Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация генов-супрессоров опухолевого роста на коротком плече хромосомы 3 человека и возможные пути их инактивации

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация генов-супрессоров опухолевого роста на коротком плече хромосомы 3 человека и возможные пути их инактивации"



На правах рукописи

МАЛЮКОВА АЛЁНА ВЛАДИМИРОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА НА КОРОТКОМ ПЛЕЧЕ ХРОМОМСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА И ВОЗМОЖНЫЕ ПУТИ ИХ ИНАКТИВАЦИИ.

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИ генетика») и в институте Микробиологии и Биологии опухолей, Каролинский Институт, Стокгольм.

Научный руководитель: Кандидат химических наук Кандидат биологических наук

Брага Элеонора Александровна Забаровский Евгений Реонардович

Официальные оппоненты: Член-корр. РАН Доктор биологических наук

профессор Габибов Александр Габибович

Кандидат биологических наук Прохорчук Егор Борисович Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится «_»_2004г. в_часов на заседании

Диссертационного Совета Д при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмоов по адресу: Москва, 117545, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Реферат разослан «_»_2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук

^^^ В-И.ЩеРбаКОва

Актуальность проблемы. Геми- и гомозиготные делеции на коротком плече хромосомы 3 (Зр) встречаются в большинстве опухолей разной локализации. Кроме того, эти генетические изменения являются ранними событиями в патогенезе множества злокачественных новообразований, так как выявляются в доброкачественных опухолях и предраковых дисплазиях. Частые геми- и гомозиготные делеции и способность субхромосомных фрагментов Зр подавлять рост опухолей, позволяют предположить локализацию в этом протяженном районе нескольких генов-супрессоров опухолевого роста. Хотя данные, свидетельствующие о важной роли Зр-плеча в патогенезе опухолей, были опубликованы более десяти лет назад, значительные успехи в идентификации генов, обладающих супрессор-ными функциями, были достигнуты недавно. Значительным успехом было определение эпигенетического механизма инактивации генов. Эти достижения ведут к развитию новых диагностических и терапевтических стратегий, направленных на предотвращение и лечение опухолевых новообразований. На данный момент известно, что генетические и эпигенетические изменения некоторых генов, расположенных на коротком плече хромосомы 3, играют значительную роль в канцерогенезе. Но все еще не ясно, сколько же генов-супрессоров находится на коротком плече хромосомы 3, и кто из многочисленных кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста играет ключевую роль в опухолевом патогенезе.

Цель и задачи исследования.

Представленная работа посвящена идентификации и характеристике новых кандидатов в гены супрессоры опухолевого роста и определению возможных путей их инактивации. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:

1. Определить уровень метилирования гена-супрессора опухолевого роста ЕЛ88Ж1Л в плоскоклеточных карциномах шейки матки (8СС) и сравнить частоту метилирования промоторного района гена ЕЛ88Ж1Л и геми- и гомозиготных делеции в полиморфных и неполиморфных локусах, окружающих этот ген (Б381568, Б384614 и N¿3-001).

2. Исследовать уровень метилирования промоторного района предполагаемого гена-супрессора опухолевого роста 8ета3В в эпителиальных опухолях разной локализации.

3. Определить уровень экспрессии генов КВ8Р3 и и8Р4 в опухолевых клетках.

4. Оценить влияние соматических мутаций генов КВ8Р3 и и8Р4 на их инактивацию.

5. Изучить влияние белковых продуктов генов КВ8Р3 и и8Р4 на измепение содержания в клетке фосфорилированной и дефосфорилированной формы белка ЯБ.

Научная новизна работы.

В данной работе проведен анализ метилирования промоторных районов генов ЗгтаЗБ и ЕЛЗЗЖЫ в эпителиальных опухолях различной локализации. Проведенные исследования позволяют оценить вклад эпигенетической модификации генов ЗгтаЗБ и на их

инактивацию и определить взаимосвязь метилирования с опухолевой прогрессией. Для гена ЯБЗРЗ уточнена последовательность 5" района и определены два варианта альтернативного сплайсинга. Для генов ЯБЗРЗ и и$Р4 впервые определен относительный уровень экспрессии в клеточных линиях эпителиальных опухолей и первичных опухолях. Экспрессия данных генов была снижена во многих опухолях по сравнению с клетками нормальной ткани. Для гена ЯБЗРЗ были найдены мутации в клеточных линиях и первичных опухолях разной локализации. С целью выяснения функций белковых продуктов генов КБЗРЗ и и$Р4 в клетке изучено их влияние на активную и неактивную формы белка КБ. Показано, что транзиентная экспрессия ЯБЗРЗ приводит к снижению содержания фосфо-рилированной формы белка ЯБ в клетках, и, следовательно, к остановке клеточного цикла на границе перехода из 01 в 8 фазу. Практическая ценность работы.

Разработка новых онкомаркеров доклинической диагностики и маркеров, выявляющих изменения в опухолевых клетках, которые приводят к ухудшению клинического прогноза, очень актуальна- Не менее актуален поиск генов, вовлеченных в развитие и прогрессию опухолей. Идентификация генов с аномальным метилированием их промоторных районов, открывает широкие перспективы для создания принципиально-новых подходов к диагностике и прогнозированию распространенных и социально значимых онкологических заболеваний (таких как рак легкого, почки, молочной железы, яичников и шейки матки). Определение новых генов-супрессоров опухолевого роста и изучение их функциональной активности может способствовать решению задач генной терапии. Апробация работы.

Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП "ГосНИИ Генетика" от 13 января 2004 г.

Результаты настоящей работы докладывались на конференциях программы РФ «Геном человека», (Москва 2000 и 2002 г.), на конгрессе Международной организации по изучению генома человека НОМ* 2002 (Шанхай, Китайская народная республика, 2002 г.), на конференции Федерации Европейского Биохимического общества (РББ8 2002 г., Стамбул, Турция), на конгрессах Американской ассоциации раковых исследований (ЛАСК: Бостон, США, 2002 г., Торонто, Канада, 2003 г.).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 4 статьи, а также тезисы докладов и сообщений на международных конференциях.

Структура диссертации: Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на ПО страницах машинописного текста и содержит 10 таблиц и 24 рисунка.

Анализ уровня метилирование гена супрессора RASSFIA в опухолях шейки матки

В регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, все большая роль отводится метилированию CpG-островков в промоторных районах (Att-wood et al., 2002, Jain, 2003). Эпигенетическая модификация регуляторных участков нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя эти участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-парами (Methyl-CpG binding proteins), и, кроме того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние (Bird, 2002, Prokhorchouk et al., 2002). Эпигепети-ческая модификация промоторных районов вызывает инактивацию транскрипции у многих генов-супрессоров опухолевого роста. Метилирование CpG-островков в промоторных районах, было выявлено для нескольких кандидатов в TSG на хромосоме 3 (Zabarovsky et al., 2002, Брага и др., 2003). В то же время, генетические мутации в генах из критичного района ШСА (Зр21.31) наблюдали с частотой менее 10% (Lerman et al., 2000).

Исследования функциональной активности гена RASSFIA Зр21 Л, выполненные в последнее время в лаборатории Забаровского Е.Р. (Каролинсий институт, Швеция), подтвердили его роль гена-супрессора опухолевого роста. Экспрессия гена RASSFIA снижается в различных опухолевых клеточных линиях, в том числе при немелкоклеточном и мелкоклеточном раке легкого, карциноме молочной железы, почечноклетчоном раке и карциноме щитовидной железы (Dreijeiink et al., 2000, Kuzmin et al., 2002). Инактивация гена RASSFIA связана с метилированием его промоторного района, которое встречается в различных эпителиальных опухолях с частотой от 40 до 90% (Pfeifer et al 2002, Damman et al., 2003). Метилирование гена RASSFIA относится к ранним событиям канцерогенеза, поскольку выявляется в предраковых клетках и в гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли. Инактивация гена RASSFIA в результате метилирования промоториого района может повышать вероятность летального исхода в ~2,2 раза у пациентов с адсно-карциномой легкого I стадии. Таким образом, метилирование гена RASSFIA может служить маркером плохого прогноза. Нуклеотидная последовательность промотрного района

гена RASSF1A показала на рис. 1, где также показаны 13 CpG пар, исследованных в данной работе.

Был выполнен компьютерный анализ промотроного района гена RASSF1A (WEBGENE, www.itba.mi.cnr.it/webgene ) и найдены участки связывания нескольких транскрипционных факторов, имеющих в своем составе CpG островки: c-Myb, с-Мус/Мах, SPl,C/EBP,AhR/Arnt.

Рисунок 1. Схема фрагмента гомозиготно делетированнного в клеточной линии рака молочной железы. Структурная организация гена RASSF1A. Нук-леотидная последовательность промоторного района

RASSF1A. 13 CpG пар выделены подчеркиванием и жирно, позиции праймеров для МЧРА -подчеркиванием.

В данной работе для определения степени метилирования гена RASSF1A в злокачественных опухолях шейки матки был применен анализ с помощью метил-чувствительных рестриктаз с последующей ПЦР (МЧРА). Были использованы три таких рестриктазы Hpall, Hha\и 2Л12361, которые позволили исследовать статус метилирования 13 CpG-nap (рис. 1) промоторного района RASSF1A. Корреляция МЧРА с другими методами, такими как бисульфитное секвенирование и ПЦР, специфичный к метилированному аллелю (МСП) установлена с достоверной вероятностью ранее (по Спирману с помощью t-теста Стьюдента Р«10"6) (Логинов и др., 2004).

Для подтверждения полученных данных проводили амплификацию фрагмента RASSFlA-int, 150 п.н. Этот анализ был выполнен на образцах ДНК, расщепленных рест-риктазой Hhal. ПЦР проводили одновременно с амплификацией фрагмента RAR-f}2, для подтверждения полноты рестрикции.

Согласно полученным данным, промоторный район гена RASSF1A метилирован в СС с частотой 63% (26/41), а в гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли, - с частотой 22% (2/9) (Табл. 1, Р=0,03). Различие в степени метилирования опухоли и морфологически нормальной ткани еще более выражено при сравнении статуса метилирования всех 13 CpG-nap фрагмента, (Р<10-6). Аналогичные различия обнаружены между лейкоцитарной ДИК больных и здоровых доноров (Табл. 1).

ATCTCffi^TGG7G<nTTOcgGTcgC^TcfTTC7rOOCCOT-Cc^M<nt3GG(JrOTaAOOAO OGAc^AOGAQOQAAOGAAflGGCAAGGcgQQGQOOOCrCrGcgAQAOjgjgCCCAOC

CCTTCCcEC<iCCCAOTCTCGATCatXXXK»maCro

ATCTOOg<XWAGCCTCAgCTCATTC'ACCTCCQOGAflCrOOCACC 3'

Таблица 1. Уровень метилирования гена ЯА88¥1Л при плоскоклеточном раке шейки матки согласно данным МЧРА (рестриктазы Нра11, Нка\и ВвЫ2361)

Выборка образцов Частота метилирования* Уровень метилированных CpG-nap**

Р* 0,03058 7,5х11Г7

ДНК опухоли N=39 25/39, 64% 206/507,41%

ДНК условно нормальной ткани N=9 2/9,22% 20/117,17%

Р* 0,0934 4,13x14"

ДНК лейкоцитов больных N=3 2/3, 67% 22/39,56%

ДНК лейкоцитов здоровых доноров N=10 0/10,0% 0/130,0%

*Доля образцов ДНКиз данной выборки, в которыхген RASSF1Aметилирован.

** В составе образцов ДНКсоответствующей группы в каждом случае рассмотрены 13

CpG-nap.

*Достоверностьрассчитана спомощью теста Фишера.

Собранная коллекция образцов СС по гистологическому типу представляла более чем на 80% плоскоклеточный рак (SCC), и, таким образом, мы можем охарактеризовать наиболее точно частоту метилирования гена RASSF1A именно при этом виде рака, которая составила 65% (22/34). Частота метилирования при аденокарциноме составила близкую величину 67% (2/3), однако выборка этого типа рака шейки матки была недостаточно представительна для ее описания.

Следует отметить, что все исследованные образцы СС (41 случай) были инфицированы вирусом папилломы человека. Интеграция HPV 16 преобладала над другими типами HPV, составляя более 80% случаев. В связи с этими данными мы уточнили частоту метилирования RASSFJA в опухолях СС при заражении HPV 16, которая составила 60% (18/30) при анализе всех исследованных опухолей СС и 59% (16/27) в случае плоскоклеточного рака. При интеграции HPV18 и других типов частота метилирования RASSF1A достигала 80% и 100%, но по причине недостаточного количества таких образцов различие осталось статистически не достоверным.

Выборка была разделена на случаи с метастазами в регионарные лимфоузлы и случаи без метастазов. Выяснилось, что частота метилирования гена RASSF1A (или доля

образцов опухолей с метилированием этого гена) в 1.4 раза выше в случаях с метаетазиро-ванием в регионарные лимфоузлы (79% и 55% соответственно, табл. 2).

Таблица 2. Корреляция между уровнем метилирования гена КА88Р1Л и степенью мета-стазирования опухоли в регионарные лимфоузлы при плоскоклеточном раке шейки матки.

Оценка уровня метилирования Случаи с метастазами Случаи без метастазов I*

Частота метилирования* 11/14,78.6% 12/22,54.5% 0.17

Уровень метилирования СрС-пар** 110/182,60.4% 81/286,28.3% 8.5х1(Г12

*Доля образцов ДНКиз опухолей данной выборки, в которых ген RЛSSF1Лметилирован; исследованная группа суммарно составляет 36клинически охарактеризованныхслучаев. ** В составе образцов ДНКсоответствующей выборки в каждом случае рассмотрены 13СрО-пар.

* Достоверностьрассчитана спомощью теста Фишера.

Более детальный анализ уровня метилирования с учетом статуса метилирования каждой из 13 СрО-пар, исследованных в данном фрагменте гена, выявил двукратное превышение уровня метилирования гена RЛSSF1Л в образцах опухолей с метастазами в регионарные лимфоузлы (60% и 28%, табл. 2). Прямая корреляция между уровнем метилирования гена RЛSSFJЛ и метастазированием в регионарные лимфоузлы статистически достоверна (Р</СТ", табл. 2). Выражешшх корреляций уровня метилирования с размером опухоли или уровнем дифференцировки опухолей не было найдено.

Метилирование гена ИЛ88ПЛ - одни из доминирующих способов его инактивации при плоскоклеточном раке шейки матки

Ранее была установлена корреляция между метилированием СрО-островка промо-торного района RЛSSFJЛ и инактивацией этого гена. Частота метилирования гена RЛSSF1Л была сопоставлена с частотой других аберраций в данном районе.

Приведенные данные получены как с помощью аллелотипирования полиморфных локусов района ЬиСЛ, содержащего ген RЛSSFIЛ - маркеров D3S1568 и D3S4614, так и методом количественной ГЩР в реальном времени (с использованием неполиморфного маркера КЬ3-001, локализованного также в районе ШСА). Как следует из таблицы 3, частота метилирования гена RЛSSFIЛ в опухолях 8СС почти вдвое превышает частоту гемизиготных делеций и многократно - частоту гомозиготных делений вблизи этого локу-са.

Таблица 3. Частота генетических и эпигенетических изменений в районе гена ЯАЗЗЕЫ при плоскоклеточном раке шейки матки.

Локусы района LUCA (3р21.31-р21.2, бООт.п.н.) Генетические/ Эпигенетические Изменения Частота

D3S1568. D3S4614* Гемизиготные делеции 11/34,32%

NL3-001** Гемизиготные делеции 10/32,31.3%

Гомозиготные делеции 5/32,15.6%

RASSFJA Метилирование 25/39,64%

*Данные получены на основе анализа потери гетерозиготности в полиморфныхлокусах D3S1568и D3S4614(Braga etal, 2002, Брага и др., 2004)

** Данные получены методом количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием неполиморфногомаркера NL3-001 (Senchenko etal., 2003).

Высокая частота метилирования гена RASSF1A при SCC, составившая в данной работе 64% (25/39), согласуется с данными по метилированию этого гена в других эпителиальных опухолях: 60-90% при почечноклеточном раке, 60% при раке молочной железы и 40-60% при раке яичников (Dreijerink et al., 2000, Pfeifer et al., 2002, Damman et al., 2003, Логинов и др., в печати)

Более высокая частота метилирования анализируемого нами гена в опухолях с ме-тастазированием в регионарные лимфатические узлы, чем в опухолях без метастазов была отмечена ранее при раке молочной железы (Muller et al., 2003)

Метилирование гена RASSF1A в 3 из 9 образцов тканей без видимых морфологических признаков трансформации, прилегающих к опухоли, свидетельствует в пользу раннего появления этого события при развитии опухолей шейки матки. Метилирование гена в лейкоцитарной ДНК больных в отличие от лейкоцитарной ДНК здоровых доноров может указывать на системный характер нарушения метилирования гена RASSF1A у некоторых больных, как это было показано для гена IGF 2, статус метилирования которого нарушался не только в опухолях кишечника, но и в лейкоцитах больных (Cui et al., 1998).

Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что метилирование гена RASSF1A является ранним событием при развитии опухолей шейки матки, а также о том, что уровень метилирования гена увеличивается с прогрессией опухолей.

Эпигенетическая инактивация гена Бета ЗВ в первичных опухолях и клеточных линиях рака почки, легкого и яичников.

Для гена Sema3B, локализованного в составе критичного района LUCA (3р21.31), ранее было установлено полное метилирование CpG островка в 5' области гена в клеточных линиях рака легкого, которое коррелировало с инактивацией' экспрессии данного гена (Tomizawa et al., 2002) Для точного картирования 5' области гена Sema3B был выполнен RACE (rapid amplification ofcDNA ends) ПЦР. Были получены и секвенированы

Рисунок 2. Схемарайона, гомозиготно делетироеанного в кле-точнойлинии ОЬС2в. Структурная организация гена 8ета3В и нуклеотидная последовательность промоторного района этого гена; праймеры и 9 СрО пар выделены подчеркиванием

перекрывающиеся клоны кДНК, нуклеотидную последовательность которых анализировали с помощью программы WEBGENE (www.itba.mi.cnr.it/webgene) Согласно полученным данным существует единственный промоторный район гена 8ета3В, который расположен левее первого нетранслируемого экзона (-778 п.н.) (рис.2). В этом районе были найдены участки связывания многих транскрипционных факторов, имеющих в своем составе CpG островки: ЬуМ, БекаЕЕ-1, ТсМ1, с-МуЬ, 8Р1, С/ЕВР, АИИ/АЛ

Для определения степени метилирования гена БетаЗВ в злокачественных опухолях был применен метод бисульфитного секвенирования. Данный подход основан на бисуль-фитной конверсии ДНК в результате взаимодействия молекул гидросульфита с цитози-ном в составе одноцепочечной ДНК. При этом происходит замена остатков цитозина на урацил, 5-метилцитозин дезаминированию не подвергается. В дальнейшем исследуемый фрагмент амплифицируют и секвенируют, при этом все остатки урацила и тимина ампли-фицируются, как тимин, и только 5-метилцитозин воспроизводится как цитозин. Метод позволил исследовать уровень метилирования 9 CpG-nap (рис. 2) промоторного района БетаЗВ. Нуклеотидная последовательность промоторного района БетаЗВ (3р21.31, ЕУСА) представлена на рис. 2, на котором также показаны 9 CpG-nap фрагмента. Резуль-

тат бисульфитного секвенирования фрагмента содержащего две CpG-mры внутри исследуемого района показан на рис. 3.

Были использованы образцы ДНК первичных опухолей почки, легкого и яичников и соответствующих гистологически нормальных тканей. Кроме того, были исследованы 9 клеточных линий рака почки и 5 клеточных линий рака легкого. Рассчитана доля метилированных CpG пар из 9 исследованных в образцах соответствующей группы. Данная величина включает и частоту встречаемости случаев, в которых этот ген метилирован и плотность метилирования фрагмента. Из данных таблицы 4 можно сделать вывод, что уровень метилирования гена ЗгтаЗВ в первичных опухолях разной локализации колеблется в пределах 23-44%, аналогично в клеточных линиях рака легкого ^СЬС)-23%. Несопоставимо выше уровень метилирования данного CpG островка в клеточных линиях рака почки, который достигает 82%, однако в первичных опухолях рака почки уровень метилирования составил всего 23% (Рис.4 ). Возможно, в некоторых случаях клеточные линии могут давать завышенные значения уровня метилирования. Вероятно, это связано с более злокачественным фенотипом клеточных линий. Совершенно другая картина метилирования наблюдается при раке легкого. В клеточпых линиях мелкоклеточного рака легкого частота метилирования составила 40% (2/5), а в биопсиях рака легкого - 78% (11/14), однако различия становятся менее значительными при расчете плотности метилирования - 29% (13/45) в клеточных линиях мелкоклеточного рака легких и 23% (30/126) в биопсиях рака легкого NSCLC (табл. 4). В предыдущих работах был выявлен высокий уровень метилирования ЗгтаЗВ в опухолях легкого. Частота метилирования гена ЗгтаЗВ в первичных опухолях выявленная в данной работе - 78% и клеточных линиях SCLC - 40% согласуется с данными других авторов (Tomizawa et а1., 2002) по метилированию этого гена - 41% (в первичных опухолях ШСЬС) и 50% (в клеточных линиях ШСЬС).

ТССССАСТАССТАСССвАТ

ТСССЛАСТАССТАСССААТ

Б

Рисунок 3. Результат бисульфитного секвенирования 19 нуклеотидного фрагмента промоторного района гена БетаЗВ. А- опу-хо1ь, Б—норма.

Рис 4. Схематическое изображение данных по метилированию промо-торного района гена ^етаЗВ в клеточных линях и первичных опухолях ЯСС и -метилированная СрО-пара; О - неметилированная СрО-пара; результат бисулъфитного секвени-рования гена БетаЗВ в данном образце ДНК.

Высокая частота (40-100%) и высокий уровень (23-82%) метилирования Sema3B в первичных опухолях и клеточных линиях рака почек, легкого и яичников свидетельствует в пользу того, что метилирование данного гена носит системный характер и, вероятно, является общим путем инактивации гена БетаЗВ при развитии эпителиальных опухолей.

Таблица 4. Частота и уровень метилирования гена 8ета3Б в клеточных линиях и первичных опухолях разной локализации

*Доля образцов ДНК из опухолей данной выборки, в которых ген Sema3Bметилирован ** В составе образцов ДНКсоот-ветствующей выборки в каждом случаерассмотрены 9СрО-пар.

Гистологнческа» характеристика образцов Частота* Уровень** мети-

метилирования лировании*

Биопсии ОС 6/7, 85% 28/63, 44%

Биопсии ЯСС 5/10, 50% 21/90, 23%

Клеточные 9/9 67/81

линии ЯСС 100% 82%

Биопсии 11/14 32/126

^СЬС 78% 25%

Клеточные 2/5 13/45

линии 8СЬС 40% 29%

Кандидат в гены-супрессоры опухолевого роста - USP4

USP4, ген убиквитин специфической протеазы, относится к новому критичному району Зр (D3S2409-D3S3667, 600т.п.н.), содержащему кластер генов, потенциально связанных с эпителиальными опухолями разных локализаций. Профиль потерь гетерозиготности (LOH) содержит максимум LOH маркера D3S2409 от 32% при раке шейки матки до 82% при раке почки. Известны два варианта сплайсинга гена USP4: UnpEL и UnpES. В белке UnpES отсутствуют 47 аминокислотных остатков (232 - 280 а.о. белка UnpEL). Структурная организация гена показана на рисунке 5.

Рисунок 5. Схема критичного района Б382409 -Б382456. Структурная организация гена и8Р4

Экспрессия гена и8Р4 в клеточных линиях эпителиального рака различной локализации и биопсиях рака почки, рака шейки матки и карциномы яичников.

Чтобы оценить уровень экспрессии гена и8Р4, был проведен анализ содержания РНК этого гена методом количественной ПЦР в режиме реального времени (РВ-ПЦР) в 12 клеточных линиях мелкоклеточного рака легкого, рака почки, карциномы яичников, рака шейки матки и биопсиях рака почки, карциномы яичников, рака шейки матки (рис. 6). Праймеры были подобраны так, чтобы различить два варианта альтернативного сплайсинга ипрЕЕ и ипрЕ8. Относительный уровень экспрессии ипрЕЕ и ШрЕ8 был рассчитан с помощью сравнительного Ст метода. В клеточных линиях мелкоклеточного рака легкого и почечнокле-точного рака не было отмечено значительных изменений уровня экспрессии гена ипрЕЕ. В то же время в клеточной линии карциномы яичников и одной из клеточных линий карциномы шейки матки было отмечено снижение экспрессии по сравнению с экспрессией данного гена в гистологически нормальной ткани шейки матки. Другой паттерн экспрессии гена ипрЕЕ был найден в биопсиях опухолей: в четырех образцах экспрессия увеличивалась и только в

двух из девяти биопсий (два образца рака шейки матки), экспрессия была существенно снижена (рис. 6)

Рисунок б Профиль экспрессии гена UnpEL вразличныхклеточныхлшияхэпителиальных опухочей и первичных опухолях, нормированный на экспрессию внормальной ткани. Экспрессия гена UnpEL внормальной ткани принята за J HI46, N417, U2020,ACC-LC5SCLC клеточныелинии ACHN, 786-0- клеточныелинии RCC,IT, 2T, ЗТ, 4Т- первичные опухоли ЯСС, CaOvклеточнаялиния карциномы яичников, 5Т, 6Т- первичные опухоли яичников; SiHa, СаЗЫ клеточные линии опухоли шейки матки. 7Т, 8Т, 9Т- первичные опухоли шейки матки.

В случае ШрЕЗ значительных изменений уровня экспрессии, нормированной относительно гистологически нормальной ткани, не наблюдали.

Мутационный анализ гена и8Р4

Для определения способа инактивации гена иЗР4 секвенировали кодирующий район ШрЕЬ в образцах ДНК первичных опухолей ЗТ, 5Т, 7Т. Мутаций в кодирующем районе не обнаружено. Промоторный район гена иЗР4 содержит плотный СрО-островок, в котором выявлено до 50 потенциальных участков связывания факторов транскрипции В связи с этим, регуляция активности этого гена может происходить по тому же сценарию, что и в случае генов ЯАЗЗЖЫ и БетаЗВ - путем метилирования промоторного района.

Биологические функции белка USP4

Согласно компьютерному анализу, проведенному с помощью программы PFAM, белок UnpEL содержит домен карбокси-терминальной гидролазы (USH, 299-980 а.о.) и домен с неизвестными функциями (DUF1055, 82-227 а.о.). Сравнительный анализ аминокислотной последовательности UnpEL с белками, представленными в базе данных NCBI, выявил гомологичные участки с антигеном NY REN 60, ранее выявленном в сыворотке крови пациентов с поченоклеточной карциномой. В то же время, аминокислотная последовательность NY REN 60 антигена, соответствующая нуклеотидам 497-2485, на 95% идентична онкобелку Тге с деубиквитинирующей активностью (Scanlan et al, 1999). Хромосомная локализация гена кодирующего антиген NY REN 60 не определена.

В последнее время стало ясно, что Unp ферменты не только гидролизуют полиубик-витиновые комплексы, но и участвуют в специфических регуляторных путях. Недавно проведенные исследования показали, что Unp у Drosophila поддерживают высокий уровень специфических субстратов, защищая их от присоединения полиубиквитиновой цепи и последующей протеосомной деградации (Cadavid et al, 2000). Можно предположить механизм, при котором ферменты, участвующие в полиубиквитиновой деградации и деубиквитинирующие ферменты, обладают противоположным действием, что приводит к равновесию, и определяет период полураспада специфических белков. Если субстратом протеолитической деградации является белок, вовлеченный в контроль клеточного цикла, то изменения в его активности, связанные как с присоединением убиквитиновой цепи, так и с ее отщеплением, могут играть роль в стабилизации онкобелков или инактивации белков с опухоль-супрессорными функциями. Ранее сообщалось, что высокий уровень экспрессии Unp коррелирует с изменениями уровня - белка Rb в опухолевых клетках (Blanchette et al, 2001). Для проверки этой гипотезы клеточная линия рака молочной железы MCF7 была транзиентно трансфецирована UnpEL в составе eGFP экспрессирующего вектора. Экспрессию слитного белка UnpEL - eGFP наблюдали в цитоплазме трансфецированных клеток, однако содержание общего количества белка Rb в трансфецированных клетках не изменялось (рис. 7).

Рисунок 7. Флуоресценция GFP и Rb в клеточной линии MCF 7//UnpEL-GFP

1. Флуоресценция GFP- UnpEL в цитоплазме и мембранных компонентах трансфе-цированных клеток.

2. Флуоресценция белка RB после обработки Texas Red в ядре и цитоплазме клеток.

3.Ядра после обработки флуорофором Хехст 33258

4. Флуоресценция GFP- UnpEL и RB

5. Флуоресценция GFP- UnpEL uXexcma 33258

6. Флуоресценция GFP- UnpEL, RB uXexcma 33258

Вероятно, существуют белки, играющие роль посредников, полиубиквитиновая деградация которых влияет на активность белков общего контроля в опухолевой клетке. Показано, что ферменты с деубиквитинирующей активностью по своим биологическим функциям являются онкобелками. Однако последние исследования показали, что уже известные гены-супрессоры также могут иметь свойства онкогенов (Sigal et al., 2000). Дифференциальная экспрессия гена USP4 в опухолевых клетках указывает на его различные биологические функции и как гена супрессора, и как онкогена. Требуются дальнейшие детальные исследования этого гена для изучения его функций и определения специфических субстратов деубиквитинирования.

Идентификация нуклеотидпой последовательности 5 района гена RBSP3, определение двух вариантов альтернативного сплайсинга RBSP3A и RBSP3B

Как было показано ранее, локус М-003 из района АР20 3р21.33-р22 гомозиготно делегирован в 15% эпителиальных опухолей. Точное картирование наименьшей области перекрывания делеций показало, что она не затрагивает два гена ITGA9 и VILL и расположена внутри гена RBSP3 (рис. 8).

Для картирования 5' области гена RBSP3 был выполнен RACE ПЦР. Перекрывающиеся клоны кДНК были секвенированы. При сравнении всех полученных данных и нук-

леотиднои последовательности Э88153 из базы данных N031 было установлено, что определенная нуклеотидная последовательность КБ8Р3 отличается от сообщенной ранее ОШка-даа Ы а!, 1997 ), де-лецией нуклеотида О в положении 187 п.н.

(Э88153). Это означает, что АТО-кодон, выбранный ранее (Ishikawa й а1.,1997), не может быть инициирующим кодоном

открытой рамки считывания. Был определен другой инициирующий кодон на основе новой последовательности кДНК отстоящий на 373 п.н. дистально. Дальнейшее сравнение новой геномной последовательности с последовательностью Э88153 выявило и другую ошибку: в ней отсутствовал динуклеотид ТС (127-128 п.н.). В этом положении, рассматриваемом ранее в качестве границы между экзонами 1 и 2, не было выявлено сигналов сплайсинга. Вероятно, первый экзон и инициирующий кодон ранее были идентифицированы неверно.

Нами выявлено два варианта сплайсинга гена КБ8Р3: КБ8Р3Л и КБ8Р3Б (рис.8). В белке КБ8Р3А отсутствуют 11 аминокислот (79-89 а.о. в КБ8Р3Б). Ранее два подобных варианта альтернативного сплайсинга были идентифицированы в гене ортологе курицы №Б1Т1 и ШРШ5. Ген КБ8Р3 высоко консервативен - он почти идентичен генам ортоло-гам мыши и курицы, и его консервативная часть по кодирующей последовательности на 70% идентична дрожжевому ортологу УА22.

Экспрессия гена ЯБ8Р3 в клеточных линиях и первичных опухолях эпителиального рака различной локализации.

Методом РВ-ПЦР был проведен анализ экспрессии гена КБЗРЗ в клеточных линиях эпителиального рака разной локализации и первичных опухолях почки, молочной железы и яичников (рис. 9)

....... ""1 i . . !

п П - : п п •I 1 j i 1 i

У - У и - - - j i J i 1 i

1 j

г i i 1

Рисунок 9. Профиль экспрессии гена RBSP3 в различных клеточных линиях эпителиальных опухолей и первичных опухолях, нормированный по отношению к экспрессии в нормальной ткани. Экспрессия гена RBSP3 в нормальной ткани принята за 1. ACHN, 786-0, CAKI 1, КН39 - клеточные линии RCC, IT, 2T, ЗТ, 4Т- первичные опухоли RCC; CaOv клеточная линия карциномы яичников, 5Т, 6Т- первичные опухоли яичников; MCF-7 - клеточная линия карциномы молочной железы, 7Т, 8Т— первичные опухоли молочной железы; Н146, N417, U2020, ACC-LC5 SCLC клеточные линии; SiHa, CaSki клеточные линии опухоли шейки матки.

Праймеры и TaqMan проба были выбраны на границе между 2-ым и 3-им экзонами гена. Относительный уровень экспрессии RBSP3 был рассчитан с помощью сравнительного Ст метода. Существенное снижение экспрессии было найдено в 11 из 12 клеточных линий. Клеточная линия мелкоклеточного рака легкого ACC-LC5 с гомозиготной деле-цией, которая включает ген RBSP3, была использована в качестве отрицательного контроля. В одной из клеточных линий мелкоклеточного рака легкого NCI - N417, было отмечено увеличение экспрессии в 39 раз (рис.9). Аналогичное изменение уровня экспрессии было найдено и в биопсиях опухолей: в двух образцах экспрессия увеличивалась более чем в два раза и только в трех из восьми биопсий (два образца рака почки и один - опухоль молочной железы), экспрессия была существенно снижена (рис.9). В случае 2Т RCC с увеличенной экспрессией гена было найдено увеличение числа копий локуса NLJ-ООЗ в 8 раз.

Для образцов с повышенной экспрессией RBSP3 была секвенирована кодирующая последовательность. Во всех случаях были выявлены смысловые мутации. В случае 6Т ОС наблюдали делецию экзонов 2 и 3. В двух образцах 6Т ОС и 7Т ВС была найдена повторяющаяся мутация Vall32GJy (табл.5).

ДНК опухоли Число иссл. клонов Мутации в кодирующем районе RBSP3

Клеточная линия SCLC N417 8 Pro/Ser 138 а.о., H¡s/Tirl39a.o., Leu/Pro 150а.о.,

1TRCC 5 Asn/Ser 127 а.о., Asp/Gly 222 а.о., Val/Ala 266 а.о..

2TRCC 7 He/Ley 7а.о., Pro/Serl3a.o., Glu/Gly 72а.о., Lys/Arg 78 а.о., Ala/Val 163 а.о., Leu/Pro 192а.о., Val/Ala 198а.о., Ile/Val 219, Met/Ile 245 а.о., Asp/Gly 264а.о., Tyr/His 267 а.о.

5Т ОС 6 Thr/Ala 11а.о., Asn/Asp 31 a.o„ Leu/Pro 69 a.o., Pro/Ser 79 a.o., Glu/Lys 87 a.o., Asp/Gly 169 a.o., Leu/lie 171 a.o., Ser/Gly 261 a.o..

6ТОС 5 Glu/Glu 17 a.o., -2 экзон, -3 экзон, Val/Gly 132 a.o., Asp/Gly 232 a.o.,

7ТВС 6 Ser/Pro 121 ¡lo., Val/Gly 132a.o„ lie/Val 220 a.o., Cys/Arg 274 a.o., Asn/Ser 285 a.o.,

Таблица 5. Мутации, выявленные в кодирующей последовательности гена RBSP3 Статус метилирования промоторного района гена ЯВ8Р3

В предыдущих работах было показано, что АР20 область сильно метилирована в биопсиях и клеточных линиях рака почки (Kashuba et э1., 1995, Protopopov et а1., 2003). Однако анализ CpG-островка в промоторном районе гена RBSP3, проведенный в ДНК шести клеточных линий рака почки (КЯС/У, А549, СакП, ТК164, ЛСЫК, NN51) методом бисульфитного секвенирования, не выявил метилирования.

Ген RBSP3 кодирует белок с фосфатазной активностью, участвующий вдиффе-ренцировке и пролиферации клеток.

Известно, что RBSP3 (SCP3) входит в семейство малых фосфатаз, содержащих С-терминальный домен (СТО). В одной из предыдущих работ была исследована фосфатаз-ная активность двух других членов этого семейства: SCP1 (NIF3) и SCP2 (OS-4) и высказано предположение о том, что данные белки катализируют дефосфорилирование Ser 5 в составе С-терминального домена большой субьединицы РНК полимеразы II (Yeo et al, 2003).

Для подтверждения фосфатазной активности белковых продуктов гена RBSP3 клеточная линия MCF 7 была транзиентно трансфецирована RBSP3A и RBSP3Q в составе с-тус экспрессирующих векторов. RBSP3A и RBSP3B - с-тус слитные белки наблюдали и в цитоплазме и в составе внутриклеточных мембранных компонентов трансфецирован-ных клеток. Уровень фосфорилированного белка Rb в трансфецированных клетках был заметно снижен, особенно в случае экспрессии RBSP3 формы В (рис. 10,11).

Рисунок 10. Флуоресценция с-тус RBSP3A uppRB в клеточной линии MCF7

1. Флуоресценция c-myc-RBSPЗА, ppRB и Хехста 33258

2. Флуоресценция белка ppRB после обработки FITC в ядрах клеток

3. Флуоресценция c-myc-RBSP ЗА uppRB

4. Флуоресценция c-myc-RBSP ЗА в цитоплазме и мембранных компонентах трансфецированных клеток после обработки Texas Red.

5. Ядра после обработки флуорофором Хехст 33258

6. Флуоресценция c-myc-RBSP3A и Хехста 33258

Рисунок 77.Флуоресценция c-myc-RBSP3BuppRBe клеточнойлинииЫС¥7

1. Флуоресценция c-myc -RBSP3B, ppRBuXexcm a33258

2.Флуоресценция белкаppRBпосле обработки¥ТТСвядрахклеток

3. Флуоресценция c-myc-RBSP3BuppRB

4.Флуоресценция c-myc-RBSP3Be цитоплазмеимембранныхкомпонентахтрансфеци-рованныхклеток после обработки Texas Red

5. Ядра после обработки флуорофоромХехст33258

6. Флуоресценция c-myc -RBSP3B и Хехста33258

Однако, было показано, что содержание белка Rb было приблизительно равным во всех клетках (Рис. 12).

Рисунок 12.Флуоресценция с-тус-RBSP3A и Rbe клеточнойлинии MCF7

1. Флуоресценция c-myc-RBSP3A,RB иХехста33258

2.Флуоресценция белкаppRBпосле обработки FITC вядрахклеток

3. Флуоресценция c-myc-RBSP3A uRB

4.Флуоресценция c-myc-RBSP3A в цитоплазме имембранныхкомпонентахтрансфеци-рованных клеток после обработки Texas Red

5. Ядра после обработки флуорофоромХехст33258

6.Флуоресценция c-myc-RBSP3A иХехста33258

Эти данные подтверждают гипотезу, что белок ЯБ8Р3 является фосфатазой, участвующей в регулировании пролиферации и дифференцировки клеток.

Предполагаемый механизм действия ЯБ8Р3 в патогенезе опухолей.

Ген КББРЗ расположен в области 3р21.3, наиболее часто делегируемой в опухолях различной локализации. Согласно анализу экспрессии гена КББРЗ, изменения в опухолевых клеточных линиях и биопсиях могут быть диаметрально противоположными: экспрессия может быть как увеличенной, так и сниженной, по сравнению с нормальными клетками (рис.9). В 3 из 8 биопсий было отмечено существенное снижение экспрессии, а в двух из них экспрессия увеличивалась. Для одного образца биопсии рака почки с увеличенной экспрессией было найдено восьмикратное увеличение в геноме числа копий локу-са N0-003. Подобная картина экспрессии была найдена и в опухолевых клеточных линиях. Это подтверждают предыдущие исследования, проведенные в нашей группе: локус №Л-ООЗ был делегирован в 48-74% и амплифицирован в 17-34 % опухолевых клеточных линий и биопсий (8епеЬепко й а1., 2003). В случаях с повышенной экспрессией КББРЗ были найдены множественные соматические мутации гена.

Белки ЯБ8Р3 содержат ядерный ЫМ-связывающий домен (N0). NLI-домен высоко консервативен и играет важную регуляторную роль в клеточном развитии. Вероятнее всего, что NLI-домен облегчает промотер-энхансерное взаимодействие и передачу сигналов между элементами транскрипционного контроля. NLI-домен может регулировать транскрипционную активность LIM-содержащих белков, определяя специфический выбор партнера. Таким образом, белковые продукты гена КББРЗ могут работать как координаторы транскрипции через взаимодействие с NLI-содержащими белками.

Транскрипция и процессинг пре-мРНК в эукариотических клетках регулируются обратимым фосфорилированием РНК полимеразы II. Экспрессия 8СР блокирует активацию транскрипции. В то же время известно, что мутант не обладающий фосфатазной активностью- 8СР1, усиливает транскрипцию. Соответственно, 8СР игрют роль в регуляции экспрессии, возможно, управляя переходом от инициации транскрипции до постепенного удлиннения транскрипта. Сделано предположение, что экспрессия каждого из членов семейства 8СР может влиять на транскрипцию и 8СР имют как общие, так и разные биологические функции и участвуют в различных сигнальных путях. Не исключена возможность, что члены семейства 8СР могут влиять на состояние фосфорилирования различных субстратов, в том числе и не содержащих С-терминальный домен (Уео е1 а1., 2003). Из-за близкой гомологии между последовательностями 8СР1, 8СР2, и 8СР3, мутантные

формы белков 8СР могут препятствовать друг другу и блокировать некоторые функции, и, возможно, функционировать как онкоген.

Интересно, что и RASSFIA (регион гомозиготных делеций ШСЛ) и RBSP3 (регион гомозиготных делеций АР20) могут помогать друг другу в индукции ареста клеточного цикла: первый, блокируя циклин (8Ыуакитаг et а1., 2002) и второй, активизируя ЯБ белок. Это предположение объясняет частые гомозиготные делеций, и в ЬИСА, и в АР20-областях в одних и тех же опухолях и подтверждает гипотезу, что гены-супрессоры опухолевого роста, расположенные в данных критичных районах, могут иметь синергич-ный эффект (8епЛепко et а1., 2003).

Все функциональные особенности гена RBSP3 совместимы с классическими характеристиками генов-супрессоров опухолевого роста. Не исключено, что как наблюдается для гена р53, взаимодействие мутантных форм белка ЯБ8Р3 с нормальным белком может приводить к его инактивации. Можно предполагать, что RBSP3 представляет новый класс генов, обладающих как супрессорной, так и онкогенной функциями.

ВЫВОДЫ

1. Исследован уровень метилирования промоторного района гена ЛЛ^ЛЛ в опухолях шейки матки. Частота метилирования ЛЛ^ЛЛ составила 6 4%. Установлено, что метилирование данного гена является ранним событием в патогенезе опухолей шейки матки и одним из главных способов его инактивации.

2. Показана корреляция степени метилирования гена ЛЛ^ЛЛ с метастазированием опухолей шейки матки в регионарные лимфоузлы.

3. Изучен спектр метилирования промоторного района гена 8еша3В с помощью би-сульфитного секвенирования. Высокая частота метилирования (40 - 100%), свидетельствует о системном характере метилирования данного гена. Вероятно, метилирование представляет общий путь инактивации гена 8еша3В при развитии эпителиальных опухолей разных локализаций.

4. Выявлен дифференциальный характер изменения экспрессии двух изоформ сплайсинга гена и8Р4 (ипрЕЬ и ипрЕ8) в эпителиальных опухолях разной локализации. Установлено, что уровень экспрессии данного гена не зависит от мутаций в кодирующем регионе. Согласно полученным данным, белок Rb не является субстратом убиквитин специфической протеазы, кодируемой геном и8Р4, как это предполагалось ранее другими авторами.

5. Выявлен дифференциальный характер изменения экспрессии гена RBSP3 в эпителиальных опухолях разной локализации. Во всех случаях с повышенной экспрессией RBSP3 выявлены мутации в кодирующем районе гена.

6. Показано, что белковые продукты гена RBSP3 являются фосфатазами, снижающими количество фосфорилированного белка ppRb в опухолевых клетках, что может приводить к остановке клеточного цикла на стадии перехода из G1 в S фазу.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брага Э.А., Кашуба В.И., Малюкова А.В., Логинов В.И., Сенченко В.Н., Базов И.В., Киселев ЛЛ., Забаровский Е.Р. Новые гены-супрессоры опухолевого роста в горячих точках хромосомы 3 человека: новые методы идентификации. Молекулярная биология. 2003,37:1-18.

2. Брага Э. А., Логинов В.И., Малюкова А.В., Килосанидзе Г., Сенченко В.Н., Серегин Ю.А., Баркевич О.А., Кашуба В.И., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Киселев Л Л, Забаровский Е.Р. Гены хромосомы 3 человека, ассоциированные с эпителиальными опухолями разных локализаций: диагностическое и прогностическое применение. VII Российский Онкологический Конгресс. 2003,141-144.

3. V. Kashuba, J. Li. F. Wang, V. Senchenko, A. Protopopov, A. Malyukova, A.G. Kutsenko, E. Kadyrova, V.I. Zabarovska, O.N. Muravenko, A.V. Zelenin, L.L.Kisselev, I. Kuzmin, J. Minna, G. Winbcrg, I. Ernberg, E. Braga, M. Lerman, G. Klein, E. Zabarovsky. RBSP3 (HYA22) is a tumor suppressor gene implicated in major epithelial malignancies. PNAS, 2004,101,4906-4911

4. В.И. Логинов, А.В. Малюкова, Ю.А. Серегин, Д.С. Ходырев, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, ЛЛ. Киселев, Е.Р. Забаровский, Э.А. Брага. Уровень метилирования промоторной области гена RASSF1A в опухолях почек, молочных желез и яичников. Молекулярная Биология. 2004,38 с

5. Брага Э.А., Базов И.В., Логинов В.И., Малюкова А.В., Пугачева Е.М., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Мазуренко Н.Н., Киселев Ф.Л., Лю Ж. Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека из клеток опухолей разных локализаций. Тезисы докладов на конференции "Геном человека", Москва, Январь, 2000, стр. 8.

6. Брага Э.А., Логинов В.И., Малюкова А.В., Петраш Н.Ю., Базов И.В., Кашуба В.И., Протопопов А.И., Сенченко В.Н., Лерман М.И., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарь-кавцева Р.Ф., Мазуренко H.H., Киселев ФЛ., Забаровский Е.Р., Киселев ЛЛ. "Выявление и анализ новых генов-супрессоров опухолевого роста на коротком плече хромосо-

мы 3 человека" Тезисы докладов на конференции "Геном человека", Москва, Январь, 2002,стр.14-16

7. G. Kilosanidze, A. Malyukova, N. Petrash, W. Loginov, I. Bazov, V. Kashuba, V. Ermitova, T. Kazubskaya, R. Garkavtseva, M.I. Lerman, E. Zabarovsky, E. Braga. Search for cancer -associated genes in 3p21.31. Abstracts of HUGO'S Human Genome Meeting, HGM2002, Shanghai, China, April 2002, № 201, p!29.

8. G. Kilosanidze, A. Malyukova, N. Petrash, W. Loginov, I. Bazov, V. Kashuba, V. Ermilova, T. Kazubskaya, R. Garkavtseva, M. Lerman, E. Braga, E. Zabarovsky. SAGE data for searching cancer-associated genes in 3p21.3. 28th Meeting of the Federation of European Biochemica Societies, Istanbul, Turkey, October 2002, FEBS J., 2002,269: p. 40, PS 1-022.

9. W. Loginov, V. Senchenko, A. Malyukova, I. Bazov, T. Kazubskaya, V. Ermilova, R. Garkavtseva, V. Kashuba, E. Zabarovsky, E. Braga. Methylation of RASSFIA (3p21.31) promoter region and deletion aberrations around this TSG in epithelial carcinomas. Abstracts of AACR 2002 Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research, Boston, October 2002, #100369.

10. Malyukova, G. Kilosanidze, W. Loginov, I. Bazov, V. Kashuba, V. Ermilova, T. Kazubskaya, R. Garkavtseva, E. Zabarovsky, E. Braga. Methylation of SEMA3B and new candidate TSGs in D3S2409-D3S2456 in chromosome 3p21.31. Abstracts ofAACR 2002 Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research, Boston, October 2002, # 100436.

11. Malyukova, W. Loginov, N. Petrash, V.D. Ermilova, T.P. Kazubskaya, R.F. Garkavtseva, M.I. Lerman, E.R. Zabarovsky, EA. Braga. Methylation spectrum of multiple TSG RASSFIA (3p21.31) in various epithelial carcinomas. Abstracts ofAACR 2003 Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research Toronto, April 2003, # 107259.

12. G. Kilosanidze, A. Malyukova, V. Kashuba, M. Lerman, E. Braga, E. Zabarovsky. Comparative analysis of gene expression for searching tumor suppressor genes in crucial regions of human chromosome 3. Prague, 2003.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 23.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усллечл. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 478. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. ТелУФакс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.ВЛомоносова.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малюкова, Алёна Владимировна

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Трансформированная клетка: критерии и свойства, приобретаемые трансформированной клеткой

1.2 Молекулярно генетические изменения в опухолях

1.3 Роль метилирования в онкогенезе

1.3.1. Деметилирование генома

1.3.2.Гиперметилирование отдельных генов

1.4 Критичные районы на коротком плече хромосомы 3 человека

1.5 Кандидаты в гены-супрессоры опухолевого роста на коротком плече хромосомы 3 человека

1.5.1.Область АР

1.5.2.0бласть LUCA

Ген RASSF1A

Гены БетаЗВ и Sema3F

1.5.3.Область D3S

Ген USP

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация генов-супрессоров опухолевого роста на коротком плече хромосомы 3 человека и возможные пути их инактивации"

С самого начала исследование молекулярных основ канцерогенеза вселяло надежду на разработку более эффективных терапий рака. Так как рак имеет разную этиологию и опухолевая прогрессия связана с бесконечной комбинацией генетических и эпигенетических изменений, порождающих несоизмеримый ряд аномалий, возникло убеждение, что и лечение рака должно быть, таким же разнообразным, как и нарушения. Действительно, так как рак не является единообразным заболеванием, то не может существовать и единственного варианта его лечения. Поиск оптимальной терапии раковых заболеваний представлялся Геракловой и практически невозможной задачей.Однако эти утверждения оказались слишком пессимистичными. Хотя злокачественные новообразования чрезвычайно разнообразны и гетерогенны, в основе этих изменений находится относительно небольшое количество критических событий, одновременное проявление которых требуется для развития любых злокачественных новообразований. Хотя в развитие неоплазии вовлечено множество процессов, в основе прогрессии опухолей лежит неконтролируемое размножение клеток и уход от апоптоза. Поэтому необходимо определить и понять молекулярную анатомию основных этапов опухолевого патогенеза и создать терапевтические схемы, направленные на элиминацию этих этапов.Движущая сила рака - это случайные соматические мутации в генах, которые управляют пролиферацией и дифференцировкой. Возникновение и развитие новообразований является эволюционным процессом, в котором естественный отбор направлен на закрепление приобретенных признаков опухолевых клонов, предоставляя им селекционное преимущество.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Малюкова, Алёна Владимировна

выводы

1. Исследован уровень метилирования промоторного района гена RASSFIA в опухолях шейки матки. Частота метилирования RASSFIA составила 64%. Установлено, что метилирование данного гена является ранним событием в патогенезе опухолей шейки матки и одним из главных способов его инактивации.

2. Показана корреляция степени метилирования гена RASSFIA с метастазированием опухолей шейки матки в регионарные лимфоузлы.

3. Изучен спектр метилирования промоторного района гена Sema3B с помощью бисульфитного секвенирования. Высокая частота метилирования (40 - 100%), свидетельствует о системном характере метилирования данного гена. Вероятно, метилирование представляет общий путь инактивации гена Sema3B при развитии эпителиальных опухолей разных локализаций.

4. Выявлен дифференциальный характер изменения экспрессии двух изоформ сплайсинга гена USP4 (UnpEL и UnpES) в эпителиальных опухолях разной локализации. Установлено, что уровень экспрессии данного гена не зависит от мутаций в кодирующем регионе. Согласно полученным данным, белок Rb не является субстратом убиквитин специфической протеазы, кодируемой геном USP4, как, это предполагалось ранее другими авторами.

5. Выявлен дифференциальный характер изменения; экспрессии гена RBSP3 в эпителиальных опухолях разной локализации. Во всех случаях с повышенной экспрессией RBSP3 выявлены мутации в кодирующем районе гена.

6. Показано, что белковые продукты гена RBSP3 являются фосфатазами, снижающими количество фосфорилированного белка ppRb в опухолевых клетках, что может приводить к остановке клеточного цикла на стадии перехода из G1 в S фазу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малюкова, Алёна Владимировна, Москва

1. Базов И.В., Аксенова М.Г., Казубская Т.П., Смирнов А.В., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. (1997) Мол. биол. 31, 805-809

2. Брага Э. А., Логинов В.И., Малюкова А.В., Килосанидзе Г., Сенченко В.Н., Серегин Ю.А., Баркевич О.А., Кашуба В.И., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Киселев Л.Л, Забаровский Е.Р. 2003, VII Российский Онкологический Конгресс. 141-144

3. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. (2004). Молекуляр. биология. 38, 179-190. Гвоздев В.А. (1999). Соросовский образовательный журнал, 2, 22-31 Копнин Б.П. 2000,Биохимия, 65, 5-33

4. Мазуренко Н., Беляков И., Блиев А., Гуо Ж., Ху К., Винокурова С., Биджиева Б., Павлова Л., Понтен Я., Киселёв Ф. (2003). Молекуляр. биология. 37, 472-481.

5. Aggerholm A, Hokland Р. (2000) Blood. 95(9):2997-2999.

6. Alimov A., Kost-Alimova М., Liu J., Li С., Bergerheim U., Imreh S., Klein G., Zabarovsky E.R. (2000). Oncogene. 19, 1392-1399.

7. Arapshian A, Kuppumbatti YS, Mira-y-Lopez R. (2000) Oncogene 35 4066-4070.

8. Bateman A., Birney E., Durbin R., Eddy S.R., Finn R.D., Sonnhammer E.L. (1999). Nucleic Acids Res. 27, 260-262.

9. Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP (1998) Adv Cancer Res. 72:141196.

10. Bestor TH. (1988) Gene. 1 :9-12 Bird A. (2002). Genes Dev. 16,6-21.

11. Blanchette P., Gilshrist C., Baker R., Gray D. (2001). Oncogene 20, 5533-5537

12. Boulay JL, Reuter J, Ritschard R, Terracciano L, Herrmann R, Rochlitz C. (1999) Biotechniques. 2:228-230, 232.

13. Brambilla E., Constantin В., Drabkin H., Roche J. (2000) Am. J. Pathol. 156, 939-950.

14. Cameron EE, Bachman KE, Myohanen S, Herman JG, Baylin SB (1999) Nat Genet. 1:103-107

15. Chuang LS, lan HI, Koh TW, Ng HH, Xu G, Li BF. (1997) Science.277(5334): 19962000.

16. Cohen Y, Singer G, Lavie O, Dong SM, Beller U, Sidransky D. (2003). Clin Cancer Res. 9, 2981-2984.

17. Costello JF, Berger MS, Huang HS, Cavenee WK. (1996) Cancer Res. 10:2405-2410 Costello JF, Plass C. (2001) У Med Genet. 5:285-303

18. Cowin AJ, Kallincos N, Hatzirodos N, Robertson JG, Pickering KJ, Couper J, Belford DA. (2001) Cell Tissue Деу.306(2):239-50

19. Croce CM, Sozzi G, Huebner K. (1999). J.Clin.Oncol.,17, 1618-1624.

20. Cui H., Horon I., Oholsson R., Hamilton S., Feinberg A. (1998). Nat. Med., 4, 1276-1280.

21. Dammann R., Li C., Yoon J.H., Chin P.L., Bates S., Pfeifer G.P. (2000). Nature Genet. 25,315-319.

22. Dammann R., Schagdarsurengin U., Strunnikova M., Rastetter M., Seidel C., Liu L., Tommasi S., Pfeifer G.P. (2003). Histol. Histopathol. 18, 665-677.

23. Dammann R., Takahashi Т., Pfeifer G.P. (2001). Oncogene. 20, 3563-3567

24. Dammann R., Yang G., Pfeifer G.P. (2001). Cancer Res. 61, 3105-3109.

25. DeSalle L., Latres E., Lin D., Graner E., Montagnoli A., Baker R., Pagano M., Loda M., (2001). Oncogene, 20, 5538-5542

26. Dessain SK, Yu H, Reddel RR, Beijersbergen RL, Weinberg RA. 2000 Cancer Res 60(3):537-41

27. Devereux TR, Horikawa I, Anna CH, Annab LA, Afshari CA, Barrett JC. 1999 Cancer Res. 59(24):6087-90

28. Dreijerink К., Braga E., Kuzmin I., Geil L., Duh F.M., Angeloni D., Zbar B.,.Lerman М.1., Stanbridge E.J., Minna J.D., Protopopov A., Li J., Kashuba V., Klein G., Zabarovsky E.R. (2001). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 7504-7509.

29. Esteller M, Corn PG, Baylin SB and Herman JG. {2Ш).Сапсег Res., 61, 3225-3229.

30. Esteller M, Guo M, Moreno V, Peinado MA, Capella G, Galm O, Baylin SB, Herman JG. 2002 Cancer Res. 62(20):5902-5

31. Evan G.L, Vousden K.H. (2001). Nature. 411, 342-348. Frederick A., Rolfe M., Chiu I. (1998). Oncogene, 16, 153-165 Fujisawa H., Kitsukawa T. (1998). Curent. Opin. Neurobiol. 8, 587-592.

32. Gilbert F. Scott. 1998, Developmental Biology.

33. Girard L, Zochbauer-Muller S, Virmani AK, Gazdar AF, Minna JD. 2000 Cancer Res.6Q{\ 7):4894-906

34. Gray D.A., Inazawa J., Gupta K., Wong A., Ueda R; (1995). Oncogene, 10, 2179 2183. Green D.R. (1998) Cell,, 94,695-698.

35. Greger V, Passarge E, Hopping W, Messmer E, Horsthemke В 1989 Hum Genet. (2): 155158

36. Jones PA, Laird PW. 1999 Nat Genet. 21(2):163-7

37. Kashuba V.I., Gizatullin R.Z., Protopopov A.I., Li J., Vorobieva N.V., Fedorova L., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Kost-Alimova M., Domninsky D.A., Kiss C.,

38. Allikmets R., Zakharyev V.M., Braga E.A., Sumegi J., Lerman M., Wahlestedt C., Zelenin A.V., Sheer D., Winberg G., Grafodatsky A., Kisselev L.L., Klein G., Zabarovsky E.R. (1999). Gene. 239,259-271

39. Kashuba V.I., Szeles A., Allikmets R., Bergenheim U., Modi W., Grafodatsky A., Dean M., Stanbridge E.J., Winberg G., Klein G„ Zabarovsky E.R. (1995). Cancer Genet. Cytogenet. 81, 144-150.

40. Kass SU, Landsberger N, Wolffe AP. 1997 Curr 5/o/.7(3): 157-65

41. Katzenellenbogen RA, Baylin SB, Herman JG. 1999 Blood. 93(12):4347-53

42. Keith R.L., Miller Y.E., Gemmill R.M., Drabkin Н.А., Dempsey E.C., Kennedy T.C., Prindiville S., Franklin W.A. (2000). Clin. Cancer Res. 6, 1616-1625.

43. Kholodnyuk I., Kost-AIimova M., Yang Y, Kiss H., Fedorova L., Klein G., Imreh S. (2002). Genes Chrom. Cancer. 34, 341-344.

44. Kim S.T., Lim D.S., Canman C.E., Kastan M.B. 1999. Substrate specificities and identification of putative substrates of ATM kinase family members. J. Biol. Chem. 274, 37538-37543.

45. Kinzler K.V., Vogelstein В., (1997). Nature, 386, 761-763.

46. Кок K., Naylor S.L., Buys C.H.C.M. (1997) Adv. Cancer Res. 71,27-92.

47. Kuzmin 1, Geil L, Ge H, Bengtsson U, Duh FM, Stanbridge EJ, Lerman MI. (1999) Oncogene. 18(41 ):5672-9.

48. Kuzmin I, Liu L, Dammann R, Geil L, Stanbridge EJ, Wilczynski SP, Lerman MI, Pfeifer GP. (2003). Cancer Res. 63, 1888-1893.

49. Maitra A., Wistuba I.I., Wachington C., Virmani A.K., Ashfaq R., Milchgrub S., Gazdar A.F., Minna J.D. (2001). Am. J. Pathol. 159, 119-130

50. Martinez A., Walker R.A., Shaw J.A., Dearing S.J., Maher E.R., Latif F. (2001). J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol. 54, 300-306.

51. Merlo A, Herman JG, Mao L, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, Baylin SB, Sidransky D. (1995) Nat Med. 1 (7):686-92

52. Mertens F., Johansson В., Hoeglund M., Mitelman F. (1997) Cancer Res. 57, 2765-2780. Muller HM, Widschwendter A, Fiegl H, Ivarsson L, Goebel G, Perkmann E, Marth C, Widschwendter M. (2003) Cancer Res. 63, 7641-7645.

53. Murata Y., Tamari M., Takahashi Т., Horio Y., Hibi K., Yokoyama S,. Inazawa J., Yamakawa K., Ogawa A., Takahashi Т., et al. (1994). Human Molec. Genet. 3, 13411344.

54. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. (1999) Cell.99(3):247-57

55. Palmisano W.A., Divine K.K., Saccomanno G., Gilliland F.D., Baylin S.B., Herman J.G., Belinsky S.A. (2000). Cancer Res. 60, 5954-5958.

56. Pfeifer G.P., Yoon J.-H., Liu L., Tommasi S., Wilczynski Sh.P., Dammann R. (2002). Biol.Chem. 383, 907-914.

57. Ponder B.A.J. (2001). Nature. 411, 336-341.

58. Prokhortchouk E. and Hendrich B. (2002). Oncogene. 21, 5394-5399

59. Protopopov A., Kashuba V.I.', Zabarovska V.I., Muravenko О.-V., Lerman M.I., Klein G., Zabarovsky E.R. (2003). Cancer Res.

60. Robertson KD, Keyomarsi K, Gonzales FA, Velicescu M, Jones PA 2000 Nucleic Acids ^.28(10):2108-13

61. Roche J., Boldog F., Robinson M., Robinson L., Varella-Garcia M., Swanton M., Waggoner В., Fishel R., Franklin W., Gemmill R., Drabkin H. (1996). Oncogene. 12, 1289-1297.

62. Rountree MR, Bachman KE, Baylin SB 2000 Nat Genet. 25(3):269-77 Saaristo A., Karpanen Т., Alitalo K. (2000) Oncogene, 19, 6122-6129.

63. Scanlan M., Gordan J., Williamson В., Stockert E., Bander N., Jongeneel V., Gure A., Jager D„ Knuth A., Chen Y-T., Old L. (1999). Int. J. Cancer. 83, 456-464

64. Sekido Y., Ahmadian M., Wistuba I.I., Latif F., Bader S., Wei M.H., Duh F.M., Gazdar A.F., Lerman M.I., Minna J.D. (1998). Oncogene. 16, 3151-3157.1.t)

65. Sekido Y., Bader S., Latif F„ Chen J.Y., Duh F.M., Wei M.H., Albanesi J.P., Lee C.C., Lerman M.I., Minna J.D. (1996). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4120-4125.

66. Sekine M., Nagata H., Tsuji S., Hirai Y., Fujimoto S., Hatae M., Kobayashi I., Fujii Т., Nagata L, Ushijima K., Obata K., Suzuki M., Yoshinaga M., Umesaki N., Satoh S., Enomoto Т., Motoyama S., Tanaka K. (2001) Human Molec. Genet. 10, 1421-1429.

67. Senchenko V., Liu J., Braga E., Mazurenko N;, ,Loginov W., Seryogin Y., Bazov I., Kisseljov F., Kashuba V., Lerman М.1., Klein G., Zabarovsky E. (2004). Oncogene. Accepted.

68. Shivakumar L., Minna J.D., Sakamaki Т., Pestell R.G., White M.A. (2002). Mol. Cell. Biol. 22,4309-4318.

69. Sigal A., Rotter V. (2000). Cancer Res., 60, 6788 -6793

70. Silva J.M., Dominguez G., Villanueva M.J., Gonzalez R., Garcia J.M., Corbacho C., Provencio M., Espana P., Bonilla F. (1999). British Journal of Cancer. 80, 1262-1264.

71. Stanbridge E.J. (1990). Annu. Rev. Genet. 24, 615-657.

72. Stunnenberg, H.G, Garcia-Jimenez, C., and Betz J.L. (1998) Biochim. Biophys. Acta, 1423, F15-F33.

73. Szeles A., Yang Y., Sandlund A., Kholodnyuk I., Kiss H., Kost-Alimova M., Zabarovsky E.R., Stanbridge E., Klein G., lmreh S. (1997). Genes Chromos. Cancer. 20, 329-336.

74. The International Lung Cancer Chromosome 3p21.3 Tumor Suppressor Gene Consortium. Lerman M.I., Minna J.D. (2000). Cancer Res. 60, 6116-6133:

75. Todd M.C., Xiang R.H., Garcia D.K., Kerbacher K.E., Moore S.L., Hensel C.H., Liu P., Siciliano M.J., Кок K., van den Berg A., Veldhuis P., Buys C.H., Killary A.M., Naylor S.L. (1996). Oncogene. 13, 2387-2396.

76. Tomizawa Y., Kohno Т., Kondo H;, Otsuka A., Nishioka M., Niki Т., Yamada Т., Maeshima A., Yoshimura K., Saito R., Minna J.D., Yokota J. (2002). Clin. Cancer Res. 8, 2362-2368.

77. Tse С., Xiang R.H., Bracht Т., Naylor S.L. (2002). Cancer Res. 62, 542-546. Tsujie M, Yamamoto H, Tomita N, Sugita Y, Ohue M, Sakita I, Tamaki Y, Sekimoto M, Doki Y, lnoue M, Matsuura N, Monden T, Shiozaki H, Monden M. 2000 Oncology. 58(2): 126-36 *

78. V. Senchenko, J. Liu, E. Braga, N. Mazurenko, W. Loginov, Y. Seryogin, I. Bazov, F. Kisseljov, V. Kashuba, M.I. Lerman, G. Klein and E. Zabarovsky. (2003). Oncogene. 22, 2984-2992.

79. Vawas D., Li X., Avruch J., Zhang X.F. (1998) J. Biol. Chem. 273, 5439-5442.

80. Virmani AK, Muller C, Rathi A, Zoechbauer-Mueller S, Mathis M, Gazdar A F. (2001). Clin Cancer Res: 7, 584-589.

81. Vos M.D., Ellis C.A., Bell A., Birrer M.J., Clark G.J; (2000). J. Biol. Chem. 275, 3566935672.

82. Wei M-H., Latif F., Bader F., Kashuba V., Chen J-J., Duh F-M., Sekido Y., Lee C-C., Geil L., Kuzmin L, Zabarovsky E., Klein G., Zbar В., Minna J.D., Lerman M.I. (1996). Cancer Res. 56, 1487-1492.

83. Wistuba I.I., Behrens C., Virmani A.K., Mele G., Milchgrub S., Girard L., Fondon J.W. 3rd, Garner H.R., McKay В., Latif F., Lerman M.I., Lam S., Gazdar A.F., Minna J.D. (2000) Cancer Res. 60, 1949-1960.

84. Wolffe AP. 1996 Science. 272(5260):371-2

85. Wong l.H.N.,-Lo Y.M.D., Zhang J., Liew Ch.-T., Ng M.H.L., Wong N., Lai P.B.S., Lau W.Y., Hjelm N.M., Johnson PhJ. (1999). Cancer Res. 59, 71-73.

86. Xiang R., Davalos A.R., Hensel C.H., Zhou X.J., Tse C., Naylor S.L. (2002). Cancer Res. 62, 2637-43.

87. Xiang R.H., Hensel C.H., Garcia D.K., Carlson H.C., Кок K., Daly M.C., Kerbacher K., van den Berg A., Veldhuis P., Buys C.H., Naylor S.L. (1996) Genomics. 32, 39-48.

88. Xiang R.H., Hensel C.H., Garcia D.K., Carlson H.C., Кок K., Daly M.C., Kerbacher K., van den Berg A., Veldhuis P., Buys C.H., Naylor S.L. (1996). Genomics. 32, 39-48.

89. Xie S, Wang Z, Okano M, Nogami M, Li Y, He WW, Okumura K, Li E. (1999) Gene\ 236(l):87-95.

90. Yang Y., Kost-Alimova M., Ingvarsson S., Qianhui Q., Kiss H., Szeles A., Kholodnyuk I., Cuthbert A., Klein G., Imreh S. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 1136-1141

91. Yeo, M., Lin, P.S., Dahmus, M.E. & Gill, G.N. (2003). J. Biol. Chem. 278, 26078-26085

92. Yu MY, Tong JH, Chan PK, Lee TL, Chan MW, Chan AW, Lo KW, To KF. (2003) Int J Cancer. 105,204-209.

93. Zabarovsky E.R., Lerman M.I., Minna J. (2002) Oncogene. 21, 6915-6935 Zochbauer-Muller S., Gazdar A.F., Minna J.D. (2002) Annu. Rev. Physiol. 64, 681-708.