Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Полиморфизм гетерохроматических районов хромосом человека
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм гетерохроматических районов хромосом человека"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

КРУМИ ня Астрида Робертовна

УДК 575.113:591

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕТЕРОХРОМАТИЧЕСКИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

(03.00.15 — генетика)

Автор еферят диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА — 1989

Работа выполнена в Рижском медицинском институте Министерства здравоохранения Латвийской ССР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук БАРСКИИ В. Е. доктор биологических наук КУЛЕШОВ Н. П. доктор биологических наук МИКЕЛЬСААР А.-В. Н.

Ведущее учреждение — Институт цитологии Академии наук СССР

Защита диссертации состоится «_» _ 1989 г. в

__ часов на заседании Специализированного совета Д.001.16.01

при Институте медицинской генетики АМН СССР (115478, Москва, ул. Москворечье, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМГ АМН СССР. Автореферат разослан «_»_ 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

КУРИЛО Л. Ф.

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКA Г.ЛБОТН

Актуальность проблемы. Современными цитогзивтачвошм) магодами показана огрогаая структурная вариабельность хромосом человека (см.обзоры Захаров, 1977;' Проксфьеча-Еэльгозская, 1977, 1986); Работам по молекулярной генетика доказано, что основой межавдиовдуйльной вариабельности морфологических ха-ра к гари о ей к хромосом прехде всего является высока*: степень изменчивости генетически малоактивных, так называемых: гемрохро-магических районов UP) хромосом, содержащих многократно повторяющиеся нуклеотихушэ последовательности Д1К ( йозазп et al., 1Э75,. IC8I). Хотя.геномы мазгк лидоз ч содержа г большие количества гетерохроматина (например, в генома человека 20-ЗС$>, aro функцяоначьное значение до сих пор.остается навшюнешш?.'. Один из подходов для ропеадя этой проблемы - изучение структурного полимотгтщзьи хромосом человека в разных этнических я возрастных группах, а такта внявленяе связи ра^лячных вариантов хромосом с патологией человека.

Цитогене тиками собрана взслма обширная информация о морфологических вариантах хромосом человека, ибо исследование полиморфизма кариотипа человека имеет большее значения е теоретическом плана для раскрытия структурно-функциональной оргэнкза«-.. дай а биологической р<пгп гетерохроматина, а ¡также а практической медицине для мздико-генетического консультирование, установления групп сцепления генов, пргнаталвной диагностики наследственной пагологли, установления зиготности близнецов л т.д. Начатые з 60-х гг. исследования полиморфизма хромосом (ИХ) человека особенно широко разверну.шюь о 70-х гг. в сэяза с появлением штодов джрарелгдального окрашивания хромосом,

слссобст'вуш'да прямой .тазурлкзаг^а феномену полиморфизма на цитологическом уровне. Ссюзйляш и близнеце исслодования-ш доказано, tvo сгруятуршо паразита хромосом, лак прияло, наследуются не из дюне иными (Цикольг"ар, IS3I;Robinaon et al., IS75;Van Eyke et al., 1977; rliillips, 1977; McCrucicen et al., . Iw78 i; др.), установлена высокая стабильность вариантов ГР в разных тканях одного я того же индивида к в ряду клеточчнх поколений ( Hooin et ai., 1977), накоплен таклсс ряд фантов, свидетельствующих о цитологической разнородности гетерохроматических районов хромосом человека ( Jalal et а?.. Д974; Ifogonie st е.1.,1973; Вода et al., I2ST'Donlon, MaGsnis. 1981). Тем г.э менее, достаточно четкая концепция о природе полиморфизма карпотляа а настоящее врз;.щ еще на сформирована. М/.-лгио аспекта ца!-слогачеокой, молекулярной и генетической характеристик шшоюрфлзиа хромосом вз освещены я литорзгуре, либо дзшше о них лротаiсречивы. Ч.чоло яопуляционннх всслэдоеонйй лелгморраз-

хромо с о г." человека невелико, разноречивы даншв о связи ПХ с narojiomei: человека. Ъолшая часть этих работ проведена с ис-пользованна?,! одного - двух методов выяапэныл структурного го-т^рохрог,;атмпа без яоличеояабнкой оценки вариабельности ГР хро-лосо.м. Результаты, получощшз раэцк.а авторами, практически аз ара ваши из-за отсутствия унифицированных методических дод-хоиоа к анализу ИХ, Совсем на изучена молекулярная слогуфич-коегь гегерохроматачосках районов хромосом, npaxizveoiat пз so-слсдошнз молекулярная осяоъз цятологичоски наблхдаоиого полк-:«р.?кэкз хромосом. Но па во ома xaiœs роль гй тарохромахячоских участков хролюсогл ь онтогенезе человека,

л ."аддчг ;сзледот:аяпл. Принимая во внимание обще-то регичзское а практическое значение ке только огазтеь на вше

- s -

перочяслбЕнда ¿опросы, но а нпсбходамость додолняиельноЯ годной информации дня их решашш» ками было проаодека иоследчча-кяа с целью уогалоэлэяяд зклада структурной неоднородности ги-тарохроматячесгих районоп а и&ялморфизм хромосом л лыяелония связи еарязбвл.ькосгв гегерохромагачаскйх районов с патолога эй человека.

Указанная цель рзасизонака на основа комплексного исследования хромосомного полиморфизма в ЁТ.чичеоки однородной iif-'уяя-цяи (аорааное населенна Латшйокой ССР) о охга^ом трзх уровней проявления полиморфизма хромосом - мелок,улярпого, цитсморфоло-гачеакого и органпзмениого (фаноганатачаоиого).

Конкратаьш'задачи paöcm-i были сладутацяа:

1) для корректного сопоставления результатов цитоморйол'.)-гичаcauro, молекулярного я фенсгонбтичеокого анализа полкмср-фазгл хромосом решить ряд метидичзсмкх вопросов «оминвксппго исследования гетзрохромзтичьских районов хромосом;

2) колачосгпеяао оцедить полиморфизм хромосом, анчоляскнЛ

в пределах эмшчбоаи однородной грудга, трок* мояодош /¿^форвк-¡овальной окраски хромосом: G-, 0 - и дйстамициксм А/э AFI I ск— рзскаЭ A/d API); изучи-гь столеиь и характер сьгыантацчи с-ли-коз проглвтафазных хромосом;

3) иослэдесать хромосо.ануэт лсла/таандо трах плсяяроз^нних повторяющихся последозательиссгвй ДКК чолоизка Ссдпой

ней и друх посладоэотзльаосгей оагеллитноп ДНК III) ^ o-¡,<:m;oü .«явндаводушглшх различий рояультго.и лбрлдкзшдаа iri aitu i: язуглчь сзакпосшт дагслйхчяаскйх харакм^.сгян ac.n?y.cu'f,'.iz~ к а с о о о б и кпо с шли мялвкулнрпогс огг-сепял .r-з ?ярсхгж:'па«>,о«.'->? pji-OHOb хромосом;

4) оценить вариабельность С-гетерохроматачоскпх районов з грох возрастных-группах (г.оворощгяннш, лица 17-35 лат л старые 70 лет), отрзгсаюдих основные стадии по о гиа сального онтогенеза ч-лоиека;

5) провести сравнительный анализ полиморфизма хромосом

в группе лиц с патолзгшй (супруги скиа пары о понторными скон-гзаиша абортами неясной втяслоган) и у здоровых аддевадов.

Исследование проведано г, пределах npoi'paiam ПС-IT 0.S9.G7. по модациаокой генетнде и жмуаологпк. ' ■

Рпл'ччэя попипна результатов иоолалорзния. В работа шарике осуизствлоно КСМГЛЗКСНОе (|,?ол-ЗКуЛЛрНО-Ц11ТОГеКвТ51ЧОСКОа н феаогенетаческса) исследовато полиморфизма готерохроматйчос-ш районов хромопоп человека л разработана кагоднческал основа такого исследования.

Показана структурная неоднородность готврохроматачосдих рааоиоа хромосом чалоьака, .кг которую указываю? различная чх окралщвааыисть разпцш красителями, сегментация в прометафазных хромосомах ¡1 различное воздействие па ках щелочных обработок.

Впервые установлена частота ьстречаемсста различиях юрз-' зима р-, С- и в А/DAPI пелашр^изиа хромосом у коргнног-о яа~ саланая Лятаийсд'ой ССР. Впервые получена ксллчостэокнкз харзк-тзриогика полиморфизма гзтерохромашчееккх районов, выяадаиного ойраекой D А/ D API.

Предложен ряд мгтодачвеках прламоа, иопользуемцх при анализа результатов гибридизации на хромосомна npsnspovux клоди-•'ропаникх повторяицахса нуд^аогвднкх последовасгяьаоотсй. Впер--SK9-0 помощью двсперсиош^А'О. анолиза даиних гибридизация in ait и оценена мзникдишдуйяьная я маямгаточная вариабельность двух

клонированных последовательностей сателллтной ДНК III C?PD 3 ' я p?D 18) п одной альфовдной последовательности (pHS 05), Вн-яьленн большие моззидавидуалыще различия в случаи использования для гибридизация последовательности стДНК. Сопоставленном к ар яш цитологического полиморфизма хпомосом с результатами гибридизаций in situ повтсряквдхся последовательностей ДНК впервые показано, что основой визуального под макроокопом наблюдаемого полиморфизма працентромпрккх районов хромосом человека явдяотся молекулярная вариабельность как сателлитаой, так и аяьфоадяой ДНК, Вклад сагелдигиых последовательностей в цитологически наблюдаемой подиморТвдм хромосом болша, чем зкээд альфоядпой пссдедосзгельносги.

Ксслодосодшяш а трох везрзстят: группах (яоворо:.'датшз, лица 17-35 лет г лица старше 70 лет) шарэив покапано, что роз-мерн С-ссплентсв хромосом 1,9 в 16 ъ старших группах болью, чем э младзих (различая-для У-хромссомц из облзруивяа).

Сравнительна! лолшгеоггеянш ача-езем лолимер'азгла 0~ а Р' сегментов хромосом у фокотагшчсски здоровпх лиц и у (¡упруг.аскях пар, иметаих в анамчеза повторят» споитоишз edopru неясной этиологии, впервые установлено, что для указанной паполегла характерно уменьшенное количество структурного гегерехромота-»Я (К2» Q-. V"* ч fb-твдwплгтуктч'Рйяя ч тпттвпмт* T.S в ТЪ) . Различая для У-хромосоки не обнаружена (также кал з а исследованных возрастннх грушах), что указывает на о тачающееся функцлональдов значение гетерохроматического района отой хромосомы.

Результат« исследования полиморфизма хромооом в разных ■ возрастных группах здоровых индивидов, а также б группе лиц с репродуктивной патологией позволили обосновать предположение о

_ в -

неблагоприятном эффекте уменьшенного количества гетерохрома-тша в хромосомном набора, проявляющемся на разшс: стадиях онтогенеза чалоэвка, и сделать заключения, что вариабельность размеров гетерохроматических районов не является нейтральным для организма признаком.

Получаиназ данные намечают направления дальнейших- патологических и молакулярно-генетичосках иссладованлй полиморфизма гетерохроматических районов хромосом человека.

Практическая ценность работы. Полученные данные позволяют обосновать нрэделц вариабельности гетерохроматических районов у фенатапачоска здоровцх лад, что может найти применение в практике цитагаяетичаских доследований о мадякс-ганегйЧбоких консультациях. Данные об уменьшенном количестве структурного гзтерохроматина у супружеских пар с повторными спонтанными абортами могут использоваться для разработки методики сценки риска спонтанного прараьа;шя беременности в практике кадико-гаиеткчеоксго консультирования. Разработанные мзтодвчаскиз при-зга анализа результатов гибридизации 1п могут быть по-

пользованы в популяционпкх исследованиях пелмморйизмз повторяющихся последовательностей ДНК. Практическое значение работы состоит также в оценке, возмеянсотд использования отделыш-. фракций повторяющихся послодовагаяьиостай ДИК в качества моло-.чуллрнс-гонстаческях маркеров генома человека. ' •

Практически о рексмаццацпи, разработанные на основании про-пада;>;:г,го исследования, прпменгатся в практической работа лаборатории 1а5огег:етикя мадикс-геязтич^скай консультации Лот-ССР, отдела деИкзослогш; .с отдала охраш материнство з д'1тсл<а Щ-П'Л Разе«ого• ме,зациисйогс института. Организован (!££? г.) распубличалок«;?. научний се.-ачито "Кзлзльзогапча мола-

кулярно-ганетпчеоких маркеров в диагностике наследственной патология человека". Изданы информационный листок Манпстзрст-ва здравоохранения Латвийской ССР "Мэтодккэ адямения участков отруктурного гатарохроьягияа хромооом человеке путей С-окраски (Крутаня, Кроашана, 1983) я методические ракомвнда-т^иц Министерства здравоохранения Латвийской СО? "Показания и : исследования хромосом у супружаскнх пар о патологией потомства" (Крумиая, Воскобойни«, Андраова, Засилвк, Кройкина, 1987';. Основные положения работа включены в курс обучения студентов медицинской биологии и генетики в Рижском мздиципском илститу-■га и в спецкурс по медицинской генетика на биологическом факультете Латвийского государственного университета,

Аппо(1;тИ)Ч циссертетак. '¿атариялк диссертации доложена на: явух научных. семинарах исполнителей Бсеооюаой мвкинститутской программ "Полиморфизм хромосом человек»" (Москва, 1'9?Э, 1933)' НУ ежегодной конференции Европейского обцостла по .мутагг5нам внешней срадн (Москва, 1984); I Воаосйзнсм съезде научного общества медицинских генетиков (Киев, 19В4); трах Бсесоюзшхх научных, семинарах основных исполнителей заданий 04. СГ;-04. "Хромосомные основы нарушения, развитая , у человека" программы ГКНТ 0.69.07 {РаГй. Т9П5; Цпг.кйя. 1986: Харьков. 1907); двух Всасокзши совещаниях по структура и функциям хромосом {'Лущшо, Ш5, 1988); XXI симпозиуме цитогензгиксЕ ЧССР (Прага, 1288); научной конференция, ¡шсшщшьой 6 Осетию со дня р здания чл,-корр. АЖ СССР, дроф, /..^.Захарова (Мтслс, ГьПв); на I Бое-отрнек оъаада .чаэдзеках орочей (Рига, 1К9); двух със-.д;»:: оо-щчотпа гачетякоэ ¡а суленциунероа ЛагчССР (Сгзш!.«, 10;>1; >гг, 1Р86>; яасрланйа доучгмгэ сбидаотс-з екуасгв^'^кихлсго» лзтгге,«

(Рига, 197Я); заседании научного общесгза патофизиологов ЛатвССР {Рига, 1881); объединенной каучно-нрак тиче окой кон- ' ференции дамках арачей и акуасроп-х'инекологоэ ЛатвССР (Рига, 1961); пятя заседаниях научного общества медицинских гон6тиков ЛатвССР (Para, IS78, 1982, 1935, 1967, 1988).

Публикация. По теме даосертации опубликованы 24 научные работы (аз них 2 в зарубежной, 15 во всесоюзной и 7 в расцуб~ лякакской печати), список которых приводен в конца автореферата. ■

Структура работа. Диссертация состоит из введения, девя- 1 ти глав, заключения, выводов, списка литературы и прилежания с Ш£;р«]ю2ографиями. Она изложена на 169 страницах машинопиои, из которых такс:? диссертации занимает 153 страниц; содержат 56 таблиц и 13 рисункся. Список литературы включает 2?"2> наименований ( 55" на русском и ЪЪЪ на других языках).

Ссьовнна положения;, пыиосимна на■

I. Гетерохроматические района хромосом обладают цитологической, молекулярной и феногоноткческой гатарогакностып.

2. Альфощцще и саталлатяке последовательности ДЖ, входящие в состав гатерехроматпчеекпх районов, характеризуются различной хромосомной локаяизациой, разной степень» выршшшсс-шживдцавдуашш'Л. вариабельности, различным уровнем кор])едя--хда злокуляраого и цитологического полишрпизма.

3. Структурная вариабельность гетерохроматических районов на являотоя нейтральным для организма признаком.

4. Умгншен.чоо кслнчостио гзтерохроштяна а хромосомной наборе окезыпзот набдагслрилтаоа здиянив на онтогенез чалосе-ка, пр«7Ш23'лееся на разня? зге судиях.

■ СОДЬТИГОЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Объем п материал исследования. Для решения поета&юныи задач исследовал« разные грулли лиц, всего 83Э аэдивндов,

I. Феностшичаоди здот>овко индивид?;. Хрсмеоога исследованы у 335 здоровпх индивидов. Есе обследованные лица бцли ляпстской аациональносгл (до третьего поколения). Еацьшузл часть обследованных (295 чел.) составляли лица в возрасте от 17 до -ос> лет. В ззачсамостя от характера проводимого исолсдояшшч всех здоровпх индивидов можно разделит!, на следующие подгруппы:

I. L-rpyana из 70 мужчин и 70 женщин, у которых проведен анализ Q-поликарфизма хромосом. У 50 из них (25 мужчин и ,'¿5 кец-щин) проведан такие количественный анализ вариабельности С-се?-меятоа хршбеом 1,9,16 и У после обрйбогяя препаратов гидроокисью натрия;

1.2. - групп» из 25 чгунчиа я 25-женщин, у аоторнх тгкуз бич исслодоэан полиморфизм С-согмантов хромосом 1,9, 1С и У, но препарат обрабатывай гидроокисью баряя;

1.3. - группа аз 10 кенцик и 7 мужчин, у которых проведено количественное исследование полиморфизма гетерохроматических пяйлчпн, вмягелянных окраской о А/п API, У 14 аз них (3 яелпуш

и 6 мужчин) яз тех за препаратах затем бшга проведана гибридизация in situ с клонированной паслгдонзтольи>ютьг! рРв I'.i ctjjJiK Ш;

1.4. - rpynua so SO челоьок-(17 юни\т к К муг.ч:::'.); у кс-тор^х <5usa проведена габридив^шя хроме сом о г.Щ'Ш лпягролэд-шлла последеьвтчьиоатякй' ot0K 111 - рГо 9 :: j-Ри» 'Л. Галрчдд» оалпя ir. situ о кмоно.л рП1 IB o'ttrta •яг.здчем и и^таю*;:

I) после предварительной окраски прапаратов .с D Л/в API (О жен- . пая a G мужчин); 2) посла предварительной окраски пропялакрахин-ипрнтом (10 женщин и 8 муячян). Гибридизацию с кленом pPD 9 у II гаксщн и 7 мужчин таклш проводили посла предварительной окрасил препаратов пропилакрахЕнипратом. У 13 человек проводили гибридизацию i» situ с обоими клоиащ стДШС ИТ. У 8 человек поел« гибридизации in oitu проводили анализ размеров С-саг-ментов хромосом 1,9, 16 и У;

1.5. - группа из 38 человек (22 мужчин и 16 яаквдн), у которых посла предварительной окраски пр паратов пропилакрихин-ппрпх'ом и анализа Q-вариантоа хромосом было проведена гибридизация in eltu - о клонированной альфоядной последовательностью ЛлК человека (клон рНз05). У 19 человек из этой группы затем был проваден анализ размеров С-сегментов хромосом I и 16;

1.6. - одновременно обследованные 'три возрастные группы: новорожденные (20 чел.), лица 17-35 лет (20 чел.) л лица отарою 70 лат (20 чал.). Во.всех трах группах бия проведен количественной г.нглпз вариабельности .С-сегментов хромосом 1,9, 16 и У.

. 2, args^OT.^pK, fluytpie в n9W9"S3aJBmuaB"

ябооту. Цпгог.',кетачесш)е обследование о использссадизм дяф-$сроицеалыюй О -окраски било прспедеко у 252 супружаслах пар, обратившихся в консультаций'"Брак .и семья" г.Риги по поводу повторных спонтанных абортов. Вса супружеские пары били подвергнуты тщательному ¿шгш'ко-геястйческоыу обследованию, посла чого для анализа полиморфизма хромосом 6ïmû отобрано 50 пар ла~ vleïской национальности; пкзюачх в анамнезе не манае двух спон-•синаь'х абортов аавияшшной «ч-аологяв. как. нравзло, в j грд-мзетро барамзкности. При отбора материала псклкяата пары с

хромосомными аномалиями; о живороядянншз да ими; о профессиональными вредностям!! в анамнезе у кого-либо из оупругов; с заболеваниями, которые могла быть непосредственной причиной опоатинного прорывзпяя бараманноота. У отобранных 50 пар был проведан анализ {¿-полиморфизма хромосом 'одновременно о группой 1.1»), у 25 из я тих пар бил проведен такко анализ (¡-полиморфизма хромосом 1,9, 16 я.У (одновременно группой 1.2.),

Материалом дая исследования служили препараты хромосом, полученные из культур лимфоцитов периферической крова.

Матодц йойтедовадяя.

I, Культияиготоня с клрток и пуяготоидояпа хромосомных препаратов 30УШСТШ1ЯДИ ПО общепринятой МЗтодшш &00ГН<1Г.(1 в! а1.,

1960) о небольшими изменениями. й-окраску препаратов прг 'одилч из СЕекепрпготоачешшх препаратах по модифицированному матоду Патвла с соэвт, ( Ге^ц аг а!., 1971).

2., Внявлеиме и акатгаз О-сегментов' хрокдеом. С-сегмонтц в:г>-ляли двумя способа».© - воздействием гидроокиси натрия по модифицированному матоду Арриги и Хсгс (Агг^ьз., Нзи, 1971) й гидроокисью бария по модифицированному катоду С а:,вера с соалт. ( з-лтег аь а1., 1971). В огличиа ог обичяо лршапяемой в предложенной наш матодякя используется другая концентрация солевого раствора для инкуб ада и препаратов, з таглз иная пподслкиголЬ" • ,. кость различных этапов их обработки. В результата отте изменения грзницк внйвдяемых готерохрокатяческях-со гманго в сталл болаа четкими. Для фотографирования ■ я даяьяейшаго измерения хромосом отбирали «отафззяый пластинка, ответатие требованиям модемет~ рячбского анализа. С помочив фотоувеличителя с нзгативз рисовали кокеры обоих хромовой 2Ф гак ягк отбор юзтафазянх пластиной оо сходной степенью опиралазацаи хромосом проводив-по длина

хромосомы 2 (усредненной но четырем хромагадам). Хромосома 2 для отбора била выбрала из-за ее длины, хорошо коррелирующей о суммарной длиной набора хроноооы, легкой идентифицируемости и мз-зэ отсутствия в этой поре хромосом больших блоков гстерохро-матпна, окыьаэдихся по конденсационным свойством от оухромати- . ческих районов. Длину обеих хромосом 2 на зарисовках измеряли с помощью лупы МБС-2 (цена деления измерительной лиязйки 0,025 шм). Для определения размеров Г? у кздого индивида отбирала но 5 ма~ тафазннх пластинок с душной хромосомы 2 от 8 до 9 аиш при обработке препаратов гидроокисью бария и от ? до 8 мкм при обработке гу.броокисыо натрия. Из-за незначительных размеров блоков С-готарохромзтйна в йольшнстер хромосом измеряли С-сегменты лишь в хромосомах 1,2, 16 и У. Измерения проводили о фотояагатявов по методике, предложенной Подугслышковой с соавт. (197Э). Раз-мэры С-сегмантоа гомологичных хроглосом дгя каждого индивида находили усреднением по Б клеткам отдельно для С-сагшнгое с большим и меньшим размером, обозначения их одним или двумя ттрихаш

i и

соотЕотствза м (например,. I и I ). Характеризовали размеры С~ сагментса как абсоллткой их длиной (й микрома трах), так и относительной, Относительные значения размеров С-оогментов хромосом 3:,?, 16 я У для >:адцвяда рассчитывали как долю от их суммарной даны в исследованных яутооомзх в процентах. Для оценки ошибки измаранлй было сделано по 60 измерений С-сегментов обеих хромосом I, Эк ,16 одной клеши Средняя ошибка измерений для нашего материала оказалась равной 0,05 шм.

3. Вялачанг^ хромосом. Для окраски

хремооом использовали прошиткрихинаприт, синтезированный а Институте ядерной физика АГ СССР, Окраску препаратов проводила

по модифицированному методу Шваршахора ( Schwaraaciie?, 1974). Изучали по 10 шгафазных шгастя.чок ааздого индивида. Исследовала вариабельность сегментов ЗрЩИ, 4pIIqII, I3pII, I3pI3, 14рИ, I4pI3, I5pII, I5pX3, 2IpII, 2IpI3, 22pII, 22pI3 и диоталь-ной части длинного плеча у—хромосома. Интенсивность фяюрасцеццйя . оцанявали только как. яркую (4 а 5 баллов по Парижской номенклатуре) или неяркую (1-3 балла) (Paria Conference, 1971;Supplement, 1975). Для оценки гомо- или.гетерозиготноста изучаемого сегмента по признаку яркой флюоресценции применяли методы Южного я 50£-ного учета свечения, прздлокекшз Мияельсаарсм (1979). Пра методе I0¡?—него учета "гомозиготой" (+t)'инадиввда очатали в тух случаях, когда яркое свечение обнаруживали в обевх.гемрлогглшп: хромосомах хотя бы в одной из 10 изученных клеток; "готарозиготой" {+-) - осла яркое свечение обнаруживали только э одном гомологе определенной пары хромосом; а "гомозиготой" {—) - если сет-мэнт на вмал яркого овачаная на в одной: из 10 исаяадавбнных. клеток. Прз методе 50^-ного учета регистрировала тот Tai свечения сегмента, который наблюдали а больше! чаоти .изученных клеток, йты свечения оценивала- в баллах; - 2 балла, "+-" - I балл,

-"О баллов, . •

4.Окраска-'препаратов дясташцннозд A/óffil и; анализ. гкягкдац-ного полпиорФазма гдташхрокастчсских районов .хиомццич;. Cupaúftj. препаратов проводила по ко'тодике, • аредаозтенноЛ Иигйцбром с соавт, ( Sohwolsep. et aI,,-297&) ¿ :;оогласкс которой пропурагы'после 15 . ан обработки рстбарйй-дкстаулцанй А (з Л)- красили фяюарзхро-мом 4' . Ф API) *. Для аоморшшя разке- :

ров .ГР у каждох'о-ЕН.давйда с.гч5:ирз.,щ1 лс Б мчтафадагх пластинок о . длиной хрочпоолш 2 off (5»S до .7,3 мйй.гВДк «ая пря шфзеле я.оддэ«. paicü о o A¿> K?L[KW^aniyiek'-it 15; -I5,B'y,Jre ex

размеры а измеряла (за исключением ГР хромосомы 15 из-за малых размеров выявляемого оегмента-, величину ГР в коротком плече этой хромосомы оценивали в.баллах). Измерения и анализ результатов проводили по методике, списанной для С-сагментов.

5. Приготовление препаратов проматасбазных хромосом. Препараты проматафазных хромооом получали по модифицированной методике Юниоа (Yunis ', 1976). Для синхроназациа клеточных циклов sa 22 ч до фиксации в яультуральцуа смесь добавляли аматоптерин в коночной концентрации моль/л.

6. Гибридизация на хромосомных препаратах клонированной аль-Фоипной последовательности pHs 05. Данная часть работы выполнена на база „аборатораи генетики ВНЦПЗ АМН GGGP, Для гибридизации. in situ коллекции Pat I -рестрактов ДНК человека, клонированных в штамме К-12 b'.coli в составе векторной плазмиды рКы 001, был выбран рекомбинантный клон рНз 05. Эта клоно тока быда получека в лаборатории генетики'ВНЦПЗ АМН ССОР Яковлевым (1983). Вы» бор указанного клона объясняется содержанием в. нем вставка ДНК человека альфоадной природы.(Зайцев, IS04), а такке иго хромосомной локализацией в прицентромарных районах ряда хромосом, преимущественно в околоцеятромердом районе хромооош 3 (Яковлев, 1983; Александров и др., IS86; Юров и др., 1985). Тригдевую мотку о пробу ДНК вводили о помощью ДНК-полимеразной реакции замещения - методом ник-трансляции. (Rigby ,et &1.Д977), Гибридизацию на хромосомных препаратах осуществляли по методу; Голла и Пардю

( Gall, Perdue, 1971).а модификации Юрона -(1384), Препараты ма-тафазных хромооом (вве одновременно приготовленные) денатурировали в 0,07 я. к аШ-(рй 13,0) в течение 30 и, затем отмывали а -двух смонях 70с~ного я двух - 96°-ного этанола. В состав .оибри-дизацйонпой смеси кроне Z С их с тки 50$ формаындэ, 1"05? дак-ст^шсулНята, Т.СО мкг/м" полк (А) и радаоактивная проба доча-

tr

турировавной Л1Ж (0,15 . 10° pacn/шн на I дал смаси),Гибридизацию проездили а течение 18 ч при 37°С о последующей асмявкой препаратов а 2 33 С (при 37° к при. комнатной температуре) и в этанола (70° и 96°). Посла высушивания-препараты покрывали эмульсией тала М (ГосНИИздм&отшроаяг) л экспонировала их в темноте при комнатной температура-14 сут. Пссле проявления радиоавтографов препараты окраимвзли красителем Романовского-Гиглза, Распределение матки но хромосомах анализировала путем

подсчета rpanyi серебра над каедоЛ хромосомой. Для ядентлфида-

/

ции хромосом^/ вспо."ьзовада ч^ртоногативн' тех на матафазных пластинок, окрашенных до гибридизации пропилакрвхинапритом. Для каждого индивида анализировали шэ-мЬнаа 5-7, шгафззшвс лласгсвок. С-окраску части препаратов после гибридизации прзаодиял выше опиоан-1шм опое об ом, метку удалял!'! путам погружения препаратов на 30 кии в горячую воду (Епифанова и др., 197?).

7. "Гдбтщкзация па уромосомньгя: ярэпасагах лиге клонированных п.пслаловат<У)ьвоотаЯ стЛНК III' (пооладорз'тельпостя cPD IB). Использованные аработе ■ клонированные иоследааатаяь-■ ностз отДНК-Ш 6уш нам дабазно предоставлены'Де'йнинямром (Университет штата • Луизиана,' США).,Опяса вив этих -последозэтельяое-50Й.Я-ЯХ нуклеотиднив таком-приведена а -статье'' Дейвйняора о оо-авт. ( Deininger et al., 1981). ;Цетодика владения радиоактивно« • не иск. в пробы ДНК в гибридизация на одаовроме.-шя стандартно яр-готовленных хромосомных-препаратах в пргтципе\'нв отличалась от описанных для клонированной аи^оидной ' после .яоватедьяоотп pßSOS, Поело: завершения ДШ-налиморязяой рапкцш замещения удалымя

- С - ' -- -

радиоактивность ДКК соптазляла 1,24.Ю"1 ймо/шш дяЯ йяокзровии- • ной последовательности-рРЗ 10 и,1,12.10° да p?Df'.

Препараты мета^азных xpovlrim'доаотупйровблЙ а О,Г// п. аШ

в м-хание 15 с. Под покровное огзало наносили 20 мчл готовой гибрядвзационной смеси, содержащей радиоактивную. пробу денатурированной Ш\ (0,13 Л О5 paoii/ти на I мал смеси для рРВ 18 и 0,11 ЛО5 расн/ман на I мкл смеси для р?а 9). Врали экспози-циации радиоавтографов осота шшю 7 суг ядя р?0 28 а 30 оут для рРэ 9. Часть ирзпаратсв (дта 14 Человек) перед гибридизацией la oitu о клонированной последовательностью pPD 18 окрашивали р A/tAPI. Дифференциальное G-окрашвание покрытых эмульсией прз-наратои хромосом проводили, посла проявления радиоавтографов, используя я этил случае краситель Райта ( Ch^adior, Yunig, J.378). Во всех остальных случаях после проявления радиоавтографов прзпароты окрашивага lOjTr-iiHV. раствором красителя Романовско-го-Г«мз ; адентафацаровали хромосомы с фотонегативов тех еэ ме-юшазьых пластинок, окрашенных до гибридизации провалаараханип-ритом. Дет каждого индивида анализировали не 'гчнез 5-7 метафайлах пластинок. С-окраску части препаратов после гибридизации in situ проводили способом, ошеанным виге. Мзтку удаляла псслсдоватольноХ обработкой препаратов растворами колазосикеро-цизтого калия в таофосфата нзт. m (Слезикгор, Прок офьевз-Бьль-гояскся, IS65),

8. Сгвуистдазскто обработку пиФрошх данных проводили по общепринятым иатодам для вычисления и сравнения средних параметров, к оррз ля: июни его и одпефакторного дисперсионного анализа (Урбпх, 1975). На всех ртапах работы, если предварительный анализ на тшвлАт-различий меяду полам, данные для мужчин и женщин суммировали.

Ввиду значительно« методических трудностей при исследования полиморфизма хромосом начали экспериментальную часть работы с оценки влияния на ланеГшне параметры ГР двух факторов: способа предобработки препаратов и стапэнз слиралкзашм хромосом. Для зтоД цели была использована С-екряска хромосом.

Различия в размерах С-сог:геятоп хромосом в зависимости от способа обработки препаратов и степени гяшралязациг хромосом бшш проверены в двух сериях экспериментов: I) препараты хромосом одного ц того йе индивида бшш подвергнуть; различной телочкой обработке (часть препаратов сбрзбатнаали каШ, члотъ -Ва(ОЭ)р), причем в каждом случае доследовали 80 Агауафазшс: пластинок с одинаковой степенью спЕрализация хромосом; 2} различной дел очной обработка били подвергнуты препараты хромосом 25 мужчин и 25 гонваа, причем различалась тзкйо степони сяпра-лизапяи хромосом в исследованных мотафазпых пластинках. Результаты' экспериментов первой сэриа показали, что.при обработке препаратов гидроокисью бария размеры С-согмактов хромосом 1,9, 16 а 7 статискгмска достоверно больше, чзм при обработке препаратов того лее человека гидроокисью натрия (при той :?,о,степени спиралнзацил хромосом). Била обнаружена также разница откс-"" си телышх длин С-сегмантов (статистически достоверна для хроми-сом 9 я У), что свидетельствует о различном влиянии щелочной обработки на .ЕР в разшж хромосомах. .Результант экспериментов второй серии показали, что при исследовании размеров I? хромосом даже у лиц одной я той ;га популяции, но с использованием отля-чэгсцихся католических подходов (а данном случае - различная

•деленная обработка а отличающаяся степень сплралкззцки хромо- • сом) могут бьяь получены сильно различающиеся результаты (е пашск исследовании - статистически достоверные различия раз-мерой С-оешзнтов хромосом 1,9,16 и У). Очевидно, что ¡мтафаз-нмъ ялаегшш -с оолез дековдекенровашшш хромосомами, отобранные б узком интервале степени «парализации хромосом, более информативны дд>т шявлзяия различий'я размерах блоков С-готорохро-маглка при проведении поиуляцишишх исследований, при сравнении неруу с патологией и т.н. 3 литературе, цгсаяпшшой анализу по-лшорсизка С-сзлленгоа хромосом, предложено несколько способов . отбора шгеафазаых пластинок по степени спирализяции хромосом влк соответствующие метода коррекции, однако сил но нашли широкого применения. Ведосгагком метода "нормализации" результатов измерений с использованием уравнений регрессии является то, что при отом не учи' ивггатся различия в скорости совралязацпи как индлвидуальнкх хромосом, гак и отдельных частей хромосом. Думаем, что кргдяоЕанкнй наш способ о испольуованием суммарной длины хромосомы 2, несмотря на трудоемкость, дайт возможность отобрать метафаэкыз пластинки в очень узком интервале степени спиргдгяадки хромосом. Учет раЪсмо транша: методических моментов имеет псрностепанчоо значение, так как различия в степени слгралЕзацпп хромосом а в способе обработки препаратов, на ааи взгляд, яадлется главной причиной различевдахся рззуль-т«5'ов как при нолуксличеотвенном (сценка в баллах), таз й при кодичвсгв«мком (прямые измерения) анализа полиморфизма ГР хромосом,

Лет визуального изучения под микроскопом полиморфизма хромосом нами использованы три метода выделения ГР: С—, р- к £АД>АР1- окраска. Получены количественные характеристики вари-

&С шпионя ТР. Обнарупет: I) выпаявшая меяадмшдз'апшш вариабельность разыерйз I? (например, крайне зщ. гения размеров I? на хромосомах I и 9, всгречаяцяося р исследованной популяции, различались в 4-5 роз); 2) у часта индоадоэ вариабельность лшалазащш 1Р в виде полной яла частичной инверсии при-центромерних 1? (наиболее часто в хромосомах 1,3 к 9); 3) цитологическая неоднородность ГР хромосом, проявляющаяся в различное способности к связывании разных красителей гетерохроматическими районами разных хромосом и даж разными пастями ГР одной и тоц же хромосомы. Например, С-сирьска вшшллс ' щмжтичес--ки все районы структурного гетерохроматина в хромосомах человека (цзнтрожркые района всех хромосом, короткие ¡глечи акроцеггг-рпческих хромосом, участки вторичных пзрететек хромосом 1,3,15 и дистальнув часть длинного плеча 7-хромосомы); окраска т>А/сАР1 выявляет только ГР вторичных перетяжек хромосом 1,9,16, короткое плечо хромосомы 15 п дисталгдую часть длинного плеча У-хроиосоми. В результате проведенного исследования наш вняв' лоны также различая размеров I? в одних и тех хромосомах после окраски'С я о А/-) ЛР1 (табл. 1). Статаст.тчеоки достоверно показано, что II5 я хромосомах 16 и' У яссле С--окраспл имеют меньше размера, чем после окраски о А/Ь АР1 (это несмотря на то, что при С-окраске были использованы солое десшфалг.зованные хромосомы). Обнаружены также различия з частота швереяй ГР при использования йтпх двух мзтодоз окраски: частичная инверсия О-сегмента в xpoi.ro-сокй 9 у 12 лиц из 50 я полнее отоутстъае такой шшереки поэлв обработки о А/> АР1 в МЯ у.з хромосома у .17 лиц. Эхо наблюдение согласуется о да;шаш, приводимым! в литература последних лет, о няг-кой реальной частоте встречаемости частичной инверсии прпценгромер-кого ГР хромосош 9 (в большинстве случаен частичная шшерсия

Таблица I

Размеры гетерохроматических районов, мхм, выявленных разными способами и их коэффициенты вариации" (КВ),*%

Количество Срвдшш

Ойраииа ' исследован- ДГЫНЙ Хромосома I Хромосома 9 Хромассма 16 У - хромосома

индпви- хрсмс- Размер КВ Ризкер Кб Размер I© Размер КВ

. *>» сош 2 ■ ■ .

50 7,12± 1,094 0,94± 0»82* 0.85±

±0,05 ¿0,016 15,5 ¿0,013 13'8 ¿0,008 9,8 ±0,018 10'5

МЛАК *7 6'57" 1'0Й: Т* Л 0,56± ТЯ 2 0«93± ™ Л ^ то о

^ .±0,04 • ¿0,013 15'4 ±0,010 13'2 Ю,9 12,2

Р<0,Ы1 Р>0,05 Р>0,05 Р<0,001 Р<0,001

С-сегмеата а хромосома 9 является лишь отрачаниог? увеличения размеров гетерохроматического участка, его распространения на короткое плечо).

Сравнение полученных нами результатов количественного анализа С- и Р-лолнморфазыа хромосом у коренного населения Латвийской ССР с данными для других этнических груди затруднительно (для полиморфизма, выявленного окраской в А-4 сопоставление невозможно из-за отсутствия литаратуршс: данных) , так как сравнение возмогло только, зслп исследователи использовали ту же методику обработки препаратов, те яе крнтарпк отбора ма-тафасшсс пластинок и изучали хромосома того яа уровня, спирализе~ дав. Ми сопоставили лолучошшз-ваш результаты деслздзгаякя 0-пслйиср1изка. с дршккя Иикельсаара (1979) для гюпулэдп-! Зо~ тонской ССР, так как он иоипльзспал та на, что и мы, чатсд.ччес-киа приомц приготовления а анализа препаратов хромосом. Сравнение выявило статистически дсстосерккэ■различая лгаь при метода 10^-ного уча та районов хромосом о яркой флюпросцетша-?;/При использовании метода 505-яого учета ярко, снзт.тдихся сзгмеитоз хромосом ...различий по обдзрукояо. На кал взгляд, это ссидотзль-ствует о' больаом влияния; субъективиста о«сш;а нд результата

восприятия последователя. Считаем поэтому, что .-дал лрзведзнйя сравнцтельно-популяшюнкнх доследований предпочти тальм о .метод СО^-пого' учета ярко свегяедахоя С~оег;.-,аитоз хроиооом.

Полученные п пастояэдй работа дотше о рз^тачагадейся з:го-с. бв?схи разных Г? к овязмазлия пззлжмнх крася татей я с лнчайдзмся яячкяйй на лнкойиао ларл.'.атрь раа»ш: Г? рзэл8«рих' способов предобработки прзьарзтов согласия тля о деязплсыш»

зо последние года ь цятогене тике на только человека, но и д руглх объектов данниии, свидетельствующими о не однородности ГР. На структурную гетерогенность ГР указывают и результаты проиедпансгс иамй нсслодов.зш'л сегментации ГР в промотафазных хромосомах. Специальные исследования фрагментации 1Р намного-члеленны и в основном ограничиваются наблвданиями сегментации лркс сошосресцкруюшего гетерохроматического сеилвнта У-хромосо-1лг иослч уКшр.тда. Нети обнаружена Соплектация С-гетерохрома-тьчеемх районов я проматафазных хромосомах I, 9, 1С и У, по частота сегментации.:; количество шяаюшшх субсегментов у рал них хромосом било различно. В хромоосгах I и У сегментацию С-Г'стерсхроматлчоских участков наблвдяли практически ао всех изучомых клоткех всех лиц, в хромосоме 9 - у большинства ассле-доебнлык индиьядов, в хромосоме 16 - лшь у 4 лиц (в одном из IX,молохо.о) из 16 обе.- щопанннх. В большинстве случаев сегментации гзтйрохромагачаских участков хромосом I и 9 выявлено ах разделение на два небольшие околоцеятроморныа субсегменты (ло-кализо'азнкиа в коротком и длинном плочзх в примикаадав пепоо-редегмлно к центромере) & один или несколько большего размера ярицонтроморные субсегменты (соответствующие области вторичной шрстяжа этих хрсмосо.«). Обнаружено независимое иолшлдаваду-альнсг, варьирование размеров выявлена»; субсегментов. Еолзе чем у долозича обследованиях лиц (у 2 из 15) размер гетзрохро-мажзексгс окплоцентсомерного субсегмента в коротком плеча хроиоссш 9 был больше точкового. Распространение окслецентро-Мс1 Рхюго х'оторолромлтичоскох'о сегмснта на короткое плечо хромосом:: 1 наблюдала роаз Су 3 аедпеедов из 16) -

Текем образом, результаты цатоморфологачаокой части ра~ оогк поаазпаают гетерогенность Г? как и различных хромосомах.

гак и а пределах одной и той же хрсмосош и указывают на организацию ГР из дискретных субъадпшщ,

М сл е к .у ля рн о -т та т о ге н а ч в с к я й анализ поликорЕпзма

го те рохпомп гичя склх па-Дор^, хрруосом^м°2ШШ.

С целые анализа молекулярной природы цитологически наблюдаемой 'ниоднородности ГР была проведана гибридизация на хромосомных препаратзх трех клонированных повторяющихся последовательностей ДНК человека (одна альфоидная и две.последовательности отДНК III)-. нуклеотпдиые тексты которых были расшяЛрова-нн и было известна их-хромосомная локализации - Г? в ряде хре- ' моссм.

Для количественной оценки результатов гпоридизации с целка дал^нешааго их сопоставления с цитологическими харакгорисп'клдя ГР нам необходимо бшо решить ряд мемдичосиих вопросов. Дело в том, что, если вопросы методики гибридизации довольно■подробно оешцонн в литературе, то исследования, посшгдеялыо методике кодичеогвенного анализа полученных результант. почт;»., отсутствуют. В настоящей работа сделана попытка ответить на оледуш1ю

г; с с с » о с с псиасйи-из о. лч^^^дйоидил! ¿3 "¡.о пл. м'л чоно**

го "фона" определить на хромосомах моста достоверной локалаза- ' 131 и позторявдхся ку1;леотидн!1х последовательностей?-Как сплав ГЬ вариабельность результатов, вызванную случайными мпккло-точными различиями в колачаотшз гранул метки?.Опзотн на от вопросы важны но только для изучения молекулярной природы ппламир-фнзма 1Р хромосом, но к дня выявления потскциолыт молскудярлс-генотичйскпх мзркзроз хромосом человека (Ггьдилис, Ананьев, Т»'84). Денные, получен;«;« при гиОрчдязагаи о .млс;шьсь2иисй ял б-

фоздной дооледоветолькосуьи рН505, дали возможность ответить на указан' е вопросы и сформулировать ряд предложений, позволяющих' лол'' эффективность количественного, анализа распределения з хромосомах повторяющихся последовательностей ДНК, виявляемого путем гибридизации з11;и : I) местами закономерной локализации повторяющихся■пуклеотвдных последовательностей следует считать те участки хромосом, над которыми суммарное количест¿о гранул многих клзток многих индивидов яревшает оди-нпкозкй для всех других участков "фоновый" уровень; 2) при ана-лаое результатов гибридизации надо использовать количество гранул метки не над всей хромосомой, а только над местами их регулярной локализации; 3) для снижения вариабельности,, обусловленной случайными различиями в степени кечеяня отдельных клеток, в анЕЛизо следует использовать не абсолютные .числа гранул матки, а отяослтельше их количества; 4) при анализе, рекомендуется ва-лользовать данные только по тем ¡слеткам, степень меченая которых оптимальна для бияквснш всех мает локализации в хромосомах исьторядагхоя гтследозательиоствЗ исследуемого класса. Последнее прэдложэнле основывается на выявленном нами- гиперболическом характере зависимости относительных количеств гранул метки над хромосомами от степени меченая клетей (объясняется, очевидно, болыгамч различия?,да в числе копий исследуемого-класса нуклоо-твдккх коследоьатвльнсстеХ в различных хромосомах;, Ш рекомендуем при количественном анализе результатов гибридизации на хре -МП001,препаратах повторкюг^хоя последовательностей ДНК кс-г.ользо^рть клетки в определенном интервале степени мочения: от уроакч, кохха начинается стабилизация относительных количеств г*.етуу., до уровня, когда з местах иакболее частей их ло-гдджуэ-ди:' «Здявьегоч: слияние стдельшо. гранул.

Проведенный на такой методической основа анализ разуть- . 5*9*08 гибридизации на хромосомных препаратах одной аифокдной г • й двух последовательностей счШЖ III дал возкоккость но только оценить вклад этих последовательностей в цитологически яаблхг-даемай полиморфизм ГР, но а па; -ялельао получить количественные характеристики хромосомной локализации используемых последовательностей. 33 случае адьфоядной последовательности' (клоп pIISOS) анализ распределения'гранул матки у.38 лиц показал выра~. жаиную-околоцептромернуа локализацию изучаемой фракции ДНК практически во всех хромосомах набора. Выявлены зпаадтольпка меяхромосомши различия, большая доля метки связывалась- с сколо-цептромерянм районом хромосома 3 СХЗ,8$ от общогс калачесгяа •гранул метки наблюдалось над. каждой из хромосом 3-;:'парг.Ч Лан-Ела о среднем относительном количестве г_-знул метки над хремо-.сомами после гибридизации о этой последовательностью в клетках о оптимальной степенью мочения. (79 клеток 23 лик), прнведйшш на рио. I, хорошо согласуются с результатами изучения особенностей гибридизации последовательности р[£>05, получении:«; в схсдпих шгких'условиях гибридизации в лаборатории гекмякл ШЩЗ АШ СССР (Врсв, I98S). ..

С! -целью количественной оценки юэживдаавдуашшх различии результатов-гибридизации in situ получакние дашше бита подвергнута одно^акторному диапврсионяс?.у анализу. Значимая дом-понепта меаандга^Дуальпых различил в общей дисперсия бш;а выявлена для хромосом 1,7,12,13 а 22, причем и д*л этих хромосом доля мэ:ш!диа"дузлышх различий была саыотао доли маакле-течкнх различий Сдоля меяывдп мдушшик различий не пр»;лазала 1С-31£). На няш взгляд, то обстоятельство, что доа'Нпсриш .'.«г-пвдий'дуалы'це различия ;ы\ш оОняруж'зшг лтаь ;оя отах тх-ыкуу*,

- Ж -

14 %

1 а 3 4 Ь 8 7 1 в 10 II 12 13 14 15 й 17 1в 13 23 21 й « У

ХРОМОСОМЫ

Рис Л.Сроднее относитзльное количество (%) гранул цатки н&ц хромосомами после гибридизации с клонированной посла-дооательнсстьэ ольфоидной человека рНЗОа, Число обследспанннх ллц - ¿3, число щютолнзировшых хрсаоссы каждой п&ры - 153.

объясняется случайностью выборки. Могло предположить, что отдельные индивиды могут отличаться от остальных представителей популяции степенно копийеоотп исследованной Фракция зльфоидпой ДНК и в других хромосомах набора, но частота встречаемости тагах индивидов р популяции мяла. Об этом говорит также то обстоятельство, что попарное сравнение средних значаний относительного количества гранул метки над околйцентрог.гарннма районами хромосом отдельных индивидов в нэкоторю; случаях выявило статиотя-чоски достоверные различая и по другим хромосомам.

Аналогичный анализ, проведанный для дзух сатсллатдых последовательностей рИ>9 и, pFDIS, доказал, что для них мостами преимущественной локализация являются прицеигромерныо районы хромосомы 9, и, но сравнения с альфоидной последовательностью, мегхромосомные различия (особенно для последовательность p?D 9) менее вырансны (на рис.. 2 приведены средние относительные кольче ства гранул мотки над хромосомам посла гибридизации с указан-ними двумя последовательностями озталлитной ДИК III). Кроме то' го, если для альфой,цной последовательности местами локализации бшш сравнительно узкие околоцантромарнна районы хромосом, то для сателлитннх последовательностей матка обнаруживалась а над районами сторачних перетяжек хромосом 1,9, короткими плачам", акроцентричоских хромосом 13-15 и 21-22 и диотальной частью длинного плача У-хромосомы, т.е. практически над везг ' местами цитологической локализации гетерохроматических районов. На рис. 3 отражены различия в локализации альфоидоо>Та с'ателлеишх последовательностей на примере хромосомы I.

ОдноФакторный дисперсионный анализ результатов гибридиза-■ циц, проведенный дая 'обеих сателлившх последовательностей, вклеил статистичисяа значимую компоненту ме^индйЕидуальпкх различий для большяго числа упомооом в большуи дата этих различий

клон р РО 6 «ми р РОИ

и!

шЖк

И 12 и И 15' 16 » 13 13 Я

ттс.зт

I 1

Рис.¿„Среднее относительное количество (%) гранул метки над хромосомами поело гибрндигодш с двумя-клонкрзвавр&ли посла-Аог.ателкк>стяыл сателлигкой ДНК III иолооока. Число обследованиях лиц для посдодосатольносм рРО 10 - 16,

дли ррс 9 - П,

Подчеркнуты номера тех 'хромосом, средние относительна«! коли-

гранул кзтки над которыми статистически достоверно самич'ались.

Рйс.З.Локализация гранул метки яад-зсрочосоиоП I после'гибридизации с илснироваяяьми альф'оидной н дьуда сателлцукаи гос лодо н94,влы»остями .

.Число'обследованию лиц для аяьфоидной лпсяваоеатоиьчастн-ЗЙ,

дчи сйтсллитдах последопьтельмооэ'ей - 30, каждого ичад-ь."да проанализировано 6 - 10 клеток.

в общзй дисперсии по сравнению о альфолдной последовательное- ■ ТМ1. Д7И хромосомы 9, например, эта дтля в случае гибридизации с последовательностью p'PDlS составляла 62,4.?, превышая долю кеуллегоч/шх различий. При анализе результатов гибридизации in situ оонарумендио различия я выраженности мсгосромосомных я молавдапедуальшсс различий для альфоидной и сетоялиюшх нооле-довательностай указывают на перспективность использования некоторых сателлнтннх последовательностей в качестве молакулярно-гакстаческах маркеров, а альф-эвдаых поелвдовагельаоотвй - в качества молекулярных маркеров хромосом,

При выполнении расскатрппаоной часто работы било обнаружено влиялие способа предобработка препаратов'на результаты гибридизации iu a-itu. Опыт гибридизации на хромосомных препаратах клонированной последовательности саталлдтной ЛНК III pPDlS был поставлен в двух вариантах: у 14 индивидов гибридизации прад-шствосаза окраска хромо со;, шкх препаратов по методике dA/)AFI, у ГЗ яздашгдоя.гибхедигацил бкда проведена без такск предобработки. Сравнение полученных результатов показам статистически доо:?ог.ергше различия в ерздпом относительном количество тронул ;.шт::и над рядом хромосом. Предобработка препаратов но методике ЛАДАН увеличила специфичность связывания метая: ббльаая деля шиш кшмллзсь на хромосоме 9; штка отсутствовала а л ой усах, и кслсрых без предобработки са количество было нсЕяачитсльшм. Механизм алияния окраски DA/bAPI на результаты последующей гибридизации in altuнеясен, так as, кок неясен мехациг« самой окраски. Модно предполагать,'что при обработка препаратов хро-иоаом перед гибридизацией некоторыми красителями молекулы красителя могут связываться с определенными последовательностями .Жч затрудняя их последующее выявления. Это паолюдение, которое

- S3 -

следу ог учитывать при проведении гибридизации in situ й оценке за результатов, 'на ваы взгляд, макет служить косвенны:! доказательством того, это различные места хромосомной локализации изученных сателлита: последовательностей различаются в основном числом я сияй по вгошиешхея последовательностей и в значительно меньшей мерз их голгалогичностью.

Uu с о па с та mm: результаты исслэдо»чшзя цигояогячяского полиморфизма гогарохроматичееккх сегментов с данными гибридизация лозторявднхея последовательностей ДНК на аюгафзэных хромосомах человека, В. связи, с .выраженной избир-iтальнооть'о габркдиаацяг клонированной альфоддной последовательности рНЗОо с хромосомой -3 нам ирбдсяодаялось'ангвроопш сопзстазить картины молекулярного и Р-псишморфазиа ояолоцентромерного района хромосомы 3, 0 этой целью у 6 индивидов, являющихся "гетврозцгстзмв" по признаку яр- '. кой фяксресценцип цгнтромерногс района хромосом 3, бше проведен подсчет гранул метка отдельно над каждой из гомологичных хромосом згой пары (идентификации гемолегез осуществили с фотонегативоа этих до штафазшк птаптинок, до гибридизация параевзних пропил-* акршшапраком). Суммирование данных по 42 клеткам тзота обследованных лиц не шязало стаикетлески достоверных различий я количестве гранул метки над токологами (над хромосомами с отсутствием яркого сведения сроднее количество гранул маки бшл даже, больше}• Отсутствие связи результатов пгбридязаци с картиной р-лаяшорфизма» пс-ьидамому, является свидетельством того, что яркую Фдазрзсцевцко сколоцинтроу.арнкх районозГнеясторых хромосом нссле {Мщраска нельзя объяснять преимущественной локализацией з этих районах аовторяедяхея посладова тадьнс стай альфоядпой . ' . iiosno согласиться о мнением тех исследователей, которыз считают,что интзнанвйссть ейвчеизя О-сегг.автов зависят на просто от содержа-

ния в ЯЖС АТ-сснованкй, а от пространственной локализации п нов-. •"оряеызстд куклеотидянх пар АТ и ГЦ в мплокуле ЛКК ( Sel.ftr.clor, СНшрвИе <3е 1а , 1873),

Мы силосыхши также размера ГР, выявленных окраской С и ЯА.'ЬА?I, о количеством локализованных над этими сегментами хромосом гранул мотки пооле гибридизации о двумя клонирования® фракциями повторяющихся .последовательностей ДНК человека - ельфо-идной рН505 в сателлкткой ДИК XII - р?в18. На существование взаимосвязи мевду цитологическим к молекулярным полиморфизмом указывает результата сравнения количества гранул метки над гомолсгач-ицма хромосомами (влияние размпий в степени ышралЕзаци» хромосом зля их кечеяия на эти результаты должно быть яачт-жш). Получен ние данкня прпвчдолп в табл. 2.

Сращение показало одинаковую картину для всех иослздован-шч хромосом 15 обеих клонированиях фракций ДНК, аспользовзшшх з гкбредиззцяа' 1п в1Ли : над хромосомами о большими разтлорагла готзрохромгтЕЧ-ских районов во зсех случаях среднее количество гранул гмгаи било большим. .Статистически достоверные различия в количество гранул мзтка над гомологичными хромосомами с ГР разного размера была о,.зарукенн доя С~оегмонтоз хромосом 16 (клон рНз05) и Э (клоп рН1) 18), а тажа прицентромзргшго ГР хромооо.'.щ I поете окраска 0А/эАР1 (кдон.рРп 10). Эш различия нодгверздеиы такие ^значениями косффицкбктов корреляции размеров ГР в клетках со сходными стопа пью егшралазацяи хромосом в степенью мэчания и количества докаднзйваийах на 'них гранул мзтка: полокителы-шз коэффициенты корреляции нзйдеш для тех ка.Т, для которых отмечени статистически доотовораае различия в ко* \гаестве грянул метки над гомоясгичаы-ш\ хромосомами.

Таким образом, результаты, проведенного анализа показывают,

Таблица 2 •

Средни? количества гранул натки иед гетзрохроматичаскжш районами гсмолсгичнжс хромосом посла гибридизации с двумя клонировышшя фрагыантамя поэтсрящихся последовательностей

.• ДК{ человека

Число ис-слэдовац-Окраска нк>; ыэта-фазкых пластинок

Количество гранул мзтки над хромосомаш

Г

9'

16'

16м. 15« 15"

Адьфоиднэя последовательность рНЗОЗ

С 83 ¡'.,04 1,72 - - 1,26 0,73

. (Р»0,05) (0,057^.0,01)

Саталлитная последовательность ДНК II. -рРОШ 1к4>№1 0,91 0,53 7,0 5,9 0,16 0,11 1,35 1,12

(0,0ЬР>0,001) (Ь0,05) (Рл0,05) (Й»0,05)

С 28 0,68 0,ЗЭ 4,4 3,2

(р>о,оо> (о,оь>ьо,о1)

со сл

Примечание - гетерохроматический район большого размера обозначен одним штрихом, а меньшего -двуыя штриз:ши.

что мевЕВД>"чидуашьные различия размере® ГР обусловлены различиями в числе копий не только сателлитяых, но в альфоадшх яо-■ следовательиостей ДйК, причем вклад отдельных фракций последовательностей в цитологический-полиморфизм ГР разных хромосом различен. Тая, различной для разных хромосом была выраженность корреляции размеров ГР, выявленных окраской С ив A/DAPI, о количеством локализованных над ними гранул матки после гибридизации о клонированной последовательностью рр d 18. Б случае С-окрас-кл статистически достоверная корреляция бнла обнарукена для -працентромэрногс- IP хромосош у, в случае окраски ЪА/QkPl - для ГР хромосомы I. Различия в выраженности коррел>пуш10- и DA/frAPl -сегментов одних а тех же хромосом отражают, очевидно, различную природу этих ¿<0 годов дифференциальной окраски хромосом.

Существование корреляции .между цитологическими и молекуляр-1Ш1 характеристиками ГР'было выявлено также путем изучения инверсий прицеятромерного гетерохроматического сегмента хромосош S. У двух из К человек, у которых была проведена окраска хромосом d A/tAPI, была обнаружена полная кнзерсия прицентромерного ГР хромосомы 9 (частичные инверсии при этой окраоке обнаружены на были), Изучение результатов гибридизации- in situ клонированной последовательности сателлитной ДНК III р? ь 16 у етих лиц показало '.изменения а локализации гранул метки над;парицеитромерным районом хромосош 9: количество метки над короткими плечами штерт и-ровшлых хромосом Шло заметно больше, чем над короткими плеча-га декзмеяенлых хромосом ото" пары. При исследовали - хромосом после С-скраске у тех ка. 14 -человек-были обнаружены как-полные инверсии иркедн грошраого С-сегманга хроиаоош;9 (у тех.»е-, двух человек, у которых они были выгаданы и после обработки с г<Ал5аГТ) . isx и честкчтае, нэ ьижденняо окраской У А/- EAPI [у rpi>: ччлоуэк; , Бшзвть измзлешм в локализаций метки в сяу-

чаях частичных аквероай прицентроморпих ГР не представлялось возможным из-за недостаточной для этой цеда разрешайтей способности использованного метода анализа. По этой же причина яальая ■ было сделать вьшод о том, какой из, использавэняих' методов дифференциальной окраска хромосом более четко отраяает молекулярный полиморфизм ГР, обусловленной разпшл числом кодий исследованного фрагмента стДНК Ш.

Таким образом, полученные нами результаты s согласии с данными литературы, основаннкма на других методах исследоп. шя, указывают на сложное'строение гетерохромагвчзокйх районов, в котором участвует несколько типов тандешс-организованпых повторяющихся последовательностей.

Различающаяся локализация альфэвдпнх и сатзллитяых последовательностей в хромосомах человека, разная внрлаённость мея-ивдЕвидуальнах различи! в количество гранул метки над ГР после гибридизации in situ альфовдшх к сатёялнтних последовательное тей, а такхе разный уровень гсорреляцип даашх молекулярного анализа а цитологического полиморфизма даот нш основание прецпело-нвть , что основяу» роль в цитологическом полиморфизме-IP играют сателлйтныэ ДНК, однако альфовдними последовательностями также обусловлена вариабельность.■ размеров:ЕР хромосом человека. След о-ЬпТиЛЬдо, oe^urtxmj, что и щущщиональная роль' этих двух

типов. повторящихсл аудаюотйддах последовательностей также шйза1 быть-различной,

' анажиа отттухуур-т^х тевиа'!Тов1Гй-^ро>г;с-

зозрэдтш и патслог.й^й); ,

В цел«»: получения довсагштелгвоЯ • гкфэршю'я дрл регегсая-зопт;осе о' бкслсгкчаско.Ч ролл гетсрохрома-гинз. солшс^Ългы хс^вс-

сои бш дссладоэан еще на одном - оргачязменном (фэногенегяческсм)т уровне. Морфологическая вариабельность «арпо'дша была изучзяа у . здоровых лид грех возрастных групп и у индяввдоа о репродуктивной патологией.

При наполнении итого этапа работы особое внимание уделялооь' методика исследования, что связано с противоречивостью литератур-них данных.

I. ПслркоеФиен С-сзгментов хромосом 1.9.16 и У у лип тро; возрао'тннх групп

. Количественный анализ (путам измерений) полиморфизма гетерохроматических С-сегментов хромоооы 1,9,16 а У был проведен у новорожденных, лиц 17-35 лет и лиц отарше 70 лет. Вое обследованное лица (как и в продндущих исследованиях) бшш латышской национальности, приготовление к обработку препаратов проводили однотипно и одновременно. В каадой возрастной- группе било 20 чо-лов5к. Анализировали 5-7 метафазнше пластинок кзвдого индивида. Степень егшрализащи иоследованных хромосом (определяли по средней длине хромосома 2) у всех индивидов всех трах групп била одинаковой. Данные для мужчин а женщин суммировали, так как . предварительно проведенный анализ. доказал стоутотеие половах различий размеров С-сегментов.

Ср&аштйльний анализ р-асизроа.С-оегментов показал,, что; в старших возрастных группах размеры ГР в хромосомах. 1,9 и 16, бол mis, чем в шадшях. Попарное оравнвнио размеров С-сегмспгов ъ созраекых группах (табл. 3) показало,.что в группе лиц старка 70 ас г как сушзр»53Я-Дшш .Снзегмеитон аиали&рруамше еугосом, гак ü £аэ»юук С—св;'М'ЗИ50В' а хромосомах 1,9 а 1й достоверно оодь-чем у изаорожммаяг« .Про оравши.» разизрзе ГР этих хромо-

Таблица 3

Результаты срагниталького'аяализа абсашгшсс размеров С-сегиектсз хромосом I, 9, 15 и У (кгси) у лиц разяях возрастных групп

Сравниваемые возрастные группы Размеры ХрОМОСОК!! 2 С Размер 0-се гментоэ хромое !ОМ Суммарная дли-

I '9 16 У ка С-сегаен-тов хромосом I, 9, 16

КоБороянеяяые Лица 17-35 лет 7,81+0,05 7,86+0,05 Р > 0,05 1,34+0,01 1,38+0,01 0,05>Г?> 0.01 1,25+0,01 I 25+0,01 Р >~0,05 1,01+0,007 I 03+0,009 0,05 >Р> 0.01 1,06+0,02 1,08+0,02 Р >~0,05 7,20+0,06 7,33+0,06 Р >~0,05

Новорокдзнныз Лица стариэ 70 лат 7,81+0,05 7,32+0,05 Р ;> 0,05 1,34+0,01 . 1,25+0,01 1,01+0,007 1,43+0,01 1,30v0,01 1,06+0,002 ? < 0,0001 0,1 >?"> 0,001 Р-с 0,Ó00I 1,05+0,02 1.07+0,02 Р,-~0,05 7,20+0,05 7,56+0,06 р* oToooi

Лица 17-35 лзт Лица старше 70 лет 7,66*0,05 7,92+0,05 Р> 0,05 1,38+0,01 1,43+0,01 0,05 >Р> 0,01 1,25+0,01 1,03+0,003 1,30+0,01 1,06+0,003 0,05^~Р> 0,01 Р>0,05 1,06+0,02 1,07+0,02 Р >0,05 7,33+0,06 7,56+0,06 0,05=-Р> "),01

Примечание: число исследуемых лиц в каздой возрастной группе 20 число проанализированных мстафазнчх пластинок 100.

сом у норорождшшнх и лиц 17-35 лег и лиц старше 70 лох выявлены ' менее шр&женяцз различи: статистически достоверны различия а размерах гагарохроматкчоских С-оагиентов хромосом I я 16 догя нопороч'!денаых и лиц праднягс возраста кхромооогл 1-й 9 для лиц сроднаго возраста и старккоа. Размеры С-согаентов в У-хромсссме у. лец исследованных возрастных групп не различались.

П. Анечиз С- а угюмосом у супружеских

пап с ушруиьнжка ренподустлчной пункции

Структурный полиморфизм ГР хромосом был исследован у одной группы. лиц с патологией - у супрукесяих пар, имеющих а анамнезе повторные спс.чтакшш абортн неясной этиология. При изучении связи полиморфизма хромосом с патологией чолопека нарушения рапро-дуктпзней функции представляют особый интерес, так как предпола-газтел, что псгсмонйзя частота' нееынешивашш беременности ми ройдеаие деты'; о пороками разаиг^я может быть следствием неблагоприятного влияния определенных. еариантов хромосом у супруяес-ких пар, имбпвдх ч кзрпотвпо этих хромооошша зорнонты. Дашше литературы о оеязи полиморфизма хромосом- о этой лг.тадогивй противоречивы.

Сравнптольный количсстеашшй анализ (путем измерений) С-оег-маятов хромосом бак прогеден у клинячоски здорозкх 25 мудазд и 25 г.ендан л 25 супружеских пар, имеющих з анамяазе на мапзе дгух спонтанных абортов иаьнясяоаной этиологии. Все яовдедуе.</ыз Онки латыаской нацисначьасстн, препараты хромосом обрабатывали однотипно и сдкрЕрзмешш, степень спирализацни хромосом п исследораннкх матафазисс пластинках была одинаковой. Бывд обнаружено, что как у мухчяп, так л у жедэдя с репродуктивной петолегигй размеры С-согчеясоп в хромосомах и 16 умоньвмщ (у мужчин это раз-

личке статистически достоверно, см.табл. 4). Достоверность ' различий по отдельным хромосомам только у мужчин, вероятно, объясняется яексторцми различиями в степени ояйрализацик хромосом (у женщин с патологией степень сшрализацпи хромосом била несколько лад, чем в контрольной группе). У ляц с отягощенным акушерским анамнезом (как у мужчин, так я у женщин) статистически достоверно уменьшено суммарное содержите измеренного С-гетерохродатина. Различий в размерах С-оегмептов в У-хромосоме не обнаружено.

Умзньшенге размеров С-ге" ^рохроматяческах районов у лиц с репродуктивной патологией было подтверждено и анализом ф-полиморфизма. Сравнительчый анализ Р-полиморфпзма был проведен у клинически здоровых. 70 муячин п 70 кенщин и 50 супружеских пар, имеющих в анамнезе повторные спонтанные аборты. Практически по всем изученным локуеам (за исключением хромосомы 3) большее количество хромосом с ярким свечением наблюдало • ь у здоровых лкд (табл. 5). Среднее количество ярко фяюореепкрую-■ них сегментов в расчете, на клетку у лиц с патологией оказалось статистически достоверно ниже (7,91), чем у лиц контрольной группы (10,0).

Данине, полученные при иеследоеакия полиморфизма хромосом в кзччештх группах, указывают, что вариабельность рагмзро ГР ' только в определенных пределах является нейтральным для организма признаком. Уменьшение содержания гетерохроматина з клетках лиц, ямсида в анамнезе повторные спонтанные аборта, ий неш взгляд, сиидетольстЕуег об определенной роли, выполняемой ГР па ракядх стадиях онтогенеза человека. Зги дашшо ссглпоу-ются с результата® работа Подугольшжозой с сошзт. (1282), которые наблюдали уменьшенные размеры С~оегмел?ов у дотай о

Таблица 4

Абгслогяке-размэрн С-сегментов хромосом I, 9, 16 е У (гтаО у здоровых лиц л в группе репродуктивной патология

Число - ,Средняя дли-

Гругла исследо- на хромосо-

вакяых . ш 2, мкм ■ хпомосом

Размеры С-сех.ментов хромосом

16

Суммарная . длина измеренных С-сегментов

1В2

. Цуктаяы '•'.."

8^38+0,05 1,55+0,016 1,41+0,018 1,13_\012 1,22^0,026 9,41+0,081

8,34+0,05 1,48+0,016 1,23+0,015 1,03+0,009 1,27+0,021 8,88+0,092

Р > 0,05 Р < 0,01 • Р < 0,01 Р < 0,001 Р > 0,05 Р < 0,001.

Контрольная

Роярсдтктквнэя 210 патология

Контрольная

Методу ктииная патология

Еенщины

176 8.^4+0,05 1,56+0,019 1.38+0,018 1,08+0,011

228 . 8,42+0,05 1,50+0,016 1,36+0,013 1,07+0,010

Р > 0,05 Р > 0,05 Р > 0,05 Р ? 0,05

•см

8,10+0,090 7,87+0,070 0,05-:Р> 0,01

Таблица 5

Ч&сыта встречав* остя интенсивно флюоресцирующих сегментов хромосом у здоровых лиц к в группе репродуктивной патологии. *

Се'-ыек? ' ' ' Контрольная грузна (п -140)к Группа репродуктивной патологии' (п-100) '

хромосома Чясло хрсмосом с ин- Частота Число хромосом с интен- Частота тенсяйног флворесцея- % сивной фзооресценциея %

■ у ■ .у шей' . . ■ ■ _;______

ЗрПсЛ .385 ■ 66,1 179 85,5 <0,01 .

4рПоХ1 336 • 47,6 4 2,0 <0,01

1^11 2 Й . 75,7 ' .126 63,0 >0,05

ХорЗЗ . зю 39,3 ' ■ 84 . . 42,0 »0,05

74р11 . ; 21 . 7,5 0 0 <0,01

34р13 . 367' . 59,6 ' 56 . " . 28,0 . <0,01

'63 22,5 22 и,о : 0,05 > Р > 0,01

15рХЗ. . 367 ; 5Э,6 101 50,5 >0,05

21рИ ; V 24 8,6 6 ' 3,0 >0,05

21ЛЗ :.. • 168 60,0 38 49,0 • <0,01

2Гр15 ,* ' • - • 77 27,5 47 23,5 »0,05

71 25,4 43 24,0 >0,05

"Среднее каиязстао ■ • ■ . . . -• • '

. £.еооресн#ьувдих 10,0 7,01 <0,01

Р-сйгмгатет ьа клгтяу . .

З^йИйчаЕйв? дааяыг да: куяявк л зеащкк не различается, 'поэтому они суммировали. - числе неследованиях лиц.

признаками нарушения амбриогенеза. Можно пред положить, что отрицательное влияние пониженного содержания гетерохроматина на ранних стадиях онтогенеза человека может сказаться пре*..з всего ш транскрипционной активности структурных генов, предположительно заключенных в ГР к находящихся под регулирующим их работу влиянием ТВ. Если ©то предположение верно, то дисбаланс по ГР означает существовавший на определенных стадиях онтогензза дисбаланс оо важным функционирующим генам, отрицательно сказывающийся да жизнеспособности организма. Менывее содержание гетерохроматина уновороадзкных по сравнению с ладами среднего и особенно преклонного возраста, на наш взгляд, является результатом отбора, на правленном против индивидов о уменьшенным коли' честном гетерозфоматина в хромоеошщх наборах, Пониженное содержание гетерох^ошгиаа у фенотупически здоровых, , но имеющих в анамнезе повторные спонтанные аборты жц, указывает, очевидно, на большое значение генотипа организма в проявлении отрицатель-' шос последствий для индивида этого уменьшенного содержания га-терохрдаотияа. Так как отличающиеся от норш данные обнаружены и у.кеящан, а у мужчин, можно предположить, что некоторые структурные варианты хромосом, в отдельности Сезьредше для овоих носителей, сочетаясь, в потомстве этих лиц, могут превратит« в факторы нарушаидаеонтогенез человека на рандах стдиях.

То.обстоятельство, что ии при сравяе*вш данных для пупд о патологией и фенотияячеоки здоровых яиц, гш при сравнении данных для разных возраотш* груоя не обнаружены- различия в размерах гетерохроматического сегмента в длинном мече У-хромосомы, указывает очевидно, на раЕЛгчцуг генетическую "цеаяоом" гетеро-хрд1<аТ1г*ув раьшх хроиэоонах, ра&ягляое фякциойашкм значение разных гэте.-рохро.:ч1ических райолов.

ВЫВОДЫ

I. У феяотипичзокп здорсзнх лиц латшгакой национальности наблюдается широкий полиморфизм гетерохроматических раЯоког хромосом, выявленный трем методами: G-Q а - эА/ЬАРЬ-окра'мшаяпегз,

2. В проыетафззшх хромосомах I, 9 и У обнаруживается высокая частота сегментация С-гетарохроматических районов с дифференциацией их на независимо варьирующее по своим размерам субсегменты,

3. Гетерохроматические районы хромосом челодека характеризуются структурной неоднородностью, на которую указывают различная их окршааваемость разшмя красителями, сегментация ь лроме-тафазшх хромосомах и различное воздействие ка них щелочных об--работок.-

4. Количественный анализ результатов гибридизации на хро-люсомаих препаратах двух клонированных последовательностей

стДНК III (pft>9 а pPDlS) и одной альфовдной последовательности (рЕ'305) выявляет различающуюся локализации альфоздиой я сатол-литшх последовательностей (строго околоцентромерниг районы дэд альфоидной последовательности и все участки цитологической локализации гетерохроматических районов, включая околоцзнтромершб, для сателлитных последовательностей) и-разную степень выраженности мекхромосомной и меаицдиввдуальноЯ вариабельности елъфсид--ной я сателлитннх последовательностей (для альфоидной дослодоза-тельноотз значительно' ввракенние мевдсромооомшо-различия а бо вира-генный мзкннд,извдуальгай ла'ш.;орфизм, для сателлитькс последовательностей венеэ. здраздявие меиромосо-.'нте и болоп от-чэт.'лшио нечиндаввдуальше' разлвчкяЬ

5. Солоата&шше далякзс гкбркдгэадш' ottu -едчой г^уЛ»-' здвой посяед<38нтоа>яо&<г& иа.дгдтоет<^нос:'?<!!? сгл-сллу-гпой.

ДШ III о результатами изл'срешй гетерохроматических районов показывает, что молекулярной основой С- и р/^о^Х-полшлор&игма при-цеитромерных гетерохроматических районов хромосом 1,9 и 16 является колекудярнгШ полиморфизм üü только сьтеллетиых, по и альфо-едкой последовательности, хотя вклад сатшшшшх последовательностей в цитологически наблюдаемый полиморфизм хромосом бо^шз.

6. Размеры С-Гетерохромат11ческ11х районов хрогосом I, 9 в 16 з трех иозрастшх группах (у ксворокдепяцх, лиц 17-35 лет к старше 70 лот) различаются: з старших возрастных Г£>ушах размеры С-сетаепюь этих хромосом больше.

7. В карлотпиах супружеских пар, тлеющих в анамнезе повторные опо«таняые аборты леяааоЯ отолота, С- д (^-гетерйфоиицо меньше, чем в хромосомяпх наборах здоровых лиц.

8. У ^дорсьш: пндиьедов разных возрастных групп я у лиц с репрсд/хгиьпоЯ патологией различия в длине С-сегмента дисаальяой части длгяного ялеча У-храч-осош не обнаруживайте, что указхдаа-ет на отлхчзэдееся функциональное значение гетерохроматического рагоча -згой хро/'оссчы.

?„ Результата исследования полиморфизма хромосом в разщх зсзрасашх группах сдорогих шцпвьдог., а также в группа лиг; с ропродуктпЕпоЯ патологией позволяют обосновать продлслогкзнае о пебдагоаркятях: зффеюго у;.;опьшеиного количества гегерохроматена, лрсяв/лютался ни разных савдпях оятсгелсза человека, к сделать заключение, что вариабельность раамерсв гетерохроматических районом не является нейурэльшш для организма признаком.

CIKGCK PAFQT, СПУБЛИКОЬЛЬБЫХ ПО ТИйЕ ДИССЕРТАЦИИ

X* Крумакя А.Р., Крсяквса В.Г. Полиморфизм С-сегмеятов .хромосом у ллц коренного населения Латвийской ССР // Ш съезд Лат-üSÜoKoro реопубликавохого 00п»стаа генетг'-.ов и селокционероз* им. ¡иигзиклопа: Тез .докл. - Рига, I2&2. - С. II- 12.

2. Круминя А.Р., Кропкйнз В.Г. Пслшлсрфизм С- и 9-ссгмзктсв хромосом у фэнотнтгаески здоровых лиц латкпокоГ- национальности // Полиморфизм хромосом у человека. М., 1381. - С. 4'.' - 55.

3. Круминя А.?., Кроаякяа В.Г. Полиморфизм хромосом у фено-типически здоровых ляд коренного населения ЛСОР // съезд Всесоюзного общества гснеткхоз и селекционеров: Тез.долл. - М., 1982. - С. 64.

4. Круминя А.Р., Хроияшна В.Г. Количественный аяаляз полиморфизма С-сегмгптоь хромосом 1,9,16 к У у фенояшачеекп здоровых лиц коренного населения ЛССР // Цоол.генет. 19-32. -

Т. 16. - И 4. - С. 56 - 59.

5. Круминя А.Р., Кршккяа З.Г. Шзшмсрфиза 9~сегколтов хромосом у фенотипически здоровых лиц коренного населения ЛССР // Цитол.генет. -- 1983. - Т. 17. - й 4. - С. 54 - 58.

о. Крушяп А.Р., Крошккна В.Г. Методика выявления тчасткоз структурного гетерохросатина зфомосом человека цутам С-окраокя // КкфзркацношшЭ листок Минздрава ЛатвСС?. - .1983, - 3 с.

7. Крушня А.Р. Полиморфг.агл гстерохроиатияовлк районов хро-косом "л нарушение репродуктивной функции человека // I Всесоюзный съезд общества-кедицшсю1х'генетиков: Тез.докл. - М,, 1334. - С. 170.

8. Крогяшяа В.Г., Еоокобойнек -Ц.И.,'Крумаяя Л.Р., Еасн-лкк Л.В., Ыелдере Л.В. Цкгогонетхчесхое наследование сулружгог.ах пар с повторными опентаякшя абортами // Школ.тенет. - 1534, -Т. 18.-Ю. - С. 229 - 230.

9. Восиобойник Н.И., йрушяа А.Р., Крошкяна В.Г. Частота инверсий околоцеятромерного гетарохроматкна в группе супружеских пар с найгяеягяма репродуктивной ф/шада // Х.1У Ежегодная Европейская конференция до мутагенам окружающей среды: Тез«докл. -

М., 1984. - С. 559 - 560.

- 48 -

10. Зннченко Л,К., Крушш А.Р., Крошкияа В.Г., Вевере И,А. Частота и распределение ассоциаций акроцеятрических хромосом в лимфоцитах человека // Цдтол.геиет, - 1985. - Т. 20. - F. -

О, 7.02 - 105.

11. Юров Ю.Б,, Александров И.А., Миткевич О.П., Крумиш А.Р. Клояирояаянш последовательности сателлитной ДНК III, специфичные для црицеятроиерного. гетерохромашна хрошсош 9 человека// Мол. генетика,шкробкол., вирусол. - IS36, - И 3. - 0. 9 - II.

12. Круыияя А.Р., Воскобойник H.F., Андреева АЛ'., Василии Л.В,, Крошкина В.Г. Показания к исследованию хромосом у супружеских пар с патологией потомства // Методические рекомендации Мшгадраъа ЛатвССР, - 1986. - 8 с.

13. Крошкна В.Г. г Крумши А.Р. Гетероморфизм хромосом человека в норме и при патологии .// Генетика и селекция в Латвийской ССР. - Рига, 198?. - С. 160 - 163.

14. Хруминя А.Р., Крошкина В.Г., Воскобойник Н.И., Зиячея-ко Л.К., Решетников А.Н. Полиморфизм гетерохроматиновых участков хролмсо.м человека я его молекулярная природа // Генетика и селекция в Латвийской ССР. - Рига, 1987. - С. 145 - 153.

Ib. Крушш А.Р., Крошкина В.Г., Восксбойник Н.К., Решетников А..Н. Количественный анализ С-сегментоп хромосом 1,9,16 к 7 ' у супружеских пар с нарушениями репродуктивной функции.// Генетика. - 1987. - ?. 23. - Jí'3. - С. 540 - 543,

16, Круыцач А.Р., Крошкина В,Г., Решетников А,Е. Полиморфизм Ç-ссгмейТОв хромосом у супружеских пар с нарушениями репродуктивной фуч/цик // Генетика. - 1937. - Т. 23. - !: 3, - 0. 5-14 - 548.

17. Кругши А.Р., Крошкина В.Г., Shksj—o Л.И., Восксбойник Н.И. Солмморфпзм хромосом в популяция Латвийской СОР (^еяотипичсо-кь здоровнз лпгд и две групдн патологии) // Изьестия A4 ЛчтвСОР. -

isa?. - д s. - с. 120 - t¿5.

18. Крукипя А.Р., Кроглслна В.Г. Клояировашшб повторяющиеся ' последовательности ДНК человека в исследовании полиморфизма и?-

терохроматических районов хромосом // У' съезд гене тисов и солея-пионеров Молдавской ССР: Тез.докл. - Кишинев, IC87. - С. 51.

19. Кру.чиня А.Р., Кролкпна В.Г. Использование' повторяющихся последовательностей ДНК человека в изучении молекулярных основ структурного поламорфапма хромосом // У съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров: Тез.докл. - М., 1337. - 0. 59.

20. Круминя А.Р., Крсккпна З.Г., Иров Ю.В., Гиндаяко ВЛ.1,

К методике анализа хромосомной локализации певторяклдаея нуклео-тедных последовательностей путем гибридизация in oil, и // Генетика. - 1988. - Т. 24. - й 5. - С. 943 - 946.

21. Крумякц А.?., Кроакина В.Г., Вроь Ю.Б., Александр i II.Л., *.!пткйшзч О.П., Гичдилкс В,Гг. Использование клонированной альфотд-' гай повторяющейся последовательности ДНК человека в язуче'шп ;:о-лкморфнзг.а гетерохроматиновых районов хромосом // Генетика. - . 1983. - Т. 24. - Л 5. - С. 93? - 942.

22. KrCtal'-jti A., Krc3h.kir*a V. Cytologics-l, noloculcvr тас! gsnotic hoterogoneity of hocferoohrofatJ.!-- rsgicno cf гмтлп chromosomes // XXX syrapo'jiura on cytogenetics of '.he Cneob'S'loval: biological nocioty: Abstracts.-Prague, I960. - Г.32

23. Круыиш A.P., К^оетита З.Г., &ров Д. Б., Александров К.А.. Миткевич С_Г!., Гиндплко В.". Количественный анализ хромосомной* локализации двух клонарованних последовательностей сателлытпоХ ДпК III человека о помогла метода гибрпдиаацш irv stta.

// Генетика. - 1989. - Т, 25. - Л 4. - 0. 521 - 530.

24. Крумлиа Л.?., Крошкяпа В.Г., ¡Оров D.S., Алзкоавдрсз И.А., Кнткевич С.П., Гиядклсс й.М. О корреляции полиморанз.та гетерохроматических сегментов о гибридизацией на хромосомных препаратах некоторых клонированных повторяющихся последоват-ельчос/ой ДЧл человек // Генетика. - IP89. - Т. 25. - й 5. - С, SC2 - 909.

КРУ и и к я

Астрада Ройэртовна

годажжа: хмшшштйческих районов хрожсом человека

Автор»lepan

Лодпдаено 2 зечзгь 25.07,69. Формат 6CocS4/I6. Бунйга -шсзая. ОЗъсы 3,0 физ.поч.л., 2,0 уч.-изд.л. 05сот. Тираж 100 экз. Воплатно. Зэкза if I0IS.

Иясют??; мвдвшшокой гвнетмш АШ СССР (II5478. Моск.1», ул.йоохэоизчьо, I).

Отпечатано на ротапринте ИИ. 225331, Pirca, ул. А. Уоша, 22.