Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование хромосомы 13 человека: анализ хромосом-специфических космедных клонотек и распределение в них повторяющихся последовательностей различных типов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование хромосомы 13 человека: анализ хромосом-специфических космедных клонотек и распределение в них повторяющихся последовательностей различных типов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ им. Н.И. ВАВИЛОВА

на правах рукописи УДК 575.1: 599.9

КАПАНАДЗЕ Баграт Иосифович

НССЛЕДОВАШСЕ ХРОМОСОНН 13 ЧЕЛОВЕКА: АНАЛИЗ ХР<ЙЮСОМ~ СПЕЩЙНЧЕСКИХ КОСЯЩНЫХ КГОНОТЕК И РАСПРЕДЕЛИПЕ В НЗГХ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ РАЗЛИЧНЫХ БОТОВ

Специальность 03.00Л 5-генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 1996г.

Работа выполнена в лаборатории анализа генома Института Общей Генетики РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Янковский Н.К.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук П. Л Иванов

доктор биологических наук О.В.Евграфов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Институт Молекулярной Биологии РАН

Защита состоится"_м' : ' • ■ ""'1996 г. в__часов

на заседании диссёртационого Ученого Совета Д 002. 49101 при Институте Общей Генетики им Н.И. Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва, В-333, ул.Губкина,3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотек® Института Общей Генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан"__"_1996 г.

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат биологических наук

ПОЛУХИНА Г.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертаций. Одной из ведущих научных программ нашего времени является всемирная преграда "Геком человека", направленная на молекулярно-генетическое исследование генома человека вплоть до определения полной последовательности нуклеотидов всех его хромосом. В нашей стране для работ в этом направлении была создана Государственная Научно-Техническая Программа "Геном человека". Работы по ГНШ ведутся в рамках Проектов, часть из которых непосредственно направлена на исследование отдельных хромосом человека. Данная работа выполнялась в рамках Проекта "Картирование хромосомы 13 человека".

До настоящего времени приоритетными по программе "Геном человека" в мире и в России являлись, в частности, два направления работ. 1) Построение физических карт генома человека, представленных в виде наборов перекрывающихся последовательностей рекомбинантных ДНК (контигов), расположенных известным образом вдоль хромосом человека. Относительно элементов коптига, клопов, картируют отдельные гены или мутации, в первую очередь представляющие интерес для фундаментальных научных исследований, а также для медицины. 2) Создание молекулярно-генетических маркеров, главным образом на основе простых тандемных повторов (STR) для генетического и физического картирования генома человека, а также для ДНК диагностики наследственных заболеваний человека.

Формирование физической карты проводится на основе хромосомспецифических библиотек клонов. Наиболее распространены и глубоко охарактеризованы библиотеки, созданные на основе космидных векторов из хромосом, очищенных на хромосомном сортере. Такие библиотеки созданы в частности в Лос-Аламосской Национальной Лаборатории (LANL), и в Фонде раковых исследования (ICRF), Великобритания- Эти библиотеки сконструированы и для хромосомы 13 человека, но ни одна из них не была охарактеризована к началу данной работы. Такая характеристика библиотек, наряду с подготовкой молекулярно-генетических маркеров на их основе, явилась первоочередной задачей по проекту "Картирование хромосомы 13 человека" ГНТП "Геном человека" и составила главную цель исследования, проведенного в диссертационной работе.

Дель исследования - анализ хромосомспецифических космидных клонотек по 13-й хромосоме человека и оценка их качества для физического картирования; выявление в этих библиотеках и характеристика космид, содержащих микросателлитные повторы для создания молекулярно-генетических маркеров 13-й хромосомы

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследование и сравнительный анализ характеристик специфичных по хромосоме 13 космидных библиотек ЮУ С108 и ШЗЖХ)1: определение количества и проверка жизнеспособности клонов этих библиотек; рестрикционый анализ и определение размеров рекомбинантных космид; определение степени хромосомспецифичности библиотек; гибридизационная характеристика панели, клонов библиотек и построение контига в области гена АТР1АЫ.

2. Выявление в космидных библиотеках и исследование распределения повторов различных типов для создания молекулярно-генетических маркеров хромосомы 13 человека: выявление Ь"Г1?-повторов девяти различных мотивов в составе рекомбинантных космид; исследование кластеризации ЭТИ различных мотивов в составе рекомбинантных космид; выявление-и анализ копийности генов рДНК в индивидуальных хромосомах 13 человека; выявление и анализ полиморфизма, связанного с генами рДНК 13-й хромосомы; анализ БТ^состава космид, несодержащих рДНК.

3. Формирование набора БТй-содержащих космид и их локализация е уникальных областях 13-й хромосомы.

Научная новизна и практическая значимость полученных рузультатов. Определено количество и жизнеспособность клонов в двух специфичных по хромосоме 13 космидных библиотеках - ШИР С108 и ШЗМСШ. Проведен рестрикционый анализ и определены размеры Солее чем 700 рекомбинантных космид, представляющих в совокупности более 1/6 части хромосомы 13 человека и являющихся охарактеризованными точками роста для создания космидного контига этой хромосомы. Экспериментально определена представительность этих библиотек и степень их хромосомспецифичности. Построен контиг космид в области гена АТР1А1Л. Все исследованые характеристики показали пригодность библиотек ЮКГ и ЬАНЬ для построения космидных контигов.

Гибридизацией с STR-зондами 9 мотивов (GA, CAG, CCG, САС, TCG, GGA, GACA, 6AGT и GATG) идентифицированы 7501 положительных космидных клонов, доступных для создания молекулярно-генетических маркеров 13-й хромосомы человека на основе выявленных клонов. Обнаружен феномен кластеризации SIR различных мотивов в составе рекомбинанмшх космид, связанный с их присутствием в повторяющихся последовательностях размером со вставку в космидах. К таким повторам относятся гены рДНК и повторы не менее одного нового Tima. Определена копийность генов рДНК и показано почти 5-кратное различие в числе этих генов в двух индивидуальных хромосомах 13 человека, составившая 41 копию в источнике хромосомы для кос>щд ICRF и 1ЭД копта - з источнике для космид LANL. Выявлен полиморфизм генов рДНК 13-й хромосомы, проявляющийся на нескольких уровнях. Показано, что микросателлитные мотивы CAG и GATG имеют предпочтительную локализацию в прителомерном районе хромосомы 13 (q32-34), относительно менее насыщенном генетическими маркерами. Для 36 космид, содержащих STR маркер, установлена цитогенетическая локализация на хромосоме 13 как единственная в геноме человека. Информация об этих космидах передана в международную базу данных по геному человека (6DB), где эти космиды получили идентификационные D-номера.

Создана общедоступная база данных библиотек LANL и ICRF, которая позволяет интегрировать результаты, получение нами и другими исследователями. Все 28500 клонов двух библиотек переданы на хранение и доступны в Всеросийской коллекции промышленных микроорганизмов при ГосНииГенетика.

Результаты работ по диссертации использованы по сотрудничеству в рамках проекта "Картирование хромосомы 13" в лабораториях ИМЕ РАН, ИБГ РАН, ИВХ РАН, ГосНииГенетика и ВНЦГО Минздрава РФ, а также в рамках международного проекта "Картирование хромосомы 13" в лабораториях Фонда исследований рака, Великобритания.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах и составлена по традиционному плану. Полученные данные иллюстрированы 5 рисунками и 14 таблицами.

Апробация работы. Результаты работы опубликованы в 20 статьях в отечественных и зарубежных журналах, а также докладывались на международных и отечественных конференциях по программе "Геном че-

ловека" в 1994 и 1995 гг.

Работа выполнена в рамках планов и при финансировании со стороны следующих программ: 1) ГНШ РФ "Геном человека", проект "Картирование хромосомы 13 человека"; 2) Миннауки РФ, проект по международному научно-техническому сотрудничеству с Genome Analysis Laboratory, ICRF, UK и Haemathology and Oncology Laboratory, ICRF, UK; 3) US Department of Energy "Human Genome Project" grant »0R00033-93C13016^ ,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

. 1. ИССДВДОВАНИЕ КОСЩДНОЙ БИБЛИОТЕКИ ICRF С108 DH5 U/FS 13.

Библиотека ICRF С108 размещена в 13824 ячейках 144 контейнеров .-.. . 96-луночных иммунологических планшетов. Для последующих работ были созданы 2 копии исходной клонотеки. Живых клонов выявлено 12854 (92Z от всех заложенных на хранение). Из более чем 500 клонов библиотеки ICRF была выделена космидная ДНК и получены электрофореграммы рестриктов (рестрикционные портреты) этих космид по двум рестриктазам (EcoRI и HindIII). Размер каждого рестрикционного фрагмента и суммарный размер космид введены в базу данных. Вставку содержали 96% космид ICRF и средний размер вставки составил 35.4 т.п.н. Размер 83% космид ICRF соответствует размеру молекул ДНК, способных к упаковке в капсид фага ламбда In vitro (27 -54 т.п.н.), и вставки в них могут соответствовать по структуре нативной ДНК человека.

Совместно с сотрудниками лаборатории А.В.Зеленина (ИМБ, Москва) и Дк.Каузлла (ICRF, London) была проведена оценка хромосрмспецифичности библиотеки ICRF С108 путем локализации 44 рекомбинантных космид данной библиотеки методом флуоресцентной гибридизации In situ (FISH) на метафазных хромосомах человека. Около 95% (42 из 44) локализованых космид гибридизировались с

хромосомой .13,.....тогда как доля 13-й хромосомы в геноме человека

составляет около 3%.

Размер.13-й хромосомы равен 114 млн.п.н. При данном размере вставки (35,5 т.п.н.) 1 эквивалент генома хромосомы 13 соответствует 3220 рекомбинантным космидаы ICRF. Соответственно 12854 космид ICRF содержит 3.8 эквивалента генома хромосомы 13

(учитывая 95% хромосомспецифичность).

Для гибридизационых анализов были созданы так называемые панели клонов - найлоновые фильтры, на которых упорядочение и воспроизводимо нанесена иммобилиаированная рекомбинантная ДНК. Аликвоты суспензии клеток переносили с помощью специальных щеток-репликаторов, позволяющих разместить с высокой плотностью 1536 клонов из 16 иммунологических планшетов на фильтре размером 125x85 мм. Полная библиотека 1СИ7 (12854 живых клона), умещается при этом на 9 фильтрах. Гибридизация всех клонов панели с данным зондом проводится одновременно, а результаты гибридизации учитываются для ¡саадого из индивидуальных клонов (всего - более 12000). Технология создания и использования панелей клонов такого масштаба освоена в нашей стране впервые в рамках данной работы.

Мы провели гибридизацию 25 различных уникальных ДНК зондов, специфичных для хромосомы 13 , с панелью космидных клонов библиотеки 1СИг и выявили 93 позитивных клона. Среднее число клонов, перекрывающих точечный зонд (2,6 клонов), оказалось примерно в 1,5 раза меньше, чем ожидаемое исходя из данных рестрикционного анализа (3,8 клонов). Номера зондов и позитивных клонов приведены в рукописи диссертации, а также хранятся и доступны из базы данных. Пример гибридизации панели клонов и гибридизации по Саузерну на уникальный зонд приведен на рис. 1.

Для 23 из 25 зондов в исследованной выборке выявлен хотя бы один гибридизующийся клон. Таким образом, экспериментально определенная представительность библиотеки ¡СНГ С108 по гибридизационныы данным составляет около 92%, что близко к оценке, полученной на основе рестрикционного анализа. Космиды и их группы, выявление гибридизационными зондами известной хромосомной локализации, являются исходными островками физической карты, покрывающими определенную часть хромосомы, и являются стартовыми площадками для роста контигов путем шагания по хромосоме в данной области.

Мы продемонстрировали возможность построения протяженного контига с использованием библиотеки ¡СИ7 на участке хромосомы 13д12.3, содержащем ген АТР1Ы (кодирующий На+К+АТФазу). Интерес к физическому картированию этой зоны определяется тем, что в ней находятся гены, дефект которых приводит к наследственной глухоте у человека. Поэтому клонирование соответствующих генов и создание диагностикума на это заболевание представляет кроме научного еще и

А /;.

С :

О

Е

Н " ;

С;

Н

1

* *■ ?3

л

■ л ■

» * * * *

Рнс.1 а. Радиоавтограф фильтра № 4 панели клонов библиотеки (СЯР, гибридизованной с зондом 0.8Н11/1. Стрелкой отмечен позитивный сигнал от кос-млды 74А11.

4 5 6 7 8 9 10 11 12

12 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

Рнс.1 б.

Электрофореграмма рестриктов космид библиотеки КЖР 74А11, 14Н2, 11403, гибридизующихся с зондом 0.8Н11Л. а) -фрагменты ДНК в геле, окрашенные бромистый этндием (стрелками отмечено положение фрагментов, выявляемых как позитивные при блот-шбридизацин; б} - радиоавтограф результатов блог-гибри-днзадии по Саузерну на зонд 0.8Н 11/1.

Дорожки: 1 - 74А11/ 2 - 14Н2/ 3- 11403/&«Я1; 4 - ЛЛ-фрагменты ДНК фага к;

5 - 74А1 1/НЫШ;

6- ИН2Я//«ЛМ;

7 - 1 \4D3IHinMl

практический интерес.

Мы выявили позитивные космиды (рис. 1 а, б) для каждого из трех использованных зондов на этот ген (фрагменты ДНК ?.,1К313/2, 0.8Н11/1 и 0.6Н11/1,). Четыре космиды (12802, 74Н2, 56БЗ, 6801) из семи позитивных были помечены методом рассеянной затравки и использованы для гибридизации с панелью клонов всей библиотеки Юй7. Результаты гибридизации панели ¡сполов представлены в табл. 1 и подтверждены Саузерн-гибридизацией для всех 12 выявленных космид. Полученные данные позволяют расставить космиды в последовательности: 2764 ?СЗ 128С2 50ПЗ 98Р? У4А11 11403 74Н2 63В1 89Н8 89Л5 Ю4В7, при которой ориентация контига соответствует ориентации гена АТР1АЫ в хромосоме 13. Четыре космиды данного контига, суммарная длина вставок в которых составляет 144,5 т.п.н. (космиды 2704, 56БЗ, 74Н2, 104В7), практически не перекрываются (см. табл. 1 и рис. 2), и мы полагаем, что контиг имеет протяженность не менее 150 т.п.н. Зонды, соответствующие концевым экзонам гена АТР1А1Л, не гибридизируются с концевыми космидами контига (27Б4 и 104В7, см. табл. 1). Вероятно ген АТР1АЫ перекрывается сформированным контигом полностью. Размеры областей, фланкирующих ген АТР1АЫ в контиге (около 30 и 40 т.п.н. с 5'- и 3'-конца соответственно) соизмеримы с размером участка, приходящегося на один ген в хромосомах человека (около 50 т.п.н.), и полученный контиг соответствует по размеру примерно 3 генам.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ КОСМИДНОЙ БИБЛИОТЕКИ LANL13NC01 Библиотека LANL13NC01 размещена в 16896 ячейках 176 планшетов. Созданы 2 копии исходной клонотеки. Живых клонов выявлено 16220 (95% от всех заложенных на хранение). Из более чем 200 клонов библиотеки LANL была выделена космидная ДНК и получены рестрикционные портреты этих космид по двум рестриктазам (EcoRl и Hindi 11) - Вставку содержали 98% космид LANL и средний размер вставки составил 37.1 т.п.н. Размер 93% космид LANL соответствует размеру молекул ДНК, способных к упаковке в капсид фага ламбда in vitro (37 - 54 т.п.н.), и вставки в них могут соответствовать по структуре нативной ДНК человека.

При данном среднем размере вставки (37,1 т.п.н.) 1 эквивалент

-ю-

Таблица 1. Гибридизационный анализ космид библиотеки ЮИ7 С108, перекрывающих ген АТР1АЫ

Космиды панели. Зонды

номер .размер,. 2.115313/2 0.8Н11/1 0.6Н11/1 12862 5603 74Н2 6801 .т.п.н. .

2764 • 33,6 . 0 0 0 + 0 0 0

7Е9 38,9 . 0 0 0 + + 0 0

12862 • 34,7 . + 0 о + + 0 0

561)3 33.1 . + о 0 + + 0 0

98Р7 39,1 . + + о + + + 0

74А11 38,8 . 0 + + 0 + + +

11403 41,5 . 0 + + о 0 + +

74Н2 • 36,5 . 0 + + 0 0 + +

6801 # 35,3 . 0 0 + 0 0 + +

89Н8 « 39,0 . 0 0 о о 0 + +

89А5 « 37,9 . 0 0 0 о 0 + +

104В7 • 41,3 . 0 0 0 о 0 0 +

"+" - наличие гибридизации, "о" - отсутствие гибридизации Рисунок 2 Схема космидного контига в области генп АТР1АЫ

2764

98Р7

—х-----------х—

. 74А11

------х-----х-

104В?

Косм, пробы

769

89А5 89Н8

----------- . 114133 . . ------

—X-----X--------

12862 . 74Н2 .

56Ш . . . 68Б1 "

Плазм, пробы

2.1К513/2 5'-нетранслируемая область гена АТРА11

х х 0.8Н11/1 экзон 13

0.6Н11/1 экзоны 20-21

генома хромосомы 13 соответствует 3072 рекомбинантным космидам Соответственно 16200 космид ICRF содержат-5,2 эквивалента генома хромосомы 13.

Мы провели гибридизацию 14 различных уникальных ДНК зондов, специфичных для хромосомы 13, с панелью космидных клонов библиотеки ЬЛМЬ и выявили 70 позитивных подтвержденных блот гибридизацией клонов (данные получепы совместно с В. Бродянским, ИОГен РАН). Номера зондов и позитивных клонов хранятся и доступны из базы данных. Для 13 из 14 зондов в исследованной выборке выявлен хотя бы один гкбридизугзеийся клон. Таким образом, зксттершентально определенная представительность библиотеки ишь составляет около 93%.

Среднее число клонов, перекрывающих точечный зонд (5 клонов), соответствует ожидаемому исходя из данных рестрикционного анализа (5,2 клонов). Однако количество положительных клонов для каждого зонда сильно варьирует (от 0 до 12 для зондов АРМ203ха1 и 013331 соответственно)

Полученные нами результаты показывают высокое качество обоих исследованных космидных библиотек и их пригодность для получения контига космид, перекрывающего 13-ю хромосому человека. В общей сложности охарактеризованные нами космиды представляют информацию о рестрикционных портретах по двум рестриктазам для более чем 20 млн. пар нуклеотидов (более 1/6 части хромосомы 13 человека). Среднее растояние между концами охарактеризованных нами космид в хромосоме 13 составляет около 150 т.п.н. и они являются охарактеризованными точками роста для создания космидного контига 13-й хромосомы.

Клоны, не обнаруженные в библиотеке 1СЯГ (для 2 зондов -Н1-26 и Н1-2) идентифицированы в библиотеке ЬАМЬ, а в случае отрицательного результата скрининга в библиотеке ЬАНЬ ( зонд АРМ203ха1, положительные клоны были обнаружены в библиотеке 1С1?Г. Непредставленность отдельных участков хромосомы 13 в каждой из библиотек мажет быть связана с причинами ¡сак статистического, так и биологического характера. Использование обеих библиотек, созданных на векторах разных типов (Со1Е1 репликон в ЬАИЬ и репликон фага лямбда в ЮТ7), позволяет обеспечить большую непрерывность при построении физической карты хромосомы 13.

- is -

3. ВЫЯВЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВТОРОВ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ В ХРОМОСОМЕ 13 ЧЕЛОВЕКА.

Для создания молекуля рно- гентических маркеров в геноме человека наиболее часто используются динуклеотидные микросателлиты мотива CA. Более удобными для применения являются маркеры .с большей длиной мономера - три- и тетрануклеотидные микросателлиты. Тринуклеотидные STR особенно интересны как основа для создания генетических маркеров, поскольку их экспансия является одним из механизмов формирования мутаций, приводящих к наследственным заболеваниям. Тетрануклеотидные STR как правило оказываются более высокополиморфными по сравнению с тринуклеотидными STR. Для исследования мы выбрали как три-, так и тетрануклеотидные микросателлиты нескольких мотивов. Встречаются эти STR значительно реже, чем динуклеотидные, однако их выявление в каждой из космид ICRF и LANL достигается в результате всего одной гибридизации из-за использования панелей клонов. Кроме того, обе библиотеки космид были проскринированы на содержание последовательностей рибосомной ДНК (рДНК) й альфасателлитной ДНК.

Выявление STR-повторов девяти различных мотивов в составе рекомбинантных космид хромосомы 13. Библиотеки рекомбинантных космид хромосомы 13 человека были проскринированы на содержание последовательностей микросателлитов 9 мотивов: SA, GAG, CCG, САС, TCG, GGA, 6ACA, GACT и GATG. Библиотека ICRF была проскринирована по микросателлитам GÂ,4 CÁ6, САС, TCG, GGA, GACA, GACT и GATG; библиотека LANL проскринирована микросателлитами САС, TCG, GSA, САБ, CCG, GACA и GATG. Часть данных на библиотеке ICRF по зондам GACA и GSA получена совместно с Н. Куприяновой (ИБГ РАН), а по зонду 6АТ6 - совместно с Н.Брага (ГосНКИГенетика).

На рис 3 приведен пример результатов опыта по выявлению STR-содержащих космид путем гибридизации панели клонов и гибридизации по Саузерну с меченным олигонуклеотидным зондом.

Число и доля микросателлит-содержащих, а также рДНК и альфа-сателлитных клонов в библиотеках LANL и ICRF указаны в таблице 2.

Л

£*

»

Л* а «V» * ■ '

!' ♦ • » • 4 у • О • *

* » в »"

I

"П

А В

С

о

Е Г

6 н

8 9 10 11 12

~ " -О " ° ■

О о ССР О с'°

'.'• ■. '■ о

123456? 89 10 1112 131415161718

Рис.3 А-Радиоавтограф фильтра с панелью клонов библиотеки ГСКГ, гибридизованой с олнгонугаеотидом(СА6)5. Б- Радиоавтограф результатов блот-гибридизации по Саузерну ДНК позитивных космид с тем же олигонуклеотидом. 1-67Б6; 2-16В2; 3-78Е6; 4-20В6; 5-70Н2; 6-18139; 7-19А8; 8-23Е10; 9-78Н5; 10-98В4; 11-99ГЗ; 12-10Ю10; 13-11865; 14-13703; 15-144612; 16-107А12; 17-1726; 18-168612.

Таблица 2. Число и доля микросателлит-содержаадх, а также рДНК и альфа- сателлитных клонов в библиотеках LANL и 1CRF.

- ICRF, 12500 клонов. LANL, 16000 КЛОНОВ.

. Мотив . Позитивные клоны . Позитивные клоны .

• число . доля, X . число . доля, % .

. CAG . 217 . 1.9 308 . 1.9

. GATS . 136* . 3.2 294* . 2.9

. 6АСА . 253 . 2.0 1133 . 7.1

. GGA . 781 . 6.2 1742 . 10.5

. САС . 225 . 1.8 779 . 4.9

. GACT . 328 . 2.6 - . -

. ста . - - 714 . 4.5 . .

..рДНК . 194 . 1.6 1144 . 7.1

.: a-sat . 12 . 0.1 40 . 0.25

* В библиотеке ICRF было проскринировано 3 фильтра (4167 клонов), в библиотеке LANL - 7 фильтров (10181 клон),

Номера клонов, для которых мы определили ответ на каждый из гибридизационных зондов, приведены в рукописи диссертации и в базе данных CLONE (Миронов A.A., ГосНИИГенетика), а также переданы в общедоступную базу данных RLDB (Reference Library Data Base, H.Lehrach, ICRF). В общей сложности определены и введены в базы данных около 240 ООО гибридизационных характеристик исследованных космидных клонов.

Исследование кластеризации STR различных мотивов в составе рекомбинантных космид хромосомы 13. Анализ содержания общего количества микросателлитов в каждом отдельном клоне показал, что во многих клонах встречаются одновременно по несколько STR.

Отметим, что данный феномен не может быть выявлен при анализе неупорядоченных клонотек и выявляется только при использовании метода работы с панелями клонов, где результаты гибридизации учитываются по каждому клону, имеющему известные координаты на фильтре и номер в коллекции.

Феномен кластеризации STR выявляется как в библиотеке ICRF (табл. За), так и в библиотеке LANL (табл. 36), что указывает на особенности структурной организации повторов в самой хромосоме 13, а не просто отражает частную особенность одной из библиотек. Другими словами, STR-локусы сблочены друг с другом и образуют кластеры на урсмсссмо 13 в пределах участков размером 30-40 kb.

Из табл. 3 видно, что с возрастанием числа STR-мотивов на клон порядок превышения экспериментальной частоты встречаемости клонов, содержащих одновременно STR двух и более мотивов, над теоретической возрастает от нескольких раз (для сочетания двух и более STR-локусов) до почти миллиона раз (для сочетания 6 локусов).

Анализ частоты встречаемости каждого из типов попарных сочетаний STR-маркеров среди исследованных космидных клонов показал, что независимое распределение наблюдается только для STR мотива GATG относительно STR остальных S мотивов (GA, САС, CAG, CCG, TCG, GGA, BACA, и GACT). Для всех остальных попарных сочетаний частоты совместной встречаемости STR разных мотивов достоверно превышают частоты, рассчитанные из предположения об их независимом распределении по клонам библиотеки.

Анализ частот встречаемости клонов, содержащих определенные сочетания микросателлитов двух и более мотивов показал, что в обеих библиотеках наиболее часто встречаются попарно мотивы GACA, САС и ТСС. Среди клонов, содержащих три и более мотивов (от 3 до 6 в одном клоне), эти же мотивы образуют основную часть. Таким образом множественные сочетания микросателлитов во фрагментах размером 30-40 kb не случайны по составу входящих в эти сочетания мотивов.

Обнаруженная кластеризация микросателлитов может быть связана с выявлением повторяющейся последовательности или семейства разных последовательностей хромосомы 13, содержащих определенный набор мотивов. Данный феномен может проявляться, если длина такой последовательности (или длина более коротких, но

Таблица 3. Частоты встречаемости клонов 1СКР (А) и ЬАЖ. (В), содержащих одновременно двух и более мотивов.

.Кол-во .мотивов .на клон Кол-во. клонов.- юи? . Доля клонов зксп./ . /теор. .

эксп. теоретич.

. >1 240 . .02 .005 4 .

. >2 96 . .008 .0001 80 .

. >3 48 . .004 .000002 2000 .

. >4 24 . .002 .00000002 100000 .

. >5 1 . .00008 .0000000001 800000 .

(Б)

Кол-во мотивов на клон Кол-во клонов 1Ж Доля клонов .Зксп./теор

зксперим.. теоретич.

>1 746 .046 . .0025 . 18

>2 399 .024 . .00013 . 180

>3 152 .0095 . .000003 . 3200

>4 11 .00068 . .00000015 . 4500

тандемноповторящихся последовательностей) равна или превышает длину вставки в космидах (около 35 kb в данном случае). По крайней мере одна такая повторяющаяся последовательность есть в хромосоме 13. Это тапдемный повтор, содержащий гены рДНК. Размер монсмеркой единицы этого повтора составляет 43 kb.

Выявление и анализ копийности генов рДНК в индивидуальных хромосомах 13 человека. Используя гибридизацию панели клонов обеих библиотек, мы выявили космиды, содержащие рДНК, определили копийность генов рДНК в хромосомах 13 клеточных линий, из которых были получены космидкые библиотеки, и проанализировали распределение STR и их сочетаний в подвыборке рДНК-содержащих и рДНК-несодержащих космид. Кроме того, мы охарактеризовали клоны этих библиотек по присутствию альфа-сателлитного повтора.

Из данных табл. 2 видно, что тандемные. повторы (рДНК и альфасателлитные последовательности) присутствуют. .. в двух исследованных библиотеках и, вероятно, исходных хромосомах 13 в разном количестве копий. В источнике ДНК для библиотеки 1CRF, по сравнению с LANL, число рибосомных генов в 4,6 раза меньше, а число альфа-сателлитных последовательностей в 2,5 раза больше. Полученные данные указывают на полиморфизм хромосомы 13 по числу копий повторов исследованных типов.

Выявление и анализ полиморфизма, связанного с генами рДНК 13-й хромосомы. Клоны каждой из космидных библиотек ICRF и LANL были приписаны к одной из двух групп: клоны, содержащие фрагменты рДНК (194 клона ICRF.h 1144 клона LANL, в которых соответствено зарегистрировано 659 и 3089 сигнала от микросателлитных зондов), и клоны, не содержащие фрагменты рДНК, в которых зарегистрированы 1531 сигнал (ICRF) и 2227 сигналов (LANL).

Обращает на себя внимание тот факт, что в составе рДНК-содержащих клонов, составляющих лишь около 2-7% от всех клонов (ICRF и LANL соответственно), выявляется непропорционально большая часть микросателлитов: около половины всех сигналов GACA, треть - САС, GACT и ТСС, десятая часть - TCG. Лишь мотив SATG, обнаруженный в единственном рДНК-содержащем клоне, является исключением.

Микросателлиты мотивов GACA и GGA встречаются, вероятно,

практически в каждой из копий рДНК мономера. Это указывает на появление этих микросателлитов в составе рДНК до этапа их амплификации в хромосоме 13, и, возможно, на важную роль этого структурного элемента рДНК-мономера в функционировании каждого из мономеров рДНК. Мотивы САС, GACT и CCG имеются более чем в половине копий рДНК, но в части копий определенно отсутствуют.

Мотивы 6АТ6 и СА6, обнаруживаются в 1-5% рДНК-содержащих клонов (1 - 10 локусов на блок из 41 - 190 рДНК повторов). Представленность данных двух мотивов лишь в небольшой части из всех рДНК генов может указывать на специфическую роль (дифференциальную регуляцию) этого подкласса генов рДНК. Хотя возможно и противоположное объяснение, например, то, что данный подкласс рДНК повторов представляет собой псевдогены.

Саузерн-блотинг выявил присутствие в составе отдельных мономеров множественных локусов не только разных мотивов, но и по несколько локусов одного и того же мотива, например GACA, в рДНК-содержащих космидах. Только в двух из 12-ти космид мотив GACA присутствует в единичном рестрикционном фрагменте; в остальных 10 космидах мотив GACA имеется в нескольких (2 - 4) рестрикционных фрагментах. Сходная картина наблюдается для повторов САС и 6GA. Таким образом, в мономере рДНК могут присутствовать по несколько нетандемных копий каждого из 3 упомянутых микросателлитов.

Таким образом мы выявили полиморфизм, связанный с генами рДНК на нескольких уровнях: 1) по количеству копий мономера рДНК в гомологичных хромосомах, 2) по количеству и составу STR-локусов в составе разных мономеров в одной и той же хромосоме 13. Не исключено и существование третьего, "традиционного" типа полиморфизма - по числу мономеров в STR одного и того же локуса в одном и том же мономере рДНК. Однако не представимо, как последний случай полиморфизма может быть экспериментально зарегистрирован.

Множественная представленность STR-содержащего локуса в геноме может оказаться основой нового инструмента ДНК-индивидуализации человека с помощью ПЦР. Например, микросателлит в составе разных мономеров рДНК может быть фланкирован одной и той же последовательностью нуклеотидов, пригодной для подбора праймеров, а число мономеров, составляющих микросателлит, может оказаться разным в разных мономерах рДНК. В этом случае ПЦР-продукт, получаемый при использовании всего одной пары

праймеров, может выявиться как набор полос (или профиль из многих полос) характерный для индивида.

Анализ STR-состава космид, не содержащих рДНК. В данном разделе проведен анализ STR-состава космид несодераащих рДНК, поскольку именно эти космвды представляют интерес как материал для создания молекулярно-генетических маркеров для неповторяющихся участков 13-й хромосомы человека. Всего в таких клонах зарегистрирован 1531 сигнал (ICRF) и 2227 сигналов (LANL) от микросателлит-ных зондов всех использованных мотивов. В таблице 4 приведены частоты встречаемости и средние расстояния STR-локусаыи одинакового мотива в ¡слонах, несодеркащих рДНК.

Табл. 4.Микросателлиты в клонах,не содержащих рДНК: частоты встречаемости и средние расстояния между локусами одинакового мотива

ICRF LANL

. Мотив . . Позитивные клоны.Рассто-. Позитивные клоны.Рассто-.

. число . доля, %.яние Mb. число . доля. %.яние Mb.

. CAG . 213 . 1.7 . 2.1 . 288 . 1.8 .2.1

. GATG . 133* . 3.2 . 1.1 . 207* . 2.8 . 1.3 .

. GACA . 102 . 0.8 . 4.5 . 172 . 1.1 . 3.4 .

. GGA . 618 . 4.9 . 0.7 1067 . 6.7 . 0.6

. слс . 129 . 1.0 .3.6 . 155 . 1.0 . 3.7 .

. GACT . 247 . 2.0 . 1.8 . 247 . 1.5 . 2.5 .

* В библиотеке 1СРР было проскринировано 3 фильтра (4167 клонов), в библиотеке ЦШЬ - 7 фильтров (10181 клон),

Расстояния между выявленными . микросателлитами одного мотива составляют 0.6 - 5.3 млн.п.н., исходя.из допущения о равномерности распределения данных микросателлитов вдоль хромосомы 13. Один

какой-либо микросателлит приходится в среднем на одну из шести космид, т.е. среднее ожидаемое расстояние в хромосоме 13 между данными микросателлитами составляет около 200-300 т.п.н..

Из анализа частот встречаемости клонов, содержащих микросателлиты двух и более мотивов, среди не содержащих рДНК клоков также выявляется феномен сблоченности микросателлитов в пределах фрагментов размером 30 - 40 т.п.н. В табл. 5 приводятся частоты попарной совместной встречаемости микросателлитов различных мотивов в космидах, не содержащих рДНК и их превышение над случайным.

Таблица 5. Кластеризация STR некоторых мотивов в составе

космид 13-й хромосомы, не содержащих рДНК

Комбинация Число КОСМИД

STR-мотивов LANL ICRF

. эксп. теор.* Э/Т . эксп. теор.* Э/Т

САС+ЗАСА . 34 2 17 . 12 1 12

GGA+3ACA . 71 12 6 . 27 5 5

GGA+CAC . 49 11 4.5 . 31 6 5

CA03GA . 78 19 4.1 . 34 10 3.4

CAGfGAC . 11 3 3.7 9 2 4.5

*теор. - рассчитанное из предположения о независимом распределении

Мы предположили, что в данном случае, как и в случае с рДНК повторами, повышенная частота встречаемости космид с определенным сочетанием (кластеризация) ряда STR-мотивов выявляет новые типы повторов в хромосоме 13. Для проверки этой гипотезы была проведена (совместно с Л.Федоровой, ИМБ РАН) гибридизация in situ на метафазных хромосомах для 3-х космид, имеющих различные сочетания микросателлитных мотивов: 50Н5 (GGA, CCG, CAG, SACA); 92С4 (CAG, GGA, CCG) И 172C3 (CAS, GGA, CCG).

Клон 50H5 дает в большом количестве слабые сигналы, диспергированые по геному, а также сильные сигналы, исходящие от NOR районов акроцентрических хромосом. Вероятно, это новый тип

тандемного повтора, не гомологичный рДНК, поскольку м'от клон m* вдавядетси как pif.HK позитивный при гибридизации колоний. Тем но моле*, распределение: блоков повтора-атого тегта в Vohükv

ц^лор^кл СООТЬОТО'мЛаТ ППапр'г'Дааа!;1Ь rViOi:--.? рЛ!!К. -ÎT'j wavV V,-? ■<;£.îlTî lia ii'yHK'l.i:'iKUÎP'iVSi aiaiV. nOiiVOpüß ïiï'Oi'O типа л оДНК.

Клон 9?гм логплюзг.ап t: {».чГг'Н" , a ка«" п-'ут • •л.'^.ыг*

амгаала an i :-н> . Кдои Г/аСЗ дас!> миидестветад*1

uu-iidLîioi различной йетитои^'^тпт. да- ■ • «»>.•

¡';:kî;V I.а ач/ч.аа'! д.иай а-ролто-" vïi: учъирлдать, '•'¡" «-'Iii ли^миды, содержщие определенное -сочетание оачядап>"* STR-котиьов. furrp^f/ir-rra », „.тыш-нип» ^-.чл-ой, -<•» vre сгпд-'А-лт î-v*v»w г. псжтгл ь от повтора, соизмеримого по размеру с размером ветавго! в космйде. Увйдичешг* числа 3TR-зондов в гибридизациопном анализе- космид позволят, вердотно* выявить ношь îiûiu повторов в геноме человека.

Анализ частот попарных сочетаний разных STR-мотивов показывает, что лишь мотив 6ATG распределяется но космидам независимо от других мотивов. .Практически no г~т.\ч-..иих

üorfapHHK ''а^а'а:!;1;! ''".'г.'Д;.- Ги-'-Учи-"

aaaavaa I. ,Ч' •':••! ч • ..Л!:.;!.. " 'И.-г. I - - 'Л. -il.':' .а _>:. г,.

Г. '(,., ^y.i.f , va- va 'а......... аа а .-a; v

il. a:,,:,, у,- \ '.а. .а а • : (. ! rvaa ■. л ■,<•. -wa а? ■ а/ а

¿ri-: , а ava;.. iv.: ':>■ !.;■ аа-а n-, а аа а; :■-. г-ааа:; ,. а. i-aa-.-м г. -а';1 ■■ a vvvvca - ava^--. a^vir.г> a/aa v,'

... -'„..<■ • ' .-, гг'Н i'l.4 . . .(aiüa :,a; ,., J,

«... i,tpi„. (.'я,: м-ipa-'ija-i. ia и хримоссш человека- На

основе шомид, содержащих wmpGcarejuiimi ¡эдгт^ :.rvrrr. . •'•..!

а: ■ va. ' ! - • .-.а-. ;.

Нормирование набора GÎR содержащих юсмид и их локпдиаяпчч г

¿КйКаЛЬНЫХ гг.л" а;аа< - а:а.;. Яп-а ;.. ai:. /ача;а»:-;'; га-i .- ¡¡оа- aa /ааадаы »'iJrt \лйнн№

1.-иЬ!лгитно с .;! а^тг.-л-..'..:-.;. '".т: гдп .. а 1 , >и-л , а-а-

;■'•■■ м-, .'гaari'OV'.ia ( ■¡•-¡а;-\ча :: a;tia- а а а ¿х-Лиме

» ;« .i .--¡-.ч. a.-V'L-iiiü^nb ь табл. fi. Укавшшие коемэды, являются пшбодее ценным ксточнигсоы для получения на их основе молекулярйо-генетических STR-маркеров.

Таблица 6. FISH локализация на 13-й хромосоме человека рекомбинантных коемид содержащих STR.

Космида Мотивы Район Библиотека

1 50Н12 ТС6, CA, GACT P 11 ICRF

2 24Е12 TCG, GA.GACT р 11 II Ii

3 40А05 TCG q 14 II

4 47А06 — q 14 H II

5 45В06 - и— q 14 II Ii

6 06В12 САС q 21 II, , II

7 43Е05 GGA ql3-ql4, q31-q32 * 1*., ,1»

8 43Е05 q 31 - q 32 II II

9 50А03 CA q 32.3 - q 33.1 II,. , II

10 07Н08 GACT q 14 И „, ,1»

11 23А12 q.33 - q34 II. II

12 32Е08 q 22 - q31 И II

13 98А02 — q 13 - ql4, q21 * И II

14 98А04 q 13 - ql4 «1 II

15 98А06 q 33 - q34 II II

15 98G05 q 21 II., , ,1«

17 99А09 q 21 - q22 II , .11

18 99В08 q 12 - ql3 II, II

19 99Е09 — q 13 - ql4 II. Ii

20 102А11 q 13 - ql4 II «1

21 18В05 GATQ q 32 - q33 II , .11

22 19D05 q 21 II,, 1»

23 08Н03 — q 12 - ql3 II_M

24 28D02 q 12 - ql3 II.,.., II

25 29В02 — q 12 - ql3 II II

26 59В10 q 32 - q33 «_"

27 59Е09 q 32 - q33 II_II

28 59Е08 q 33 - q34 И , II

29 54С02 .и. q 33 - q 34 II 1»

30 132А05 САБ q 14 LANL

31 129А07 q 32 И_II

32 163В09 q 12 II , II

33 99F03 q 34 II И

34 03D07 ql2, q34 * II_II

35 61С11 q 34 II , II

36 99С07 q 14 II_II

* - дополнительный более слабый сигнал на хромосоме. ,.

Как следует из таблицы 6, космиды, содержащие микросателлиты СШ и 6АТв предпочтительно (56% , 9 космид) локализованы в районе 432-34, который составляет 20% длинного плеча хромосомы 13. Прителомерный район хромосомы 13 относительно менее насыщен генетическими маркера»«!, что делает локализованные ЗТР-содержащие космиды особенно ценным источником получения генетических маркеров для поиска генов и диагностики наследственных заболеваний, определяемых данной областью хромосомы 13. Другие ЗТЯ-содержащие космиды представлены, в основном, мотивом (ЗАСТ. поэте??/ »¿стю только говортга, что этот мотив распределен вдочь хромосомы 13 без ннра*еной неравномерности.

ВЫВОДЫ

1) Охарактеризованы две специфичные по хромосоме 13 человека космидных библиотеки - ICRF С108 и LANL LA13N'C01: показано, что объем клонотек составляет 3,8 и 5,2 эквивалента хромосомы 13 (12500 и 16000 клонов соответственно). Рассчетная вероятность обнаружения клона, соответствующего уникальной последовательности в этих библиотеках составляет >99%, а экспериментально определенная - 100% (по 34 зондам). Определены размеры рестрикционных фрагментов (EcoRI и HindiII) для более чем 500 космид ICRF и 200 космид LANL, представляющих в совокупности более 20 млн. пар нуклеотидов (около 1/6 части хромосомы 13 человека). Среднее расстояние между концами охарактеризованных нами космид в хромосоме 13 составляет около 150 т.п.н. и они являются начальными точками роста для создания космидного контига

13-й хромосомы. Не более 93% (LANL) и 87% (ICRF) вставок в космидах могут соответствовать нативной хромосоме 13 по структуре. Показано, что около 95% (42 из 44) локализованных космид библиотеки ICRF гибридизировались с хромосомой 13.

2) В целом качество клонотек ICRF и LANL высокое и достаточное для построения физической карты на их основе, представленной в виде космидного контига. Построен контиг космидных клонов (ICRF) размером более 150 т.п.н., перекрывающий ген ATP1AL1 (Na+,K+ АТФаза, пептид альфа 1).

3) Гибридизацией с STR-зондами 9 мотивов (GA, CAG, CCG, САС, TCG, GGA, GACA, GACT и GATG) идентифицированы 7501 положительных космидных клонов, доступных для создания мокекулярно-генетических маркеров 13-й хромосомы человека на основе выявленных клонов.

4) Обнаружен феномен кластеризации SIR различных мотивов в составе рекомбинантных космид, связанный с их присутствием в повторяющихся последовательностях размером со вставку в космид ах. К таким повторам относятся гены рДНК и повторы нового типа.

5) Определена копийность генов рДНК в индивидуальных хромосомах 13 человека, составившая 41 копию в источнике хромосомы для космид ICRF и 190 копий - в источнике для космид LANL. Выявлен полиморфизм генов рДНК 13-й хромосомы, проявляющийся на нескольких уровнях.

6) Показано, что микросателлитные мотивы СА6 и GATG имеют предпочтительную локализацию в ирителомерном районе хромосомы 13 (q3?-34).

7) Для 36 космид, содержащих STR маркер, установлена цитогенетическая локализация на хромосоме 13 как единственная в геноме человека.

8) Создана общедоступная база данных для библиотек LANL и ICRF, содержащая данные рестрикционного анализа (размеры более чем 12500 рестриктов от более чем 700 космид) и данные гибридизационного анализа (около 240 ООО результатов гибридизации 28500 клонов с 9 STR зондами и 34 зондами уникальной локализации).

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. А.П.Рысков, Н.С.Куприянова, Б.И.Каланадзе, К.К.Нечволодов, Г.Е.Позмогова, М.И.Просняк, Н.К.Янковский. Оценка частоты встречаемости некоторых мини- и микросателлитных последовательностей в ДНК 13 хромосомы человека. "Генетика" 1993, т. 29, N 10, с.1750-1754.

2. Сулимова Г.Е., Захарьев В.Н., Удина И.Г., Блисковский В.В., Кириллов A.B., Капанадзе Б.И., Щепинов М.С., Воробьева Н.В., Графо-датский A.C., Янковский Н.К. Характеристика пробы Н2-42 локуса D13S25 13-й хромосомы человека: нуклеотидная последовательность,

локализация, ПЦР-маркеры. "Мол.биология", 1993, т.27, N 4,

С.908-920

3. М. В.Кост, Л.И.Федорова, Б.И.Капанадзе, Н.К.Янковский, A.B. Зеленин. Субрегиональная локализация на хромосоме 13 человека рекомбинантных 1сосмид, содержащих микросателлитные последовательности. "Молекулярная биология", 1994, т.28, N 5, с. 1149 - 1157

4. Б.И.Капанадзе, В.М.Бродянский, А.В.Баранова, С.Ю.Севастьянов, Н.Д.Федорова, М.М.Курсков, М.А.Костина, А.А.Миронов, С.П.Синеокий, В.М.Захарьев, А.С.Графодатский, Н.Н.Модянов, Н.К.Янковский. "Исследование космидных библиотек, содсргазн /ПК х(ючосоми 13 человека" Генетика, 1996, т.32, N 3, с. 331-340

5. Н.А.Брага, Б.И.Капанадзе, Г.А.Шкутов, В.М.Бродянский, В.В.Носиков, Н.С.Куприянова, А.П.Рысков, Н.К.Янковский. "Выявление и анализ распределения микросателлитных повторов семи мотивов в составе рекомбинантных космид хромосомы 13 человека." Молекулярная биология, 1995 т.29, 5, с. 1001-1010

6. Hawthorn L.A., Kapanadze В., Yankovsky N., COwell J. Regional localization of tri- and tetranucleotide repeat sequence containing cosmids on chromosome 13. Cytogenet. Cell Genet,1995, 70;102-103.

7. Куприянова H.C., Нечволодов К.К., Кириленко П.М., Капанадзе Б.И., Янковский Н.К., Рысков А.П. Внутригеномный полиморфизм генов рибосомной РНК хромосомы 13 человека. "Молекулярная биология", 1996, т. 30, N1, с. 51 - 60.

8 Богуш А.И., Вейко H.H., Салимов А.Г., Капанадзе Б.И., Янковский Н.К., Карпухин A.B. Выделение и анализ клонированных в космидах прителомерных последовательностей ДНК хромосомы 13 человека. // В: Сб. трудов 3-й. конф. 'Теном человека-93" , Черноголовка, март 1993 г. с.169

9. Брага Э.А., Носиков В.В., Капанадзе Б.И., Янковский Н.К. Выявление потенциально полиморфных маркеров хромосомы 13 человека с использованием микросателлитных зондов (САС)5, (TCG)5, (САСТ)4 и (GATG)4 //В: Сб. трудов 3-й. конф. "Геном человека-93" , Черноголовка, март 1993 г. с.170

10. Капанадзе Б.И., Янковский Н.К. Характеристика библиотек рекомбинантных космид, полученных из хромосомы 13 человека. //В: Сб. трудов 3-й. конф. "Геном человека-93" , Черноголовка, март 1993 г. с. 171

11. Кост М.В., Капанадзе Б.И., Зеленин A.B., Янковский Н.К. Ха-

рактеристика и субхромосомная локализация ряда рекомбинантных кос-мид на хромосоме 13 человека. //В: Сб. трудов 3-й. конф. "Геном человека-93" , Черноголовка, март 1993 г. с.172

12. Куприянова Н.С., Каланадзе Б.И., Нечволодов К. К., Рысков А.П., Янковский Н.К. Мини- и микросателлитные последовательности 13 хромосомы человека. //В: Сб. трудов 3-й. конф. "Геном человека-93"

, Черноголовка, март 1993 г. с. 173

13. Сулимова Г.Е., Захарьев В.Н., Удина И.Г., Блисковский В.В., Кириллов А. В., Каланадзе Б.И., Щепинов М.С., Воробьева Н.В., Графо-датский А.С., Янковский Н.К. Нуклеотидная последовательность, локализация и ПЦР маркеры пробы Н2-42 локуса D13S25 13-й хромосомы человека. //В: Сб. трудов 3-й. конф. *Теноы человека-93" , Черноголовка, март 1993 г. с.177

14. Ryskov А.P., Kupriyanova N S, Kapanadze В.I., Netchvolodov К.К., Prosnyak M.I., Yankovsky N.K. Frequency of raini and microsa-teJlites in the human chromosome 13. Human Genome topping Workshop 93. Nov 14-17, 1993 Kobe, Japan, p 28.

15. J.Cowell, M.Kost, L. Fedorova, A Grafodatsky, B.Kapanadze,

A.Zelenin, N.Yankovsky. Subregional location да chromosome 13 of microsatellite containing cosmids. Abstr of the 2d Human Chromosome 13 workshop. 19-22 May 1994, Groningen, the Netherlands.

16. Yankovsky N., Kapanadze B., Baranova A., Koltsova 6., Braga E., Zakharyev V. Making genetic markers for chromosome 13 genes. Abstr of the 2d Human Chromosome 13 workshop. 19-22 May 1994, Groningen, the Netherlands.

17. Бродянский В.M.,Каланадзе Б.И., Баранова А.И., Щеминов М.А., Добрынин И.Н., Сулимова Г.Е., Забаровский Е.Р. .Янковский Н.К. Создание панелей клонов и формирование энциклопедии генов хромосомы 13 человека //В: Сб. трудов 4-й. конф. "Геном человека-94" , Черноголовка, март 1994 г.

18. Braga Е.A., Chistyakov D.A., Ivanova G.M., Nosikov У.v.,

B.1.Kapanadze, S.S.Aitova, A.V.Kosl1ova,6.E.Sulimciva, N.K.Yankovsky, Yurov Yu.B., Krasilnikov A.S., Turetskaya R.A., V.M.Bannikov, V.M.Zakhariev, L.I.Fedorova, M.V.Kost-Alimova, A.V.Zelenin. Chromosome 13 specific cosmid library studies. Abstr of the 3d Human chromosome 13 workshop. Tarrytown NJ USA, 30 Oct - 1 Nov 1995

19. V.M.Brodjansky, G.E.Sulimova, I.G.Udina, S.S.Aitova, A.V.Ba-ranova, B.I.Kapanadze, L.I.Fedorova, M.V.Kost-Alimava, A.V.Zelenin,

y.M.Zakharlev, O.A.Serpinsky, Ch.Buys, E.R.Zabarovsky, S, Einhorn, H.K.Yankovsky. Making YAC and cosmid contig spanning 13ql4.3 region frequently lost in chronic lymphocytic leukemia. Abstr of the 3d

Human chromosome 13 workshop. Tarrytown NJ USA, 30 Oct- 1 Nov 1995 20. U.K. Yankovsky, B.I. Kapanadze, V.M. Brodjansky, S.E. Suli-nova A chromosome 13 mapping project based on the Los Alamos cosmid library. 1994-95 DOE human genome programm report.