Роль транспортных белков и ферментов метаболизма ксенобиотиков в формировании лекарственной устойчивости при лимфопролиферативных заболеваниях

Воронцова, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль транспортных белков и ферментов метаболизма ксенобиотиков в формировании лекарственной устойчивости при лимфопролиферативных заболеваниях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль транспортных белков и ферментов метаболизма ксенобиотиков в формировании лекарственной устойчивости при лимфопролиферативных заболеваниях"

На правах рукописи

Воронцова Елена Владимировна

РОЛЬ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ И ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТИКОВ В ФОРМИРОВАНИИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПРИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Гришанова А.Ю. Научный консультант:

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Ляхович В.В.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Вавилин В.А. кандидат медицинских наук Казначеев К. С.

Ведущая организация:

Институт Цитологии и Генетики СО РАН (Новосибирск)

Защита состоится "_"_2004 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 001.034.01 в Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 2; тел.: 8-3832-33-54-81).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН

Автореферат разослан "_"_2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Г.С.Русских

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - это устойчивость клеток опухоли к целому ряду химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия (Roninson I.B. et al., 1986 Ставровская А.А., 2002). Феномен лекарственной устойчивости достаточно хорошо продемонстрирован и изучен на опухолевых клеточных линиях (Riordan J.R. et al., 1985; Shen D.W. et al., 1986), однако клинические исследования лекарственной устойчивости опухоли выявили ряд проблем, одной из которых является большое количество механизмов, лежащих в ее основе (Chan H.S. et al., 1991; Finnegan M.C. et al., 1995; Ribrag V., et al, 1996; Zhan Z. et al., 1997; Webb M. et al., 1998; Filipits M. et al., 2000; Concoli U. et al., 2002).

В последние годы выявляется все больше новых белков, которые могут способствовать устойчивости опухолевых клеток к химиотерапии. Транспортные белки семейства ABC насчитывают в настоящее время 49 членов, и для десяти из них уже показано участие в формировании устойчивости клеток к химиопрепаратам (Dean, M. et al., 2001). Наиболее изученными представителями этого семейства являются Р-гликопротеин (Р-gp) и MRP1. Исследования экспрессии разных транспортных белков семейства ABC в различных опухолях продемонстрировали, что в одной и той же опухоли могут экспрессироваться одновременно несколько ABC транспортеров, а также возможна экспрессия одного из них. Нередко гиперэкспрессию генов, связанных с лекарственной устойчивостью, обнаруживают в нелеченных опухолях; это чаще всего связано с типом клеток, из которых происходят данные новообразования. Однако обычно число случаев с гиперэкспрессией генов, связанных с лекарственной устойчивостью, возрастает после проведения курсов лечения. Множественная миелома является одним из примеров заболевания, при котором лекарственная устойчивость, связанная с Р-гликопротеином, возникает в результате лечения (Marie J.P. et al., 1996).

Помимо функционирования транспортеров семейства ABC, множественная лекарственная устойчивость может возникать и в результате работы детоксикационных систем, метаболизирующих лекарственные препараты в клетке.

I, lOQ/l) R "НГТНОГТП, т и о H РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ[

БИБЛИОТЕКА

S*g№fv i

S-трансферазы могут участвовать в формировании множественной лекарственной устойчивости у больных острым и хроническим миелолейкозом (Beck J. et al., 1996). О роли ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков цитохромов Р450 в формировании лекарственной устойчивости у онкологических больных сведений пока нет. Между тем, такие противоопухолевые препараты, как винка алкалоиды, циклофосфамид, таксол являются субстратами одной из форм Р450 -CYP3A4 (Yu L. et al., 1996).

Помимо множественности механизмов, статус лекарственной устойчивости опухоли может варьировать в зависимости от генотипа индивидуума. Полиморфизм генов имеет прямое отношение к различной чувствительности разных индивидуумов к широкому кругу лекарственных препаратов. В последнее время активно обсуждается необходимость индивидуального подбора дозировок и комбинаций противоопухолевых лекарств. Поэтому выявление полиморфизма и его влияние на функцию генов, связанных с лекарственной устойчивостью, также является необходимым для определения статуса лекарственной устойчивости опухоли.

Выбор оптимального метода, применимого для адекватной диагностики статуса лекарственной устойчивости опухоли, является еще одной проблемой для клинической онкологии. Разнообразие методов дегекции генов/белков лекарственной устойчивости: иммуногистохимия, функциональные тесты, проточная цитофлюориметрия, методы определения мРНК, а также отсутствие стандартизации в рамках каждого метода затрудняют интерпретацию результатов, полученных в различных лабораториях. Кроме того, для некоторых онкологических заболеваний нет четких клинических критериев лекарственной устойчивости, что затрудняет сравнение результатов, полученных разными исследователями. Помимо этого, в клинических образцах не выявляется увеличения уровня экспрессии генов, связанных с множественной лекарственной устойчивостью, сравнимого с уровнем, продемонстрированным in vitro. Поэтому, несмотря на многочисленные исследования, ответ на вопрос о выборе метода, применимого для диагностической процедуры определения статуса лекарственной устойчивости опухоли, остается неоднозначным.

Множественность механизмов лекарственной устойчивости и разнообразие способов детекции значительно затрудняют как диагностику причин устойчивости больных к терапии, так и выработку подходов по преодолению множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Это определяет необходимость дальнейшего исследования роли различных механизмов в возникновении лекарственной устойчивости опухолей, в том числе, при различных онкогематологических заболеваниях. Больные лимфопролиферативными заболеваниями, в частности, хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами

обычно достигают ремиссии после одного-двух курсов терапии, но с очень высокой степенью рецидивов. Несмотря на многочисленные исследования в этой области, статус множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток при лимфопролиферативных заболеваниях оценен недостаточно для выработки правильной стратегии терапии.

Целью настоящей работы является исследование взаимосвязи уровня экспрессии, функциональной активности и полиморфизма транспортных белков и ферментов метаболизма ксенобиотиков с формированием лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить уровень мРНК генов транспортных белков: MDR1 и MRP1 в лимфатических узлах, костном мозге и лимфоцитах периферической крови и функциональной активности P-gp (продукта гена MDR1) в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями и оценить связь с результатом химиотерапии.

2. Определить уровень мРНК генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTPI и CYP3A4 в лимфатических узлах, костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями и оценить связь с результатом химиотерапии.

3. Исследовать взаимосвязь полиморфизма гена GSTPI A/G3'J с результатом химиотерапии у больных лимфопролифератавными заболеваниями.

4. Определить уровень мРНК Торо II в лимфатических узлах, костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Научная новизна. Проведенные исследования уровня мРНК CYP3A4 впервые показали, что СУРЗА4 участвует в формировании лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями: лекарственная устойчивость формируется у тех больных, у которых наблюдается высокий уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге.

Впервые проведенное исследование полиморфизма GSTPI A/G3b у больных продемонстрировало, что полиморфные варианты гена не являются предрасполагающим фактором к развитию лимфопролиферативных заболеваний, но полиморфизм гена

влияет на результат химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями: лекарственная устойчивость чаще возникает у больных, имеющих замену A/G313 в гене GSTPI.

Выявлено увеличение уровня мРНК MRP1 в лимфатических узлах больных неходжкинскими лимфомами с рецидивами этого заболевания.

Среди больных лимфопролиферативными заболеваниями, исследованных до химиотерапии, высокая функциональная активность Р-gp является прогностическим фактором формирования лекарственной устойчивости к последующей химиотерапии.

Практическая значимость работы. По своему содержанию работа носит фундаментально-прикладной характер и представляет собой исследование роли ферментов транспорта и метаболизма ксенобиотиков у больных лимфопролиферативными заболеваниями в формировании лекарственной устойчивости.

Выявление статуса лекарственной устойчивости опухоли может помочь оптимизировать химиотерапию и снизить токсическое воздействие цитостатиков на нормальные ткани больного, а также дает возможность использовать в терапии опухоли специфические ингибиторы к белкам лекарственной устойчивости.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Прогрессия опухоли у больных лимфопролиферативными заболеваниями сопровождается увеличением уровня мРНК генов Topo II. MRP1, GSTP1.

2. Полиморфные варианты гена GSTP1 А/G313 не являются предрасполагающим фактором к развитию лимфопролиферативных заболеваний. Полиморфизм гена GSTP1 A/G313 влияет на терапевтический ответ у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

3. Уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге повышен у больных, устойчивых к химиотерапии, исследованных на фоне лечения.

4. Высокая функциональная активность P-gp, исследованная до начала химиотерапии в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями, является прогностическим фактором возникновения лекарственной устойчивости к последующей химиотерапии.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых «Терапия и фундаментальные науки — перспективы содружества в новом тысячелетии», Новосибирск, 2001; на сателлитном международном симпозиуме "Новые технологии в медицине и биологии третьего тысячелетия" 1-го международного

мультидисциплинарного симпозиума "Стресс и экстремальные состояния", Кара-Даг (Феодосия, Крым, Украина), 2002; на Ш Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004.

Публикации. По материалам диссертации имеется 20 печатных работ.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 19 таблиц и 15 рисунков и состоит из 6-ти разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 231 ссылку.

Основное содержание работы

Описание клинического материала. Работа выполнена на образцах клинического материала - крови, костном мозге, лимфоцитах периферической крови и биоптатах лимфатических узлов. Пациенты наблюдались в гематологическом кабинете Новосибирской областной консультативной поликлиники и проходили лечение в отделении гематологии Государственной Новосибирской областной клинической больницы с 1988 по 2002 гг. Исследовано 255 больных, из них 56 больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 121 больной неходжкинскими лимфомами (НХЛ) и 16 больных лимфогранулематозом (ЛГМ). Контрольная группа включала 62 человека, не имеющих онкологических заболеваний. Процентный состав клеток крови и костного мозга определялся в клинической лаборатории областной клинической больницы. Лечение больных проводилось по протоколам, которые включали следующие препараты: циклофосфамид, лейкеран, адриамицин, онковин, винкристин, преднизолон. Эффективность химиотерапии оценивалась через 6 месяцев после установления диагноза и начала лечения. Наличие ответа на лечение определялось при полной или частичной клинико-гематологической ремиссии у больных НХЛ и ХЛЛ и в случае стабилизации у больных ХЛЛ. Отсутствие ответа на лечение определялось при прогрессировании заболевания или в случае смерти больного.

Методы. Для определения уровня мРНК MDR1, MRP1, GSTP1, Торо Ц и CYP3A4 использовали метод полуколичественной обратно -транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР). Суммарную РНК выделяли гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной экстракцией (Chomczynski et al, 1987). Реакцию обратной транскрипции проводили в конечном объеме 30 мкл с использованием обратной транскриптазы MoMLV RT RNAse H Minus («Биосан», Новосибирск) и 30 единиц ингибитора рибонуклеаз (ООО «Лаборатория Медиген», Новосибирск). Для проведения полимеразно-цепной реакции использовали праймеры специфичные для (3-актина, MDR1, MRP1, GSTP1. Торо II и CYP3A4, синтезированные в «Biosset» (Новосибирск). Продукты ПЦР анализировали

в 1,8 % агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием. Сканирование геля проводили в УФ свете с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва) и денситометрировали с помощью программы "Total Lab". Величину экспрессии каждого гена представляли как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы исследуемого гена к интенсивности Р-актин-специфической полосы.

Анализ функциональной активности P-gp проводили на проточном цитофлюориметре FACS Calibur фирмы «Becton Dickinson». Активность Р-gp оценивали по выбросу родамина 123 и определяли как отношение геометрических средних флюоресценции родамина 123 в присутствии ингибитора - верапамила и без него (Е).

Полиморфизм GSTP1 в 105 кодоне определялся методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с использованием праймеров, описанных в работе (Harries L.W. et al., 1997). Амплификационный фрагмент (176 пар нуклеотидов) подвергался последующей рестрикции фермнтом BsoMA 1 ("Сибэнзим", Новосибирск). Этот анализ позволяет различить гомозиготу для Ие105, гетерозиготу Пе105 /Vall05, гомозиготу Vall05/ Vall05.

Для оценки достоверности различий между выборками по экспрессии генов Торо II, MDR1, MRP1, GSTPI, и CYP3A4 и функциональной активности P-gp использовались критерии Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова (STATISTICA, версия 5). Об ассоциации разных генотипов GSTPI с заболеванием (или эффектом от лечения) судили по величине отношения шансов (ОШ) (Pearse N.,1993; Флечер Р. и др., 1998), Достоверность различий оценивалась по критерию х2 (Ли Ч., 1978) или двустороннему точному критерию Фишера (для п<5) с использованием программы Epilnfo 6.

Результаты и обсуждение

Уровень мРНК MDR1, MRPI, GSTP1, Торо II в лимфатических узлах больных лимфопролиферативными заболеваниями. Уровень мРНК Торо II, MDRI, MRPI, GSTPI был определен в лимфоузлах опухолевого (НХЛ и ЛГМ) и неопухолевого (реактивные гиперплазии) происхождения. Достоверных различий по уровню экспрессии исследованных генов между этими группами больных не обнаружено. Уровень мРНК MRPI у больных НХЛ на фоне химиотерапии был выше по сравнению с больными, исследуемыми до химиотерапии (таблица 1). Показатели экспрессии генов MDRI, GSTPI и Торо II достоверно не различалась в этих группах больных. Уровень мРНК MRPI у больных НХЛ (таблица 2), был ниже в группах с низкой и промежуточной степенью злокачественности по сравнению с группой с высокой степенью злокачественности. Таким образом, представленные данные

демонстрируют, что из всех исследуемых генов, лишь MRP1 участвует в формировании лекарственной устойчивости у больных с рецидивами НХЛ.

Таблица 1

Уровень мРНК MDR1, MRP1, GSTPJ и Торо II в группах больных НХЛ до

Группы больных НХЛ Показатели экспрессии генов МЛУ (мРНК гена МЛУ/мРНК гена Р-актина)

Topo 11 MDR1 MRP1 GSTP1

До химиотерапии, п=12 0.37±0.10 0.02±0 01 0.0810.02 0.1410.07

На фоне химиотерапии, п=8 0.33±0.10 0.04+0.01 0 44±0.14* 0.23Ю.08

* - р<0,05 по сравнению с больными до химиотерапии.

Таблица 2

Уровень мРНК MDR1, MRPI, GSTPI и Торо II при НХЛ различной степени

Группы больных НХЛ со степенью злокачественности Показатели экспрессии генов МЛУ (мРНК гена МЛУ/мРНК гена Р-актина)

Topo 11 MDR1 MRPI GSTP1

Высокой, п=5 0.48Ю.16 0.03Ю01 0.52+0 02 0.20+0.11

Промежуточной, п=6 0.52Ю.16 0.04+0 02 0.09Ю.03 * 0.16Ю 08

Низкой, п=9 0.1710.05 0,0110.007 0.16Ю 08 ** 0 23+0.10

* - р<0,05, ** - р<О,ОЗ - достоверные различия по сравнению с НХЛ с высокой степенью злокачественности.

Уровень мРНК MDR1, MRPI, GSTP1, Торо //и CYP3A4 в костном

мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями. В 69 образцах костного мозга больных НХЛ и ХЛЛ была определена экспрессия генов: MDRI, MRPI, Торо II, GSTPI и CYP3A4. Для того, чтобы выяснить, как экспрессия исследуемых генов зависит от состава костного мозга и оценить связь с прогрессией опухоли, все больные были разделены на четыре группы согласно двум критериям: количество лимфоцитов в костном мозге и наличие или отсутствие химиотерапии на момент исследования. Больные, исследуемые до химиотерапии (первичные), были

разделены на 2 группы: с интактным костным мозгом и с костным мозгом с повышенным количеством лимфоцитов (группы 1 и 3). При этом в группу 1 были дополнительно включены больные ЛГМ (n=8). Аналогично были выделены группы у больных на фоне химиотерапии (вторичные): с нормальным (группа 2) и с повышенным (группа 4) содержанием лимфоцитов в костном мозге. На рисунке 1 представлен уровень мРНК MDR1, MRP1, GSTP1 и CYP3A4 в этих группах. Выявлены различия в уровне мРНК MDR1 между больными до и на фоне химиотерапии для групп с повышенным количеством лимфоцитов. Изменение уровня мРНК MDRI в процессе химиотерапии может быть как результатом положительной селекции небольшой популяции клеток с более высоким уровнем экспрессии генов лекарственной устойчивости, так и возможной индукцией экспрессии МЛУ-генов препаратами, использующимися для лечения. Однако не выявлено увеличения уровня мРНК у больных с интактным костным мозгом, которые также прошли курс химиотерапии, поэтому наиболее вероятной является селекция клеток с более высоким уровнем экспрессии MDR1. Однако имеются работы, где у больных ХЛЛ и НХЛ показано увеличение экспрессии MDR1 при лечении препаратами, субстратами P-gp, винкристином и доксорубицином (Friedenberg W.R. et al., 1999, Webb M. et al., 1998).

Анализ мРНК MRP1 в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями показал, что мРНК MRP1 достоверно ниже в группе с интактным костным мозгом относительно групп больных с повышенным содержанием лимфоцитов. Известно, что мРНК MRP1 в ниже чем в других, более зрелых субпопуляциях

костного мозга (Legrand О. et al., 1996). Поэтому вполне закономерно, что увеличение содержания лимфоцитов в костном мозге приводит к увеличению мРНК MRP1. В костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями мРНК GSTP1 изменялась лишь с прогрессией опухоли. В группах больных с повышенным количеством лимфоцитов в костном мозге уровень мРНК GSTP1 был достоверно выше, чем в группах больных с нормальной миелограммой. Увеличение мРНК GSTP1, связанное с опухолевой прогрессией, может вносить вклад в формирование лекарственной усойчивости, но ассоциации экспрессии GSTP1 с эффектом от химиотерапии не выявлено.

MDR1 mrpi

p<0.025 jxO.OOl

1 2 3 4 1 2.3 4

1 2 3 4 1 2 3 4

Рисунок 1. Уровень мРНК MDR1, MRP1, GSTP1 и CYP3A4 в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями: по оси X - группы больных:

1 -до химиотерапии с интактным костным мозгом;

2 — на фоне химиотерапии с интактным костным мозгом;

3 -до химиотерапии с повышенным содержанием лимфоцитов в костном мозге;

4 - на фоне химиотерапии с повышенным содержанием лимфоцитов в костном мозге;

по оси Y - уровень мРНК, выраженный в относительных единицах (отношение интенсивности окрашивания специфической полосы каждого гена к интенсивности Р-актин-специфической полосы)-

Наличие мРНК CYP3A4 в костном мозге (Hodges V.M. et al., 2000), в лимфоцитах (Raucy Y.L. et al., 1999, Nagai F. et al., 2002), нейтрофилах (Janardan S.K. et al., 1996) позволяет, предположить участие, этого цитохрома в защите клеток крови от ксенобиотиков. Был исследован уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге больных лимфопролиферативными

заболеваниями. Полученные нами данные демонстрируют, что уровень мРНК CYP3A4 выше в группе леченых больных с повышенным количеством лимфоцитов по сравнению с нелеченными, а также с группой больных, имеющих нормальную миелограмму. Увеличение уровня мРНК CYP3A4 в нормальных клетках костного мозга способствовало бы защите их от токсичности химиопрепаратов. Однако увеличение мРНК CYP3A4 для опухолевых клеток может приводить к формированию лекарственной устойчивости.

Таблица 3

Уровень мРНК MDR1, MRPI, GSTP1, Торо II и CYP3A4 в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями и связь с эффектом от

лечения (М±т)

Показатели экспрессии генов МЛУ (мРНК гена МЛУ/мРНК гена 3-актина)

MDRI MRP1 GSTPi Topo II CYP3A4

Первичные

Чувствительные к химиотерапии ' N=7 0,19+0,06 0,49+017 0,77+0,1 0,60±0,14 0,07+0,04

Устойчивые к химиотерапии 18 0,27±0,06 0,72+0,11 0,76±0,09 0.97+0,12 0,09±0,02

Вторичные

Чувствительные к химиотерапии N=7 0,35±0,14 0.82+0,19 0,68+0,15 1,01±0,21 0,06+0,03

Устойчивые к химиотерапии N=21 0,49+0,09 0,76+0,12 0,70±0,0S 0,62±0,10 0,18+0,04 *

*р<0,025 по сравнению с группой вторичных больных чувствительных к химиотерапии.

Чтобы оценить роль исследуемых генов в формировании лекарственной устойчивости, исследовалась связь экспрессии исследуемых генов в группе больных до и на фоне химиотерапии с эффектом от лечения (таблица 3). Выявлено, что у больных на фоне химиотерапии уровень мРНК CYP3A4 выше у устойчивых больных, по сравнению с чувствительными. Это может свидетельствовать в пользу того, что CYP3A4 участвует в формировании лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями. А уровень мРНК MDRI, MRP1, GSTP1 и Торо II в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями связан с прогрессией опухоли и не является показателем

прогноза устойчивости к химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Функциональная активность P-gp в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями. В лимфоцитах 40 больных НХЛ и ХЛЛ и 13 человек контрольной группы была определена функциональная активность P-gp. Анализ функциональной активности P-gp в нашей работе выявил, что у больных на фоне химиотерапии функциональная активность была достоверно ниже, чем в контроле, и недостоверным это снижение было по сравнению с первичными больными. Наши результаты подтверждают данные, полученные в работе (Grulois I. et al., 1995), где показано снижение функциональной активности P-gp у больных ХЛЛ по сравнению с контролем. Однако в исследованиях (Concoli U. et al., 2002) у больных ХЛЛ продемонстрировано, что увеличение функциональной активности P-gp связано с прогрессией заболевания и лечением. Кроме того, на функциональную активность P-gp могут влиять и другие факторы, такие как CD-фенотип клеток (Coon J.S. et al., 1991; Ludescher C. et al., 1998). Наиболее высокая активность показана в CD56 клетках (натуральных киллерах) (Klimecki W.T. et al., 1994). Исследуемые нами группы больных состояли преимущественно из больных НХЛ, у которых не определялся CD фенотип.

Рисунок 2. Функциональная активность P-gp (Е^и) в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями до и на фоне химиотерапии, а также в контрольной группе.

При анализе связи активности P-gp с эффектом от лечения продемонстрировано, что среди больных, исследованных до химиотерапии, функциональная активность P-gp была выше у тех больных, которые были устойчивы к химиотерапии, по сравнению с больными, чувствительными к химиотерапии. Среди больных, исследованных на фоне химиотерапии,

подобных различий не выявлено. Также следует отметить, что среди больных, не имеющих ответа на лечение, функциональная активность P-gp была выше у нелеченных больных, по сравнению с больными на фоне химиотерапии. Высокая функциональная активность P-gp у нелеченных больных может быть следствием его физиологической функции, заключающейся в транспорте цитокинов. В опухолевой клетке P-gp может вовлекаться в транспорт цитокинов, необходимый для аутокринных механизмов клеточного роста или выживаемости, и способствовать тем самым повышению его экспрессии. Отсутствие эффекта у леченых больных с низким уровнем P-gp активности может объясняться вовлечением других механизмов лекарственной устойчивости.

Рисунок 3. Функциональная активность Р-§р (Е^щ) в группах больных лимфопролиферативными заболеваниями до и на фоне химиотерапии в зависимости от эффекта от лечения (в группах чувствительных и устойчивых к химиотерапии (XT)).

Полиморфизм GSTP1 А/G - у больных

лимфопролиферативными заболеваниями. Интерес к исследованию глутатион S-трансфераз у больных лимфопролиферативными заболеваниями связан с тем, что при их лечении используются препараты, которые являются субстратами для глутатион S-трансфераз: алкилирующие агенты (Tew K.D. 1994), доксорубицин (Harbottle A. et al., 2001).

Таблица 4

Распределение полиморфных вариантов гена 08ТР1 в группе контроля и в группе больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Таблица 5

Распределение полиморфных вариантов гена 08ТР1 в группе больных лимфопролиферативными заболеваниями в зависимоети от эффекта от

лечения.

ПеЛ1е 11еЛ/а1 + Уа1Л/а1 ОШ Р

Устойчивые к химиотерапии 29 26 2,79 0,1

Чувствительные к химиотерапии 6 45

Таблица 6

Уровень мРНК 08ТР1 в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями до и на фоне химиотерапии в зависимости от полиморфных _вариантов гена GSTP1_

Группы больных Геноти пы С8ТР1 п Уровень мРНК 08ТР1 (М±ш) Чув. к ХТ Уст. к ХТ ОШ

До химиотерапии 11е/11е 12 0,34±0,09

Ие/Уа1; Уа1/Уа! 5 0,58±0,09

На фоне химиотерапии Не/Не 9 0,85±0,15 * 7 2 8,17; Р<0,51

Пе/Уа1; Уа1/Уа1 10 0,68±0,12 3 7

Р<0,03 достоверные различия экспрессии мРНК GSTP1 между группами первичных и вторичных больных с генотипом Не/Не.

Исследование полиморфизма гена GSTP1 A/G313 (с заменой Не на Val в 105 кодоне) проводилось в 2-х направлениях: изучалась предрасположенность индивидуумов с различными полиморфными вариантами IlelO5Val GSTPI к возникновению лимфопролиферативных заболеваний и эффективность лечения больных с различными полиморфными вариантами IlelO5Val GSTP1.

Распределение полиморфных вариантов гена GSTPI в группе без онкопатологии и в группе больных представлено в таблице 4. Ни один из полиморфизмов гена GSTPI A/G313 не ассоциируется с развитием данного заболевания

Полиморфизм GSTPI гена может играть важную роль не только при возникновении заболевания, но и быть значимым при лечении опухолей. Однако в нашей работе не было выявлено связи полиморфных вариантов Ilel05Val GSTPI гена с эффектом от лечения у больных лимфопролиферативньши заболеваниями (таблица 5).

Далее мы проанализировали взаимосвязь уровня мРНК GSTP1 в костном мозге у больных с различными полиморфными вариантами Не 105Val GSTPI с ответом на лечение (таблица 6). Для варианта Не 105Не уровень мРНК GSTP1 гена выше у больных на фоне химиотерапии, по сравнению с больными до химиотерапии, но у больных с Val аллелем в генотипе различий нет. Несмотря на увеличение уровня мРНК, у леченых больных с генотипом Ие105№, чувствительных к химиотерапии было больше, чем в группе больных с наличием Val аллеля. Таким образом, вклад GSTPI в формирование лекарственной устойчивости определяется не только уровнем экспрессии гена, но и может быть связан с полиморфным вариантом.

Представленные данные свидетельствуют о том, что, во-первых, высокий уровень мРНК не всегда может быть связан с возникновением лекарственной устойчивости, во-вторых, в формировании лекарственной устойчивости могут участвовать, кроме широко изучаемых MDR1, MRPJ, GSTP1, еще и CYP3A4, и, в-третьих, наряду с исследованием мРНК и белка, необходимо изучение полиморфизма генов, вовлеченных в фармакокинетику химиопрепаратов.

выводы

1. Увеличение уровня мРНК MDR1, MRPI, GSTP1 и TopoII в костном мозге больных хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами и мРНК MRP1 в лимфатических узлах больных неходжкинскими лимфомами связано с прогрессией опухоли.

2. Уровень мРНК MDR1, MRPI, GSTP1 и Торо Л в лимфатических узлах, костном мозге и MDR1 в периферической крови не является показателем для прогноза устойчивости к химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями: хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами.

3. Высокая функциональная активность P-gp в .лимфоцитах нелеченных больных лимфопролиферативными заболеваниями коррелирует с лекарственной устойчивостью к последующей химиотерапии.

4. Высокий уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге больных хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами, исследуемых на фоне химиотерапии связан с формированием лекарственной устойчивости.

5. Замена A/G313 в гене GSTP1 ассоциирован с формированием лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями: хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Мухин О.В., Домникова Н.П. Экспрессия генов лекарственной резистентности в лимфатических узлах различной этиологии. // Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии. Материалы международного симпозиума. - Сб. тез. - Новосибирск. - 2000. - С.ЗЗО.

2. Safina A.F., Vorontsova E.V., Grishanova A.Y. Expression of cytochrome P450 forms in human lymph nodes. // Abstracts International Workshop "From sequence to function: esperimetal and bioinformatics stadies of cytochrome P450 superfamily". - Moscow. - 2000. - P.71.

3. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости в клетках лимфатических узлов при лимфомах. // Бюлл. эксп. биол.мед. - 2001. - Приложение 1. - С.78-80.

4. Воронцова Е.В. Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости цитохрома Р4503А4 в костном мозге больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями. // Сибирский конкурс молодых ученых «Терапия и фундаментальные науки -

перспективы содружества в новом тысячелетии». - Сб. докладов. -2001. - Новосибирск. - С.145-150.

5. Vorontsova E.V., Grishanova A.Y., Gulyaeva L.F., Muhin O.V., Domnikova N.P. Expression of CYP3A4 and MDR-related genes in bone marrow samples from patients with chronic lymphocytic leukaemia. // Drug Metabolism Reviews. - 2001. - V.33 (1). - P. 159.

6. Домникова Н.П., Мухин О.В., Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Ляхович В.В. Прогностическое значение экспрессии генов лекарственной устойчивости при неходжкинских лимфомах. // VII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». — Тез. докл. - Москва. - 2001. - С. 296.

7. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Горева О.Б., Сафронова О.Г., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Полиморфизм гена GSTP1 у больных хроническими лимфопролиферативными заболеваниями: оценка связи с экспрессией GSTn и лекарственной устойчивостью. // Бюлл. эксп. биол.мед.-2002-Прил.1.-С.65-67

8. Grishanova A.Yu., Vorontsova E.V., Goreva O.B., Lyakhovich V.V. GSTP1 gene polymorphism and expression in patients with lymphoproliferative disease: relation to drug resistance. // 17th Meeting of Europe Association for Cancer Research, 8-11 June, 2002, Granada, Spain. Abstr. N 460.

9. Grishanova A.Yu., Vorontsova E.V., Goreva O.B., Lyakhovich V.V. GSTP1 gene polymorphism and expression in patients with lymphoproliferative disease: relation to drug resistance. // 18th International Cancer Congress, 30 June-5 July 2002, Oslo, Norway, Abstr. N 854.

10. Goreva O., Grishanova A., Vorontsova E., Lyakhovich V. GSTP1 gene polymorphism and expression in patients with non-Hodgkin's lymphoma and chronic lymphocytic leukaemia: relation to drug resistance. // European Scientific Conference: Understanding the Genome: Scientific Progress and Microarray Technology, November 29 - December 1 2002, Genova, Italy.

11. Мухин О.В., Домникова Н.П., Воронцова Е.В. и др. Влияние гиперэкспрессии маркеров множественной лекарственной устойчивости на эффективность терапии агрессивных неходжкинских лимфом. // Новые методы диагностики, лечения' заболеваний и управления в медицине. - Новосибирск. - 2002. — С. 42-43.

12. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости и цитохрома Р-4503А4 в костном мозге больных хроническим лимфолейкозом. // Бюлл. эксп. биол.мед. - 2002. -Приложение 1. - С.58-59.

13. Grishanova A.Y., Vorontsova E.V., Goreva О., Lyakhovich V.V GSTP1 gene polymorphism and expression in patients with lymphoproliferative disease: relation to drug resistance. // International J. Cancer. - 2002. -Suppll3.-P.403-404.

14. E.V.Vorontsova, A.Y. Grishanova, V.V. Lyakhovich. Expression of MDR1, MRP, GST-pi and topoisomerase II genes in non-Hodgkin's lymphomas. // Ann Oncol. -2002. - V.13 Suppl 2. - P.l-204. Abstr. 345

15. Goreva O., Grishanova A., Vorontsova E.,' Lyakhovich V. Genetic polymorphism of glutathione S-transferase PI and sensitivity to chemotherapy of patient with lymphoid maiignances. // 37thAnnual Scientific Meeting: European society for clinical investigation. / The pathophysiology of diseases: from bench to bedside. - 2-5 April, 2003. - Verona, Italy.

16. Домникова Н.П., Мухин О.В., Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Ляхович В.В. Факторы прогноза при агрессивных неходжкинских лимфомах. // Новые методы диагностики, лечения заболеваний и управления в медицине. - Новосибирск. - 2003. - С. 22-25.

17. Домникова Н.П., Мухин О.В., Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Ляхович В.В. Клинико-лабораторные признаки заболевания и экспрессия MDR1 в клетках костного мозга как факторы прогноза при агрессивных неходжкинских лимфомах. // Проблемы гематологии и переливания крови. - 2003. -№2. - С. 38.

18. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Мельникова Е.В., Мухин О.В., Домникова Н.П., Ляхович В.В. Функциональная активность Р-гликопротеина в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями. // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2003. - Т. 136, № 11. - С.547-549.

19. Домникова Н.П., Мухин О.В., Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Ляхович В.В. Клинические факторы прогноза и феномен множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) при хроническом лимфолейкозе и неходжкинских лимфомах низкой степени злокачественности. // Abstracts of Russian-Norwegian conference in hematology. - Saint-Petersburg. - 2003. - С 75-77.

20. Воронцова Е.В., Гришанова А.Ю., Мельникова Е.В., Мухин О.В., Домникова Н.П. Флюоресценция родамина 123 и уровень экспрессии мРНК гена MDR1 в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями. // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. III конференция молодых ученых с международным участием. Сб. тезисов. - Москва. - 2004. - С. 72-73.

Соискатель Воронцова Е.В.

Список используемых сокращений:

ЛГМ - лимфогранулематоз

ЛУ - лекарственная устойчивость

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

мРНК-матричная рибонуклеиновая кислота

НХЛ - неходжкинские лимфомы

ОТ-ПЦР - обратно-транскриптазная полимеразно-цепная реакция

ОШ - отношение шансов

ХЛЛ - хронический лимфолейкоз

ABC - семейство АТФ связывающих белков

CYP3A4 - цитохром Р450 ЗА4

GST - глутатион^-трансфераза

MDR1 - ген, кодирующий Р-гликопротеин

MRP1 - ген, кодирующий белок, ассоциированный с МЛУ

MRP1 - белок, ассоциированный с МЛУ

P-gp - Р-гликопротеин

Торо II - ген, кодирующий топоизомеразу II

Автор благодорит зав. гематологического отделения с блоком асептических палат для трансплантации костного мозга Новосибирской обласной клинической больницы Мухина Олега Викторовича и д.м.н., проф. НМГА Домникову Наталью Петровну за предоставление клинического материала.

*11749

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Воронцова, Елена Владимировна

Введение.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Возникновение лекарственной устойчивости опухолевых клеток.

1.2. Основные классы противоопухолевых препаратов и механизм их действия.

1.3. Основные механизмы лекарственной устойчивости.

1.3.1. Транспортертные белки семейства ABC, осуществляющие выброс лекарств из клетки.

1.3.1.1. Р-гликопротеин.

1.3.1.2. MRP.

1.3.2. Топоизомеразы и лекарственная устойчивость к их ингибиторам.

1.4. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков.

1.4.1. Основной фермент метаболизма лекарств - P450CYP3A4.

1.4.2. Семейство глутатион-Б-трансфераз.

1.4.2.1. Свойства глутатион-Б-трансфераз.

1.4.2.2. Классификация глутатион-Б-трансфераз.

1.5. Р-гликопротеин и Р4503А4 - совместная функция в распределении ^ лекарств.

1.6. Лимфопролиферативные заболевания.

1.6.1. Классификация и клиникахонического лимфолейкоза.

1.6.2. Классификация и клиника неходжкинских лимфом.

1.7. Исследование лекарственной устойчивости при лимфопролиферативных заболеваниях.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Описание клинического материала.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Выделение суммарной РНК.

2.2.2. Обратнотранскриптазная полимеразно-цепная реакция.

2.2.3. Определение функциональной активности P-gp.

2.2.3. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

2.2.5. Статистическая обработка.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Уровень мРНК Торо II, MDR1, MRP1, GSTP1 в лимфатических узлах больных лимфопролиферативными заболеваниями.

3.2. Уровень мРНК Торо II, MDR1, MRP1, GSTP1 и CYP3A4 в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями.^

3.3. Связь уровня мРНК MDR1, MRP1, GSTP1, Торо II и CYP3A4 с эффектом от лечения.

3.4. Уровень мРНК генов MDR1, GSTP1 в лимфоцитах периферической крови больных лимфопролиферативными заболеваниями.^

3.5. Функциональная активность P-gp и уровень мРНК MDR1 в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями.

3.6. Функциональная активность P-gp в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями.

3.7. Полиморфизм GSTP1 у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Уровень мРНК MDR1, MRP1 и GSTP1 в лимфатических узлах больных неходжкинскими лимфомами.

4.2. Уровень мРНК MDR1, MRP1, GSTP1 и CYP3A4 в костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями.

4.3. Функциональная активность P-gp и уровень мРНК MDR1 в лимфоцитах больных лимфопролиферативными заболеваниями.

4.4. Полиморфизм GSTP1 A/G313 у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

4.5. Участие топоизомеразы II в формировании лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль транспортных белков и ферментов метаболизма ксенобиотиков в формировании лекарственной устойчивости при лимфопролиферативных заболеваниях"

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) - это устойчивость клеток опухоли к целому ряду химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия (Roninson I.B. et al., 1986 Ставровская А.А., 2002). Феномен лекарственной устойчивости достаточно хорошо продемонстрирован и изучен на опухолевых клеточных линиях (Riordan J.R., 1985 Shen D.W., 1986;), однако клинические исследования лекарственной устойчивости опухоли выявили ряд проблем, одной из которых является большое количество механизмов, лежащих в ее основе (Chan H.S., 1991; Finnegan М.С. et al., 1995; Ribrag V., et al, 1996; Zhan Z. et al., 1997; Webb M., et al., 1998; Filipits M. et al., 2000; Concoli U. et al., 2002).

В последние годы выявляется все больше новых белков, которые могут определять устойчивость опухоли к химиотерапии. Транспортные белки семейства ABC насчитывают в настоящее время 49 членов, и для десяти из них уже показано участие в формировании лекарственной устойчивости. (Dean, М. et al., 2001). Наиболее изученными представителями этого семейства являются Р-гликопротеин (P-gp) и MRP1. Исследования экспрессии разных транспортных белков семейства ABC в различных опухолях продемонстрировали, что в одной и той же опухоли могут экспрессироваться одновременно несколько ABC транспортеров, а также возможна экспрессия одного из них. Нередко гиперэкспрессию генов, связанных с лекарственной устойчивостью, обнаруживают в нелеченных опухолях: это чаще всего связано с типом клеток, из которых происходят данные новообразования. Однако обычно число случаев с гиперэкспрессией генов, связанных с лекарственной устойчивостью, возрастает после проведения курсов лечения. Множественная миелома является одним из примеров заболевания, при котором лекарственная устойчивость, связанная с Р-гликопротеином, возникает в результате лечения (Marie J.P. et al., 1996).

Помимо функционирования транспортеров семейства АБС, множественная лекарственная устойчивость может возникать и в результате работы детоксикационных систем, метаболизирующих лекарственные препараты в клетке.

Показано участие в лекарственной устойчивости глутатион S-трансфераз (GST), ферментов II фазы биотрансформации ксенобиотиков. Многие противоопухолевые препараты, такие как алкилирующие агенты и антрациклины (Black S.M. et al., 1990, Harbottle A. et al., 2001), препараты платины (Goto S. et al., 1999) являются субстратами для GST и влияют на лекарственную устойчивость при лечении онкологических заболеваний цитостатическими препаратами (Tew K.D., 1994). В частности, глутатион S-трансферазы могут участвовать в формировании множественной лекарственной устойчивости у больных острым и хроническим миелолейкозом (Beck J. et al., 1996). О роли ферментов I фазы метаболизма ксенобиотиков цитохромов Р450 в формировании лекарственной устойчивости у онкологических больных сведений пока нет. Между тем, такие противоопухолевые препараты, как винка алкалоиды, циклофосфамид, таксол являются субстратами одной из форм Р450 - CYP3A4 (Yu L. et al., 1996).

Выбор оптимального метода, применимого для адекватной диагностики статуса лекарственной устойчивости опухоли, является еще одной проблемой для клинической онкологии. Разнообразие методов детекции генов/белков лекарственной устойчивости: иммуногистохимия, функциональные тесты, проточная цитофлюориметрия, методы определения мРНК, а также отсутствие стандартизации в рамках каждого метода затрудняют интерпретацию результатов, полученных в различных лабораториях. Кроме того, для некоторых онкологических заболеваний нет четких клинических критериев лекарственной устойчивости, что затрудняет сравнение результатов, полученных разными исследователями. Помимо этого, в клинических образцах не выявляется увеличения уровня экспрессии генов, связанных с множественной лекарственной устойчивостью, сравнимого с уровнем, продемонстрированным in vitro. Поэтому, несмотря на многочисленные исследования, ответ на вопрос о выборе метода, применимого для диагностической процедуры определения статуса лекарственной устойчивости опухоли, остается неоднозначным.

Множественность механизмов' лекарственной устойчивости и разнообразие способов детекции значительно затрудняют как диагностику причин устойчивости больных к терапии, так и выработку подходов по преодолению множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Это определяет необходимость дальнейшего исследования роли различных механизмов в возникновении лекарственной устойчивости опухолей, в том числе, при различных онкогематологических заболеваниях. Больные лимфопролиферативными заболеваниями, в частности, хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами обычно достигают ремиссии после одного-двух курсов терапии, но с очень высокой степенью рецидивов. Несмотря на многочисленные исследования в этой области, статус множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток при лимфопролиферативных заболеваниях оценен недостаточно для выработки правильной стратегии терапии.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

2. Определить уровень мРНК генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTP1 и CYP3A4 в лимфатических узлах, костном мозге больных лимфопролиферативными заболеваниями и оценить связь с результатом химиотерапии.

3. Исследовать взаимосвязь полиморфизма гена GSTP1 A/G с результатом химиотерапии у больных лимфопролифератавными заболеваниями.

Научная новизна

Проведенные исследования уровня мРНК CYP3A4 впервые показали, что CYP3A4 участвует в формировании лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями: лекарственная устойчивость формируется у тех больных, у которых наблюдается высокий уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге. 1 ^

Впервые проведенное исследование полиморфизма GSTP1 A/G у больных продемонстрировало, что полиморфные варианты GSTP1 A/G гена не являются предрасполагающим фактором к развитию лимфопролиферативных заболеваний, но полиморфизм GSTP1 A/G313 гена влияет на результат химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями: лекарственная устойчивость чаще возникает у больных, имеющих замену A/G313 в гене GSTP1.

Выявлено увеличение уровня мРНК MRP1 в лимфатических узлах больных HXJI с рецидивами этого заболевания.

Среди больных лимфопролиферативными заболеваниями, исследованных до химиотерапии, высокая функциональная активность P-gp является прогностическим фактором формирования лекарственной устойчивости к последующей химиотерапии.

Практическая значимость работы

По своему содержанию работа носит фундаментально-прикладной характер и представляет собой исследование роли ферментов транспорта и метаболизма ксенобиотиков у больных лимфопролиферативными заболеваниями в формировании лекарственной устойчивости.

Основные положения выносимые на защиту

1. Прогрессия опухоли у больных лимфопролиферативными заболеваниями сопровождается увеличением уровня мРНК генов Торо II, MRP1, GSTP1.

2. Полиморфные варианты гена GSTP1 A/G не являются предрасполагающим фактором к развитию лимфопролиферативных заболеваний. Полиморфизм гена GSTP1 AJQ влияет на терапевтический ответ у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на конференции молодых ученых «Терапия и фундаментальные науки - перспективы содружества в новом тысячелетии», Новосибирск, 2001; на сателлитном международном симпозиуме "НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В МЕДИЦИНЕ И БИОЛОГИИ ТРЕТЬЕГО ТЫСЯЧЕЛЕТИЯ" 1-го международного мультидисциплинарного симпозиума "СТРЕСС И ЭКСТРЕМАЛЬНЫЕ СОСТОЯНИЯ", Кара-Даг (Феодосия, Крым, Украина) 2002 г; на III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2004.

Автор выражает глубокую благодарность директору НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН Ляховичу Вячеславу Валентиновичу и руководителю Гришановой Алевтине Юрьевне за руководство работой на всех ее этапах, а также за помощь в написании диссертации.

Автор благодорит Мельникову Евгению Владимировну и Гореву Ольгу Борисовну за помощь в проведении экспериментальной части работы, а также зав. гематологического отделения с блоком асептических палат для трансплантации костного мозга обласной клинической больницы Мухина Олега Викторовича и д.м.н., проф. НМГА Домникову Наталью Петровну за предоставление клинического материала.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Воронцова, Елена Владимировна

Выводы

1. Увеличение уровня мРНК MDR1, MRP1, GSTP1 и TopoII в костном мозге больных хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами и мРНК MRP1 в лимфатических узлах больных неходжкинскими лимфомами связано с прогрессией опухоли.

2. Уровень мРНК MDR1, MRP1, GSTP1 и Торо II в лимфатических узлах, костном мозге и MDR1 в периферической крови не является показателем для прогноза устойчивости к химиотерапии у больных лимфопролиферативными заболеваниями: хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами.

3. Высокая функциональная активность P-gp в лимфоцитах нелеченных больных лимфопролиферативными заболеваниями коррелирует с лекарственной устойчивостью к последующей химиотерапии.

4. Высокий уровень мРНК CYP3A4 в костном мозге больных хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами, исследуемых на фоне химиотерапии, связан с формированием лекарственной устойчивости.

5. Замена A/G в гене GSTP1 ассоциирован с формированием лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями: хроническим лимфолейкозом и неходжкинскими лимфомами.

Заключение

В нашей работе была проанализирована связь между формированием лекарственной устойчивости у больных лимфопролиферативными заболеваниями и уровнем экспрессии мРНК генов MDR1, MRP1, GSTP1, TopoII и CYP3AA в костном мозге, лимфатических узлах и лимфоцитах периферической крови, функциональной активностью в лимфоцитах Р-гликопротеина (продукта гена MDR1), а так же полиморфизмом гена GSTP1AJG .

В лимфатических узлах больных HXJI при исследовании экспрессии мРНК генов MDR1, MRP1, GSTP1, TopoII показано, что из всех исследуемых генов лекарственной устойчивости, лишь MRP1 может участвовать в формировании МЛУ у больных с рецидивами HXJ1.

Уровень мРНК MRP1, GSTP1, TopoII в костном мозге обследуемых больных был связан с прогрессией опухоли и зависел от количества лимфоцитов в костном мозге. Но для этих генов не было выявлено зависимости результата химиотерапии от уровня экспрессии. Уровень мРНК MDR1 был выше у больных после лечения, однако для него также не было выявлено связи с результатом химиотерапии. И только повышение экспрессии мРНК CYP3A4 у вторичных больных было связано с устойчивостью к лечению.

Выявленная с применением кластерного анализа гетерогенность в экспрессии мРНК MDR1, MRP1, GSTP1 и CYP3A4 свидетельствует о значительных межиндивидуальных различиях в экспрессии этих генов у больных лимфопролиферативными заболеваниями.

Исследования функциональной активности P-gp и экспрессии мРНК MDR1 в лимфоцитах периферической крови продемонстрировали отсутствие корреляции между функциональной активностью Р-гликопротеина и уровнем мРНК MDR1. Однако высокая активность Р-гликопротеина при постановке диагноза у первичных больных может служить основанием для прогноза устойчивости к последующему лечению.

Кроме того, при исследовании полиморфизма GSTP1 A/G313 было показано, что лекарственная устойчивость чаще возникает у тех больных

2 1 »з лимфопролиферативными заболеваниями, которые имеют замену A/G .

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что, во-первых, высокий уровень мРНК не всегда может быть связан с лекарственной устойчивостью, во-вторых, в формировании лекарственной устойчивости могут участвовать, кроме широко изучаемых MDR1, MRP1, GSTP1, еще и CYP3A4, и, в-третьих, наряду с исследованием мРНК и белка, необходимо изучение полиморфизма генов, вовлеченных в фармакокинетику химиопрепаратов.

Можно заключить, что связь экспрессии МЛУ-генов с исходом терапии гематологических новообразований не так просты. Сочетание различных механизмов лекарственной устойчивости в одних и тех же клетках, влияние индивидуального генотипа больного и разнообразие методов исследования затрудняет выработку подходов к диагностике МЛУ статуса опухоли и определяет необходимость дальнейших исследований роли различных механизмов в возникновении множественной лекарственной устойчивости опухолей различной этиологии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Воронцова, Елена Владимировна, Новосибирск

1. Волкова М.А. Полвека в терапии хронического лимфолейкоза. // Гематол. и Трансфузиол. 1998. - Т.43. - №5. - С. 6-11.

2. Переводчикова Н.И. Место химиотерапии в системе лечения онкологических больных и выбор терапевтической тактики. // Современная онкология. 2001 -Том 3 - С. 18-22.

3. Ковригина A.M., Богатырев В.Н. R.E.A.L.-классификация: возможности цитоморфологической диагностики неходжкинских лимфом (анализ литературных и клинических данных). В-клеточные опухоли. // Новости клинической цитологии России, 1997.-Т.1.-№3.-С. 106-115.

4. Ставровская А.А. Клеточные механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Биохимия. 2000. - т. 65, вып. 1. - С. 112-126.

5. Комбинированное и комплексное лечение больных со злокачественными опухолями, (под ред. Чиссова В.И.), Медицина, Москва, 1989.

6. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. // Пер. с англ. М.: Медиа Сфера, 1998. 352 с.

7. Abraham Е.Н., Prat A.G., Gerweck L., Seneveratne Т., Arceci R.J., Kramer R., Guidotti G., Cantiello H.F. The multidrug resistance (mdrl) gene product functions as an ATP channel. //Natl. Acad. Sci. 1993. - V.90 (1). - P. 312-6.

8. Aggarwal S., Tsuruo Т., Gupta S. Altered expression and function of P-glycoprotein (170 kDa), encoded by the MDR 1 gene, in T cell subsets from aging humans. // J. Clin. Immunol. 1997. - V.l7 (6). - P.448-54.

9. Allan J.M., Wild C.P., Rollinson S. Polymorphism in glutathione S-transferase PI is associated with susceptibility to chemotherapy-induced leukemia. // Proc. Natl. Acad. Sci. -2001.-V.98.-P. 11592-11597.

10. Allikmets, R., Schriml, L.M., Hutchinson, A., Romano-Spica, V. & Dean, M. A human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 involved in multidrug resistance. // Cancer Res. 1998 - . - V.58. - P. 5337-5339.

11. Ambudkar, S.V. Dey S, Hrycyna С A, Ramachandra M, Pastan I, Gottesman MM Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999. - V.39. - P. 361-398.

12. Armstrong R.N. Mechanistic imperatives for the evolution of glutathione transferases. // Current Opinion in Chemical Biology. 1998. - Vol.2. - P. 618-623.

13. Baron J.M., Zwadlo-Klarwasser G., Jugert F., Hamann W., Rubben A., Mukhtar H., Merk H.F. Cytochrome P450 1B1: a major P450 isoenzyme in human blood monocytes and macrophage subsets. // Biochem. Pharmacol. 1998. - V. 56 (9). - P.l 105-1110

14. Baron J.M., Goh L.B., Yao D., Wolf C.R., Friedberg T. Modulation of P450 CYP3A4-dependent metabolism by P-glycoprotein: implications for P450 phenotyping. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. - V. 296 (2). - P. 351-8.

15. Beck J., Niethammer D., Gekeler V. High mdrl- and mrp-, but low topoisomerase II alpha-gene expression in B-cell chronic lymphocytic leukaemias. // Cancer Lett. 1995. - V. 89(2).-P. 227.

16. Beck J., Niethammer D., Gekeler V. MDR1, MRP, topoisomerase Ilalpha/beta, and cyclin A gene expression in acute and chronic leukemias. // Leukemia. 1996. - V.3. - P. 39-45.

17. Beckett G.J., Hayes J.D. Glutathione S-transferases: biomedical applications // Adv. Clin. Chem.- 1993.-Vol. 30.-P. 281-380.

18. Belinsky, M. G. & Kruh, G. D. MOAT-E (ARA) is a full-length MRP/cMOAT subfamily transporter expressed in kidney liver. // Br. J. Cancer. 1999. - V.80. - P. 1342-1349.

19. Bello-Reuss E, Ernest S, Holland OB, Hellmich MR. Role of multidrug resistance P-glycoprotein in the secretion of aldosterone by human adrenal NCI-H295 cells. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. - V.278 (6). - P. 1256-65.

20. Berhane K., Hao X.Y., Christensson В., et al. The expression of glutathione transferase isoenzymes in human malignant lymphoma biopsies. // Acta. Oncol. 1995. - Vol.34. - P. 35-41.

21. Bertz R.J., Granneman G.R. Use of in vitro and in vivo data estimate the likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions. // Clin. Pharmacokinet. 1997. - V.32 (3). -P.210-258.

22. Bhushan A., Abramson R., Chiu J.F., Tritton T.R. Expression of c-fos in human and murine multidrug-resistant cells. // Mol. Pharmacol. 1992. -V. 42 (1). - P. 69-74.

23. Biedler J.L., Riehm H. Cellular resistance to actinomycin D in Chinese hamster cells in vitro: cross-resistance, radioautographic, and cytogenetic studies. // Cancer Res. 1970. - V.30. -P. 1174-84.

24. Black S., Beggs J.D., Hayes J.D., et al. Expression of human glutathione S-transferases in Saccharomyces cerevisiae confers resistance to the anticancer drugs adriamycin and chlorambucil. // Biochem. J. 1990. - V.268. - P. 309-315.

25. Blumberg В., Sabbagh W. Jr., Juguilon H., Bolado J.Jr., van Meter C.M., Ong E.S., Evans R.M. SXR, a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor. // Genes Dev. 1998. -V.12 (20). -P. 3195-3205.

26. Borst, P., Zelcer, N. & van Helvoort, A. ABC transporters in lipid transport. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - V. 1486. - P. 128-144.

27. Broxterman HJ, Heijn M, Lankelma J. How does the MRP/GS-X pump export doxorubicin? // J. Natl. Cancer Inst. 1996. - V.88 (7). - P.466-8.

28. Burger H., Nooter K., Sonneveld P., Van Wingerden K.E., Zaman G.J., Stoter G. High expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) in chronic and prolymphocyte leukaemia. // Br. J. Haematol. 1994. - V.88 (2). - P.348-56.

29. Cao L., Duchrow M., Windhovel U., Kujath P., Bruch H.P., Broil R. Expression of MDR1 mRNA and encoding P-glycoprotein in archival formalin-fixed paraffin-embedded gall bladder cancer tissues. // Eur. J. Cancer. 1998. - V.34 (10). - P. 1612-7.

30. Carbone, P. P., Kaplan, H. S., Musshoff, K. et al. Report of Committee on Hodgkin's disease staging classification//Cancer Res. 1971.-V.31.-P. 1860-1861.

31. Chan H.S., Haddad G., Thorner P.S., DeBoer G., Lin Y.P., Ondrusek N., Yeger H., Ling V. P-glycoprotein expression as a predictor of the outcome of therapy for neuroblastoma. // N. Engl. J. Med. 1992 - V.326 (17). - P.l 162-3.

32. Chattopadhyay N., Kher R., Godbole M. 6 Inexpensive SDS/phenol method for RNA extraction from tissue. // Biotechniques. 1993. - P. 15(1). - P.24-28.

33. Chaudhary P.M., Roninson I.B. Expression and activity of P-glycoprotein, a multidrug efflux pump, in human hematopoietic stem cells. // Cell. 1991. - V.66 (1). - P.85-94.

34. Chen Z. S., Lee K., Kruh G. D. Transport of cyclic nucleotides and estradiol 17-. -D-glucuronide by multidrug resistance protein 4: resistance to 6-mercaptopurine and 6-thioguanine.//J. Biol. Chem. -2001. V.276. -P.33747-33754.

35. Chin K.V., Ueda K., Pastan I., Gottesman M.M. Modulation of activity of the promoter of the human MDR1 gene by Ras and p53. // Science. 1992. - V.255 (5043). - P.459-62.

36. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal. Biochem. 1987. - V.162. - P. 156159.

37. Christians U., Jacobsen W., Benet L.Z., Lampen A. Mechanisms of clinically relevant drug interactions associated with tacrolimus. // Clin. Pharmacokinet. 2002. - V.41 (11). -P.813-51.

38. Cole S.P.C., Deeley R.G. Multidrug resistance mediated by the ATP-bindning cassette transporter protein MRP. // Bioessays. 1998. - Vol.20. - P. 931-940.

39. Coles В., Wilson I., Wardman P., Hinson J.A., et al. The spontaneous and enzymic reaction of N-acetyl-p-benzoquinonimine with gluthation: A stopped-flow cinetic study // Arch. Biochem. Biophys. 1988. - Vol.264. - P.253-260.

40. Coon J.S., Wang Y.Z., Bines S.D., Markham P.N., Chong A.S., Multidrug resistance activity in human lymphocytes. // Hum. Immunol. 1991. - V.32 (2) . - P. 134-40.

41. Combates N.J., Rzepka R.W., Chen Y.N., Cohen D. NF-IL6, a member of the C/EBP family of transcription factors, binds and trans-activates the human MDR1 gene promoter. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269(47). - P. 29715-9.

42. Consoli U., Santonocito A., Stagno F., Fiumara P., Privitera A., Parisi G., Giustolisi G.M., Pavone B. Multidrug resistance mechanisms in chronic lymphocytic leukaemia. // Br. J. Haematol. 2002. - V.l 16 (4). - P.774-80.

43. Cornwell M.M., Smith D.E. A signal transduction pathway for activation of the mdrl promoter involves the proto-oncogene c-raf kinase. // J. Biol. Chem. 1993. - V.268 (21). - P. 1534750.

44. Danielson P.B. The Cytochrome P450 Superfamily: Biochemistry, Evolution and Drug Metabolism in Humans.// Current Drug Metabolism . 2002. -V. 3. - P. 561-597.

45. Danks M.K., Warmoth M.R., Friche E., Granzen В., Bugg B.Y., Harker W.G., Beck W.T. Single-strand conformational polymorphism analysis of the M(r) 170,000 isozyme of DNA topoisomerase II in human tumor cells. // Cancer Res. 1993. - V.53 (6). - P.1373-9.

46. Dean, M., Rzhetsky, A. & Alliknets, R. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. // Genome Res. -2001. V.l 1. - P. 1156-1166.

47. Demeule M, Jodoin J, Beaulieu E, Brossard M, Beliveau R Dexamethasone modulation of multidrug transporters in normal tissues. // FEBS Lett. 1999. - V.442 (2-3). - P.208-14.

48. Di Simone D., Testi R., Caracciolo F., et al. Glutathione-S-transferase activity and multidrug resistance phenotype in chronic lymphocytic leukemia: do they have any clinical relevance? // Haematologica. 1995. - V.80. - №2 . - P. 103-107.

49. Drach J., Zhao S., Drach D., Korbling M.5 Engel H., Andreeff M. Expression of MDR1 by normal bone marrow cells and its implication for leukemic hematopoiesis. // Leuk Lymphoma. 1995. - V. 16(5-6). - P.419-24.

50. Drocourt L., Ourlin J.C., Pascussi J.M., Maurel P., Vilarem M.J. Expression of CYP3A4, CYP2B6, and CYP2C9 is regulated by the vitamin D receptor pathway in primary human hepatocytes. // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277 (28). - P. 25125- 25132.

51. Durand R. E., Olive P. L. Resistance of tumor cells to chemo- and radiotherapy modulated by the three-dimensional architecture of solid tumors and spheroids. // Methods Cell Biol. -2001.-V. 64.-P. 211-233.

52. Engman H.A., Lennernas H., Taipalensuu J., Otter C., Leidvik В., Artursson P. CYP3A4, CYP3A5, and MDR1 in human small and large intestinal cell lines suitable for drug transport studies. //J. Pharm. Sci. 2001. - V.90 (11). - P. 1736-51.

53. Felix C.A., Walker A.H., Lange B.J., Williams T.M., Winick N.J., Cheung N.K., Lovett B.D., Nowell P.C., Blair I.A., Rebbeck T.R. Association of CYP3A4 genotype with treatment-related leukemia. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - V.95 (22). - P. 13176-81.

54. Filipits M., Jaeger U., Simonitsch I., Chizzali-Bonfadin C., Heinzl H., Pirker R. Clinical relevance of the lung resistance protein in diffuse large B-cell lymphomas. // Clin. Cancer Res. -2000. -V.6 (9). P. 3417-23.

55. Finnegan M.C., Royds J., Goepel J.R., Lorigan P., Hancock B.W., Goyns M.H. MDR-1 expression in non-Hodgkin's lymphomas is unrelated to treatment intensity or response to therapy. // Leuk. Lymphoma. 1995. - V.18 (3-4). - P.297-302.

56. Friedenberg W.R., Spencer S.K., Musser C., Hogan T.F., Rodvold K.A., Rushing D.A., Mazza J.J., Tewksbury D.A., Marx J.J. Multi-drug resistance in chronic lymphocytic leukemia. // Leuk Lymphoma. 1999. - 34(1-2). - P.171-8.

57. Geick A., Eichelbaum M., Burk O. Nuclear response elements mediate induction of intestinal MDR1 by rifampin. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276 (18). - P. 14581-7.

58. Gerloff T. The sister of P-glycoprotein represents the canalicular bile salt export pump of mammalian liver. // J. Biol.Chem. 1998. - V. 273. - P. 10046-10050.

59. Gill P.K., Gescher A., Gant T.W. Regulation of MDR1 promoter activity in human breast carcinoma cells by protein kinase С isozymes alpha and theta. // Eur. J. Biochem. 2001. -V.268 (15). -P.4151-7.

60. Goldie J.H., Coldman A.J. Quantitative model for multiple levels of drug resistance in clinical tumors. // Cancer Treat Rep. 1983. - V.67 (10). - P.923-31.

61. Goodwin В., Moore L.B., Stoltz C.M., McKee D.D., Kliewer S.A. Regulation of the human CYP2B6 gene by the nuclear pregnane X receptor. // Mol. Pharmacol. 2001. - V. 60 (3). -P. 427-431.

62. Goto S., Iida Т., Cho S., et al. Overexpression of glutathione S-transferase pi enhances the adduct formation of cisplatin with glutathione in human cancer cells. // Free. Radic. Res. 1999.-V. 31.-P. 549-558.

63. Gottesman M.M., Fojo Т., Bates S.E. Multidrag resistance in cancer: role of ATF-dependent transporters. // Nat. Rev. Cancer. 2002. - V.2. - P. 48-58.

64. Green S. K., Frankel, A., Kerbel R. S. Adhesion-dependent multicellular drug resistance. // Anticancer Drug Des. 1999.-V.14.- P.153-168.

65. Gros P., Croop J., Housman D. Mammalian multidrug resistance gene: complete cDNA sequence indicates strong homology to bacterial transport proteins. // Cell. 1986. - V.47 (3). - P. 371-80.

66. Grulois I., Fardel O., Drenou В., Lamy Т., Le Prise P.Y., Fauchet R. Multidrug resistance in B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Acta Haematol. 1995. - V.94 (2). - P.:78-83.

67. Guengerich P., Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism, // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1999. -V. 39. - P. 1 -17.

68. Gurbuxani S., Singh Arya L., Raina V., Sazawal S., Khaltar A., Magrath I., Marie J., Bhargava M. Significance of MDR1, MRP1, GSTpi and GSTmu mRNA expression in acute lymphoblastic leukemia in Indian patients. // Cancer Lett. 2001. - V.167. - P.:73-83.

69. Hamilton K.O., Yazdanian M.A., Audus K.L. Modulation of P-glycoprotein activity in Calu-3 cells using steroids and beta-ligands. // Int. J. Pharm. 2001. - V. 228 (1-2). - P. 171-9.

70. Hannun Y.A. Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy. // Blood. 1997. - V.89 (6).- P.1845-53.

71. Hao X.Y., Christensson В., et al. The expression of glutathione transferase isoenzymes in human malignant lympho ma biopsies. // Acta. Oncol. 1995. - Vol.34. - P. 35-41.

72. Harbottle A., Daly A.K., Atherton K., Campbell F.C. Role of glutathione S-transferase PI, P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein 1 in acquired doxorubicin resistance. // Int. J. Cancer. 2001. - V.92. - P. 777-783.

73. Harris M.J., Coggan M., Langton L., et al. Polymorphism of the Pi class glutathione S-transferase in normal populations and cancer patients. // Pharmacogenetics. 1998. -V.8.-P. 27-31.

74. Hartmann G., Cheung A.K., Piquette-Miller M. Inflammatory cytokines, but not bile acids, regulate expression of murine hepatic anion transporters in endotoxemia. // J. Pharmacol. Exp. Ther.-2002.-V.303 (1).-P.273-81.

75. Higgins C. F. ABC transporters: from micro-organisms to man. // Annu. Rev. Cell. Biol. -1992. V.8. - P. 67-113.

76. Hinoshita E., Taguchi K., Inokuchi A., Uchiumi Т., Kinukawa N., Shimada M. Decreased expression of an ATP-binding cassette transporter, MRP2, in human livers with hepatitis С virus infection. // Hepatol. 2001. - V.35 (6). - P.:765-73.

77. Hipfher D.R., Deeley R.G., Cole S.P. Structural, mechanistic and clinical aspects of MRP1. Biochim. // Biophys. Acta. 1999. - V.1461 (2). - P.359-76.

78. Hodges V.M., Molloy G.Y., Wickramasinghe S.N. Demonstration of mRNA for five species of cytochrome P450 in human bone marrow, bone marrow-derived macrophages and human haemopoietic cell lines. // Br. J. Haematol. 2000. - V.108 (1). - P. 151-6.

79. Honkakoski P., Zelko I., Sueyoshi Т., Negishi M. The nuclear orphan receptor CAR- retinoid X receptor heterodimer activates the phenobarbital-responsive en-hancer module of the CYP2B gene. //Mol Cell Biol. 1998. -V. 18 (10). -P.5652-8.

80. Ни X., Xia H., Srivastava S.K. Activity of four allelic forms of glutathione S-transferase hGSTPl-1 for diol epoxides of polycyclic aromatic hydrocarbons. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V.238. - P.397-402.

81. Janardan S.K., Lown K.S., Schmiedlin-Ren P., Thummel K.E., Watkins P.B. Selective expression of CYP3A5 and not CYP3A4 in human blood. // Pharmacogenetics. 1996. -V.6(5). -P.379-85.

82. Jedlitschky G., Leier I., Buchholz U., Center M., Keppler D. //.ATP-dependent transport of glutathione S-conjugates by the multidrug resistance-associated protein. // Cancer Res. -1994. V.54(l 8). - P. 4833-6.

83. Johnson B.M., Charman W.N., Porter C.J. The impact of P-glycoprotein efflux on enterocyte residence time and enterocyte-based metabolism of verapamil. // J. Pharm. Pharmacol. -2001. V.53(12). - P. 1611-9.

84. Jones RJ Biology and treatment of chronic myeloid leukemia. // Curr. Opin. Oncol. 1997. -V.9. -P.3-7.

85. Juliano R.L., Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. - V.455 (1). - P. 152-62.

86. Juszczynski P., Niewiarowski W., Krykowski E., Robak Т., Warzocha K. Expression of the multidrug resistance-associated protein (mrp) gene in chronic lymphocytic leukemia. // Leuk Lymphoma. 2002. - V.43 (1). - P. 153-8.

87. Kang Y.K., Zhan Z., Regis J., Alvarez M., Robey R., Meadovs B. Expression of mdr-1 in refractory lymphoma: quantitation by polymerase chain reaction and validation of the assay. // Blood.- 1995.-V.86(4).-P. 1515-1524.

88. Katoh M, Nakajima M., Yamazaki H. Yokoi T. Inhibitory effects of CYP3A4 substrates and their metabolites on P-glycoprotein-mediated transport. // Eur. J. Pharm. Sci. 2001. - V.l2 (4). -P.505-513.

89. Kaufmann S.H., Karp J.E., Burke P.J., Gore S.D. Addition of etoposide to initial therapy of adult acute lymphoblastic leukemia: a combined clinical and laboratory study. // Leuk. Lymphoma. 1996. - V.23( 1 -2). - P. 71 -83.

90. Kivisto K.T., Kroemer H.K., Eichelbaum M. The role of human cytochrome P450 enzymes in the metabolism of anticancer agents: implications for drug interactions. // Br. J. Clin. Pharmacol. 1995. - V.40 (6). -P.523-30.

91. Klimecki W.T., Futscher B.W., Grogan T.M. and WS Dalton P-glycoprotein expression and function in circulating blood cells from normal volunteers. // Blood. -1994. V.83 (9). -P.2451-2458.

92. Konig J., Nies A.T. Cui Y., Leier I., Keppler D. Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRP) family: localization, substrate specificity, and MRP2-mediated drug resistance. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V.1461 (2). -P.377-94. .

93. Kool M. van der Linden M., de Haas M., Scheffer G.L., de Vree JM., Smith A.J., Jansen G., Peters G.J., Ponne N. et al. MRP3, an organic anion transporter able transport anti-cancer drugs. // Proc. Natl Acad. Sci. 1999. - V 96(12). - P. 6914-6919.

94. Kool M., van der Linden M., de Haas M., Baas F. Expression of human MRP6, a homologue of the multidrug resistance protein gene MRP 1, in tissues and cancer cells. // Cancer Res. -1999.-V. 59. -P.175-182.

95. A.P., Kaminski D.L., Rasmussen A. Substrates of human hepatic cytochrome P450 3A4. // Toxicology.- 1995.-Vol. 104.-P. 1-8

96. Maliepaard, M. et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. // Cancer Res. 2001. - V.6. - P. 13458-3464.

97. Mannervik В., Awasti Y.C., Board P.G., et al. Nomenclature for human glutathione transferases. // Biochem. J. 1992. - Vol.282. - P. 305-306.

98. Marie J.P., Legrand O., Perrot J.Y., Chevillard S., Huet S., Robert J. // Semin. Hematol. -1997.-V.34 (4). -P.63-71.

99. Marie J.P., Zhou D.C., Gurbuxani S., Legrand O., Zittoun R. MDRl/P-glycoprotein in haematological neoplasms // Eur. J. Cancer. 1996. - V.32A (6). - P. 1034-8.

100. McCune J.S., Hawke R.L., LeCluyse E.L., Gillenwater H.H., Hamilton G., Ritchie J., Lindley C. In vivo and in vitro induction of human cytochrome P4503A4 by dexamethasone. // Clin Pharmacol. Ther. 2000. - V.68. - P.356-66.

101. Meyer U. A. Overview of enzymes of drag metabolism. // J. Pharmacokinet. Biopharm. 1996. -V.24(5). - P. 449-59.

102. Mickley L.A., Spengler B.A., Knutsen T.A., Biedler J.L., Fojo T. Gene rearrangement: a novel mechanism for MDR-1 gene activation. //J. Clin. Invest. 1997. - V.99. - P. 1947-1957.

103. Miyazaki M, Kohno K, Uchiumi T, Tanimura H, Matsuo K, Nasu M, Kuwano M. Activation of human multidrug resistance-1 gene promoter in response to heat shock stress. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 187(2). - P.677-84.

104. Mulder T.P.J., Peters W.H.M., Wobbes T. Measurement of glutatione S-transferase Pl-1 in plasma. // Cancer. 1997. - Vol.80. - P. 873-880.

105. Murray G.I., McKay J.A., Weaver R.J., Ewen S.W., Melvin W.T., Burke M.D. Cytochrome P450 expression is a common molecular event in soft tissue sarcomas. // J. Pathol. 1993. -V.171 (1). -P.49-52.

106. Nagai F., Hiyoshi Y., Sugimachi K., Tamura H.O.Cytochrome P450 (CYP) expression in human myeloblasts and lymphoid cell lines. // Biol. Pharm. Bull. 2002. - V.25. -P.383-5.

107. National Cancer Institute Sponsored Study of Classifications of Non-Hodgkin'n Lymphomas. Summaiy and Description of a Working Formulation for Clinical Usage. // Cancer. 1982. -V. 49.-P. 2112-2135.

108. Nebert D.W., Gonzalez F.J. P450 genes: structure, evolution, and regulation. // Annu. Rev. Biochem. 1987.-V.56.-P.945-93.

109. Nooter K, Sonneveld P. Clinical relevance of P-glycoprotein expression in haematological malignancies. // Leuk Res. 1994. - V.18 (4). - P.233-43.

110. Ollikainen Т., Hirvonen A., Norppa H. Influence of GSTT1 Genotype on Sister Chromatid Exchange Induction by Styrene-7/8-Oxide in Cultured Human Lymphocytes. // Environmental and Molecular Mutagenesis. 1998. - Vol.31. - P. 311-315.

111. Osheroff N. Biochemical basis for the interactions of type I and type II topoisomerases with DNA.//Pharmacol. Ther.- 1989.-V.41 (1-2).- P.223-41.

112. Pal A., Desalt D.H., Amin S., et al. Location of the epoxide function determines specificity of the allelic variants of human glutathione transferase Pi toward benzoc.chrysene diol epoxide isomers. //FEBS Letters. 2000. - Vol.486. - P. 163-166.

113. Pastan I., Gottesman M. Multiple-drug resistance in human cancer. // N. Engl. J. Med. -1987.-V.316.-P. 388-1393.

114. Paulusma С. C. et al. Congenital jaundice in rats with a mutation in a multidrug resistance-associated protein gene. // Science. 1996. - V.271. - P.l 126-1128.

115. Pearse N. What does the odds ratio estimate in case-control study? // Int. J. Epidemiol. -1993.-Vol.22.-P. 1189-1192.

116. Pearson W.R., Vorachek W.R., Xu S.J., et al. Identification of class-mu glutathione transferase genes GSTM1-GSTM5 on human chromosome lpl3 // Am. J. Hum. Genet. -1993.-Vol. 53.-№1.-P. 220-233.

117. Per SR., Mattern M.R., Mirabelli C.K, Drake F.H., Johnson R.K., Crooke S.T. Characterization of a subline of P388 leukemia resistant to amsacrine: evidence of altered topoisomerase II function. // Mol. Pharmacol. 1987. - V.32(l). - P. 17-25.

118. Pilarski L.M., Szczepek A. J., Belch A.R. Deficient drug transporter function of bone marrow-localized and leukemic plasma cells in multiple myeloma. // Blood. 1997. - V. 90(9). -P.3751-9.

119. Raucy J.L., Ingelman-Sundberg M., Carpenter S., Rannug A., Rane A., Franklin M., Romkes M. Drug metabolizing enzymes in lymphocytes. // J. Biochem. Mol. Toxicol. 1999. -V.13 (3-4).-P.223-6.

120. Ribrag V., Massade L., Faussat A.M., Dreyfus F., Bayle C., Gouyette A., Marie J.P. Drug resistance mechanisms in chronic lymphocytic leukemia. // Leukemia. 1996. - V.10(12). -P. 1944-9.

121. Riordan J.R., Deuchars K., Kartner N., Alon N., Trent J., Ling V. Amplification of P-glycoprotein genes in multidrug-resistant mammalian cell lines. // Nature. 1985. -V.316(6031). -P.:817-9.

122. Roninson I.B., Chin J.E., Choi K.G., Gros P., Housman D.E., Fojo A., Shen D.W., Gottesman M.M., Pastan I. Isolation of human mdr DNA sequences amplified in multidrug-resistant KB carcinoma cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. 1986. - V.83(12). -P.4538-42.

123. Rosenberg M.F., Callaghan R., Ford R.C., Higgins C.F. Structure of the multidrug resistance P-glycoprotein to 2.5 nm resolution determined by electron microscopy and image analysis. // J. Biol. Chem. 1997. - V.272(16). - P. 10685-94.

124. Ruiz J.C., Choi K.H, von Hoff D.D., Roninson I.B, Wahl G.M. Autonomously replicating episomes contain mdrl genes in a multidrug-resistant human cell line. // Mol. Cell. Biol. -1989. -V. 9(1). -P.109-15.

125. Russo D., Marie J.P., Zhou D.C., et al Evaluation of the clinical relevance of the anionic GST pi and mdrl gene coexpression in leukemias and lymphomas. // Leuk. Lymphoma. 1994. -V.l5 (5-6). - P. 453-68.

126. Sakaeda Т., Nakamura Т., Okomura K. MDR1 Genotype-Related Pharmacokinetics and Pharmacodynamics // Biol. Pharm. Bull. 2002. - V. 25(11). - P. 1391—1400.

127. Sampath J., Sun D., Kidd V.J., Grenet J., Gandhi A., Shapiro L.H., Wang Q., Zambetti G.P., Schuetz J.D .Mutant p53 cooperates with ETS and selectively up-regulates human MDR1 not MRP1. // J. Biol. Chem. 2001. - V.276 (42). - P.39359-67.

128. Schisselbauer J.C., Silber R., Papadopoulos E., et al. Characterization of glutathione S-transferase expression in lymphocytes from chronic lymphocytic leukemia patients. // Cancer. Res. 1990. - Vol.50. - P. 3562-3568.

129. Schuetz E.G., et al., Regulation of human liver cytochromes P-450 family ЗА in primary and continuous culture of human hepato-cytes. // Hepatology. 1993. - V.18 (5). - P. 12541262.

130. Schuetz, J. D. et al. MRP4: a previously unidentified factor in resistance to nucleoside-based antiviral drugs. // Nature. Med. 1999. - V.5. - P. 1048-1051.

131. Seidegard J., Vorachek W.R., Pero R.W., et al. Hereditary differences in the expression of the human glutathione transferase active on trans-stilbene oxide are due to a gene deletion. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1988. - Vol .85. - P. 7293-7297.

132. Sempoux C., Starkel P., Stevens M., Van Den Berge V., Horsmans Y. Cytochrome P450 ЗА proteins are expressed in В lymphocytes but not in T lymphocytes. // Pharmacogenetics. -1999.-V. 9-P. 263-265.

133. Sheehan D., Meade G., Foley V.M., Dowd C.A. Structure, function and evolution of glutatione transferases: implications for classification of non-mammalian members of an ancient enzyme superfamily. // Biochem. J. 2001. - V.360. - P. 1-16.

134. Shen D.W., Fojo A., Chin J.E., Roninson I.B., Richert N., Pastan I., Gottesman M.M. Human multidrug-resistant cell lines: increased mdrl expression can precede gene amplification. // Science. 1986. - V.232 (4750). - P.643-5.

135. Simon S.M., Schindler M. Cell biological mechanisms of multidrug resistance in tumors. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. - V.91 (9). - P.3497-504.

136. Stavrovskaya A., Turkina A., Sedyakhina N., Stromskaya Т., Zabotina Т., Khoroshko N., Baryshnikov Prognostic value of P-glycoprotein and leukocyte differentiation antigens in chronic myeloid leukemia. // Leuk. Lymphoma. -1998. V.28 (5-6). - P.469-82.

137. Strauss B.E., Shivakumar C., Deb S.P., Deb S., Haas M. The MDR1 downstream promoter contains sequence-specific binding sites for wild-type p53. // Biochem. Biophys. Res .Commun. 1995. - V.217 (3). -P.825-31.

138. Strautnieks, S.S. et al. A gene encoding a liver-specific ABC transporter is mutated in progressive familial intrahepatic cholestasis. // Nature. Genet. 1998. - V. 20. - P.233-238.

139. Sundseth R., MacDonald G., Ting J., King A.C. DNA elements recognizing NF-Y and Spl regulate the human multidrug-resistance gene promoter. // Mol. Pharmacol. 1997. -V.l(6).- P. 963-71.

140. Synold T.W., Dussault I., Forman B.M. The orphan nuclear receptor SXR coordinately regulates drug metabolism and efflux. // Nature Med. 2001. - V. 7. - P. 584-590.

141. Tan K.L., Board P.G. Purification and characterization of a recombinant human Theta-class glutathione transferase (GSTT2-2)//Biochem. J. 1996.-V.315. - P. 727-732.

142. Tew K.D. Glutathione-associated enzymes in anticancer drug resistance. // Cancer. Res. -1994. -V.54.-P.4313-4320.

143. Thottassery J.V., Zambetti G.P., Arimori K., Schuetz E.G., Schuetz J.D. p53-dependent regulation of MDR1 gene expression causes selective resistance to chemotherapeutic agents. // Proc Natl Acad Sci. 1997. - V.94 (20). - P. 11037-42.

144. Tulpule A., Sherrod A., Dharmapala D., Young L.L., Espina B.M., Sanchez M.N., Gill P.S., Levine A.M. Multidrug resistance (MDR-1) expression in aids-related lymphomas. // Leuk. Res. 2002. - V.26 (2). - P. 121-7.

145. Turley H., Comley M., Houlbrook S., Nozaki N., Kikuchi A., Hickson I.D., Gatter K. The distribution and expression of the two isoforms of DNA topoisomerase II in normal and neoplastic human tissues. // Br. J. Cancer. 1997. - V.75 (9) - P.1340-6.

146. Vanoye C.G., Castro A.F., Pourcher Т., Reuss L., Altenberg G.A. Phosphorylation of P-glycoprotein by PKA and PKC modulates swelling-activated CI- currents. // Am. J. Physiol. -1999. V.276. -P.370-8.

147. Wang Q., Beck W.T. Transcriptional suppression of multidrug resistance-associated protein (MRP) gene expression by wild-type p53. // Cancer Res. 1998. - V. 58(24). - P.5762-9.

148. Watkins R.E., Noble S.M., Redinbo M.R. Structural insights into the promiscuity and function of the human pregnane X receptor. // Curr. Opin. Drug. Discov. Devel. 2002. - V.5 (1). -P. 150-8.

149. Webb M., Brun M., McNiven M., Couteur D., Craft P. MDR1 and MRP expression in chronic B-cell lymphoproliferative disoders. // Br. J. Haematol. 1998. - V.102. - P. 710-717.

150. Welfare M., Adeokun A.M., Bassendine M.F., Daly A.K. Polimorphism in GSTP1, GSTM1, and GSTT1 and susceptibility to colorectal cancer. // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 1999. - V.8. - P. 289-292.

151. Yao D, Ding S, Burchell B, Wolf CR, Friedberg T. Detoxication of vinca alkaloids by human P450 CYP3A4-mediated metabolism: implications for the development of drug resistance. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. - V.294 (1). - P.387-95.

152. Yang J.M., Vassil A.D., Hait W.N. Activation of phospholipase С induces the expression of the multidrug resistance (MDR1) gene through the Raf-MAPK pathway. // Mol. Pharmacol. 2001. - V. 60 (4). - P. 674-80.

153. Zelcer N., Reid G., Wielinga P., Kuil A., van der Heijden I., Schuetz J.D., Borst P. Steroid and bile acid conjugates are substrates of human multidrug-resistance protein (MRP) 4 (ATP-binding cassette C4). // Biochem. J. 2003. - V.371. - P. 361-7

154. Zhang K., Mack P., Wong K.P. Glutathione-related mechanisms in cellular resistance to anticancer drugs. // Int. J. Oncol. 1998. - V. 12 (4). - P. 871-82.

155. Zhang Y., Guo X, Lin E.T., Benet L.Z. Overlapping substrate specificities of cytochrome P450 ЗА and P-glycoprotein for a novel cysteine protease inhibitor. // Drug. Metab. Dispos. -1998. V.26 (4). - P. 360-6.

Информация о работе

Воронцова, Елена Владимировна
кандидата медицинских наук
Новосибирск, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль транспортных белков и ферментов метаболизма ксенобиотиков в формировании лекарственной устойчивости при лимфопролиферативных заболеваниях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы