Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека в четырех типах рака с помощью панели высокополиморфных микросателлитных маркеров

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека в четырех типах рака с помощью панели высокополиморфных микросателлитных маркеров"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НЛУЧНО-ИССЛЕДОВЛТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

Базов Игорь Валентинович

Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека в четырех типах рака с помощью панели высокополиморфных микросателлитных маркеров.

03.08.03 - Молекулярная биология

молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного паучно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Государственное унитарное предприятие «генетика»).

Научный руководитель:

кандидат химических наук Э. А. Брага

Официальные оппоиснты:

доктор биологических наук Д.В. Залетаев

кандидат химических наук Т.Д. Машкова

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

заседании Диссертационного Совета Д103.06.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: Москва, 113545,1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Защита состоится «

часов на

Автореферат разослан «

2000 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

ешщо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Онкологические заболевания занимают второе место по причине смертности в мире после сердечно-сосудистых заболеваний (Трапезников и Аксель, 1999) и представляют собой одну из наиболее актуальных, проблем здравоохранения. Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют гены-супрессоры, подавляющие опухолевый рост. Поиск таких генов является важным этапом в изучении механизмов возникновения и развития раковых заболеваний. Для поиска генов-супрессоров проводят картирование областей ДНК, подверженных делециям в раковых клетках и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих районов.

Делеции и хромосомные перестройки, происходящие в злокачественных новообразованиях человека, затрагивают многие хромосомы (Mitelman et al., 1997; Mertens et al., 1997; Fujii et al., 1998; Ingvarsson et al., 1998). В некоторых видах эпителиальных опухолей, таких как светлоклеточная карцинома почки и во всех видах рака легкого в наибольшей степени повреждается короткое плечо хромосомы 3 (Kok et al., 1997; Ulimann et al., 1998). Делеции в области короткого плеча хромосомы 3 также обнаружены в опухолях многих других органов: молочной железы, шейки матки, желудка, прямой кишки, яичпиков и мочевого пузыря (Kok et al., 1997; Su et al., 1998). Высокая частота потери гетерознготпостн в некоторых районах хромосомы Зр, обнаружение гомозиготных делеций в этих же районах, а также проявляемая ими опухолеподавляющая активность позволяют предположить, что короткое плечо хромосомы 3 содержит гены, инактивация или изменение функции которых является кр иi ri-iccKüÄi ссбытием з Пихогсксзс некоторых типов риКи> 3 сиязп с эти?** iiü коротком плече хромосомы 3 проводится интенсивный поиск генов, вовлеченных в развитие рака почки, легкого, молочной железы, шейки Mai км и друт их органов.

Цель и задачи псслсдовяпия. Цель данной работы состояла в детальном анализе потери гетерозиготпости на коротком плече хромосомы 3 человека при раке почки, легкого, молочной железы и шейки матки для выявления участков локализации потенциальных гепов-супрессоров, общих и специфичных для этих типов рака.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. провести детальный анализ потери гетсрозиготности в 20 локусах короткого плеча хромосомы 3 человека в тотальной ДНК из образцов рака почки, рака легкого, рака молочной железы и рака шейки матки (всего 164 образца);

2. сравнить характер аллельных потерь в четырех типах эпителиального рака и определить участки, наиболее подверженные делециям;

3. определить возможную корреляцию между частотой потери гетерозиготности и клиническими и гистологическими параметрами опухолевых образцов.

Научная новизна работы. В данной работе впервые проведен сравнительный анализ нестабильности короткого плеча хромосомы 3 человека с использованием плотной панели микросатсллитных маркеров (20 полиморфных локусов) в

эпителиальных опухолях четырех разных локализаций. Полученные данные позволили впервые в сопоставимых условиях сравнить степень аллельных изменений иа коротком плече хромосомы 3 в разных типах рака и значимость рада критических районов хромосомы Зр для поиска гепов-супрессоров опухолевого роста. Показано, что в опухолях почки и легкого преобладают более протяженные аллельные делеции и частота потерь гетерозиготности в большинстве локусов в два раза выше, чем в опухолях молочной железы и шейки матки. Это различие позволило предположить участие дополнительных гспетических элементов на хромосомы Зр в патогенезе рака почки и легкого. В результате анализа частот потерн гетерозиготности на хромосоме Зр определены новые локусы-кандидаты для генов-супрессоров опухолевого роста, в том числе общий локус для трех форм эпителиальной нсоплазии, который был локализован вблизи маркера D3S2409 в районе 3р21.31. Для рака почки и рака легкого показала корреляция гистопатололгаеских параметров опухоли с протяженностью аллельных Зр-делеций.

Практическая ценность работы. Исследование потери гетерозиготности в микросателлитцых локусах в четырех типах эпителиального рака позволило выявить ряд участков на хромосоме Зр, которые могут быть местами локализации генов-супрессоров. Эти данные могут явиться основой для дальнейших исследований с целью идентификации генов, вовлеченных в развитие и прогрессию раковых заболеваний. В настоящее время по результатам работы проводится отбор РАС-клонов, принадлежащих к найденным локусам-каццидатам. Применение высокоинформативных микросателлитных локусов в качестве тестов может быть перспективным дтГл доклиппческои диагностики и протезирования развЕггия заболевания. Клонирование новых генов-супрессоров открывает возможности его применения в генной терапии.

Апробации работы. Диссертационная рабога была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ГУЛ «ГосНИИ генетика» от 22 декабря 1999 г. Результаты настоящей работы докладывались на ежегодных конференциях Государственной Подпрограммы «Геном человека» (Москва, Черноголовка, 1996, 1997, 1998, 1999 гг.), на конференциях ГУЛ «ГосНИИ генетика» (1996, 1997 гг.), на конгрессах международной организации по изучению генома человека HUGO (Гейдельберг, 1996 г.; Турин, 1998 г.; Брисбэйн, 1999 г.; Ванкувер, 2000 г.), на конференциях европейского сообщества по изучецию генетики человека ESHG (Лиссабон, 1998 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, включая две статьи и тезисы докладов и сообщений на международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и содержат 15 таблиц и 8 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Коллекции образцов н маркеры.

Для анализа аллельных потерь хромосомы Зр была использована панель нз 20 полиморфных микросателлитных маркеров. Панель включала 9 три- н тетрамерных маркеров, выбранпых из базы данных CHLC (Cooperative Human Linkage Center), 10 динуклеотидных маркеров, выбранных из базы данных GDB (Genome Data Base) и дшгуклсотидный маркер NL1-024, полученный ранее в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии «ГосНИИ геиетикн» (Брага и др., 1997). Локализация маркеров приведена ниже (см. гл. 3). Маркеры относятся к 14 цитогенетическим районам хромосомы Зр, таким образом в данной работе исследованы аллельные изменения, происходящие на всем протяжении короткого плеча хромосомы 3. Наибольшее внимание уделено центральному цнтогепетическому району Зр21, для которого показана важная роль в развитии рака легкого и почки (Kok et al., 1997; van den Berg et al., 1997). Этот район исследован с использованием 9 маркеров. Наиболее детально в этом районе исследована область гомозиготных делений АР20 (маркеры NL1-024, D3S1298 и D3S3527) и область, прилежащая к маркеру D3S2409, для которог о в процессе работы были обнаружены наиболее высокие частоты потерь гетсрозиготности. Облаете гепов-капдидатов VHL, Зр25-26 и FHIT, Зр14.2 также исследованы с использованием нескольких полиморфных локусов.

Исследование проведено на основе коллекции, состоящей из 164 пар препаратов ДНК, выделенных из опухолевых и соответствующих нормальных (контрольных) тканей. Коллекция включала 57 нар образцов рака почки, 40 пар образцов рака легкого, 31 пару образцов рака молочной железы и 36 пар образцов рака шейки матки. Парные образцы опухолевых и нормальных тканей были собраны и охарактеризованы клинически и гистопатолопгческн, в том числе по международной классификации TNM (UICC, Union Internationale Contre Le Cancer) совместно с лабораторией клинической онкогенетики и лаборатории гистохимии Онкологического Научного Центра РАМН. При отборе материала проводили гистонатологический анализ микросрезов, что обеспечило высокое (не менее 70%) содержание опухолевых клеток в исследуемом материале.

2. Апализ аллельных потерь и нестабильности мшсросателлптов. Учет H и L-аллелей.

Определение потери гетерозиготпости в тотальной ДНК из опухолевых препаратов проводили методом ПЦР. Продукты ПЦР разделяли элекгорофорезом в 8%-12% неденатуриругощем полиакриламидном геле и окрашивали серебром. Для амплификации динуклеотидных маркеров с длиной продукта более 170 п.н. использовали 32Р-меченные праймеры, продукты, амплификации разделяли в 6% денатурирующем полиакриламидном геле с последующей авторадиографией.

171 174 17t Потерю гетерозиготности выявляли, Т И Т N Т J4 сравпивая разделенные в ПААГ продукты |г ¿1 ПЦР, проведенаой на препаратах ДНК из ,. .> йу опухолевого материала и нормальной J?" FJIJS ткали. В случае потери гетерозиготности Рис. 1. Картина элегарофорепиеского наблюдается исчезновение одного из разделения продуктов ПЦР для маркера аллелей в продукте амплификации ДНК из D3S2406 в 8% неденатурирующем ПААГ опухолевой ткани по сравнению с ДНК из с последующим окрашиванием серебром нормальной ткани того же пациента. В

Т-продукт амплификации ДНК из опухолевой

ткани, N-иродукт амшшфйкации ДНК из Рядс случаев, однако, наблюдалась нормальной ткани, М (маркер) - фрагменты неполная потеря гетерозиготности, pUC 19/Mspl длиной 404 и 331 П.Ц. ,

1 * обусловленная присутствием некоторого

количества нормальных клеток в опухолевом образце. При этом вместо полного исчезновения аллеля наблюдается его слабый сигнал. Потеря гетерозиготности учитывалась при уменьшении интенсивности одного из аллелей в опухоли по отношению к нормальной ткани на 40%. Характерные картины разделения продуктов ПЦР приведены на рис. 1. Образцы №170, 171 и 174 являются примерами потери гетерозиготности: в образце 171 произошла потеря верхнего, Н-аллеля, в образцах 170 и 174 — нижнего, L-аллеля. Образец №123 представляет пеипформативный случай, а образец №178 является примером сохранения гетерозиготности.

Микросатсллитную нестабильность (MIN) выявляли с использованием того же подхода. В отлтгчие от картины, наблюдаемой при LOH и связанной с утратой одного из аллелей, в случае MIN изменяются размеры одного или обоих аллелей или ьместо стандартных двух аллелей появляется одни или два дополнительных.

Как было замечено ранее в лаборатории Е.Забаровского, Каролинский Институт, Стокгольм, (Ш ct al-' 1999), при анализе образцов со значительной примесыо иеопухолевых клеток в случае полиморфных СА-повторов происходит двукратное недовыявление потерь аллелей низкого молекулярного веса (L-аллелей) по сравнению с потерями аллелей высокого молекулярного веса (Н-аллелей). При анализе данных литературы (100 случайпо выбранных публикаций) сотпошепие числа Н- и L-аллелей составило 1.93 (530/275, Liu et al., 1999). В связи с этим, для анализа аллельных потерь в ДНК из опухолевого материала были разработаны правила, которые требуют обнаружение потерь обоих типов (особенно при выявлении прерывистых или множественных делеций) и достижения равенства в количестве выявленных потерь каждого типа. Применение плотной панели маркеров, а также тщательный анализ аллельных изменений обеспечили равенство для выявленных потерь Н- и L-аллелей (477/470) при анализе полной выборки образцов (164 пары). Большинство найденных нами делеций содержали оба типа потерь. В случае множественных делеций участки сохранения гетерозиготности чередовались с потерями как Н-, так и L-аллелей.

3. Аллельныс изменения па коротком плече хромосомы 3 в образцах рака

почкл.

Повреждения короткого плеча хромосомы 3 наблюдаются в большинстве образцов непапиллярной почечпоклсточной карциномы. Высокая частота аллелыгых потерь, наблюдаемая на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака почки, позволяет предположить важную роль хромосомы Зр в развитии этой формы. В цитогенетнческих исследованиях хромосомы Зр в опухолях почки делеции с высокой частотой пайдепы в областях Зр26, Зр21 и Зр14 (Mertens et al., 1997; Mitelman et al., 1997). Максимумы потерь гетерозиготности при раке почки также найдены в разных районах Зр (Kok et al., 1997), включая область гена-кандидата, VHL, Зр25, а также районы Зр24, Зр21, 3р14.3 и Зр14.2 (Van den Berg et al., 1996, 1997; Shridhar et al., 1997; Siebert et al., 1998; Orikasa et al., 1998; Chino et al., 1999). Для гепа-калдидата VHL получепы дштые, демонстрирующие его супрессорпую функцию (Kok et al., 1997). Кроме того, в области Зр12 обнаружен участок NRC-1 (non-papillary renal cell carcinoma), опосредующий подавление роста опухоли и гибель раковых клеток in vivo (Lott et al., 1998; Lovell et al., 1999). Таким образом, цитсгепетические профили делеций и молекулярные данные говорят о присутствии множественных локусов i-епов-супрессоров на коротком плече хромосомы 3 (Van den Berg and Buys, 1997).

Коллекция образцов рака почки состоит из 57 пар образцов (опухоль/норма) почечноклеточной карциномы непапиллярпого строения, из которых 47 пар представлены светлоклеточным раком почки, 3 пары - гранулярноклеточным раком почки и 7 пап - смешапнмм типом (светлпклеточтлм и грптгулярппклеточпым). I стядпя развития рака представлена четырьмя образцами, II стадия — 34 образцами, III стадия — 14 образцами и IV стадия - 4 образцами.

Результаты делециошюго картирования приведены на рис. 2, на котором образцы расположены в соответствии со степенью происходящих в них аллельных изменений. Представлены образцы, выявившие LOH хотя бы в одном из исследованных локусов. Аллельпые изменения хромосомы Зр в образцах рака почки в одном или более локусов Зр были пайдепы в 91% случаев (52/57 образцов) (табл. 1).

Более половины из всех выявленных делеций были концевыми (29/52, 56%), в ряде образцов аллельные потери обнаружены во всех информативных локусах Зр, что по- видимому свидетельствует о полной потере Зр-плеча (образцы №4, 42, 47, 72, 74, 104, 106, 107, 109, 143, 145, 170, 171, 174, 184, 193, 196, 300, 301 и 304). Протяженные делеции всего Зр-плеча свидетельствуют о значительных хромосомных изменениях. Более короткие внутренние и множественные делеции, в которых участки потери гетерозиготности перемежаются с участками сохранения гетерозиготности, найдены в меньшем числе образцов, в 5/52, 10% и в 18/52, 35%, соответственно. Короткие внутренние делеции могут соответствовать начальным событиям в канцерогенезе.

Данные о представленности делеций разного типа (табл. 1) в образцах рака почки коррелируют с данными литературы, демонстрируя некий консенсус. Как и

Рис. 2. Делеционное картирование хромосомы Зр в образцах рака почки

Примечание: в - потеря гетерозиготнссти, О - сохранение гетерозиготности, - - кеинформативный случай

Таблица I. Типы аллельных делеций на коротком плече хромосомы 3 в опухолях четырех видов

Рак почки Рак легкого Рак молочной железы Рак шейки матки

Всего Зр 52/57 30/40 23/31 27/36

делеций 91% 75% 74% 75%

Концевые 29/52 16/30 1/23 3/27

56% 53% 4% 11%

Впутрешше 5/52 8/30 6/23 6/27

короткие 10% 27% 26% 22%

Множественные 18/52 6/30 16/23 18/27

35% 20% 70% 67%

в работе Chudeck et al., 1997, доминирующими найдены протяженные концевые делеции. С другой стороны, благодаря применению плотной панели маркеров и определению типа потерянного аллеля подтверждено существование внутренних и множественных делеций, выявленных ранее (Van den Berg et al., 1997; Shridhar et al., 1997; Alimov et al., 2000).

Средняя частота потери гетерозиготности для локусов Зр была найдена равной 69%, варьируя при этом от 49% для цептромерного локуса D3S2406 (Зр12.2) до 82% для локуса D3S2409, расположенного в центральной области 3р21.31 (табл. 2). Максимумы потерь гетерозиготности в образцах рака почки пайдены для следующих маркеров: D3S2405 (Зр26.1, 78% LOH), D3S1317 (3р25.3, 77% LOH), NL1-024 (Зр22, 78% LOH), D3S2420 (3р21.31, 78% LOH) и D3S2409 (3р21.31, 82% LOH). Максимумы потерь гетсрозигот!юста при раке почки относятся, таким образом, к районам Зр26 и Зр21, что согласуется с данными литературы (Kok et al., 1997; van den Berg et al., 1997; Alimov et al., 2000). Применение в нашем исследовании более новых три- и тетрамерных маркеров позволило выявить новые локусы с высокой частотой потерь (D3S2420 и D3S2409) в центральной области Зр-плеча.

Микросателлитная нестабильность в образцах рака почки найдена для 9 образцов из 57 (16%), что несколько превышает частоту встречаемости MIN, найденную другими авторами (0% MTN, Chino et al., 1999; 1.5% MIN, Shridhar et al., 1997; 3%MIN, Goessletal., 1998; 10% MIN, Sugimura et al., 1997). Для 4 из 9 обрядов с MIN нестабильность микросателлитов была найдена для двух и более локусов Зр. Такой фенотип, фенотип ошибок системы репарации или RER-фенотип, связан с повреждениями гена системы репарации. Один из таких генов, hMLIIl, локализован на хромосоме 3 в области Зр22. Возможно, частые делеции в опухолях почки в области 3р22-р21.33, повреждающие этот ген, приводят к повышепной частоте нестабильности и появлению RER-фенотипа. С другой стороны, выявленная в данном исследовании повышенная частота MIN, может быть связана с применением три- и тетрамерных маркеров, которые с большей частотой подверженны таким изменениям (см. ниже, раздел 7.4).

Таблица 2. Частота аллельных потерь в разных локусах короткого плеча хромосомы 3 в опухолях четырех типов

Маркер* Локализация/ Рак почки Pax легкого Рак молочной Рак шейки

млн. п.н.** железы матки

D3S2405 Зр26.1/ 28/36 15/29 7/19 6/25

GGAT2A11 4.4 78% 52% 37% 24%

D3S1038 Зр26.1 26/36 11/25 5/25 10/32

5.0 72% 44% 20% 31%

D3S1317 3р25.3/ 26/34 16/30 3/18 7/23

(VHL) 7.9 77% 53% 17% 30%

D3S1286 Зр25.2/ 20/33 20/36 6/22 6/26

11.6 61% 56% 27% 23%

D3S3047 3р24.3/ 26/37 16/27 6/16 3/18

GATA85F02 22.6 70% 59% 38% 17%

D3S1283 Зр24.2/ 29/39 16/33 11/27 8/24

24.2 74% 49% 41% 33%

NL1-024 Зр22/ 14/18 8/15 8/15 3/9

39.8*" 78% 53% 53% 33%

D3S1298 3р21.33/ 26/38 14/24 7/15 7/25

41.6 68% 58% 47% 28%

D3S3527 3р21.33/ 30/41 13/26 10/21 6/29

44.4 73% 50% 48% 21%

D3S2420 3р21.31/ 28/36 14/30 8/22 8/28

ATA25A07 58.4 78% 47% 36% 29%

D3S2409 3р21.31/ 23/28 16/28 10/27 8/25

АТА10Ш1 58.85*** 82% 57% 37% 32%

D3S2456 3р21.31/ 25/34 11/25 12/22 5/24

GATA63E04 59.3 74% 44% 55% 21%

D3S1767 3р2131/ 28/40 11/23 ю,ai 6,-25

GATA7A01 59.5 70% 48% 4о% 24%

D3S1568 Зр21.2/ 22/32 9/23 10/29 8/25

61.9 69% 39% 35% 32%

D3S1766 Зр21.1/ 20/29 14/27 7/20 3/26

GATA6F06 66.9 69% 52% 35% 12%

D3S1300 Зр14.2/ 24/34 7/18 6Û0 6/19

IHIT 75.8*** 71% 39% 30% 32%

D3S1481 Зр14.2/ 20/36 18/35 4/22 3/30

FUIT 76.0 56% 51% 18% 10%

D3S1285 Зр14.1/ 13/25 10/25 4/15 8/21

81.1 52% 40% 27% 38%

D3S2454 3р13/ 11/19 10/18 5/20 2/11

GATA52H09 85.5 58% 56% 25% 18%

D3S2406 Зр 12.2/ 22/45 11/29 1126 8/30

GGAT2G03 91.2 49% 38% 27% 27%

Среднее значение 461/670 260/526 146/422 121/475

частоты LOII на Зр 69% 49% 35% 26%

* Для три- и тетрамерных микросателлигов приведены также их краткие названия из базы данных CHLC (Cooperative Human Linkage Center )

** Приведены онтогенетическая локализация и расстояние от теломерного конца Зр-плеча из базы данных LDB (Location Data Base, http://cedar.genetics.soton.ac.uk/pub/chrom3/gmap)

*** Данные экстраполированы на основе дополшггельной информации: расстояние между NL1-024 и D3S1298 составляет 1.8 илн.п.н. (Kashuba, personal communication); расстояние между D3S1300 и D3S1481 составляет 0.2 млн.п.н. (Shridhar et al., 1997); расстояния от теломерного конца для соседних локусов D3S2420, D3S2409 и D3S2456 составляют 188 cR, 193.4 cR и 198.3 cR (из базы данных Whitehead Institute, http://carbon.wi.mit.edu:8000/cgi-bin/contig/sts_info)

4. Аллсльпые изменения па коротком плече хромосомы 3 в образцах рака легкого.

Согласно литературным данным, во всех формах рака легкого хромосомным аберрациям наиболее подвержено короткое плечо хромосомы 3. Данные цитогенетическнх исследований указывают па области Зр12 и Зр21-р25, демонстрируя па цитогенетическом профиле потерь широкий максимум от середины Зр-плеча до предтеломерной области (Mertens et al., 1997). Молекулярные исследования показывают, что области Зр25-р26, 3р21.3-р22 и Зр14-сеп играют важную роль в канцерогенезе легкого (Kok et al., 1997). В области Зр21 и Зр14.2 обнаружены гомозиготные делеции в линиях клеток и в образцах мелкоклеточного и плоскоклеточного рака легкого (Todd et al., 1997). Исследования предраковых изменений показали, что в многоэтапном патогенезе плоскоклеточного рака легкого аллсльпые делеции в районах Зр21, Зр22-р24 и Зр25 являются паиболее ранними и частыми событиями (Wistuba et al., 1999).

Использованная в данной работе коллекция образцов рака легкого состоит из 40 пар образцов (опухоль/норма) и сравнительно однородна гистологически. Она представлена двумя образцами мелкоклеточной карциномы легкого и 38 образцами

Рис. 3. Делеционное картирование хромосомы Зр в образцах рака легкого Обозпачения см. рис. 2.

немелкоклеточного рака легкого, из которых 30 случаев относятся к плоскоклеточному раку легкого и 8 - к аденокарциноме. I стадия заболевания представлена десятью образцами, II стадия - 15, III стадия - 13 и IV стадия развития рака представлена одним образцом.

При анализе аллельпых потерь в указанной коллекции из 40 образцов рака легкого с использованием 20 мшсросателлитных маркеров потеря гетерозиготности в одном или более локусов короткого плеча хромосомы 3 была выявлена в 75% случаев (30/40 образцов). Данные исследования аплельных потерь в образцах рака легкого представлены па рис. 3, из которого исключены образцы, не обнаружившие потери гетерозиготности ни в одном из исследуемых локусов.

Концевые делеции выявлены в 16/30, 53% образцов рака легкого, обнаруживших делецию. В образцах №5, 23, 38, 39, 50, 60, 67, 100, 130, 162, 324, 326, 327, 329 и 330 потеря гетерозиготпости выявлена во всех информативных локусах. По-видимому, в этих образцах на одной из пары хромосом произошла потеря всего Зр-плеча. С меньшей частотой в образцах рака легкого обпаружепы короткие внутренние (8/30 образцов, 27%) и множественные делеции, в которых участки потери гетерозиготности перемежаются с участками сохранения гетерозиготности (6/30 образцов, 20%) (табл. 1). Высокая частота аллелышх делеций (75%) и повышенная встречаемость протяженных концевых делеций на хромосоме Зр при раке легкого отмечались и ранее (Kok et al., 1997; Minna et al., 1997; Wistuba et al., 1999a).

Частота потери гетерозиготности в индивидуальных локусах хромосомы Зр для рака легкого варьирует от 38% в локусс D3S2406 (Зр12.2) до 59% в локусе D3S3047 (3р24.3) и в среднем равна 49% (табл. 1). Наиболее высокая частота LOK обнаружена для следующих маркеров: D3S1286 (Зр25.2, 56% LOH), D3S3047 (3р24.3, 59% LOH), D3S1298 (3р21.33, 58% LOH), D3S2409 (3р21.31, 57% LOII) и D3S2454 (3р13, 56% LOII). Максимумы потерь гетерозиготности при раке легкого обнаружены для областей Зр25.2, 3р24.3, 3р21.33, 3р21.31 и 3р13. Интересно отметить, что полученные нами данные подтверждают выявленный на цитогенстических профилях максимум, покрывающий области 3р24.3 - Зр25.2 (Mertens et al., 1997).

Нестабильность микросателлитов была обнаружена для двух образцов рака легкого (2/40, 7%), причем один из них, №23, показал MIN в нескольких локусах Зр и обнаружил RER-фенотип. Эти данные не противоречат данным литературы, согласно которым частота MIN для немелкоклеточного рака легкого сильно варьирует (от 0 до 69%) (Pylkkanen et al., 1997; Peltomaki et al., 1993; Fong et al., 1995; Sekine et al., 1997; Rosell et al., 1997).

5. Аллсльпые изменения на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака молочной железы.

Аллельныс изменения при раке молочной железы обнаруживаются на многих хромосомах: 1р, Зр, 11p, 13q, 16q, 17р и 17q (Ingvarsson et al., 1998). Данные по локализации аллельных делеций на Зр-плече указывают па различные области: 3р13-

р14, Зр21-р22 и Зр24-р26 (Chen et al., 1994), Зр21-р25 (Ali et al., 1989), Зр14 и 3p21.3 (Eiriksdottir et al., 1995), 3p24-p26 (Dietrich et al., 1995a). Данные цитогенетичсских исследований говорят о вовлеченности в развитие рака молочной железы областей Зр14 и Зр25-р2б (Mertens et al., 1997). В результате сопоставления данных разных авторов, в том числе для доброкачественных форм, область Зр14 определена как минимальный участок перекрывания делений (Pandis et al., 1997).

В работе использована коллекция, состоящая из 31 пары образцов рака молочной железы. Из них 19 пар образцов принадлежат к инфильтратпвно-дольковому типу рака молочной железы, 8 пар образцов - к инфильтративно-протоковому и 4 - к медуллярному. I стадия развития рака представлена 6 образцами, II стадия — 12 образцами, III стадия представлена 4 образцами.

Потеря гетерозиготности в одном или более локусах Зр при исследовании аллельного полиморфизма 20 локусов выявлена в 23 образцах из 31 (74%). Результаты делеционного картирования образцов рака молочной железы показаны на рис. 4, па

»-ifit-i Л Н И И Н ИЙНИИ-1ИНИ T—t < t—i W

26.3 26.1 25.3

25.2

24.3 24.2

22 21.33

21.31

21.2 21.1

14.2

14.1 13

12.2

■S2405

•sitra

■S1317 ■S1286 -<

■S3047 ■S12S3 О

•NL1-024

■S122S

■S3527

■S2420

■1Ш§6

■S1767 ■S1563

■31766

■S1300 ■S1481 ■S1285 ■S2454

■S2406

Рпс. 4. Делеционное картирование хромосомы Зр в образцах рака молочной железы Обозначения см. рис. 2.

котором представлены образцы, обнаружившие LOH хотя бы в одном из исследованных локусов. Образцы па рис. 4 расположены соответственно районам Зр, в которых обнаружены делеции - от центромсрных к теломерным. Видно, что подавляющее большинство обнаруженных в образцах рака молочной железы делеций являются либо короткими внутренними (6/23 образцов, 26%), либо множественными (16/23 образцов, 70%) делециями (табл. 1). Длинные концевые делеции были найдены в одном образце, №155 (1/23 образцов, 4%).

Большая часть аллельных делеций обнаружена в районах 3р21.31 и Зр22. Короткие внутренние делеции в опухолях молочной железы найдены в шести образцах (№111, 112, 116, 127, 154 и 175). В 4 из 6 таких образцов (67%) делеции затрагивали райоп Зр21.31. С этой областью таким образом могут быть связаны ранние события в развитии рака молочной железы.

Средняя частота потери гетерозиготности для 20 локусов хромосомы Зр в образцах рака молочной железы найдена равной 35% (табл. 2). Минимальная частота LOH - 17% найдена для теломерного локуса D3S1317 (3р25.3), максимальная - 55% для локуса D3S2456 (3р21.31). Ряд локусов показал высокую частоту LOH: NL1-024 (Зр22, 53% LOH), D3S1298 (3р21.33,47% LOH), D3S3527 (3р21.33,48% LOH), D3S1767 (3р21.31, 48% LOH). Таким образом, обнаружено, что Зр-делеции при раке молочной железы часто затрагивают центральную область Зр-плеча (районы 3р21.31, 3р21.33 и Зр22), что указывает па важную роль, которую эта область играет в развитии рака молочной железы. Благодаря применению дополнительных полиморфных маркеров нами получены данные, которые смещают критичный район от Зр14 (Pandis et а!., 1997) в область 3р21.3. Сходные дшшыс были получены б работе Maisumoto et а!., 1997, где с использованием высокоинформативяых микросателлитных маркеров в образцах рака молочной железы были обнаружены короткие внутренние делеции, затрагивающие область Зр14-р21. Перекрывание области частых аллельных потерь с обнаруженными ранее гомозиготными делециями в районах 3р14.3-р21.1 (Buchhagen et al., 1994) и Зр21.2 (Sekido et al., 1998), говорят в пользу существования в районе Зр14-р21.2 одного или нескольких гспов-супрсссоров, ассоциированного с раком молочной железы.

Локусы нестабильности микросателлитов обнаружены в двух образцах: №177 и №311 (2/31, 7%). Эти данные соответствуют литературным данным, согласно которым частота MIN для рака молочной железы сильно варьирует, от 0% до 85% (Peltomaki et al., 1993; Wooster et al., 1994; Patel et al., 1994, Dillon et al., 1997).

6. Аллельныс изменепии па коротком плече хромосомы 3 в образцах рака шейки матки.

Большинство случаев карцином шейки матки (90%) связывают с инфекцией папилломовирусов человека (HPV) (Rader et al., 1998). На хромосоме Зр в районе Зр14 находится фрагильный участок FRA3B, содержащий участок встраивания вируса HPV-16 (Muller et al., 1998). Несмотря на то, что инфекция папилломовирусами является важным событием в патогенезе рака шейки матки, сама по себе она недостаточна для

приобретения злокачественного фенотипа. Необходимыми событиями являются делении Зр-плсча, обнаруживаемые в различных его областях: 3р13 и Зр25 (Chung et al., 1992), 3p2U-pl3 (Kohno et al., 1993), 3p22.1-p21.33 (Mitra et al., 1994). Сравнение всех хромосомных плеч при раке шейки матки показало, что в наибольшей степени делениям подвергается область Зр14.1-р12 (Rader et al., 1996). Детальный анализ потерь гетерозиготностн Зр-плеча с использованием большого числа Зр-маркеров выявил несколько областей частых аллельных потерь: Зр12.1-р11, Зр14.2-р14.1, Зр21.2-р14.2, Зр24.2-р21.1 и 3pter-3p24.2, из которых область Зр14 наиболее часто подвергалась делениям (Larson et al., 1997). Высокие значения потери гетерозиготностн были найдены для областей 3р13 (Wong et al., 1997), Зр14.2 и Зр21 (Wistuba et al., 1997) и Зр22-р24 (Ku ct al., 1997).

Анализ аллельных потерь в данной работе выполнен с использованием коллекции, состоящей из 36 пар образцов (опухоль/норма) плоскоклеточного рака шейки матки. Во всех образцах были обнаружены вирусные последовательности (HPV16 или HPV18).

Аллельные изменения в одном или более локусах хромосомы Зр обнаружены в

Рис. 5. Делециоппое картирование хромосомы Зр в образцах шейки матки Обозначения см. рис. 2.

27 из 36 образцов (75%). Данные анализа потери гетерозиготности на хромосоме Зр в образцах рака шейки матки представлены на рис. 5, из которого исключены образцы, не обнаружившие потерю гетерозиготности ни в одном из исследованных локусов. Большинство найдеш1ых делеций являются внутренними, включая короткие внутренние (6/27 образцов, 22%) и множественные (18/27 образцов, 67%). Длинные концевые делехщи, преобладающие в образцах рака почки и легкого, составляют меньшую часть делеций в образцах рака шейки матки (3/27 образцов, 11%) (табл. 1).

Частота аллельных потерь в образцах рака шейки матки для 20 локусов Зр-плеча составила в среднем 26% (табл. 2). Наибольшая частота LOH была обнаружена для локуса D3S1285 (Зр14.1, 38% LOH). Несколько других Зр-локусов также показали относительно высокую частоту аллельных потерь: D3S1283 (Зр24.2, 33% LOH), NL1-024 (Зр22, 33% LOH), D3S2409 (3р21.31, 32% LOH), D3S1568 (Зр21.2, 32% LOH), D3S1300 (Зр14.2, 32% LOH). Таким образом, максимумы потерь гетерозиготности при раке шейки матки обнаружены в областях Зр24.2, Зр22, 3р21.31, Зр21.2, Зр14.2 и Зр14.1, что в целом согласуется с данными литературы, цитированными выше.

Микросателлитная нестабильность в образцах рака шейки матки обнаружена в 6 из 36 случаев (17%) (образцы №86, 212, 235, 286, 458 и 459). Для образцов №86 и 212 MIN выявлена в двух локусах Зр и таким образом, для этих образцов обнаружен RER-фенотип. Частота встречаемости MIN в опухолях шейки матки соответствует данным литературы, согласно которым MIN варьирует от 5.3% до 35% (Chu et al., 1999; Kersemaekers et al., 1998; Wistuba et al., 1997).

7. Сравнение аллельных изменений us хромосоме Зр б разных б идах эпителиального рака.

Дслеционное картирование хромосомы Зр проводится в солидных опухолях разных локализаций в разных лабораториях мира. При этом даже для одной формы рака, например светлоклеточного рака почки, полученные результаты часто оказываются противоречивы как в отношении положения областей, наиболее подверженных делениям, так и в отношении доли концевых, внутренних и множественных делеций (Van den Berg et al., 1996, 1997; Chudek et al., 1997; Shridhar et al., 1997; Clifford et al., 1998). Такое расхождение результатов, по-видимому, связано с использованием различных наборов маркеров и с различием в методах отбора материала (применение микродиссекции или линий клеток).

В данной работе впервые проведено делеционное картирование хромосомы Зр в разных видах эпителиального рака в сопоставимых условиях - с использованием идентичной панели микросатсллитных маркеров и одинаковых подходов к отбору материала и анализу результатов. Такой сравнительный анализ хромосомы Зр в сопоставимых условиях позволил сравнить частоты аллельных потерь, соотношение делеций разных типов и частоты нестабильности микросателлитов в четырех типах эпителиального рака, а также локализовать общие и специфичные локусы генов-кандидатов.

7.1. Сравнение частоты и протяженности делений в четырех типах эпителиального рака.

Доля образцов с делецнями хотя бы в одном из исследованных локусов была найдена достаточно высокой в разных типах эпителиальной неоплазии (табл. 1). Наибольшее число образцов с делециями было обнаружено при исследовании рака почки, 52 из 57 (91%) исследованных образцов. В опухолях легкого, молочной железы и шейки матки доля образцов с делециями оказалась примерно одинаковой. Делении хотя бы в одном из локусов Зр были найдены в 30 из 40 (75%) исследованных образцов рака легкого, в 23 из 31 (74%) случаев рака молочной железы и в 27 из 36 (75%) образцов рака шейки матки.

Обнаруженные делеции можно отнести к трем группам: а) концевые, затрагивающие значительную часть или все Зр-плечо, б) короткие внутренние, в которых один небольшой район аллсльных потерь окружен участками сохранения гетерозиготпости и в) множественные, в которых участки потери гетерозиготности в одних локусах перемежаются с участками сохранения гетерозиготности в других локусах. Множественные делеции состоят или только из внутренних, или включают оба типа, и концевые, и внутренние. Показано, что для каждого типа рака характерно преобладание определенных типов делеции. Как видно из табл. 1, протяженные концевые делеции доминировали в образцах рака почки и легкого, а более короткие внутренние и множественные — в образцах рака молочной железы и шейки матки. Различие в протяженности аялелышх делеций напшо отражение в частотах аллельных потерь л отдельных локусах Зр а тзюке в средних значениях этих величин, рассчитанных для разных типов рака (табл. 2). Средние значения частоты LOH при раке почки и легкого составили 69% (461 из 670 информативных случаев) и 49% (260 из 526 информативных случаев), что примерно вдвое выше, чем в случае рака молочной железы (146 из 422 случаев, 35%) и шейки матки (121 из 475 случаев, 26%).

Эти данные позволяют разделит;, четыре Tima рака по характеру и уровню аллельных потерь на хромосоме Зр на два типа: (а) с протяженными делециями и высокой частотой LOH (рак почки и рак легкого) и (б) с короткими делециями и низкой частотой LOH (рак молочной железы и шейки матки). На основании этих данных можно сделать предположение об участии дополнительных генетических элементов в патогенезе рака почки и рака легкого. Можно предположить, что в опухолях почки и легкого играет важную роль сайт ломкости FRA3B, расположенный в области Зр14.2 в составе гена FHIT между маркерами D3S1300 и D3S1481 (см. рис. 2 и 3 и табл. 2). Частые разрывы в области FRA3B могут приводить к протяженным концевым делециям, характерным для рака почки и легкого. Аналогичное предположение было высказано ранее в отношении рака ночки (Shridhar et al., 1997).

Внутренние и множественные делеции, которые связывают с ранними событиями в канцерогенезе, выявлены па Зр с разной частотой во всех исследованных нами типах эпителиального рака (табл. 1). Вопрос о встречаемости и даже о

существовании внутренних делеций активно дискутировался в литературе на основе исследований опухолей почки (Wilhelm et al., 1995; Chudek et al., 1997; Van den Berg et al., 1997; Shridhar et al., 1997; Alimov et al., 2000). Проведенный нами сравнительный анализ хромосомы Зр в четырех видах эпителиального рака с использованием идентичной и плотной панели маркеров подтвердил существование внутренних и множественных делеций в разных видах эпителиального рака.

7.2. Корреляция протяженности делеций с гистопатологнчсским типом опухоли почка и легкого.

Для образцов рака почки и рака легкого была исследовала корреляция типов делеций Зр и гистопатологических параметров опухоли. Результаты исследования представлены в табл. 3 и 4. Было показано, что длшшые концевые делеции наиболее характерны для более злокачественного светлоклеточного рака почки (28/43, 65%), а в зернистоклеточном и смешанном типе рака почки преобладают множественные и короткие внутренние делеции (8/9, 89%, табл. 3). Полученные результаты согласуются с данными других авторов. Так, в исследовании гистопатологической корреляции потерь Зр с подтипами опухолей ночки было показано, что обширные аллельные изменения в нескольких областях Зр характерны для светлоклеточной карциномы почки и не обнаружены в несветлоклеточной карциноме (Hadaczek et al., 1996).

Для плоскоклеточного рака легкого и аденокарциномы легкого выявлена сходная корреляция глубины делеций Зр с гистологическим подтипом опухоли. Из табл. 4 видно что в образцах плоскоклеточного рака легкого преобладают длинные концевые делеции (13/21, 62%), а в образцах аденокарциномы - множественные и короткие внутренние делеции (4/6, 67%). Для рака почки и легкого была исследована зависимость протяженности делеций от стадии развития заболевания (табл. 3 и 4). В случае рака почки корреляция протяженности делеций со стадией болезни не выявляется, ни при рассмотрении полной коллекции образцов клеточного рака почки

Таблица 3. Корреляция протяженности делеций на (табл. 3), ни при хромосоме Зр с клинико-гистологическими параметрами в опухолях почки

Гистопатологическии Концевые, Множественные и

тип опухоли более длинные внутренние,

делеции более короткие

Светлоклеточный 28/43 15/43

65% 35%

Зернистоклеточный и 1/9 8/9

смешанный 11% 89%

Стадия I -3/4,75% I -1/4,25%

II -14/28,50% II -14/28,50%

III — 8/14, 57% 1П —6/14,43%

IV-2/4, 50% IV-2/4, 50%

раздельном рассмотрении разных гистологических подтипов: а)

светлоклеточного и б)

гранулярноклеточно-го и смешанного (данные не

показаны). Интересно лишь отметить, что в образцах

светлоклеточного рака Таблица 4. Корреляция протяженности делеций на почки на всех стадиях хромосоме Зр с клинико-гастологичсскими параметрами в

„ .. , опухолях легкого

(I-IV) преобладают

концевые, более

длинные делеции.

Напротив, для

немелкоклсточного

рака легкого

наблюдается

некоторая корреляция

со стадией рака -

начиная с III стадии

четко преобладают

концевые, более длинные делеции (8/10, 80%) (табл. 4). Эти данные согласуются с

результатами Wistuba et al. (1999), выявившими удлипепие делеций хромосомы Зр с

профессией гистопатологичсских изменений при нсмелкоклеточном раке легкого.

7.3. Районы частых аллсльных делецпн в четырех типах эпителиального

рака.

Частое обнаружение на коротком плече хромосомы 3 множествеппых делеций, разделенных участками сохранения гетерозиготности, может указывать на существование множественных генов-супрессоров опухолевого роста.

Как видно из рис. 2-5, аллельные потери наблюдались в разных районах Зр, но л большинстве случаев с множественными делециями — в совокупности с потерями в центральном районе Зр-плеча - области Зр21. Так, ¡гри раке почки аллельные потери затрагивали область 3р21.31 в 15 из 17 (88%) случаев с множественными делециями. При раке легкого во всех образцах с множественными делециями (8 из 8, 100%) наряду с теломерной или центромерной областью аллельные потери затрагивали область 3р21.3. При рассмотрении двух других типов рака: молочной железы и шейки матки наблюдалось аналогичное явление: аллельные потери в области Зр21.3 выявлялись в большинстве множественных делеций (14 из 18 случаев, 78% и 10 из 16, 63%, соответственно). Эти данные указывают па значимость этого района в развитии и этих типов эпителиального рака. Таким образом, район 3р21.3 может являться местом локализации гепов-супрессоров, общих и специфичных для эпителиальных опухолей разных локализаций.

Ранее значимость района Зр21 в отношении частоты аллельных делеций обсуждалась, главным образом, для опухолей почки (Van den Berg et al., 1996, 1997). При сравнении злокачественных и доброкачественных опухолей почки, оказалось, что потери в области 3р21.3 ассоциированы с карциномой, а в аденомах наблюдаются делеции только в теломерной или центромерной областях. Таким образом, потери в области Зр21, по-видимому, необходимы для злокачественной трансформации и

Гистологический Концевые, Множественные и

тип опухоли более длинные внутренние,

делеции более короткие

Плоскоклеточный 13/21 8/21

рак 62% 38%

Лденокарцинома 2/6 4/6

33% 67%

Стадия I - 4/8, 50% I -4/8,50%

II -4/10,40% II -6/10,60%

III - 8/10, 80% Ш-2/10,20%

IV-1/1,100% IV-0/1,0%

развития рака почки. Более того, как показано Todd et al. (1996), перенос фрагментов из этой области в составе микроклеточных гибридов подавляет рост опухолей в иммунно-дефицитных мышах.

Важность района Зр21 отмечалась ранее и для рака легкого, и для рака молочной железы, в которых помимо аллельных потерь были также обнаружены гомозиготные делеции, локализованные в двух районах 3р21.31 (Wei et al., 1996; Todd et al., 1997; Sekido et al., 1998) и 3p21.33-p22 (Murata et al., 1994; Kashuba et al., 1995; Roche et al., 1996; Ishikawa et al., 1997).

В представленной работе район Зр21 исследован в опухолях четырех локализаций с использованием девяти полиморфных маркеров (табл. 2). Наиболее детально с использованием нескольких (3-4-х) маркеров были изучены 2 района: а) вокруг локуса D3S2409; 3р21.31 (с дополнительными маркерами D3S2420, D3S2456 и D3S1767), для которого в процессе работы были выявлены частые потери в разных видах опухолей, и б) область гомозиготных делеции ЛР20 (маркеры NL1-024, D3S1298, D3S3527), относящаяся к району 3р21.33-р22 (Murata et al., 1994; Kashuba et al., 1995; Roche et al., 1996; Ishikawa et al., 1997).

Согласно полученным данным (табл. 2), в этих двух областях аплельные потери наблюдаются с высокой частотой в опухолях разных локализаций. Так, в локусах D3S2409 и D3S2420, 3р21.31 была определена самая высокая частота аллельных потерь для рака почки (23/28, 82% и 28/36, 78%, соответственно), в локусе D3S2409 - один из максимумов частоты LOH для рака легкого (16/28, 57%, относительно средних значений этих Ееличнн, табл. 2). К прилежащим леку сам этой области D3S2456 к D3S1767 относится главный максимум частоты LOH для рака молочной железы (12/22, 55% и 10/21,48%, соответственно).

Для маркеров, принадлежащих или окружающих область АР20, 3р21.33-р22, высокая частота аллельных потерь была определена для всех четырех исследованных видов рака. Для рака почки это маркер NL1-024 (14/18, 78%), рака легкого - D3S1298 (14/24, 58%), рака шейки матки - NL1-024 (3/9, 33%), а для рака молочной железы найден широкий максимум, охватывающий все три исследованных локуса этой области - NL1-024 (8/15, 53%), D3S1298 (7/15, 47%) и D3S3527 (10/21, 48%). Данные о значимости области АР20, 3р21.33-р22 были получены ранее, но только для рака легкого и для рака почки (Murata et al., 1994; Kashuba et al., 1995; Roche et al., 1996; Ishikawa et al., 1997; Alimov et al., 2000). В данной работе значимость этого района продемонстрирована для эпителиального рака четырех локализаций.

Интересно отметить, что выявленный нами в области 3р21.31 новый критичный район вокруг маркера D3S2409 окружен двумя другими интересными районами. С теломерной стороны к району D3S2409 прилежит район CER1 (commonly eliminated region), 3р21.31, найденный по частому элиминированию фрагментов хромосомы Зр из ДНК опухолей иммуннодефицитных мышей, перенесенной посредством микроклегочных гибридов (Szeles et al., 1997; Kholodnyuk et al., 1997; Yang et al., 1999).

Область CER1 смыкается с районом D3S2409, перекрываясь в локусе D3S2420. А центромернее района D3S2409 локализовал район гомозиготных делений, обнаруженных в опухолях легкого и молочной железы, относящийся к области Зр21.2 (Wei et al., 1996; Todd et al., 1997; Sekido et al., 1998). Прилежащие к найденному нами новому району критичные области исследуются структурно и функционально, выявлен ряд генов-кандидатов: GNAI2, SemalV, LTF, LIMD1 и другие (Wei et al., 1996;. Yang et al., 1999; Kiss et al., 1999).

В теломерном районе хромосомы Зр высокая частота потеря гетерозиготности обнаружена, главным образом, для рака почки в области гена-кандидата VHL, исследованной с использованием трех маркеров: D3S2405, Зр26.1 (28/36, 78%), D3S1038, Зр26.1 (26/36, 72%) п D3S1317, 3р25.3 (26/34, 77%). Частота аллельпых потерь в области VHL для рака легкого, молочной железы и шейки матки незначительно превышает среднюю частоту LOII, найденную для этих видов рака или меньше ее (табл. 2). Таким образом, аллелт.пые потери в области вблизи гена VHL, Зр26.1 н Зр25 являются наиболее характерными для рака потки.

Для рака легкого высокая частота LOH отмечена для более цептромерного района, лежащего между областью VIIL и АР20. Для локализованных в районе Зр24-р25 маркеров D3S1286 и D3S3047 частота LOII составила 56% (20/36) и 59% (16/27), соответственно. Делеции в этой области отличают рак легкого от других типов рака и позволяют локализовать область для поиска гена-кандидата, специфичного для рака легкого. Интересно отметить, что на цитогенетпческих профилях Зр для рака легкого пыипляется широкий максимум, охиятыгатощиЯ районы Зр25-р21 (Mertens et а!., 1997).

Совпадение наиболее часто делегарусмых. участков в рашых формах рака может говорить о существовании гена-супрессора, общего для этих форм. По-видимому, такой перспективной областью является обнаруженная нами область, содержащая локус D3S2409, выявляющий высокую частоту потери гетерозиготности в разных видах рака. В пастоящее время ведется поиск РАС-клопоз, покрывающих обнаруженную нами область частых аллельных потерь в райопе маркера D3S2409 для идентификации содержащихся в ней генов (совместно с лабораторией Е.Р. Забаровского).

В области гена-кандидата FHIT (Зр14.2), к которой относятся маркеры D3S1300 и D3S1481, сравнительно высокая частота потери гетерозиготности была определена только для рака шейки матки. Несмотря на сниженную экспрессию гена FIHT и аберрантные транскрипты, наблюдаемые в некоторых типах рака, например, в немелкокпеточном раке легкого (Yanagisawa et al., 1996) и раке молочной железы (Negrini et al., 1996), его роль в качестве гена-супрессора по-прежнему остается недоказашюй.

В прицентромерной области Зр12-р14, высокая частота LOH была найдена для рака легкого в локусе D3S2454 (3р13) (10/18, 56%) и для рака шейки матки - в локусе D3S1285, Зр14.1 (8/21, 38%). Эти данные согласуются с данными Wong et al., 1997,

который обнаружил высокую частоту LOH в области 3р13 при исследовании большой коллекции из 64 образцов плоскоклеточной карциномы шейки матки.

Для определения общих и специфичных критичных районов на хромосоме Зр данные по распределению частот аллельных потерь вдоль Зр представлены в виде профилей частот LOH для трех типов рака (рис. 6). Для рака молочной железы использованы данные, относящиеся к полной выборке образцов, а для рака легкого и почки представлены данные, рассчитанные для гистологически однородных коллекций: светлоклеточного рака почки и плоскоклеточного рака легкого. Видно, что высокая частота LOH наблюдается в области гена VHL для рака почки, в области АР20

пае ии si в ид и и ü

Эр, ИЛИ. ILK.

Рис. 6. Профили частот потери гетерозиготности (LOH) на коротком плече хромосомы 3 для трех типов рака

наблюдается высокая частота LOH для разных типов рака, область потерь в районе маркера D3S2409 общая для рака почки, легкого и молочной железы. В центромерной области 3р13-р14 наблюдаются пики для рака легкого, молочной железы и небольшой пик для рака почки. Пик в районе Зр21.31 для рака молочной железы (локусы D3S2456 и D3S1767) смещеп песколько цептромерпее по сравнению с пиками в этой области для рака почки и рака легкого (локусы D3S2409 и D3S2420). Такая картина может говорить о существовании рядом нескольких генов-супрессоров, специфичных для разных типов рака. В то же время совпадение пиков для рака почки и легкого позволяет предположить существование одного общего гена-супрессора.

При переходе к гистологически более однородным выборкам основные максимумы сохраняются, например в локусс D3S2409 для рака почки и легкого и в локусе D3S1298 для рака легкого. Огмечепо небольшое смещение, например для светлоклеточного рака ночки в районе АР20 и VIIL в центромерную область, от D3S2405 к D3S1038 и от NL1-024 к D3S3527 и D3S1298. Для рака легкого отмечено смещение максимума в локусе D3S3047, 3р24.3 в теломерную область — к локусу D3S1286, Зр25.2.

7.4. Мпкросатсллитная нестабильность в четырех типах эпителиального

рака.

Результаты анализа микросателлитной нестабильности приведены в табл. 5. Во всехлшах_ракз_мвкросателлитная нестабильность наблюдалась с меньшей частотой, чем потеря гетерозиготпости. Наибольшая частота MIN найдена в образцах рака шейки матки (б/Зб, 17%) и рака почки (9/57, 16%), с меньшей частотой MIN найдена в образцах рака молочной железы (2/31, 7%) и рака лякого (2/40, 5%). Фенотип RER (replication error), связанный с повреждением генов системы репарации н выявляемый по нестабильности микросателлитов в нескольких локусах, был обнаружен в образцах

Таблица 5. Мпкросатсллитная нестабильность на коротком плече хромосомы 3 в опухолях четырех типов

Рак Рак Рак молочной Рак шейки Суммарпо по

почки легкого железы матки всем видам

>1 локусов MIN* 9/57 2/40 2/31 6/36 19/164

16% 5% 7% 17% 12%

RER-фенотип* 4/57 1/40 0/31 2/36 7/164

7% 3% 0% 6% 4%

Димерпые 3/369 4/294 0/229 3/266 10/1158

маркеры** 0.81% 1.36% 0.0% 1.13% 0.86%

Три- и тетра- 14/318 0/236 2/195 5/217 21/966

мерные маркеры** 4.40% 0.00% 1.03% 1.54% 2.17%

* Приведена доля образцов с MIN

** Приведено соотношение суммарного числа событий MIN для данных образцов и данных маркеров к суммарному числу всех событий (MIN, LOH, сохранения гетерозиготяоети).

рака почки (4/57 образцов, 7%), рака шейки матки (2/36, 6%) и рака легкого (1/40, 3%). Между фенотипами с LOH и высоким уровнем MIN выявляется односторонняя положительная корреляция. Действительно, практически во всех образцах с MIN выявляется потеря гетерозиготности, причем чаще в нескольких локусах. Односторонняя ассоциация MIN с LOH на хромосоме Зр возможно, связаиа с повреждениями гена системы репарации hMLIIl, локализованного на хромосоме 3 в области Зр22.

Интересно отметить, что частота MIN, рассчитанпая раздельно для динуклеотидных и для три- и тетрамерных маркеров различалась в 2.5 раза (табл. 5). Повышение частоты MIN для три- и тстрамерных повторов в 2.4 раза по сравнению с СА-повторами было отмечено ранее для рака молочной железы (Dillon et al., 1997). Причина такого различия остается непонятной, однако можно предположить, что три-и тетрамерные повторы с большей частотой участвуют в процессах рекомбинации, приводящих к изменению числа тандемных повторов в локусе.

Таким образом, в данной работе впервые проведено делеционное картирование хромосомы Зр в разных видах эпителиального рака в сопоставимых условиях - с использованием идентичной панели микросателлитпых маркеров и одинаковых подходов к отбору материала и анализу результатов. Для четырех типов рака продемонстрировано различие по степени аллелышх изменений, микросателлитной нестабильности и соотношению типов делеций. Для всех типов рака показано существование внутренних и множественных делеций. При сравнении областей частых аллельных потерь выявлены общие и характерные только для определенного типа рака критичные районы Зр. Обнаружен новый район частых аллельных потерь в области маркера D3S2409, общий по крайней мере для трех типов рака.

ВЫВОДЫ

1. Впервые с применением идентичной и плотной панели полиморфных микросателлитпых маркеров (20 локусов) проведен сравнительный анализ короткого плеча хромосомы 3 (Зр) в эпителиальных опухолях четырех разных локализаций. Сопоставлены степень аллельных изменений на Зр в разных типах рака и значимость ряда критичных районов Зр для поиска генов-супрессоров опухолевого роста.

2. Показано, что на хромосоме Зр в опухолях почки и легкого наблюдаются значительно более протяженные делеции, чем в опухолях молочной железы и шейки матки, что, по-видимому, отражает участие дополнительных генетических факторов в патогенезе рака почки и легкого.

3. Для рака почки и легкого выявлена корреляция протяженности делеций с гистопатологическим типом опухоли. Протяженные концевые делеции преобладают

в более злокачественных светлоклеточном (28/43, 65%) и плоскоклеточном (13/2), 62%) гистонатологических типах рака почки и легкого.

4. Идентифицированы еовыз районы для поиска общих и специфичных генов-супрессоров опухолевого роста. Новый район генов-кандидатов рака почки, легкого и молочной железы локализован между маркерами D3S2420 и D3S1766, 3р21.31 на отрезке ДНК протяженностью 1.1 млн. пл.

5. Во всех четырех типах рака наблюдаются частые аллельпые делении в районе гомозиготных делеций АР20, 3р21.33-р22 (NL1-024, D3S1298, D3S3527). Район вокруг гена VIIL, Зр26 (D3S1317, D3S1038, D3S2405) оказался характерным для рака почки, а более центромерная область 3р25.2-3р24.3 (D3S1286, D3S3047) -специфичной для рака легкого.

6. Нестабильность микросателлитов наблюдается в эпителиальных опухолях с меньшей частотой (5%-17%), чем потеря гетерозиготности (74%-91%), и как правило, сопровождается аллельными потерями в соседних локусах. Отмечено, что явление нестабильности для ¡ря- и теграмерпых полиморфных локуеов обнаруживается в 2.5 раза чаще (21/966, 2.17%), чем для димерных маркеров (10/1158, 0.86%).

СПИСОК ГАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Базов И.В., Аксенова М.Г., Казубская Т.П., Смирнов A.B., Забаровский Е.Р. и Брага Э.А. (1997) «Анализ аллельиых потерь в области короткого плеча хромосомы 3 в карциномах почки, тела матки и яичников с помощью три- и тетрамерных маркеров». Мол. Виол. (Москва) 31, 805-809.

2. E.Braga, E.Pugacheva, I.Bazov, V.Ermilova, T.Kazubskaya, R.Garkavtseva, N.Mazurenko, F.Kisseljov, J.Lui, V.Debabov, E.Zabarovsky, L.KKisselev. (1999) «Comparative allelotyping of the short arm of the human chromosome 3 in epithelial tumors of four different types». FEBS Letters 454,215-219.

3. Базов И.В., Пугачева E.M., Аксенова М.Г., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. «Сравнительный анализ хромосомы Зр в четырех типах эпителиального рака». Тезисы докладов па Восьмой конференции «Геном человека - 98», Москва, Январь, 1998, стр. 10.

4. Пугачева Е.М., Базов И.В., Котова Е.Ю., Аксепова М.Г., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Гизатуллин Р.З., Кашуба В.И., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. «Полиморфные и STS-маркеры хромосомы Зр для картирования локусов-кандидатов генов-супрессоров опухолевого роста». Тезисы докладов на Восьмой конференции «Геном человека - 98», Москва, Январь, 1998, стр. 9.

5. Брага Э.А., Пугачева Е.М., Базов И.В., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Мазурецко H.H., Киселев Ф.Л., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. «Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях почки, легкого, шейки матки и молочной железы с использованием общей панели маркеров.» Тезисы докладов на Девятой конференции «Геном человека - 99», Москва, Февраль, 1999, стр. 14-15.

6. Bazov I.V., Pugacheva E.M., Ermilova V.D., Kazubskaya T.P., Garkavtseva R.F., Alimov A. A., Zabarovsky E.R., Braga E.A. «Human chromosome 3p deletion mapping in different types of cancer». Abstracts of the 30!l> Annual Meeting of the ESHG, May 1998. Eur. J. Hum. Gen., v. 6, sup. 1, 1998, p. 92.

7. Braga E.A., Bazov I.V., Pugacheva E.M., Kotova E.Yu., Ermilova V.D., Kazubskaya T.P., Garkavtseva R.F., Kashuba V.I., Gizatullin R.Z., Alimov A.A. and Zabarovsky E.R. «Polymorphic and STS markers of the human chromosome 3p and their application for mapping of tumor supressor gene candidate loci». Abstracts of HUGO'S Human Genome Meeting «HGM'98», Torino, Italy, March, 1998, p. 30.

8. Pugacheva E., Bazov I., Kotova E.Yu., Kazubskaya T.P., Garkavtseva R.F., Kashuba V.I., Gizatullin R.Z., Alimov A.A., Zabarovsky E.R, Braga E.A. «Polymorphic and STS markers of the human chromosome 3p for mapping of tumor supressor gene candidate loci». Abstracts of the 30"" Annual Meeting of the ESHG, May 1998. Eur. J. Hum. Gen., v. 6, sup. 1, 1998, p. 92.

9. Kazubskaya T.P., Bazov I.V., Braga E.A., Pugacheva E.M., Ermilova V.D., Zabarovsky E.R., Garkavtseva R.F. «Human chromosomc 3p deletion mapping in carcinomas of kidney, lung and reproductive organs». Abstracts of the 17"1 International Cancer Congress, Rio de Janeiro, August, 199S, p. 600.

10. E.Braga, E.Pugacheva, I.Bazov, V.Ermilova, T.Kazubskaya, R.Garkavceva, N.Mazurenko, F.Kisseljov, J.Li, V.Debabov, E.Zabarovsky, L.Kisselev. «Deletion mapping of human chromosome 3p in four types of malignant epithelial neoplasia». Abstracts of HUGO's Human Genome Meeting «HGM'99», Brisbane, Australia, March, 1999, p.24-25.

11. E.Braga, I.Bazov, V.Senchenko, J.Lui, V.Loginov, E.Pugacheva, V.Ermilova, T.Kazubskaya, N.Mazurenko. R-Garkavtseva, L.Kisselev, E.Zabarovsky. «Common Deletion Regions on Chromosome 3p in Different Types of Cancer». Abstracts of HUGO's Human Genome Meeting «HGM2000», Vancouver, Canada, April, 2000, p. 75.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Базов, Игорь Валентинович

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Гены-супрессоры опухолевого роста

1.2. Методы поиска генов-супрессоров опухолевого роста

1.2.1. Цитогенетический анализ

1.2.2. Анализ аллельных потерь

1.2.3. Нестабильность микросателлитов в опухолях

1.2.4. Тонкая локализация и идентификация генов в клонированных фрагментах ДНК

1.2.5. Методы прямого клонирования делетированных и амплифицированных фрагментов ДНК опухоли

1.3. Делеционное картирование короткого плеча хромосомы человека в опухолях почки, легкого, молочной железы, шейки матки и других органов.

1.3.1. Делеции на коротком плече хромосомы 3 в опухолях почки

1.3.2. Делеции на коротком плече хромосомы 3 в опухолях легкого

1.3.3. Делеции на коротком плече хромосомы 3 в опухолях молочной железы

1.3.4. Делеции на коротком плече хромосомы 3 в опухолях женских репродуктивных органов

1.3.5. Делеции на коротком плече хромосомы 3 в опухолях других органов

1.4. Гены-кандидаты на коротком плече хромосомы 3 человека

1.4.1. Область 3р13-р

1.4.2. Область Зр

2. Материалы и методы

2.1.Реактивы и ферменты

2.2. Буферные растворы

2.3. Сбор материала

2.4. Выделение геномной ДНК из ткани человека

2.5. Панель микросателлитных маркеров

2.6. Полимеразная цепная реакция

2.7. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации

2.8. Анализ потери гетеозиготности (LOH)

3. Результаты и обсуждение;

3.1. Аллельные изменения на коротком плече хромосомы в эпителиальных опухолях четырех локализаций

3.1.1. Типы аллельных изменений на хромосоме Зр в ДНК из опухолей; учет потерь Н- и L-аллелей

3.1.2. Аллельные изменения на хромосоме Зр в образцах рака почки

3.1.3. Аллельные изменения на хромосоме Зр в образцах рака легкого

3.1.4. Аллельные изменения на хромосоме Зр в образцах рака молочной железы

3.1.5. Аллельные изменения на хромосоме Зр в образцах рака шейки матки

3.2. Сравнение аллельных изменений на коротком плече хромосомы 3 в четырех видах эпителиального рака

3.2.1. Сравнение частоты и протяженности делеций в четырех типах эпителиального рака

3.2.2. Корреляция протяженности делеций с гистопатологическим типом опухоли почки и легкого

3.2.3. Районы частых аллельных делеций в четырех типах эпителиального рака

3.2.4. Микросателлитная нестабильность в четырех типах эпителиального рака

3.2.5. Дупликация и амплификация аллеля в четырех типах эпителиального рака

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека в четырех типах рака с помощью панели высокополиморфных микросателлитных маркеров"

Онкологические заболевания занимают второе место по причине смертности в мире после сердечно-сосудистых заболеваний и представляют собой одну из наиболее актуальных проблем здравоохранения (Трапезников и Аксель, 1999). Достигнутый в последнее время прогресс в изучении молекулярно-генетических основ канцерогенеза является важным шагом к пониманию природы рака.

Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют гены, подавляющие опухолевый рост. Поиск таких генов, генов-супрессоров опухолевого роста (tumor supressor genes), является важным этапом в изучении механизмов возникновения и развития раковых заболеваний. С целью обнаружения генов-супрессоров опухолевого роста проводят картирование областей ДНК, подвергающихся делециям в раковых клетках и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих районов.

Первым этапом в поиске генов-супрессоров является анализ делеций в ДНК из опухолевых клеток с помощью методов цитогенетики и с использованием полиморфных ДНК-маркеров. В злокачественных новообразованиях человека делеции и перестройки обнаруживают на многих хромосомах: 3, 9, 9, 13, 17 и других (Mertens et al., 1997, Todd et al., 1997, Fujii et al., 1998, Ingvarsson et al., 1998). В некоторых видах опухолей, например в светлоклеточной карциноме почки и во всех видах рака легкого в наибольшей степени повреждениям подвергается короткое плечо хромосомы 3 (Kok et al., 1997; Leong et al., 1998; Ullmann et al., 1998). Делеции в области короткого плеча хромосомы 3 также обнаружены в опухолях многих других органов: молочной железы, шейки матки, желудка, прямой кишки, яичников и мочевого пузыря (Chen et al., 1994; Ishwad et al., 1996; Su et al., 1998). Высокая частота потери гетерозиготности в некоторых районах хромосомы Зр, обнаружение в этих же районах гомозиготных делеций и опухоль-подавляющей активности позволяют предположить, что короткое плечо хромосомы 3 содержит гены, инактивация или изменение функции которых является критическим событием в патогенезе некоторых форм рака. В связи с этим, на коротком плече хромосомы 3 проводится интенсивный поиск генов, вовлеченных в развитие рака почки, легкого, молочной железы, шейки матки и других органов.

Представленная работа посвящена поиску генов-супрессоров опухолевого роста на коротком плече хромосомы 3. Для определения областей, подверженных аллельным потерям, было проведено картирование аллельных делеций на хромосоме Зр с использованием ДНК опухолевых клеток и панели микросателлитных маркеров.

Результаты делеционного картирования, полученные при исследовании даже одного и того же вида рака, например рака почки, но в разных лабораториях, весьма противоречивы как в отношении частот аллельных потерь, так и в отношении положения областей, наиболее подверженных делециям (Van den Berg et al., 1997; Shridhar et al., 1997; Clifford et al., 1998). Такое расхождение результатов, по-видимому, связано с различиями в методах отбора материала и использованием разных наборов маркеров. По этим причинам сопоставление данных, полученных в разных лабораториях для разных форм рака, еще более затруднено. Тем не менее, в результате таких сравнений обнаружены перекрывания делетируемых областей хромосомы Зр в опухолях почки и легкого (Kok et al., 1997), а также перекрывание гомозиготных делеций в опухолях легкого и молочной железы (Todd et al., 1997; Sekido et al., 1998), что позволяет предположить существование на Зр-плече общих генов-супрессоров опухолевого роста, участвующих в патогенезе разных форм рака. Для их обнаружения требуется детальное делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 в разных формах рака в сопоставимых условиях: с применением одинаковой техники отбора материала и с использованием одной и той же панели маркеров. Такое делеционное картирование и было проведено в данной работе.

В работе была использована обширная коллекция, состоящая из 164 образцов опухолевых тканей, представляющих четыре вида рака (рак почки, легкого, шейки матки и молочной железы) и плотная панель микросателлитных маркеров (ди-, три- и тетрамерных, 20 локусов). Гистологический анализ микросрезов при отборе образцов позволил обеспечить высокое (не менее 70%) содержание опухолевых клеток в исследуемом материале. Полученные результаты позволили впервые корректно сравнить частоты аллельных потерь, нестабильности микросателлитов и делеций разных типов на хромосоме Зр в эпителиальных опухолях разных локализаций. Следует отметить, что подобное

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Базов, Игорь Валентинович

выводы

1. Впервые с применением идентичной и плотной панели полиморфных микросателлитных маркеров (20 локусов) проведен сравнительный анализ короткого плеча хромосомы 3 (Зр) в эпителиальных опухолях четырех разных локализаций. Сопоставлены степень аллельных изменений на Зр в разных типах рака и значимость ряда критичных районов Зр для поиска генов-супрессоров опухолевого роста.

2. Показано, что на хромосоме Зр в опухолях почки и легкого наблюдаются значительно более протяженные делеции, чем в опухолях молочной железы и шейки матки, что, по-видимому, отражает участие дополнительных генетических факторов в патогенезе рака почки и легкого.

3. Для рака почки и легкого выявлена корреляция протяженности делеций с гистопатологическим типом опухоли. Протяженные концевые делеции преобладают в более злокачественных светлоклеточном (28/43, 65%) и плоскоклеточном (13/21, 62%) гистопатологических типах рака почки и легкого.

4. Идентифицированы новые районы для поиска общих и специфичных генов-супрессоров опухолевого роста. Новый район генов-кандидатов рака почки, легкого и молочной железы локализован между маркерами D3S2420 и D3S1766, 3р21.31 на отрезке ДНК протяженностью 1.1 млн. п.н.

5. Во всех четырех типах рака наблюдаются частые аллельные делеции в районе гомозиготных делеций АР20, 3р22-р21.33 (NL1-024, D3S1298, D3S3527). Район вокруг гена VHL, Зр26 (D3S1317, D3S1038, D3S2405) оказался характерным для рака почки, а более центромерная область Зр25.2-3р24.3 (D3S1286, D3S3047) - специфичной для рака легкого.

6. Нестабильность микросателлитов наблюдается в эпителиальных опухолях с меньшей частотой (5%-17%), чем потеря гетерозиготности (74%-91%), и как правило, сопровождается аллельными потерями в соседних локусах. Отмечено, что явление нестабильности для три- и тетрамерцых полиморфных локусов обнаруживается в 2.5 раза чаще (21/966, 2.17%), чем для димерных маркеров (10/1158, 0.86%).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Базов, Игорь Валентинович, Москва

1. Баранова А.В., Янковский Н.К. (1998). Мол. биол., 32, 206-218.

2. Брага Е.А., Котова Е.Ю., Пугачева Е.М., Гизатуллин Р.З., Кашуба В.И., Лерман М.И., Аксенова М.Г., Ефремов И.А., Забаровский Е.Р., Киселев JI.J1. (1997). Мол. биоп. 31, 988-999.

3. Киселев Ф.Л. (1998). Мол. биол., 32, 197-205.

4. Трапезников Н.Н., Аксель Е.М. (1999). "Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1997 г.", стр. 281, Москва.

5. Aburatani Н., Wang Y., Shibata Н., Noda Т., Schwartz D. and Housman D.E. (1994). Am. J. Hum. Genet., 55, A51.

6. Ali I.U., Lidereau R. and Callahan R. (1989). Natl. Cancer Inst., 81, 1815-1820.

7. Alimov A., Kost-Alimova M., Liu J., Li C., Bergerheim U., Imreh S., Klein G. and Zabarovsky E.R. (2000). Oncogene, 19, 1392-1399.

8. Allegra E., Garozzo A., Grillo A. and Catalano G.B. (1992). Arch. Otolaryngol. Head and NeckSurg., 118, 1320-1322.

9. Anglard P., Tory K., Brauch H., Weiss G.H., Latif F., Merino M.J., Lerman M.I., Zbar B. and Linehan W.M. (1991). Cancer Res., 51, 1071-1077.

10. Aoki Т., Mori Т., Nisihira Т., Matsubara T. and Nakamura Y. (1994). Genes Chrom. Cancer, 10, 177-182.

11. Ballester R., Marchuk M., Boguski A. et al. (1990). Cell, 63, 851-859.

12. Barnes L.D., Garrison P.N., Siprashvili Z. (1996). Biochemistry, 35, 11529-11535.

13. Bello M.J. and Rey J A. (1990). Int. J. Cancer, 45, 50-54.

14. Bieche I., de Murcia G., Lidereau R. (1996). Clin. Cancer Res., 2(7), 1163-1167.

15. Boldog F. L., Waggoner В., Glover T.W., Chumakov I., Le-Pasier D., Cohen D., Gemmill R.M., Drabkin H.A. (1994). Genes Chrom. Cancer, 11, 216-221.

16. Boveri, T. (1929). "The origin of malignant tumors", pp. 26-27. The Williams and Wilkins Co., Baltimore.

17. Brauch H., Johnson В., Hovis J., Yano Т., Gazdar A., Pettengill O.S., Graziano S., Sorenson G.D., Poiesz B.J., Minna J., Linehan M. and Zbar B. (1987). N. Eng. J. Med., 317, 11091113.

18. Brauch H., Tory K., Linehan W.M., Weaver D.J., Lovell M.A. and Zbar B. (1990a). J. Urol., 143, 622-624.

19. Brauch H., Tory K., Kotler F., Gazdar A.F., Pettengill O.S., Johnson D., Graziano S., Winton T., Buys C.H.C.M., Sorenson G.D., Poiecz B.J., Minna J.D. and Zbar B. (1990b). Genes. Chrom. Cancer, 1, 240-246.

20. Brauch H., Pomer S., Hieronimus T., Schadt T., Lohrke H. and Komitiwski D. (1994). World J. Urol., 12, 162-168.

21. Bronner C.E., Baker S.M., Morrison P.T. et al. (1994). Nature, 368, 258-261.

22. Buchberg A.M., Cleveland L.S., Jenkins N.A., Copeland N.G. (1990). Nature, 347, 291-294.

23. Buchhagen D.L., Qin L. and Etkind P. (1994). Cancer, 57, 473-479.

24. Budowle B., Chakraborty R., Guisti A.M., Eisenberg A.J., Allen R.C. (1991). Am. J. Genet., 48, 137-144.

25. Buttitta F., Marchetti A., Radi O., Bertacca G., Pellegrini S., Gadducci A., Genazzani A.R. (1998). Br. J. Cancer, 77, 1048-1051.

26. Carritt B., Kok K., van den Berg A., Osinga J., Pilz A., Hofstra R., Davis M.B., van der Venn A.Y., Rabbitts P.H., Gulati K. and Byus C.H.C.M. (1992). Cancer Res., 52, 1536-1541.

27. Cairns J.P., Chiang P.-W., Ramamoorthy S., Kurnit D.M. and Sidransky D. (1998). Clin. Cancer Res., 4, 441-444.

28. Cavenee W.K., Dryja T.P., Philips R.A., Benedict W.F., Godbout R, Gallie B.L., Murphree A.L., Strong L.C. and White R. (1983). Nature, 305, 779-784.

29. Cavenee W.K., Hansen M.F., Nordenskjold M., Kock E., Maumenee I., Squire J.A., Philips R.A. and Gallie B.L. (1985). Science, 228, 501-503.

30. Chen L.-C., Kurisu W., Ljung B.-M., Goldman E.S., Moor II D., Smith H.S. (1992). Natl. Cancer Inst., 84, 506-510.

31. Chen L.-C., Matsumura K., Deng G., Kurisu W., Ljung B.-M., Lerman M.I., Waldman F.M., Smith H.S. (1994). Cancer Res., 54, 3021-3024.

32. Chen F., Kishida T., Duh F.-M., Renbaum P, Orcutt M.L, Schmidt L. and Zbar B. (1995). Cancer Res., 55, 4804-4807.

33. Chiang P.-W., Beer D.G., Wei W.-L., Orringer M.B. and Kurnit D.M. (1999). Clin. Cancer Res., 5, 1381-1386.

34. Chino K., Esumi M., Ishida H., Okada K. (1999). J. Urol., 162, 614-618.

35. Chu T.Y., Shen C.Y., Lee.H.S., Liu H.S. (1999). Genes Chrom. Cancer, 24(2), 127-134.

36. Chung G.T.Y., Huang D.P., Lo K.W., Chan M.K.M. and Wong F.W.S. (1992). Anticancer Res., 12, 1485-1490.

37. Chudek J., Wilhelm M., Bugert P., Herbers J., Kovacs G. (1997). Int. J. Cancer, 73(2), 225229.

38. Chung G.T.Y., Sundaresan V., Hasleton P., Rudd R., Taylor R. and Rabbitts P.H. (1995). Oncogene, 11, 2591-2598.

39. Cleaver J.E., Kraemer K.H. (1988). Xeroderma Pigmentozum. In: The Metabolc Bases of Inherited Disease. New York: McGraw-Hill, p. 2949-2971.

40. Clifford S.C, Prowse A.H., Affara N.A., Buys C.H.C.M., Mäher E.R. (1998). Genes Chrom. Cancer, 22, 200-209.

41. Coleman A., Fountain J.W., Nobori T., et al. (1994). Cancer Res., 54, 344-348.

42. Collins F., Drumm M., Cole J., Lockwood W., Vande Woude G., Lanuzzi M. (1987).1. Science, 235, 1046-1049.

43. Daly M.C., Xiang R.H., Buchhagen D., Hensel C.H., Garcia D.K., Killary A.M., Minna J.D., Naylor S.L. (1993). Oncogene, 8, 1721-1729.

44. Datson N.A., Duyk G.M., Van Ommen J.B., Den Dünnen J.T. (1994). Nucl. Acid Res., 22, 4148-4152.

45. Dietrich C.U., Pandis N., Teixeira M.R., Bardi G., Gerdes A.M., Andersen J.A. and Heim S. (1995). Int. J. Cancer, 60, 49-53.

46. De Fusco P.A., Frytak S., Dahl R.J., Weiland L.H., Unni K.K. and Dewald G.W. (1989). Mayo Clin. Prot. 64, 168-176.

47. DeJong B., Oosterhuis J.W., Idenburg V.J., Castedo S.M., Dam A. and Mensink H.J. (1988).

48. Cancer Genet. Cytogenet., 30, 53-61.

49. Devilee P., van den Broek M., Kuipers-Dijkshoorn N., Kolluri R., Meera Khan P., Pearson P.L. and Cornelisse C.J. (1989). Genomics, 5, 554-560.

50. Dillon E.K., de Boer W.B., Paradimitriou J.M. and Turbett G.R. (1997). Br. J. Cancer, 76, 156-162.

51. Dodson M.K., Hartman L.C., Cliby W.A., DeLacey K.A., Keeney G.L., Ritland S.R., Su J.Q., Podratz K.C. and Jenkins R.B. (1993). Cancer Res., 53, 4450-4460.

52. Drabkin H.A., Mendez M.J., Rabbitts P.H., Varkony T., Bergh J., Schlessinger J., Erickson P. and Gemmill R.M. (1992). Genes. Chrom. Cancer, 5, 67-74.

53. Druck T., Kastury K., Hadaczek P., Podolski J., Toloczko A., Sikorski A., Ohta M., LaForgia S., Lasota J., McCue P., Lublinski J and Huebner K. (1995). Cancer Res., 55, 5348-5353.

54. Drummond I.A., Madden S.L., Rowher-Nutter P. et al. (1992). Science, 257, 674-678.

55. Duan D.R., Humphrey J.S., Chen D.Y.T. et al. (1995). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 64596463.

56. Dulic V., Kaufmann W.K., Wilson S.J. et al. (1994). Cell, 76, 1013-1023. Dyson N. and Harlow E., (1992), Cancer Surv., 12, 161-195.

57. Eiriksdottir G., Bergthorsson J.T., Sigurdsson H., Gudmundsson J., Skirnisdottir S., Egilsson V., Barkardottir R.B. and Ingvarsson S.(1995). Int. J. Oncol. 6, 369-375.

58. El-Deiry W.S., Harper J.W., O'Connor P.M. et al. (1994). Cancer Res., 54, 1169-1174.

59. Erlandsson R., Bergerheim U.S.R., Boldog F., Marcsek Z., Kunimi K., Lin B.Y.-T., Ingvarsson S., Castresana J.S., Lee W.-H., Klein G. and Sumegi J. (1990). Oncogene, 5, 1207-1211.

60. Falor W.H., Ward-Skinner R. And Wegryn S. (1985). Cancer Genet. Cytogenet., 16, 175177.

61. Fields S., Adams M.D., White O., Venter J.C. (1994). Nature Genet., 7, 345-346.

62. Fishel R., Ewel S., Lee M.K., Lescoc M.K., Griffith J. (1994). Science, 266, 1403-1408.

63. Fong K.M., Zimmerman P.V., Smith P.J. (1995). Cancer Res., 55,28-30.

64. Ford D., Easton D.F., Bishop D.T. et al. (1994). The Breast Cancer Linkage Consortium. Lancet, 343, 692-695.

65. Foster K., Crossey P.A., Cairns P. et al. (1994). Br. J. Cancer, 69, 230-234.

66. Foster K., Osbourne R.G., Huddart R.A., Affara M.A., Ferguson-Smith M.A. and Mäher E.R. (1995). Eur. J. Cancer, 31-A, 2392-2395.

67. Fox J.L., Hsu P.H., Legator M.S. et al. (1995). Clin. Chem., 41, 1554-1549.

68. Friend S.H., Bernards R., Rogelj S., Weinberg R.A., Rapaport J.M., Albert D.M. and Dryja T.P. (1986). Nature (London), 323, 643-646.

69. Fujii S., Takeshima Y., Arihiro K., Kaneko M., Inai K. (1998). Hiroshima J. Med. Sei., 47(3), 89-97.

70. Fynan T.M. and Reiss M. (1993). Crit. Rev. Oncog. 4,493-540.

71. Gazdar A.F., Bade S., Hung J., Kishimoto Y., Sekido Y., Sugio K., Virmani A., Fleming J., Carbone D.P. and Minna J.D. (1994). Cold Spring Harb. Symp. Quant. Boil., 59, 565-572.

72. Geil L., Latif F., Chen L.-C, Waldman F.M., Smith H.S. and Lerman M.I. (1994). Am. J. Hum. Genet., 55, A56.

73. Gibas Z., Li F.P., Antman K.H., Bernal S., Stahel R. and Sandberg A.A. (1986). Cancer Genet. Cytogenet.,20, 191-201.

74. Goessl C., Heicappell R., Munker R., Anker P., Stroun M., Krause H., Muller M., Miller K. (1998). Cancer Res., 58, 4728-4732.

75. Gonzalez I.L., Sylvester J.E. (1995). Genomics, 27, 320-328.

76. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. (1994). Cancer Res., 51, 48554862.

77. Grimberg J., Nawoschik S., Belluscio L., McKee R., Turck A., and Eisenberg A. (1989).

78. Nucleic Acids Res., 17, 8390.

79. Guo Z., Wilander E., Sallstrom J., Ponten J. (1998). Anticancer Res., 18, 707-712.

80. Haber D.A., Sohn R.L., Buckler A.J. et al. (1991). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 96189622.

81. Hadaczek P., Podolski J., Toloczko A., Kurzawski G., Sikorski A., Rabbitts P., Huebner K., Lublinski J. (1996). Virchows Arch., 429, 37-42.

82. Hahn S.A., Schutte M., Hoque A.T., et al. (1996). Science, 271, 350-353.

83. Hartwell L.H. and Kastan M.B. (1994). Science, 266, 1821-1828.

84. Hebert J., Cayuela J-M., Berkeley J., Sigaux F. (1994). Blood, 84,4038-4044.

85. Hecht F., Hecht B.K. (1990). Cancer Genet. Cytogenet., 46, 9-19.

86. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. (1996). Genome Res., 6, 986-994.

87. Hibi K., Takahashi T., Yamakawa K., Ueda R., Sekido Y., Ariyoshi Y., Suyama M., Takagi H., Nakamura Y. and Takahashi T. (1992). Oncogene, 1,445-449.

88. Hoovers J.M.N., Mannens M., John R., Bliek J., van Heyningen V., Porteous D.J., Leschot N.J., Westerveid A. and Little P.F.R. (1992). Genomics, 12, 254-263.

89. Huddard R., Wooster R., Horwich A. et al. (1995). Brit. J. Cancer, 72, 642-645.

90. Hulsken J., Birchmeier W. and Behrens J. (1994). J. CellBiol. 127, 2061-2069.

91. Hulsken J., Behrens J., Birchmeier W. (1994). Curr. Opin. CellBiol., 6, 711-716.

92. Johnson B.E., Sakaguchi A.Y., Gazdar A.F., Minna J.D., Burhc D., Angus M. and Naylor S.L. (1989). J.Clin. Invest., 82, 502-507.

93. Jones M.H. and Nakamura Y. (1992). Oncogene, 7, 1631-1634.

94. Jones M.H., Koi S., Fujimoto I., Hasumi K., Kato K. and Nakamura Y. (1994). Genes Chrom. Cancer, 9, 119-123.

95. Jones W.A., Scaloni A., Bossa F., Popowicz A.M., Schneewind O. And Manning J.M (1991). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88, 2194-2198.

96. Kallioniemi O.P., Kallioniemi A., Piper J. et al. (1994). Genes Chrom. Cancer, 10, 231-243.

97. Kamb A., Gruis N.A., Weaver-Feldhaus J„ et al. (1994). Science, 264, 436-440.

98. Kaplan R., Morse B., Huebner K., Croce C., Howk R., Ravera M., Ricca G., Jaye M. and Schiessinger J. (1990). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87, 7000-7004.

99. Karisen F., Rabbitts P.H., Sundresan V. and Hagmar B. (1994). Int. J. Cancer, 58, 787-792. Karran P. (1995). Science, 268, 1857-1858.

100. Kashuba V.l., Szeles A., Allikmets R.L., Nilsson A.S., Bergerheim S.R., Modi W., Grafodatsky A., Dean M., Stanbridge E.J., Gosta Winberg, Klein G. and Zabarovsky E.R.1995). Cancer Genet. Cytogenet. 81, 144-150.

101. Kastury K., Ohta M., Lasota J., Moir D., Dorman T., LaForgia S., Druck T. and Huebner K.1996). Genomics, 32, 225-235.

102. Kersemaekers A.M., Hermans J., Fleuren G.J., van de Vijver M.J. (1998). Br. J. Cancer, 77, 192-200.

103. Kholodnyuk I., Kost-Alimova M, Kashuba V., Gizatullin R., Szeles A., Stanbridge E.J., Zabarovsky E.R., Klein G., Imreh S. (1997). Genes Chrom. Cancer, 18, 200-211.

104. Killary A.M., Wolf M.E., Giambernardi T.A. and Naylor S.L. (1992). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 10877-10881.

105. Kinzler K.V. and Vogelstein B, (1997). Nature, 386, 761-763.

106. Kiss H., Kedra D., Yang Y., Kost-Alimova M., Kiss C., O'Brien K.P., Fransson I., Klein G., Imreh S., Dumanski J.P. (1999). Hum. Genet., 105, 552-559.

107. Kitzler J.W., Farr S.B. and Ames B.N. (1992). Intracellular function of ApnN: procaryotes. In "Ap4A and other dinucleoside polyphosphatases" (A.G. McLennan, Ed), CRC Press, Boca Paton, FL.

108. Knudson A.G. (1971). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 68, 820-823.

109. Kohno T., Takayama H., Hamaguchi M., Takano H., Yamaguchi N., Tsuda H., Hirihashi S., Vissing H., Shimizu M., Oshimura M. and Yokota Y. (1993). Oncogene, 8, 1825-1832.

110. Kok K., Oshiga J., Carritt B., Davis M.B., van der Hout A.H., van der Veen A.Y., Landsvater R.M. de Leij L.F.M.H., Berendsen H.H., Postmus P.E., Poppema S. and Buys C.H.C.M. (1987). Nature (London), 330, 578-581.

111. Kok K., van den Berg A. and Buys C.H.C.M. (1989). Cancer Genet. Cytogenet., 38, 201.

112. Kok K, van der Berg A., Veldhuis P.M.J.F., van der Veen A.Y., Franke M., Schoenmakers E.F.P.M. Hulsbeek M.M.F., van der Hout A.H., de Leij L., van der Ven W. and Buys C.H.C.M. (1994). Cancer Res., 54, 4183-4187.

113. Kok K., Naylor S.L., Buys C.H.C.M. (1997). Adv. Cancer Res., 71, 27-92.

114. Kovacs G., Szücs S., De Riese W. and Baumgärte. H. (1987). Int. J. Cancer, 40, 171-178.

115. Kovacs G., Erlandsson R., Boldog F., Invarsson S., Müller-Brechlin R., Klein G. and Sümegi J. (1988). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 1571-1575.

116. Kovatich A., Friedland D.M., Druck T., Hadaczek P., Huebner K., Comis R.L., Hauck W., McCue P.A. (1998). Cancer, 83, 1109-1117.

117. Kraus C., Liehr T., Behrens J., Hulsken J., Birchmeier W., Grzeschik K.H. and Ballhausen W.G. (1994). Genomics, 23, 272-274.

118. Ku W.H., Liu I.L., Yen S., Chang Chien C.C., Yue C.T, Ma Y.Y., Chang S.F., Ng H.T., Wu C.W., Shen C.Y. (1997). Int. J. Cancer, 72, 270-276.

119. F.P., Marchetto D.J. and Brown R.S. (1982). Cancer Genet. Cytogenet., 7, 271-275.

120. J., Yen C., Liaw D. Et al. (1997). Science, 275, 1943-1946.1.sitsyn N.A., Lisitsina N.M., Calbagni G., Barker P., Sanchez C.A., Gnarra J., Linehan W.M, Reid B.J. and Wigler M.H. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 151-155.

121. Maestro R., Gasparotto D., Vukosavljevic T., Barzan L., Boiocchi M. (1993). Cancer Res., 53, 5775-5779.

122. Madden S.L., Cook D.M., Morris J.F. et al. (1991). Science, 253, 1550-1553.

123. Maloney K.E., Norman R.W., Lee C.L. Millard O.H. and Welch J.P. (1991). J. Urol, 146, 692-696.

124. Mao L., Lee D.J., Tockman M.S., Erozan Y.S., Askin F. and Sidransky D. (1994). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 9871-9875.

125. Mathew S., Murty V.V.V.S., Chiefetz S., George S., Massague J. and Boiocchi M. (1994). Genomics, 20, 114-115.

126. Matturri L. And Lavezzi A.M. (1994). Eur. J. Histochem., 38, 53-58.

127. Matsumoto S., Kasumi F., Sakamoto G., Onda M., Nakamura Y. and Emi M. (1997). Genes Chrom. Cancer, 20, 268-274.

128. Meloni A.M., Bridge J. and Sandberg A.A. (1992). J. Urol., 148, 253-265.

129. Meitzer S., Richardson S, Chen N. et al. (1994). Cancer Res., 54, 3379-3382.

130. Mertens F., Johansson B., Hoeglund M. and Mitelman F. (1997). Cancer Res., 57, 27652780.

131. Meyn M.C. (1995). Cancer Research, 55, 5991-6001.

132. Miller Y.E., Drabkin H., Jones C. And Fisher J.H. (1990). Genomics, 8, 149-154. Minna J.D., Mangelsdorf D.J. (1997). J. Natl. Cancer Inst., 89, 602-604. Mitchell P.J., Tjian R. (1989). Science, 245, 371-378.

133. Mitelman F., Mertens F. and Johansson B.A. (1997). Nat. Genet., 15, 417-474.

134. Mitra A.B., Murty V.V.V.S, Li R.G., Pratap M., Luthra U.K. and Chaganti R.S.K. (1994). Cancer Res., 54, 4481-4487.

135. Mitsudomi T., Oyama T., Nishida K., Ogami A., Osaki T., Sugio K, Yasumoto K., Sugumachi K., Gazdar A.F. (1996). Clin. Cancer Res., 2, 1185-1189.

136. Miura I., Siegfried J.M., Resau J., Keller S.M., Zhou J.-Y. and Testa J.R. (1990). Genes Chrom. Cancer, 2, 328-338.

137. Mori N., Yokota J., Oshimura M., Cavenee W.K., Mizoguchi H., Noguchi M., Shimosato Y., SugimuraT. and TeradaM. (1989). Cancer Res., 49, 5130-5135.

138. Morita R., Ishikawa J., Tsutsumi M., Hikiji K., Tsukada Y., Kamidodno S., Maeda S. and Nakamura Y. (1991). Cancer Res., 51, 820-823.

139. Mulligan L.M., Gardner E., Smith B.A., Mathew C.P.G., and Ponder BA.J. (1993). Genes Chrom. Cancer, 6, 166-177.

140. Mullokandov M.R., Kholodilov N.G., Atkin N.B., Burk R.D., Johnson A.B. and Klinger H.P. (1996). Cancer Res., 56, 197-205.

141. Muller C.Y., Boyle D.O., Fong K.M., Wistuba I.I., Biesterveid E., Ahmadin M., Miller D.S., Gazdar A.F., Minna J.D. (1998). J. of National Cancer Institute, 90, 433-439.

142. Murata Y., Tamari M., Takahasi T., Horio Y., Hibi K., Yokoyama S., Inazawa J., Yamakawa A., Takahashi T. and Nakamura Y. (1994). Human Mol. Genet., 3, 1341-1344.

143. Nawroz H., van der Riet P., Hruban R.H., Koch W., Ruppert J.M. and Sidransky D. (1994). Cancer Res., 54, 1152-1155.

144. Naylor S.L., Marshal A., Hensel C., Martinez P.F., Holley B. and Sakaguchy A.Y. (1989). Genomics, 4, 355-361.

145. Negrini M., Monaco C., Vorechovsky I., Ohta M., Druck T., Baffa R., Huebner K., Croce C.M. (1996). Cancer Res., 56, 3173-3179.

146. Nelson W.G. and Kastan M.B. (1994). Mol. Cell Biol., 14, 1815-1823.

147. O'Connell P., Pekkel V., Fuqua S., Osborne C.K. and Allred D.C. (1994). Breast Cancer Res. Treat., 32, 5-12.

148. Ogasawara S., Maesawa C., Tamura G. and Satodate R. (1995). Cancer Res., 55, 891-894.

149. Ogawa O., Kakehi Y., Ogawa K., Koshiba M., Sugiyama T. and Yoshida O. (1991). Cancer Res., 51,949-953.

150. Ohmura H., Tahara H., Suzuki M., Ide T., Shimizu M., Yoshida M.A., Tahara E., Shay J.W., Barrett J.C. and Oshimura M. (1995). Jpn. J. Cancer Res. 86, 899-904.

151. Ohta M., Inoue H., Cotticelli M.G., Kastury K., Baffa R., Palazzo, Siprashvili, Z., Mori M., McCue P., Druck T., Croce C.M. and Huebner K. (1996). Cell, 84, 587-597.

152. Olopade O.I., Jenkins R.B., Ransom D.T. et al. (1992). Cancer Res., 52, 2523-2529.

153. Prayer Galetti T., D'Arrigo L., De Zorzi L., Patarnello T. (1997). Arch. Ital. Urol. Androl., 69, 241-246.

154. Orikasa K., Orikasa S., Horii A. (1998). Cancer Genet. Cytogenet., 104, 104-110.

155. Ozisik Y.Y., Meloni A.M., Altungoz O., Peier A., Karakousis C., Leong S.P.L. and Sandberg A.A. (1994). Cancer Genet. Cytogenet., 77, 69-73.

156. Pandis N., Bardi G., Mitelman F. and Heim S. (1997). Genes Chrom. Cancer, 18, 241-245.

157. Pandis N., Jin J., Limon J, Bardi G., Idvall I., Mandahl N., Mitelman F. and Heim S. (1993). Genes Chrom. Cancer, 6, 151-155.

158. Park K., Kim S.J., Bang Y.J., Park J.G., Kim N.K., Roberts A.B. and Sporn M.B. (1994). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 8772-8776.

159. Parra I., Windle B. (1993). Nature Genet., 5, 17-21.

160. Patel U., Grunfest-Broniatowski S., Gupta M. and Banergee S. (1994). Oncogene, 9, 36953700.

161. Pathak S, Strong L.C., Ferrel R.E. and Trindale A. (1982). Science, 217, 939-941.

162. Pathak S. and Goodacre A. (1986). Cancer Genet. Cytogenet., 19,29-36.

163. Pejovic T., Heim S., Mandahl N, Baldetorp B., Elmforst B., Floderus U.-M., Firgyik S., Helm G., Himmelman A., Willen H. and Mitelman F. (1992). Genes Chrom. Cancer, 4, 5868.

164. Peltomaki P., Lothe R.A., Aaltonen L.A., Pylkkanen M., Nystrom-Lahti M., Seruca R., David L., Holm R., Ryberg D., Haugen A., Brogger A., Borresen A., de la Chapelle. (1993). Cancer Res., 53, 5853-5855.

165. Petersen I., Bujard M., Petersen S., Wolf G., Goeze A., Schwendel A., Langreck H., Geliert K., Reichel M., Just K., du Manoir S, Cremer T., Ried T. and Dietel M. (1997). Cancer Res., 57, 2331-2335.

166. Powell S.M., Zilz N., Beazer-Barclay Y. et al. (1992). Nature, 359, 235-237.

167. Presti J.C.Jr., Reuter Y.E., Galan T., Fair W.R., and Cordon-Cardo C. (1991). Cancer Res., 51, 5405-5409.

168. Pylkkanen L., Karjalainen A., Anttila S., Vainio H., Husgafvel-Pursiainen K. (1997). Environ. Mol. Mutagen. 30, 217-223.

169. Rabbitts P., Douglas J., Daly M., Sundaresan V, Haselton P., Wells F., Albertson D., Waters J. and Bergh J. (1989). Genes Chrom. Cancer, 1, 95-105.

170. Rabbitts P., Bergh J., Douglas J., Collins F. and Waters J. (1990). Genes. Chrom. Cancer, 2, 231-238.

171. Rader J.S., Kamarasova T, Huettner P.C., Li L., Li Y., Gerhard D.S. (1996). Oncogene, 13, 2737-2741.

172. Rader J.S, Gerhardt D.S., O'Sullivan M.J, Li Y, Li L, Liapis H, Huettner P.C. (1998).

173. Genes Chrom. Cancer, 22, 57-65.

174. Riggins G.J, Thiagalingam S, Rozenblum E, et al. (1996). Nature Genetics, 13, 347-349!

175. Rimessi P, Gualandi F, Morelli C, Trabanelli C, Wu Q, Possati L, Montesi M, Barrett J.C. and Barbanti-Brodano G. (1994). Oncogene, 9, 3467-3474.

176. Roche J, Boldog F, Robinson M, Robinson L, Varella-Garcia M, Swanton M, Waggoner B, Fishel R, Franklin W, Gemmill R. and Drabkin H. (1996). Oncogene, 12, 1289-1297.

177. Rossell R, Pifarre A, Monzo M, Astudilo J, Lopez-Cabrerizo M.P, Calvo R, Moreno I, Sanchez-Cespedes M. (1997). Int. J. Cancer, 74, 330-334.

178. Sanchez Y„ El-Naggar A, Pathak S. and Killary A.M. (1994). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91,3383-3387.

179. Sandros J, Stenman J. and Mark J. (1990). Cancer Genet. Cytogenet., 44, 153-167.

180. Sato T, Akiyama F., Sakamota G., Kasumi F., Nakamura Y. (1991). Cancer Res., 51, 57945799.

181. Savitsky K., Bar-Shira A., Gilad S. et al. (1995). Science, 268, 1749-1753.

182. Schneider B.G., Pulitzer D.R., Brown R.D., Prihoda T.J., Bostwick D.G., Saldivar V., Rodriguez-Martinez H.A., Gutierrez-Diaz M.E. and O'Connell P. (1995). Genes Chrom. Cancer, 13, 263-271.

183. Scully R., Chen J., Plug A. et al. (1997). 88, 265-275. Segal E. and Le Pecq J.B. (1986). Exp. Cell Res., 167, 119-126.

184. Seizinger B.R., Rouleau G.A., Ozelius L.J. et al. (1998). Nature (London), 332, 268-269.

185. Sekido Y., Ahmadian M., Wistuba I.I., Latif F., Bader S., Wei M.H., Duh F.M., Gazdar A.F., Lerman M.I, Minna J.D. (1998). Oncogene, 16, 3151-3157.

186. Seruca R, Dos Santos N, Seixas M et al. (1995). Int. J. Cancer, 64, 32-36.

187. Sekine I, Yokose T, Ogura T, Suzuki K, Nagai K, Kodama T., Mukai K, Nishiwaki Y, Esumi H. (1997). Jpn. J. Cancer Res., 88, 559-563.

188. Sharan S.K, Morimatsu M, Albrecht U. (1997). Nature, 386, 804-810.

189. Shibagaki I, Shimada Y, Wagata T, Ikenaga M, Imamura M. and Ishizaki K. (1994). Cancer Res., 54, 2996-3000.

190. Shiseki M, Kohno T, Adachi J, Okazaki T, Mizoguchi H., Noguchi M., Hirohashi S. and Yokota J. (1996). Genes Chrom. Cancer, 17, 71-77.

191. Shridhar V, Wang L., Rosati R, Paradee W, Shridhar R, Mulline C., Sark W, Gridnon D, Miller O.J., Sun Q.C, Petros J. and Smith D.I. (1997). Oncogene, 14, 1269-1277.

192. Siebert R, Jacobi C, Matthiesen P, Zuhlke-Jenisch R, Potratz C, Zhang Y, Stöckle M, Klöppel G, Grote W., Schlegelberger B. (1998). J. Urol., 160, 534-539.

193. Sithanandam G, Dean M, Brennscheidt U., Beck T, Gazdar A, Minna J.D, Brauch H, Zbar B. and Rapp U.R. (1989). Oncogene, 4, 451-455.

194. Smith M.L, Chen I-T, Zhan Q. et al. (1994). Science, 266, 1376-1380.

195. Sozzi G, Miozzo M, Pastorino U, Pilotti S, Donghi R, Giarola M, De Gregorio L, Manenti G, Radice P, Minoletti F, Delia Porta G. and Pierotti M.A. (1995). Cancer Res., 55, 135-140.

196. Su T.H., Wang J.C., Tseng H.H., Chang C.P, Chang T.A., Wei H.J, Chang J.G. (1998). Int. J. Cancer, 13; 76(2), 216-222.

197. Sugimura J., Tamura G., Suzuki Y., Fujioka T. (1997). Pathol. Int., 47, 79-83.

198. Sundaresan V., Ganly P., Hasleton P., Rudd R., Sinha G., Bleehen N.M., Rabbitts P. (1992). Oncogene, 7, 1989-1997.

199. Szeles A., Yang Y., Sandlund A.M., Kholodnyuk I., Kiss H., Kost-Alimova M, Zabarovsky E.R., Stanbridge E., Klein G., Imreh S. (1997). Genes Chrom. Cancer, 20, 329-336.

200. Takayama T., Shiozaki H., Shibamoto S., Oka H., Kimura Y., Tamura S., Inoue M., Monden M., Ito F. and Monden M. (1996). Am. J. Pathol., 148, 39-46.

201. Tavtigian S., Simard J., Rommens G. (1996). Nature, 12, 333-337.

202. Testa J.R. and Siegfried J.M. (1992). Cancer Res., 52, 2702-2706.

203. Thoenes W., Storkel S., Rumpelt H.J. (1986). Path. Res. Pract., 181, 125-143.

204. Thrash-Bingham C.A., Greenberg R.E., Howard S., Bruzel A., Bremer M., Göll A., Salazar H., Freed J.J. and Tartof K.D. (1995). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92, 2854-2858.

205. Todd S., Roche J., Hahner L., Bolin R., Drabkin H.A. and Gemmill R.M. (1995). Genomics, 25, 19-28.

206. Todd M.C., Xiang R.H., Garsia D.K., Kerbacher K.E., Moore S.L, Hensel C.H., Liu P., Siciliano M.J., Kok K., van der Berg A., Veldhuis P.M.J.F., Buys C.H.C.M., Killary A.M., and Naylor S.L. (1996). Oncogene, 13, 2387-2396.

207. Todd S., Franklin W.A., Varella-Garcia M., Kennedy T., Hilliker C.E.J., Hahner L., Anderson M., Wiest J.S., Drabkin H.A. and Gemmill R.M. (1997). Cancer Res., 57, 13441352.

208. Tomlison I.P., Novel Ii M.R. and Bodmer W.F. (1996). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 14800-14803.

209. Trask B., Pinkel D., van den Engh G. (1989). Genomics, 5, 710-717.

210. Tsukamoto T., Takahashi T., Ueda R., Hibi K, Saito H. and Takahashi T. (1992). Cancer Res., 52, 3506-3509.

211. Turleau C., DeGrouchy J., Chavin-Colin F., Schlienger L., Leblanc A. And Hage C. (1985). Cancer Genet. Cytogenet., 16, 321-334.

212. Ullmann R., Schwendel A., Kiemen H., Wolf G., Petersen I., Popper H.H. (1998). Hum. Pathol., 29, 1145-1149.

213. Van der Berg E., van der Hout A.H., Oosterhuis J.W., Storkel S., Dijkhuizen T., Dam A., Zweers, H.M.M, Mensink H.J., Buys C.H.C.M. and de Jong B. (1993). Int. J. Cancer, 55, 223-227.

214. Van der Berg A., Kok K., Timmer T., Draaijers T.G., van der Veen A,Y., Veldhuis P.M.J.F., Naylor S.L. and Buys C.H.C.M. (1995a). Sixth International Workshop on Human Chromosome 3 (Minneapolis) (abstract), Genome Data Base, G00-677-042.

215. Van den Berg A., van der Veen A.Y., Hulsbeek M.M.F., Kovacs G., Gemmill R.M., Drabkin HA. and Buys C.H.C.M. (1995b). Genes Chrom. Cancer, 12, 224-228.

216. Van der Berg A., Kooy R.F., Hulsbeek M.M.F., de Jong D., Kok K., van der Veen A.Y. and Buys C.H.C.M. (1996a). Cancer Genet. Cytogenet., 72, 225-228.

217. Van der Berg A., Kooy R.F., Hulsbeek M.M.F., de Jong D., Kok K., van der Veen A.Y. and Buys C.H.C.M. (1996b). Cancer. Genet. Cytogenet., 72, 225-228.

218. Van den Berg and Buys C.H.C.M. (1997). Genes Chrom. Cancer, 19, 59-76.

219. Van den Berg A., Dijkhuizen T., Draaijers T.G., Hulsbeek M.M.F., Mäher E.R., van den BergE., Storkel S. and Buys C.H.C.M. (1997). Genes Chrom. Cancer, 19, 228-232.

220. Van Hengel J., Nollet F., Berx G., van Roy N., Speleman F. and van Roy F. (1995). Cytogenet. Cell Genet. 70, 68-70.

221. Van der Hout A.H., Kok K., van der Berg A., Oosterhuis J.W., Carritt B. and Buys C.H.C.M. (1988). Cancer Genet. Cytogenet., 32, 281-285.

222. Van der Hout A.H., van der Vlies P., Wijmenga C., Li F.P., Oosterhuis J.W., Carritt B. and Buys C.H.C.M. (1991). Genomics, 11, 537-542.

223. Van der Hout A.H., van der Berg E., van der Vlies P., Dijkhuizen T., Störkel S., Oosterhuis J.W., de Jong B. And Buys C.H.C.M. (1993). Int. J. Cancer, 53, 353-357.

224. Varella-Garcia M., Gemmill R.M., Rabenhorst S.H., Lotto A., Drabkin H.A., Archer P.A., Franklin W.A. (1998). Cancer Res., 58, 4701-4707.

225. Virgilio L., Shuster M., Gollin S.M. et al., (1996). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93, 97709775.

226. Vieten L., Beiair C.D., Savelieva L., Julicher K., Brocker F., Bardenheuer W., Schutte J., Opalka B., Reznikoff C.A. (1998). Genes Chrom. Cancer, 21, 39-48.

227. Virmani A.K., Fong K.M., Kodagoda D., Mclntire D., Hung J., Tonk V., Minna J.D., Gazdar A.F. (1998). Genes Chrom. Cancer, 21, 308-319.

228. Waber P.G., Lee N.K. and Nilsen P.D. (1996). Oncogene, 12, 365-369.

229. WangN. and Perkins K.L. (1984). Cancer Genet. Cytogenet., 11,479-481.

230. Wang H.W., Forrester K., Yeh H. et al. (1994). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91, 2230-2234.

231. Wang L., Darling J., Zhang J.-S. et al., Smith D. (2000). Genes Chrom. Cancer, 27, 1-10.

232. Weber J.M. and May P.E. (1989). Am. J. Hum. Genet., 44, 388-396.

233. Weber J.L. and WongC. (1993). Hum. Mol. Genet., 2, 1123-1128.

234. Wei M.-H., Latif F., Bader S.,Kashuba V., Chen J.-Y., Duh F.-M., Sekido Y., Lee C.-C., Geil L., Kuzmin I., Zabarovsky E., Klein G., Zbar B., Minna J.D., and Lerman M.I. (1996).

235. Cancer Res., 56, 1487-1492.

236. Weston A., Wiley J.C., Modali R., Sugimura H., McDowell E.M, Resau J., Light B., Haugen A., Mann D.L., Trump B.F. and Harris C.C. (1989). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 50995103.

237. Whang-Peng J., Kao-Shan C.S., Lee E.C., Bunn P.A., Carney D.N., Gazdar A.F. and Minna J.D. (1982a). Science, 215, 181-182.

238. Whang-Peng J., Bunn P.A., Kao-Shan C.S., Lee E.C., Carney D.N., Gazdar A. and Minna J.D. (1982b). Cancer Genet. Cytogenet6, 119-134.

239. Whaley J.M., Naglich J., Gelbert L., Hsia E., Lamiell J.M., Green J.S., Collins D., Neumann H.P.H., Laidlaw J., Li F.P., Kleino-Szanto A.J.P., Seizinger B.R. and Kley N. (1994). Am. J. Hum. Genet., 55, 1092-1102.

240. Wiest J.S., Franklin W.A, Drabkin H., Gemmill R., Sidransky D., Anderson M.W.J. (1997). CellBiochem. Suppl., 28, 64-73.

241. Wilhelm M., Bugert P., Kenck C., Staehler G. and Kovacs G. (1995). Cancer Res., 55, 53835385.

242. Wistuba LI., Montellano F.D., Milchgrub S., Virmani A.K., Behrens C., Chen H., Ahmadian M., Nowak J.A., Muller C., Minna J.D., Gazdar A.F. (1997). Cancer Res., 57, 3154-3158.

243. Wistuba I.I., Behrens C., Virmani A.K., Milchgrub S., Syed S., Lam S., Mackay B., Minna J.D., Gazdar A.F. (1999). Cancer Res., 59, 1973-1979.

244. Wong Y.F., Chung T.K., Cheung T.H., Tam P.O., Chang A.M. (1997). Cancer Lett., 115, 161-164.

245. Wooster R., Neuhausen S.L., Mangion J. et al. (1994). Science, 265, 2088-2090.

246. Wooster R., Cleton-Jansen A.-M., Collins N., Mangion J., Cornelis R.S., Cooper C.S., Gusterson B.A., Ponder B.A.J., von Deimling A., Wiesler O.D., Cornelisse C.J., Devilee P. and Stratton M.R. (1994). Nature Genet., 6, 152-156.

247. Wooster R., Bignell G., Lancaster G. (1995). Nature, 378, 788-792.

248. Wu C.L., Sloan P, Read A.P., Harris R.H. and Thakker N.S. (1994). Cancer Res., 54, 64846488.

249. Xu G.F., O'Connel P., Viskochil D. et al. (1990). Cell, 2, 599-608.

250. Yamakawa K., Morita R., Takahashi E., Hori T., Ishikawa J. and Nakamura Y. (1991). Cancer Res., 51, 4707-4711.

251. Yamakawa K., Takahasi Y., Horio Y., Murata Y., Takahasi E., Hibi K., Yokoyama S., Ueda R., Takahasi T. and Nakamura Y. (1993). Oncogene, 8, 327-330.

252. Yanagisawa K, Kondo M., Osada H., Uchida K., Takagi K., Masuda A., Takahashi T., Takahashi T. (1996). Cancer Res., 56, 5579-5582.

253. Yang Y., Kiss H., Kost-Alimova M, Kedra D., Fransson I., Seroussi E., Li J., Szeles A., Kholodnyuk I., Imreh M.P., Fodor K., Hadlaczky G., Klein G., Dumansky J.P., Imreh S. (1999). Genomics, 62, 147-155.

254. Yang-Feng T.L., Han H., Chen K.C., Li S.B., Claus E.B., Carcangiu M.L., Chambers S.K., Chambers J.T. and Schwartz P.E. (1993). Int. J. Cancer, 54, 546-551.

255. Yokota J., Wada M., Shimosato Y., Terada M. and Sigimura T. (1987). Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 9252-9256.

256. Yokota J., Tsukata Y., Nakajima T., Gotoh M., Shimosato Y., Mori N., Tsunokawa Y., Sigimura T. and Terada M. (1989). Cancer Res., 49, 3598-3601.

257. Yokoyama S., Yamakawa K., Tsuchiya E., Murata M., Skaiyam S. and Nakamura Y. (1992). Cancer Res., 52, 873-877.

258. Yoshida M.A., Ohyashiki K., Ochi H., Gibas Z, Pontes J.E., Prout G.R. and Sandberg A.A. (1986). Cancer Res., 46, 2139-2147.

259. Yoshino K., Enomoto T., Nakamura T., Nakashima R., Wada H., Saitoh J., Nöda K., Murata Y. (1998). Int. J. Cancer, 76, 176-181.

260. Yunis J.J. and Ramsey N. (1978). Am. J. Dis. Child., 132, 161-181.

261. Zabarovska V., Li J., Muravenko O., Fedorova L., Braga E., Ernberg I., Wahlestedt C., Klein G., Zabarovsky E.R. (2000). Chrom. Res., 8, 77-84.

262. Zabarovsky E.R., Boldog F., Thompson T., Scanlot D., Winberg G., Marcsek Z., Erlandsson R., Stanbridge E., Klein G., Sumegi J. (1990). Nucleic Acid Res., 18, 6319-6324.

263. Zabarovsky E.R., Boldog F., Erlandsson R., Kashuba V.l., Allikmets R.L., Marcsek Z., Kisselev L.L., Stanbridge E., Klein G., Sumegi J., Winberg G. (1991). Genomics, 11, 10301039.

264. Zabarovsky E.R., Allikmets R.L., Kholodnyuk I.D., Zabarovska V, Paulsson V., Bannikov V.M., Kashuba V.l., Dean M., Kisselev L.L., Klein G. (1994). Genomics, 20, 312-316.

265. Zabarovsky E.R., Kashuba V.l., Gizatullin R.Z., et al., Kisselev L.L., Klein G. (1996). Cancer Detection and Prevention, 20, 312-316.

266. Zbar B., Brauch H., Talmadge C., Linehan M. (1987). Nature (London), 327, 721-724. Zhang R., Wiley J., Howard S.P., Meisner L.F., Gould M. (1989). Cancer Res., 49, 444-449.

267. Zou T.T., Lei J., Shi Y.Q, Wang S., Souza R.F., Kong D., Simada Y., Smolinski K.N, Greenwald B.D., Abraham J.M, HarpazN. and Meitzer S.J. (1997). Oncogene, 15, 101-105.

268. Zur Hausen H. (1991). Virology, 184, 9-13.