Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм гетерохроматических районов хромосом человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм гетерохроматических районов хромосом человека"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ГЕНЕТИКИ

/Л

На правах рукописи

КРУМИ ня Астрида Робертовна

УДК 575.113:591

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕТЕРОХРОМАТИЧЕСКИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА

(03.00.15 — генетика)

Автор еферят диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА — 1989

Работа выполнена в Рижском медицинском институте Министерства здравоохранения Латвийской ССР

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук БАРСКИИ В. Е. доктор биологических наук КУЛЕШОВ Н. П. доктор биологических наук МИКЕЛЬСААР А.-В. Н.

Ведущее учреждение — Институт цитологии Академии наук СССР

Защита диссертации состоится «_» _ 1989 г. в

__ часов на заседании Специализированного совета Д.001.16.01

при Институте медицинской генетики АМН СССР (115478, Москва, ул. Москворечье, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМГ АМН СССР. Автореферат разослан «_»_ 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета доктор биологических наук

КУРИЛО Л. Ф.

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКA Г.ЛБОТН

Актуальность проблемы. Современными цитогзивтачвошм) магодами показана огрогаая структурная вариабельность хромосом человека (см.обзоры Захаров, 1977;' Проксфьеча-Еэльгозская, 1977, 1986); Работам по молекулярной генетика доказано, что основой межавдиовдуйльной вариабельности морфологических ха-ра к гари о ей к хромосом прехде всего является высока*: степень изменчивости генетически малоактивных, так называемых: гемрохро-магических районов UP) хромосом, содержащих многократно повторяющиеся нуклеотихушэ последовательности Д1К ( йозазп et al., 1Э75,. IC8I). Хотя.геномы мазгк лидоз ч содержа г большие количества гетерохроматина (например, в генома человека 20-ЗС$>, aro функцяоначьное значение до сих пор.остается навшюнешш?.'. Один из подходов для ропеадя этой проблемы - изучение структурного полимотгтщзьи хромосом человека в разных этнических я возрастных группах, а такта внявленяе связи ра^лячных вариантов хромосом с патологией человека.

Цитогене тиками собрана взслма обширная информация о морфологических вариантах хромосом человека, ибо исследование полиморфизма кариотипа человека имеет большее значения е теоретическом плана для раскрытия структурно-функциональной оргэнкза«-.. дай а биологической р<пгп гетерохроматина, а ¡также а практической медицине для мздико-генетического консультирование, установления групп сцепления генов, пргнаталвной диагностики наследственной пагологли, установления зиготности близнецов л т.д. Начатые з 60-х гг. исследования полиморфизма хромосом (ИХ) человека особенно широко разверну.шюь о 70-х гг. в сэяза с появлением штодов джрарелгдального окрашивания хромосом,

слссобст'вуш'да прямой .тазурлкзаг^а феномену полиморфизма на цитологическом уровне. Ссюзйляш и близнеце исслодования-ш доказано, tvo сгруятуршо паразита хромосом, лак прияло, наследуются не из дюне иными (Цикольг"ар, IS3I;Robinaon et al., IS75;Van Eyke et al., 1977; rliillips, 1977; McCrucicen et al., . Iw78 i; др.), установлена высокая стабильность вариантов ГР в разных тканях одного я того же индивида к в ряду клеточчнх поколений ( Hooin et ai., 1977), накоплен таклсс ряд фантов, свидетельствующих о цитологической разнородности гетерохроматических районов хромосом человека ( Jalal et а?.. Д974; Ifogonie st е.1.,1973; Вода et al., I2ST'Donlon, MaGsnis. 1981). Тем г.э менее, достаточно четкая концепция о природе полиморфизма карпотляа а настоящее врз;.щ еще на сформирована. М/.-лгио аспекта ца!-слогачеокой, молекулярной и генетической характеристик шшоюрфлзиа хромосом вз освещены я литорзгуре, либо дзшше о них лротаiсречивы. Ч.чоло яопуляционннх всслэдоеонйй лелгморраз-

хромо с о г." человека невелико, разноречивы даншв о связи ПХ с narojiomei: человека. Ъолшая часть этих работ проведена с ис-пользованна?,! одного - двух методов выяапэныл структурного го-т^рохрог,;атмпа без яоличеояабнкой оценки вариабельности ГР хро-лосо.м. Результаты, получощшз раэцк.а авторами, практически аз ара ваши из-за отсутствия унифицированных методических дод-хоиоа к анализу ИХ, Совсем на изучена молекулярная слогуфич-коегь гегерохроматачосках районов хромосом, npaxizveoiat пз so-слсдошнз молекулярная осяоъз цятологичоски наблхдаоиого полк-:«р.?кэкз хромосом. Но па во ома xaiœs роль гй тарохромахячоских участков хролюсогл ь онтогенезе человека,

л ."аддчг ;сзледот:аяпл. Принимая во внимание обще-то регичзское а практическое значение ке только огазтеь на вше

- s -

перочяслбЕнда ¿опросы, но а нпсбходамость додолняиельноЯ годной информации дня их решашш» ками было проаодека иоследчча-кяа с целью уогалоэлэяяд зклада структурной неоднородности ги-тарохроматячесгих районоп а и&ялморфизм хромосом л лыяелония связи еарязбвл.ькосгв гегерохромагачаскйх районов с патолога эй человека.

Указанная цель рзасизонака на основа комплексного исследования хромосомного полиморфизма в ЁТ.чичеоки однородной iif-'уяя-цяи (аорааное населенна Латшйокой ССР) о охга^ом трзх уровней проявления полиморфизма хромосом - мелок,улярпого, цитсморфоло-гачеакого и органпзмениого (фаноганатачаоиого).

Конкратаьш'задачи paöcm-i были сладутацяа:

1) для корректного сопоставления результатов цитоморйол'.)-гичаcauro, молекулярного я фенсгонбтичеокого анализа полкмср-фазгл хромосом решить ряд метидичзсмкх вопросов «оминвксппго исследования гетзрохромзтичьских районов хромосом;

2) колачосгпеяао оцедить полиморфизм хромосом, анчоляскнЛ

в пределах эмшчбоаи однородной грудга, трок* мояодош /¿^форвк-¡овальной окраски хромосом: G-, 0 - и дйстамициксм А/э AFI I ск— рзскаЭ A/d API); изучи-гь столеиь и характер сьгыантацчи с-ли-коз проглвтафазных хромосом;

3) иослэдесать хромосо.ануэт лсла/таандо трах плсяяроз^нних повторяющихся последозательиссгвй ДКК чолоизка Ссдпой

ней и друх посладоэотзльаосгей оагеллитноп ДНК III) ^ o-¡,<:m;oü .«явндаводушглшх различий рояультго.и лбрлдкзшдаа iri aitu i: язуглчь сзакпосшт дагслйхчяаскйх харакм^.сгян ac.n?y.cu'f,'.iz~ к а с о о о б и кпо с шли мялвкулнрпогс огг-сепял .r-з ?ярсхгж:'па«>,о«.'->? pji-OHOb хромосом;

4) оценить вариабельность С-гетерохроматачоскпх районов з грох возрастных-группах (г.оворощгяннш, лица 17-35 лат л старые 70 лет), отрзгсаюдих основные стадии по о гиа сального онтогенеза ч-лоиека;

5) провести сравнительный анализ полиморфизма хромосом

в группе лиц с патолзгшй (супруги скиа пары о понторными скон-гзаиша абортами неясной втяслоган) и у здоровых аддевадов.

Исследование проведано г, пределах npoi'paiam ПС-IT 0.S9.G7. по модациаокой генетнде и жмуаологпк. ' ■

Рпл'ччэя попипна результатов иоолалорзния. В работа шарике осуизствлоно КСМГЛЗКСНОе (|,?ол-ЗКуЛЛрНО-Ц11ТОГеКвТ51ЧОСКОа н феаогенетаческса) исследовато полиморфизма готерохроматйчос-ш районов хромопоп человека л разработана кагоднческал основа такого исследования.

Показана структурная неоднородность готврохроматачосдих рааоиоа хромосом чалоьака, .кг которую указываю? различная чх окралщвааыисть разпцш красителями, сегментация в прометафазных хромосомах ¡1 различное воздействие па ках щелочных обработок.

Впервые установлена частота ьстречаемсста различиях юрз-' зима р-, С- и в А/DAPI пелашр^изиа хромосом у коргнног-о яа~ саланая Лятаийсд'ой ССР. Впервые получена ксллчостэокнкз харзк-тзриогика полиморфизма гзтерохромашчееккх районов, выяадаиного ойраекой D А/ D API.

Предложен ряд мгтодачвеках прламоа, иопользуемцх при анализа результатов гибридизации на хромосомна npsnspovux клоди-•'ропаникх повторяицахса нуд^аогвднкх последовасгяьаоотсй. Впер--SK9-0 помощью двсперсиош^А'О. анолиза даиних гибридизация in ait и оценена мзникдишдуйяьная я маямгаточная вариабельность двух

клонированных последовательностей сателллтной ДНК III C?PD 3 ' я p?D 18) п одной альфовдной последовательности (pHS 05), Вн-яьленн большие моззидавидуалыще различия в случаи использования для гибридизация последовательности стДНК. Сопоставленном к ар яш цитологического полиморфизма хпомосом с результатами гибридизаций in situ повтсряквдхся последовательностей ДНК впервые показано, что основой визуального под макроокопом наблюдаемого полиморфизма працентромпрккх районов хромосом человека явдяотся молекулярная вариабельность как сателлитаой, так и аяьфоадяой ДНК, Вклад сагелдигиых последовательностей в цитологически наблюдаемой подиморТвдм хромосом болша, чем зкээд альфоядпой пссдедосзгельносги.

Ксслодосодшяш а трох везрзстят: группах (яоворо:.'датшз, лица 17-35 лет г лица старше 70 лет) шарэив покапано, что роз-мерн С-ссплентсв хромосом 1,9 в 16 ъ старших группах болью, чем э младзих (различая-для У-хромссомц из облзруивяа).

Сравнительна! лолшгеоггеянш ача-езем лолимер'азгла 0~ а Р' сегментов хромосом у фокотагшчсски здоровпх лиц и у (¡упруг.аскях пар, иметаих в анамчеза повторят» споитоишз edopru неясной этиологии, впервые установлено, что для указанной паполегла характерно уменьшенное количество структурного гегерехромота-»Я (К2» Q-. V"* ч fb-твдwплгтуктч'Рйяя ч тпттвпмт* T.S в ТЪ) . Различая для У-хромосоки не обнаружена (также кал з а исследованных возрастннх грушах), что указывает на о тачающееся функцлональдов значение гетерохроматического района отой хромосомы.

Результат« исследования полиморфизма хромооом в разных ■ возрастных группах здоровых индивидов, а также б группе лиц с репродуктивной патологией позволили обосновать предположение о

_ в -

неблагоприятном эффекте уменьшенного количества гетерохрома-тша в хромосомном набора, проявляющемся на разшс: стадиях онтогенеза чалоэвка, и сделать заключения, что вариабельность размеров гетерохроматических районов не является нейтральным для организма признаком.

Получаиназ данные намечают направления дальнейших- патологических и молакулярно-генетичосках иссладованлй полиморфизма гетерохроматических районов хромосом человека.

Практическая ценность работы. Полученные данные позволяют обосновать нрэделц вариабельности гетерохроматических районов у фенатапачоска здоровцх лад, что может найти применение в практике цитагаяетичаских доследований о мадякс-ганегйЧбоких консультациях. Данные об уменьшенном количестве структурного гзтерохроматина у супружеских пар с повторными спонтанными абортами могут использоваться для разработки методики сценки риска спонтанного прараьа;шя беременности в практике кадико-гаиеткчеоксго консультирования. Разработанные мзтодвчаскиз при-зга анализа результатов гибридизации 1п могут быть по-

пользованы в популяционпкх исследованиях пелмморйизмз повторяющихся последовательностей ДНК. Практическое значение работы состоит также в оценке, возмеянсотд использования отделыш-. фракций повторяющихся послодовагаяьиостай ДИК в качества моло-.чуллрнс-гонстаческях маркеров генома человека. ' •

Практически о рексмаццацпи, разработанные на основании про-пада;>;:г,го исследования, прпменгатся в практической работа лаборатории 1а5огег:етикя мадикс-геязтич^скай консультации Лот-ССР, отдела деИкзослогш; .с отдала охраш материнство з д'1тсл<а Щ-П'Л Разе«ого• ме,зациисйогс института. Организован (!££? г.) распубличалок«;?. научний се.-ачито "Кзлзльзогапча мола-

кулярно-ганетпчеоких маркеров в диагностике наследственной патология человека". Изданы информационный листок Манпстзрст-ва здравоохранения Латвийской ССР "Мэтодккэ адямения участков отруктурного гатарохроьягияа хромооом человеке путей С-окраски (Крутаня, Кроашана, 1983) я методические ракомвнда-т^иц Министерства здравоохранения Латвийской СО? "Показания и : исследования хромосом у супружаскнх пар о патологией потомства" (Крумиая, Воскобойни«, Андраова, Засилвк, Кройкина, 1987';. Основные положения работа включены в курс обучения студентов медицинской биологии и генетики в Рижском мздиципском илститу-■га и в спецкурс по медицинской генетика на биологическом факультете Латвийского государственного университета,

Аппо(1;тИ)Ч циссертетак. '¿атариялк диссертации доложена на: явух научных. семинарах исполнителей Бсеооюаой мвкинститутской программ "Полиморфизм хромосом человек»" (Москва, 1'9?Э, 1933)' НУ ежегодной конференции Европейского обцостла по .мутагг5нам внешней срадн (Москва, 1984); I Воаосйзнсм съезде научного общества медицинских генетиков (Киев, 19В4); трах Бсесоюзшхх научных, семинарах основных исполнителей заданий 04. СГ;-04. "Хромосомные основы нарушения, развитая , у человека" программы ГКНТ 0.69.07 {РаГй. Т9П5; Цпг.кйя. 1986: Харьков. 1907); двух Всасокзши совещаниях по структура и функциям хромосом {'Лущшо, Ш5, 1988); XXI симпозиуме цитогензгиксЕ ЧССР (Прага, 1288); научной конференция, ¡шсшщшьой 6 Осетию со дня р здания чл,-корр. АЖ СССР, дроф, /..^.Захарова (Мтслс, ГьПв); на I Бое-отрнек оъаада .чаэдзеках орочей (Рига, 1К9); двух със-.д;»:: оо-щчотпа гачетякоэ ¡а суленциунероа ЛагчССР (Сгзш!.«, 10;>1; >гг, 1Р86>; яасрланйа доучгмгэ сбидаотс-з екуасгв^'^кихлсго» лзтгге,«

(Рига, 197Я); заседании научного общесгза патофизиологов ЛатвССР {Рига, 1881); объединенной каучно-нрак тиче окой кон- ' ференции дамках арачей и акуасроп-х'инекологоэ ЛатвССР (Рига, 1961); пятя заседаниях научного общества медицинских гон6тиков ЛатвССР (Para, IS78, 1982, 1935, 1967, 1988).

Публикация. По теме даосертации опубликованы 24 научные работы (аз них 2 в зарубежной, 15 во всесоюзной и 7 в расцуб~ лякакской печати), список которых приводен в конца автореферата. ■

Структура работа. Диссертация состоит из введения, девя- 1 ти глав, заключения, выводов, списка литературы и прилежания с Ш£;р«]ю2ографиями. Она изложена на 169 страницах машинопиои, из которых такс:? диссертации занимает 153 страниц; содержат 56 таблиц и 13 рисункся. Список литературы включает 2?"2> наименований ( 55" на русском и ЪЪЪ на других языках).

Ссьовнна положения;, пыиосимна на■

I. Гетерохроматические района хромосом обладают цитологической, молекулярной и феногоноткческой гатарогакностып.

2. Альфощцще и саталлатяке последовательности ДЖ, входящие в состав гатерехроматпчеекпх районов, характеризуются различной хромосомной локаяизациой, разной степень» выршшшсс-шживдцавдуашш'Л. вариабельности, различным уровнем кор])едя--хда злокуляраого и цитологического полишрпизма.

3. Структурная вариабельность гетерохроматических районов на являотоя нейтральным для организма признаком.

4. Умгншен.чоо кслнчостио гзтерохроштяна а хромосомной наборе окезыпзот набдагслрилтаоа здиянив на онтогенез чалосе-ка, пр«7Ш23'лееся на разня? зге судиях.

■ СОДЬТИГОЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Объем п материал исследования. Для решения поета&юныи задач исследовал« разные грулли лиц, всего 83Э аэдивндов,

I. Феностшичаоди здот>овко индивид?;. Хрсмеоога исследованы у 335 здоровпх индивидов. Есе обследованные лица бцли ляпстской аациональносгл (до третьего поколения). Еацьшузл часть обследованных (295 чел.) составляли лица в возрасте от 17 до -ос> лет. В ззачсамостя от характера проводимого исолсдояшшч всех здоровпх индивидов можно разделит!, на следующие подгруппы:

I. L-rpyana из 70 мужчин и 70 женщин, у которых проведен анализ Q-поликарфизма хромосом. У 50 из них (25 мужчин и ,'¿5 кец-щин) проведан такие количественный анализ вариабельности С-се?-меятоа хршбеом 1,9,16 и У после обрйбогяя препаратов гидроокисью натрия;

1.2. - групп» из 25 чгунчиа я 25-женщин, у аоторнх тгкуз бич исслодоэан полиморфизм С-согмантов хромосом 1,9, 1С и У, но препарат обрабатывай гидроокисью баряя;

1.3. - группа аз 10 кенцик и 7 мужчин, у которых проведено количественное исследование полиморфизма гетерохроматических пяйлчпн, вмягелянных окраской о А/п API, У 14 аз них (3 яелпуш

и 6 мужчин) яз тех за препаратах затем бшга проведана гибридизация in situ с клонированной паслгдонзтольи>ютьг! рРв I'.i ctjjJiK Ш;

1.4. - rpynua so SO челоьок-(17 юни\т к К муг.ч:::'.); у кс-тор^х <5usa проведена габридив^шя хроме сом о г.Щ'Ш лпягролэд-шлла последеьвтчьиоатякй' ot0K 111 - рГо 9 :: j-Ри» 'Л. Галрчдд» оалпя ir. situ о кмоно.л рП1 IB o'ttrta •яг.здчем и и^таю*;:

I) после предварительной окраски прапаратов .с D Л/в API (О жен- . пая a G мужчин); 2) посла предварительной окраски пропялакрахин-ипрнтом (10 женщин и 8 муячян). Гибридизацию с кленом pPD 9 у II гаксщн и 7 мужчин таклш проводили посла предварительной окрасил препаратов пропилакрахЕнипратом. У 13 человек проводили гибридизацию i» situ с обоими клоиащ стДШС ИТ. У 8 человек поел« гибридизации in oitu проводили анализ размеров С-саг-ментов хромосом 1,9, 16 и У;

1.5. - группа из 38 человек (22 мужчин и 16 яаквдн), у которых посла предварительной окраски пр паратов пропилакрихин-ппрпх'ом и анализа Q-вариантоа хромосом было проведена гибридизация in eltu - о клонированной альфоядной последовательностью ЛлК человека (клон рНз05). У 19 человек из этой группы затем был проваден анализ размеров С-сегментов хромосом I и 16;

1.6. - одновременно обследованные 'три возрастные группы: новорожденные (20 чел.), лица 17-35 лет (20 чел.) л лица отарою 70 лат (20 чал.). Во.всех трах группах бия проведен количественной г.нглпз вариабельности .С-сегментов хромосом 1,9, 16 и У.

. 2, args^OT.^pK, fluytpie в n9W9"S3aJBmuaB"

ябооту. Цпгог.',кетачесш)е обследование о использссадизм дяф-$сроицеалыюй О -окраски било прспедеко у 252 супружаслах пар, обратившихся в консультаций'"Брак .и семья" г.Риги по поводу повторных спонтанных абортов. Вса супружеские пары били подвергнуты тщательному ¿шгш'ко-геястйческоыу обследованию, посла чого для анализа полиморфизма хромосом 6ïmû отобрано 50 пар ла~ vleïской национальности; пкзюачх в анамнезе не манае двух спон-•синаь'х абортов аавияшшной «ч-аологяв. как. нравзло, в j грд-мзетро барамзкности. При отбора материала псклкяата пары с

хромосомными аномалиями; о живороядянншз да ими; о профессиональными вредностям!! в анамнезе у кого-либо из оупругов; с заболеваниями, которые могла быть непосредственной причиной опоатинного прорывзпяя бараманноота. У отобранных 50 пар был проведан анализ {¿-полиморфизма хромосом 'одновременно о группой 1.1»), у 25 из я тих пар бил проведен такко анализ (¡-полиморфизма хромосом 1,9, 16 я.У (одновременно группой 1.2.),

Материалом дая исследования служили препараты хромосом, полученные из культур лимфоцитов периферической крова.

Матодц йойтедовадяя.

I, Культияиготоня с клрток и пуяготоидояпа хромосомных препаратов 30УШСТШ1ЯДИ ПО общепринятой МЗтодшш &00ГН<1Г.(1 в! а1.,

1960) о небольшими изменениями. й-окраску препаратов прг 'одилч из СЕекепрпготоачешшх препаратах по модифицированному матоду Патвла с соэвт, ( Ге^ц аг а!., 1971).

2., Внявлеиме и акатгаз О-сегментов' хрокдеом. С-сегмонтц в:г>-ляли двумя способа».© - воздействием гидроокиси натрия по модифицированному матоду Арриги и Хсгс (Агг^ьз., Нзи, 1971) й гидроокисью бария по модифицированному катоду С а:,вера с соалт. ( з-лтег аь а1., 1971). В огличиа ог обичяо лршапяемой в предложенной наш матодякя используется другая концентрация солевого раствора для инкуб ада и препаратов, з таглз иная пподслкиголЬ" • ,. кость различных этапов их обработки. В результата отте изменения грзницк внйвдяемых готерохрокатяческях-со гманго в сталл болаа четкими. Для фотографирования ■ я даяьяейшаго измерения хромосом отбирали «отафззяый пластинка, ответатие требованиям модемет~ рячбского анализа. С помочив фотоувеличителя с нзгативз рисовали кокеры обоих хромовой 2Ф гак ягк отбор юзтафазянх пластиной оо сходной степенью опиралазацаи хромосом проводив-по длина

хромосомы 2 (усредненной но четырем хромагадам). Хромосома 2 для отбора била выбрала из-за ее длины, хорошо коррелирующей о суммарной длиной набора хроноооы, легкой идентифицируемости и мз-зэ отсутствия в этой поре хромосом больших блоков гстерохро-матпна, окыьаэдихся по конденсационным свойством от оухромати- . ческих районов. Длину обеих хромосом 2 на зарисовках измеряли с помощью лупы МБС-2 (цена деления измерительной лиязйки 0,025 шм). Для определения размеров Г? у кздого индивида отбирала но 5 ма~ тафазннх пластинок с душной хромосомы 2 от 8 до 9 аиш при обработке препаратов гидроокисью бария и от ? до 8 мкм при обработке гу.броокисыо натрия. Из-за незначительных размеров блоков С-готарохромзтйна в йольшнстер хромосом измеряли С-сегменты лишь в хромосомах 1,2, 16 и У. Измерения проводили о фотояагатявов по методике, предложенной Подугслышковой с соавт. (197Э). Раз-мэры С-сегмантоа гомологичных хроглосом дгя каждого индивида находили усреднением по Б клеткам отдельно для С-сагшнгое с большим и меньшим размером, обозначения их одним или двумя ттрихаш

i и

соотЕотствза м (например,. I и I ). Характеризовали размеры С~ сагментса как абсоллткой их длиной (й микрома трах), так и относительной, Относительные значения размеров С-оогментов хромосом 3:,?, 16 я У для >:адцвяда рассчитывали как долю от их суммарной даны в исследованных яутооомзх в процентах. Для оценки ошибки измаранлй было сделано по 60 измерений С-сегментов обеих хромосом I, Эк ,16 одной клеши Средняя ошибка измерений для нашего материала оказалась равной 0,05 шм.

3. Вялачанг^ хромосом. Для окраски

хремооом использовали прошиткрихинаприт, синтезированный а Институте ядерной физика АГ СССР, Окраску препаратов проводила

по модифицированному методу Шваршахора ( Schwaraaciie?, 1974). Изучали по 10 шгафазных шгастя.чок ааздого индивида. Исследовала вариабельность сегментов ЗрЩИ, 4pIIqII, I3pII, I3pI3, 14рИ, I4pI3, I5pII, I5pX3, 2IpII, 2IpI3, 22pII, 22pI3 и диоталь-ной части длинного плеча у—хромосома. Интенсивность фяюрасцеццйя . оцанявали только как. яркую (4 а 5 баллов по Парижской номенклатуре) или неяркую (1-3 балла) (Paria Conference, 1971;Supplement, 1975). Для оценки гомо- или.гетерозиготноста изучаемого сегмента по признаку яркой флюоресценции применяли методы Южного я 50£-ного учета свечения, прздлокекшз Мияельсаарсм (1979). Пра методе I0¡?—него учета "гомозиготой" (+t)'инадиввда очатали в тух случаях, когда яркое свечение обнаруживали в обевх.гемрлогглшп: хромосомах хотя бы в одной из 10 изученных клеток; "готарозиготой" {+-) - осла яркое свечение обнаруживали только э одном гомологе определенной пары хромосом; а "гомозиготой" {—) - если сет-мэнт на вмал яркого овачаная на в одной: из 10 исаяадавбнных. клеток. Прз методе 50^-ного учета регистрировала тот Tai свечения сегмента, который наблюдали а больше! чаоти .изученных клеток, йты свечения оценивала- в баллах; - 2 балла, "+-" - I балл,

-"О баллов, . •

4.Окраска-'препаратов дясташцннозд A/óffil и; анализ. гкягкдац-ного полпиорФазма гдташхрокастчсских районов .хиомццич;. Cupaúftj. препаратов проводила по ко'тодике, • аредаозтенноЛ Иигйцбром с соавт, ( Sohwolsep. et aI,,-297&) ¿ :;оогласкс которой пропурагы'после 15 . ан обработки рстбарйй-дкстаулцанй А (з Л)- красили фяюарзхро-мом 4' . Ф API) *. Для аоморшшя разке- :

ров .ГР у каждох'о-ЕН.давйда с.гч5:ирз.,щ1 лс Б мчтафадагх пластинок о . длиной хрочпоолш 2 off (5»S до .7,3 мйй.гВДк «ая пря шфзеле я.оддэ«. paicü о o A¿> K?L[KW^aniyiek'-it 15; -I5,B'y,Jre ex

размеры а измеряла (за исключением ГР хромосомы 15 из-за малых размеров выявляемого оегмента-, величину ГР в коротком плече этой хромосомы оценивали в.баллах). Измерения и анализ результатов проводили по методике, списанной для С-сагментов.

5. Приготовление препаратов проматасбазных хромосом. Препараты проматафазных хромооом получали по модифицированной методике Юниоа (Yunis ', 1976). Для синхроназациа клеточных циклов sa 22 ч до фиксации в яультуральцуа смесь добавляли аматоптерин в коночной концентрации моль/л.

6. Гибридизация на хромосомных препаратах клонированной аль-Фоипной последовательности pHs 05. Данная часть работы выполнена на база „аборатораи генетики ВНЦПЗ АМН GGGP, Для гибридизации. in situ коллекции Pat I -рестрактов ДНК человека, клонированных в штамме К-12 b'.coli в составе векторной плазмиды рКы 001, был выбран рекомбинантный клон рНз 05. Эта клоно тока быда получека в лаборатории генетики'ВНЦПЗ АМН ССОР Яковлевым (1983). Вы» бор указанного клона объясняется содержанием в. нем вставка ДНК человека альфоадной природы.(Зайцев, IS04), а такке иго хромосомной локализацией в прицентромарных районах ряда хромосом, преимущественно в околоцеятромердом районе хромооош 3 (Яковлев, 1983; Александров и др., IS86; Юров и др., 1985). Тригдевую мотку о пробу ДНК вводили о помощью ДНК-полимеразной реакции замещения - методом ник-трансляции. (Rigby ,et &1.Д977), Гибридизацию на хромосомных препаратах осуществляли по методу; Голла и Пардю

( Gall, Perdue, 1971).а модификации Юрона -(1384), Препараты ма-тафазных хромооом (вве одновременно приготовленные) денатурировали в 0,07 я. к аШ-(рй 13,0) в течение 30 и, затем отмывали а -двух смонях 70с~ного я двух - 96°-ного этанола. В состав .оибри-дизацйонпой смеси кроне Z С их с тки 50$ формаындэ, 1"05? дак-ст^шсулНята, Т.СО мкг/м" полк (А) и радаоактивная проба доча-

tr

турировавной Л1Ж (0,15 . 10° pacn/шн на I дал смаси),Гибридизацию проездили а течение 18 ч при 37°С о последующей асмявкой препаратов а 2 33 С (при 37° к при. комнатной температуре) и в этанола (70° и 96°). Посла высушивания-препараты покрывали эмульсией тала М (ГосНИИздм&отшроаяг) л экспонировала их в темноте при комнатной температура-14 сут. Пссле проявления радиоавтографов препараты окраимвзли красителем Романовского-Гиглза, Распределение матки но хромосомах анализировала путем

подсчета rpanyi серебра над каедоЛ хромосомой. Для ядентлфида-

/

ции хромосом^/ вспо."ьзовада ч^ртоногативн' тех на матафазных пластинок, окрашенных до гибридизации пропилакрвхинапритом. Для каждого индивида анализировали шэ-мЬнаа 5-7, шгафззшвс лласгсвок. С-окраску части препаратов после гибридизации прзаодиял выше опиоан-1шм опое об ом, метку удалял!'! путам погружения препаратов на 30 кии в горячую воду (Епифанова и др., 197?).

7. "Гдбтщкзация па уромосомньгя: ярэпасагах лиге клонированных п.пслаловат<У)ьвоотаЯ стЛНК III' (пооладорз'тельпостя cPD IB). Использованные аработе ■ клонированные иоследааатаяь-■ ностз отДНК-Ш 6уш нам дабазно предоставлены'Де'йнинямром (Университет штата • Луизиана,' США).,Опяса вив этих -последозэтельяое-50Й.Я-ЯХ нуклеотиднив таком-приведена а -статье'' Дейвйняора о оо-авт. ( Deininger et al., 1981). ;Цетодика владения радиоактивно« • не иск. в пробы ДНК в гибридизация на одаовроме.-шя стандартно яр-готовленных хромосомных-препаратах в пргтципе\'нв отличалась от описанных для клонированной аи^оидной ' после .яоватедьяоотп pßSOS, Поело: завершения ДШ-налиморязяой рапкцш замещения удалымя

- С - ' -- -

радиоактивность ДКК соптазляла 1,24.Ю"1 ймо/шш дяЯ йяокзровии- • ной последовательности-рРЗ 10 и,1,12.10° да p?Df'.

Препараты мета^азных xpovlrim'доаотупйровблЙ а О,Г// п. аШ

в м-хание 15 с. Под покровное огзало наносили 20 мчл готовой гибрядвзационной смеси, содержащей радиоактивную. пробу денатурированной Ш\ (0,13 Л О5 paoii/ти на I мал смеси для рРВ 18 и 0,11 ЛО5 расн/ман на I мкл смеси для р?а 9). Врали экспози-циации радиоавтографов осота шшю 7 суг ядя р?0 28 а 30 оут для рРэ 9. Часть ирзпаратсв (дта 14 Человек) перед гибридизацией la oitu о клонированной последовательностью pPD 18 окрашивали р A/tAPI. Дифференциальное G-окрашвание покрытых эмульсией прз-наратои хромосом проводили, посла проявления радиоавтографов, используя я этил случае краситель Райта ( Ch^adior, Yunig, J.378). Во всех остальных случаях после проявления радиоавтографов прзпароты окрашивага lOjTr-iiHV. раствором красителя Романовско-го-Г«мз ; адентафацаровали хромосомы с фотонегативов тех еэ ме-юшазьых пластинок, окрашенных до гибридизации провалаараханип-ритом. Дет каждого индивида анализировали не 'гчнез 5-7 метафайлах пластинок. С-окраску части препаратов после гибридизации in situ проводили способом, ошеанным виге. Мзтку удаляла псслсдоватольноХ обработкой препаратов растворами колазосикеро-цизтого калия в таофосфата нзт. m (Слезикгор, Прок офьевз-Бьль-гояскся, IS65),

8. Сгвуистдазскто обработку пиФрошх данных проводили по общепринятым иатодам для вычисления и сравнения средних параметров, к оррз ля: июни его и одпефакторного дисперсионного анализа (Урбпх, 1975). На всех ртапах работы, если предварительный анализ на тшвлАт-различий меяду полам, данные для мужчин и женщин суммировали.

Ввиду значительно« методических трудностей при исследования полиморфизма хромосом начали экспериментальную часть работы с оценки влияния на ланеГшне параметры ГР двух факторов: способа предобработки препаратов и стапэнз слиралкзашм хромосом. Для зтоД цели была использована С-екряска хромосом.

Различия в размерах С-сог:геятоп хромосом в зависимости от способа обработки препаратов и степени гяшралязациг хромосом бшш проверены в двух сериях экспериментов: I) препараты хромосом одного ц того йе индивида бшш подвергнуть; различной телочкой обработке (часть препаратов сбрзбатнаали каШ, члотъ -Ва(ОЭ)р), причем в каждом случае доследовали 80 Агауафазшс: пластинок с одинаковой степенью спЕрализация хромосом; 2} различной дел очной обработка били подвергнуты препараты хромосом 25 мужчин и 25 гонваа, причем различалась тзкйо степони сяпра-лизапяи хромосом в исследованных мотафазпых пластинках. Результаты' экспериментов первой сэриа показали, что.при обработке препаратов гидроокисью бария размеры С-согмактов хромосом 1,9, 16 а 7 статискгмска достоверно больше, чзм при обработке препаратов того лее человека гидроокисью натрия (при той :?,о,степени спиралнзацил хромосом). Била обнаружена также разница откс-"" си телышх длин С-сегмантов (статистически достоверна для хроми-сом 9 я У), что свидетельствует о различном влиянии щелочной обработки на .ЕР в разшж хромосомах. .Результант экспериментов второй серии показали, что при исследовании размеров I? хромосом даже у лиц одной я той ;га популяции, но с использованием отля-чэгсцихся католических подходов (а данном случае - различная

•деленная обработка а отличающаяся степень сплралкззцки хромо- • сом) могут бьяь получены сильно различающиеся результаты (е пашск исследовании - статистически достоверные различия раз-мерой С-оешзнтов хромосом 1,9,16 и У). Очевидно, что ¡мтафаз-нмъ ялаегшш -с оолез дековдекенровашшш хромосомами, отобранные б узком интервале степени «парализации хромосом, более информативны дд>т шявлзяия различий'я размерах блоков С-готорохро-маглка при проведении поиуляцишишх исследований, при сравнении неруу с патологией и т.н. 3 литературе, цгсаяпшшой анализу по-лшорсизка С-сзлленгоа хромосом, предложено несколько способов . отбора шгеафазаых пластинок по степени спирализяции хромосом влк соответствующие метода коррекции, однако сил но нашли широкого применения. Ведосгагком метода "нормализации" результатов измерений с использованием уравнений регрессии является то, что при отом не учи' ивггатся различия в скорости совралязацпи как индлвидуальнкх хромосом, гак и отдельных частей хромосом. Думаем, что кргдяоЕанкнй наш способ о испольуованием суммарной длины хромосомы 2, несмотря на трудоемкость, дайт возможность отобрать метафаэкыз пластинки в очень узком интервале степени спиргдгяадки хромосом. Учет раЪсмо транша: методических моментов имеет псрностепанчоо значение, так как различия в степени слгралЕзацпп хромосом а в способе обработки препаратов, на ааи взгляд, яадлется главной причиной различевдахся рззуль-т«5'ов как при нолуксличеотвенном (сценка в баллах), таз й при кодичвсгв«мком (прямые измерения) анализа полиморфизма ГР хромосом,

Лет визуального изучения под микроскопом полиморфизма хромосом нами использованы три метода выделения ГР: С—, р- к £АД>АР1- окраска. Получены количественные характеристики вари-

&С шпионя ТР. Обнарупет: I) выпаявшая меяадмшдз'апшш вариабельность разыерйз I? (например, крайне зщ. гения размеров I? на хромосомах I и 9, всгречаяцяося р исследованной популяции, различались в 4-5 роз); 2) у часта индоадоэ вариабельность лшалазащш 1Р в виде полной яла частичной инверсии при-центромерних 1? (наиболее часто в хромосомах 1,3 к 9); 3) цитологическая неоднородность ГР хромосом, проявляющаяся в различное способности к связывании разных красителей гетерохроматическими районами разных хромосом и даж разными пастями ГР одной и тоц же хромосомы. Например, С-сирьска вшшллс ' щмжтичес--ки все районы структурного гетерохроматина в хромосомах человека (цзнтрожркые района всех хромосом, короткие ¡глечи акроцеггг-рпческих хромосом, участки вторичных пзрететек хромосом 1,3,15 и дистальнув часть длинного плеча 7-хромосомы); окраска т>А/сАР1 выявляет только ГР вторичных перетяжек хромосом 1,9,16, короткое плечо хромосомы 15 п дисталгдую часть длинного плеча У-хроиосоми. В результате проведенного исследования наш вняв' лоны также различая размеров I? в одних и тех хромосомах после окраски'С я о А/-) ЛР1 (табл. 1). Статаст.тчеоки достоверно показано, что II5 я хромосомах 16 и' У яссле С--окраспл имеют меньше размера, чем после окраски о А/Ь АР1 (это несмотря на то, что при С-окраске были использованы солое десшфалг.зованные хромосомы). Обнаружены также различия з частота швереяй ГР при использования йтпх двух мзтодоз окраски: частичная инверсия О-сегмента в xpoi.ro-сокй 9 у 12 лиц из 50 я полнее отоутстъае такой шшереки поэлв обработки о А/> АР1 в МЯ у.з хромосома у .17 лиц. Эхо наблюдение согласуется о да;шаш, приводимым! в литература последних лет, о няг-кой реальной частоте встречаемости частичной инверсии прпценгромер-кого ГР хромосош 9 (в большинстве случаен частичная шшерсия

Таблица I

Размеры гетерохроматических районов, мхм, выявленных разными способами и их коэффициенты вариации" (КВ),*%

Количество Срвдшш

Ойраииа ' исследован- ДГЫНЙ Хромосома I Хромосома 9 Хромассма 16 У - хромосома

индпви- хрсмс- Размер КВ Ризкер Кб Размер I© Размер КВ

. *>» сош 2 ■ ■ .

50 7,12± 1,094 0,94± 0»82* 0.85±

±0,05 ¿0,016 15,5 ¿0,013 13'8 ¿0,008 9,8 ±0,018 10'5

МЛАК *7 6'57" 1'0Й: Т* Л 0,56± ТЯ 2 0«93± ™ Л ^ то о

^ .±0,04 • ¿0,013 15'4 ±0,010 13'2 Ю,9 12,2

Р<0,Ы1 Р>0,05 Р>0,05 Р<0,001 Р<0,001

С-сегмеата а хромосома 9 является лишь отрачаниог? увеличения размеров гетерохроматического участка, его распространения на короткое плечо).

Сравнение полученных нами результатов количественного анализа С- и Р-лолнморфазыа хромосом у коренного населения Латвийской ССР с данными для других этнических груди затруднительно (для полиморфизма, выявленного окраской в А-4 сопоставление невозможно из-за отсутствия литаратуршс: данных) , так как сравнение возмогло только, зслп исследователи использовали ту же методику обработки препаратов, те яе крнтарпк отбора ма-тафасшсс пластинок и изучали хромосома того яа уровня, спирализе~ дав. Ми сопоставили лолучошшз-ваш результаты деслздзгаякя 0-пслйиср1изка. с дршккя Иикельсаара (1979) для гюпулэдп-! Зо~ тонской ССР, так как он иоипльзспал та на, что и мы, чатсд.ччес-киа приомц приготовления а анализа препаратов хромосом. Сравнение выявило статистически дсстосерккэ■различая лгаь при метода 10^-ного уча та районов хромосом о яркой флюпросцетша-?;/При использовании метода 505-яого учета ярко, снзт.тдихся сзгмеитоз хромосом ...различий по обдзрукояо. На кал взгляд, это ссидотзль-ствует о' больаом влияния; субъективиста о«сш;а нд результата

восприятия последователя. Считаем поэтому, что .-дал лрзведзнйя сравнцтельно-популяшюнкнх доследований предпочти тальм о .метод СО^-пого' учета ярко свегяедахоя С~оег;.-,аитоз хроиооом.

Полученные п пастояэдй работа дотше о рз^тачагадейся з:го-с. бв?схи разных Г? к овязмазлия пззлжмнх крася татей я с лнчайдзмся яячкяйй на лнкойиао ларл.'.атрь раа»ш: Г? рзэл8«рих' способов предобработки прзьарзтов согласия тля о деязплсыш»

зо последние года ь цятогене тике на только человека, но и д руглх объектов данниии, свидетельствующими о не однородности ГР. На структурную гетерогенность ГР указывают и результаты проиедпансгс иамй нсслодов.зш'л сегментации ГР в промотафазных хромосомах. Специальные исследования фрагментации 1Р намного-члеленны и в основном ограничиваются наблвданиями сегментации лркс сошосресцкруюшего гетерохроматического сеилвнта У-хромосо-1лг иослч уКшр.тда. Нети обнаружена Соплектация С-гетерохрома-тьчеемх районов я проматафазных хромосомах I, 9, 1С и У, по частота сегментации.:; количество шяаюшшх субсегментов у рал них хромосом било различно. В хромоосгах I и У сегментацию С-Г'стерсхроматлчоских участков наблвдяли практически ао всех изучомых клоткех всех лиц, в хромосоме 9 - у большинства ассле-доебнлык индиьядов, в хромосоме 16 - лшь у 4 лиц (в одном из IX,молохо.о) из 16 обе.- щопанннх. В большинстве случаев сегментации гзтйрохромагачаских участков хромосом I и 9 выявлено ах разделение на два небольшие околоцеятроморныа субсегменты (ло-кализо'азнкиа в коротком и длинном плочзх в примикаадав пепоо-редегмлно к центромере) & один или несколько большего размера ярицонтроморные субсегменты (соответствующие области вторичной шрстяжа этих хрсмосо.«). Обнаружено независимое иолшлдаваду-альнсг, варьирование размеров выявлена»; субсегментов. Еолзе чем у долозича обследованиях лиц (у 2 из 15) размер гетзрохро-мажзексгс окплоцентсомерного субсегмента в коротком плеча хроиоссш 9 был больше точкового. Распространение окслецентро-Мс1 Рхюго х'оторолромлтичоскох'о сегмснта на короткое плечо хромосом:: 1 наблюдала роаз Су 3 аедпеедов из 16) -

Текем образом, результаты цатоморфологачаокой части ра~ оогк поаазпаают гетерогенность Г? как и различных хромосомах.

гак и а пределах одной и той же хрсмосош и указывают на организацию ГР из дискретных субъадпшщ,

М сл е к .у ля рн о -т та т о ге н а ч в с к я й анализ поликорЕпзма

го те рохпомп гичя склх па-Дор^, хрруосом^м°2ШШ.

С целые анализа молекулярной природы цитологически наблюдаемой 'ниоднородности ГР была проведана гибридизация на хромосомных препаратзх трех клонированных повторяющихся последовательностей ДНК человека (одна альфоидная и две.последовательности отДНК III)-. нуклеотпдиые тексты которых были расшяЛрова-нн и было известна их-хромосомная локализации - Г? в ряде хре- ' моссм.

Для количественной оценки результатов гпоридизации с целка дал^нешааго их сопоставления с цитологическими харакгорисп'клдя ГР нам необходимо бшо решить ряд мемдичосиих вопросов. Дело в том, что, если вопросы методики гибридизации довольно■подробно оешцонн в литературе, то исследования, посшгдеялыо методике кодичеогвенного анализа полученных результант. почт;»., отсутствуют. В настоящей работа сделана попытка ответить на оледуш1ю

г; с с с » о с с псиасйи-из о. лч^^^дйоидил! ¿3 "¡.о пл. м'л чоно**

го "фона" определить на хромосомах моста достоверной локалаза- ' 131 и позторявдхся ку1;леотидн!1х последовательностей?-Как сплав ГЬ вариабельность результатов, вызванную случайными мпккло-точными различиями в колачаотшз гранул метки?.Опзотн на от вопросы важны но только для изучения молекулярной природы ппламир-фнзма 1Р хромосом, но к дня выявления потскциолыт молскудярлс-генотичйскпх мзркзроз хромосом человека (Ггьдилис, Ананьев, Т»'84). Денные, получен;«;« при гиОрчдязагаи о .млс;шьсь2иисй ял б-

фоздной дооледоветолькосуьи рН505, дали возможность ответить на указан' е вопросы и сформулировать ряд предложений, позволяющих' лол'' эффективность количественного, анализа распределения з хромосомах повторяющихся последовательностей ДНК, виявляемого путем гибридизации з11;и : I) местами закономерной локализации повторяющихся■пуклеотвдных последовательностей следует считать те участки хромосом, над которыми суммарное количест¿о гранул многих клзток многих индивидов яревшает оди-нпкозкй для всех других участков "фоновый" уровень; 2) при ана-лаое результатов гибридизации надо использовать количество гранул метки не над всей хромосомой, а только над местами их регулярной локализации; 3) для снижения вариабельности,, обусловленной случайными различиями в степени кечеяня отдельных клеток, в анЕЛизо следует использовать не абсолютные .числа гранул матки, а отяослтельше их количества; 4) при анализе, рекомендуется ва-лользовать данные только по тем ¡слеткам, степень меченая которых оптимальна для бияквснш всех мает локализации в хромосомах исьторядагхоя гтследозательиоствЗ исследуемого класса. Последнее прэдложэнле основывается на выявленном нами- гиперболическом характере зависимости относительных количеств гранул метки над хромосомами от степени меченая клетей (объясняется, очевидно, болыгамч различия?,да в числе копий исследуемого-класса нуклоо-твдккх коследоьатвльнсстеХ в различных хромосомах;, Ш рекомендуем при количественном анализе результатов гибридизации на хре -МП001,препаратах повторкюг^хоя последовательностей ДНК кс-г.ользо^рть клетки в определенном интервале степени мочения: от уроакч, кохха начинается стабилизация относительных количеств г*.етуу., до уровня, когда з местах иакболее частей их ло-гдджуэ-ди:' «Здявьегоч: слияние стдельшо. гранул.

Проведенный на такой методической основа анализ разуть- . 5*9*08 гибридизации на хромосомных препаратах одной аифокдной г • й двух последовательностей счШЖ III дал возкоккость но только оценить вклад этих последовательностей в цитологически яаблхг-даемай полиморфизм ГР, но а па; -ялельао получить количественные характеристики хромосомной локализации используемых последовательностей. 33 случае адьфоядной последовательности' (клоп pIISOS) анализ распределения'гранул матки у.38 лиц показал выра~. жаиную-околоцептромернуа локализацию изучаемой фракции ДНК практически во всех хромосомах набора. Выявлены зпаадтольпка меяхромосомши различия, большая доля метки связывалась- с сколо-цептромерянм районом хромосома 3 СХЗ,8$ от общогс калачесгяа •гранул метки наблюдалось над. каждой из хромосом 3-;:'парг.Ч Лан-Ела о среднем относительном количестве г_-знул метки над хремо-.сомами после гибридизации о этой последовательностью в клетках о оптимальной степенью мочения. (79 клеток 23 лик), прнведйшш на рио. I, хорошо согласуются с результатами изучения особенностей гибридизации последовательности р[£>05, получении:«; в схсдпих шгких'условиях гибридизации в лаборатории гекмякл ШЩЗ АШ СССР (Врсв, I98S). ..

С! -целью количественной оценки юэживдаавдуашшх различии результатов-гибридизации in situ получакние дашше бита подвергнута одно^акторному диапврсионяс?.у анализу. Значимая дом-понепта меаандга^Дуальпых различил в общей дисперсия бш;а выявлена для хромосом 1,7,12,13 а 22, причем и д*л этих хромосом доля мэ:ш!диа"дузлышх различий была саыотао доли маакле-течкнх различий Сдоля меяывдп мдушшик различий не пр»;лазала 1С-31£). На няш взгляд, то обстоятельство, что доа'Нпсриш .'.«г-пвдий'дуалы'це различия ;ы\ш оОняруж'зшг лтаь ;оя отах тх-ыкуу*,

- Ж -

14 %

1 а 3 4 Ь 8 7 1 в 10 II 12 13 14 15 й 17 1в 13 23 21 й « У

ХРОМОСОМЫ

Рис Л.Сроднее относитзльное количество (%) гранул цатки н&ц хромосомами после гибридизации с клонированной посла-дооательнсстьэ ольфоидной человека рНЗОа, Число обследспанннх ллц - ¿3, число щютолнзировшых хрсаоссы каждой п&ры - 153.

объясняется случайностью выборки. Могло предположить, что отдельные индивиды могут отличаться от остальных представителей популяции степенно копийеоотп исследованной Фракция зльфоидпой ДНК и в других хромосомах набора, но частота встречаемости тагах индивидов р популяции мяла. Об этом говорит также то обстоятельство, что попарное сравнение средних значаний относительного количества гранул метки над околйцентрог.гарннма районами хромосом отдельных индивидов в нэкоторю; случаях выявило статиотя-чоски достоверные различая и по другим хромосомам.

Аналогичный анализ, проведанный для дзух сатсллатдых последовательностей рИ>9 и, pFDIS, доказал, что для них мостами преимущественной локализация являются прицеигромерныо районы хромосомы 9, и, но сравнения с альфоидной последовательностью, мегхромосомные различия (особенно для последовательность p?D 9) менее вырансны (на рис.. 2 приведены средние относительные кольче ства гранул мотки над хромосомам посла гибридизации с указан-ними двумя последовательностями озталлитной ДИК III). Кроме то' го, если для альфой,цной последовательности местами локализации бшш сравнительно узкие околоцантромарнна районы хромосом, то для сателлитннх последовательностей матка обнаруживалась а над районами сторачних перетяжек хромосом 1,9, короткими плачам", акроцентричоских хромосом 13-15 и 21-22 и диотальной частью длинного плача У-хромосомы, т.е. практически над везг ' местами цитологической локализации гетерохроматических районов. На рис. 3 отражены различия в локализации альфоидоо>Та с'ателлеишх последовательностей на примере хромосомы I.

ОдноФакторный дисперсионный анализ результатов гибридиза-■ циц, проведенный дая 'обеих сателлившх последовательностей, вклеил статистичисяа значимую компоненту ме^индйЕидуальпкх различий для большяго числа упомооом в большуи дата этих различий

клон р РО 6 «ми р РОИ

и!

шЖк

И 12 и И 15' 16 » 13 13 Я

ттс.зт

I 1

Рис.¿„Среднее относительное количество (%) гранул метки над хромосомами поело гибрндигодш с двумя-клонкрзвавр&ли посла-Аог.ателкк>стяыл сателлигкой ДНК III иолооока. Число обследованиях лиц для посдодосатольносм рРО 10 - 16,

дли ррс 9 - П,

Подчеркнуты номера тех 'хромосом, средние относительна«! коли-

гранул кзтки над которыми статистически достоверно самич'ались.

Рйс.З.Локализация гранул метки яад-зсрочосоиоП I после'гибридизации с илснироваяяьми альф'оидной н дьуда сателлцукаи гос лодо н94,влы»остями .

.Число'обследованию лиц для аяьфоидной лпсяваоеатоиьчастн-ЗЙ,

дчи сйтсллитдах последопьтельмооэ'ей - 30, каждого ичад-ь."да проанализировано 6 - 10 клеток.

в общзй дисперсии по сравнению о альфолдной последовательное- ■ ТМ1. Д7И хромосомы 9, например, эта дтля в случае гибридизации с последовательностью p'PDlS составляла 62,4.?, превышая долю кеуллегоч/шх различий. При анализе результатов гибридизации in situ оонарумендио различия я выраженности мсгосромосомных я молавдапедуальшсс различий для альфоидной и сетоялиюшх нооле-довательностай указывают на перспективность использования некоторых сателлнтннх последовательностей в качестве молакулярно-гакстаческах маркеров, а альф-эвдаых поелвдовагельаоотвй - в качества молекулярных маркеров хромосом,

При выполнении расскатрппаоной часто работы било обнаружено влиялие способа предобработка препаратов'на результаты гибридизации iu a-itu. Опыт гибридизации на хромосомных препаратах клонированной последовательности саталлдтной ЛНК III pPDlS был поставлен в двух вариантах: у 14 индивидов гибридизации прад-шствосаза окраска хромо со;, шкх препаратов по методике dA/)AFI, у ГЗ яздашгдоя.гибхедигацил бкда проведена без такск предобработки. Сравнение полученных результатов показам статистически доо:?ог.ергше различия в ерздпом относительном количество тронул ;.шт::и над рядом хромосом. Предобработка препаратов но методике ЛАДАН увеличила специфичность связывания метая: ббльаая деля шиш кшмллзсь на хромосоме 9; штка отсутствовала а л ой усах, и кслсрых без предобработки са количество было нсЕяачитсльшм. Механизм алияния окраски DA/bAPI на результаты последующей гибридизации in altuнеясен, так as, кок неясен мехациг« самой окраски. Модно предполагать,'что при обработка препаратов хро-иоаом перед гибридизацией некоторыми красителями молекулы красителя могут связываться с определенными последовательностями .Жч затрудняя их последующее выявления. Это паолюдение, которое

- S3 -

следу ог учитывать при проведении гибридизации in situ й оценке за результатов, 'на ваы взгляд, макет служить косвенны:! доказательством того, это различные места хромосомной локализации изученных сателлита: последовательностей различаются в основном числом я сияй по вгошиешхея последовательностей и в значительно меньшей мерз их голгалогичностью.

Uu с о па с та mm: результаты исслэдо»чшзя цигояогячяского полиморфизма гогарохроматичееккх сегментов с данными гибридизация лозторявднхея последовательностей ДНК на аюгафзэных хромосомах человека, В. связи, с .выраженной избир-iтальнооть'о габркдиаацяг клонированной альфоддной последовательности рНЗОо с хромосомой -3 нам ирбдсяодаялось'ангвроопш сопзстазить картины молекулярного и Р-псишморфазиа ояолоцентромерного района хромосомы 3, 0 этой целью у 6 индивидов, являющихся "гетврозцгстзмв" по признаку яр- '. кой фяксресценцип цгнтромерногс района хромосом 3, бше проведен подсчет гранул метка отдельно над каждой из гомологичных хромосом згой пары (идентификации гемолегез осуществили с фотонегативоа этих до штафазшк птаптинок, до гибридизация параевзних пропил-* акршшапраком). Суммирование данных по 42 клеткам тзота обследованных лиц не шязало стаикетлески достоверных различий я количестве гранул метки над токологами (над хромосомами с отсутствием яркого сведения сроднее количество гранул маки бшл даже, больше}• Отсутствие связи результатов пгбридязаци с картиной р-лаяшорфизма» пс-ьидамому, является свидетельством того, что яркую Фдазрзсцевцко сколоцинтроу.арнкх районозГнеясторых хромосом нссле {Мщраска нельзя объяснять преимущественной локализацией з этих районах аовторяедяхея посладова тадьнс стай альфоядпой . ' . iiosno согласиться о мнением тех исследователей, которыз считают,что интзнанвйссть ейвчеизя О-сегг.автов зависят на просто от содержа-

ния в ЯЖС АТ-сснованкй, а от пространственной локализации п нов-. •"оряеызстд куклеотидянх пар АТ и ГЦ в мплокуле ЛКК ( Sel.ftr.clor, СНшрвИе <3е 1а , 1873),

Мы силосыхши также размера ГР, выявленных окраской С и ЯА.'ЬА?I, о количеством локализованных над этими сегментами хромосом гранул мотки пооле гибридизации о двумя клонирования® фракциями повторяющихся .последовательностей ДНК человека - ельфо-идной рН505 в сателлкткой ДИК XII - р?в18. На существование взаимосвязи мевду цитологическим к молекулярным полиморфизмом указывает результата сравнения количества гранул метки над гомолсгач-ицма хромосомами (влияние размпий в степени ышралЕзаци» хромосом зля их кечеяия на эти результаты должно быть яачт-жш). Получен ние данкня прпвчдолп в табл. 2.

Сращение показало одинаковую картину для всех иослздован-шч хромосом 15 обеих клонированиях фракций ДНК, аспользовзшшх з гкбредиззцяа' 1п в1Ли : над хромосомами о большими разтлорагла готзрохромгтЕЧ-ских районов во зсех случаях среднее количество гранул гмгаи било большим. .Статистически достоверные различия в количество гранул мзтка над гомологичными хромосомами с ГР разного размера была о,.зарукенн доя С~оегмонтоз хромосом 16 (клон рНз05) и Э (клоп рН1) 18), а тажа прицентромзргшго ГР хромооо.'.щ I поете окраска 0А/эАР1 (кдон.рРп 10). Эш различия нодгверздеиы такие ^значениями косффицкбктов корреляции размеров ГР в клетках со сходными стопа пью егшралазацяи хромосом в степенью мэчания и количества докаднзйваийах на 'них гранул мзтка: полокителы-шз коэффициенты корреляции нзйдеш для тех ка.Т, для которых отмечени статистически доотовораае различия в ко* \гаестве грянул метки над гомоясгичаы-ш\ хромосомами.

Таким образом, результаты, проведенного анализа показывают,

Таблица 2 •

Средни? количества гранул натки иед гетзрохроматичаскжш районами гсмолсгичнжс хромосом посла гибридизации с двумя клонировышшя фрагыантамя поэтсрящихся последовательностей

.• ДК{ человека

Число ис-слэдовац-Окраска нк>; ыэта-фазкых пластинок

Количество гранул мзтки над хромосомаш

Г

9'

9я

16'

16м. 15« 15"

Адьфоиднэя последовательность рНЗОЗ

С 83 ¡'.,04 1,72 - - 1,26 0,73

. (Р»0,05) (0,057^.0,01)

Саталлитная последовательность ДНК II. -рРОШ 1к4>№1 0,91 0,53 7,0 5,9 0,16 0,11 1,35 1,12

(0,0ЬР>0,001) (Ь0,05) (Рл0,05) (Й»0,05)

С 28 0,68 0,ЗЭ 4,4 3,2

(р>о,оо> (о,оь>ьо,о1)

со сл

Примечание - гетерохроматический район большого размера обозначен одним штрихом, а меньшего -двуыя штриз:ши.

что мевЕВД>"чидуашьные различия размере® ГР обусловлены различиями в числе копий не только сателлитяых, но в альфоадшх яо-■ следовательиостей ДйК, причем вклад отдельных фракций последовательностей в цитологический-полиморфизм ГР разных хромосом различен. Тая, различной для разных хромосом была выраженность корреляции размеров ГР, выявленных окраской С ив A/DAPI, о количеством локализованных над ними гранул матки после гибридизации о клонированной последовательностью рр d 18. Б случае С-окрас-кл статистически достоверная корреляция бнла обнарукена для -працентромэрногс- IP хромосош у, в случае окраски ЪА/QkPl - для ГР хромосомы I. Различия в выраженности коррел>пуш10- и DA/frAPl -сегментов одних а тех же хромосом отражают, очевидно, различную природу этих ¿<0 годов дифференциальной окраски хромосом.

Существование корреляции .между цитологическими и молекуляр-1Ш1 характеристиками ГР'было выявлено также путем изучения инверсий прицеятромерного гетерохроматического сегмента хромосош S. У двух из К человек, у которых была проведена окраска хромосом d A/tAPI, была обнаружена полная кнзерсия прицентромерного ГР хромосомы 9 (частичные инверсии при этой окраоке обнаружены на были), Изучение результатов гибридизации- in situ клонированной последовательности сателлитной ДНК III р? ь 16 у етих лиц показало '.изменения а локализации гранул метки над;парицеитромерным районом хромосош 9: количество метки над короткими плечами штерт и-ровшлых хромосом Шло заметно больше, чем над короткими плеча-га декзмеяенлых хромосом ото" пары. При исследовали - хромосом после С-скраске у тех ка. 14 -человек-были обнаружены как-полные инверсии иркедн грошраого С-сегманга хроиаоош;9 (у тех.»е-, двух человек, у которых они были выгаданы и после обработки с г<Ал5аГТ) . isx и честкчтае, нэ ьижденняо окраской У А/- EAPI [у rpi>: ччлоуэк; , Бшзвть измзлешм в локализаций метки в сяу-

чаях частичных аквероай прицентроморпих ГР не представлялось возможным из-за недостаточной для этой цеда разрешайтей способности использованного метода анализа. По этой же причина яальая ■ было сделать вьшод о том, какой из, использавэняих' методов дифференциальной окраска хромосом более четко отраяает молекулярный полиморфизм ГР, обусловленной разпшл числом кодий исследованного фрагмента стДНК Ш.

Таким образом, полученные нами результаты s согласии с данными литературы, основаннкма на других методах исследоп. шя, указывают на сложное'строение гетерохромагвчзокйх районов, в котором участвует несколько типов тандешс-организованпых повторяющихся последовательностей.

Различающаяся локализация альфэвдпнх и сатзллитяых последовательностей в хромосомах человека, разная внрлаённость мея-ивдЕвидуальнах различи! в количество гранул метки над ГР после гибридизации in situ альфовдшх к сатёялнтних последовательное тей, а такхе разный уровень гсорреляцип даашх молекулярного анализа а цитологического полиморфизма даот нш основание прецпело-нвть , что основяу» роль в цитологическом полиморфизме-IP играют сателлйтныэ ДНК, однако альфовдними последовательностями также обусловлена вариабельность.■ размеров:ЕР хромосом человека. След о-ЬпТиЛЬдо, oe^urtxmj, что и щущщиональная роль' этих двух

типов. повторящихсл аудаюотйддах последовательностей также шйза1 быть-различной,

' анажиа отттухуур-т^х тевиа'!Тов1Гй-^ро>г;с-

зозрэдтш и патслог.й^й); ,

В цел«»: получения довсагштелгвоЯ • гкфэршю'я дрл регегсая-зопт;осе о' бкслсгкчаско.Ч ролл гетсрохрома-гинз. солшс^Ългы хс^вс-

сои бш дссладоэан еще на одном - оргачязменном (фэногенегяческсм)т уровне. Морфологическая вариабельность «арпо'дша была изучзяа у . здоровых лид грех возрастных групп и у индяввдоа о репродуктивной патологией.

При наполнении итого этапа работы особое внимание уделялооь' методика исследования, что связано с противоречивостью литератур-них данных.

I. ПслркоеФиен С-сзгментов хромосом 1.9.16 и У у лип тро; возрао'тннх групп

. Количественный анализ (путам измерений) полиморфизма гетерохроматических С-сегментов хромоооы 1,9,16 а У был проведен у новорожденных, лиц 17-35 лет и лиц отарше 70 лет. Вое обследованное лица (как и в продндущих исследованиях) бшш латышской национальности, приготовление к обработку препаратов проводили однотипно и одновременно. В каадой возрастной- группе било 20 чо-лов5к. Анализировали 5-7 метафазнше пластинок кзвдого индивида. Степень егшрализащи иоследованных хромосом (определяли по средней длине хромосома 2) у всех индивидов всех трах групп била одинаковой. Данные для мужчин а женщин суммировали, так как . предварительно проведенный анализ. доказал стоутотеие половах различий размеров С-сегментов.

Ср&аштйльний анализ р-асизроа.С-оегментов показал,, что; в старших возрастных группах размеры ГР в хромосомах. 1,9 и 16, бол mis, чем в шадшях. Попарное оравнвнио размеров С-сегмспгов ъ созраекых группах (табл. 3) показало,.что в группе лиц старка 70 ас г как сушзр»53Я-Дшш .Снзегмеитон аиали&рруамше еугосом, гак ü £аэ»юук С—св;'М'ЗИ50В' а хромосомах 1,9 а 1й достоверно оодь-чем у изаорожммаяг« .Про оравши.» разизрзе ГР этих хромо-

Таблица 3

Результаты срагниталького'аяализа абсашгшсс размеров С-сегиектсз хромосом I, 9, 15 и У (кгси) у лиц разяях возрастных групп

Сравниваемые возрастные группы Размеры ХрОМОСОК!! 2 С Размер 0-се гментоэ хромое !ОМ Суммарная дли-

I '9 16 У ка С-сегаен-тов хромосом I, 9, 16

КоБороянеяяые Лица 17-35 лет 7,81+0,05 7,86+0,05 Р > 0,05 1,34+0,01 1,38+0,01 0,05>Г?> 0.01 1,25+0,01 I 25+0,01 Р >~0,05 1,01+0,007 I 03+0,009 0,05 >Р> 0.01 1,06+0,02 1,08+0,02 Р >~0,05 7,20+0,06 7,33+0,06 Р >~0,05

Новорокдзнныз Лица стариэ 70 лат 7,81+0,05 7,32+0,05 Р ;> 0,05 1,34+0,01 . 1,25+0,01 1,01+0,007 1,43+0,01 1,30v0,01 1,06+0,002 ? < 0,0001 0,1 >?"> 0,001 Р-с 0,Ó00I 1,05+0,02 1.07+0,02 Р,-~0,05 7,20+0,05 7,56+0,06 р* oToooi

Лица 17-35 лзт Лица старше 70 лет 7,66*0,05 7,92+0,05 Р> 0,05 1,38+0,01 1,43+0,01 0,05 >Р> 0,01 1,25+0,01 1,03+0,003 1,30+0,01 1,06+0,003 0,05^~Р> 0,01 Р>0,05 1,06+0,02 1,07+0,02 Р >0,05 7,33+0,06 7,56+0,06 0,05=-Р> "),01

Примечание: число исследуемых лиц в каздой возрастной группе 20 число проанализированных мстафазнчх пластинок 100.

сом у норорождшшнх и лиц 17-35 лег и лиц старше 70 лох выявлены ' менее шр&женяцз различи: статистически достоверны различия а размерах гагарохроматкчоских С-оагиентов хромосом I я 16 догя нопороч'!денаых и лиц праднягс возраста кхромооогл 1-й 9 для лиц сроднаго возраста и старккоа. Размеры С-согаентов в У-хромсссме у. лец исследованных возрастных групп не различались.

П. Анечиз С- а угюмосом у супружеских

пап с ушруиьнжка ренподустлчной пункции

Структурный полиморфизм ГР хромосом был исследован у одной группы. лиц с патологией - у супрукесяих пар, имеющих а анамнезе повторные спс.чтакшш абортн неясной этиология. При изучении связи полиморфизма хромосом с патологией чолопека нарушения рапро-дуктпзней функции представляют особый интерес, так как предпола-газтел, что псгсмонйзя частота' нееынешивашш беременности ми ройдеаие деты'; о пороками разаиг^я может быть следствием неблагоприятного влияния определенных. еариантов хромосом у супруяес-ких пар, имбпвдх ч кзрпотвпо этих хромооошша зорнонты. Дашше литературы о оеязи полиморфизма хромосом- о этой лг.тадогивй противоречивы.

Сравнптольный количсстеашшй анализ (путем измерений) С-оег-маятов хромосом бак прогеден у клинячоски здорозкх 25 мудазд и 25 г.ендан л 25 супружеских пар, имеющих з анамяазе на мапзе дгух спонтанных абортов иаьнясяоаной этиологии. Все яовдедуе.</ыз Онки латыаской нацисначьасстн, препараты хромосом обрабатывали однотипно и сдкрЕрзмешш, степень спирализацни хромосом п исследораннкх матафазисс пластинках была одинаковой. Бывд обнаружено, что как у мухчяп, так л у жедэдя с репродуктивной петолегигй размеры С-согчеясоп в хромосомах и 16 умоньвмщ (у мужчин это раз-

личке статистически достоверно, см.табл. 4). Достоверность ' различий по отдельным хромосомам только у мужчин, вероятно, объясняется яексторцми различиями в степени ояйрализацик хромосом (у женщин с патологией степень сшрализацпи хромосом била несколько лад, чем в контрольной группе). У ляц с отягощенным акушерским анамнезом (как у мужчин, так я у женщин) статистически достоверно уменьшено суммарное содержите измеренного С-гетерохродатина. Различий в размерах С-оегмептов в У-хромосоме не обнаружено.

Умзньшенге размеров С-ге" ^рохроматяческах районов у лиц с репродуктивной патологией было подтверждено и анализом ф-полиморфизма. Сравнительчый анализ Р-полиморфпзма был проведен у клинически здоровых. 70 муячин п 70 кенщин и 50 супружеских пар, имеющих в анамнезе повторные спонтанные аборты. Практически по всем изученным локуеам (за исключением хромосомы 3) большее количество хромосом с ярким свечением наблюдало • ь у здоровых лкд (табл. 5). Среднее количество ярко фяюореепкрую-■ них сегментов в расчете, на клетку у лиц с патологией оказалось статистически достоверно ниже (7,91), чем у лиц контрольной группы (10,0).

Данине, полученные при иеследоеакия полиморфизма хромосом в кзччештх группах, указывают, что вариабельность рагмзро ГР ' только в определенных пределах является нейтральным для организма признаком. Уменьшение содержания гетерохроматина з клетках лиц, ямсида в анамнезе повторные спонтанные аборта, ий неш взгляд, сиидетольстЕуег об определенной роли, выполняемой ГР па ракядх стадиях онтогенеза человека. Зги дашшо ссглпоу-ются с результата® работа Подугольшжозой с сошзт. (1282), которые наблюдали уменьшенные размеры С~оегмел?ов у дотай о

Таблица 4

Абгслогяке-размэрн С-сегментов хромосом I, 9, 16 е У (гтаО у здоровых лиц л в группе репродуктивной патология

Число - ,Средняя дли-

Гругла исследо- на хромосо-

вакяых . ш 2, мкм ■ хпомосом

Размеры С-сех.ментов хромосом

16

Суммарная . длина измеренных С-сегментов

1В2

. Цуктаяы '•'.."

8^38+0,05 1,55+0,016 1,41+0,018 1,13_\012 1,22^0,026 9,41+0,081

8,34+0,05 1,48+0,016 1,23+0,015 1,03+0,009 1,27+0,021 8,88+0,092

Р > 0,05 Р < 0,01 • Р < 0,01 Р < 0,001 Р > 0,05 Р < 0,001.

Контрольная

Роярсдтктквнэя 210 патология

Контрольная

Методу ктииная патология

Еенщины

176 8.^4+0,05 1,56+0,019 1.38+0,018 1,08+0,011

228 . 8,42+0,05 1,50+0,016 1,36+0,013 1,07+0,010

Р > 0,05 Р > 0,05 Р > 0,05 Р ? 0,05

•см

8,10+0,090 7,87+0,070 0,05-:Р> 0,01

Таблица 5

Ч&сыта встречав* остя интенсивно флюоресцирующих сегментов хромосом у здоровых лиц к в группе репродуктивной патологии. *

Се'-ыек? ' ' ' Контрольная грузна (п -140)к Группа репродуктивной патологии' (п-100) '

хромосома Чясло хрсмосом с ин- Частота Число хромосом с интен- Частота тенсяйног флворесцея- % сивной фзооресценциея %

■ у ■ .у шей' . . ■ ■ _;______

ЗрПсЛ .385 ■ 66,1 179 85,5 <0,01 .

4рПоХ1 336 • 47,6 4 2,0 <0,01

1^11 2 Й . 75,7 ' .126 63,0 >0,05

ХорЗЗ . зю 39,3 ' ■ 84 . . 42,0 »0,05

74р11 . ; 21 . 7,5 0 0 <0,01

34р13 . 367' . 59,6 ' 56 . " . 28,0 . <0,01

'63 22,5 22 и,о : 0,05 > Р > 0,01

15рХЗ. . 367 ; 5Э,6 101 50,5 >0,05

21рИ ; V 24 8,6 6 ' 3,0 >0,05

21ЛЗ :.. • 168 60,0 38 49,0 • <0,01

2Гр15 ,* ' • - • 77 27,5 47 23,5 »0,05

71 25,4 43 24,0 >0,05

"Среднее каиязстао ■ • ■ . . . -• • '

. £.еооресн#ьувдих 10,0 7,01 <0,01

Р-сйгмгатет ьа клгтяу . .

З^йИйчаЕйв? дааяыг да: куяявк л зеащкк не различается, 'поэтому они суммировали. - числе неследованиях лиц.

признаками нарушения амбриогенеза. Можно пред положить, что отрицательное влияние пониженного содержания гетерохроматина на ранних стадиях онтогенеза человека может сказаться пре*..з всего ш транскрипционной активности структурных генов, предположительно заключенных в ГР к находящихся под регулирующим их работу влиянием ТВ. Если ©то предположение верно, то дисбаланс по ГР означает существовавший на определенных стадиях онтогензза дисбаланс оо важным функционирующим генам, отрицательно сказывающийся да жизнеспособности организма. Менывее содержание гетерохроматина уновороадзкных по сравнению с ладами среднего и особенно преклонного возраста, на наш взгляд, является результатом отбора, на правленном против индивидов о уменьшенным коли' честном гетерозфоматина в хромоеошщх наборах, Пониженное содержание гетерох^ошгиаа у фенотупически здоровых, , но имеющих в анамнезе повторные спонтанные аборты жц, указывает, очевидно, на большое значение генотипа организма в проявлении отрицатель-' шос последствий для индивида этого уменьшенного содержания га-терохрдаотияа. Так как отличающиеся от норш данные обнаружены и у.кеящан, а у мужчин, можно предположить, что некоторые структурные варианты хромосом, в отдельности Сезьредше для овоих носителей, сочетаясь, в потомстве этих лиц, могут превратит« в факторы нарушаидаеонтогенез человека на рандах стдиях.

То.обстоятельство, что ии при сравяе*вш данных для пупд о патологией и фенотияячеоки здоровых яиц, гш при сравнении данных для разных возраотш* груоя не обнаружены- различия в размерах гетерохроматического сегмента в длинном мече У-хромосомы, указывает очевидно, на раЕЛгчцуг генетическую "цеаяоом" гетеро-хрд1<аТ1г*ув раьшх хроиэоонах, ра&ягляое фякциойашкм значение разных гэте.-рохро.:ч1ических райолов.

ВЫВОДЫ

I. У феяотипичзокп здорсзнх лиц латшгакой национальности наблюдается широкий полиморфизм гетерохроматических раЯоког хромосом, выявленный трем методами: G-Q а - эА/ЬАРЬ-окра'мшаяпегз,

2. В проыетафззшх хромосомах I, 9 и У обнаруживается высокая частота сегментация С-гетарохроматических районов с дифференциацией их на независимо варьирующее по своим размерам субсегменты,

3. Гетерохроматические районы хромосом челодека характеризуются структурной неоднородностью, на которую указывают различная их окршааваемость разшмя красителями, сегментация ь лроме-тафазшх хромосомах и различное воздействие ка них щелочных об--работок.-

4. Количественный анализ результатов гибридизации на хро-люсомаих препаратах двух клонированных последовательностей

стДНК III (pft>9 а pPDlS) и одной альфовдной последовательности (рЕ'305) выявляет различающуюся локализации альфоздиой я сатол-литшх последовательностей (строго околоцентромерниг районы дэд альфоидной последовательности и все участки цитологической локализации гетерохроматических районов, включая околоцзнтромершб, для сателлитных последовательностей) и-разную степень выраженности мекхромосомной и меаицдиввдуальноЯ вариабельности елъфсид--ной я сателлитннх последовательностей (для альфоидной дослодоза-тельноотз значительно' ввракенние мевдсромооомшо-различия а бо вира-генный мзкннд,извдуальгай ла'ш.;орфизм, для сателлитькс последовательностей венеэ. здраздявие меиромосо-.'нте и болоп от-чэт.'лшио нечиндаввдуальше' разлвчкяЬ

5. Солоата&шше далякзс гкбркдгэадш' ottu -едчой г^уЛ»-' здвой посяед<38нтоа>яо&<г& иа.дгдтоет<^нос:'?<!!? сгл-сллу-гпой.

ДШ III о результатами изл'срешй гетерохроматических районов показывает, что молекулярной основой С- и р/^о^Х-полшлор&игма при-цеитромерных гетерохроматических районов хромосом 1,9 и 16 является колекудярнгШ полиморфизм üü только сьтеллетиых, по и альфо-едкой последовательности, хотя вклад сатшшшшх последовательностей в цитологически наблюдаемый полиморфизм хромосом бо^шз.

6. Размеры С-Гетерохромат11ческ11х районов хрогосом I, 9 в 16 з трех иозрастшх группах (у ксворокдепяцх, лиц 17-35 лет к старше 70 лот) различаются: з старших возрастных Г£>ушах размеры С-сетаепюь этих хромосом больше.

7. В карлотпиах супружеских пар, тлеющих в анамнезе повторные опо«таняые аборты леяааоЯ отолота, С- д (^-гетерйфоиицо меньше, чем в хромосомяпх наборах здоровых лиц.

8. У ^дорсьш: пндиьедов разных возрастных групп я у лиц с репрсд/хгиьпоЯ патологией различия в длине С-сегмента дисаальяой части длгяного ялеча У-храч-осош не обнаруживайте, что указхдаа-ет на отлхчзэдееся функциональное значение гетерохроматического рагоча -згой хро/'оссчы.

?„ Результата исследования полиморфизма хромосом в разщх зсзрасашх группах сдорогих шцпвьдог., а также в группа лиг; с ропродуктпЕпоЯ патологией позволяют обосновать продлслогкзнае о пебдагоаркятях: зффеюго у;.;опьшеиного количества гегерохроматена, лрсяв/лютался ни разных савдпях оятсгелсза человека, к сделать заключение, что вариабельность раамерсв гетерохроматических районом не является нейурэльшш для организма признаком.

CIKGCK PAFQT, СПУБЛИКОЬЛЬБЫХ ПО ТИйЕ ДИССЕРТАЦИИ

X* Крумакя А.Р., Крсяквса В.Г. Полиморфизм С-сегмеятов .хромосом у ллц коренного населения Латвийской ССР // Ш съезд Лат-üSÜoKoro реопубликавохого 00п»стаа генетг'-.ов и селокционероз* им. ¡иигзиклопа: Тез .докл. - Рига, I2&2. - С. II- 12.

2. Круминя А.Р., Кропкйнз В.Г. Пслшлсрфизм С- и 9-ссгмзктсв хромосом у фэнотнтгаески здоровых лиц латкпокоГ- национальности // Полиморфизм хромосом у человека. М., 1381. - С. 4'.' - 55.

3. Круминя А.?., Кроаякяа В.Г. Полиморфизм хромосом у фено-типически здоровых ляд коренного населения ЛСОР // съезд Всесоюзного общества гснеткхоз и селекционеров: Тез.долл. - М., 1982. - С. 64.

4. Круминя А.Р., Хроияшна В.Г. Количественный аяаляз полиморфизма С-сегмгптоь хромосом 1,9,16 к У у фенояшачеекп здоровых лиц коренного населения ЛССР // Цоол.генет. 19-32. -

Т. 16. - И 4. - С. 56 - 59.

5. Круминя А.Р., Кршккяа З.Г. Шзшмсрфиза 9~сегколтов хромосом у фенотипически здоровых лиц коренного населения ЛССР // Цитол.генет. -- 1983. - Т. 17. - й 4. - С. 54 - 58.

о. Крушяп А.Р., Крошккна В.Г. Методика выявления тчасткоз структурного гетерохросатина зфомосом человека цутам С-окраокя // КкфзркацношшЭ листок Минздрава ЛатвСС?. - .1983, - 3 с.

7. Крушня А.Р. Полиморфг.агл гстерохроиатияовлк районов хро-косом "л нарушение репродуктивной функции человека // I Всесоюзный съезд общества-кедицшсю1х'генетиков: Тез.докл. - М,, 1334. - С. 170.

8. Крогяшяа В.Г., Еоокобойнек -Ц.И.,'Крумаяя Л.Р., Еасн-лкк Л.В., Ыелдере Л.В. Цкгогонетхчесхое наследование сулружгог.ах пар с повторными опентаякшя абортами // Школ.тенет. - 1534, -Т. 18.-Ю. - С. 229 - 230.

9. Восиобойник Н.И., йрушяа А.Р., Крошкяна В.Г. Частота инверсий околоцеятромерного гетарохроматкна в группе супружеских пар с найгяеягяма репродуктивной ф/шада // Х.1У Ежегодная Европейская конференция до мутагенам окружающей среды: Тез«докл. -

М., 1984. - С. 559 - 560.

- 48 -

10. Зннченко Л,К., Крушш А.Р., Крошкияа В.Г., Вевере И,А. Частота и распределение ассоциаций акроцеятрических хромосом в лимфоцитах человека // Цдтол.геиет, - 1985. - Т. 20. - F. -

О, 7.02 - 105.

11. Юров Ю.Б,, Александров И.А., Миткевич О.П., Крумиш А.Р. Клояирояаянш последовательности сателлитной ДНК III, специфичные для црицеятроиерного. гетерохромашна хрошсош 9 человека// Мол. генетика,шкробкол., вирусол. - IS36, - И 3. - 0. 9 - II.

12. Круыияя А.Р., Воскобойник H.F., Андреева АЛ'., Василии Л.В,, Крошкина В.Г. Показания к исследованию хромосом у супружеских пар с патологией потомства // Методические рекомендации Мшгадраъа ЛатвССР, - 1986. - 8 с.

13. Крошкна В.Г. г Крумши А.Р. Гетероморфизм хромосом человека в норме и при патологии .// Генетика и селекция в Латвийской ССР. - Рига, 198?. - С. 160 - 163.

14. Хруминя А.Р., Крошкина В.Г., Воскобойник Н.И., Зиячея-ко Л.К., Решетников А.Н. Полиморфизм гетерохроматиновых участков хролмсо.м человека я его молекулярная природа // Генетика и селекция в Латвийской ССР. - Рига, 1987. - С. 145 - 153.

Ib. Крушш А.Р., Крошкина В.Г., Восксбойник Н.К., Решетников А..Н. Количественный анализ С-сегментоп хромосом 1,9,16 к 7 ' у супружеских пар с нарушениями репродуктивной функции.// Генетика. - 1987. - ?. 23. - Jí'3. - С. 540 - 543,

16, Круыцач А.Р., Крошкина В,Г., Решетников А,Е. Полиморфизм Ç-ссгмейТОв хромосом у супружеских пар с нарушениями репродуктивной фуч/цик // Генетика. - 1937. - Т. 23. - !: 3, - 0. 5-14 - 548.

17. Кругши А.Р., Крошкина В.Г., Shksj—o Л.И., Восксбойник Н.И. Солмморфпзм хромосом в популяция Латвийской СОР (^еяотипичсо-кь здоровнз лпгд и две групдн патологии) // Изьестия A4 ЛчтвСОР. -

isa?. - д s. - с. 120 - t¿5.

18. Крукипя А.Р., Кроглслна В.Г. Клояировашшб повторяющиеся ' последовательности ДНК человека в исследовании полиморфизма и?-

терохроматических районов хромосом // У' съезд гене тисов и солея-пионеров Молдавской ССР: Тез.докл. - Кишинев, IC87. - С. 51.

19. Кру.чиня А.Р., Кролкпна В.Г. Использование' повторяющихся последовательностей ДНК человека в изучении молекулярных основ структурного поламорфапма хромосом // У съезд Всесоюзного общества генетиков и селекционеров: Тез.докл. - М., 1337. - 0. 59.

20. Круминя А.Р., Крсккпна З.Г., Иров Ю.В., Гиндаяко ВЛ.1,

К методике анализа хромосомной локализации певторяклдаея нуклео-тедных последовательностей путем гибридизация in oil, и // Генетика. - 1988. - Т. 24. - й 5. - С. 943 - 946.

21. Крумякц А.?., Кроакина В.Г., Вроь Ю.Б., Александр i II.Л., *.!пткйшзч О.П., Гичдилкс В,Гг. Использование клонированной альфотд-' гай повторяющейся последовательности ДНК человека в язуче'шп ;:о-лкморфнзг.а гетерохроматиновых районов хромосом // Генетика. - . 1983. - Т. 24. - Л 5. - С. 93? - 942.

22. KrCtal'-jti A., Krc3h.kir*a V. Cytologics-l, noloculcvr тас! gsnotic hoterogoneity of hocferoohrofatJ.!-- rsgicno cf гмтлп chromosomes // XXX syrapo'jiura on cytogenetics of '.he Cneob'S'loval: biological nocioty: Abstracts.-Prague, I960. - Г.32

23. Круыиш A.P., К^оетита З.Г., &ров Д. Б., Александров К.А.. Миткевич С_Г!., Гиндплко В.". Количественный анализ хромосомной* локализации двух клонарованних последовательностей сателлытпоХ ДпК III человека о помогла метода гибрпдиаацш irv stta.

// Генетика. - 1989. - Т, 25. - Л 4. - 0. 521 - 530.

24. Крумлиа Л.?., Крошкяпа В.Г., ¡Оров D.S., Алзкоавдрсз И.А., Кнткевич С.П., Гиядклсс й.М. О корреляции полиморанз.та гетерохроматических сегментов о гибридизацией на хромосомных препаратах некоторых клонированных повторяющихся последоват-ельчос/ой ДЧл человек // Генетика. - IP89. - Т. 25. - й 5. - С, SC2 - 909.

КРУ и и к я

Астрада Ройэртовна

годажжа: хмшшштйческих районов хрожсом человека

Автор»lepan

Лодпдаено 2 зечзгь 25.07,69. Формат 6CocS4/I6. Бунйга -шсзая. ОЗъсы 3,0 физ.поч.л., 2,0 уч.-изд.л. 05сот. Тираж 100 экз. Воплатно. Зэкза if I0IS.

Иясют??; мвдвшшокой гвнетмш АШ СССР (II5478. Моск.1», ул.йоохэоизчьо, I).

Отпечатано на ротапринте ИИ. 225331, Pirca, ул. А. Уоша, 22.