Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тетрануклеотидные микросателлиты на карте хромосомы 13. Анализ распределения и применение для создания маркеров

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Тетрануклеотидные микросателлиты на карте хромосомы 13. Анализ распределения и применение для создания маркеров"



/

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ИВАНОВА ГАНКА МАНЕВА

ТЕТРАНУКЛЕОТИДНЫЕ МИКРОСАТЕЛЛИТЫ НА КАРТЕ ХРОМОСОМЫ 13. АНАЛИЗ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СОЗДАНИЯ МАРКЕРОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики геномной дактилоскопии Государственного научн исследовательского института генетики и селекщ промышленных микроорганизмов (Государственный научнь центр "ГосНИИ генетика").

Научный руководитель:

кандидат химических наук Э.А. Брага

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук П.М Чумаков, кандидат биологических наук В.Г. Богуш

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится "// " _1996г. в У

часов на заседании специализированного совета Д.098.12.С при Государственном научно-исследовательском институ генетики и селекции промышленных микроорганизмов I адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан "/У" [МЯ^ 1996г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Щербакова В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На протяжении многих лет и по настоящее время в ведущих лабораториях мира проводится создание плотной панели генетических маркеров и STS (sequence tagged sites) хромосомы 13, которые успешно применяются как для локализации генов наследственных заболеваний, так и при построении интегрированной карты этой хромосомы. Применение микросателлитов для создания генетических маркеров чрезвычайно эффективно в связи с: а) их повсеместным распространением в геноме млекопитающих; б) высокой гетерозиготностью и информативностью; в) существованию простого и универсального способа идентификации (на ДНК клонов, на геномных ДНК и ДНК клеточных линий). В последние годы для создания новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, все более широкое распространение стали получать микросателлиты три- и тетрамерных viothbob. Благодаря большей длине звена применение тримеров и гетрамеров позволило увеличить разрешающую способность анализа шлельного полиморфизма, повысить достоверность результатов и /простить методику, заменив радиоактивную метку окрашиванием фрагментов ДНК серебром. Эти преимущества три- и тетра-¡уклеотидных маркеров открывают перспективы для их применения I клинической практике для целей диагностики и прогнозирования 1аследственных заболеваний, а также для идентификации личности в еномной дактилоскопии.

Цель и задачи исследования: Настоящая работа посвящена нализу распределения микросателлитов ряда мотивов на хромосоме 3 и созданию генетических маркеров и STS на основе отобранных окусов. Для достижения цели работы были поставлены следующие адачи:

1 - отбор космид, содержащих тетрануклеотидные повторы, з клонотеки хромосомы 13 по гибридизации с олигонуклеотидными >ндами;

2 - анализ отобранных космид гибридизацией по методу аузерна;

3 - субрегиональная локализация позитивных космид ш метафазных хромосомах методом флуоресцентной гибридизации i условиях in situ (FISH);

4 - реклонирование отобранных космид с применение\ плазмидных векторов;

5 - определение нуклеотидных последовательное^ повторов и уникальных участков, фланкирующих микросателлиты синтез праймеров, комплементарных этим последовательностям;

6 - анализ аллельного полиморфизма локусов i использованием представительной выборки (30-140 неродственны; индивидов);

7 - анализ возможностей применения новых маркеров ддз локализации генов заболеваний в области 13q и в исследованиях пс типированию личности.

Научная новизна и практическая ценность работы. Настояща] работа выполнена в рамках проекта "Картирование хромосомы 13' ГНТП РФ "Геном человека", при участии сотрудников лабораторий возглавляемых д.б.н. В.М. Захарьевым, проф. A.B. Зелениным (ИМ1 РАН), проф. Н.К. Янковским (ИОГен РАН) и член-корр. РАН А.П Рысковым (ИБГ РАН). Данная работа является частью комплексны: исследований, проводимых в лаборатории молекулярно! диагностики и геномной дактилоскопии ГНЦ "ГосНИИ генетика" направленных на поиск высоко информативных микросателлитов i геноме человека и их применение для локализации гено] распространенных наследственных заболеваний, в диагностике и npi идентификации личности.

Проведен скрининг упорядоченной клонотеки хромосомы Г. с применением плотных панелей клонов, что позволило провесп статистический анализ данных. В результате изучены особенносп распределения три- и тетрануклеотидных микросателлитов н; хромосоме 13 и выбран единственный мотив из 7 исследованных применимый для картирования хромосомы 13 и други; ядрышкообразующих хромосом - 14,15, 21 и 22.

Созданы новые полиморфные маркеры и STS в области 13q которые не были идентифицированы ранее в других Научны: центрах, в том числе зарубежных. С применением панели YAC-o: (СЕРН) детально определена локализация полиморфного локус; D13S699 (13ql4, 28сМ от pter-конца), для которого получень предварительные данные о его возможной ассоциации

изофренией. Высокоинформативный маркер 0138699 успешно зименеи в судебной медицине для решения вопросов о спорном гцовстве.

Апробация результатов н публикации. Результаты настоящей 1боты докладывались на 4-ой и 5-ой Конференции "Геном человека" [ерноголовка, 1994 и 1996 г.), Международной конференции Молекулярная биология накануне XXI века" (Москва, 1994 г.), 1-ом :ероссийском съезде медгенетиков (Москва, 1994 г.), 27-й и 28-й онференциях Европейского общества генетики человека (Берлин, •95 г. и Лондон, 1996 г.), 3-м Международном рабочем совещании ) хромосоме 13 (Агенда, США, 1995 г.), 3-й и 4-й Конференциях Щ "ГосГНИИ генетика" (1995 и 1996 г.), на Международной эн ференции "Геном человека" (Гейдельберг, 1996 г.). Материалы [ссертации опубликованы в 2 статьях и 9 тезисах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа

ложена на _страницах машинописного текста и состоит из

едения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения зультатов, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Частота встречаемости и особенности распределения (кросателлитов различных мотивов в составе рекомбииантных смид хромосомы 13.

Проведен скрининг панелей клонов высокой плотности едставительной упорядоченной космидной клонотеки хромосомы с зондами на микросателлиты трех мотивов: ОАСТ, вАТв и ТСв. I основании наших результатов и данных скрининга той же онотеки с зондами других четырех мотивов (ОАСА, САС, ТСС и У), полученных в лабораториях Н.К. Янковского (ИОГен РАН) и П. Рыскова (ИБГ РАН), был проведен статистический анализ нных гибридизации каждого из клонов с каждым из зондов. В ;днем, с изпользованием каждого зонда проанализировано 12000 энов , что соответствует 3,7 эквивалента хромосомы 13. Доля энов, позитивных по каждому из мотивов составила 2-3%.

Рис.1. Гибридизация панели 7 (1536 клонов) с зондом (GACT) 4

Использована клонотека ICRF С108, штамм Е. coli DH: вектор Lawrist 4, вставка 35,4 т.п.н. 1536 клонов из 16 имму логических планшетов упорядоченно и воспроизводимо размещ; на фильтре (Hybond N) с размерами 125x85 мм с помощью ще-репликаторов. Колонии выращивали ночь при 37° С, помес фильтры на LB-arap с канамицином, и фиксировали по стандарт! методике. С каждым из зондов проведена гибридизация 8 панелей.

Анализ содержания микросателлитов в каждом отделы клоне показал, что часть клонов содержат микросателл* нескольких разных мотивов. При анализе значимости корреляций критерию х2_кваДРат оказалось,что только локусы мотива GA распределяются независимо от микросателлитов других мотивов. J. попарных сочетаний микросателлитов шести других моти: частоты совместной встречаемости достоверно превышают часто рассчитанные из предположения об их независимом распредели по космидам. При этом с возрастанием числа мотивов на ю превышение экспериментальной частоты над теоретичеа возрастает на несколько порядков (табл.1).

Таблица 1.

Частота встречаемости клонов, содержащих одновременно микросателлиты двух и более мотивов при анализе всех клонов клонотеки (подвыборка 12000 клонов)

м Эксп./теор.

Эксперим. Теор. 1о£ Р

>1 240 2x10-2 5x10 3 >1 >0,99

>2 96 8х10-з 1х10-4 ~2 >0,99

>3 48 4х10-з 2x10-6 ~3 >0,99

>4 24 2x103 2x10-8 ~5 >0.99

>5 1 8x10-5 1x10-1° ~6 >0,99

[ - количество различных мотивов микросателлитов в составе зного клона

- общее количество космидных клонов, использованных при гборе

ш - количество клонов, гибридизовавшихся с микросателлитными »ндами

- доверительный интервал

Анализ частоты встречаемости клонов, содержащих феделенные сочетания микросателлитов двух и более мотивов, жазал, что наиболее часто попарно встречаются локусы пяти этивов: ОАСА, ОАСТ, САС, ТСС и ОА. Эти же микросателлиты »минируют в клонах, содержащих от 3 до 6 мотивов. Было »едложено, что обнаруженная кластеризация микросателлитов язана с их принадлежностью к семейству среднегювторяющихся »следовательностей генов рибосомных РНК хромосомы 13. Тем »лее, что спейсерная область генов рРНК млекопитающих содержат южество мини- и микросателлитов, и размер повторяющейся иницы рДНК человека (43 т.п.н.) превышает длину вставки в смидах (35,4 т.п.н.).

Чтобы выявить космиды, содержащие последовательности ЩК, был проведен скрининг панели клонов с двумя типами зондов рДНК (выполнено в лаб. Н.К.Янковского). В качестве одного из ндов был использован олигонуклеотид, соответствующий участку яавания интрон-специфической эндонуклеазы 1Рро1, характерной я 28Э рДНК. В качестве второго зонда использовали суммарную Ж пяти космид, локализованных в области ядрышкового

организатора (Кост, 1994). С учетом этих данных был проведе анализ встречаемости микросателлитов в области рДНК.

Таблица 2.

Частота встречаемости микросателлитов 7 мотивов в области рДНК (подвыборка 139 клонов, содержащих рДНК)

Мотив Nm/N L К 0

ТСС 0,84 21 124 60

GACA 0,78 23 113 56

GA 0,69 26 110 50

САС 0,50 36 72 36

GACT 0,42 43 60 30

TCG 0,14 260 10 10

GATG 0,01 2600 1 1

N - общее количество космидных клонов, использованных пр отборе Nm - количество клонов, гибридизовавшихся микросателлитными зондами L - Среднее расстояние между локусами в т.п.н. К - Количество локусов данного мотива Q - Количество копий рДНК, содержащих данный мотив При расчете принимали, что позитивный клон в среднем содержит локуса данного мотива.

Обращает на себя внимание тот факт, что в клона> содержащих рДНК и составляющих лишь около 2% от всех космщ выявляется непропорционально большое количеств микросателлитов. С учетом размера вставки (35,4 т.п.н.), был рассчитано среднее расстояние между соседними локусами дл каждого из семи мотивов в области рДНК; эта величина для пят мотивов (GACA,GACT,TCC,CAC и GA) составила 20-40 т.п.н. Такт образом, кластер из 60 повторяющихся единиц рДНК, имеющи: протяженность 2,6 млн.п.н., содержит 1 локус GATG и от 60 до 12 локусов мотивов GACA, GACT, ТСС, САС и GA.

Вне области рДНК, то есть на основной части хромосомы 1; средние расстояния между соседними локусами для 7 мотиво составили 1-2 млн.п.н. Для пяти мотивов (GACA, GACT, САС, ТС( и GA) эти величины на 1-2 порядка больше, чем в области рДН1

абл. 2). Среднее расстояние между локусами мотива GATG не [висит от их принадлежности к области рДНК.

Локусы, принадлежащие области рДНК, являются руктурным элементом повторяющейся последовательности более зупного размера и поэтому не могут быть использованы для •здания генетических маркеров. Мотив GATG распределен ¡зависимо от семейства средне повторяющихся последовательностей ДНК и может быть успешно применен для картирования хромосомы 1 и других ядрышкообразующих хромосом - 14,15,21 и 22.

2. Анализ GATG- и GACT-позитивных космид методом блот-¡бридизации; исследование субрегиональной локализации обранных космид методом флуоресцентной гибридизаци в условиях situ (FISH) на мстафазных хромосомах.

Статистический анализ данных гибридизации упорядоченных 1нелей клонотеки позволил нам выбрать 120 клонов, позитивных по ндам на мотивы GACT и GATG и негативных по зондам на рДНК. :е эти клоны были исследованы методом гибридизации по Саузерну пробами (GACT)4 и (GATG)4 . Наличие локусов микросателлитов то подтверждено для 40 космид (33% от общего числа следованных клонов). Для GATG-позитивных космид оказалось 'лее характерным обнаружение только одного гибридизующегося )агмента, в то время как половина GACT-позитивных космид держали две и более полос на радиоавтографе (рис. 2, табл. 3). 1К видно из табл.3, такие космиды наряду с локусами (GACT) п, как авило, содержат и микросателлиты других мотивов.

40 космид, позитивных по данным блот-гибридизации, были кализованы субрегионально на метафазных хромосомах методом уоресцентной гибридизации в условиях in situ (табл.3). При поставлении данных FISH с данными, полученными при бридизации колоний и фрагментов ДНК космид, были выявлены здующие закономерности. Практически все GACT-позитивные смиды, содержащие кластеры микросателлитов и интенсивно Зридизующиеся с пробой (GACT)4, оказались расположены в ласти ядрышкового организатора.

А абвгдежзиклмнопр абвгде

Рис. 2. Блот- гибридизация с зондами (GATG)4 и (GACT)4 ДН космид, расщепленных парой рестриктаз (Eco RI + HindIII); .

Анализ ДНК GACT- позитивных космид; a- A.+Hindlll; б космида 41С5; в- 38G2; r-41G10; д- 39G12; е- 44Н1; ж- 47Н2; 38В12; и- 36С5; к- 7Н8; л- 23А12; м- 24Е12; н-50Н12; 0-98А6; 99В8; р- 102А11; Б- Анализ GATG- позитивных космид: а- 20С б- 19D5; в- 29F6; г- 28D2; д- 19D6; е- X+HindlII.

Таким образом, большинство локусов (GACT)n принадлеж области рДНК короткого плеча хромосомы 13. Напротив, в GATG-нозитивные космиды, в том числе и содержащие кластеры локусов (GATG)n, или комбинации повторов (GATG)n с микр сателлитами других мотивов, были локализованы методом FIS исключительно в области 13q. Распределение локусов (GATG)n вдо; плеча 13q нельзя назвать равномерным, так как большинство локус* (11 из 15) относятся к району 13q31-q34, то есть к дистальной час: длинного плеча хромосомы 13. Ранее (Petrukhin, 1993) был выявл< избыток повторов (СА)п в районе 13q32-q34. По-видимому, да теломерной области хромосомы 13 характерно повышенж содержание микросателлитов определенных мотивов.

Характеристика GATG и GACT- позитивных космнд

N Косми- рДНК I-Ppol Локализация Гибридизация Сокласте-

да косм. # * FISH число полос IIITCHCHB-IIOCTb ризация

GATG - позитиннме космиды

1. 60В11 - - I3ql 1 2 + GACT

2. 7Н07 - - I3ql2 2 ++ -

3. 27F12 - - I3ql2 1 + + -

4. 28D02 - - 13ql2-ql3 1 1 + -

5. 29В09 - I3ql2-ql31 1 + -

6. 29F06 н.и. н.и. 13ql3-ql4 1 +++ -

7. 8. 19D05 2F02 : I3ql4 I3q2l 1 1 ++ + -

9. 117AI! - - 13q31-q32 2 ++ -

10. 59BI0 - - I3q32-q33 1 1 +++ -

11. 12. 13. 59Е09 18В05 54С02 - ■ 13q22-q31 1 13q33-q34 X 1 1 2 + + + ++ + CA

14. I6H08 13q33-q34 X 1 + +

15. 93В07 _ 13q33-q34 X 1 +++

16. 115D09 _ 13q34 1 + + GACA

17. 85Н06 I3q34 2 + +

18. 36С05 + н.и. I3q34 3 + + TCC,GA,GACT

19. 75D06 I3q34 1 + + GACT

20. 44В06 13q34 n + _

21. 45D10 _ I3q34 2 + +

22. 64CI1 I2q24 1 +

cht 9

GACT-позмтивные космнди

1. 4IG10 - I3q 11-е 1 + + TCC

2. 39G12 - 13ql2,chX 1 + TCC

3. 99В08 - 13ql2-ql3 1 + -

4. 102А11 - 13ql3-ql4 1 + + -

5. 99Е09 - I3ql3-ql4 2 + -

6. 98А04 - 13ql3-ql4 1 + -

7. 8. 7Н08 98G05 l3ql4X I3q21 I 1 + + +

9. 99А09 - 13q21-q22 1 + -

10. 32Е08 • I3q22-q31 X 1 + ■

11. 98А06 - V3q33-q34 l + ■

12. 111А11 - NOR 1 + TCC

13. 10SH02 - NOR n + + CAC,CA,GA,TCC

14. I09D10 - NOR n ++ GACA.CAC.CA, GA.TCC

15. 24EI2 - - NOR X n + -

16. 38G02 + U.U. NOR n ++ GACA,CAC,TCC

17. 44H0I H.H. - NOR n + + GACA.CAC.TCC

18. 50Н12 + - NOR i ¡1 + + CA

* - гибридизация с 5' CTCTCTTAAGGTAGC 3' ( сайт I-Ppol в 28S рДНК )

# - гибридизация с суммарной ДНК космнд: 36GI I, 38G02, 44Н06, 47А! 1, 4ÜCI2.

и.и,- пс исследовано; X - (I lawlliorn, 1994)

3. Получение и анализ реклонов, содержащих повт (САТО„.

Проведено реклонирование 15 ОАТО- и одной вА позитивной космиды, главным образом, путем встраива фрагментов 8аиЗА1 в р11С19 по участку ВашН1. Отбор рекло) содержащих локусы повторов, осуществляли с помоь гибридизации колоний с последующим анализом отобранных кло методом блот-гибридизации (рис.3). Размер вставки в позитив реклонах составлял от 0,2 до 3 т.п.н. (табл.4). Наиболее корот вставки были прочитаны от стандартных праймеров цели (реклоны 29-5, 19-3, 98-39, 59е-6, 59Ь-10, 54-55, 85-43, 85-44). Из ше таких последовательностей только одна не содержала искои микросателлит (реклон 98-39).

Рис. 3. Блот- гибридизация с зондом (GATG).« ДНК реклонов космид 44В06 расщепленных парой рестриктаз: Eco RI + Hind Ш; крайние дорожки Х+ Hind III. Космиды реклонировали с исспользованием штамма Е. coli JM 109 и векторов pUC19 HpUC21.

Реклоиы GATG- позитивных космнд

Космида Локализ. FISH Pck.ioii Размер вставки Стратегия секвенировання т.п.«. Снквснс повторов @

Т.П.II. Станд. пр. Синтез, пр. D R D-1 R-1

27А12 13ql2 27-Зл 2,5 507 529 400 и

7Н07 13ql2 7-Ь8л 7-h30 2,2 1.3 460» 338 420 (GATG)>I9

29В02 13q 12-13 ± ' 29b-5 0,5 479* (GATG)14/2I

19D05 13q 14 X 19-3 0,7 681* (GATG)24/50

98G05 13q21 98-39 0.2 180 н.о.

59Е09 13q22-31 1 59e-6 0,9 875* (GATG )49/83

59c 17 1.5 519* (GATG)!0/20

59В10 13q32-33 1 59b47 1.3 411 и

U7AU I3q31-q32 117-55л 117-21 1 17-62 3.0 1.5 472 503 510 495 896 938 422 505 и il

18В05 13q32-33 X 18-96л 1.2 442 625 H

54С02 13q33-q34 1 54-55 0.3 250* (GATG)>7

93BÜ7 13q34 93-28л >2 339 357 и

115D09 13 q 3 4 us-ic4 >3 408 393 469* (GATG >35

851106 13q34 85-43 0.5 528* (GATG) 10/18

85-44 0.2 169* (GATG) >13

44В06 I3q34 44-65 44-67 1.3 1.5 485 563 386 426 (GATG)9/11

36С02 13q34 36-48л 1.8 440 300* 492 (GATG >22

75D06 13q34 75-31л 1.5 415 485 39!* (GATG)>43

©-Приводится число GATG- повторов относительно суммы всех повторов,

включая вырожденные.

1- (Hawthorn , 1994)

А- проводится укорачивание

*- содержит GATG-повторы.

и.о.- не обнаружен

и- исследуется

В нуклеотидных последовательностях реклонов, прочитанны) частично (табл.4, 59el7-D, 44-65-D и 36-48-R), также были найдень повторы (GATG)n- Для завершения определения последовательностей таких локусов, как и для идентификации повторо! (GATG)n в реклонах с наиболее длинными вставками, был* синтезированы специфические праймеры, комплементарные ранее установленным последовательностям.

С их применением повторы (GATG)n были обнаружены прр секвенировании реклонов 115-10 и 75-31 от праймеров типа D1 Анализ амплификации реклонов с использованием стандартных (D \ R) и специфических (D1 и R1) праймеров, позволил проверит! комплементарность праймеров и подтвердить наличие повтора вс вставке. Длины отрезков, определенные по нуклеотидной последовательности (D-Dl, R1-R) и по амплификации (D-R, D-Rl, Dl-R \ D1-R1), четко коррелируют для ряда реклонов. С применение\ специфических праймеров выполнено определение нуклеотидной последовательности следующих реклонов: 59е-17, 18-96, 44-67 и 75-31. В случае слишком коротких вставок (0,2-0,4 т.п.н., реклоны 59Ь-10 54-55 и 85-44), проводится определение нуклеотидной последова тельности полных локусов с применением специфических праймеро! непосредственно на исходных космидах - 59В10, 54С02 и 85Н06.

Для реклонов с наиболее длинными вставками проведено и> укорачивание с использованием участков узнавания рестриктаз выявленных на основе анализа ранее прочитанных нуклеотидны> последовательностей, или с помощью рестриктазного анализа. И: реклона 27-3 и 18-96 были удалены GATG-негативные фрагменть AccI (1,5 т.п.н.) и HincII (500 п.н.), соответственно. С другой стороны субклонированы GATG-позитивные Сзр61-фрагменты реклонов 75 31 (800 п.н.) и 36-48 (600 п.н.) по участку Ndel в pUC21, а такж< GATG-позитивный HindIII-фрагмент реклона 7h-8 (700 п.н.). I перекрывающихся реклонах 117-55 и 117-21 прочитаны после довательности по -900 п.н. с обоих краев с применением толькс стандартных праймеров. Однако неисследованная и содержаща? локус (GATG)n часть составляет не менее 1,8 т.п.н. Проведенс делетирование фрагмента SacI (400 п.н.) из реклона 117-55 i-фрагмента Smal (400 п.н.) из реклона 117-21, что позволяет начат! определение нуклеотидной последовательности центральной част этих реклонов (1,8-2,0 т.п.н.) с применением стандартных праймеров Кроме того, субклонированы GATG-позитивные фрагменты Csp6I и;

центральной части реклона 117-55 (~1 т.п.н. и 600 п.н.). Комбинация хвух подходов - получение укороченных реклонов и применение :пецифических праймеров, сделало возможным определение полных 1уклеотидных последовательностей еще 7 локусов.

4. Структура и аллельиый полиморфизм шести ПЦР-маркеров в (бласти 13q.

Определение нуклеотидных последовательностей локусов GATG)n показало, что кроме повторяющихся единиц GATG, они одержат повторы других мотивов, главным образом, етраиуклеотидных. На рис.4 приведена нуклеотидная оследовательность одного из локусов, локализованного в области 3q (D13S707). Микросателлит состоит из 24 повторяющихся единиц, реди которых 14 повторов GATG и десять вырожденных типа rAGG, GACG, GACA, GATA и ATG. В табл. 5 структура пяти окусов (GATG) п охарактеризована количеством содержащихся в аждом из них повторяющихся единиц GATG и общим числом андемных повторов локуса, с учетом вырожденных.

СССТТССАС CATGATТАТА AGTTTCCTGA GGCCTCCCCA GACCTGCTGA 100 CTGTGAGTC ААТТАААССТ СТТТССТТТА ТАААТТАССС AGTCTTGGGT 150 ГСТСТТТАТ TAGCAGCGTG AGAACCAACA GATACAGGGT GCTTGACATG 200 ^AAGGCTTA GTGAATGcat gaatggatgg atggagggat agatggatgg 250 tggatggac ggacagacgg atggatggat ggatggatgg atgatggatg 300 atggataat ggCCACCACA GCCTGCTGTC АГСАТСАТТТ CATGCACAGA 350 YGTTTCACC TTCTCAAGTA TGAAGGCCAC AACTGAAGAA TGAAGGACAT 400 ГСТТТССАА GCAAGGGTGT TGGCAGCTTG CGCAACATCA TACTCTCCTT 450 YCCCTAACT TGCCTCAGAC AGTGATCTC

nc.4. Нуклеотидная последовательность локуса D13S707; тандемные >вторы вьщелены. Нуклеотидную последовательность клонирован-.IX ДНК определяли на автоматическом секвенаторе фирмы Applied Biosystems"(CllIA), исспользуя стандартны набор реактивов 'RISM Ready Reaktion Dye Deoxy Terminator Cycle Sequensing Kit" й же фирмы. Режим ПЦР : 96° С - 10 е., 50° С - 5 е., 60° С - 4 мин. (25 шюв). Праймеры выбирали при помощи компьютерной юграммы "Oligo"; синтез олигонуклеотидов проводился в боратории В.П.Вейко.

Как видно на примере D13S707 (рис.4), вырожденные повтс чаще содержат замены, чем делеции. В составе пяти локусов д единиц GATG изменяется от 50% (D13S699) до 80% (DI3SI4 Высокая степень "пересеченности" GATG-локусов согласуете} данными по структуре тетрануклеотидных маркеров, описан* другими авторами (Edwards, 1991).

JSi

. 42.

т

1

Цч ЗЮ tHoit!» "1 „С

I

Рис. 5. Продукты амплификации локуса D13S699 при использова! в качестве матрицы ДНК ряда индивидов; электрофоретичеа разделение в 8% полиакриламидном геле; маркеры: А- pBR322+ AI Б- фХ174+НннШ1. Амплификацию большинства локусов проводи по программе: 94° С/ 1мин., 55-65° С/ 1мин., 70° С/ 1мин.( 30 цикл« на амплификаторе РНС-2 (Techne, UK). Реакционная см< содержала: 0,67 М трис-HCl pH 8,8; 167мМ (NH4)2S04 ; 0,01% твин-0,2 мМ каждого dNTP; 0,1 мкг геномной ДНК ; 20 пмолей кажде праймера; 2 ед. полимеразы TaqR ; MgCh от 1 до 4 м Амплификацию локуса D13S690 прово-дили при специальн условиях: 25 мМ трис- НС! pH 8,7; 85 мМ ацетат калия ; 0,2 каждого dNTP; 0,1 мкг геномной ДНК ; 20 пмолей каждого прайме] 1мМ ацетат магния; 1,75 ед. полимеразы rTth (Perkin- Elmer Ceti 0,2 ед. полимеразы Vent (New England Biolabs, USA). Програм включала 10 циклов при 54°С и 20 циклов - 58°С. Продук амплификации анализировали в 6-12% поли-акриламидном геле ил1 2% агарозном геле. Полиакриламидный гель окрашивали серебро* Budowle, 1991).

ПЦР- маркеры хромосомы 13

Кос,мила D номер Локализация Структура локуса * Последовательность пранмеров (5--3-) 1 Мй2+ 1 mM Темп, отжига С» Размер продукта п.н. Число аллелей Гетеро-зигот-ность

29В02 D13S707 13ql2.11-ql3 14/24 gacatggaaaggcttagtgaatgc aaatgatgatgacagcaggctgtg 2 65 139-151 4 0.66

19D05 D13S699 13ql4 24/50 catcaccaaacaattactgaatgtca gcatcttcttcctttagaggtatttc 1-2 55 208- 224 5 0.64

59Е09 D13S690 13q22-q31 49/83 cctcacatcttgattgaaag gggcgatccatccaacatc 1 54,58 344-352 6 0.75

44B0Ó D13S14I7 13q34 9/11 caatacaaatcagcgacact taagcttgggtctccctata 65 268 1 0.0

851106 D13S1420 13q34 10/18 taggtgctgtccggctgctg CtggCtgCtgtgtgttggKC 1 65 226 1 0.0

98G05 D13S703 13q21.1-q21.3 - taagcgcacgattcccatt cggtggctctgcctattttg 2-4 65 263 1 0.0

*- отношение числа GATG- повторов к общему числу повторов , включая врожденные.

Наличие полиморфизма выявляли при использовании выборки из 15 неродственных индивидов . Аллельный полиморфизм полиморфных локусов DI 3S699 и D13S707 был изучен с применением выборки из 120- 140 неродственных индивидов русской популяции г. Москвы, а лок\с DI 3S690 - на выборке из 32 неродственных индивидов французской национальности.

Для шести локусов области ¡Зя был и сформирова праймеры и подобраны условия амплификации (табл.5). Разме продуктов амплификации шести локусов изменяются в пределах 140 до 370 п.н. Пример электрофоретического разделения продукт амплификации одного из локусов показан на рис. 5. Полиморфны оказались три локуса с числом повторов выше 20, причем наибо. протяженный локус (0135690) характеризуется и наибольшим числ аллелей (6), и наиболее высокой гетерозиготностью (0,75), что со< ветствует описанной в литературе корреляции между эти параметрами. Обнаружение полиморфизма в трех локусах из п^ исследованных соответствует ожидаемой частоте встречаемое полиморфных локусов среди три- и тетрануклеотидн микросателлитов с числом повторов больше семи (МеПБ, 1993).

Распределения частот встречаемости аллелей локус 0135707, 0138699 и 0138690 показаны на диаграмме (рис. 6). Все т] локуса имеют по одному доминирующему аллелю: 0135707 -.147 п. 0135699 - 220 п.н., 0135690 - 356 п.н. Распределение четырех аллех локуса 0135707 можно считать равномерным, так как пр( ставленность каждого из аллелей достаточно высока (не ниже 9%) случае локуса 0135699 из 5 аллелей один (208 п.н.) встречается край редко (1,4%), поэтому преимущества этого локуса выявляются толы

□135707 0138690 0135653

Рис. 6. Распределения частот встречаемости аллелей локусов 1)1387( ОШ699 и 0138690.

Таблица 6.

Наблюдаемые и ожидаемые частоты встречаемости генотипов локуса 0138699 в русской популяции Москвы

Частота встречаемости

Генотип Ожидаемая Число Наблю- Число

наблюдений даемая наблюдений

208/208 0.000 0.028 0.007 1

208/212 0.006 0.789 0.000 0

208/216 0.004 0.563 0.000 0

208/220 0.016 2.296 0.007 1

208/224 0.002 0.296 0.007 1

212/212 0.039 5.521 0.014 2

212/216 0.056 7.887 0.056 8

212/220 0.226 32.141 0.275 39

212/224 0.029 4.141 0.035 5

216/216 0.020 2.817 0.014 2

216/220 0.162 22.958 0.190 27

216/224 0.021 2.958 0.007 1

220/220 0.329 46.776 0.289 41

220/224 0.085 12.053 0.099 14

224/224 0.005 0.776 0.000 0

Всего 1.000 142.000 1.000 142

Наблюдаемые частоты встречаемости аллелей и ожидаемые частоты тречаемости генотипов для полиморфных локусов рассчитывали с 'мощью компютерной программы (Вишниченко О.В., НИИ смического приборостроения, Москва). Наблюдаемые частоты речаемости генотипов проверяли на отклонение от равновесие грди-Вайнберга на основе критериев %2 и G- статистики с исполь-ванием компьютерной программы RxC ( Rows х Columns, Жд. 1рмоди, Карлетонский университет, Оттава). Программа раз-ботана на основе алгоритма (Roff, 1989).

и использовании выборки из 100 и более человек. Все 6 аллелей куса D13S690 достаточно представлены (с частотой не менее 6%) и, шм образом, распределение частот встречаемости аллелей этого куса можно считать равномерным, и рассматривать этот локус как сокогетерозиготный и высокоинформативный.

Анализ наблюдаемых и ожидаемых частот встречаемое! генотипов трех полиморфных локусов продемонстрировг соответствие их распределения равновесию Харди-Вайнбер] (табл.6). Исследование распределения аллелей при семейном анали: позволило сделать заключение о независимом характере наел дования аллелей данных локусов. Мутантных аллелей не бьи обнаружено.

6. Возможности применения новых STS и полиморфнь: локусов 13q.

Самым эффективным подходом к построению интегр! рованной карты отдельных хромосом оказалось применение плотнь панелей STS - коротких последовательностей, локализованных у хромосоме и идентифицируемых с помощью ПЦР. К настоящем времени нами определены нуклеотидные последовательное! фрагментов ДНК 16 космид, локализованных на длинном пле1 хромосомы 13 (табл.4). Из 16 исследованных локусов да формирования праймеров и создания маркеров пока использован нуклеотидные последовательности 6 космид, локализованных в субрегионах (13ql2-ql3, 13ql4, 13q21, 13q22-q31 и 13q34, табл.6). Дл 10 других космид завершается анализ реклонов на содержат локусов (GATG)n и/или определение прилежащих к ни нуклеотидных последовательностей (табл.5). 16 новых STS повыся плотность панели STS 13q. Следует отметить, что к настоящем времени создано несколько панелей STS и EST хромосомы 13 (Shav 1995; Fischer, 1995), которые позволили провести анали перекрывания и стыковку в контиги 700 YAC-ов (СЕРН) и 700 космид и успешно применяются для интеграции физическое генетической и генной карт 13q. Новые STS 13q могут быт использованы для дальнейшего анализа и стыковки пере крывающихся клонов при построении интегрированной карты это: хромосомы.

На длинном плече хромосомы 13 локализованы \ проклонированы гены, предопределяющие развитие многи распространенных генетических заболеваний: ген ретинобластом! (13ql4.2), ген болезни Вильсона (13ql4.3), ген алвеолярно] рабдомиосаркомы (13ql4). Для ряда наследственных заболеваний ассоциированных с областью 13q, в настоящее время проводите поиск генов, участвующих в возникновении заболевания, применением полиморфных маркеров и STS. Созданный нам!

ысокополиморфный маркер D13S707, а также ряд локусов, тносящихся к области 13ql2-ql3 (табл.5) могут быть применены для окализации и клонирования генов четырех заболеваний, ссоциированых с этой зоной: аутосомная рецессивная мышечная истрофия, аутосомная рецессивная нейросенсорная глухота, индром Мебиуса, рак молочной железы. Высокополиморфный аркер D13S699 (13ql4), возможно, будет полезен для локализации ;на лимфоцитарной лейкемии (13ql4.3) и/или гена, вовлеченного в азвитие шизофрении, так как, согласно литературным данным, бласть I3q 14. l-q32 ассоциирована с этим заболеванием (Lin, 1995). [олучены предварительные данные об изменении распределения астот аллелей маркера D13S699 среди больных шизофренией. С рименением панели YAC-ов (СЕРН, Франция) определена более эчно локализация этого полиморфного локуса - в районе 13ql4, 28 VI от pter-конца. Немалый интерес представляют и микро-ггеллитные локусы в области 13q31-q34, так как согласно лтературным данным, теломерные районы разных хромосом чалогично прицентромерным областям характеризуются эвышенным содержанием генов (Shaw, 1995; Morishima, 1995).

Аллельный полиморфизм нового маркера D13S699 был эименен в области геномной дактилоскопии при решении вопросов спорном отцовстве. Было проанализировано 12 семей. В ряде гучаев было выявлено несовпадение генотипов предполагаемого гца и ребенка по ряду локусов, в том числе и по маркеру D13S699. аким образом, была продемонстрирована применимость новых лсокоинформативных маркеров в судебно-медицинской практике 1я идентификации личности.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг космидной клонотеки хромосомы 13 :ловека на содержание микросателлитов 7 мотивов: GACT, GATG, 2G (выполнено нами) и GACA, САС, ТСС и GA (выполнено в лаб. [ен-корр. РАН А.П.Рыскова); исследована принадлежность обранных космид области генов рибосомных РНК (выполнено в i6. проф. Н.К.Янковского). Использование упорядоченной (онотеки и панелей клонов высокой плотности (8 панелей по 1536 юнов) позволило применить компьютерный анализ и сопоставить нные гибридизации каждого из клонов с каждым из зондов.

2. Выявлено крайне неравномерное распределение ря; мотивов вдоль хромосомы 13. В случае мотивов GACT, GACA, CA и ТСС совместная встречаемость их локусов на несколько порядк( превышает величину, ожидаемую при независимом распределени Большинство кластеров принадлежит области рДНК. В результат 60 повторяюшихся единиц рДНК, составляющие только 2 хромосомы 13, содержат приблизительно по 100 локусов (GACT) (GACA)n, (САС)п и (ТСС) п, что на два порядка выше, чем ь основной части хромосомы 13. Напротив, локусы (GATG распределены независимо от встречаемости других микросателлитс и от принадлежности к рДНК.

3. Среди 7 исследованных микросателлитов локусы с мотиво GATG наиболее подходят для создания генетических маркере хромосомы 13 человека. Локусы микросателлитов, относящиеся области рДНК, являются элементом повторяющей* последовательности более крупного размера (~40 т.п.н.) и потому i могут применяться для создания уникальных генетических маркеро Таким образом, мотивы GACT, GACA, САС и ТСС не эффективн при картировании хромосомы 13, и других ядрышкообразующ* хромосом - 14, 15, 21 и 22.

4. 120 космид, позитивных по гибридизации с зондами к микросателлиты типа (GATG)n и (GACT)n и негативных по зонда на рДНК, исследованы гибридизацией по Саузерну. 40 косми, позитивных по данным блот-гибридизации, локализован субрегионально методом флуоресцентной гибридизации в условиях i situ (FISH) на метафазных хромосомах.

5. Большинство GACT-позитивных космид локализованы области ядрышкового организатора и представлены кластерами v локусов (GACT)n в комбинации с микросателлитами других мотиво) Все локусы (GATG)n, в том числе и образующие кластерь локализованы исключительно на длинном плече хромосомы 1! причем 11 из 15 локусов в теломерной области 13q (13q31-q34).

6. Для 16 космид, локализованых в области 13q, получен) реклоны и частично определены их нуклеотидны последовательности. Локусы (GATG)n обнаружены в нуклеотидны последовательностях 13 реклонов. Полностью определен] нуклеотидные последовательности 6 локусов.

7. На базе уникальных последовательностей, окружающи микросателлиты, сформированы 6 пар праймеров и соответственно

5ТБ, идентифицируемых ПЦР. Анализ аллельного полиморфизма •тих локусов с применением представительной выборки 1еродственных индивидов (30-140 человек) позволил выявить 3 ¡ысокоинформативных маркера с числом аллелей от 4-х до 6-ти и с етерозиготностыо 0,64-0,75, а также охарактеризовать эти маркеры ю распределению частот аллелей и наблюдаемых генотипов.

8. Новые маркеры и исследованные локусы относятся, лавным образом, к теломерной и прицентромерной областям 13я, >тличающимся повышенным содержанием генов. Получены [редварительные данные о возможной ассоциации полиморфного юкуса 013Б699 с шизофренией. С применением панели УАС-ов юкализация этого локуса определена более точно - 13д14, 28 сМ от ^ег-конца. Высокоинформативный маркер В13Б699 нашел [рименение в судебной медицине для решения вопросов о спорном отцовстве.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Брага Э.А., Капанадзе Б.И., Куприянова Н.С.,Иванова '.М.,Бродянский В.М., Нечволодов К.К., Шкутов Г.А., Рысков А.П., 1осиков В.В., Янковский Н. К. (1995). Анализ распределения икр о сателлитов семи мотивов в составе космид упорядоченной лонотеки хромосомы 13 человека. Молекулярная биология, 29 (5), 001-1010.

2. Э.А.Брага, Г.М.Иванова, Д.А.Чистяков, Л.И.Федорова, .М.Банников, А.С.Красильников, Р.Л.Турецкая, К.И.Ратманова, .П.Вейко, А.В.Зеленин, В.М.Захарьев, Н.К.Янковский.(1996). етрануклеотидные маркеры на основе космид упорядоченной пюнотеки хромосомы 13 человека. Молекулярная биология, в гчати.

3. Брага Э., Иванова Г., Барышников В., Нурбеков М., нковский Н., Белявский А., Кольцова Г., Захарьев В. Метод отбора :нов, содержащихся в составе протеженных геномных эследовательностей. Тезисы 4-й конференции "Геном человека", 12-13, Черноголовка (март 1994).

4. Брага Э., Иванова Г., Седлов Е., Нурбеков М., Носиков В., апанадзе Б., Баранова А., Янковский Н., Белявский А., Захарьев В., ольцова Г. Потенциальные полиморфные маркеры на 13-й

хромосоме из геномной и кДНК-овой клонотек. Тезисы 4 конференции "Геном человека", с. 14-15, Черноголовка (март 1994).

5. Брага Э.А., Иванова Г.М., Котова Е.Ю., Аксенова M.I Капанадзе Б.И., Янковский Н.К., Носиков В.В., Дебабов В. Полиморфные STR-маркеры в картировании генома человек Материалы 1-ого Всероссийсвого съезда медгенетиков, 4.1, Моею (декабрь 1994).

6. Braga Е.А., Chistyakov D., Ivanova G., Zakhariev ^ Krasilnikov A. , Yankovsky N. Novel GATG-rich microsatellites locat< on chromosome 13: allele polimorphism in a Russian population -Moscow, 27th Annual Meeting of the European Society of Hum; Genetics, Berlin, Germany, C-2, p. 161, (May 1995).

7. Braga E.B., Chistyakov D.A., Ivanova G.M., Nosikc V.V.,Kapanadze B.I., Aitova S.S., Sulimova G.E., Yankovsky N.K Zakhariev V.M., Fedorova L.I., Kost- Alimova M.V. , Zelenin A.1 Chromosome 13 specific cosmid library studies. Third Internation Chromosome 13 Workshop, Agenda, (October 1995).

8. Иванова Г.М., Чистяков Д.А., Брага Э.А. Создан! полиморфных маркеров на основе рекомбинантных kocmi-хромосомы 13. Тезисы III научной конференции ГНЦ "ГосНИ генетика", стр.30, (май 1995).

9. Braga Е., Chistyakov D., Ivanova G., Kotova E., Nosikov \ Kapanadze В., Yankovsky N., Fedorova L., Krasilnikov A., Bannikc V.,Zakhariev V., Zabarovsky E., Zelenin A., Kisselev L. Tri- ar tetrameric microsatellite markers on chromosome 3 and 13 maps. 281 Annual Meeting of the European Society of Human Genetics, London, ] 97, (April 1996).

10. Иванова Г., Аксенова M., Ефремов И., Чистяков Д., Bpai Э. Маркеры мотива GATG на длинном плече хромосомы 13 и в зог 13q34 с повышенным содержанием генов; возможная ассоциащ GATG- маркера D13S699 (13ql4) и EST мозга HS0073, содержащег CAG-повтор, с шизофренией. Тезисы 4-ой научной конференци ГНЦ "ГосНИИ генетика", (апрель 1996).

11. Braga Е., Chistyakov D., Ivanova G., Fegorova L Krasilnikov A., Zelenin A., Zakhariev V., Zabarovsky E., Yankovsky N Kisselev L. Tetra- and trimeric markers on chromosome 3, 13 and 3p21. maps. HUGO'S Human Genome Meeting, Heidelberg, p. 14, (Marc 1996).