных штаммов E.coli, экспрессирующих свойство АА (табл.2), показал, что и те и другие отличались от контрольного штамма E.coli НВ101 с векторной плазмидой pUC19 (11%), однако степень гидрофобности была выше у штаммов чумного мшфоба (4(3%), чем у штаммов кишечной палочки с плазмидами pYPQ-2, pi8-2, рТ7-5-2 (23, 31, и 33%, соответственно). Несмотря на эти различия, предполагаемый фактор АА обоих видов бактерий мог быть экстрагирован с поверхности клеток с помощью

Таблица 2

Сравнительный анализ аутоагглютинации штаммов Y.pestis и рекомби-нантных штаммов E.coli HB 101

Штамм Им' АС6 ПГ+|Э5

До после Э" ДО После Э

Y.pestis

EV76 5,5 0,125 >4 40±2,5 10±5,5

106 Otten 5,5 0,125 >4 37±5,0 12±6,0

E.coli НВ101

PUC19 - >4 >4 11±0,5 9±3,0

PYPQ-2 6,5 0,25 >4 23+2,5 12±2,5

P18-2 6 0,25 >4 31±8,5 14±2,5

PGP1-2+pT7-5-2 Не опр. 0,5 >4 33+3,5 10+2,0

а. ИАд - значение pH среды, ингибирующее аутоагглютинативный рост клеток;

б, в. - как в табл. 1;

г. Э - экстракция клеток раствором 10 мМ NaOH.

слабощелочных растворов. Экстракция приводила к снижению гидрофобно-сти клеток до уровня контрольного штамма E.coli НВ101 с плазмидой pUC19, на который такая процедура влияния не оказывала (табл.2). Косвенным свидетельством того, что АА обоих видов бактерий определяется одним и тем же или близким по структуре продуктом, является ее зависимость от одних и тех же факторов. Так, добавление в среду культивирования глюкозы и других метаболизируемых углеводов препятствовало проявлению АА как у Y.pestis, так и у рекомбинантных штаммов E.coli, что могло быть связано с изменением pH среды в результате культивирования микроорганизмов. Для изучения влияния pH среды на проявление признака АА штаммы выращивали при 28 С и 37 С в среде LB, забуференной фосфатным буфером с различными значениями pH. В этих экспериментах было обнаружено, что pH среды оказывал существенное влияние на АА обоих видов бактерий: проявлялась она только в нейтральной и щелочной среде и отсутствовала - в кислой. Причем значение pH, ингибирующее АА (Идд) было более низким у штаммов

чумного микроба (5,5), несколько выше у штаммов кишечной палочки с плазмидой р18-2 (6,0) и самым высоким (6,5) - с плазмидой pYPQ-2 (табл.2). Возможной причиной этих различий мог быть разный уровень экспрессии ' фактора АА у чумного микроба и рекомбинантных штаммов кишечной палочки, о чем свидетельствует и разница в их поверхностной гидрофобности. Таким образом, вышеописанные эксперименты позволили заключить, что АА и ингибиция роста рекомбинантных штаммов E.coli определяются экспрессией генов IS100, расположенных на цепи ДНК, комплементарной orfl и orf2. При анализе последовательности нуклеотидов этой цепи в ней были обнаружены только короткие orf, способные кодировать небольшие по размеру полипептиды. Возможно, что такие полипептиды принимают участие в экспрессии АА либо непосредственно, за счет секреции на поверхность клетки, либо опосредованно, оказывая регуляторное влияние на синтез каких-то клеточных компонентов, обусловливающих поверхностную гидрофобность. Для решения данного вопроса необходимы дальнейшие исследования по структурной характеристике фактора АА, выделенного из рекомбинантных штаммов кишечной палочки и штаммов чумного микроба. Детекция Y.pestis и Y.pseudotuberculosis I сероварианта методом ПЦР. Ранее, методом гибридизации нуклеиновых кислот (Подладчикова с соавт., 1992, 1994) было показано, что IS100 встречается только у возбудителя чумы и возбудителя псевдотуберкулеза I сероварианта. Эти данные свидетельствовали о возможности использования последовательностей IS 100 для детекции упомянутых микроорганизмов в ПЦР. Для поиска последовательностей, на основе которых можно было конструировать праймеры, была использована компьютерная программа 0LIG04, которая позволила выявить в IS100 два коротких фрагмента, имеющих одинаковую температуру плавления и не содержащих самокомплементарных последовательностей ДНК. Праймеры были синтезированы фирмой "Roth" (Германия) и любезно предоставлены нам А.В.Ракиным (Институт микробиологии и гигиены, г.Вюрцбург, Германия). Прямой праймер (isp3) соответствовал положению 210-232 н., а обратный (isp2) - был комплементарен участку 1329-1349 н. IS 100. Праймеры имели следующую структуру:

Isp3 S'-CAAAATCTGAGCCGCCAAAATAT-S' Isp2 S'-GTCATACTCTTCGAACGTTTT-S' Эта пара прай.мсров, в ПЦР направляла синтсз продукта длиной 1128 п.н., комплементарных orfl (Рис. 6) и выявляла только штаммы, содержащие 1S100, а именно штаммы Y.pestis и I сероварианта Y.pseudotuberculosis

Glal EcoRV EcoRI PstI EcoRI

.■■■:•*■'■■:■..•■ orfL . \f -у.-'-с^-~ or/2 У-:.-г: .

isp3 isp2

Рис.6. Физическая и генетическая карта КЮО. Стрелками показано положение последовательностей ДНК, на основе которых были сконструированы праимеры и ¡эрЗ.

Таблица 3.

Результаты ПЦР различных видов иерсиний с праймерами 1БрЗ и ¡вр2, комплементарными ЛБЮО.

Вид микроорганизма Количество исследованных штаммов Количество штаммов, имеющих положительную реакцию

У.реБ^Б1 12 12

У.рзе1^оЧ1Ьегси1о515

1 серотип2 4 4

У.р5еис1о1иЬегси1о515

II-VI серотип3 7 0

У.еЩегосоНйса 4 0

У.й-ескпкБепи 2 0

УлШепиесПа 2 0

У.к^епяепп 2 0

'-штаммы: EV76 линии НИИЭГ, 106 Otten, 6/69М, 231, 4"Манчжурия", 923(Р-134), 363(1/1479), 922(Р-133), 126, А-1806, 5S5S. Yava, 2-штаммы: YPI, 1, 881, S82, 3-штаммы: YPIII, 861(11), 50(111), 506(IV), 810(V), P-15186(V), 463(VI).

(табл.3). Из 12 штаммов Y.pestis и 4 штаммов Y.pseudotuberculosis I серовари-анта все детектировались предложенными праимерами, тогда как другие представители рода Yersinia не давали продуктов амплификации. Полученные результаты свидетельствовали о том, что данные праймеры можно использовать для детекции возбудителя чумы и I серотипа возбудителя псевдотуберкулеза методом ПЦР. В последнее время появились данные о том, что IS 100 был обнаружен не только у Y.pestis и I серотипа Y.pseudotuberculosis, но и у возбудителя псевдотуберкулеза других серотипов (Бобров, 1996, McDonough, 1997). Авторы, с помощью гибридизации с ДНК-зондами, комплементарными области IS 100, кодирующей ог!2, выявили по одной кошш этого элемента у некоторых штаммов Y.pseudotuberculosis не-01 серотипа. Тем не менее, наши исследования этих микроорганизмов с помощью ПЦР с праимерами isp2 nisp3, а также имеющиеся в литературе данные (Подладчи-кова с соавт., 1992) по гибридизации большого числа . штаммов Y.pseudotuberculosis с зондом, комплементарным orfl, не выявили присутствия в них IS100 (табл.3). Одной из причин подобного противоречия может являться различие в выборе детектируемых последовательностей IS100. Возможно, что в некоторых штаммах Y.pseudotuberculosis встречается элемент, имеющий частичную гомологию с IS100 и способный детектироваться с помощью зонда, выявляющего orf2, и не выявляющегося с помощью зонда или праймеров, комплементарных oifl. Это предположение подтверждается данными Куличенко (1995г.), обнаружившего в хромосоме Y.pestis повторяющиеся последовательности, которые имели частичную гомологию с IS100 и гибридизовались с отдельными штаммами Y.pseudotuberculosis независимо от их серотипа. Для окончательного решения этого вопроса необходимы дополнительные исследования по сравнительной структурной характеристике IS100 и изо-ISlOO элементов. Тем не менее, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что праймеры isp2 и isp3 можно использовать для детекции возбудителя чумы и I серотипа возбудителя псекдотуберкулеза методом ПЦР и дифференциации их от других иерсиний.

ВЫВОДЫ

1. Получен набор рекомбинантных плазмид, содержащих инсерционный элемент возбудителя чумы IS 100 в различных векторах, различающихся расположением промотора по отношению к элементу.

2. Показано, что наличие внешнего промотора, направляющего транскрипцию двух крупных открытых рамок считывания, имеющихся на одной цепи ДНК IS 100, вызывает активацию транспозиции элемента и приводит к образованию делеций различной протяженности, вызванных появлением дополнительных копий элемента в разных участках рекомбинантных плазмид.

3. Обнаружено, что наличие внешнего промотора, направляющего транскрипцию цепи ДНК IS 100, не содержащей больших открытых рамок считывания, приводит к экспрессии поверхностных компонентов, определяющих способность рекомбинантных штаммов к аутоагглютинации.

4. Проведено секвенирование области плазмиды pYP Y.pestis, предшествующей IS 100, и в ней обнаружены промоторные и терминаторные последовательности, потенциально способные регулировать транскрипцию двух открытых рамок считывания IS 100 в плазмиде pYP Y.pestis.

5. На основе данных о первичной структуре ДНК IS 100 сконструированы прэймеры для детекции Y.pestis и Y.pseudotuberculosis I сероварианта с помощью полимеразной цепной реакции.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Детекция возбудителя чумы и I сероварианта возбудителя псевдотуберкулеза с помошыо полимеразной цепной реакции (Подладчикова О. Н., Ра-кин А. В., Диханов Г. Г).- // Акт. вопр. проф. чумы и других инфекц. заболеваний: матер, междунар. конф. - Ставрополь, 1994. - С. 68 - 69.

2. Структурная характеристика мобильного генетического элемента IS100 возбудителя чумы (Подладчикова О. Н., Диханов Г. Г., Ракин А. В.).- // Проф. и меры борьбы с чумой: матер, межгос. научн. конф., посвящ. 100-летпю открытия возбудителя чумы. - Алма-Аты, 1994. - С. 119.

3. Функциональные свойства инсерционного элемента IS100 возбудителя чумы (Подладчикова О. Н., Иванова В. С., Малявина О. П.).- // Гомеостаз и инфекционный процесс: тез. докл. междунар. конф. - Саратов, 1996. - С. 215.

4. Unusual properties of Yersinia pestis IS100 insertion sequence (Podladchickova O. N., Dikhanov G. G.).- // Abst. Intern. Union Microbiol. Societies Congresses.-Jerusalem, 1996.-P.l8.

5. Влияние генов инсетнюнного элемента IS100 на биологические свойства возбудителя чумы (Подладчикова О., Иванова В., Кравцов А. Малявина О., Диханов Г.).- // Матер. VII съезда Всерос. об-ва эпидемиол., микробиол., паразитол. - М., 1997. - Т. 1. - С. 304 - 305.

6. Изучение транспозиционной активности инсерционного элемента В100 возбудителя чумы в клетках кишечной палочки (Подладчикова О. Н., Диха-новТ. Г.).- // Матер, науч.-практ. конф;, посвящ. 100-летию образов, противочумной службы России. - Саратов, 1997. - Т. 2. - С. 137.

7. Клонирование и экспрессия инсерционного элемента В100 возбудителя чумы в клетках кишечной палочки (Подладчикова О. Н., Диханов Г. Г.).- // Мол. биология. 1997. - Т. 31, № 6. - С. 849 - 853.