Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-цитогенетический полиморфизм гетерохроматиновых районов хромосом у детей с недифференцированными формами умственной отсталости

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демидова, Ирина Александровна, Москва

/- ' Л Л) . ' . ■ '

А,. . »' ' лу .. ^

и- V. ^ " ./'

у

-• ст-эт, р с )

О'" 0 .г: и1' ... I?' „а "Ш-

> V? ») Л"'ЛЬС« < »'1<» /Л' * у 1 , »irt.it'< . ¿.'СиО

ааТОГШ

^ртисб 0еисс/~

\глт ллэксачдрртга

•; .'{¡¿айв-

„: -II 'с :г л иЙ /з - I ч/У¿¿Жг*^ш .РОЛАЧ)- АТ ¡ьо I

: О " "Г С .. ЧгО ^ ,.11! '■Ог' .

ШТВВШЮ.. ОТСЪУЮСТЙ

03.00.4.5 - Генвтжка

,<СС'"14 А

на соисканйз ученой степени каядхязтз бйолсгипвских наук

;!Г-------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ~

; Президиум ВАК России

! (решение от " " ^ 19^ РУ^БОДИТвйЬ

¿¿ЗдЗб^М^ом К/«,7_ октор $№Я. наук

ЪиОиеНдч^бяШ_______|Г сл'^°^сай0ва

: ' * управления ВАК Ро: - ¿аучшй консультант

£¿¿¿6 __________________________________Академик ШШ, про г*

'' " ................. "" «.'3..Вельтищев

гежва -

О г Я А В Л g М й S

ч

; * т < > \ttjj в

: t t1 ' >i

I . v it. и ...................... i —C>

ь. 0-...Л» T * r?v ............... . . . . 7^0

iui. Гятологичвский полиморфиз« гетерохроматиновых

районов хромосом человека. ............ 7-20

£.¿,1. >Мтя характеристика поличор^мзма гетерохроматиновых районов жротесом человека. ....... 7-у

IT.i.i?. голшорФжзм С -гетер охроматшовых районов

хромосом | лиц с нормальном фенотипом. ..... ХО~Х^

1.1.3. 1-:олоо'.>]йт/ С-гетерехроматиновнх райояов

xpo»*or.o»i и патология .............. iWO

i';.i.S.i. Иссяеюванш С-гетерохроштшшвых районов

хромосом при нарушении репродуктивной ФУНКЦИИ.

Исследование 0-гетерохроматиновых районов хромосом у детей с задержкой психомоторного развитая ш врожденшзш порокаш развития . . .

L.i.a..-. .Исследование С-гетерохроматиновых районов

хромосом при онкологических заболеваниях . . . ii-гО

1 олекулярний нолш-чор; 7.зк гетерохрошткновнх районов х.ю с:оу человека.............

V.i-.i. г.«соко оиторп /еся еателлитнш последовательности ~л;? в генощ человека. ..........

Изучение молекулярного полиморфизма Снгетаро-

хре^атшовше районов хромосом с номо^ьк методе ГШЗрРЗДЗЗОД! in situ ............ -U

l.°,v>. i-'зучение молекулярного подкур'тии л-гетерс-хроштшовях ра' о- о-- хромосс ~ i-c о > одтоя бяст-гиб^жиза?щи на Фильтрах по Саузерну. . . .

Г.з. За ключе иге к обзору литератур"..........об^+о

г* Ф •« < \ ......

. ч I 1 ........ е. «....»* T.L —

ПЛ. Объект исследовании............... .

Стр.

Лряготовлеше препаратов метафазннх хромосом . . . ШЛ. Фетодн диФФеревитального окрашивания хромосом. . . ^^

8.3.1. ^-окраска хромосом . ..................,+г:ф

С-о?фаска хромосом ...............

м.-*. !';рйптшп анализа хромосомных ..препаратов ......

ЦтЬТ&йщтшщъ Г т метафазннх хромосомах

//7 зИи .....................

-1.6. .-.«ндсяеяяе мз клеток яимфоадов периферической

крови.........................................нб-ч?

.V» , глотка , рсст^гктазамк. ........... ч-7-.нЗ

. Голь-олактроФорез. . . ...... ....... . ча

Ф.^. шот-гкбркдиза щп ¿Ш т $ьтрах но методу

Саузеряа ..................... ^ч^о

•1 .¿О. -"яошфовандов "классическиен и альфа-сателлшшае

последовательности .Лн, используемы® в работа . .

bi.ii» Статистическая обработка результатов. ......

т*' ъта ол:г ............ . .

1У.1. ^'итогенетйческое исследование детей с задержкой психомоторного развития, шожествеиншй вуожден-вшш пороками развития ш/шяш шкроаиокалияш. . .

г'^ол*кулярно-читогенетйческйе исследования хромо» сомнях вариантов 1Чь+ , 9ф+ , 1баЬзг у детей с п.-^^р^'ло' ьс\ .о -стор! ого развитая, множествен*»

тгу Шу1О-чзИМ развития ш/шяш кикро-

аиошяшши. . .......'......... . 70~8в

а/-.о. Исследование молекулярного ¿юдшорФ^зма длины ресхрисционявх Фрагментов О-гетерохроматинового района хромосом« £•.•••.•••••••• . 65—106

1>г.3.х. »«деление 1 из клеток периферической крови. »6-02

¿•7.3.'?. выявление полиморфизма по' длине' рестрикционннх Фрагментов нуклаотидной последовательноеи

"классическом* сателлитиой ■ рис сьот'-кчной для хромосома 1 .....

;)» с ..-к - 1. > • .

и

Стр.

А » ( ' > 9

• * • * 92-106

• • * •107-I11

• • ♦ • 1Ш-11Ь

.л ' -

1 1*4 — 1С*г

i. ВВЕД IB IS

Актуальность теми, Кктогенетичаскйв исследования, «оказали, что феиотипйпвски нормалытез индивидуум« различается между собой по тонким особенностям строения хромосом, ¿то приводит к

»крокощ? п о лммор* и зау хромосом в понуяячлм человека (Прокофьева-Беяьговская, i>:Ki). Истинный полиморфизм хромосом обусловлен вар'иабельностьг в размерх их гетерохротттових районов

( Jacobs ,

г? настоящее время собрана обширная ик^сдоатля о различиях варзшшх гатерохронатиновнх раюнов. Наиболее ярко- их варкабеявность в^ратена в оволоцвнтромвряях участках хромосом I, у, iu и дистаяъноу еегиенте длинного »1р*й хро?досомн У.

Останов явно, что полкмор; чч околоце нгроперного готерохро-катииа коязблетси в определешшх пределах. Его экстрешяьнае варианта, OCOtfeHHO такие;, как lqh+ , 9qh+ , 16qh+ встречаются в нормальных популяциях-, с частят ор до ■ i ,£>)» (Кулешов, Кулиева, ЫЪ | Hsu et ai . з Ш7> и это не отражается на их 4'оиотипе. •'.• то же время-- известно, что среди индивидуумов с задержкой психомоторного развития, множестве г нш/н<; вро деннаш пороками развития

Чл } я/или шкроаиомздкяш р-.звитил (и'Л-) носители иодобнмх хроь'осошгох вариантов встречаются с частотой до llр ( Kanata , i>k»). литературе v*r*n представлены сведения, «о котгу е-которяе вариант« хроиосом могут рассматриваться как одна из причин возниктговенир дефектов развития ( Gardner et al . , ¿>'7-* | Spak et al . , Ь^У). ^ЛШКО ДО СИХ ft Op вДйКОГО ВЗГЛЯД« KB

роль нартитов гятерохроматиновшс сегментов з возникновении той

или мной патологии человека не существует. Остается неизучениям

вопрос о том, связана ли вариабельность околоцеитромернмх гетерохроматиновых районов хромосом о их ганеtiпеской нейтральность» и отсутствием специальных функции или са«а вариабельность составляет особенность тех функций гетерохроштина, вследствие которых наблюдается задержка психомоторного развития, ШВР и/или I&Р (Прокофьева-Вельгояская, &<ii ). Классические методы цитоге-нетического анализа позволили обнаружить лишь цитологический поягчи«!/я«* этих участков хрошоооы, не объясняя их нолекулярвой сути. : связи с эти*.' /pvwm строения гетерохроштина, его влияния на функционирование генома и корреляции iqh+ , 9qh+ ,

i6qh+ с наследственной патологией остаются нерешеннши задачами современно/: цитогенетики человека.

В последнее время разработан« «етодн изучения полиморфизма готерохроадтиноаях районов хромосом на молекулярное уровне. üm метода основану на технологии получения рвкоибянанхявх молекул ¿Ш и испо^ьзованил их в виде ¿НК-ьроб или ДШ'С-зоядов в исследовании рар&'о'ельпости гетерохронатина у разных индивидуумов. Такие . '-зонды сконструирован» на основе клонированных в плаз-mm новторяг<шхся фрагментов "классической" сателяитной и альфа-еателлитиой ДНК человека, чор?.*иругщкх гетерохроштиновне участки хромосом. С мх ксгоапь» било i"¿o-í83ap0, что для гетерохроматиновых районов, я w числе к для хромосом i, у, ¿ь характерно два тиш принципиально различного поликсрфкзма« идш: из них связан с вариабельностью копи.:-; "классической" сатеяяитног; которая, по-тжтощ, отражает цитологипеский «ояииорфизя С-гэтерохроматииа

( J.R. Gosden , С.М. Gosden , t^J-J^pOB И Др., $

яова и др., Все встречающиеся в литературе немногочислен-

ное сообщения но изучаемому вопросу ароведенп на нормальных индивидуумах. ¿.ú сих пор на изу чался вопрос о связи числа копий раз-

личншс типов сателлитhwx хромосом i, ;J, Lb с патологическим состоянием человека, '-отя можно предположить, что к тру тетю развития могут б*зть причастии отдельное семейства повторяющихся последовательностей вариабельность в количестве копий шторах мохет иметь патологический эффект (иветкова и др., ъШ).

другой mi. полиморфизма связан с рестритоннам полиморфизмом сателлиттшх ; WilXard , i Jabs et al. , }WilXard,

Waye , ibi;i7 | Waye et aX. , a-» ¿7 J *.pOB, } Yurov et aX . ,

Ш7, 1'Ж ( Kiyama et aX. , . p83fIbTiiT0 ИССЛеДОВЗНИМ

обнаружив» что «рактически для каждой из немногих изученных са-теллитных последовательностей существует мвшгндйвмдуальн»й полк-мо;.»фжзм фрагментов рестрикции. '1акие фрагмента характеризуются, в основном, стабильно^ хромосомной локализацией и наследуются* вероятно, как яростна мендеяевские признаки. Даяние же литература? по м-швлензш полиморфизма ляда; рестрик-гдонинх фрагментов око-лепентрсщрного гетерохрсштина хромосом J, 16 едянични

С WilXard et al,, J ?0Г3 8В, *~рОВ, . ^ИЯВЛвНЙЗ НОВ ИХ

полиморфных Фрагментов сатеялитннх хромосом >, хо позволит выяснить происхождение вариантов этих хромосом в овмвйимх случаях, что 1аыт актуально в проведении генетических исследовании идевтифгi.vona ть личность индивидуумов при проведении генотипо-скопии чоаределении отцовства, зиготности Олжзне юв), а также на основе стратегии сцепления картировать расположеннне в этом районе гена наследственных болезней и детализировать генетическую карту хромосом ¿, д, ш.

Исходя из всказанного, челью настоящей работе явилосьi на основе молекулярного и молекулярно-питогенетического исследования вариабельных гетерохроматиновых районов хромосом х, *, ¿и у детей с задержкой психомторного развития, ВИР ?./тж MP и их

родителей установить частоту хро^осошнх вариантов м »оказать

возможность использования их как генетических маркеров хромосом в практика медицинской генетики.

Для достижения поставленное цели в работе решались следующие за дачи:

I. Тщявить грущу больных с увеличенными ..экстремальншш) гетеро-

хроштшювши районами xpoaocoil lqh+ , 9qh+ , 16qh+ СрвДИ детей с задержкой психомоторного р*зз, тут, • 1 Ал/ ДГ, используя метода патогенетического анализа.

Определить частоту г рзегфвделвние по полу и возрасту отдельных хромосошмх вариантов ; iqh+ , 9qh+ , i6qh+ ) среди детей о задержкой психомоторного развит/ь Л. > к/или «АР. ve '""-нявить связь экстрешяьнчх хромосогн*"с вариантов íqw- ,>

9qh+ э 16qh+ С Определенней ТИШШ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ ПОСДвДО-

- тельноптей /Mi в груше болымх Дчзтей. . з ч 'ть пояи?лор*йзия -о длине ростршщгопнпх "раг'-'нвтов на прх~ г-с- ;;jot<<í*:ho н/клотядяоД послелог,".твмЫтооги "кяасси-«^скоД* езтетютог :г i»77), сги1иД:чно ' хдотсот ¿.

Научная новизна. ггрв-е изучена связь хромосомных вариантов lqh+ , 9qh+ , 16qh+ С SOTO "О" Ьл^/Í бСГЬНОСТъ- <\ « С * tlH-

но двух разщчннх типов сатеяягткчх ^ , «¡гдетавденн * vvzr клегров&тюх хро?лосомосненифичнах последовательностей "классической" сатеялмт??од * ь а-сателлитной дик у детей с задержкой психомоторного развит' , ! и/или ДПР.

Гоказатго, что увеличение гетерохроматиновых районов хромосоа I., У , 16 у детой с умственной отсталостью уожет бчть связано с поешетштл содертаиием числа копий "классических" и альфа-сателлит пт '}'", причем впервые устачовяепо, что эти два типа варьируют независимо друг от друга.

- í> -

Зпврвнв выявлен полиморфизм по длине рестрикцкоиншг фрагментов да примере ДЯК последовательности риС X.77, ene оИ отрой для хромосош после воздействия реетриэдионной эндонуклаазоб Важ! 1 и ?иперполкмсрфизм по длине рострикционнях фрагментов поело воздействия рестрнкщшшой .эвдояуклеазой ВсоЕ I*

Определена частота (14,4» экстремальных хромосоштх вариантов , связанных с увеличением размеров гетерохроматиновых районов lqh+ , 9qh+ , 16qh+ В ГруППО Д6Т9Й С ЗаДерЖКОЙ психомоторного развития, :ашр и/к л i . Вариант iqh+ вгпвлявтея в f , ( чучаев, 9qh+ - в 7,3/% i6qh+ - в и ,9 сочетаяные вариант« - в ■*- • uto существенно отличается от их встречаемости в нормально« популяции - i ,s>

Г; ay чно-пра ш ин е ска я з на чщрот.ь.. В процессе работа успешно апробирован молекулярно-гштогенетичзскяй подход в анализу С-гетерохроматиновых районов хромосом с применением хромоссмоспеци- " фкчшх % —1 _ гб рис i.77, ¿r i~i2r рй) р'Л': рНиВ.

pss Ртм шесть зондов, специфичных для хромосом i, i6, соответственно, мо-пто рекомендовать как шторма л для последующих работ по анализу полиморфизма гетерохроматиновнх участков ж ввяо-нению их возможно.!-! связи с наследственной патологией у человека, lia;с исследования показали, что такие задачи вполне реаяыт. ¿ля осуществления этих задач есть все необходимее предпосылки, которое включагг яали»иг ззрзгистрто^чнях болыгох а задержкой психомоторного развитие, "'IV И/ИЛИ ' И lqh+ , 9qh+ , 16qh+ ' , на .9 ' -зондов дл-* проведения молажулярно-цитогенетического анализа даннчх районов, агробированний подход к их анализу с помощью метода гибридизация нуклеиновых кислот in situ при использовании хромосомосзд цифичннх ,.чШ1-прод.

Практическое значение имеет внявленн-лй полиморфизм но дли-

т фрагментов рестрикции последовательности рис 1,77, специфичной для хромосома д.. дти фрагиентя можно использовать в качестве маркзра с прилегая наряду с уникальными полиморфными Фрагментами тя картирош-щ^ генов, расположенных вблизи геторохро^атина зто л ну ссг-7". к',« го' о, обнаружению пояииорфнмз фрагменты и о и;» лг з генетической жлвтт для выявления т 71 /I* " • гг ~ вариантов в снаэШшк случа-

ях, личности но "о^к« аг мч" при устаиоч ;енип

ИСТлЧН'ТО 11- '¡О-^ПТО ОПОВСТВв И ЛЩЧ'Г-О^ГЛ близнецов.

"■■аявлешшэ резкие отличия по частоте хромосомных вариантов ель*: 53т-1 с з -»рж-го п? х* 'ЧС^и.т^ ¡> .зи • хх-, : _ /"л; ^ « к-. *рг 1мю. гр>" не св. Д'1!^ »ьегг ю , »ио ш. с д^о о~ СОКШШИ варштттаии 1дЬ+ » 9чЬ+ , 16дЬ+ еОЛхХ-Л^Т группу диска и требуют - л го тщательного исся«,.с **; .

- ? -

í;V0i,3üp лшшьтда

íuí» ''итологическиМ полиморфизм гетерохроматиновых районов хромосом человека

fUX.i. Общая характеристика полиморфизма гетере-хроштяновнх районов хромосом человека

Peo яоршльнче индивиду у ш шект присущие только им особенности тонкого строения хромосом, нто создает их широкий полиморфизм в популяций человека» Уояшорфизм хромосои человека характеризуется: присутствие« варианта хромосомы во всех клетках, передачей хромосомного варианта, как простого "зчдзлиру*wo признака, отсутствием заметного фвнотшшческого з 4 акта v..a<apos, ,уонева, Ш- i Прокофьева-Бельговская, 1

Исследования но -изучению- полиморфизма хромосом начали в кон-т 5v-x годов после внедрения в генетику современных методов приготовления препаратов ш рождения такой щуки, как даогеиетмка человека. Наибольшее развитие они получили в 70--? годн, кода исследователи обнаружили Феномен двффвренщального окрашивания хромосом no дяйяг? ( (г -, «1 - , С- к И-метода)- Ь результате стало известно, что дитояогичес-:/. ьоя/мер'и'"' хромо с о?»? обусловлен различиями в размерах и свойствах их гстерохроматхновух районов, которое содартат, в основном, высоко ш средневовторягщиэея последовательности ДНи:. Ьолиморфизм m наиболее ярко выражен в районах вторичных перетяжек хромосом i, i, ¿ó, а также в диетаяьнок сегменте длинного плеча хромосома У . крупные гетерохр оматиновае района могут варьировать но величине не только в клетках разних индивидуумов, но i у гомологов одной тары хромосом. Такое явление получило название гетероморфизма гомологов.

данные вариант« цитологически дано обнаружить с помощью

обычных методов равномерного окрашивания» критерии для идентификации которых впервые йпжш Предложена Н.&. Lubs И Ruddle ( Lubs » Ruddle , Ш70). ГрИ ЭТОМ наибОЯвв КруПНВв бЛОКИ ГвТврО-

хроматина хромосом i, 9 г 16 регистрируются как вторичная перетяжка .

Околонтромврняв гетерохроматиновые районы, а также гете-рохроматия длинного плеча —хромосома, наиболее интенсивно проявляется при применений О-мвтода окрашивания • последний включает в себя обработку фиксированиях хромосом воднши растворами с высоким значением рН ш солевыми растворами при повышенное теине-ратуре. Это позволяет но-разному воздействовать на зу- и гетерохроматиновое районы. Около центромерный гетерохроматш значительно устойчивей к хшшческш и температурным воздействиям. Ьоэтому он сохраняет способность к интенсивному о^ашванию специфическими

ЯДврнЫМй красителями ( Arrigki , Hsu , l97i 5 Hsu , Arrighi,

¿9711 Sumner , ¡^7Д). is ы являющиеся при использовании данного метода сегменту гатерохроштишовых районов носят название С-ге-тврохрокатина.

Д последние года, появились новые модификации С-окрашвания

Babu et al . ) УО f ¡.J J 5 } Hedemann et al ; , iAlii}« ШШ

основаны на воздействии рестрикционных эшшнуклеаз на метафазкне хромосомы человека ш последу »щей регистрации различного набор С-полос. Ьо сравнению с традиционные С-окрашиванием данный вето ж дозволяет более эффективно изучать популяциониый полиморфизм хромосом, в том числе i, ш ш пары.

Несмотря на то, нто изучение С-гвтврохро&атина хромосом ведется на протяжений лет, до сих пор не втаработано единого унифицированного способа для определения его размеров. Одних только

— 'J «-

полу КОЛЙЧеОТВеННИХ методов известно более ПЯТИ ( Madan , Bobrov ,

I Patil , Lubs , Ш?Ь I Verma et al . , } ЦВ0ТКОВ8 ,

якова, ВШ). ?последние основана на вычислении соотношения длин блока С-гетерохро^атина исследуемое хромосош и плеч отдельна! хромосом с последующей оценкой по - !>-тг бальной системе •

Г'ри этом, крупные блоки оцениваются в баллов, а шшииалыгаз в i балл. Наиболее то«я> йрздставляетоя метод учета О-рзтерохро-

манна, разработан»®! под руководством А л Д;рокофьвво-Вельг0вской Система учета размеров гетерохроматических участков хромосом i, 9, 1Х> и У" (а^ЗЛз которш ¿федусмотрено определение соотношения »еягду длино "'-сегментов ж коротких и длинны-; плеч хромосом £, Р, & И. у.

Разработан» к количественные методы измерения О-гетерохро-штша различных хромосом (ЛвлЯкова И др., ВТ? $ Balieek et al

\ У ГО ты К -'ОЧи •• ' 5 Brown et al . , ШО J

Казаренко ; , ' >\ Jh.: на м точны, ко также не поззол?*-

шт объективно оценить величину c-сегшнтов на хромосомах 16 и >г. Трудности з жх использовании заключаются в той, что хромосома в