Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экстремальные варианты гетерохроматических районов хромосом человека как маркеры индивидуальной токсико-генетической чувствительности к факторам среды

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Экстремальные варианты гетерохроматических районов хромосом человека как маркеры индивидуальной токсико-генетической чувствительности к факторам среды"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ Н А ? К СССР • ВСЕСОЮЗНОЙ КАУЧНУр. ЖДИКО-ГБНЕГ/ЧЁСКИй аЕНТР

На прзвак р^гсяиск

ДРУЖИНИН ВЛАДИМИР ГЕННАДЬЕВИЧ

ЭКСТРЕМАЛЬНЫЕ ВАРИАНТУ геТйРОХРО;МТйЧЕ"К.КХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА КАК МАРКЕРЫ ИНДИВИДУАЛЬНО»! ТОКОТО-ГЕНБ'ШШСШ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ФАКТОРАМ сши

03.00.15 - гйпетиха

А В Т0Р2$ЕР'АТ

диссертации иа соискание ученой ст^г.гла: кекдл'лпта биологических кауг.

Кесква ~ 1991

г&Йата виполнеиа на кафедр» зоологии к генетики Кемеровского госугппстгонпогс университета

Н&учныо рукоЕодитчлч: кандидат медицинских наук, доиек? Б.Е.Ллвряомн ; Л05".'ор биологкчеохих паук ¡ЗД.Рояазова.

Сфицчалькыо оппонмты: доктор биологических авук 3,С,£уркоь ;

доктор биологических наук • Н.А.Яппуиояа.

Бедуй*» учреждение: Институт общий генетики км. Н. И,Ивашова АН СССР

Заяята состоится " И " 1991 г. в час,

на зрсед&иии специализированного Сонета Л.001.16.01. при ВНМГЦ аМИ СССР ио адресу: И5478, г.Мескьа, ул.Москворечье,!•

О диссертацией нохг.ь ознакоииться в библиотеке

внмп: айн ссс?.

Адторофйсвт разослан " 3 " 1951 г.

Учекай секретарь о.чаиивлйзирояаннргс Совета,

¿окч'ор биологичеекчх наук Л,Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Большинство усилий, предпринимаемых в области экологической генетики, в настоящее время направлено <ш выявление мутагенов и оценку их потенциальной генетической опасности. Однако, исключить все мутагенные вещества из среды обитания человека не представляется возможным » в промышленности на ряде предприятий в производственных циклах и в отходах сохраняются сильные мутагены, что может привести к повышенному риску различных заболеваний. Особую актуальность приобретает проблема изучения неодинаковой чувствительности индивидуумов к неблагоприятным воздействиям среды (.Бочков и др., 1975 ; Бочков, 1981).

• Индикаторами чувствительности могут являться саше различные мор|'0-физиологаческие и генетические реакции, изучаемые яа всех уровнях организации:■начиная с организменного и органного и заканчивая молекулярным. На хромосомном уровне такая чувствительность может проявляться в виде различных индивидуальных частот хромосомных повреждений как в соматических, так и в половых клетках у индивидуумов, находящихся в сходных экологических условиях. Известно однако, что показатель хромосомных аберраций в значительной мере является динамичным, так как зависит от целого комплекса причин (.Курков, 1975 } Сусков, Сазонова, 1983% В этой связи представляется важной проблема поиска некоторых конституциональных особенностей индивидуального кариотипа, которые могла бы являться маркерами гоксико-генегяческой чувствительности к факторам среды.

В человеческой популяции известно наличие широкого наследственного полиморфизма хромосом, проявлявшегося в вариациях размеров и локализации структурного гетерохроматина, основу которого составляют относительно простые, многократно повторяющиеся нуклеотидные последовательности, не несущие структурных генов Шрокофьева-Бельговская, 1986"). Варианты хромосомного полимор-. физма, как правило, стабильны, они наследуются и сегрегируют в потомстве в соответствии с законами Менделя Сога1в-иа1аео ег а1., 1975-). Кроме этого, распределение в популяции размеров гетерохроматических сегментов соответствует нормальному: 80~9С$ приходится на варианты средних размеров и'лишь 10-20$ - на очень

крупные или очень мелкие блоки гетерохромагина Щветкова, IS8I"). Последние варианты принято называть экстремальными (Прокофьева-Бельговская, 1986),

Сопоставление тлеющихся в литературе данных о преимущественной локализации индуцированных разрывов хромосом в участках структурного гетерохроматина florad.Jonasson, 1973 jHanemann, 1976") с одной стороны, и данных о накоплении числа носителей экстремальных вариантов С-гвтерохроматияа в грушах различных патологий, связанных с повышенной хромосомной нестабильностью (.Захаров, Цонева, 1982 i Прокофьева-Бельговская, 1986"), - с другой стороны, позволяет предположить, что отдельные экстремальные варианты хромосомного полиморфизма или их комплексы в кари-отипе могут определять цитологический ответ на мутагенное воздействие, то есть хромосомный полиморфизм, в известной мере, ко-* жет быть индикатором индивидуальной чувствительности организма к неблагоприятным факторам среды.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение связи мевду наличием в кариотипе человека экстремальных вариантов С-полиморфизма хромосом и индиви-' дуальной токсико- генетической чувствительностью к различным мутагенным воздействиям.

Конкретные задачи исследования заключались в оценке частот повреждаемости хромосом в контрольной и профессиональной группах, а также степени повреждений после воздействия мутагенами на культуру клеток в зависимости от наличия или отсутствия дисбаланса по структурному гетерохроматину в 1,9,16 и У хромосомах..

Hay. ч н а я новизна работы. В настоящей работе впервые была изучена коррелятивная связь между наличием или отсутствием, в кариотипе крайних вариантов С-полиморфизма I, 9,16 и У хромосом а индивидуальной токсико-генетической чувствительностью к факторам среда в виде спонтанных и индуцированных различными агентами аберраций хромосом. Кроме этого, был проведен анализ специфики повреждений центромерных и пряцентро-мерных блоков структурного гетерохроматина для того, чтобы оценить вклад.повреадений этого типа в общую картину.хромосомного мутагенеза.

При решении поставленных задач были получены результаты, свидетельствующие о том, что наличие в кариотипе дисбаланса по структурному гетерохроматину тесно ассоциировано с повышенной

хромосомной нестабильностью. Показано, что значительная масть повреждений структура хромосом у таких индивидуумов локализуется в прицентромерном гетерохроматине или на границе его контакта с эухроматическим материалом.

Научно-практическая значимость. Результаты диссертационного исследования могут иметь широкий спектр практического применения, в частности, в качестве одного из тестов при определении профессиональной пригодности для работы во вредных условиях; кроме того, для выявления групп риска при различных формах патологий, связанных с повышенной хромосомной нестабильностью, например, при онкологических новообразованиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наличие в кариотшга экстремальных вариантов С-полимор-физма I, 9, 16 и У хромосом сопряжено с увеличением частоты спонтанных и индуцированных хромосомна аберраций.

2. Повышенная хромосомная нестабильность у таких индивидуумов в значительной мере обусловлена за счет разрывов, локализованных в участках структурного гетерохроматина, в частности, тех хромомос, которые содер;кат экстремальные С-варианты.

3. Наличие экстремального варианта не вызывает безусловного повышения повреждаемости хромосом, однако для лиц, имеющих такие особенности кариотипа увеличен токсико-генетическийриск, который может быть высоким при интенсивном воздействии на организм различных мутагенных факторов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на выездных заседаниях Секции генетических аспектов проблемы "Человек и Биосфера" МНТС при ГКНТ СССР (.Ереван, 1287; Кемерово, 1988'); на 1У Всесоюзном симпозиума "Генетические маркеры в антропогенетпке и медицине" (Хмельницкий, 1988"); на X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного адра" (.Гродно, 1990); на семинаре лаборатории общей цито-генетики Института медицинской генетики А® СССР и»1осква,1989")> на семинаре лаборатоии мутагенеза ВШИ профилактической токсикологии Ш СССР Шосква, ИЗ!) ; на семинаре лаборатории цито-геяетщш филиала Института медицинской генетики АМН СССКТомск, 1991"),

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы из 24в наименований, в том числе 168 на иностранных языках, Материалы .диссертации изложены на 104 страницах машинописного текста, включая 5 рисунков и 14 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Цитогенетически исследовали 48 человек из контрольной и 46 человек из профессиональной групп.

В состав контрольной группы вошли лица в возрасте от 18 до 33 лет, профессионально не контактирующие о производственными вредностями жители г.Кемерово. Все обследуемые к моменту сбора материала были практически здоровы, не подвергались рентгенологическим исследованиям и не принимали лекарственных препаратов в течение 3-х месяцев до начала исследования. У 24 человек из контрольной группы сбор материала проводили повторно синтез рвалом в 2 месяца от первого исследования. В последнем случае ■ часть культур подвергали, воздействию митомицина С (.0,03мкг/мл) и циклофосфана <.10 мкг/мл"). Мутагены вводили в 76-часовые культуры раздельно за 24 часа до окончания культивирования без последующего отмыва.

В качестве профессиональной - исследовали группу мужчин, рабочих основных цехов алюминиевого производства (.46 человек в возрасте от 22 до 54 лет")» которые в процессе работы постоянно подвергались воздействию фтористых соединений, аэрозолей металлов и смолистых возгонов каменноугольного лека (.Тямакин и др., 1984'), Внутризаводской контроль для профессиональной группы составили работники аппарата управления этого же предприятия. Обследованные рабочие не имели хронических заболеваний.

Материалом для исследования служила цельная периферическая кровь, которую забирали у доноров в асептических условиях, Для культивирования лимфоцитов пользовались общепринятой методикой (. нипцегГогЛ ч 1965 % Питающую смесь готовили из расчета: среда 199 - 6 мл; сыворотка крупного .рогатого скота - 1,5 мл; фи-тогемагглютишш "Р" (.фирма " ыгсо " , США') - 0,1 мл. Смесь поме шала в культурные флаконы и добавляла 0,5 мл гепаринизированно: крови. Срок культивирования для анализа спонтанного и професся

онально индуцируемого уровней хромосомных аберраций составлял 48 часов с момента введения ФГА. Для изучения аберраций, индуцированных митомишшом С и циклофосфаном материал фиксировали на 72 часу культивирования. За 2 часа до фиксации в культуры вводили колхицин (.0,25 мкг/мл% После предварительной обработки проб гипотоническим раствором 0,55$ kci в течение 10-15 мин. при 37$ проводили фиксацию в этанол-укусусном фиксаторе до получения однородной клеточной суспензди. Препараты хромосом готовили путем раскапывания на чистые обезжиренные и охлажденные стекла, окрашивали 2% раствором красителя Гимзы. Готовые препараты шифровали.

Хромосомные аберрации анализировали не менее, чем в 100 клетках в каздом варианте. Отбор метафазных пластинок для анализа и критерий учета аберраций соответствовали общепринятым (.Бочков, 1971% Учитывали хроматидные и изохроматидные фрагменты и аберрации обменного типа. Пробелы в число-аберраций не включали и регистрировали отдельно.

Для выявления С-сегментов хромосомы подвергали щелочной обработке насыщенным Ва(он)2 с последующей инкубацией в стандартном солевом растворе (. г х ssc ) при температуре 65°С и окраской раствором красителя Гимзы на фосфатном буфере дрирь-6,8 (. Sumner et ai., 1971% С-сегменты хромосом I, 9, 16 и У изучала долуколичественным методом в соответствии с рекомендациями Института медицинской генетики АМН СССР (.Прокофьева-Бе-льговская, Захаров, 1981% Метод предусматривает 5-бальную систему оценки С-блокоа в зависимости от их линейных размеров: -1-й балл - минимальный размер, 5-й балл --максимальный размер. Экстремальными считали варианты С-сегментов, которым соответствовали баллы I, 4 и 5, а также случаи инверсий С-блоков (Две-ткова, 1981% В профессиональной группе.оценку С-полимОрфизма хромосом проводили также методом количественного анализа, для чего измеряли линейные размеры С-блоков в микрометрах (.Подуго-льникова и др., 1984% Выбор I, 9, 16 и У хромосом для анализа был основан на том, что в этих хромосомах находятся наиболее ; крупные и вариабельные блоки структурного гетерохроматина.

Для статистической обработки полученных результатов пользовались критерием Стъюдента ий- критерий ранговых сумм Уилкинсона '(Холлендер, Вулф, 1983%

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Повреждаемость хромосом при наличии или отсутствии в кариотипе экстремальных вариантов С-гетерохроматина-

Для проверки гипотезы о возможной связи дисбаланса по С-ге-терохроматину в геноме и патогенетической чувствительностью клеток в виде индивидуальных частот хромосомных аберраций необходимо совместное изучение этих показателей в достаточно однородных группах индивидов, находящихся в сходных зкогенетическихусловиях.

При анализе С-полиморфизма хромосом I, 9, 15 в контрольной группе у 15 человек из 48 исследованных были обнаружены экстремальные варианты кариотила, причем у 6 человек кариотип был экстремальным по двум и более признакам. В одном случае выявлена полная инверсия гетерохроматического блока в 9-й хромосоме, в . пяти случаях инверсия этого участка.оказалась частичной.

Спонтанный уровень хромосомных аберраций в контрольной группе составил в целом 3,93 ^ 0,52$ при первом исследовании и 6,54 + 0,97$ - при повторном. Такие высокие показатели повреада-емости хромосом у лиц, не связанных с вредными производствами, по нашему мнению, могут быть следствием неблагоприятной вколо-гической обстановки г.Кемерово. Не исключается также действие эпидемического фактора, так как сбор материала для повторного исследования проводили в период интенсивного инфицирования вирусом гриппа (зимне-весбйний период"). Обращает на себя внимание значительная индивидуальная.вариабельность показателей частоты хромосомных аберраций от 0$ до 18$..

Дифференцированный анализ частот хромосомных аберраций в зависимости от наличия или отсутствия экстремальных С-вариантов в кариотипе показал, что повреждаемость хромосом' среди лиц,име-* ющих отклонения в содержании или локализации структурного гете-рохроматина (6,79 + 1,18') значительно выше, чем у лиц с нормальным кариотипом - 2,83^0,37 (таблЛ'). Причем достоверность различий мевду сравниваемыми группами возросла при повторном исследовании ( 0,001) по сравнению с первым ( р * 0,01"5.Это наводит на мысль о том, что значимость экстремальных вариантов может повышаться при увеличении мутагенной нагрузки на организм, так как во втором исследовании общая частота повреждений хромосом была значительно выше.

Частота спонтанных хромосомных аберраций у людей с разными вариантами хромосом I, 9 и 16

Группа лиц Кол-во Частоты хромосомных

лиц аберраций ^ ± е-

Первое исследование

С нормальными хромосомами 33 2,63 + 0,37

С экстремальными вариантами хромосом 15 6,79±1,181

Повторное исследование

С нормальными хромосомами 13 3,31+0,47

С экстремальные вариантами хромосом II 10,36 + 1.322

Достоверно отличается от значения для лиц с нормальными хромосома;® С1 0,01 { 2 0,001").

Следует отметить, что понятие "спонтанный уровень" хромосомных аберраций в условиях нашего исследования является в значительной мере условным. Неблагоприятные климатические условия, большое количество предприятий химического профиля и, как следствие этого, многократные превышения ЦДК токсичных отходов производства в г.Кемерово - эти факторы, по нашему мнению, являются причиной высокой повреждаемости хромосом выявленной в группе лиц,.не контактирующих профессионально с производственными вредностями. Более однородной, в смысле подверженности то-ксико-генетическим воздействиям, очевидно, является производственная группа. Изучение показателя частоты хромосомных аберраций среди рабочих основных цехов алюминиевого производства показало, что.он достоверно превышает показатель.яовревдаемостя хромосом в группе внутризаводского контроля (.4,46 + 0,35$ и 2,26+0,43$ соответственно), В табл.2 показано распределение частот хромосомных аберраций в зависимости от наличия или отсутствия экстремальных С-вариантов в профессиональной группе.

7

Соотношение частот хромосомных аберраций и

экстремальных вариантов в хромосомах $

16 и У в группе рабочих алюминиевого производства

Группа лиц Кол-во лиц Частота хромосомных аберраций j + е-

С нормальными хромосомами 28 4,10* 0,35

,С экстремальными вариантами хромосом 18 6,71 ¿1,63!

С экстремальными вариантами в 9-й хромосоме 10 9,28 +2,761

1 Достоверно отличается от значения для лиц с нормальным ка-риотилом (. р<0,05').

Из табл.2 следует, что наличие в кариотипе отклонений в содержании .С-гетерохроматина сопряжено с повышением хромосомной ,, нестабильности, как и в случае изучения спонтанного уровня аберраций.

Изучение хромосомных аберраций in vivo не позволяет выделять основные повревдшощие факторы в казщом конкретном случае: фиксируется суммарное действие мутагенов ила комбинаций факторов производственной среда; таким образом, можно говорить лишь об относительной схожести эколого-генетических условий, в которых проводится онтогенетический анализ. Наиболее однородные, условия токсико-генетического воздействия на клетки разных доноров можно создать при введении в изучаемые культуры одинаковых концентраций мутагенов, индуцирующих значительное повышение уровня хромосомных аберраций. Поэтому на следующем этапе работы был проведен модельный эксперимент с использованием в качестве мутагенной "нагрузки" митомицина С и циклофосфана. При • действии на лимфоциты in vitxo была обнаружена выраженная цитохимическая активность этих агентов, Так, митомицин С в использованной концентрации вызывал увеличение частоты хромосомных аберраций в общей группе до 31,07^1,56$, а циклофосфан-до 8,73 + 0,76# при 3,21 ¿ 0,62$ в контроле. При этом индуцированные повреждения хромосом чаще возникали у лиц с.экстремальными С-вариантами в кариотипе: 37,37±1,66$ и 25,91 +0,68$ после

.воздействия митомвдином С; 11,08 + 1,61 и 8,1640,82$ после воздействия цяклофосфаном (.табл.З-).

Таблица 3

Хромосомные аберрации, индуцированные митошцином С и циклофосфаном, и экстремальные варианты С-полимо-рфиэма I, 9 и 16 хромосом

Группа лиц Кол-во Число лиц клеток Частота хромосомных аберраций, х + 8х

Мятомицин С

С экстремальными вариантами кариотипа 9 900 37,37 + 1,661

С нормальным кариотипом II 1100 Циклофосфан 25,91 + 0,68

С экстремальными вариантами кариотипа 5 500 11,08 + 1,61

С нормальным кариотипом 21 2100 8,16 + 0,82

* Достоверно отличается от значения для лиц о нормальным кари-

отипом (. Р < 0.001-).

Таким образом, на всех трех уровнях сравнения (.контрольная, профессиональная группы и модельный эксперимент') были получены сходные результаты, рассмотрение которых в совокупности позволяет придти к заключению, что наличие в к&риотипе отклонений в вариабельности или изменение локализации С-блоков сопряжено с повышенной хромосомной нестабильностью. При этом, наличие экстремального варианта само по себе не вызывает безусловного увеличения разрывов хромосом. Так, например, среди носителей частичной перицентрической инферсии гетерохроматического блока 9-й хромосомы в профессиональной группе частоты аберраций составил;! 17$ ; 6,4$ ; 2,3$« Поэтому речь скорее может идти об увеличении токсико-генетического риска для лиц, имеющих экстремальные варианты в кариотиле. Однонаправленность полученных результатов во всех сериях эксперимента свидетельствует такте об отсутствии принципиальной специфики при воздействии мутагенов разного типа. Важно наличие самого воздействия, а стзпэнь реализация разрывов

зависит от индивидуальных возможностей репарационных систем организма, к которым, по нашему мнению, следует добавить и особенности состояния гетерохроматических районов.

2. Цитогенетическая значимость разных типов экстремальных вариантов С-полиморфизма

К понятию "экстремальный вариант" по' условиям работы относили любое значительное отклонение в количественном содержании или локализации структурного гетерохроматина. Однако, понятный интерес вызывает вопрос о том, какие конкретно варианты полиморфизма: увеличение, уменьшение-или изменение локализации С-сег-ментов в геноме сочетаются с наиболее высокой нестабильностью хромосом. В табл.4 сведены данные, полученные с учетом такой дифференцировки яри изучении контрольной группы.

Таблица 4

Хромосомные аберрации в группах лиц с разными типами экстремальных С-вариантов

Группа лиц Кол-во лиц Частота хромосомных аберраций, х ±

Носители вариантов (.+■) 8 6,38* 1,05

Носители вариантов (.-У 6 10,50*2,74

Носители ияФерсяй . 7 - 7,56* 1,62

Оказалось, что наличие любого из рассматриваемых типов экстремальных вариантов сопровождается повышением уровня хромосомных аберраций, однако достоверности различий между этими группами нет ни в одном случае. Следует отметить, что такой анализ связан с рядом методических сложностей. Имеется ввиду,прежде всего, малочисленность выборок носителей отдельных типов вариантов и, как следствие этого, большая ошибка средней. Кроме того, в кариоише донора могут одновременно присутствовать дваялг более экстресалышх варианта, поэтому оценить значимость какого , либо отдельного варианта в таких случаях не представляется возможным.

Недостаточностью выборок можно объяснить отсутствие достоверных различий при рассмотрении частот хромосомных аберраций у

носителей С-вариантов разных хромосом (.табл.5"), В ?том случае

Таблица 5

Хромосомные аберрации и С-варианты отдельных хромосом

Экстремальный вариант Кол-во лиц Частота хромосомных аберраций , х * в ;

Варианты 1-й хромосомы 9 6,68*1,79

Варианты 9-й хромосомы 7 7,83 + 1,47

Два и более экстремальных варианта 6 9,67*2,02

наиболее высокая частота разрывов ассоциируется с наличием двух и более вариантов в кариотипе: 9,67 + 2,02$. Этот факт хорошо коррелирует с данными литературы о накоплении в группах различных патологий индивидов, обладающих сразу несколькими экстремальными полиморфными вариантами (.Микельсаар, 1979; Каретникова, 1981 ; 0г1зЪезаес!гуШ et а1. ,19851. Вопрос о неодинаковой "ценности" гегерохроматина в отдельных хромосомах обсуждается в литературе. Обычно выделяют хромосому 9, дисбалано по которой коррелирует с аномалиями развития и нарушениями репродуктивной функции. Это, как правило, связывают с возможностью значительных вариаций э содержании гегерохроматина в этой хромосоме (.Захаров, Цонева, 1982'). В этой связи, интересным лредятавля-ется наблюдаемое нами увеличение уровня хромосомных' аберраций среди обладателей экстремальных вариантов в 9-й хромосоме в профессиональной группе (.табл.Э').

3.' Особенности локализации спонтанных и

индуцированных разрывов в хромосомах человека

Логично предположить, что повышенная хромосомная нестабильность среда носителей экстремальных С-вариантов может быть обусловлена увеличением вклада разрывов, локализованных в гетерохроматических районах, которые более всего подвержены изменениям (. Когай,<Топаз5оп, 1973} Напвшанн, 1976 ¡¡исЬаар еЬ а1., ■

1980; Доверь еъ а1, 1982"). В связи с этим были определены частоты повревдаемости гетерохроматических районов хромосом I, 9 и 16-й у лиц с экстремальными вариантами кариотипа и у лиц с нормальным кариотипом. Оказалось, что у лиц с нормальным кариотипом доля разрывов в гетерохроматических районах составила в среднем 12,9$ при первом и 15,6% - при повторном исследовании контрольной группы, а у лиц с экстремальными вариантами кариотипа эти величины оказались почти в два раза выше: 2В% и 29,1% соответственно. При сравнении числа аберраций в гетерохроматических районах в расчете на I клетку оказалось, что у лиц с экстремальными вариантами повреждаемость этих районов достоверно выше, чем у лиц с нормальным кариотипом: 0,022±0,004 и 0,004^0,001 в первом исследовании; 0,031 ¿0,004 и 0,005 + 0,002 в повторном . исследовании (.табл.б-). Аналогичные различия в частотах повреждаемости гетерохроматических районов наблюдались и в модельном эксперименте: 0,17^0,02 и 0,10^0,01 после воздействия митомицина С; 0,02 ± 0,007 и 0,01 + 0,002 после воздействия циклофос-вана (.табл. 7}, однако их достоверность отмечалась лишь после вот здействия митомшдощ С. Мятомицин С оказался более специфичес- • ким повреждающим агентом' в отношении гетеоохроматических районов хромосом, чем цяклофосфан, так как при действии митомицина С 36,0$ всех разрывов локализовались именно в этих участках хромосом, а при действии циклофосфана - только 12,2%. Кроме того, на специфичность действия митомицина С указывает тот факт, что после его воздействия'в прицентромерном гетерохроматине хромосом I и.9 во многих случаях наблюдались неокрашенные участки, напоминающие по морфологии изохроматидные гэпы. Такие структурные особенности гетерохроматических блоков после воздействия митомицина С, очевидно, наблюдали Малыгина-с соавторами (.1988-), которые назвала их фрагильными сайтами, -чувствительными к мито-, мицину С.-В. настоящей работе такие-фрагильные сайты в случае отсутствия смещения ацентрического фрагмента-по оси хромосомы в число аберраций не включались, а учитывались отдельно в качестве пробелов.

Для Выяснения вопроса; насколько кавдый отдельный вариант является местом, где концентрируются разрывы был проведен анализ локализации повреждений в гетерохроматине тех хромосом, которые несут экстремальные варианты (.табл.8).

Частота стоитеиных повреждений хромосом в районах структурного гетерохронатина

Группа лиц Кол-во лиц Число Число аберраций на клеток I клетку, * + 5г Число аберраций на I клетку в гетерохроматических районах, к +

. ПЕРВОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

С экстремальными вариантами кариотипа 15 1500 0,076+ 0,0121 0,022 + 0,0041

С нормальным кариотипом 34 3400 0,027 + 0,004 ПОВ'ХОШОЕ ИССВДОВАНИЕ 0,004 + 0,001

С экстремальндаи вариантами кариотипа II •1100 . 0,110+ 0.0121 0,031+-0.0041

С нормалькьм кариотипом 13 1300 0,035 + 0,006 0,005 + 0,002

^ Достоверно отличается от-значения1 для лиц с нормальным кариотипом (Р < 0,001).

Таблица 7 •

Частота хромосомных повреждений, локализованных в районах структурного гетерохроматина, после воздействия мктоми-цияом С и циклофосфаном

• Группа лиц Кол-во лиц 'Число • - Число еберраций на клеток I клетку х + ¿. ..... ■ ■ ■ ■ .............. Число аберраций э гетерохроматических районах да I клетку, х . + 5- ' X

МИТОМЙЦЙН с

С экстремальными вариантами кариотапа 9 900 о^г+о.ог1 о.^+о.ог2

С нормальным кариотипом,- II 1100 0,30 + 0,01 ¡щлозосш 0,10+0,01

С экстремальными вариантами кариотипа 5 500 0,14 + 0,013* 0,02 + 0,007

С нормальным кариотипом 23 2300 0,06 + 0,008 0,01+0,002

Достоверно отличается от значения .для лиц с нормальным карцотипом Р< 0,001;

2 Р < 0,01).

Локализация повреждений в гетерохроматических районах хромосом I, 9, 16 и 7 после воздействия митомишшом С у лиц с экстремальными вариантами разных хромосом

Экстремальный вариант Кол-во лиц Частота поврэвдений в гетерохроматических районах разных хромосом, %

I 9 16 7

1-я хромосома 5 30,3 67,1 2,6

9-я хромосома ' 4 19,9 74,7 2,7 2,7

Очевидно, что наличие экстремальных вариантов в хромосомах I или 9 ассоциировано с увеличением доли разрывов именно вгетерохроматине этих хромосом, однако объяснить общую картину повышенной хромосомной нестабильности у таких индивидов только за счет аберраций в измененных гетерохроматических районах не представляется возможным. К настоящему времени не ясен механизм, обуславливающий высокую частоту разрывов и в эухроматической части генома у лиц с экстремальными вариантами С-подиморфизма I, 9 и 16 хромосом.

Высокая частота разрывов в структурном гетерохроматине может быть объяснена некоторыми физико-химическими особенностями, отличающими его от эухроматических районов Шрокофьева-Вельгов-ская, I986-). Так, например, то, что гетерохроматин находится в конденсированном состоянии, по мнению ряда авторов, затрудняет доступ к местам первичных поврезденяй для ферментов системы репарации С yielding , 1974 ; Лежава, ^БО). Таким образом, случайное распределение предмутационных событий по длине хромосом в конечном итоге реализуется в картину преимущественной локализации разрывов в гетерохроматине. С другой стороны, разновременность репликации гетеро- и эухроматических участков генома может создавать в местах их физического контакта некоторое статическое напряжение, в результате чего часть разрывов возникает на границе эухроматина и гетерохроматина по принципу'"рвется там, где тоньше".

Полученные данные о том, что липа имеющие ь кариотияе экс-

треыальнне варианты С-полиморфизма хромосом'I, 9 и 16 более чувствительны к действию мутагенных факторов, чем липа с нормальным кариотипом, позволяют по новому взглянуть на возможные причины клинического эффекта дисбаланса гетерохроматина в геноме человека, обсуждаемые в литературе. Не исключая возможных крушений мейотических процессов, прямого или опосредованного влияния гетерохроматических участков на функционирование генов, активных в эмбриогенезе, t Sanders , Favan , 1972 ; Schwarzacher, 1976"), мы хотели бы обратить внимание на высказанную Hsu еще в 1975 году идею о том, что изменения в распределена и количественном содержании гетерохроматина связаны с изменением мутабиль-ности, а повышенная клеточная мутабильность, в свою очередь, может иметь значение в патогенезе многих заболеваний (.Hsu, 1975"). К сожалению, в исследованиях, посвященных изучению клинического значения полиморфизма хромосом этот вопрос практически не обсуждался, ХОТЯ В 1976 ГОДУ Halbrecht и Shabtei Предложили гипотезу, согласно которой в участках хромосом, где имеются увеличенные гетерохроматические блоки может повышаться вероятность различных поломок. Авторы предложили, что именно, г-жой механизм лежит в основе многих патологических состояний, где имеет значение нарушение структуры хромосом: спонтанные выкидыши, врожденные аномалий, злокачественные новообразования и т.д. (.Halbrecht, Shabteil976')» ' ' ; ' '

На основании результатов, полученных, в настоящей работе, можно сделать вывод о том, что индивиды, имеющие, несбалансированный, С точки зрения гетерохроматина, геном относятся к группам повышенного риска при возникновении различных патологических состояний, так или иначе связанных с хромосомной нестабильностью. Причем, риск будет тем выше, чем сильнее на организм давление мутагенньос факторов природного или антропогенного характера.

В связи с этом, полученные нами экспериментальные данные могут найти применение в системе медико-генетического мониторинга производственных контингёнтов, работающих в условиях, связанных с повышенной профессиональной вредностью. Сюда можно отнести химические, фармацевтические, металлургические, горно-добывающие и другие предприятия. Тест на-определение экстремаль- -ных полиморфных вариантов в кариотипе', наряду с другими методами определения индивидуальной токсико-генетической чувствитель-: • . • 16

нести к условиям конкретного производства, позволит давать рекомендации по рациональному использованию трудовых ресурсов и, в конечном итоге, снизить уровень заболеваемости со всеми вытекающими из этого благоприятными последствиями.

ВЫВОДЫ.'

1. Изучена зависимость частоты спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови человека от наличия или отсутствия в кариотипе экстремальных вариантов С-Долиморфизма I, 9, 16 и У хромосом.

2. Выявлена связь экстремальных вариантов С-полиморфизма хромосом с повышенной чувствительностью кариотяпа донора к изученным видам мутагенного воздействия.'

3. Определено, что высокий уровень хромосомных аберраций у носителей экстремальных вариантов в.значительной мера связан с увеличением вклада разрывов в.гетерохроматических районах и, в частности, тех хромосом, гэтерохроматия которых имеет отклонения от средяелояуляционных значений.

4. Показано, что носительство экстремальных вариантов m вызывает безусловного повышения частоты повреждений хромосом, • однако, для лиц, имеющих экстремальные варианты в кариотипе увеличивается токсико-генетический риск, который может.быть высоким при интенсивности воздействий на.организм различных провоцирующих факторов.

5. Полученные результаты позволяют предложить выявление экстремальных вариантов С-полиморфизма хромосом в качестве' цито-генетического теста на определение профессиональной пригодности для работы в условиях с повышенной вредностью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дружинин В.Г., Пономарев И.В. Исследование хромосомных аберраций и С-полиморфизма в группах лиц повышенного профессионального рискаИспользование биосферных и модельных объектов для генетического мониторинга: Тез.докл. Ереван, 1997. С.35.

2. Дружинин В.Г.,'Пономарев И.В., Кель Л.й. Экстремальные в$ри~

w

анты С-полиморфиэма хромосом как маркеры индивидуальной чувствительности к токсико-генетическому воздействию производства Ц Генетический мониторинг населения промышленных городов в условиях загрязнения окружающей среды. - Кемерово, 1988.-■ С.81-87.

3. Дружинин В.Г. Экстремальные варианты С-полиморфизма как воз-мо.таый маркер токеико-генетической чувствительности лейкоцитов человека/1 Генетические маркеры в аятропогенетике и медицине: Тез.докл. - Хмельницкий, 1988.-С.114.

4. Дружинин В. Г. Дисбаланс по гетерохроматяну I и 9 хромосом как маркер токсико-генетической чувствительности к факторам среды/' Проблемы мониторинга за здоровьем населения промышленных-городов: Тез.докл, - Ангарск, 1989. -С.41-42.

5. Дружинин В.Г., Самойлов Э.В. Особенности хромосомного полиморфизма и чувствительность к канцерогенезу/' Молодые ученые Кузбасса - народному хозяйству: Тез.докл.-Кемерово, 1990.-С.28.

6. Дружинин В.Г., Грищук Т.Г. Онтогенетический эффект неактивированного циклофосфамида в культуре клеток периферической

• крови человека// Молодые учете Кузбасса - народному хозяйству: Тез.докл.-Кемерово, 1990.~C.S7.

7; Дружинин В.Г. Особенности локализации индуцированных разрывов в хромосомах человека// Цитология. 1990. Т.32. Л8. С.847-. 851.

КемПК. 1991г\ Зак. ¿368 '