Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1) и гена VKORC1 в популяциях коренных этносов Северной Сибири

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1) и гена VKORC1 в популяциях коренных этносов Северной Сибири"

На правах рукописи

КОРЧАГИНА РОЗА ПАВЛОВНА

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ (СУР2С9, СУР4Р2, СУР206, С75ГМ7, С5Г77) И ГЕНА УКОЯС1 В ПОПУЛЯЦИЯХ КОРЕННЫХ ЭТНОСОВ СЕВЕРНОЙ СИБИРИ

Генетика-03.02.07

ч с [ю-? т'0

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2012

005017511

005017511

Работа выполнена в лаборатории популяционной этногенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Осипова Людмила Павловна

Официальные оппоненты: Захаров Илья Кузьмич

доктор биологических наук, профессор заведующий лабораторией генетики популяций

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Гришаиова Алевтина Юрьевна

доктор биологических наук, профессор заведующая лабораторией биохимии чужеродных соединений Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» СО РАМН, г. Новосибирск

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа

Защита диссертации состоится « сЛаХЬЛ^ЪЪМ г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН, в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, д.Ю, т. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь % ^

диссертационного совета, /0' /¡и

доктор биологических наук \к {]/ Хлебодарова Т. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Организм человека постоянно подвергается воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, в том числе чужеродных соединений - ксенобиотиков. Естественные и синтезированные химические вещества, содержащиеся в воздухе, воде, пище, в лекарствах, в табачном дыме, являются потенциальными мутагенами, канцерогенами, тератогенами [Баранов и др., 2000]. В целом, токсическое действие ксенобиотиков на живые организмы определяется их способностью вмешиваться и нарушать процессы жизнедеятельности, что может быть причиной развития различных заболеваний [Курляндский, Филов, 2002].

Ведущую роль в защите организма от действия чужеродных веществ играет система биотрансформации ксенобиотиков (БК) [Саприн, 1991; Райе, Гуляева, 2003; Бочков, 2004]. Индивидуальные особенности работы системы биотрансформации определяются уникальным для каждого человека сочетанием полиморфных вариантов генов соответствующих ферментов, что ведет к различной адаптационной способности, то есть устойчивости или чувствительности индивидов к воздействию повреждающих внешних факторов [Жученко и др., 2006].

Наличие мутантных (функционально неполноценных) вариантов генов ферментов БК является причиной неблагоприятных ответных реакций организма человека на действие ксенобиотиков и предрасполагает к возникновению заболеваний, в том числе, онкологических [Баранов и др., 2000; Хуснутдинова, Боринская, 2002; Ляхович и др., 2006; Фрейдин и др., 2006; Shi et al, 2008], занимающих второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний Ihttp://wvvw.oncc.ni/; http://www.sci.aha.ru/Amra53d.htm].

В качестве маркеров чувствительности к онкологическим заболеваниям обоснованно рассматривают гены GSTM1, GSTT1 и CYP2D6. Например, показано, что «нулевые» генотипы GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0 в сочетании с вариантами CYP2D6*1/CYP2D6*3 или CYP2D6* 1/CYP2D6*4 ассоциированы с повышенным риском развития базальных клеточных карцином [Yang, 2006]. Выявлено, что гомозиготный генотип по делеции гена GSTM1 связан с повышенным риском развития рака легких, желудка и мочевого пузыря [Seidegard et al., 1990; Alexandrie et al., 1994; Ford et al., 2000; Ляхович и др., 2004; Habdous et al., 2004; Shi et al., 2008; Economopoulos et al., 2010].

Ферменты БК также активно участвуют в метаболизме лекарственных препаратов в организме человека. Наличие полиморфных вариантов в генах ферментов системы БК, приводящих к изменению функции фермента, могут влиять на безопасность терапии и эффективность лечения заболеваний. Так, фермент CYP2D6 метаболизирует использующийся для лечения рака молочных желез тамоксифен, превращая его в активный метаболит. У носителей мутантного аллельного варианта CYP2D6*4, ответственного за развитие фенотипа «медленный» метаболизатор, снижена скорость образования активного метаболита, что приводит к снижению длительности периода ремиссии и выживаемости при раке молочной железы [Jordana, 2007; Ron, 2008]. У индивидов с гомозиготным генотипом CYP2D6*4/CYP2D6*4 при применении

антидепрессанта флуоксетина возможно развитие нескольких побочных реакций, одной из которых является агрессивное поведение [Кукес, 2010].

Выявлено, что носительство полиморфных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 гена CYP2C9, наиболее распространенных среди европеоидов, приводит к значительному снижению активности фермента. В результате, индивиды с мутантными генотипами (как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии), являются чувствительными к терапии нестероидными противовоспалительными, противодиабетическими, антиэпилептическими препаратами и антикоагулянтами (варфарином), поэтому таким лицам требуются более низкие дозы лекарств по сравнению со средними терапевтическими дозами, иначе возможно развитие серьезных побочных реакций [Pirmohamed, Park, 2003; Сироткина и др., 2004; Pilotto et al., 2007; Обжерина и др., 2009].

Кроме полиморфизма генов системы БК (CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, GSTM1, GSTT1), определяющего индивидуальные особенности ответа организма на лекарственные препараты, важно учитывать наличие полиморфизма генов, кодирующих белки-транспортеры лекарств, а также генов, кодирующих мишени для этих веществ. Одним из таких генов является ген К-эпоксидредуктазы (VKORC1), продукт которого играет важную роль в процессе метаболизма витамина К и является мишенью варфарина, антикоагулянта непрямого действия, применяемого для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, лидирующих по частоте возникновения, инвалидизации и летальности населения в разных странах [Константинов, 1999; Шевела и др., 2008]. Носительство различных мутаций в гене VKORC1 может повышать как риск развития тромбозов, так и риск кровотечений.

Полиморфизм VKORC1 С1173Т определяет чувствительность индивидов к варфарину путем снижения активности фермента и увеличивает риск кровотечений. Носителям такого варианта следует уменьшать дозу варфарина, подбирая ее с предельной осторожностью [D'Andréa et al., 2005; Reitsma et al., 2005].

Еще одним геном, наличие полиморфизма по которому связано с чувствительностью индивидов к варфарину, кроме CYP2C9 и VKORC1, является CYP4F2. Предполагается, что фермент CYP4F2 участвует в инактивации витамина К путем гидроксилирования его боковой цепи. Установлено, что полиморфизм G1347А (аллель CYP4F2*3, Val433Met) в гене CYP4F2 приводит к снижению функции фермента, в связи с этим витамин К недостаточно инактивируется, и индивидам с мутантным вариантом CYP4F2*3 требуются, напротив, повышенные дозы антикоагулянта [Sontag, Parker, 2002; McDonald et al., 2009]. В этом контексте наличие мутантного аллеля CYP4F2*3 оказывает противоположный эффект по сравнению с вариантами CYP2C9*2, CYP2C9*3 и VKORCl С1173Т.

Представленность тех или иных аллельных вариантов генов БК в популяциях человека существенно зависит от их расовой и этнической принадлежности. Поэтому получение знаний об этнических/популяционных вариациях полиморфных генов БК может иметь решающее значение для выявления в конкретных этнических группах наличие риска развития побочных

лекарственных реакций и патологических состояний, связанных с нарушением работы системы БК.

В настоящее время во многих популяциях человека изучен полиморфизм генов системы БК (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1 и GSTT1) и гена VKORC1 [Вахитова и др., 2001; Garte et al., 2001; Xie et al., 2002; Herman et al., 2003; Ахматьянова и др., 2008; Федорова и др., 2009; Limdi et al., 2009]. Однако для популяций коренных самодийских этносов Северной Сибири имеются лишь единичные неполные исследования по данному вопросу [Duzhak et al., 2000; 2001]. На территории проживания нганасан, селькупов, лесных и тундровых ненцев, на Таймыре и в Ямало-Ненецком автономном округе, начиная с 1960-х годов, происходит бурное развитие промышленности, что ведет к резкому ухудшению экологической обстановки за счет проникновения новых химических веществ и загрязнителей в среду обитания коренных народов, изменению их традиционного уклада жизни. Без сомнений, устойчивость коренных этносов к этим неблагоприятным факторам во многом зависит от структуры их генофондов, от способности метаболизировать чужеродные вещества окружающей среды. Успешное развитие медицины ведет к тому, что значительно увеличивается лекарственная нагрузка на организмы северных жителей. К тому же, меняются стандарты лечения, требующие применения совершенно новых лекарств, с которыми представители коренных народов Севера раньше не сталкивались. Для достижения безопасной и эффективной терапии медикаментами необходимо знать особенности их метаболизма у коренных народов. Исследование самодийских этносов важно и потому, что в их популяциях увеличивается степень метисации с пришлым населением. Этот процесс может способствовать привнесению новых генных вариантов в генофонды этносов и изменению их приспособленности к проживанию в суровых условиях среды и устойчивости к другим неблагоприятным факторам.

Цель данного исследования - изучение полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1) и гена VKORC1 в популяциях коренных самодийских этносов (селькупов, тундровых неЕщев, лесных ненцев, нганасан), и у русских Северной Сибири в контексте выявления межпопуляционных различий и наличия генетических основ предрасположенности или устойчивости различных этносов к онкологическим заболеваниям, а также развитию побочных реакций на терапию лекарственными препаратам.

Согласно поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. изучить распределение полиморфных вариантов генов CYP2C9 (CYP2C9*2 и CYP2C9*3), CYP2D6 (CYP2D6*3 и CYP2D6*4), CYP4F2 (CYP4F2*3) и VKORC1 (VKORC1 C1173T) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов в этнических выборках самодийских популяций и у русских Северной Сибири;

2. изучить распределение «нулевых» генотипов GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя SYBR Green I в этнических выборках самодийских популяций и у русских Северной Сибири;

3. выполнить межпопуляционный анализ по частотам восьми полиморфных вариантов изученных генов в пяти исследуемых этносах, и провести сравнение с европеоидными и монголоидными популяциями, используя современные статистические методы;

4. выявить наличие генетических основ предрасположенности или устойчивости к развитию побочных реакций на терапию лекарственными препаратами на основе полученных частот аллелей и генотипов генов СУР2С9 (СУР2С9*2 и СУР2С9*3), СУР4Р2 (СУР4Р2*3) и УКОЯС1 (УКОКС1 С1173Т) в популяциях коренных самодийских этносов и русских Северной Сибири;

5. выявить генетические основы предрасположенности или устойчивости к онкологическим заболеваниям на основе полученных частот аллелей гена СУР2йб (СУР2Бб*3 и СУРЮб*4) и «нулевых» генотипов ОЭТМ 0/0 и С5ТТ10/0, вероятных маркеров риска развития онкопатологий, в популяциях самодийцёв и русских Северной Сибири.

Научная новизна

Впервые в четырех самодийских популяциях (селькупов, лесных и тундровых ненцев, нганасан) и у русских Северной Сибири (всего 1475 чел.) изучено распределение полиморфных вариантов генов системы биотрансформации ксенобиотиков (СУР2С9*2, СУР2С9*3, СУР2И6*3, СУР2В6*4, СУР4Р2*3, СЗТМ/ 0/0, СБТТ! 0/0) и гена УКОЯС1 (УКОКС! С1173Т), имеющих важное значение в метаболизме лекарственных веществ и канцерогенов.

Впервые выявлено, что в изученных популяциях жителей Северной Сибири существует значимая доля лиц с мутантными аллельными вариантами генов СУР4Р2, УКОЯС1 и лиц - «медленных» метаболизаторов по гену СУР2С9, что, с высокой вероятностью определяет чувствительность данных индивидов к терапии лекарственными препаратами, в метаболизме которых задействованы данные гены.

Впервые на основе пониженных частот мутантных вариантов генов СУР206, С8ТМ1 и ОБТП выдвинуто предположение, что самодийские этносы по сравнению с русскими Сибири на популяционном уровне имеют более низкий риск развития онкологических заболеваний, связанных с полиморфизмом в данных генах.

На основании высокой распространенности у самодийцёв мутантного аллеля УКОЯС1 1173Т, ассоциированного со снижением активностей витамин К-зависимых белков свертывания крови, впервые выдвинута гипотеза об адаптивном значении этого аллеля, вероятно, способствовующего снижению риска развития тромбозных инфарктов миокарда и инсультов у представителей самодийских этносов.

Научно-практическая ценность

Результаты данного исследования

• расширяют знание о распределении частот полиморфных вариантов генов системы БК и гена УКОЯС1, имеющих большое значение в метаболизме ксенобиотиков, в человеческих популяциях;

• могут быть использованы для выявления возможных ассоциаций между определенными заболеваниями и полиморфными вариантами в генах системы БК в изученных популяциях Северной Сибири;

• имеют значение для превентивной медицины при прогнозировании вероятности осложнений на используемые лекарственные препараты, которые метаболизируются ферментами CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1 GSTT1 VKORC1, в целях достижения безопасной и эффективной терапии, а также при проведении профилактических мер против заболеваний, с которыми могут быть ассоциированы мутантные варианты изученных генов;

• вносят вклад в представление о роли генетического полиморфизма генов БК и гена VKORC1 в адаптации популяций к конкретным условиям окружающей среды.

Практические рекомендации

Рекомендуется выявлять носительство аллелей CYP2C9*2 и CYP2C9*3, CYP4F2*3 и VKORC1 1173Тиа индивидуальном уровне в популяциях коренных жителей Северной Сибири с целью достижения безопасного и эффективного лечения варфарином, НПВГТ и другими лекарственными препаратами, в метаболизме которых участвуют ферменты CYP2C9, VKORC1 и CYP4F2.

Положения, выносимые на защиту

1) Популяции коренных самодийских этносов существенно отличаются от популяций русских Северной Сибири, других европеоидов и монголоидов Китая по частотам восьми полиморфных вариантов генов CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, GSTM1, GSTT1 и VKORC1 и образуют отдельный «самодийский» кластер. Наибольший вклад в генетическое разнообразие между этническими группами вносят полиморфные варианты VKORC1 1173Т, GSTT1 0/0, GSTM1 0/0, CYP2D64.

2) В популяциях коренных самодийских этносов и русских Северной Сибири у лиц - носителей мутантных вариантов генов CYP2C9, CYP4F2 и VKORC1 прогнозируется повышенная чувствительность к терапии лекарственными препаратами, метаболизируемыми соответствующими ферментами.

3) У коренных самодийских этносов, имеющих высокую частоту распространенности мутантного аллеля VKORC1 117ЗТ, прогнозируется сниженный популяционный риск развития связанных с тромбозами инфарктов миокарда и инсультов, по сравнению с русскими Северной Сибири.

4) Самодийские этносы, по сравнению с русскими Северной Сибири, на популяционном уровне имеют более низкий риск развития онкологических заболеваний, с которыми ассоциирован полиморфизм в генах CYP2D6, GSTM1 и GSTT1.

Апробация работы

Результаты данной работы были представлены на: IX Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2010 г.); VII международной конференции «Bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology» (Новосибирск, 2010 г.); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-

биологические аспекты мультифакгориальной патологии» (Курск, 2011 г.); семинаре мастер - классе «Актуальные вопросы генодиагностики в современной медицине» (респ. Казахстан, г. Семей, 2011 г.); II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011 г.).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, из них три статьи в отечественных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора

Автор самостоятельно выполнил генотипирование однонуклеотидных замен в генах CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, VKORC1 и делеций в генах GSTM1 и GSTT1, провел статистическую обработку полученных результатов, построил карты генетических дистанций. Автор также принял участие в выделении ДНК.

Структура и объем работы

Работа изложена на 110 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: список использованных сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждение, выводы, список литературы (267 наименований). В тексте представлено 11 рисунков и 19 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В настоящем исследовании приняли участие этнические представители пяти популяций: селькупы, лесные ненцы, тундровые ненцы Ямало-Ненецкого автономного округа, нганасаны полуострова Таймыр и русские Северной Сибири, проживающие в Ямало-Ненецком автономном округе и Красноярском крае (всего 1475 человек).

Генетический материал собирался во время экспедиций в Ямало-Ненецкий АО и п-ов Таймыр сотрудниками лаборатории популяционной этногенетики ИЦиГ СО РАН под руководством к.б.н. Л.П. Осиповой. Выборки ДНК сформированы из общего банка коллекционного материала на основании изучения демографических и генеалогических данных этническими представителями селькупов (N=330), тундровых (N=310) и лесных (N=303) ненцев, нганасан (N=186), русских (N=346); последние использовались в качестве группы сравнения. В эти выборки не вошли метисы разных уровней от браков коренных жителей с русскими и представителями других пришлых этносов. Забор крови производился квалифицированными медицинскими работниками по международным правилам с использованием «Информированного согласия» от добровольцев, практически здоровых на момент исследования.

Генотипирование однонуклеотидных замен в генах CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, VKORC1 проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени (real-time PCR) с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементарных полиморфным участкам ДНК. Каждый образец амплифицировался с использованием пары праймеров и двух зондов,

несущих «гаситель» на 3'-конце и разные флуоресцентные красители (FAM или R6G) на 5'-конце. Работа проводилась с использованием амплификатора ¡Cycler ¡Q 4 (Bio-Rad, USA). Выявление распределениея генотипов проводилось с помощью программы «Bio-Rad iQ5».

Выявление делеций в генах GSTM1 и GSTT1 проводилось с помощью метода real-time PCR с использованием флуоресцентного интеркалирующего красителя SYBR Green I. Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР были выбраны внутри области делеций в генах GSTM1 и GSTT1 таким образом, что это обуславливало отсутствие синтеза соответствующего продукта ПЦР при анализе образцов ДНК с генотипом GSTM1 0/0 или GSTT1 0/0, соответственно. Для того чтобы различить присутствие гомозиготной делеции в генах GSTM1 и GSTT1 от отсутствия ДНК-матрицы или же ингибирования реакции ПЦР, в амплификационную смесь вводили праймеры для амплификации короткого легкоплавкого А/Т-богатого фрагмента ДНК (LTM - low temperature melting). Полученные результаты интерпретировали, исходя из анализа графиков накопления флуоресценции; специфичность реакции оценивалась с помощью кривых плавления.

Статистическая обработка данных. Популяционные частоты аллельных вариантов генов вычисляли на основе наблюдаемых частот генотипов. Оценку соответствия частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием критерия yj (Пирсона), применяя on-line программу, которая доступна по адресу: http://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hvv/hwal.pl (при р>0,05 равновесие выполняется). Статистическую оценку достоверности различий в распределении частот полиморфных аллелей и генотипов между исследованными выборками проводили стандартным методом yj с поправкой Иейтса на непрерывность (при р<0,05 результаты считались статистически значимыми). Для выявления генетических различий между исследованными популяциями мы использовали метод фиксированного индекса и метод главных компонент. Подсчет значений Fst между изучаемыми популяциями осуществлялся с помощью программы Arlequin 3.11. График многомерного шкалирования (MDS Plot), основанный на значениях Fst - матрицы, строился с использованием пакета XLStat (Addinsoft Inc. www.xlstat.com). Построение карт генетических дистанций проводили с использованием метода Харпендинга и Дженкинса [Harpending, Jenkins, 1973].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На основании исследования частот генотипов полиморфных вариантов изученных генов (табл. 1) была проведена проверка на соответствие распределения данных генотипов равновесию Харди-Вайнберга с использованием критерия %2 (Пирсона). Данное равновесие выполняется в каждом случае, что указывает на репрезентативность популяционных выборок.

Частоты встречаемости мутантных вариантов генов CYP2C9, CYP2D6, CYP4F2, VK0RC1, GSTM1 и GSTT1 для пяти популяций показаны в табл. 2.

Таблица 1. Частоты всех генотипов полиморфных вариантов генов СУР2С9, СУР4Р2, СУР2Р6, вБШ!, вЯТТ!, УКОКС! в исследованных популяциях.

Полиморфизм/ ген Частоты генотипов в популяциях, %

Генотипы Селькупы Тундровые ненцы Лесные ненцы Нганасаны Русские Северной Сибири

CYP2C9*2 ас 90,30 (298) 94,19(292) 86,47 (262) 93,01 (173) 74,49 (257)

с/т 9,70 (32) 5,81 (18) 13,53(41) 6,99(13) 23,48(81)

т/т 0 0 0 0 2,03 (7)

CYP2C9*3 А/А 83,94 (277) 92,26 (286) 98,02 (297) 91,94(171) 80,87 (279)

А/С 15,76(52) 7,42 (23) 1,98(6) 7,53 (14) 18,84(65)

С/С 0,30(1) 0,32(1) 0 0,54(1) 0,29(1)

CYP2D6*3 А/А 99,10(327) 100,00(310) 100,00(303) 99,46(185) 96,53 (334)

A/Del 0,90 (3) 0 0 0,54(1) 3,47(12)

Del/Del 0 0 0 0 0

CYP2D6-4 G/G 91,19(300) 87,10(270) 93,31 (279) 85,48(159) 69,10(219)

G/A 9,35 (29) 12,26 (38) 6,69 (20) 13,98(26) 27,40 (87)

A/A 0 0,65 (2) 0 0,54(1) 3,5(11)

CYP4F2*3 G/G 35,45(117) 60,00(186) 65,78(198) 29,57 (55) 49,71(172)

G/A 49,70(164) 33,55(104) 30,90 (93) 50,54 (94) 43,06(149)

A/A 14,85(49) 6,06 (20) 3,32(10) 19,89(37) 7,23 (25)

VKORC1 C1173T C/C 2,73 (9) 7,74 (24) 11,88(36) 1,08(2) 39,88(138)

C/T 25,45 (84) 35,16(109) 41,58(126) 9,68(18) 46,53(161)

T/T 71,82(237) 57,10(177) 46,53(141) 89,24(166) 13,58(47)

GSTM1 0/0 20,00 (66) 32,58(101) 35,31 (107) 9,14(17) 48,09(164)

+ 80,00 (270) 67,42 (209) 64,69(196) 90,86(169) 51,91 (177)

GS1T1 0/0 14,85 (49) 11,94 (37) 9,90 (30) 12,37 (23) 38,71 (132)

+ 85,15(281) 88,06 (273) 90,10(273) 87,63 (163) 61,29(209)

Примечание: в скобках указано количество индивидов с конкретным генотипом; жирным шрифтом обозначены гомозиготные мутантные генотипы.

Таблица 2. Частоты мутантных аллелей генов СУР2С9, СУР2П6, СУР4Р2, УКОКС! и нулевых генотипов БЯТМ! и СЗТТ! в исследованных популяциях, %.

Популяционные выборки (чел.) CYP2C9 CYP2D6 CYP4F2 VKORC1 GSTMI GSTT1

*2Т *ЗС *3 del *4А *ЗА 1173Т 0/0 0/0

Селькупы (330) 4,85 (32/660) 8,18 (54/660) 0,45 (3/660) 4,41 (29/658) 39,70 (262/660) 84,55 (558/660) 20,00 (66/330) 14,85 (49/330)

Тундровые ненцы (310) 2,90 (18/620) 4,03 (25/620) 0 (0/620) 6,77 (42/620) 23,23 (144/620) 74,68 (463/620) 32,58 (101/310) 11,94 (37/310)

Лесные ненцы (303) 6,77 (41/606) 0,99 (6/606) 0 (0/606) 3,34 (20/298) 18,77 (113/606) 67,33 (408/606) 35,31 (107/303) 9,90 (30/303)

Нганасаны (186) 3,49 (13/372) 4,30 (16/372) 0,27 (1/372) 7,53 (28/372) 45,16 (168/372) 94,09 (350/372) 9,14 (17/186) 12,37 (23/186)

Русские Северной Сибири(346) 13,77 (95/690) 9,71 (67/690) 1,73 (12/692) 17,19 (109/634) 28,76 (199/692) 36,85 (255/692) 48,09 (164/341) 38,71 (132/341)

Примечание: в скобках указано отношение количества мутантных аллелей или

образцов ДНК с конкретным генотипом к общему количеству обследованных аллелей или образцов ДНК, в случае которых полимеразная цепная реакция прошла успешно.

Распределение полиморфных вариантов гена CYP2C9 и межпопуляционные различия. Исследование выявило, что в самодийских популяциях по сравнению с европеоидными популяциями русских Северной Сибири, шведов [Yasar et al., 2003], немцев [Ackermann et al., 1997] и словенцев [Herman et al., 2003] частоты мутантных аллельных вариантов СУР2С9*2 и CYP2C9*3 статистически значимо снижены (исключая селькупов, у которых эти различия не достоверны, /?>0,05). Выявлены статистически значимые различия в

частотах CYP2C9*2 между всеми самодийцами и монголоидами Китая, у которых этот аллель отсутствует [Xie et al., 2002], а по частотам CYP2C9*3 с монголоидами Китая значимо различаются селькупы (повышенной частотой) и лесные ненцы (пониженной частотой). В целом, в результате анализа CYP2C9-фенотипов, сочетающих в себе наличие хотя бы одного или обоих мутантных CYP2C9*2- и СУР2СР*5-генотипов (в гомозиготном или гетерозиготном состоянии) - была выявлена значимая суммарная доля лиц - «медленных» метаболизаторов, как среди представителей коренных этносов, так и среди русских Северной Сибири. Данная величина варьирует от 13 % у тундровых ненцев до 25 % у селькупов и максимальна в популяции русских Сибири (40 %), что позволяет нам в данных популяциях прогнозировать наличие индивидуального риска развития побочных реакций на терапию лекарствами, метаболизируемыми CYP2C9.

Распределение полиморфных вариантов гена CYP2D6 и межпопуляционные различия. Частоты мутантного аллельного варианта CYP2D6*3 невысоки во всех исследованных популяциях, причем среди ненцев этот вариант не встречается вовсе, что характерно и для монголоидных популяций Китая и Японии. В популяции русских Сибири частота CYP2D6*3 достоверно выше, чем у самодийцев, и составляет 1,73 % (р<0,05). Эта частота сравнима с таковыми в других европеоидных популяциях: Эстонии [Marandi et al., 1997], Германии [Sachse et al., 1997], Швеции [Yamada et al., 1998] и США [London et al., 1997]. Можно предположить, что, либо существуют селективные механизмы, препятствующие накоплению этого варианта в популяциях, либо же этот аллель имеет сравнительно недавнее эволюционное происхождение, предположительно, в европеоидной ветви.

Частоты мутантного аллельного варианта CYP2D6*4 среди самодийцев статистически значимо различаются с таковыми для русских Северной Сибири, других европеоидов, монголоидов Китая, при этом самодийцы занимают промежуточное положение между европеоидами и монголоидами. В частотах CYP2D6*4 между самодийцами наблюдается как сходство, так и различия (табл. 1). В выборке русских Сибири частота аллеля CYP2D6*4 сходна с частотами для европеоидов Швеции (р=0,06) и США (/>=0,76). В целом, частоты мутантных вариантов гена CYP2D6, первой фазы биотрансформации ксенобиотиков, достоверно ниже в выборках коренных этносов, чем в выборке русских Сибири и в других европеоидных популяциях. Однако результаты исследования мутантных вариантов гена CYP2D6, ответственных за развитие фенотипа «медленный» метаболизатор, могут на индивидуальном уровне иметь значение при прогнозировании вероятности осложнений на используемые лекарственные препараты, которые метаболизируются ферментом CYP2D6.

Полиморфизм CYP4F2*3 (G1347A) гена CYP4F2 и межпопуляционные различия. В популяциях селькупов и нганасан выявлены самые высокие частоты мутантного варианта CYP4F2*3 (различия в частотах между этими выборками не являются статистически значимыми, р=0,30) по сравнению с ненцами (¿>=0,00), русскими Сибири, другими европеоидами (р=0,00) [Scott et al., 2010] и монголоидами Китая (р>0,05) [Deng et al., 2010]. У лесных ненцев частота этого аллеля минимальная (18,8 %) относительно частот в других

популяциях, взятых для сравнения. Индивидам, несущим аллель CYP4F2*3 в гомозиготном или гетерозиготном состоянии, вероятно, потребуются повышенные дозы варфарина. Однако при назначении терапии варфарином для подбора оптимальных доз препарата необходимо учитывать также носительство мутантных аллелей CYP2C9*2, CYP2C9*3 и VKORC1 1173Т, так как в случае их наличия требуются, наоборот, сниженные дозы антикоагулянта.

Распределение «нулевых» генотипов GSTM1 и GSTT1 генов и межпопуляционные различия. Исследование показало, что частоты «нулевых» генотипов обоих генов существенно и статистически значимо ниже в самодийских выборках, по сравнению с русскими Северной Сибири, европеоидами США и Швеции [Garte et al., 2001], монголоидами Китая [Setiawan et al., 2000]. Между самодийскими популяциями наблюдается значительная вариабельность в частотах распределения GSTM1 0/0. Сходство выявлено только между лесными (35,3 %) и тундровыми ненцами (32,6 %; /г=0,67), у которых доля лиц с мутантным генотипом GSTM1 0/0 значимо выше, чем у селькупов (20 %) и нганасан (9,1 %). Частота GSTT1 0/0 в самодийских популяциях не проявляет вариабельности и практически одинакова (в среднем, около 12 %). Наибольшую суммарную частоту встречаемости сочетаний «нулевых» генотипов, GSTM1+ / GSTT10/0, GSTT1+ / GSTM1 0/0, GSTM1 0/0 / GSTT1 0/0, среди изученных популяций имеют русские Северной Сибири (почти 64 %), а наименьшую - нганасаны Таймыра (около 16 %). Ранее было показано, что среди тундровых ненцев, больных раком или имеющих хромосомные аномалии (N=28), частота «нулевого» генотипа GSTM1 0/0 оказалась гораздо выше и составила почти 63 %, по сравнению с частотой GSTM1 0/0, выявленной среди группы здоровых ненцев (N=102; 39,8%) [Duzhak et al., 2000, 2001]. На основании этих данных, а также выявленных существенно и статистически значимо сниженных частот встречаемости вариантов GSTM1 0/0, GSTT1 0/0, CYP2D6*4, известных маркеров онкологических заболеваний, среди самодийцев по сравнению с русскими Северной Сибири мы предполагаем, что селькупы, ненцы, нганасаны на популяционном уровне имеют пониженный популяционный риск развития онкопатологий.

Полиморфизм С1173Т гена VKORC1 и межпопуляционные различия. Выявлено широкое распространение мутантного аллеля VKORC1 1173Т в самодийских популяциях, при этом его частоты значимо варьируют. Частоты аллеля 1173Т в выборках селькупов (84,6 %) и нганасан (94,1 %) превышают таковые для лесных (67,3 %) и тундровых (74,7 %) ненцев и значимо не отличаются от частот в монголоидных популяциях Китая (92,0 %) и Японии (89,1 %) [Larramendy-Gozalo et al., 2006; Takahashi et al., 2006]. В изученных самодийских популяциях частоты аллеля 1173Т существенно и статистически значимо выше, чем у русских Северной Сибири, европеоидов Франции и Швеции (р=0,00) [Osman et al., 2006; Lacut et al., 2007]. Широкое распространение VKORC1 1173T в изученных популяциях, в особенности у самодийцев, может обуславливать повышенную чувствительность индивидов к антикоагулянтам типа варфарина. Высокая частота мутантного аллеля VKORC1 1173Т, ассоциированного со снижением активности фермента VKORC1, а значит, и со снижением активности витамин К зависимых белков свертывания

крови, может способствовать снижению риска развития связанных с тромбозами инфарктов миокарда и инсультов у представителей самодийских этносов.

Значения Р5„ вычисленные на основе частот мутантных вариантов СУР2С9*2, СУР2С9*3, СУР4Р2*3, СУР2й6*3, СУР206*4, УКОЯС1 1173Т. Метод фиксированного индекса используется для выявления степени гетерогенности между популяциями. В табл. 3 представлены значения Р81 между самодийскими популяциями и русскими Северной Сибири. Метод подсчета основан на различии частот однонуклеотидных полиморфизмов между популяциями, поэтому частоты «нулевых» 05ТМ1- и ¿5Т77-гепотипов, обусловленных протяженными делениями в генах, не были включены в анализ.

Таблица 3. Значения Fst-матрицы между исследованными популяциями.

Погтуляционные выборки Селькупы Тундровые ненцы Лесные ненцы Нганасаны

Селькупы

Тундровые ненцы 0,03507

Лесные ненцы 0,07026 0,00948

Нганасаны 0,01241 0,08018 0,13212

Русские Северной Сибири 0,17020 0,12020 0,09559 0,22502

Примечание: каждое значение Fst - матрицы является статистически значимым

(р=0.00000+-0.0000).

На основе значений Fst - матрицы был построен график многомерного шкалирования (MDS Plot) (рис. 1), позволяющий расположить в пространстве исследованные популяции относительно друг друга.

Мера качества отображения (Стресс Крушкаля (1) = 4.773Е-5)

0,8

0,6 • Русские

Северной

Лесные ненцы °.4 Сибири

• Тундровые02

V X i 1- • ненцы

а 1 V -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 1 0,2 0,4 0,6 0,8 1

к» 5 -0,2 •

-0,4 ■

Селькупы •

-0,6 ■ • Нганасаны

-0,8 J

Измерение 1

Рис. 1. График многомерного шкалирования, основанный на значениях р5( - матрицы по частотам аллелей СУР2С9*2, СУР2С9*3, СУР4Р2*3, СУР2Пб*3, СУР2Вб*4, УКОКС1 1173Тдля популяций ненцев, селькупов, нганасан и русских Северной Сибири.

Популяция нганасан оказалась в большей степени «удаленной» от ненцев, в особенности, от лесных (Р51=0,132), проявив статистически значимые различия в частотах встречаемости 5 вариантов (СУР2С9*3, СУР2Б6*4, СУР4Р2*3,

УКОЯС! 1173Т, ОБТМ1 О/О). Результаты исследования частот аллелей и гаплотипов пяти генетических систем крови показали, что нганасаны генетически удалены как от селькупов, так и от ненцев [Осипова и др., 2007].

Карты генетических дистанций. На рис. 2 представлена общая карта генетических дистанций, основанная на частотах всех 8 изученных полиморфных вариантов, показывающая взаимное расположение популяций самодийцев, русских Сибири, других европеоидов и монголоидов Китая.

е2-А2=20,7 %

Монголоиды Китая

Рис. 2. Карта генетических дистанций, построенная на основании частот аллелей CYP2C9*2, CYP2C9*3, CYP4F2*3, CYP2D6*3, CYP2D6*4, VKORC1 U73Tn генотипов GSTM1 0/0, GSTT1 0/0, показывающая расположение популяций самодийцев и русских Северной Сибири в сравнении с монголоидными популяциями Китая и европеоидными популяциями Швеции и США в пространстве двух главных компонент, извлекающих 87,3 % суммарной межпопуляционной изменчивости.

Показано, что селькупы, ненцы и нганасаны удалены как от европеоидных, так и монголоидных популяций, образуя отдельный кластер, указывающий на особый генетический профиль самодийских этносов, каждый из которых имеет свою генетическую основу.

Для того чтобы выяснить, какие полиморфные варианты вносят наибольший вклад в генетическую гетерогенность между сравниваемыми популяциями, было сделано графическое представление расположения изученных полиморфных вариантов в пространстве двух главных компонент (рис. 3). Видно, что наибольший вклад в генетическое разнообразие между популяциями вносят полиморфные варианты VKORC1 117ЗТ, GSTT1 0/0, GSTM1 0/0, CYP2D64.

е27Л2=20,7 %

• СУР2С9'2 СУР2й6*4 • СурЮ6,3

СГР2С9*3

схгш о/о

е1^Л1=бб,б Ч

—•-

СУР4Р2*3

У КОКС Г И73Т

С5777 О/О

Рис. 3. Расположение изученных полиморфных вариантов аллелей и генотипов в пространстве двух главных компонент относительно популяций селькупов, ненцев, нганасан, русских Северной Сибири, монголоидов Китая, европеоидов Швеции, США.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено исследование полиморфизма генов системы БК и гена УКОЯС! в четырех популяциях коренных этносов и у русских Северной Сибири. На основе полученных частот полиморфных вариантов изученных генов наибольшее генетическое сходство выявлено между лесными и тундровыми ненцами. Наибольшее генетическое различие обнаружено между нганасанами и лесными ненцами. Исследование показало также существенные, статистически значимые генетические различия между популяциями самодийцев и русских Северной Сибири, других европеоидов и монголоидов Китая.

На основе выявленных частот мутантных вариантов генов С¥Р2В6, СБТМ1 и СБТП, ассоциированных с риском развития онкологических заболеваний в разных популяциях мира, можно прогнозировать пониженный популяционный риск онкологических заболеваний у самодийцев по сравнению с русскими Сибири. Наименьший риск, вероятно, имеют нганасаны, о чем свидетельствуют самые низкие частоты комбинированного сочетания «нулевых» генотипов вБТв в этой популяции. В связи с этим, предполагается, что увеличивающаяся в самодийских популяциях степень метисации с европеоидами может произвести отрицательный эффект на устойчивость самодийцев к развитию онкологической патологии.

В изученных популяциях выявлена высокая частота варианта УКОЯС1 1173Т и значимые доли «медленных» метаболизаторов, несущих мутантные аллели С¥Р2С9*2 и СУР2С9*3. В связи с этим, у данных индивидов возможен

риск развития побочных реакций на лекарственные препараты, которые метаболизируются через систему СУР2С9.

В популяциях лесных ненцев и нганасан выявлены заметные этнос -специфические особенности. Так, среди лесных ненцев наблюдаются минимальные частоты 5 (из 8 изученных) мутантных вариантов СУР2С9*3, СУР2В6*4, СУР4Р2 *3, вВт 0/0, УКОЯС1 1173Т по сравнению с другими самодийскими популяциями. Нельзя исключить действие факторов микроэволюции (отбора, дрейфа генов) в этой изолированной популяции под влиянием высокого инбридинга, обусловленного высокой частотой родственных браков [Абанина, Сукерник, 1980]. У нганасан, напротив, наблюдаются максимальные частоты аллелей СУР2Б6*4, УКОЯС1 1173Т, СУР4Р2*3 и минимальная доля носителей одновременно двух «нулевых» 05Г^-геиотипов относительно всех исследованных популяций. Возможно, такое распределение частот указанных полиморфных вариантов у нганасан может объясняться известным из истории резким колебанием численности популяции, что могло привести к дрейфу генов или действию отбора.

ВЫВОДЫ

1. Выявлена существенная вариабельность распределения частот полиморфных вариантов генов СУР2С9, СУР206, СУР4Р2, в8ТМ1, С£77У и УКОЯС1 в самодийских этносах и у русских северной Сибири. Наибольшее генетическое сходство обнаружено между лесными и тундровыми ненцами, а наибольшее генетическое различие - между нганасанами и лесными ненцами. Статистически значимые генетические различия наблюдаются между самодийскими популяциями и русскими Северной Сибири.

2. С помощью метода главных компонент показано, что популяции коренных этносов Северной Сибири, будучи генетически удаленными от других европеоидных и монголоидных популяций, образуют отдельный «самодийский» кластер. При этом наибольший вклад в генетическое разнообразие между этническими группами вносят полиморфные варианты VK.OR.Cl 1173Т, СБТТ1 0/0, ОБТМ1 0/0, СУР20б*4.

3. Выявлены значительные доли лиц - «медленных» метаболизаторов, (носители аллелей СУР2С9*2 и СУР2С9*3), носителей мутантных аллелей УКОЯС1 1173Т и СУР4Р2*3 в изученных популяциях, что может обуславливать риск развития побочных реакций на терапию лекарственными препаратами, в метаболизме которых принимают участие ферменты СУР2С9, УКОКС1, СУР4Р2, у исследованных лиц с данными полиморфными вариантами.

4. Обнаружена высокая частота мутантного аллеля 1173Т гена УКОЯС1 в самодийских популяциях (варьирует от 67 % у лесных ненцев до 94 % - у нганасан) по сравнению с русскими Сибири и другими европеоидами (до 40 %). Этот аллель ассоциирован со снижением активности витамин-К зависимых белков свертывания крови. На основании этого можно прогнозировать сниженный популяционный риск развития связанных с тромбозами инфарктов миокарда и инсультов у коренных самодийских этносов. Выдвинута гипотеза об адаптивном значении этого аллеля.

5. Установлено, что в самодийских популяциях частоты мутантных вариантов вБТМ! 0/0, С5ТТ1 0/0, СУР20б*3 и СУ1'206*4, известных как маркеры риска онкологических заболеваний, существенно и статистически значимо снижены, по сравнению с русскими Северной Сибири, что может обеспечивать самодийские этносы меньшим популяционным риском развития онкопатологий.

Список работ, опубликованных по теме диссертационной работы

1. Корчагина Р. П., Осипова JL П., Вавилова Н. А. и др. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков GSTM1, GSTT1, CYP2D6, вероятных маркеров риска онкологических заболеваний, в популяциях коренных этносов и русских Северной Сибири // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2011. № 3. С. 448-461.

2. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Вавилова Н. А. и др. Генетический полиморфизм цитохрома Р450 2С9, участвующего в метаболизме лекарственных препаратов, в популяциях коренных жителей Северной Сибири // Бюллетень СО РАМН. 2011. №6. С. 39-46.

3. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Вавилова Н. А. и др. Генетический полиморфизм VKORC1 С1173Т, определяющий индивидуальную чувствительность к непрямым антикоагулянтам, в популяциях селькупов, тундровых ненцев и у русских Северной Сибири // Вестник Кемеровского государственного университета. 2012. Т. 49. № 1. С. 19 - 23.

4. Korchagina R. P., Osipova L. Р, Senkova N. A. et al. Study of polymorphisms in glutathione S-transferase Ml and TI (GSTM1 and GSTT1) genes in Selkups and Tundra Nenets // Proc. of the seventh internat, conf. on bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology, Novosibirsk, 2010. P. 146.

5. Корчагина P. П., Осипова Л. П., Сенькова H. А. и др. Распределение полиморфных вариантов генов CYP2C9, CYP4F2, VKORC1, ответственных за метаболизм антикоагулянтов в популяции тундровых ненцев .// Материалы девятого Российского конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва, 2010. С. 95.

6. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Воронина Е. Н.и др. Распределение частот полиморфных вариантов генов CYP2D6, GSTM1, GSTT1 - вероятных маркеров предрасположенности к развитию онкопатологий в популяциях нганасан Таймыра И Материалы II Всероссийской научно-практич. конф. с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии». Курск, 2010. С. 68 - 69.

7. Корчагина Р. П., Осипова Л. П., Воронина Е. Н., Филипенко М. Л. Генетический полиморфизм цитохрома Р450 2С9, ответственного за метаболизм варфарина, в популяциях лесных и тундровых ненцев // Тезисы II Международной научно-практич. конф. «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика». Новосибирск, 2011. С. 203.

Подписано к печати 11.04.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л, 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 35

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корчагина, Роза Павловна, Новосибирск

61 12-3/1220

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

(Г

На правах рукописи

КОРЧАГИНА РОЗА ПАВЛОВНА

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ {СУР2С9, СУР4Е2, СУР206, С57Ш, СЛТ77) И ГЕНА УКОКС1 В ПОПУЛЯЦИЯХ КОРЕННЫХ ЭТНОСОВ СЕВЕРНОЙ СИБИРИ

Генетика-03.02.07

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель к.б.н. Л.П. Осипова

Новосибирск 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ...................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................15

1.1. Понятие о полиморфизме генов......................................................................................15

1.2. Понятие о системе биотрансформации ксенобиотиков...............................................16

1.3.1 фаза биотрансформации ксенобиотиков. Цитохромы Р450......................................18

1.3.1. Цитохром Р450 2С9 и его ген СУР2С9 (структура, функции, полиморфизм, популяционные частоты)..........................................................................................20

1.3.2. Цитохром Р450 206 и его ген СУР2В6 (структура, функции, полиморфизм, популяционные частоты)..........................................................................................22

1.3.3. Цитохром Р450 4¥2 и его ген СУР4Р2 (структура, функции, полиморфизм, популяционные частоты)..........................................................................................25

1.4. II фаза биотрансформации ксенобиотиков....................................................................27

1.4.1. Глутатион-Э-трансферазы........................................................................................28

1.4.2. Структура и хромосомная локализация СЯТМ1-геиа. С8ТМ1 и связь с заболеваниями...........................................................................................................29

1.4.3. Структура и хромосомная локализация ОБТТ! и связь с заболеваниями...........................................................................................................31

1.5. Ген ¥КОВ.С1 (строение, полиморфизм). Функции фермента УКОЯС1.....................32

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................................35

2.1. Описание изучаемых популяций коренных этносов Сибири......................................35

2.1.1. Происхождение самодийских народов...................................................................37

2.1.2. Селькупы....................................................................................................................38

2.1.3. Ненцы.........................................................................................................................39

2.1.4. Нганасаны..................................................................................................................40

2.1.5. Русские.......................................................................................................................41

2.2. Методика выделения ДНК..............................................................................................42

2.3. Генотипирование однонуклеотидных замен в генах СУР2С9, СУР2В6, СУР4Р2 и

УКСЖС!............................................................................................................................42

2.4. Выявление делеций в генах С5ТМ1 и Ст5Т77................................................................45

2.5. Метод фиксированного индекса.....................................................................................48

2.6. Метод генетических дистанций Харпендинга и Дженкинса.......................................49

2.7. Статистическая обработка данных.................................................................................49

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................50

3.1. Распределение полиморфных вариантов гена СУР2С9 в исследованных популяциях и межпопуляционные различия.....................................................................................50

3.2. Распределение полиморфных вариантов гена СУ?21)6 в исследованных популяциях и межпопуляционные различия.....................................................................................54

3.3. Полиморфизм 01347А гена СУР4Р2 в исследованных популяциях и межпопуляционные различия........................................................................................57

3.4. Распределение генотипов СБТМ] и ОБТТ! в исследованных популяциях и межпопуляционные различия........................................................................................58

3.5. Полиморфизм С1173Тгена УКОЯС1 в исследованных популяциях и межпопуляционные различия........................................................................................61

3.6. Значения Р8Ь вычисленные на основе частот вариантов СУР2С9*2, СУР2С9*3,

СУР4Р2*3, СУР2И6*3, СУР2Б6*4 и ГКОЯС! 1173Т...............................................63

3.7. Построение карт генетических дистанций....................................................................65

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................................69

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................................83

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................85

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АКО - аминокислотные остатки ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДа - килодальтон мкл - микролитр

НАДФ+ - никотинамиддинуклеотидфосфат окисленный НАДФН - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный нм - нанометр

НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты

ППЦ - полипептидная цепь

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

УДФ - уридиндифосфат

(МТР - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Организм человека постоянно подвергается воздействию различного рода неблагоприятных факторов, в том числе чужеродных, вредных соединений -ксенобиотиков, поступающих из внешней среды (экзотоксины, лекарственные препараты, канцерогены и пр.). Многие химические вещества в среде обитания человека являются продуктами и отходами производства. Естественные и синтезированные химические вещества в воздухе, воде, в лекарствах, в табачном дыме являются потенциальными мутагенами, канцерогенами, тератогенами [Баранов и др., 2000].

Токсическое действие ксенобиотиков на живые организмы определяется их способностью вмешиваться и нарушать течение фундаментальных биохимических процессов жизнедеятельности (синтез белка, дыхание, энергетический обмен, метаболизм), что может быть причиной развития различных заболеваний [Курляндский, Филов, 2002].

В человеческом организме имеются различные механизмы защиты от действия ксенобиотиков. Одним из таких главных механизмов является система биотрансформации ксенобиотиков (БК), представленная тремя фазами. Во время I фазы с помощью системы цитохромов Р450 гладкого эндоплазматического ретикулума ксенобиотики активируются с образованием промежуточных электрофильных метаболитов. Затем различные трансферазы, эпоксидгидролазы и другие ферменты осуществляют нейтрализацию (фаза II) промежуточных метаболитов до нетоксичных продуктов, которые легко выводятся из организма за счет работы физиологических систем выделения (фаза III) [Саприн, 1991; Райе, Гуляева, 2003; Бочков, 2004].

Гены ферментов системы БК высокополиморфны. Именно уникальное для каждого человека сочетание полиморфных вариантов генов соответствующих ферментов определяет индивидуальные особенности работы системы биотрансформации. Наличие полиморфизма способствует различной адаптационной способности, то есть устойчивости или чувствительности индивидов, к воздействию повреждающих внешних факторов (лекарственные препараты, табачный дым, выхлопные газы, отходы промышленного производства,

добавки в продуктах питания, канцерогены, мутагены). В связи с этим, наличие функционально неполноценных вариантов генов системы БК является причиной неблагоприятных ответных реакций организма человека на лекарственные препараты, другие ксенобиотики и предрасполагает к возникновению различных заболеваний, в том числе, онкологических [Баранов и др., 2000; Гуляева и др., 2000; Хуснутдинова, Боринская, 2002; Жученко и др., 2006; Ляхович и др., 2006; Фрейдин и др., 2006; Shi et al., 2008], занимающих второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний [http://www.oncc.ru/;

http://www.sci.aha.ru/ATL/ra53d.htm]. Уже на 1996 год было выявлено более 50 различных патологических состояний человека, ассоциированных с особенностями системы детоксикации [Calabrese, 1996].

Большое внимание во всем мире уделяется изучению полиморфизма генов ферментов БК GSTM1, GSTT1, CYP2D6, рассматриваемых в качестве маркеров чувствительности к онкологическим заболеваниям. Например, показано, что мутантные генотипы GSTM1 0/0, GSTT1 0/0 в сочетании с мутантными гетерозиготными вариантами CYP2D6*1/CYP2D6*3 или CYP2D6*1/CYP2D6*4 ассоциированы с повышенным развитием базальных клеточных карцином [Yang, 2006]. Неоднократно показано, что генотип GSTM1 0/0 связан с повышенным риском развития рака легких, желудка, мочевого пузыря [Seidegard et al., 1990; Alexandrie et al., 1994; Kelsey et al, 1997; Ford et al., 2000; Ляхович и др., 2004; Ляхович и др., 2004 а; Некрасова, 2008; Habdous et al., 2004; Shi et al., 2008; Economopoulos et al., 2010]. Носительство генотипа GSTT1 0/0 также связывают с риском развития некоторых видов рака, одним из которых является рак гортани [Шилова и др., 2009].

Генетические особенности индивида во многом определяются его принадлежностью к определенному географическому региону, популяции, этнической группе. В связи с этим, представленность тех или иных аллельных вариантов генов БК в человеческих популяциях существенно зависит от их расовой и этнической принадлежности. Следовательно, знание о распределении полиморфных аллелей генов системы БК в конкретной популяции необходимо для выявления риска развития патологических состояний, связанных с нарушением работы этой системы. Изучение факторов индивидуальной предрасположенности

человека к различным заболеваниям с учетом этнической принадлежности является актуальной задачей медицины и генетики. В различных этнических группах заболеваемость той или иной патологией различна [Бочков, 2004]. Это различие связано с экологическими, социальными условиями, и также с особенностями генетической структуры, что свидетельствует о необходимости исследования у индивидов, принадлежащим разным популяциям, генов, которые контролируют работу ферментов, участвующих в защите организма от чужеродных веществ, то есть ферментов биотрансформации ксенобиотиков.

Получение знаний об этнических/популяционных вариациях полиморфных генов системы БК может также иметь решающее значение в выборе правильной стратегии лечения фармпрепаратами и достижении эффективной и безопасной терапии, так как метаболизм многих лекарственных препаратов, как и других ксенобиотиков, осуществляется ферментами системы БК. Известно, что у 10-40 % пациентов применение лекарственных средств неэффективно, а у 10 % развиваются нежелательные лекарственные реакции. [1п£е1шап - 8ипс1Ьег§, 2001; Кукес и др., 2007]. Так, противоопухолевый препарат тамоксифен превращается в активный метаболит под действием фермента СУР2Б6, метаболизирующего более 20 % лекарственных препаратов. У носителей аллеля СУР206*4, ответственного за развитие фенотипа «медленный» метаболизатор, снижена скорость образования активного метаболита, что приводит к снижению длительности периода ремиссии и выживаемости [7огс1апа, 2007; Яоп, 2008]. У индивидов с генотипом СУР20б*4/СУР20б*4 при применении антидепрессанта флуоксетина возможно развитие нескольких побочных реакций, одной из которых является агрессивное поведение [Кукес, 2010].

Изофермент цитохрома Р540 СУР2С9, который составляет примерно 20 % от общего содержания всех цитохромов Р450 в печени человека и метаболизирует около 10 % важных лекарственных препаратов таких, как НПВП, антикоагулянт варфарин, применяющийся для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, противодиабетические и другие лекарства [Шевела и др., 2008]. Известно, что сердечно-сосудистые заболевания являются одним из главных факторов, представляющих собой угрозу для жизни населения в разных странах. К таким заболеваниям относятся инфаркт миокарда и инсульт, развивающиеся в

результате тромбозов в системе коронарного кровообращения и сосудов мозга, соответственно, а также тромбоэмболические осложнения [Чазов, 1992; Константинов, 1999; Мезенцева, Кеббель, 2004]. Важной задачей является предотвращение развития тромбозов и, следовательно, связанных с ними инфарктов и инсультов. И одним из способов ее решения является терапия непрямыми антикоагулянтами (варфарином) [Hart et al., 1999]. Однако, существует серьезная проблема индивидуального подбора оптимальной дозы этого препарата, имеющего узкий терапевтический диапазон, так как часто у пациентов развиваются побочные реакции в виде чрезмерной гипокоагуляции, что приводит к внутренним кровотечениям [Семиголовский, 2007].

Оказалось, что именно носительство полиморфных вариантов CYP2C9*2 и CYP2C9*3 в гене CYP2C9, наиболее распространенных среди европеоидов, приводит к значительному снижению активности фермента. Вариант CYP2C9*2 снижает активность фермента до 12 %, а вариант CYP2C9*3 - до 5 %. В результате, индивидам с мутантными генотипами требуются более низкие дозы варфарина во время терапии. Но исследователи отмечают, что даже при нормальном генотипе развиваются нежелательные реакции на варфарин. Это говорит о том, что полиморфизм в гене CYP2C9 - не единственный фактор, ассоциированный с изменением характера ответа организма на воздействие этого лекарства во время лечения [Pirmohamed, Park, 2003; Сироткина и др., 2004]. Кроме того, индивидам, имеющим варианты CYP2C9*2 и/или CYP2C9*3 в гене CYP2C9, также необходимо с осторожностью принимать НПВП (диклофенак, ибупрофен, целекоксиб и пр.), противодиабетические (толбутамид), противоэпилептические (фенитоин) и другие лекарственные препараты, метаболизируемые CYP2C9, во избежание развития побочных реакций [Goldstein, 2001; Lee et al., 2003; Sanderson et al., 2005].

Важным фактором, определяющим индивидуальные особенности ответа организма на лекарственные препараты, кроме полиморфизма генов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9, CYP2D6 и др.) является полиморфизм генов, кодирующих белки-транспортеры лекарств, а также генов, кодирующих мишени этих веществ. Одним из таких генов является ген витамин К-эпоксидредуктазы (VKORC1), которая является мишенью непрямого антикоагулянта варфарина. Фермент VKORC1 переводит неактивную окисленную

форму витамина Kl, поступающую в организм, в активную восстановленную форму, участвующую в посттрансляционном карбоксилировании витамин К-зависимых белков (в частности, факторов VII, IX, X внешнего пути свертывания крови). Мутации в гене VKORC1 могут повышать риск развития тромбозов или, наоборот, кровотечений. Так, полиморфизм VKORC1 С1173Т ответственен за чувствительность индивидов к варфарину и увеличивает риск кровотечений, так как связан со сниженной функцией фермента, следовательно, для носителей такого варианта (в гомо- и гетерозиготном состоянии) дозу варфарина следует подбирать с предельной осторожностью [D'Andréa et al., 2005; Reitsma et al., 2005].

Существует еще один ген, наличие полиморфизма в котором связано с чувствительностью индивидов к варфарину, - это CYP4F2, расположенный в хромосоме 19 (р13.12) и экспрессирующийся в тканях печени, легких, сердца, почек и в лейкоцитах. В организме человека фермент CYP4F2 выполняет несколько важных функций и одна из них, как предполагают исследователи, -участие в инактивации витамина К путем гидроксилирования его боковой цепи. Установлено, что полиморфизм G1347A (аллель CYP4F2*3, Val433Met) в гене CYP4F2 приводит к снижению функции фермента, в связи с этим индивидам с мутантным вариантом CYP4F2*3 требуются повышенные дозы антикоагулянта [Sontag, Parker, 2002; McDonald et al., 2009].

В настоящее время во многих популяциях человека изучен полиморфизм генов системы биотрансформации ксенобиотиков (CYP2C9, CYP4F2, CYP2D6, GSTM1, GSTT1) и гена VKORC1 [Вахитова и др., 2001; Garte et al, 2001; Xie et al., 2002; Бигатти и др., 2007; Григорьева и др., 2007; Ахматьянова и др., 2008; Федорова и др., 2009; Limdi et al., 2009; Гончарова и др., 2010]. Однако для коренных самодийских этносов Северной Сибири имеются лишь единичные неполные исследования по данному вопросу. На территории проживания нганасан, селькупов, лесных и тундровых ненцев, на Таймыре и в Ямало-Ненецком автономном округе, начиная с 1960-х годов, происходит бурное развитие промышленности (Норильский горно-химический комбинат, нефтегазовый сектор), что ведет к изменению традиционного уклада жизни коренных народов, к проникновению новых химических веществ, загрязнителей в среду их обитания. Успешное развитие медицины способствует активному проникновению

лекарственных препаратов в среду коренных северных жителей. К тому же, меняются стандарты лечения, требующие применения все новых лекарств, с которыми коренные народы Севера раньше не сталкивались. Для того чтобы терапия медикаментами была безопасной и эффективной, необходимо знать особенности их метаболизма у коренных сибирских этносов.

Увеличение содержания токсических веществ, канцерогенов, мутагенов и подобных ксенобиотиков в среде проживания северных народов в настоящее время способствует развитию патологических состояний у индивидов [Чойнзонов и др., 2004; Манчук и др., 2006]. Без сомнений, устойчивость коренных этносов к этим неблагоприятным факторам во многом зависит от структуры их генофондов, от способности метаболизировать чужеродные вещества окружающей среды, воздействующие на организм. Исследование коренных самодийских этносов важно и потому, что в популяциях самодийцев у