Анализ молекулярно-генетических нарушений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований почки

Михайленко, Дмитрий Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ молекулярно-генетических нарушений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований почки
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ молекулярно-генетических нарушений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований почки"

МИХАЙЛЕНКО Дмитрий Сергеевич

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ

03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003450033

Работа выполнена в лаборатории эпигенетики Государственного учреждения Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор Мякоткин Валерий Андреевич доктор медицинских наук, профессор Шахтарин Владимир Васильевич

Ведущая организация: НИИ канцерогенеза Государственного учреждения Российский онкологический научный центр им НН БлохинаРАМН

Защита состоится « (-£■<> (-{ ОД 2008 г в / V часов на заседании

Диссертационного Совета Д 001 016 01 в ГУ МГНЦ РАМН по адресу 115478, г Москва, ул Москворечье, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ МГ1Щ РАМН

Автореферат разослан«^» 0!/■! ¡У

2008 г

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 001 016 01, доктор медицинских наук

Зинченко Р.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Ежегодно в мире регистрируют около 200 тыс новых случаев рака ночки и почти 100 тыс смертей от этого заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурочогии В России диагностируют до 9 тыс случаев опухолен почки в год, более 90% которых приходятся на ночечно-клеточные карциномы - рак почки (РП) По темпам прироста заболеваемости РП уступает только новообразованиям предстательной и щитовидной желез [Алексеев Б Я, 2007]

В настоящее время диагностика п прогноз РП основываются на данных инструментальных методов исследования и патоморфологических критериях, что далеко не всегда позволяет правильно оцепить прогноз заболевания и возможности лечения [Ym-Goen Q , 2006] Это обусловливает необходимость создания эффективных тест-систем для проведения своевременной лабораторной диагностики, мониторинга и определения прогноза течения РП Необходимым этапом создания системы маркеров РП является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетичсских нарушений в первичных опухолях почки В качестве таких повреждении генома опухолевых клеток могут выступать мутации, потеря гетерозиготности и аберрантное метилирование ряда генов-супрессоров

Ген VHL инакгивируется в большинстве случаев самого распространенного морфологического типа РП - светлокяеточного рака почки (СРП) вследствие соматических мутаций, метилирования промотора и потери гетерозиготности [Banks R Е , 2006] Также при СРП выявляют аллельпые делеции других генов-супрессоров Вопрос о влиянии мутаций и метилирования VHL и делеций генов-супрессоров в области Зр (VIIL, RASSF1, FHIT) на прогрессию первичной опухоли и прогноз заболевания остается открытым Идентифицирован ряд 1енов-супрессоров, аберрантное метилирование которых наб "подается в различных морфологических типах опухолей [Lovisolo J А, 2006] Анализ наиболее часто метилируемых генов будет способствовать созданию системы диагностических и прогностических маркеров РП

Опубликованы данные об нссчедованиях полиморфизмов различных генов при РП [Karami S, 2008] Некоторые полиморфизмы могут представлять

\ (

интерес как потенциальные маркеры предрасположенности к спорадическому РП в популяции европейской части России или влиять на течение заболевания

РП практически не чувствителен к лучевой и химиотерапии, поэтому хирургическое удаление опухоли является основным методом лечения РП Определенные успехи связаны с внедрением в практику таргетных препаратов, механизм действия которых напрямую связан с генетическими нарушениями в опухолевых клетках [Costa L J, 2007] В связи с этим вопрос о лечении метастатического РП и местнораспросграненных форм заболевания требует максимально точной оценки прогноза развития первичной опухоли, знания ее особенностей на молекулярно-генетическом уровне

Таким образом, комплексное исследование соматических мутаций, потери гетерозиготности, метилирования 5'-регуляторных областей генов-супрессоров и полиморфных вариантов генов, задействованных в развитии РП, будет способствовать формированию системы новых молекулярно-генетических маркеров РП

Целью исследования является комплексный молекулярно-генетический анализ при РП, направленный на выявление и характеристику диагностических и прогностических маркеров заболевания Задачи исследования

1 Изучить мутации, аллельные делеции и метилирование промотора гена VHL и провести сравнительный анализ выявленных изменений относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания

2 Провести анализ потери гетерозиготности областей локализации генов VHL, RASSFI, FHJT и ТР53 в парных образцах РП на различных стадиях заболевания и степенях дифференцировки первичной опухоли

3 Оценить частоты аберрантного метилирования генов-супрессоров VHL, RASSFI, FHIT, SFRP1 и CDH1 в образцах РП и провести сравнительный анализ метилирования этих генов относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания

4 Исследовать метилирование CpG-динуклеотидов в промоторной области 1сна НОХВ13, построить карту аберрантного метилирования этого гена.

5 Определить частоты апечей и генотипов полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBRl, ILIO, VDR в норме и у больных РП Провесги сравнительный анализ полученных данных между группами пациентов и контроля, а также между различными клиническими группами больных РП

Научная новизна Идентифицированы 33 новые мутации в гене VHL Впервые исследованы сочетанные детеции генов VHL, Rj[SSF1, FHIT и ТР53 при СРП Изучено метилирование 5'-рсгуляторных областей генов VHL, RASSF1, РНГГ, SFRP1 и CDH1 с помощью мультитюкуснои мстилчувствительнои ПЦР Впервые показана ассоциация аберрантною метилирования RASSFJ с прогрессией первичной опухоли на ранних стадиях РП (Р = 0 047) С помощью бисульфитпого секвенирования построена карта метилирования промотора гена-кандидата НОХВ13 в первичных опухолях почки С помощью нового метода - минисеквенирования с детекцией в режиме фрагментного анализа - изучены полиморфные варианты генов АВСВ1, TGFBRl, ILIO и VDR Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP генов ILIO и TGFBRl, получены данные о возможном влиянии полиморфизмов в генах VDR и TGFBRl на развитие опухолей почки

Практическая значимость Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 127 первичных опухолей почки (светлоклеточных, папиллярных и хромофобиых карцином) Оптимизирован метод комплексной оценки молекулярно-генетических нарушений VHL (соматических мутаций, аберрантного метилирования и потери гетерозиготности) при CPII Выявлена высокая частота повреждении гена VHL при СРП Разработаны системы из двух STR-маркеров для тестирования аллельных делеций в областях локализации генов VHL, RASSFI, FHIT и ТР53 при РП Определена ассоциация множественных аллельных делеций генов-супрессоров на Зр (Р = 0 036), а также метилирования генов RASSF1 и CDH1 с клинико-морфологическими характеристиками опухоли (Р = 0 001), что позволит использовать анализ этих генов в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях РП Рсзз'льтаты, полученные в представленной работе, могут быть использованы в разработке

системы молекулярно-генетических маркеров РП, в частности, определение мутаций и метилирования гена УНЬ - при оптимизации таргетной терапии Положения, выносимые на защиту

1 Мутации, потеря гетерозиготности и/или метилирование гена УНЬ происходят на ранних стадиях СРП в большинстве случаев заболевания

2 Потеря гетерозиготности двух и более гепов-супрессоров, локализованных в области Зр, отражает прогрессию первичной опухоли

3 Аберрантное метилирование является существенным механизмом инактивации генов-супрессоров УНЬ, КАБЗР!, РН1Т БРНР!, СОН1 и наблюдается в 85% первичных почечно-клсточных карцином Построена карта метилирования промотора гена-кандидата НОХВ13 при спорадическом РП

4 Метилирование генов ИЛ55П и СОН! ассоциировано с прогрессией и метастазированием первичной опухочи, соответственно, что позволяет рассматривать их как составную часть системы молекулярных маркеров РП

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации Все эксперименты и методики были разработаны и проведены автором лично Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно

Апробация работы Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007-2008 гг, на конгрессах Российского общества онкоурологов в 2006-2007 гг , на Российском онкологическом конгрессе в 2007 г, конференции «Генетика в России и в мире» в 2006 г, конференции по биологии и генетике в 2007 г, конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 г, а также на межлабораторных семинарах ГУ МГНЦ РАМН Прочитана лекция на кафедре генетики Факультета усовершенствования врачей Российского государственного медицинского университета Росздрава

Публикации Результаты диссертационной работы отражены в 14 печатных работах соискателя, в том числе, 6 статей опубликовано в журналах.

рекомендованных ВАК МОП 1'Ф соискателям ученой степени кандидата медицинских наук

Внсдрсипс результатов работы в клиническую практику. На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДШС-техпологии «Молекудярно-генстичсская методика оценки прогрессии первичнои опухоли при светлооеточном раке почки» и «Молекулярно-генетическая методика оптимизации таргетной терапии при светлоклеточиом раке почки» (Разрешения на применение новой медицинской технологии ФС № 2008/150 от 22 07 2008 и ФС № 2008/152 от 23 07 2008, соответственно) Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в Межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики ГОУ ВПО ММА им ИМ Сеченова анализ терминальных мутаций в гене УИЬ при диагностики синдрома Хиппеля-Линдау, определение аллельных делеций геиов-супрессорог, в области Зр при спорадическом РП

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Образцы опухолей почки предоставлены Уролопгческой клиникой им РМ Фронштейна ГОУ ВПО ММА им ИМ Сеченова, ГУ МРНЦ РАМН и ФГУ МНИОИ им ПА Герцена (всего 127 образцов РП) Все случаи РП классифицированы по ТИМ согласно требованиям Международного противоракового союза (1ЛСС, версия 1997 г) Из них 53% (67/127) соответствовали I стадии заболевания, 12% (15/127) - И, 21% (27/127) - III и 14% (18/127) - IV На момент постановки диагноза 17% (21/127) пациентов в изучаемой выборке имечи метастазы в регионарных лимфатических узлах и/или отдаленные метастазы

Геномную ДНК из замороженных образцов опухолей и соответствующих им участков гистологически не измененной ткани выделяли с

помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией Архивные образцы опухолей, заключенные в парафиновые блоки, предварительно депарафинизировали с помощью ксилола и этанола.

Мутации VHL выявляли с помощью ПДР экзонов 1-3, SSCP-анализа ПЦР-продуктов и последующего секвенирования При анализе ДНК, полученной из парафиновых блоков, амплифицировали З'-часть 1-го экзона.

Для анализа потери гетерозиготности (ПГ) генов VHL, RASSFJ, FHIT и ТР53 была разработана оригинальная система из STR-маркеров (по два микросателлитных локуса на каждый ген) D3S1317 и D3S1038 (VHL), D3S1568 и D3S966 (RASSFl), D3S1234 и D3S1300 (FHIT), D17S1353 и IVS1 (ТР53) Проводили ПЦР вариабельных локусов, затем ПЦР-продукты разделяли в 10% денатурирующем ПААГ (IVS1-TP53 - в 8% ПААГ)

Метилирование генов VHL, RASSFl, FHIT, SFRP1 и CDH1 определяли с помощью метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР) Дизайн праймеров осуществлен в настоящем исследовании с помощью программ PerlPnraer и Vector NTI Предварительно проводили обработку геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой BstHHI («СибЭнзим», Новосибирск)

При подготовке к бисульфитному секвенированию геномную ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, который вызывает переход неметилированных остатков цитозина в урацил, но не изменяет метилированные цитозины Дизайн метилспецифических праймеров был выполнен с помощью интерактивной программы MethPnmer (http //www urogene org/methpnmer/)

ПЦР-продукты, предназначенные для секвенирования, подвергали электрофорезу в 1%-ом агарозном геле, затем эллюировали с помощью колонок Quantum Prep® Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns («Bio-Rad Laboratories») Секвенирование проводили с использованием BigDye® Terminator v 3 1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI3100 в соответствиями с протоколами фирмы «Applied Biosystems»

Mj льтилокусную ПЦР полиморфизмов АВСВ1, TGFBR1, ILIO, VDR проводили с использованием праймеров, фланкирующих исследуемые SNP в каждом из генов (методика разработана в ходе настоящей работы) Не вошедшие в реакцию праимеры и dNTP инактивировали экзонуклеазой 1 из

Ecoli и щелочной фосфатазой ("Fermentas", Литва) Далее к ПЦР-продуктам добавляли внутренние праймеры для каждого SNP и проводили реакцию с использованием ABI Prism® SNaPshot™ Multiplex Kit ("Applied Biosystems"), затем проводили обработку продуктов реакции щелочной фосфатазой Детекцию проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 ("Applied Biosystems")

Статистический анализ частот аллелей и генотипов полиморфизмов, метилирования и ПГ проводили с помощью точного двустороннего критерия Фишера Комплексный анализ встречаемости генетических нарушений в нескольких группах осуществляли при использовании критерия -¿

Программное обеспечение для секвенированных последовательностей Sequencing Analysis v 51 ("Applied Biosystems"), Chromas v2 31 Анализ мутаций сплайсинга осуществляли с помощью программы, доступной на сайте http //www fruitfly org/seq_tools/spl i ce html При сравнении выявленных мутаций с уже известными мутациями использовали интерактивные базы данных UMD (http //www umd be 2020/) и HGMD (http //www hgmd cf ac uk/ac/index php) Сравнительный анализ выявленных генетических изменений в различных группах пациентов проводили с помощью программы GraphPadlnStat v 3 05 и STATISTICA v 6 0

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение инактивации гена VHL пни спорадическом раке почки

Инактивация гена VHL вследствие молекулярно-генетических нарушений выявляется в большинстве светлоклеточных карцином почки, при этом влияние инактивирующих событий на развитие опухоли неоднозначно В настоящей работе определяли мутации (рис 1), аллельные делеции и метилирование как причины инактивации VHL Мутации VHL были определены в 31 7% (39/123) СРП Все выявленные мутации соматические, что, наряду с клиническими данными, позволило исключить синдром Хиппеля-Линдау и рассматривать имеющиеся образцы как выборку спорадического СРП Среди мутаций 69 2% (27/39) составляли делеции, протяженность которых варьировала от 1 до 42 п н , 18 0% (6/39) - инсерции, дупликации и комплексная мутация, оставшиеся 12 8% (5/39) приходятся на однонуклеотидные замены Впервые идентифицированные мутации определены в 84 6% (33/39) образцов СРП

Большинство делений и инсерций, а также дупликации и комплексная мутация, составляющие 56.4% (22/39), приводили к сдвигу рамки считывания и формированию новых стоп-кодонов.

' ' от рс^ ж

30 Г С С Т Т Т Т ? С С С С Т Т С С А А | 1J.Hl С Т в Т А Т А. С': ш К Т С к. А т 1 60 70 " I? с с л г в с с т с с а е о т т ёш

Рисунок 1. Определение мутации С.472С—»в. Вверху - результат 55СР-анализа экзона 3 гена УНЬ (Ы и Т - нормальная и опухолевая ткани, соответственно), ПЦР-продукт с аномальной подвижностью в образце 5Т; секвенирование ПЦР-продукта 5Т с обратного праймера, идентификация мутации.

Аллельные делеции УНЬ при СРП определяли по вТЯ-маркерам 0381317 и 0351038. Проанализированы 94 образца замороженных тканей опухолей и соответствующих им образцов нормальной почечной паренхимы, взятых на расстоянии не менее 1.5 см от края новообразования. Информативность используемых микросателлитных локусов составила 47.9% (45/94) для 0351317 и 77.7% (73/94) - для 0351038. Система из двух 5ТЯ-маркеров позволяла определять аллельные делеции в 91.5% (86/94) случаев. ПГ обнаружена в 27.9% (24/86) информативных образцов СРП.

Метилирование промотора УНЬ исследовали с помощью МЧ-ПЦР (рис. 2). Исследовали 94 парных образца тканей опухолей и почечной паренхимы, а также 29 парафиновых блоков с архивными образцами СРП (всего 123 опухоли). Метилирование промотора гена определено только в образцах СРП и не выявлено в гистологически нормальной ткани. Частота аберрантного метилирования составила 14.6% (18/123) выборки СРП.

М ОК ПК 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

331 уш

242 ШШ

- « »мм

190 \rnmJ

Ь'Е I

шШШШтшк

Рисунок 2. Анализ метилирования УН и М - маркер молекулярной массы (рЬ'С 19/М^р1. размеры фрагментов в п.н. указаны слева), ОК - отрицательный контроль амплификации, ПК - положительный контроль амплификации. К+ - внутренний контроль ПЦР (экзон 2 гена УИС), МЕТ - анализируемый участок промотора 17УЛ, 1-12 - анализируемые образцы опухолей. Аберрантное метилирование выявлено в образцах 5 и 10.

Сопоставлены участки СрС-островка. анализируемого в представленной работе и у других авторов. Показано, что все праймеры для метилспецифической ПЦР (МС-ПЦР) в других исследованиях локализованы внутри участка, изученного в настоящей работе. Один из праймеров всегда содержал СрО-динуклеотиды в позициях -162, -164 и -168, два из которых (-162 и -168) входят в сайты узнавания метилчувствительной рестриктазы ВэШШ. Методом МС-ПЦР изучали метилирование 8 остатков цитозина в области с,-24_-168. В настоящей работе проведен анализ метилирования с помощью МЧ-ТТЦР семи Срв-динуклеотидов на том же участке. Таким образом, МЧ- и МС-ПЦР могут служить альтернативными методами определения метилирования промотора УНЬ.

У больных на I стадии СРП соматические мутации в гене УНЬ выявлены в 35.4% (23/65) случаев, ПГ - в 28.2% (11/39) информативных случаев и аберрантное метилирование - в 20.0% (13/65) образцов. В целом, хотя бы одно из нарушений гена УНЬ обнаружено у 53.8% (35/65) больных с I стадией заболевания, что свидетельствует в пользу инактивации УНЬ на ранних стадиях СРП.

Следует отметить, что инактивация УНЬ влияет не только на развитие первичной опухоли, но и может определять тактику лечения СРП. В последние 3 года в лечении метастатического СРП произошли существенные изменения, и в настоящее время это заболевание можно считать одним из наиболее удачных

примеров применения таргетных препаратов. Эти препараты представляют собой ингибиторы определенных тирозинкиназ или факторов роста, которые взаимодействуют лишь с определенными молекулами, играющими ключевую роль в развитии РП. Наиболее эффективные из них - Сутент и Нексавар, ключевые мишени которых (УБвРЯ 1-го и 2-го типов, РОвРК) гиперэкслрессируются в ответ на инактивацию УНЬ. Следовательно, СРП, несущий молекулярно-генетические нарушения УНЬ, может представлять собой наиболее оптимальный случай для терапии одним из этих препаратов. Выдвинутое предположение нашло подтверждение в первом исследовании, показавшем более выраженный эффект применения Сутента у пациентов с соматическими мутациями УНЬ, чем у пациентов без мутаций [Личиницер М.Р., 2007].

Таким образом, соматические мутации. ПГ и аберрантное метилирование промотора УНЬ могут рассматриваться как перспективные маркеры СРП. Указанные молекулярно-генетические нарушения присутствуют в первичной опухоли на ранних стадиях заболевания и влияют на чувствительность опухоли к таргетным препаратам.

Исследование аллельных делений генов УМ., ЯА55Р1, РН1Т и ТР53

Помимо УЖ, для СРП характерны аллельные делеции других генов-супрессоров, которые могут оказывать влияние на развитие злокачественного новообразования. Для определения прогностической значимости аллельных делеций в настоящем исследовании определена ПГ областей локализации генов УНЬ, ЯАЯЗР!, ет//7"(гены-супрессоры в области Зр) и ТР53 (рис. 3).

А 1Т Ш 2Т 2Ы ЗТ ЗЫ В 4Ы 4Т 5Н 5Т 6Ы 6Т

Рисунок 3. Выявление ПГ. А - результат электрофореза в 8% ПААГ пентануклеотидного повтора 1У51 гена ТР53 (Т и N - опухолевая и нормальная ткани, соответственно). 1 -гомозигота, 2 - ПГ в опухолевой ткани, 3 - нормальная гетерозигота; В - результат денатурирующего электрофореза в ПААГ микросателлита 0351568 (образцы нанесены на гель в обратном порядке), 4 - гомозигота, 5 - ПГ в опухолевой ткани (область гена 6 - нормальная гетерозигота.

Информативность STR-локуса D3S1568 составила 58 5% (55/94), D3S966 -62 8% (59/94), D3S1300 - 67 0% (63/94), D3S1234 - 85 1% (80/94), D17S1353 -67 0% (63/94) и IVS1 - 617% (58/94), информативность и характеристики систем из двух STR-маркеров для VHL указаны в предыдущем разделе Системы из двух вариабельных локусов позволяли определять ПГ гена RASSF1 в 85 1 % (80/94), FHIT - 95 7% (90/94) и ТР53 - 89 4% (84/94) случаев

ПГ гена RASSFI обнаружена в 27 5% (22/80), FHIT- 35 6% (32/90), ТР53 -17 9% (15/84) и, как упоминалось ранее, VHL - 27 9% (24/86) информативных образцов СРП Аллельные делеции хотя бы одного гена на Зр наблюдали в 56 4% (53/94), а в совокупности из четырех исследованных генов - в 606% (57/94) информативных случаев

N = 94 RASSF1 (N* = 80) FHIT (N* = 90) ТР53 (N* = 84) > 2 гена на Зр (N• = 91)

частота Р частота Р частота Р частота Р

S[ и 21 3% (10/47) 0 203 30 2% (16/53) 0 264 18 0% (9/50) 0999 14 8% (8/54) 0 116

Siniv 36 4% (12/33) 43 2% (16/37) 17 6% (6/34) 29 7% (11/37)

G,2 23 6% (13/55) 0 287 34 4% (21/61) 0815 16 4% (9/55) 0 766 16 4% (10/61) 0 172

Oi-; 36 0% (9/25) 37 9% (11/29) 20 7% (6/29) 30 0% (9/30)

T,2 22 9% (11/48) 0311 30 9% (17/55) 0267 17 6% (9/51) 0 999 16 1% (9/56) 0 189

Т» 34 4% (11/32) 42 9% (15/35) 18 2% (6/33) 28 6% (10/35)

T.NoMo 24 2% (16/66) 0 192 315% (23/73) 0158 18 6% (13/70) 0 999 16 0% (12/75) 0 036

N и/или М полож 42 9% (6/14) 52 9% (9/17) 14 3% (2/14) 438% (7/16)

Таблица 1 ПГ генов-супрессоров в различных клинических группах (результаты по 17//. приведены в тексте ранее) N - объем выборки СРП, Ы* - количество информативных случаев для каждого из исследуемых генов, Б - стадия заболевания, С - степень дифференцировки первичной опухоли, Т - размер первичной опухоли по ТК'М-классификации, N - метастазы в регионарных лимфоузлах, М - отдаленные метастазы

Выяблена ассоциация аллельных делеций по двум и более генам-супрессорам, локализованным на коротком плече хромосомы 3, с наличием метастазов на момент постановки диагноза: Р = 0.036, (Ж = 1.49 (95% С1: 1.012.33). Можно предположить, что ПГ нескольких генов-супрессоров на Зр связана с опухолевой прогрессией, в отличие от аллельных делеций одного из исследованных генов в области Зр или гена ТР53 (табл. 1).

Следует отметить, что в последнее время много внимания уделяют комплексным исследованиям аллельного дисбаланса (ПГ и амплификации), экспрессионному профилю генов в зонах аллельного дисбаланса и соотнесению выявленных изменений с клинико-патологическими характеристиками опухоли. Выявленная в настоящей работе ассоциация множественных аллельных делеций с метастазированием первичной опухоли может быть учтена при выборе прогностических критериев спорадического СРП. Изучение метилирования генов-супрессоров УН1„ RЛSSI•'i, ПНГ. и

СРН1 в опухолях почки В настоящем исследовании изучено метилирование 5'-регуляторных областей генов-супрессоров, локализованных в области Зр (УНЬ, КАХХГ/ и №/7), а также генов и С£>#/. Метилирование определено МЧ-ПЦР

(рис. 3). Исследованы 98 парных образцов светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином, 29 парафиновых блоков СРП. В образцах гистологически не измененной почечной парнехимы гиперметилирование генов-супрессоров не выявлено.

М ОК ПК 1КГ ХТ 2КГ 2Т ЗЫ ЗТ

К-+- >. I I , » - - • • -

пит»«* ¡е.-«.»

1§ИР* ■«. .. .

Рисунок 3. Определение метилирования генов-супрессоров (на примере РШТ). М - маркер молекулярной массы (риС19/М$р1), ОК - отрицательный контроль амплификации, ПК -положительный контроль амплификации, К+ - внутренний контроль ПЦР, N и Т -нормальная и опухолевая ткани соответственно, 1-3 - анализируемые образцы. Аберрантное метилирование выявлено в образцах опухолей 1 и 2.

В опухолях аберрантное метилирование VHL определено в 14 2% (18/127), RASSF1 - 52 8% (67/127), FHIT - 54 3% (69/127), SFRP1 - 33 1% (42/127) и CDH1 - 41 7% (53/127) случаев Результаты, полученные методом МЧ-ПЦР, подтверждены бисульфитным секвенированием гиперметилированных образцов В более редких, чем СРП, типах РП были метилированы гены RASSF1 - в 1 из 2 папиллярных карцином, FHIT-в 1 из 2 папиллярных и в 1 из 2 хромофобных карцином Метилирование двух указанных генов можно рассматривать как распространенное событие в канцерогенезе опухолей почки

В настоящем исследовании наблюдаемая частота метилирования гена SFRP1 отличалась от данных, опубликованных ранее (33% против 68%) [Dahl Е , 2007] Это может быть объяснено различными методическими подходами в анализе CpG-островка и репрезентативностью выборок (123 светлоклеточных карциномы в настоящем исследовании и 38 - у других авторов) Частота метилирования другого исследованного в этой работе гена - CDH1 - близка к данным литературы [Costa V L , 2007] Проведен сравнительный анализ частот метилирования в парных клинических группах в зависимости от стадии заболевания, степени дифференцировки первичной опухоли и метастазирования (табл 2) Показана ассоциация метилирования CDH1 с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0 024, OR = 2 40 95% CI 1 13-5 08) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0 001, OR = 5 98 95% CI 2 03-17 59) Продукт гена CDH1, Е-кадгерин, участвует в обеспечении контактного торможения пролиферации в эпителиальных тканях, в том числе, в эпителии почечных канальцев Инактивацию гена CDH1 вследствие метилирования можно рассматривать как событие, способствующее инвазивному росту и метастазированию первичной опухоли Анализ аберрантного метилирования CDH1 на сегодняшний день представляется одним из перспективных прогностических маркеров РП, чему соответствуют результаты настоящего исследования

Помимо молекулярно-генетических изменений, характеризующих инвазию и метастазирование, не меньший интерес вызывают потенциальные маркеры прогрессии опухоли, которые могут быть выявлены на ранних стадиях заболевания В работе выбраны гены-кандидаты с наибольшей абсолютной частотой метилирования (>40 образцов) на ранних стадиях РП - гены RASSF1 и

РН1Т Показано, что метилирование Л455И чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0 047, (Ж = 2 58, 95% С1 104-6 35) Можно предположить, что метилирование УНЬ, ЯА55Р], РН1Т и 5РЯР1 встречается в значительной доле случаев РП уже на первой стадии, тогда как с прогрессией первичной опухоли ассоциировано аберрантное метилирование которое может считаться потенциальным

неблагоприятным маркером на ранних стадиях РП

Ген Si И Sin iv 82 45 Ps Cl 2 . GM 89 38 Pc T, 2 Tm 84 43 Рт M- M+ 106 21 Рм

VHL 14 4 0289 14 4 0 582 15 3 0113 16 2 0 735

RASSF1 38 29 0 064 45 22 0 561 41 26 0 261 52 15 0 093

FHIT 46 23 0710 47 22 0 698 47 22 0707 55 14 0 240

SFRP1 22 20 0051 25 17 0 100 23 19 0073 32 10 0 134

CDH1 29 24 0061 33 20 0 119 29 24 0 024 37 16 0 001

Таблица 2 Метилирование генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в парных клинических группах (указаны абсолютные частоты нарушений в каждой из групп) S - стадии заболевания, G - степень дифференцировки первичной опухоли, Т - размер первичной опухоли по TNM-классификации, М - метастазы в регионарных лимфатических узлах и/или отдаленные метастазы (рядом указано количество случаев в каждой из групп) Ps Рс Рт Рм -вероятности нулевой гипотезы при сравнении соответствующих парных групп

Несмотря на то, что у большинства пациентов РП выявляют на стадии локализованного опухолевого процесса, в 20% случаев заболевание характеризуется как местнораспространенное Основной метод лечения локализованного РП - хирургический, который может дополняться адьювантной неспецифической иммунотерапией препаратами ИЛ-2 и ИФН-а в случае местнораспространенного СРП с учетом соматического статуса пациента, в связи с чем особенно актуальным вопросом является оценка прогрессии первичной опухоли [Wood С G , 2007] Можно предположить, что исследование ПГ генов VHL, RASSF1, FHIT, и метилирования гена CDH1 может быть использовано вместе с другими необходимыми тестами при назначении

адьювантной иммунотерапии после удаления первичной опухоли при местнораспространенном СРП

В настоящее время анализ метилирования становится особенно актуальным в связи с поиском маркеров РП, выявляемых в биологических жидкостях пациента Фрагменты ДНК опухолевых клеток попадают в кровоток, и аберрантное метилирование, специфичное для опухоли, может быть выявлено с помощью ПЦР в плазме (сыворотке) крови Также описаны успешные примеры обнаружения аберрантного метилирования генов-супрессоров в моче пациентов Однако применяемые методологические подходы нуждаются в повышении диагностической и аналитической чувствительности, а панели тестируемых генов - в пополнении новыми генами-кандидатами Частота аберрантного метилирования исследованных в настоящей работе генов вариьровала от 14 2 до 54 3% Метилирование как минимум одного из исследованных генов обнаружено в 85 0% (108/127) образцов При объединении генов УНЬ, НЛЗЗРР РЫТ, $РРР1 и СОН], изученных в настоящей работе, с такими генами как СЖША, НАРВ2, РТСБ2, СТЫЫВ1, представляется возможным сформировать систему маркеров метилирования с чувствительностью более 95% Это будет способствовать развитию неинвазивной высокоинформативной диагностики РП

Метилирование гена НОХВ13 при спорадическом раке почки

Среди новых генов-супрессоров, которые могут быть метилированы при РП, привлекает внимание ген НОХВ13, участвующий в развитии и дифференцировке органов мочеполовой системы [Оки(1а Н , 2006] В настоящей работе проведено бисульфитное секвенирование промотора гена НОХВ13 в 5 образцах СРП и соответствующих им образцах гистологически не измененной ткани (рис 4)

Показано, что в опухолях подвергаются аберрантному гиперметилированию цитозины в составе СрО-динуклеотидов, преимущественно, в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона АТв Можно предположить, что анализ этих четырех СрО-динуклеотидов позволит достоверно оценивать метилирование промотора НОХВ13 в опухолях почки

метилированных цитозинов, указаны стрелками).

Анализ полиморфных вариантов генов АВСИ1, ТОРКИК11,10 ц УРЯ

Предрасположенность к РП может быть обусловлена аллельными вариантами ряда генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, метаболизме ксенобиотиков и противоопухолевом иммунитете. Для настоящего исследования предрасположенности к РП были выбраны БЫР в четырех генах -АВСВ1 (С3435Т), ТвРВШ (т17С24А), 1Ь10 (0-Ю82А) и УйЯ (ТаЧ1). Сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах контроля и больных РП, а также в различных клинических группах пациентов, в том числе, в многофакгорном анализе. Полиморфизмы анализировали с помощью минисеквенирования (рис. 5).

- и А. А, _ Л,_Аа. .....

JLA^ i _______jAJ^L._____

_-__JMls.___

IX2Ü ЛВС-!) J V. * П--71,

О /•. (Z Т >~ <3 J\

Рисунок 5. Определение полиморфизмов в генах АВСВ1, TGFBR1, ILIO и VDR методом минисеквенирования. Показаны три образца, позиции аллелей обозначены внизу. Генотипы АВСВI-TGFBR1-IL10-VDR: 1 (TC-GA-AG-TC), 2 (TC-GG-AG-CC), 3 (TC-GA-AA-TC).

В качестве популяционпого контроля исследовали 151 образец ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови здоровых индивидуумов Выборка пациентов с РП составила 98 человек, исследовали ДНК, выделенную из участков нормальной почечной паренхимы Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP гена TGFBR1 56% (G/G), 40% (G/A) и 4% (А/А), IL.10 51% (A/G), 32% (А/А) и 17% (G/G)

Генотип Si ii Sin iv 59 39 Ps Gl 2 С34 66 32 Pc М- м+ 83 15 Рм

АВСВ1-ТС 27 23 0 360 Т 0 999 С 0 196 36 14 0 338 Т 0 768 С 0 174 43 7 0 852 Т 0 999 С 0 567

AB СВ1-TT 23 10 19 14 27 6

АВСВ1-СС 9 6 11 4 13 2

TGFBR1-GG 34 30 0 086 G 0 999 А 0 055 39 25 0115 G 0 300 А 0 074 50 14 0 046 G 0 999 А 0 016

TGFBR1-GA 23 7 23 7 29 1

TGFBR1-AA 2 2 4 0 4 0

IL10-AG 28 19 0 427 А 0317 G 0 379 32 15 0 474 А 0 299 G 0 487 37 10 0 204 А 0 180 G 0 999

IL10-AA 16 14 22 8 26 4

IL10-GG 15 6 12 9 20 1

VDR-TT 22 15 0 945 Т 0 999 С 0 999 24 13 0 537 Т 0 389 С 0 825 30 7 0718 Т 0 999 С 0 564

VDR-TC 33 22 39 16 48 7

VDR-CC 4 2 3 3 5 1

Таблица 3 Полиморфные варианты генов АВСВ1, TGFBR1, ILIO и VDR в различных клинических группах Обозначения S - стадии заболевания, G — степень дифференцировки первичной опухоли, М - метастазы (рядом указано количество случаев в каждой из групп) Ps Pg Рм - вероятности нулевой гипотезы при сравнении соответствующих парных групп, в ячейках сверху указана Р при сравнении частот генотипов, ниже - Р при сравнении частот встречаемости определенных аллелей

Выявлены достоверные различия частот генотипов VDR при РП относительно контроля (Р = 0 025) В группе РП наблюдалась тенденция к увеличению частоты встречаемости аллеля Т и снижению - аллеля С (генотипа

С/С - почти в 1 85 раза) Возможно, снижение частоты протективного аллеля С и/или генотипа С/С связано с предрасположенностью к развитию РП в исследуемой популяции Недавно опубликованы данные, подтверждающие протективную роль аллеля С в популяциях центральной и восточной Европы при наличии фактора риска - онкологических заболеваний у родственников [Karami S , 2008] Показано, что частота аллеля А гена TGFBR1 снижена у пациентов с регионарными и/или отдаленными метастазами Р = 0 012, OR = 0 804 (95% CI 0 724-0 893) Достоверно уменьшена в группе больных с метастазами и частота встречаемости этого аллеля в составе гомо- и гетерозиготных носителей (табл 3) Полученные результаты способствуют формированию системы прогностических маркеров для спорадического РП

Настоящая работа представляет собой комплексное исследование инактивации гена VHL, ПГ генов VHL, RASSn, FHTT и ТР53, аберрантного метилирования генов VHL, RASSFI, FHIT, SFRP1, CDHI и HOXBI3, а также полиморфизмов в генах АВСВ1, TGFBR1, ILIO и VDR при РП Проведен сравнительный анализ выявленных в первичных опухолях молекулярно-генетических нарушений между группами пациентов, которые были сформированы в зависимости от стадии заболевания, наличия метастазов, степени дифференцировки первичной опухоли Нарушения в гене VHL выявлены у 54% пациентов на I стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании Следует отметить, что определение мутаций и метилирования VHL целесообразно использовать при оптимизации таргетной терапии у больных метастатическим СРП Получены результаты, указывающие на возможность использования метилирования CDH1 и ПГ генов-супрессоров на Зр в качестве прогностических маркеров спорадического РП Построена карта метилирования нового гена-супрессора HOXBI3 Выявлена ассоциация полиморфных вариантов VDR и TGFBR1 с развитием заболевания

Поиск и характеристика молекулярно-генетических маркеров, выполненные в настоящем исследовании, вместе с изучением потенциальных иммуногистохимических и биохимических особенностей почечно-клеточных карцином, позволят сформировать систему диагностических и прогностических маркеров РП На сегодняшний день, проведение молекулярно-генетических

исследований, направленных на поиск маркеров злокачественных новообразований, представтяет собой одну из приоритетных задач молекулярной медицины

ВЫВОДЫ

1 Соматические мутации, потеря гетерозиготности и метилирование гена VHL выявлены у 54% пациентов на первой стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании Впервые идентифицированы 33 новые мутации VHL

2 Аллечьные делеции двух и более генов-супрессоров (VHL, RASSF1, FH1T), локализованных на коротком плече хромосомы 3, ассоциированы с наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0 036), что может отражать прогрессию первичной опухоли

3 Аберрантное метилирование 5'-регуляториых областей гена VHL составляет 14%, RASSF1 - 53%, FH1T- 54%, SFRPJ - 33% и CDH1 - 42% случаев РП Метилирование хотя бы одного из исследованных генов происходит в 85% случаев рака почки Метилирование CDHI ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0 024) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0 001), Метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = О 047) Метилирование RASSF1 и CDH1 может служить в качестве неблагоприятного прогностического маркера на различных стадиях РП

4 Построена карта метилирования CpG-островка гена НОХВ13 при СРП Аберрантному метилированию, преимущественно, подвер1аются цитозины в позициях -139, -160 -176 и -178 от стартового кодона ATG, что может быть использовано при определении частоты метилирования HOXBI3 в опухолях почки

5 Частоты генотипов исследуемых SNP гена TGFBR] в норме составляют 56% (G/G), 40% (G/A) и 4% (А/А), ILIO - 51% (A/G), 32% (А/А) и 17% (G/G) Частоты генотипов VDR при РП достоверно отличаются от контроля (Р = 0 025) У больных РП с метастазами уменьшена частота встречаемости аллеля А гена TGFBRI (Р = 0 016)

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В настоящей работе получены данные об инактивации гена УИЬ на различных стадиях рака почки, выявлены ассоциации множественных аллельных делеций генов-супрессоров в области Зр и метилирования генов ЯАЗБР! и СОН] с прогрессией первичной опухоли, причем аберрантное метилирование как минимум одного из исследованных генов наблюдалось в 85% случаев рака почки Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными из литературных источников позволили предложить практические рекомендации по использованию некоторых результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике

1 Определение потери гетерозиготности генов /¿4557-7 и РШТ вместе с исследованием метилирования промоторной области СОН1 в материале первичной опухоли целесообразно проводить наряду с пагоморфологическим исследованием при оценке прогноза РП

2 Исследование соматических мутаций и метилирования гена УНЬ как комбинированный молекулярно-генетический анализ рекомендуется осуществлять для оптимизации таргетаой терапии СРП при использовании мулгликиназных ингибиторов, связанных с патогенетическим путем инактивации VIII.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Д.С. Михайлепко, МВ Немцова Молекулярно-генетические маркеры рака почки II Российски« онкологический журнал. - 2007 - № 4 - С 4851

2 Д С. Михайленко, Р В Курынин, А М Попов, О Б Кзрякин, М Э Епикеев, Ю Г Аляев, М В Немцова, Д В Залстаев Инактивация гена \'НЬ при спорадическом светлоклеточном раке почки // Молекулярная биология.-2008 -Т42 -№1 -С71-77

3 Михайленко Д.С., Попов А М, Курышш Р В , Аляев Ю Г, Завалишина Л Э , Залетаев Д В Анализ молекулярно-генетических нарушений в генах УНЬ, 11А88Е1, РНГГ и ТР53 при светлоклеточном раке почки Н Медицинская генетика.-2008 -№4 - С 9-14

4 Залетаев Д В , Немцова М В , Стрельников В В , Бабенко О В , Пальцева Е М, Землякова В В , Кузнецова Е Б , Кекеева Т В , Михайлеико Д.С., Манохина И К Эпигенетические маркеры в диагностике онкозаболеваний // Молекулярная медицина. - 2008 - №4 - С 46-51

5 Курынин Р В, Михайлеико Д С., Залетаев Д В, Аляев Ю Г Молекулярные маркеры в диагностике и лечении рака почки // Молекулярная медицина.-2008 -№4 -С 24-28

6 М В Немцова, Д С Михайлеико, Т В Кекеева, О А Кузнецова, С В Башкатов, Р В Курынин, А М Попов, О П Попова, П В Шегай, Ю Ю Андреева, Б Я Алексеев, М Э Еникеев, Ю Г Аляев, О Б Карякин, И Г Русаков, Г А Франк, Д В Залетаев Молекулярно-генетические маркеры в онкоурочогии// Молекулярная медицина -2007 -№3 - С 43-54

7 Д.С Михайлеико, А М Попов, Р В Курынин, О Б Карякин, К Н Сафиуллин, Е Ф Лушников, С Д Фомин, Ю Г Аляев, В А Григорян, М Э Еникеев, ДВ Залетаев Структурно-функциональные изменения генов-супрессоров короткого плеча хромосомы 3 при спорадическом светлоклеточном раке почки // Тезисы 1-го конгресса Российского общества онкоурологов, Москва, Россия - 2006 - С 150

8 Михайлеико Д С., Курынин Р В , Попов А М, Еникеев М Э , Григорян В А , Аляев Ю Г, Карякин О Б , Залетаев Д В Изучение потерь гетерозиготности в областях локализации генов УНЦ КА88Р1 и ЯШТ при светлоклеточном раке почки // Сборник тезисов международной конференции «Генегака в России и в мире», Москва, Россия - 2006 -С 126

9 Д.С. Михайлеико, Р В Курынин, А М Попов, М Э Еникеев, 10 Г Аляев, О Б Карякин, Л Э Завалишина, Г А Франк, Д В Залетаев Поиск молекутярно-генегаческих маркеров светлоклеточного рака почки // Тезисы Ц-го конгресса Российского общества онкоурологов, Москва, Россия -2007 -С 133

10 Д С. Михайлеико, Р В Курынин, АМ Попов, МЭ Еникеев, ЮГ Аляев, О Б Карякин, Л Э Завалишина, Г А Франк, Д В Залетаев Молекулярно-генетический анализ инактивации гена УНЬ при спорадическом

светлоклегочном раке почки // Тезисы XI-i о Российского онкологического конгресса, Москва, Россия - ¿007 - С 226

11 Михайленко ДС. Поиск молекулярно-генетических маркеров прогрессии светлоклеточного рака почки Тезисы докладов конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины // Вестник Российской академии медицинских наук - 2008 - №6 - С 297

12 D. Mikhaylenko, R Kurymn, A Popov, О Karyakin, М Enikeev, Y Alayev, M Nemtsova, D Zaietayev Inactivation of the VHL gene in sporadic clear cell renal cancer Abstract of European Human Genetics Conference, Nice, France // European Journal of Human Genetics -2007 - Vol 15 -Suppl 1 -P 173

13 D.S. Mikhaylenko, R V Kurymn, A M Popov, D V Zaietayev Molecular genetic aberrations of the genes VHL, RASSF1, FHIT in patients with renal cancer Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, Ukraine I/ Abstract book. - 2007 - P 177

14 D.S. Mikhaylenko, A.M Popov, R V Kurymn, D V Zaietayev Analysis of the molecular-genetic alterations in the genes VHL, RASSF1, and FHIT in clear cell renal carcinomas Abstract of European Human Genetics Conference, Barcelona, Spam // European Journal of Human Genetics - 2008 - Vol 16 - Suppl 2 -P 235

Подписано в печать 24 09 2008 г

Печать трафаретная

Заказ №810 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Михайленко, Дмитрий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология и клиническая диагностика рака почки.

1.2. ДНК-диагностика наследственных форм рака почки.

1.3. Молекулярно-генетические маркеры спорадического рака почки.

1.4. Инактивация гена VHL при светлоклеточном раке почки.

1.5. Аллельные делеции генов-супрессоров.

1.6. Метилирование CpG-динуклеотидов у человека.

1.7. Методы анализа метилирования.

1.8. Метилирование генов-супрессоров при раке почки.

1.9. Полиморфизмы генов предрасположенности.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клинический материал.

2.2. Выделение ДНК из различного клинического материала.

2.3. Анализ мутаций в кодирующей части гена VHL.

2.4. Анализ потери гетерозиготности.

2.5. Обработка геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой.

2.6. Метилчувствительная ПЦР.

2.7. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.8. Тонкое окрашивание нитратом серебра.

2.9. Электрофорез в агарозном геле.

2.10. Секвенирование ПЦР-продуктов.

2.11. Обработка геномной ДНК бисульфитом натрия.

2.12. Бисульфитное секвенирование.

2.13. Мультилокусная ПЦР полиморфизмов в генах АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR.

2.14. Определение SNP методом минисеквенирования.

2.15. Статистический анализ данных.

2.16. Программное обеспечение.

глава 3. результаты и обсуждение.

3.1. Изучение инактивации гена VHL при спорадическом раке почки.

3.2. Исследование аллельных делений генов VHL, RASSF1, FHTT и TP53.

3.3. Изучение метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в опухолях почки.

3.4. Метилирование гена-кандидата НОХВ13 при спорадическом раке почки.

3.5. Анализ полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ молекулярно-генетических нарушений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований почки"

Ежегодно в мире регистрируют около 200 тыс. новых случаев рака почки (РП) и 100 тыс. смертей от этого заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии [20]. Примерно в 2% случаев наблюдают семейные формы РП и/или опухоли развиваются как часть клинической картины наследственного онкологического синдрома [99], однако подавляющее большинство случаев РП представлено спорадическими опухолями. В настоящее время накоплено большое количество данных о молекулярно-генетических особенностях спорадического РП.

Ген VHL (Зр25) подвергается инактивации вследствие соматических мутаций, аллельных делеций и/или метилирования в 40-60% случаев наиболее частого морфологического типа РП - светлоклеточной карциномы (СРП). Белок VHL необходим для сборки мультипротеинового комплекса, в котором осуществляется убиквитин-зависимая деградация гипоксией индуцируемого фактора 1а (HIFl-а). При мутациях в гене VHL нарушается формирование убиквитин-лигазного комплекса. Это приводит к нарастанию концентрации в клетках HIFl-a и аномально высокой экспрессии гипоксией-индуцируемых генов. Известны такие гены-мишени HIFl-a, как факторы роста VEGF, PDGF и их рецепторы, которые участвуют в положительной регуляции клеточной пролиферации и ангиогенезе. Предполагают, что гиперэкспрессия этих генов лежит в основе развития VHL-ассоциированных опухолей [97, 98, 116]. В настоящее время существуют различные точки зрения на инактивацию VHL как на прогностический критерий при СРП, что указывает на целесообразность дальнейших исследований молекулярно-генетических нарушений VHL при спорадическом СРП в различных клинических группах пациентов [28, 37, 140].

Помимо VHL в канцерогенез спорадического РП вовлечены другие гены -супрессоры опухолевого роста. Наиболее распространенный способ инактивации генов-супрессоров при РП — это протяженные делении, которые захватывают весь ген и смежные с ним участки. Такие делеции выявляют как потерю гетерозиготности (ПГ) с помощью STR-маркеров [19]. Проводятся работы по анализу влияния ПГ определенных локусов на прогноз заболевания и их связи с характеристиками первичной опухоли. Так, было обнаружено, что наиболее часто при СРП в области Зр подвергаются делециям гены VHL, RASSF1, FHIT. Напротив, при папиллярной карциноме делеции FHIT наблюдались значительно реже, а повреждения Зр были ассоциированы с благоприятным прогнозом [134]. ПГ в областях локализации генов-супрессоров на Зр (в частности, VHL, RASSF1, FHIT) является характерной чертой почечно-клеточных карцином, в особенности, СРП. Однако вопрос о влиянии аллельных делеций тех или иных генов-супрессоров на прогрессию первичной опухоли и прогноз заболевания остается открытым.

Инактивация генов-супрессоров в процессе канцерогенеза может осуществляться не только вследствие мутаций или ПГ, но и с помощью аберрантного метилирования регуляторных областей [7]. Растет количество работ по картированию CpG-островков, оценке частот метилирования генов-супрессоров при анализе опухолей, архивного материала и биологических жидкостей, поиску наиболее чувствительных и специфичных панелей метилированных генов при РП. Особый интерес в этом контексте представляют наиболее часто инактивируемые гены - VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, а также гены, инактивация которых способствует метастазированию первичной опухоли, например, CDH1. Таким образом, становятся все более актуальными проблемы поиска и характеристики молекулярных маркеров спорадического РП, который входит в десять наиболее частых эпителиальных опухолей у взрослых. Наиболее целесообразным представляется комплексный анализ генетических изменений, включающий оценку статуса гена VHL, ПГ и аберрантного метилирования генов-супрессоров, генетических полиморфизмов.

Целью исследования является комплексный молекулярно-генетический анализ при раке почки, направленный на выявление и характеристику диагностических и прогностических маркеров заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить мутации, аллельные делеции и метилирование промотора гена VHL и провести сравнительный анализ выявленных изменений относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.

2. Провести анализ потери гетерозиготности областей локализации генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 в парных образцах рака почки на различных стадиях заболевания и степенях дифференцировки первичной опухоли.

3. Оценить частоты аберрантного метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHTT, SFRP1 и CDH1 в образцах рака почки и провести сравнительный анализ метилирования этих генов относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.

4. Исследовать метилирование CpG-динуклеотидов в промоторной области гена НОХВ13, построить карту аберрантного метилирования этого гена.

5. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов АВСВ1, TGFBR1, IL10, VDR в норме и у больных раком почки. Провести сравнительный анализ полученных данных между группами пациентов и контроля, а также между различными клиническими группами больных раком почки.

Научная новизна

Идентифицированы 33 новые мутации в гене VHL. Впервые исследованы сочетанные делеции генов VHL, RASSF1, FHIT и TP 53 при СРП. Изучено метилирование 5'-регуляторных областей генов VHL, RASSFI, FHIT, SFRP1 и CDH1 с помощью мультилокусной метилчувствительной ПЦР. Впервые показана ассоциация аберрантного метилирования RASSF1 с прогрессией первичной опухоли на ранних стадиях РП (Р = 0.047). С помощью бисульфитного секвенирования построена карта метилирования промотора гена-кандидата НОХВ13 в первичных опухолях почки. С помощью нового метода — минисеквенирования с детекцией в режиме фрагментного анализа - изучены полиморфные варианты генов АВСВ1, TGFBR1, IL10 и VDR. Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP генов IL10 и TGFBR1, получены данные о возможном влиянии полиморфизмов в генах VDR и TGFBR1 на развитие опухолей почки.

Практическая значимость Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 127 первичных опухолей почки (светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином). Оптимизирован метод комплексной оценки молекулярно-генетических нарушений VHL (соматических мутаций, аберрантного метилирования и потери гетерозиготности) при СРП. Выявлена высокая частота повреждений гена VHL при СРП. Разработаны системы из двух STR-маркеров для тестирования аллельных делеций в областях локализации генов VHL, RASSFJ, FHIT и ТР53 при РП. Определена ассоциация множественных аллельных делеций генов-супрессоров на Зр (Р = 0.036), а также метилирования генов RASSFI и CDH1 с клинико-морфологическими характеристиками опухоли (Р = 0.001), что позволит использовать анализ этих генов в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях РП. Результаты, полученные в представленной работе, могут быть использованы в разработке системы молекулярно-генетических маркеров РП, в частности, определение мутаций и метилирования гена VHL - при оптимизации таргетной терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации, потеря гетерозиготности и/или метилирование гена VHL происходят на ранних стадиях СРП в большинстве случаев заболевания.

2. Потеря гетерозиготности двух и более генов-супрессоров, локализованных в области Зр, отражает прогрессию первичной опухоли.

3. Аберрантное метилирование является существенным механизмом инактивации генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, CDH1 и наблюдается в 85% первичных почечно-клеточных карцином. Построена карта метилирования промотора гена-кандидата НОХВ13 при спорадическом РП.

4. Метилирование генов RASSF1 и CDH1 ассоциировано с прогрессией и метастазированием первичной опухоли, соответственно, что позволяет рассматривать их как составную часть системы молекулярных маркеров РП.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и методики были разработаны и проведены лично Михайленко Д.С. Описание собственных исследований, обработка и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно. Михайленко Д.С. провел статистический анализ всех полученных данных, сформулировал выводы и написал статьи в научных журналах, отражающие результаты его диссертационной работы.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007-2008 гг., на конгрессах Российского общества онкоурологов в 2006-2007 гг., на Российском онкологическом конгрессе в 2007 г., конференции «Генетика в России и в мире» в 2006 г., конференции по биологии и генетике в 2007 г., конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 г., а также на межлабораторных семинарах ГУ МГНЦ РАМН. Прочитана лекция на кафедре генетики Факультета усовершенствования врачей Российского государственного медицинского университета Росздрава.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 14 печатных работах соискателя, в том числе, б статей опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при светлоклеточном раке почки» и «Молекулярно-генетическая методика оптимизации таргетной терапии при светлоклеточном раке почки» (Разрешения на применение новой медицинской технологии ФС № 2008/150 от 22.07.2008 и ФС № 2008/152 от 23.07.2008, соответственно). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в Межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова: анализ терминальных мутаций в гене VHL при диагностики синдрома Хиппеля-Линдау, определение аллельных делеций генов-супрессоров в области Зр при спорадическом РП.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Михайленко, Дмитрий Сергеевич

выводы

Соматические мутации, потеря гетерозиготности и метилирование гена VHL выявлены у 54% пациентов на первой стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании. Впервые идентифицированы 33 новые мутации VHL.

Аллельные делеции двух и более генов-супрессоров (VHL, RASSF1, FHIT), локализованных на коротком плече хромосомы 3, ассоциированы с наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.036), что может отражать прогрессию первичной опухоли.

Аберрантное метилирование 5'-регуляторных областей гена VHL составляет 14%, RASSF1 - 53%, FHIT- 54%, SFRP1 - 33% и CDH1 - 42% случаев РП. Метилирование хотя бы одного из исследованных генов происходит в 85% случаев РП. Метилирование CDH1 ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001). Метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0.047). Метилирование RASSF1 и CDH1 может рассматриваться в качестве неблагоприятного прогностического маркера на различных стадиях РП.

Построена карта метилирования CpG-островка гена НОХВ13 при СРП. Аберрантному метилированию, преимущественно, подвергаются цитозины в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона ATG, что может быть использовано при определении частоты метилирования НОХВ13 в опухолях почки.

5. Частоты генотипов исследуемых SNP гена TGFBR1 в норме составляют 56% (G/G), 40% (G/A) и 4% (А/А); 1110 - 51% (A/G), 32% (А/А) и 17% (G/G). Частоты генотипов VDR при РП достоверно отличаются от контроля (Р = 0.025). У больных РП с метастазами уменьшена частота встречаемости аллеля А гена TGFBR1 (Р = 0.016).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В настоящей работе получены данные об инактивации гена VHL на различных стадиях рака почки, выявлены ассоциации множественных аллельных делеций генов-супрессоров в области Зр и метилирования генов RASSFI и CDH1 с прогрессией первичной опухоли, причем аберрантное метилирование как минимум одного из исследованных генов наблюдалось в 85% случаев рака почки. Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными из литературных источников позволили предложить практические рекомендации по использованию некоторых результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике:

1. Определение потери гетерозиготности генов VHL, RASSFI и FHIT вместе с исследованием метилирования промоторной области CDH1 в материале первичной опухоли целесообразно проводить наряду с патоморфологическим исследованием при оценке прогноза РП.

2. Исследование соматических мутаций и метилирования гена VHL как комбинированный молекулярно-генетический анализ рекомендуется осуществлять для оптимизации таргетной терапии СРП при использовании мультикиназных ингибиторов, связанных с патогенетическим путем инактивации VHL.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Михайленко, Дмитрий Сергеевич, Москва

1. Аксель Е.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями мочевых и мужских половых органов в России в 2003 г. // Онкоурология. 2005. - № 1. — С. 6-9.

2. Алексеев Б.Я., Шегай П.В. Таргетная терапия распространенного рака почки // Онкоурология. 2007. - № 4. - С. 6-11.

3. Аляев Ю.Г. Григорян В.А., Крапивин А.А., Султанова Е.А. Опухоль почки. М.: ГЭОТАР-МЕД. 2002. - 56 с.

4. Белохвостое А.С., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. М.: МАКС-Пресс. 2002. - 84 с.

5. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей человека // Молекулярная Биология. 2004. - Т. 38. - № 2. - С. 179-190.

6. Заридзе Д.Г. (под ред.). Канцерогенез. М.: «Медицина». 2004. — 576 с.

7. Иванов В.И., Киселев Л.Л. (под ред.). Геномика медицине. М.: ИКЦ «Академкнига». — 2005. - 392 с.

8. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная онкология: клинические аспекты. СПб.: МАЛО. 2007. - 211 с.

9. Карякин О.Б., Попов А.М. Паллиативное и симптоматическое лечение больных раком почки // Практическая Онкология. 2005. — Т. 6. - № 3. - С. 186-192.

10. Киселев Л.Л., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека // Молекулярная Медицина. 2005. — № 3. — С. 17-28.

11. Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Дрозд О.В. и соавт. Поиск и характеристика новых маркеров метилирования и генов, вовлеченных в канцерогенез, методомметилчувствительного фингерпринтинга // Вестник НИИ Молекулярной Медицины. 2005. - № 5. - С. 73-88.

12. Личиницер М.Р., Ганынина И.П., Филоненко Д.А. Сутент® при светлоклеточном раке почки и гастроинтестинальных стромальных опухолях // Фарматека. 2007. -№1. — С. 22-25.

13. Логинов В.И., Базов И.В., Ходырев Д.С. и соавт. Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека // Генетика. 2008. — Т. 44. - № 2. - С. 250-256.

14. Лоран О.Б., Серегин А.В., Мяндина Г.И. и соавт. PLA полиморфизм гена GP3A -новый прогностический фактор рака почки // Онкоурология. 2007. — № 3. — С. 27-31.

15. Матвеев В.Б., Марилов Т.В., Юнкер К. Цитогенетические исследования при двустороннем раке почек // Онкоурология. 2006. -№ 3. - С.14-18.

16. Михайленко Д.С., Курынин Р.В., Попов A.M. и соавт. Инактивация гена VHL при спорадическом светлоклеточном раке почки // Молекулярная Биология. 2008. — Т. 42.-№ 1.-С. 71-77.

17. Михайленко Д.С., Немцова М.В. Молекулярно-генетические маркеры рака почки // Российский Онкологический Журнал. 2007. - № 4. - С. 48-51.

18. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. М.: «Медицинское информационное агенство». 2003. - 544 с.

19. Немцова М.В., Михайленко Д.С., Кекеева Т.В и соавт. Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии // Молекулярная Медицина. — 2007. — № 3. С. 43-54.

20. Носов А.К. Клинические проявления, диагностика и стадирование ракапаренхимы почки // Практическая Онкология. 2005. - Т. 6. - № 3. - С. 148-155.108

21. Пальцев М.А. (под ред.). Введение в молекулярную медицину. М.: «Медицина». -2004.-496 с.

22. Пельс Я.Р., Марусин А.В., Спиридонова М.Г., Степанов В.А. Полиморфизм гена MDR1 человека в популяциях Сибири и Средней Азии // Молекулярная биология. 2007. - Т. 41. - № 6. - С. 982-988.

23. Путилин A.M., Москаленко М.В., Баранова И.А. и соавт. Исследование полиморфизма гена рецептора витамина D при глюкокортикоид-индуцированном остеопорозе у больных тяжелой бронхиальной астмой // Пульмонология. 2006. -№ 1.-С. 68-73.

24. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Перевод с английского. М.: Мир. 1999. - 558 с.

25. Abe H., Yamanishi Т., Mashidori T. et al. Significant association of interleukin 10 receptor mRNA levels with renal cell carcinoma metastasis // Biomedical Research. -2008.-Vol. 29.-P. 19-25.

26. Allis C.D., Jenuwein Т., Reinberg D., Caparros M.L. Epigenetics. NY, USA.: Cold spring harbor laboratory press. 2007. - 502 p.

27. Banks R.E., Tirukonda P., Taylor C. et al. Genetic and epigenetic analysis of von Hippel-Lindau (VHL) gene alterations and relationship with clinical variables in sporadic renal cancer // Cancer Research. 2006. - Vol. 66. - P. 2000-2011.

28. Bardelli A., Pugliese L., Comoglio P.M. Invasive-growth signaling by the MET/HGF receptor: the hereditary renal carcinoma connection // Biochimica et Biophysica Acta. -1997.-Vol. 1333.-P. 41-51.

29. Basturk В., Yavascaoglu I., Vuruskan H. et al. Cytokine gene polymorphisms as potential risk and protective factors in renal cell carcinoma // Cytokine. — 2004. — Vol. 30.-P. 41-45.

30. Battagli C., Uzzo R.G., Dulaimi E. et al. Promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in urine from kidney cancer patients // Cancer Research. 2003. -Vol. 63.-P. 8695-8699.

31. Bilim V., Kawasaki Т., Katagiri A., et al. Altered expression of p-catenin in renal cell cancer and transitional cell cancer with the absence of p-catenin gene mutations // Clinical Cancer Research. 2000. - Vol. 6. - P. 460-466.

32. Bodmer D., Hurk W., Groningen J.J. et al. Understanding familial and non-familial renal cell cancer // Human Molecular Genetics. 2002. - Vol. 11. - P. 2489-2498.

33. Boer J.M., Huber W.K., Sultmann H. et al. Identification and classification of differentially expressed genes in renal cell carcinoma by expression profiling on a globalhuman 31500-element cDNA array // Genome Research. 2001. - Vol. 11. - P. 18611870.

34. Brauch H., Weirich G., Brieger J. et al. VHL alterations in human clear cell renal cell carcinoma: association with advanced tumor stage and a novel hot spot mutation // Cancer Research. 2000. - Vol. 60. - P. 1942-1948.

35. Breault J.E., Shiina H., Igawa M. et al. Methylation of the y-catenin gene is associated with poor prognosis of renal cell carcinoma // Clinical Cancer Research. 2005. — Vol. 11.-P. 557-564.

36. Caceres I.I., Dulaimi E., Hoffman A.M. et al. Identification of novel target genes by an epigenetic reactivation screen of renal cancer // Cancer Research. 2006. - Vol. 66. - P. 5021-5028.

37. Chen Т., Jackson C., Costello B. et al. An intronic variant of the TGFBR1 gene is associated with carcinomas of the kidney and bladder // International Journal of Cancer. 2004. - Vol. 112. - P. 420-425.

38. Chew E.Y. Ocular manifestations of von Hippel-Lindau disease: clinical and genetic investigations // Transactions of the American Ophthalmological Society. 2005. — Vol. 103.-P. 495-511.

39. Choueiri Т.К., Vaziri S.A., Jaeger E. et al. Von Hippel-Lindau gene status and response to vascular endothelial growth factor targeted therapy for metastatic clear cell renal cell carcinoma // The Journal of Urology. 2008. - Vol. 180. - P. 860-866.

40. Christoph F., Hinz S., Weikert S. et al. Comparative promoter methylation analysis of p53 target genes in urogenital cancers // International Urology. 2008. - Vol. 80. - P. 398-404.

41. Cifola I., Spinelli R., Beltrame L. et al. Genome-wide screening of copy number alterations and LOH events in renal cell carcinomas and integration with gene expression profile // Molecular Cancer. 2008. - Vol. 7. - P. 1-12.

42. Clement G., Bosnian F.T., Fontolliet C., Benhattar J. Monoallelic methylation of the APC promoter is altered in normal gastric mucosa associated with neoplastic lesions // Cancer Research. 2004. - Vol. 64. - P. 6867-6873.

43. Costa V.L., Henrique R., Ribeiro F.R. Quantitative promoter methylation analysis of multiple cancer-related genes in renal cell tumors // BMC Cancer. 2007. - Vol. 7. - P. 133-139.

44. Dahl E., Wiesmann F., Woenckhaus M. et al. Frequent loss of SFRP1 expression in multiple human solid tumors: association with aberrant promoter methylation in renal cell carcinoma // Oncogene. 2007. - P. 1-12.

45. Dalgin G.S., Drever M., Williams T. et al. Identification of novel epigenetic markers for clear cell renal cell carcinoma // The Journal of Urology. 2008. - Vol. 180. - P. 11261130.

46. Doerfler W., Bohm P. DNA methylation: basic mechanisms. USA.: Springer. 2006. -327 p.

47. Doyle L.A., Ross D.D. Multidrag resistance mediated by the breast cancer resistance protein BCRP (ABCG2) // Oncogene. 2003. - Vol. 22. - P. 7340-7358.

48. Dreijerink K., Braga E., Kuzmin I. et al. The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumorigenesis // PNAS. 2001. - Vol. 98. - P. 7504-7509.

49. Dulaimi E., Ibanez de Caceres I., Uzzo R.G. et al. Promoter hypermethylation profile of kidney cancer // Clinical Cancer Research. 2004. - Vol. 10. - P. 3972-3979.

50. Esteller M. DNA methylation; approaches, methods, and applications. NY, USA.: CRC Press.-2005.-217 p.

51. Friedrich C.A. Genotype-phenotype correlation in von Hippel-Lindau syndrome // Human Molecular Genetics. 2001. - Vol. 10. - P. 763-767.

52. Fromm M.F. Genetically determined differences in P-glycoprotein function: implications for disease risk // Toxicology. 2002. - Vol. 181. - P. 299-303.

53. Furge K.A., Dykema K., Petillo D. et al. Combining differential expression, chromosomal and pathway analysis for the molecular characterization of renal cell carcinoma // Canadian Urological Association Journal. 2007. - Vol. 1 s. - P. 21-27.

54. Furge K.A., Lucas K.A., Takahashi M. et al. Robust classification of renal cell carcinoma based on gene expression data and predicted cytogenetic profiles // Cancer Research. 2004. - Vol. 64. - P. 4117-4121.

55. Galban S., Fan J., Martindale J.L. et al. Von Hippel-Lindau protein-mediated repression of tumor necrosis factor alpha translation revealed through use of cDNA arrays // Molecular and Cell Biology. 2003. - Vol. 3. - P. 2316-2328.

56. Gijtenbeek J., Jacobs В., Boots-Sprenger S. et al. Molecular analysis as a tool in the differential diagnosis of VHL disease-related tumors // Diagnostic Molecular Pathology. -2005.-Vol. 14.-P. 115-120.

57. Girolami F., Passerini I., Gargano D. et al. Microsatellite analysis of chromosome 3p region in sporadic renal cell carcinomas // Pathology Oncology Research. 2002. - Vol. 8.-P. 241-244.

58. Gonzalgo M.L., Eisenberger C.F., Lee S.M. et al. Prognostic significance of preoperative molecular serum analysis in renal cancer // Clinical Cancer Research. — 2002.-Vol. 8.-P. 1878-1881.

59. Gonzalgo M.L., Yegnasubramanian S., Yan G. et al. Molecular profiling and classification of sporadic renal cell carcinoma by quantitative methylation analysis // Clinical Cancer Research. 2004. - Vol. 10. - P. 7276-7283.

60. Hansel D.E. Genetic alterations and histopathologic findings in familial renal cell carcinoma // Histology and Histopathology. 2006. - Vol. 21. - P. 437-444.

61. Hansel D.E., Rini B.I. Molecular genetics of hereditary renal cancer: new genes and diagnostic and therapeutic opportunities // Expert Reviews in Anticancer Therapy. -2008.-Vol. 8.-P. 895-905.

62. Hattori K., Teranishi J., Stole C. et al. Detection of germline deletions using real-time quantitative polymerase chain reaction in Japanese patients with von Hippel-Lindau disease // Cancer Sciences. 2006. - Vol. 97. - P. 400-405.

63. Havranek E., Howell, W.M., Fussell H.M. et al. An interleukin-10 promoter polymorphism may influence tumor development in renal cell carcinoma // The Journal of Urology.- 2005. -Vol. 173.-P. 709-712.

64. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S. et al. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands // PNAS. 1996. - Vol. 93. - P. 9821-9826.

65. Herman J.G., Latif F., Weng Y. et al. Silencing of the VHL tumor-suppressor gene by DNA methylation in renal carcinoma // PNAS. 1994. - Vol. 91. - P. 9700-9704.

66. Hesson L.B., Cooper W.N., Latif F. The role of RASSF1A methylation in cancer // Disease Markers. 2007. - Vol. 23. - P. 73-87.

67. Higgins J.P. Gene array studies in renal neoplasia // The Scientific World Journal. -2006.-Vol. 6.-P. 502-511.

68. Hirai A., Yano Т., Nishikawa K. et al. Down-regulation of connexin 32 gene expression through DNA methylation in a human renal cell carcinoma cell // American Journal of Nephrology. 2003. - Vol. 23. - P. 172-177.

69. Hirata H., Hinoda Y., Kikuno N. et al. MDM2 SNP309 polymorphism as risk factor for susceptibility and poor prognosis in renal cell carcinoma // Clinical Cancer Research. -2007. Vol. 13. - P. 4123-4129.

70. Hirata H., Okayama N., Naito K. et al. Association of a haplotype of matrix metalloproteinase (MMP)-l and MMP-3 polymorphisms with renal cell carcinoma // Carcinogenesis. 2004. - Vol. 25. - P. 2379-2384.

71. Hoebeeck J., Luijt R., Poppe B. et al. Rapid detection of VHL exon deletions using realtime quantitative PCR // Laboratory Investigation. 2005. - Vol. 85. - P. 24-33.

72. Hoque M.O., Begum S., Topaloglu O. et al. Quantitative detection of promoter hypermethylation of multiple genes in the tumor, urine, and serum DNA of patients with renal cancer // Cancer Research. 2004. - Vol. 64. - P. 5511 -5517.

73. Huebner K. Tumor suppressors on 3p: a neoclassic quartet // PNAS. 2001. - Vol. 98. -P. 14763-14765.

74. Idbaih A., Omuro A., Ducray F., Hoang-Xuan K. Molecular genetic markers as predictors of response to chemotherapy in gliomas // Current Opinion in Oncology. -2007.-Vol. 19.-P. 606-611.

75. Ikuyama Т., Hamasaki Т., Inatomi H. et al. Association of vitamin D receptor gene polymorphism with renal cell carcinoma in Japanese // Endocrine Journal. 2002. -Vol. 49. - P. 433-438.

76. Jeronimo С. Quantitative methylation profiling of renal tumors and the discovery of a new generation of molecular markers // Future Oncology. 2005. - Vol. 1. — P. 197200.

77. Jiang Y., Zhang W., Kondo K. et al. Gene expression profiling in a renal cell carcinoma cell line: dissecting VHL and hypoxia-dependent pathways // Molecular Cancer Research. Vol. 1. - P. 453-462.

78. Junker K., Schlichter A., Junker U. et al. Cytogenetic, histopathologic, and immunologic studies of multifocal renal cell carcinoma // Cancer. 1997. - Vol. 79. - P. 975-981.

79. Kagara I., Enokida H., Kawakami K. et al. CpG hypermethylation of the UCHL1 gene promoter is associated with pathogenesis and poor prognosis in renal cell carcinoma // The Journal of Urology.- 2008. -Vol. 180.-P. 343-351.

80. Kalfa N., Lumbroso S., Boulle N. et al. Activating mutations of Gsa in kidney cancer // The Journal of Urology. 2006. - Vol. 176. - P. 891-895.

81. Karami S., Brennan P., Hung R.J. et al. Vitamin D receptor polymorphisms and renal cancer risk in central and eastern Europe // Journal of Toxicology and Environmental Health. 2008. - Vol. 71. - P. 367-372.

82. Kawada Y., Nakamura M., Ishida E. et al. Aberrations of the pi 4^ and pl6INIC4a genes in renal cell carcinomas // Japanese Journal of Cancer Research. 2001. - Vol. 92. — P. 1293-1299.

83. Khoo S.K., Giraud S., Kahnoski K. et al. Clinical and genetic studies of Birt-Hogg-Dube syndrome // The Journal of Medical Genetics. 2002. - Vol. 39. - P. 906-912.

84. Kim W.Y., Kaelin W.G. Role of VHL gene mutation in human cancer // Journal of Clinical Oncology. 2004. - Vol. 22. - P. 4991-5004.

85. Kleinrath Т., Gassner С., Lackner P. et al. Interleukin-4 promoter polymorphisms: a genetic prognostic factor for survival in metastatic renal cell carcinoma // Journal of Clinical Oncology. 2007. - Vol. 25. - P. 845-851.

86. Knobloch R., Hegele A., Brandt H. et al. High frequency of serum DNA alterations in renal cell carcinoma detected by fluorescent microsatellite analysis // International Journal of Cancer. 2002. - Vol. 98. - P. 889-894.

87. Korenaga Y., Naito K., Okayama N. et al. Association of the BCRP C421A polymorphism with nonpapillary renal cell carcinoma // International Journal of Cancer. 2005. - Vol. 117. - P. 431 -434.

88. Kuroki Т., Trapasso F., Yendamuri S. et al. Allele loss and promoter hypermethylation of VHL, RAR-P, RASSF1A, and FHIT tumor suppressor genes on chromosome 3p in esophageal squamous cell carcinoma // Cancer Research. 2003. - Vol. 63. - P. 37243728.

89. Kuwai Т., Kitadai Y., Tanaka S. et al. Mutation of the von Hippel-Lindau (VHL) gene in human colorectal carcinoma: association with cytoplasmic accumulation of hypoxia-inducible factor (HIF)-l alpha // Cancer Science. 2004. - Vol. 95. - P. 149-153.

90. Kvasha S., Gordiyuk V., Kondratov A. et al. Hypermehtylation of the 5'CpG island of the FHIT gene in clear cell renal carcinomas // Cancer Letters. 2008. — Vol. 265. - P. 250-257.

91. Lee M.G., Huh J.S., Chung S.K. et al. Promoter CpG hypermethylation and downregulation of XAF1 expression in human urogenital malignancies: implications for attenuated p53 response to apoptotic stresses // Oncogene. 2006. - Vol. 25. - P. 58075822.

92. Leroy X., Zini L., Buob D. et al. Renal cell carcinoma with rhabdoid features: an aggressive neoplasm with overexpression of p53 // Archive of Pathological Laboratory Medicine.-2007.-Vol. 131. P. 102-106.

93. Lim D.L., Ко R, Pautler S.E. Current understanding of the molecular mechanisms of kidney cancer: a primer for urologists // Canadian Urological Association Journal. — 2007.-Vol. Is.-P. 13-20.

94. Linehan W.M., Walther M.M., Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney // The Journal of Urology. 2003. - Vol. 170. - P. 2163-2172.

95. Linehan W.M., Zbar В., Klausner R.D. The genetic basis of human cancer, chapter 27 (Renal carcinoma). 2nd edition. USA.: McGraw-Hill Companies. 2002.

96. Lipworth L., Tarone R.E., McLaughlin J.K. The epidemiology of renal cell carcinoma // The Journal of Urology. 2006. - Vol. 176. - P. 2353-2358.

97. Lovisolo J.A., Casati В., Clerici L. et al. Gene expression profiling of renal cell carcinoma: a DNA macroarray analysis // BJU International. 2006. - Vol. 98. - P. 205-216.

98. Ma J., Jin H., Wang H. et al. Expression of NDRG2 in clear cell renal cell carcinoma // Biological and Pharmaceutical Bulletin. 2008. - Vol. 31. - P. 1316-1320.

99. Mann V., Hobson E.E., Li B. et al. A COL1A1 Spl binding site polymorphism predisposes to osteoporotic fracture by affecting bone density and quality // The Journal of Clinical Investigation. -2001. Vol. 107. - P. 899-907.

100. Molino D., Sepe J., Anastasio P., De Santo N.G. The history of von Hippel-Lindau disease //The Journal of Nephrology. 2006. -Vol. 19. -S. 10.-P. 119-123.

101. Morrissey C., Martinez A., Zatyka M. et al. Epigenetics inactivation of the RASSF1A 3p21.3 tumor suppressor gene in both clear cell and papillary renal cell carcinoma // Cancer Research. 2001. - Vol. 61. - P. 7277-7281.

102. Nagy A., Buzogany I., Kovacs G. Microsatellite allelotyping differentiates chromophobe renal cell carcinomas from renal oncocytomas and identifies new genetic changes // Histopathology. 2004. - Vol. 44. - P. 542-546.

103. Nickerson M.L., Warren M.B., Того J.R. et al. Mutations in a novel gene lead to kidney tumors, lung wall defects, and benign tumors of the hair follicle in patients with the Birt-Hogg-Dube syndrome // Cancer Cell. 2002. - Vol. 2. - P. 157-164.

104. Okuda H., Toyota M., Ishida W. et al. Epigenetic inactivation of the candidate tumor suppressor gene HOXB13 in human renal cell carcinoma // Oncogene. 2006. - Vol. 25.-P. 1733-1742.

105. Ong K.R., Woodward E.R., Killick P. et al. Genotype-phenotype correlations in von Hippel-Lindau disease // Human Mutation. 2007. - Vol. 28. - P. 143-149.

106. Page Т., Hodgkinson A.D., Ollerenshaw M. et al. Glucose transporter polymorphisms are associated with clear-cell renal carcinoma 11 Cancer Genetics and Cytogenetics. -2005.-Vol. 163.-P. 151-155.

107. Pasche В., Kaklamani V., Hou N. et al. TGFBR1*6A and cancer: a meta-analysis of 12 case-control studies // Journal of Clinical Oncology. 2003. - Vol. 21. - P. 3236-3243.

108. Paz M.F., Yaya-Tur R., Rojas-Marcos I. et al. CpG island hypermethylation of the DNA repair enzyme methyltransferase predicts response to temozolomide in primary gliomas // Clinical Cancer Research. 2004. - Vol. 10. - P. 4933-4938.

109. Rathmell W.K., Wright T.M., Rini B. Molecularly targeted therapy in renal cell carcinoma// Expert Reviews in Anticancer Therapy. 2005. - Vol. 5. - P. 1031-1040.

110. Richards F.M. Molecular pathology of von Hippel-Lindau disease and the VHL tumor suppressor gene // Expert Reviews in Molecular Medicine. Cambridge university press. -2001.-00265-4a.

111. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: A laboratory manual (3rd ed.). NY, USA.: Cold Spring Harbor Lab Press. 2001. - 2322p.

112. Sasaki M., Tanaka Y., Okino S.T. et al. Polymorphisms of the CYP1B1 gene as risk factors for human renal cell cancer // Clinical Cancer Research. — 2004. Vol. 10. - P. 2015-2019.

113. Schmidt L.S., Nickerson M.L., Warren M.B. et al. Germline BHD-mutation spectrum and phenotype analysis of a large cohort of families with Birt-Hogg-Dube syndrome //

114. American Journal of Human Genetics. 2005. - Vol. 76. - P. 1023-1033.120

115. Shi Y., Zou M., Farid N.R., Paterson M.C. Association of FHIT (fragile histidine triad), a candidate tumor suppressor gene, with the ubiquitin-conjugating enzyme hUBC9 // The Biochemical Journal. 2000. - Vol. 352. - P. 443-448.

116. Siegsmund M., Brinkmann U., Schaffeler E. et al. Association of the P-glycoprotein transporter MDR1 polymorphism with the susceptibility to renal epithelial tumors // Journal of American Society of Nephrologists. 2002. - Vol. 13. - P. 1847-1854.

117. Slaton J.W., Inoue K., Perrotte P. et al. Expression levels of genes that regulate metastasis and angiogenesis correlate with advanced pathological stage of renal cell carcinoma // American Journal of Pathology. 2001. - Vol. 158. - P. 735-743.

118. Smits K.M., Schouten L.J., Dijk B. et al. Genetic and epigenetic alterations in the von Hippel-Lindau gene: the influence on renal cancer prognosis // Clinical Cancer Research. 2008. - Vol. 14. - P. 782-787.

119. Struckmann K., Schraml P., Simon R. et al. Impaired expression of the cell cycle regulator BTG2 is common in clear cell renal cell carcinoma // Cancer Research. -2004. Vol. 64. - P. 1632-1638.

120. Sultmann H., Heydebreck A., Huber W. et al. Gene expression in kidney cancer is associated with cytogenetic abnormalities, metastasis formation, and patient survival // Clinical Cancer Research. 2005. - Vol. 11. - P. 646-655.

121. Sun C.Q., Arnold R., Fernandez-Golarz C. et al. Human p-defensin-1, a potential chromosome 8p tumor suppressor: control of transcription and induction of apoptosis in renal cell carcinoma // Cancer Research. 2006. - Vol. 66. - P. 8542-8549.

122. Takahashi M., Kahnoski R., Gross D. et al. Familial adult renal neoplasia // The Journal of Medical Genetics. 2002. - Vol. 39. - P. 1-5.

123. Tanaka Y., Hirata H., Chen Z. et al. Polymorphisms of catechol-O-methyltransferase in men with renal cell cancer // Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 2007. -Vol. 16.-P. 92-97.

124. To K.W., Zhan Z., Bates S.E. Aberrant promoter mathylation of the ABCG2 gene in renal carcinoma // Molecular and Cellular Biology. 2006. - Vol. 26. - P. 8572-8585.

125. Tokinaga K., Okuda H., Nomura A. et al. Hypermethylation of the RASSF1A tumor suppressor gene in Japanese clear cell renal cell carcinoma // Oncology Reports. 2004. -Vol. 12.-P. 805-810.

126. Tong A.L., Zeng Z.P., Li H.Z. et al. Von Hippel-Lindau gene mutation in non-syndromic familial pheochromocytomas // Annals of the New York Academy of Sciences. 2006. - Vol. 1073. - P. 203-207.

127. Tost J., Abdalaoui H.E., Gut I.G. Serial pyrosequencing for quantitative DNA methylation analysis // BioTechniques. 2006. - Vol. 40. - P. 721-726.

128. Velickovic M., Delahunt В., Storkel S., Grebe S.K. VHL and FHIT locus loss of heterozygosity is common in all renal cancer morphotypes but differs in pattern and prognostic significance // Cancer Research. 2001. - Vol. 61. - P. 4815-4819.

129. Veltri R.W., Makarov D.V. Nucleic acid-based marker approaches to urologic cancers // Urologic Oncology. 2006. - Vol. 24. - P. 510-527.

130. Warburton H.E., Brady M., Vlatkovic N. et al. p53 regulation and function in renal cell carcinoma // Cancer Research. 2005. - Vol. 65. - P. 6498-6503.

131. Wernert N., Kaminski A., Haddouti M., Hahne J.C. Tumor-stroma interactions of metastatic prostate cancer cell lines: analyses using microarrays // Methods in Molecular Biology. 2007. - Vol. 382. - P. 223-237.

132. Wood C.G. Multimodal approaches in the management of locally advanced and metastatic renal cell carcinoma: combining surgery and systemic therapies to improve patient outcome // Clinical Cancer Research. 2007. - Vol. 13. - S. 2. - P. 697-702.

133. Yano Т., Fujimoto E., Hagiwara H. et al. Connexin 32 as an anti-invasive and anti-metastatic gene in renal cell carcinoma // Biological Pharmaceutical Bulletin. 2006. -Vol. 29.-P. 1991-1994.

134. Yao M., Yoshida M., Kishida T. et al. VHL tumor suppressor gene alterations associated with good prognosis in sporadic clear-cell renal carcinoma // Journal of the National Cancer Institute. 2002. - Vol. 94. - P. 1569-1575.

135. Yin-Goen Q., Dale J., Yang W.L. et al. Advances in molecular classification of renal neoplasms // Histology and Histopathology. 2006. - Vol. 21. - P. 325-339.

136. Zbar В., Glenn G., Merino M. et al. Familial renal carcinoma: clinical evaluation, clinical subtypes and risk of renal carcinoma development // The Journal of Urology. -2007.-Vol. 177.-P. 461-465.

137. Zhao J., Yart A., Frigerio S. et al. Sporadic human renal tumors display frequent allelic imbalances and novel mutations of the HRPT2 gene // Oncogene. 2006. - Vol. 27. - P. 1-10.

Информация о работе

Михайленко, Дмитрий Сергеевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Анализ молекулярно-генетических нарушений, ассоциированных с развитием злокачественных новообразований почки - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы