Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение неонкогенного производного Ti плазмиды Во542 Agrobacterium tumefaciens A261

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение неонкогенного производного Ti плазмиды Во542 Agrobacterium tumefaciens A261"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ иг.!. В. А. ЗНГРЛБГАРДТА ЦЕНТР "БИОИНЖЕНЕРИЯ"

На правах. рукописи та 577.21

Ревбнкова Екатерина Влацкмгеозяэ

ПОЛУЧЕНИЕ НЕОККОГЕККОГО ПРОИЗВОДНОГО Ti ЛЛАЗМШШ Во542 agr03acterium tuwefacieks л261

03.00.03 - Молекулярная Сиодсгкя

Автореферат диссертации на соискание ученой степена кандидата биологических наук

Москва 1933 г.

V J./-V

Работа выполнена в лаборатории генетической инженерш растений Института молекулярной биологии им.Б.А.Энгельгардта РАН и лаборатории молекулярной биологии растений Центра "Биоинженерия" РАН

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: доктор биологвческкх наук, профессор, член-корр. РАСЗШ К.Г.Скрябин кандидат биологических наук А.С.Краев

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Н.К.Янковский доктор биологических наук П.Ы.Чуыаков

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Московский государственный университет им.М.В.Ломоносова

Защита состоится "у " 19ЭЗ г. в /^часов на

заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Знгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, д.32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Знгельгардта РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат химических наук <£/' / "" А.М.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' Актуальность работы. Разработка методов введения чужеродной ДНК в геном высших растений послужила мощным ишульсом для развития молекулярной сиологаи. Благодаря возможности переносить генетическую информацию, в руках исследователей оказались новые способы изучения структуры и функциональных особенностей генома растений. Трансгенные растения используют для изучения характера экспрессии генов, роли регуляторных последовательностей, процессов рекомбинация. Сконструированы специальные векторы, позволяющие клонировать районы, окружающие участки встраивания чужеродной ДНК. Кроме того, методы генетической трансформации стали использоваться в Оиотехнологической практике для получения культурных растений, устойчивых к гербицидам, вирусам и насекомым.

Среда зекторов для трансформации растений наиболее широкое распространение получили векторы, сконструированные на основе природной системы переноса генов почвенной бактерии .4gro bacterlur, tusefaciens. Введение в геном растения чужеродной ДНК с помощью A.turneíасlens не требует применения методов выделения и культивирования протопластов и сложных приборов, необходимых, папрнмер, для Езедзния ДНК с помощью электропорации или обстрела высокоскоростными микрочастицами. Т-ДНК, переносимая /.. turns Гас lenr, могет быть использована, наряду с растительными транспозона.ми, для "маркирования" генов. В последние годы опубликован рад работ, в которых Т-ДНК использована для поиска в растительном геноме промоторов и последовательностей, модулирующих экспрессию генов (Kcnc:: et al, 1939; Goldsboro ugh and Bevan, 1990; Kertbundít et al, 1991; Topping et al, 1991).

В существующих векторных системах переносимый фрагмент ДНК содержит ген устойчивости к антибиотику, используемый для селекции транаТюрмкрованных тканей в культуре. Но в ряде случаев сцепление селективного маркера с остальной частью введенной конструкции оказывается нежелательным. Так, для изучения последовательностей, окружаваих сайт инсерции перенесенного фрагмента ДНК (Т-ДНК), могут Оть использованы репортерные гены. Однако, при использовании для селекции

трансформированных клеток маркера, сцепленного с рзпортерным геном, будут отобраны лишь те клетки, в которых окружающие растительнйе последовательности не препятствуют достаточной для преодоления селективного сарьера экспрессии маркера Т-ДНК. На наш взгляд, перенос в растительный геном фрагмента ДНК, не содержащего селективного маркера, может Сыть осуществлен с помощью специальной векторной ситстемн.

Поскольку система переноса ДНК А.1ишеГас1еш способна переносить и встраивать в геном растения независимо две различных Т-ДНК, селективный маркер может находиться на одной из Т-ДНК, а остальная часть вводимой конструкции - на другой. Но для того,. чтобы вероятность появления трансформированных клеток, несущих обе Т-ДНК, была достаточно высокой, используемый штамм д.£иаеГас1еп2 должен обладать высокоэффективной системой переноса. Штамм ¿281 АЛитеГа.с1еп2, несущий пдазмиду рТ1Бо542, способен с повышенной (по сравнению с другими штатами) ' частотой вызывать быстро растущие опухоли у большого числа видов растений (Котаг1 вЪ &1, 1986). Благодаря этим свойствам штамм А231 был назван "супервирулентным". Было показано, что супервирулэнтность связана с участком у1г-области рТ1Во542 1Лп вь »1, 1987). Таким образом, на основе штамма А281 может быть сконструирована векторная система, способная к эффективному переносу в растительный геном двух несцепленных фрагментов ДНК. Возможность применения такой системы обусловлена еще и тем, что поиск трансформантов, несущих одновременно две Т-ДНК, одна из которых не содеркит селективного маркера, может быть легко осуществлен с помощью метода полимеразной цепной реакции, получившего широкое распространение в последние годы.

Цель работы • 1. Оценка эффективности трансформации хлопчатника штаммом ЛЛшвеГас1еп5 А231 по сравнению с широко применяющимся штаммом ЬВА4404. г. Определение положения онкогенов 1 и бь ть-днк п-плазмиды Во542 штамма А281

«С«

относительно участков узнавания нёскбЛьких рестриктаз. з. Получение неонкогенного производного рТ1Во542, в котором область Т-ДНК, содержащая онкогены, заменена на химерный ген устойчивости к гагромицину В. 4. Подтверждение способности

полученной неонкогеяной ti плазмиды к одновременному переносу в растительный геном двух несцепленных Т-ДНК.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что штамм A. turnerас lens А281 вирулентен по отношению к хлопчатнику Cossyplurn hirsutum, и при этом эффективность трансформации штаммом A2S1 выше, чем штаммом LBA4404. Получены новые данные о расположении генов 1 и бь TL-ДНК относительно сайтов ВашН1, 5аЛ и Xbai. Сконструировано неонкогеыное производное рТ1Во542, которое может Сыть использовано в качестве помощника в специальной векторной системе. Она отличается от существующих тем, что растительный селективный маркер устойчивости к гигромицину В и остальные переносимые гены находятся на несцепленных между собой Т-ДНК. Такая зекторная система может быть использована для поиска и изучения последовательностей растительного генома, контролирующих экспрессию генов. Кроме того, предлагаемая система может оказаться полезной в биотехнологической практике для получения трансгенных растений с минимальными фрагментами чужеродной ДКК.

.Апробация работа. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пушгно. 1990; на I Всесоюзном симпозиуме "Норне методы биотехнологии растений", Пиино, J991; на семинаре отдела рекомбинантных ДНК Института молекулярной биологии РАН; на заседании коллоквиума центра "Биоинженерия" РАН.

Структура и. объем диссертации. Диссертация состоит из введения,, трех глэе, вызодое и списка литературы. Она изложена 'на страницах, содержит рисунков и

библиогра^ичесюй список из названий.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНКЕ РАБОТЫ

1. Трансформация хлопчатника при цомоп^к штамма А281

ilh'kMM A2S1 (Sciaky at al, 1070) СПОСОбеН ВЫЗЫВЭТЬ

опухоли с большей частотой к у большего числа видов растений, чем рад штаммов с широким кругом хозяев, тагах.,

как Ао, Т37, ¿208, Ас'пй ¡An et al, 1935; Kood et ai, 1986b;

Kobbs et ai, I9S9). Вирулентность штамма A231 была оценена

ранее в сравнении с другими штаммами по размерам индуцируемых опухолей (Hood et ai, 1986). мы хотели оценить частоту трансформации А281 по сравнению с широко используемым разоруженным штаммом L3A4404 (Hoekema et al, 1983) по количеству возникающих в результате трансформации устойчивых к канамицину клонов растительных клеток. Для этого в штаммы А281 и LBA4404 были перенесены бинарные векторы pBHOl. И pBI121 (Jefferson et al, 1987), НбСУЩИв В составе Т-ДНК химерный ген неомицивфосфотрансферазы II. В качестве растительного объекта был выбран хлопчатник (Gossypium ftirsutum L.), сорт 108Ф.

Трансгенные растения хлопчатника (Gossypium hlrsutmn L.) впервые были получены В 1987 Г. (Firoozabady et al, 1987; Umbeck et ai, 1987). Для трансформации с помощью A.tumefaciens были использованы как бинарная, так и интегративная векторные системы, причем эффективность обеих систем оказалась относительно низкой. 1.1. Трансформация ¿281, A281(pBI101) и А281(рВ1121).

Трансформацию проводили методом кокультивирования с A. tumefaciens - фрагментов семядольных листьев 12-дневных проростков.Поскольку в Т-ДНК pTiBo542 находятся 'гены биосинтеза фитогормонов, селекцию трансформированных тканей проводили на средах без фитогормонов. При использовании pBHOl и рВ1121 на средах, без фитогормонов с 25 мг/л канамицина происходил отбор двойных трансформантов, получивших как Т-ДНК pTiBo542, так и Т-ДНК pBHOl- или pBi 121. • Через 10 дней на краях эксплантов, которые кокультивировались с A.tumefaciens, появились опухоли диаметром.О,5-1 мм, тогда как на эксплантах, не обработанных суспензией агробактэрии, наблюдались лишь точки роста корней в зонах пересечения среза с сосудистыми пучками.

Через 3 недели было подсчитано количество точек роста на эксплантах . После кокультивирования с ¿281 и селекции на среде с агарозой без фитогормонов и канамицина на кавдом экспланте образовалось 5 и больше опухолей, причем на некоторых эксплантах наблюдались участки сплошного роста.

При трансформации А281(рВ1101)' и ¿281(рви21) при культивировании на среде без канамицина картина была схрдной, а на среде с 25 мг/л канамицина количество опухолей

снижалось примерно в 3-5 раз и рост их был несколько замедлен.

Определение активности неомицинфосфотрансферазы и

(Г!е1з2 et а1, .1984) ПОДТВврДИЛО ее НаЛИЧИв В СвМИ тестированных опухолях, полученных на среде с каламицином, и отсутствие в контрольных вариантах. Присутствие в геноме клеток тести устойчивых к канамицину опухолей гена неомицинфосфотрансферазы и было подтверждено также с помощью гибиридизации по методу Саузерна.

Таким образом, получены подтверждения того, что штамм А281 яьляется вирулентным по отношению к хлопчатнику, т.е. при заражении этим штаммом происходит перенос и интеграция в геном хлопчатника Т-ДНК из резидентной Т1 плазмиды и из дополнительной (бинарной) векторной плазмиды. 1.2. Сравнение эффективности трансформации шпаиши А281 и Ш4404.

Поскольку И-плазмвда штамма 1.ва4404 является "разоруженной", при использовании его в качестве компонента бинарной системы фрагменты семядольных листьев культивировали на среде для образования • каллуса, применявшейся ранее для гипокотилей (ТгоПЫзг, СоойХп, 1987) с 0,7 * 5 агарозы и фитогормонами: 2,4-дихлорофекоксиуксусной кислотой 0,1 мг/л и кинетинсм 0,5 мг/л. В результате переноса Т-ДНК рвП01 и рВ1121 при помощи штамма х.ва-нс4 были получены каллусы, растущие на среде с 25 мг/л канамицина. Образование каллусов на среде с фитогормонами и без канамицина происходило достаточно эффективно (сплошной рост по краю экспланта), но при селекции па канамицине было получено в среднем 0,4-0,5 точек роста на эксплант. При трансформации А231 на безгормональной ч, среде получали в среднем не менее 4,5 точек роста на эксплант, а при двойной селекции (на среде без фитогормонов с канамшшяом) - 0,9 для рвпо! и 2,0 для р31121.

При трансформации хлопчатника при помощи штамма 1.ВА4404 О использованием других фитогормонов (Р1гоо2:аЪас1у et а1, 1937) средкое количество каллусов на эксгшанте колебалось от 1,3 до 4,1, а в примечании авторы указывали, что в результате оптимизации условий трансформации можно было получить 6,8. В наштх экспериментах при трансформации А281

(селекция на среде оез фитогормонов и канамицина) наибольшее среднее количество точек роста на экспланте 8,5, причем это число занижено, поскольку ооширные зоны сплошного роста по краю экспланта подсчитывались как одна точка.

Таким образом, ¡птамм Д281 проявляет высок:,то вирулентность по отнояению к тканям семядольных листьев проростков хлопчатника. Данная система может быть использована для изучения промоторов генов хлопчатника в модельных условиях - в недифференцированной ткани опухолей. Но для успешной регенерации трансгенных растений необходимо, чтобы из Т-ДНК рТ1Во542 были удалены гены, нарушающие гормональный баланс растительной клетки (онкогены). 2j_ Исследование структуры Т-ДНК рТ1Во542

Ко времени начала данной работы уже была получена рестрикционная карта pTiEo542 (Hood et al, 1984, 1986; Komari et ai, 1986) и определены фрагменты, содержащие пограничные последовательности Т-ДНК (Hood et al, 19S6). Было показано, что часть гена 1, связанного с биосинтезом ауксина, расположена в пределах sail фрагмента 12а длиной 4,6 т.п.н. (Komari et ai, 1986). Кроме того, была известна нуклеотидная последовательность ВавН1-Н1пйЗ фрагмента длиной 1,9 т.п.н., содержащего ген 4, который кодирует фермент биосинтеза штокишша (strabaia et ai, 1989). Мы хотели уточнить положение гена 1 относительно сайтов вапш и Sali и гена 4 и определить положение гена бъ, функции которого связаны С регуляцией гормонального баланса (Spanier et al, 1989; Tinland et al, 1989).

Для определения положения генов 1 и бъ были синтезированы меченые зонды на фрагментах Т-ДНК октопиновой плазмиды pTiAch5. рестрикционная карта рТ1АсЬ5 опубликована ранее (cieien et ai, 1984). Зонд 1 был синтезирован на фрагменте ншаз-Крт, содержащем 3'-область гена 1, межгенный участок между генами 1 и 4, полностью ген 4 и часть межгенного участка между генами 4 и 6а. Зонд 2 был синтезирован на фрагменте Hlnd3-Bg-22; он представляет собой начало зонда 1 и лежит внутри гена 1. Зонд 3 включает около 150 нуклеотндов с конца ßsal фрагмента и представляет участок между генами 1 и 4. Зонд 4 синтезирован на фрагменте Smai-Psti " и представляет собой 5'-область гена бь и

С BCD

Ркс.1. Определение гомологичных салонов Т-ДНК pTiBc542 к pTiAchS той помощи гибридизаций по методу " Саузерна. Гибридизация с зондами: а - зонд 1, в - зонд 2, с - зонд 3, D -"зонд 4. 1 - ДНК фага х, расщепленная Н1мз и меченная по концам,- 2 - ДНК А231, расщепленная BamHi; з - ДНК А281, расщепленная Sali; 4 - pG?020i, содержащая фрагмент tl-ДНК pTiAch5 , расщепленная Hind3 и Kpni; 5 - клон, содержаний ВаиН1 фрагмент 10 pTiBo542, расщепленный Xbai; 6 - pGV020i, расщепленная Pvu2 Слева указаны размеры фрагментов, т.п.н.

предшествующий ему нетранскрибируемый участок.

Результаты гибридизации этих зондов с ДНК А281, расщепленной рестриктазами BamHi и Sali, представлены на рис.1. С зондом 1 гибридизуются BamHi фрагменты 5, 10, 34ь и SalGi фрашенты 12а и 23ь (обозначение фрагментов из работы копал et al. 1986) (рис.1АЬ Sali фрагмент 12а гибридизуется значительно слабее, чем Sail 23ь. с зондом 2 гибридизуется БавН1 фрагмент 5; Sail фрагменты 12а и 23ь, причем 12а значительно слабее, чем 23ъ, как и с зондом 1 (рис. 1В). С зондом 3 гибридизуется ВаиН1- фрагмент 10 и Sali фрагмент 23ь (рис. 1С). По данным, полученным ранее в результате гибридизации с зоцдами из Т-ДНК' pTiAG iKomari et ai, 1986),часть гена i находится в Sali фрагменте 12а. По нашим данным, з'-область гена i находится в соседнем Saici фрагменте 23ъ. Таким образом, Sali сайт мезду 12а и23ь находится в гене l • Наши данные о расположении межгенного участка мезду генами 1 и 4 совпадают с опубликованными данными О расположении гена 4 (Strabala et al, 1989).

EamHi фрагменты 5 и 10. были нами клонированы в przi9R (Uead et al , 1986). Эти фрагменты содержат почти всю "П.-ДНК, за исключением'фрагмента длиной 450 H.n.<Hood et al, 198ба; Ко mari et al, 1986), КЛОН, содержащий BàoHl фрагмент 10, был расщеплен Xbai. При этом вырезается часть BamHi фрагмента 10, расположенная левее сайта Xbai, а часть, расположенная правее, составляет вместе с вектором фрагмент длиной 8 т.п.н. Полученные фрагменты- гибридизовали с зондом 4, синтезированном на фрагменте гена 5ь' (рис.Ю). Показано, что соответствующая часть гена бъ находится на BamHi. фрагменте 10 правее сайта Xbal. Общая схема расположения гомологичных* использованным зондам участков Т-ДНК представлена на рис.2.

Результаты гибрвдизации свидетельствуют о высокой степени гомологии соответствующих районов Т-ДНК рТ1Во542 и pach5. з. Конструирование неонкогенного производного рТ1Во542

После определения положения генов 1 и бь, клонированные фрагменты Т-ДНК были использованы для конструирования "разоруженного", производного pTiEo542. Для этого мы использовали общий подход, разработанный ранее < Van Haute et al. 1983). Сначала была сконструирована

и

Xba1

BamHi 5 34 10

11,5 т.п.н. 7,5 m. п.н.

Sail 12а 23b

4,6 т.п.н. 2,8 т.п.н.

Рис.2. Схема располскения гомологичных использованным зондам участков Т-ДНК рТ1Во542. сверху ■ прямоугольниками отмечены зонды (объяснения в тексте). Внизу изображен участок рестрикционной карты рТ1Во542, полученной ранее {Hood et al, 1984; Kocarl et al, 1985), ¡1 указаны HOMepa фрагментов и их длина.

промежуточная ппазмида pCBEii. в ее составе находятся два ' фрагмента рТ1Во542, содержащие пограничные

последовательности П-ДНК и не содержащие онкогенов. Эти фрагменты ориентирозаны по отношении друг к другу так те, как в рТ1Во542. Между ними находится растительный селективный маркер устойчивости к гкгромицину. pCBEi 1 несет также бактериальный селективный маркер устойчивости к канамипину, расположенный за пределами Т-ДНК. TL-ДНК рТ1Во542 была замещена затем Т-ДНК pCBEii с помощью гомологичной рекомбинации, зл. Конструирование pCBEi 1

Чтобы получить фрагмент, содержащий правую пограничную последовательность И-ДНК и не содержащий гена бъ, были сделаны делении с помощью экзонуклеазы ВаШ. Стартовой точкой для обработки BaI3i послужил сайт Xbal BamHl фрагмента 10 рТ1Во542 (Hood et al, 1986а; Komari et al, 1986). схема клонирования фрагментов, содержащих делению гена бъ, представлена на рис.3. Во всех полученных клонах

" о

вставка гисриднзовалась с зондом 4, поэтому один из клонов был попользован для повторной обработки 35131. Была полвека вторая серия делений фрагмента т-днк, содержащего правую пограничную последовательность. С помощью гибридизации по Саузерну был определен клон, в котором отсутствовал ген бъ, но сохранился участок, содержащий, по литературным данным (Hood et al, 19S6), правую пограничную последовательность tl-лнк. Этот клон был использован для конструирования рсвЕИ, предназначенной для замещения tl-днк рТ1Ео542 .

Химерный ген гигромпшшфосфотрансферазн <hph> был сконструирован следующим образом. pBI221 (Jefferson et al, 1987) , была расщеплена ЕсоРЛ и после достраивания конпое лигирована с Hlnd3 линкером. Полученная плазмида была расцеплена xbal и sstl для того, чтобы удалить ген gus. SamHl фрагмент, содержащий ген ftpil (Grits and Davles, 1983), был клонирован в pTZi9R, вырезан с помощью Xbal и Sstl и лигарован с вектором, полученным из pbi22i. Таким образом,

X X Е

ВашН1 10

Е

3 I

4 I

Н Н НЕ

| I 1-|

Рис.з. Схема клонирования фрагментов, содержащих делецию Гена 6Ъ. ЕатН1 10" - ЕатгЯ! фрагмент 10"рТ1Во542, клонированный в ртаэн. Цифрами обозначены следующие манипуляции: 1 - расщепление ХЬа1, 2 - обработка нуклеазой £а!31, з - расщепление ЕсоШ, достраивание "концов с помощью фрагмента Кленоза, фракционирование в агарозном геле, 4 -лйгирование с рТ219й, расщепленной 5та1. Обозначены сайты для следующих рестриктаз: е - £соЕ1, н - НШйЗ, x - хьа1

мы получили ген hph с 35S промотором вируса мозаики цветной капусты и терминатором гена нопалинсинтазы (nos), расположенный на Hlnd3 фрагменте, клонированном в puci9

(Yanisch-Perron et al, 1985). Наша КОНСТРУКЦИЯ СОДерЖИТ ГвН

hph с полностью сохраненной последовательностью дикого типа

(Gritz and Davies, 1983). АНЭЗЮГИЧНаЯ КОНСТРУКЦИЯ (pROBl ) была описана ранее (Biiang et al, 1991 ), но был использован сайт полиаденилирования CaMV 35s. При сравнении результатов трансформации протопластов табака pROBt- и теми конструкциями, где кодирующая область была изменена на 3' конце, было показано, что уровень устойчивости, обусловленный геном с немодифицированной

последовательностью, выше. В частности, по сравнению с pROBl снижение количества устойчивых каллусных клонов табака было отмечено при использовании pLG2, хотя pLG2 успешно применялась ранее для трансформации, например, арабидопсиса и риса. Показано, что играет роль не длина, а состав С-конца полипептвда, причем снижают активность замены, нарушающие гидрофильный характер С-конца, Сохранение последовательности С-конца в нашей конструкции позволяет рассчитывать на получение высокого уровня устойчивости у трансформированных растительных клеток.

Для получения промежуточной плазмиды рСЕЕП в векторе pT2i9R были последовательно клонированы следующие фрагменты--Hind3-BamHi фрагмент Тп5, содержащий ген неомицинфосфотрансферазы il ; BamHl-EcoRi фрагмент длиной 4 т.п.н., содержащий правую- пограничную последовательность TL-ДНК рТ1Во542; ВашН1~ХЬа1 фрагмент рТ1Во542 (субфрагмент BamHl фрагмента 5), ■ содержащий левую пограничную последовательность TL-ДНК рТ1Во542 (Hood et al, 1986); Н1ПЙЗ фрагмент, содержащий химерный ген

гигромицинфосфотрансферазы. В полученной плазмиде ориентация левой и правой пограничных последовательностей друг относительно друга соответствует той, в которой они находятся в исходной рИВо542. Структура рСВЕП представлена на рис.4.

3.2. Конструирование рСВЕ21

Для конструирования производного рТ1Во542 мы использовали Общий ПОДХОД, разработанный ранее (Van Haute et

з.1, 1933), но днк плазмиды рСВЕИ оыла введена в клетки А. 1шЕеГао1епз путем трансформации, а не конъюгации. Общая схема конструирования рсв£21 ^приведена на рис.5. рСВЕИ, несущая ген устойчивости к канамишшу, не способна реплицироваться в А.гшаеГас1еш. После трансформации клеток

ВашН1 ВатН1 ВашН1

I

ц____•

Рис.4. Структура области рсвеп, использованной для гомологичной рекомбинации с рТ1Во542. - фрагмент,

содержащий левую пограничную последовательность тх-днк рт1во542; ев - фрагмент, содержащий правую пограничную последовательность п.-днк рТ1Во542; пво - ген неомицинфосфотрансферазн II; ЬрЬ - ген гшфомшшвфосфотрансферазы; зэб - 35Э промотор вируса мозаики цветная капусты; поз - терминатор' гена нопалинсинтазы. Пограничные последовательности Т-ДНК обозначены треугольниками.

АЛитеГаавпя рСВЕП стабильные трансформанты, устойчивые к канамицину, могут быть получены только в случае, если после переноса плазмиды произойдет гомологичная рекомбинация, которая приведет к интеграции рсвеп в рТ1Во542. Следующий акт рекомбинация во втором гомологичном районе приведет к потере исходной "П—днк рПВо542, которая будет заменена модифицированной Т-ДНК из рСВЕП, содержащей химерный ген устойчивости к гигромицину В. Остальная часть рсвеп будет утрачена вместе с * "дикой" Т-ДНК, что приведет к потере устойчивости к канамицнну.

Для оценки частоты трансформации кошетентных клеток А.£ивеГас1еп5 , била использована шаамида рВШ9 (Ввуап, 19в4) длиной 10 т.п.н., способная реплицироваться в А.(иоеГас1еп5 ж несущая маркер устойчивости к канамицину. Для рВ1Ы19 частота трансформации составила 5Х102 на мкг ДНК, и мы сочли эту частоту достаточной для получения коинтегратов рСВЕП И рТ1Во542.

neo

pCBE11 _ HYQ

ИИЕК

с

pT¡Bo542

1 1

neo

neo

йю.5. Замещение области Т-ДНК pTiBo542, содержащей онкогены, химерным геном устойчивости к гигромицину путем гомологичной рекомбинации. neo - ген неомицинфосфотрансфёразы II из Тп5, служащий селективным маркером устойчивости к канамицину; hyg - химерный ген устойчивости к гигромицину; onc - область Т-ДНК, содержащая онкогены. Заштрихованными прямоугольниками обозначены области гомологии. 1 и 2 - первый и второй акты рекомбинации соответственно.

pCBEi 1 и pTiEo542 имеют два участка гомологии длиной 5,5 и 4 т.н.п. После трансформации рСВЕП устойчивые к канамицину клоны были получены с частотой 2 на мкг ДНК рСЕЕп. Если предположить, что частота переноса pBiNi9 и рСВЕП одинакова, то частота рекомбинации составит 4х10_3 или 0,4х1СГ6 на н.п. участка гомологии, что совпадает с полученной ранее частотой 0,5х1СГ6 (Van Hauts et al, 1983). Мы получили 36 устойчивых к канамицину клонов. ДНК пяти клонов была расщеплена BamHl и проанализирована с помощью гибридизации по Саузерну (рис.6). Было показано, что ген hph содержится в 4 клонах (дорожки 3, 4, 5, 7) (рис.бА). Гибридизация с пробой, синтезированной на рСВЕП (рис.бв), показала, что структура района Т-ДНК отличается от исходной и возникли два типа структуры (дорожки 3,5 и 4,7), соответствующие рекомбинации по двум районам гомологии. При образовании клона 6 (дорожка 6) структура- рСВЕП была нарушена, и ген hph был утрачен. Клон 7 (дорожка 7) был использован для получения второго "акта рекомбинации.

Клон 7 вырастили в жидкой среде без канамицина и посеяли на агаризованную среду для получения единичных колоний. Эти колонии были использованы для поиска чувствительных к канамицину клонов. Из 2Х103 проверенных колоний 3 были чувствительны к канамицину. ДНК этих клонов была расщеплена BamHi и проанализирована с помощью гибридизации по Саузерну. Гибридизация с пробой, синтезированной на HlndS-Smal фрагменте TL-ДНК pTiAch5, содержащем гены 1, 4, 6а И часть 6Ъ (Gielen et al, 1984 ), показала, что у клона 1 (дорожка 10) соответствующий район отсутствует (рис.бс). Этот клон был обозначен СВЕ21. Клоны 2 и 3 (дорожки 8,9) получены в результате того, что второй акт рекомбинации произошел в том же участке гомологии, что и первый, что привело к восстановлению исходной структуры рТ1Во542. Гибридизация с пробой, синтезированной на фрагменте 35s-hph-nos, клонированном в puci9, подтвердила присутствие этого гена в рсве21 (рис.бЛ). Таким образом, рСВЕ21 представляет собой "разоруженную" pTiBo542, в которой онкогены TL-днк заменены на селективный маркер устойчивости к гигромицину В, способный экспрессироваться в растениях. Ранее уже был описан сконструированный на основе А281 штамм

1 2 3 4 5 6 7 kb

В

7 6 5 4 3 2 1 kb

Рис.б. Гибридизация по методу Саузерна рекомбинантных плазмид, расщепленных BamHi. i - оСВЕИ; 2 - тотальная ДНК А281; 3 - 10 - тотальная ДНК клонов Л. tume fac lens, полученных после гомологичной рекомбинации; 11 - Hlnd3 -Siiia 1 фрагмент tl-ДНК pTiAch5~. Справа указаны размеры фрагментов. А,В - анализ клонов, полученных после интеграции рСВЕП в pTiBo542; c.D - анализ клонов, полученных после второй рекомбинации. Гибридизация с зондами, соответствующими: А, кодирующей области гена гигромшшнфосфотрансферазы; В, рСВЕП; с, Hinc¡3-Smal фрагменту pTiAchS; d, химерному гену

гигромшшнфосфотрансферазы, клонированному в puci9. Гибридизацию D проводили с пробой, меченной биотином.

iô

ЕНД.101 (Hood et al, 1986b), КОТОрЫЙ бЫЛ усПвШО ИСПОЛЬЗОВаН ДЛЯ трансформации ряда ВИДОВ (Lülsdorf et al, 19S1; Could et al, 1991, 1992). При С03ДЭНИИ ЭТОГО ШТЭММа из рТ1Во542 была

удалена область, содержащая как TL-, так и tr-днк. Поскольку было показано, что фрагмент tr-днк повышает вирулентность разоруженного штамма (Hood et al, 1986), мы полагаем, что в случае рСВЕ21 уменьшение размера делегированной области по сравнению с pEhaioi будет способствовать более полному сохранению супервирулентного фенотипа. Кроме того, мы рассчитывали, что штамм СВЕ21 можно использовать в качестве помощника с бинарным вектором, в Т-ДНК которого отсутствует растительный селективный маркер. В таком эксперименте селекцию трансформантов можно проводить на среде, содержащей гигромицин В, а затем поиск трансформантов, несущих вторую Т-ДНК. осуществлять,, например,• с помощью метода ПЦР.. Поскольку две Т-днк не сцеплены мзхду собой, при скрещивании несущего их трансформанта с нетрансгенным растением они будут сегрегировать в потомстве, и можно будет получить трансгенные растения с минимальным фрагментом чужеродной ДНК, не несущей маркеров устойчивости к антибиотику. Такая система полностью .удовлетворяет требованиям биологической безопасности, предъявляемым к трансгенным растениям, выращиваемым в условиях открытого грунта. Чтобы показать пригодность для такого эксперимента сконструированного нами штамма, в качестве модельного объекта для трансформации был взят табак (Nlcotlana tabacum I.).

3.3. Трансформация табака (Nlcotlana tabacum I.) с тюлащью ■ таяла СВЕ21

Бинарный вектор для трансформации растений был сконструирован следушим образом. Ген

фосфинотрицинацетилтрансферазы ( bar ), обуславливающий устойчивость к гербициду фосфинотрицину, был предоставлен Л.Падегимасом (Центр "Еиоинженерия" РАН). Hlnd3-EcoRi фрагмент длиной 1,2 т.н.п., содержащий промотор 35S, ген bar и терминатор nos, был пере клонирован в вектор pUON505 (Horsch, Klee, 1986), раСЩвПЛеШШЙ Hindi И EcoRl. pl!ON505 В составе т-днк содержит ген неомицинфосфотрансферазы и (npt ) с промотором и терминатором nos. Полученной ■ плазмидой

Рис.7, "структура бинарного трансформирующего вектора pMON505:: bar. RK2 - фпаГМВНТ ПЛЭЗМВДЫ С ШИрОКИМ КРУГОМ хозяев RK2, содержащий сайты инициации репликации и переноса; or1322 - фрагмент, содержащий сайт инициации репликации pBR322; rb - правая пограничная последовательность Т-ДНК pTiT37; nos рТ1Т37 - ген нопалинсинтазы рТ1Т37; Tn7 Spc/StrR - фрагмент ИЗ Тп7, содержащий ген устойчивости к спекгиномицину/стрептомицину; npt - химерный ген неомицивфосфотрансферазы и с промотором и терминатором гена нопалинсинтазы Т-ДНК, кодирующий в трансформированных клетках растения устойчивость к канаыицину; bar - химетаый ген

фосфинотрицинацетилтрансферазы. Стрелками указано направление транскрипции.

(рис.7) был трансформирован штамм СВЕ21. Присутствие PMON505::bar в полученных клонах было подтверждено с помощью гибридизации по Саузерну . Один из клонов был использован для трансформации листовых дисков N.tabacuia.

После кокультивирования с агробактерией селекцию регенерантов проводили параллельно на средах с гигромицином и канамицином. ДНК из полученных укоренившихся растений была проанализирована с помощью ПЦР. Для генов npt и bar оба праймера были расположены в кодирующей области, а для гена hph один праймер был расположен в промоторе 35s, а другой в кодирующей области. Размеры соответствующих этим праймерам фрагментов составляли для npt 173 н.п., bar - 447 н.п., hph

517— 345

M 1 2 3 4 5 6 7 9 - + M 810 - +

I3ÍI '-У*Î-. -s» j

H^t'i:': «S^r;/)^;

, rW. \ .. .'èv,

-392

517— 345—

В

Ml 23'4 5679 - + M810 — +

/

— 447

M 1 2 3 4 5 6 810 — + M 7 9 — +

— 173

Е

11 13 15 16 18 19 20 21 22 - + 27 +

— 392

М 13 15 16 18 - + М 11 19 20 21 22 27 - +

Рис. 8. Электрофореграмма продуктов полимевазной цепной реакции (ПНР) "с праймерами, специфичными к: А," Е - гену hph, 5, f - гену bar, с, й - гену npt. А, В, С - тестирование растений , полученных на среде с гигрсмицином; d, е, f -тестирование растений, полученных на "среде с канамищшом. Сверху указаны" номера тестируемых растений, м - ДНК плазмиды ptzi9r, расщепленная Mini 1 и использованная в качестве маркера; "- - ПЦР в присутствии ДНК ^трансформированного растения; + - ГШР в присутствии ЯНК A.tuicefaciens СЕЕ21 (pHCN'505;; bar). Слева указаны длины фрагментов маркера, справа - фрагментов, синтезированных в ходе Ш?, т.п.н*.

L'O

- 292 н.п. При тестировании с праймерами для hph десяти растений, полученных на среде с гигромишшом, фрагмент ожидаемой длины был получен у всех 10 растений (рис.8А). с праймерами для bar соответствующий фрагмент получен у 5 из этих 10 растений (2, 3, 4, 7 и 9) (рис.8В). Для тех же 5 растений получен положительный сигнал и при тестировании с праймерами npt (рис.бс). Таким образом, при использовании данной векторной системы с большой частотой появляются растения, несущие две Т-ДНК.

Чтобы сравнить частоты переноса этих двух Т-ДНК, при помощи ПЦР были тестированы и растения, полученные на среде с канамицином. С праймерами для npt у 9 из 10 тестированных растений получен фрагмент ожидаемой длины ( рис.8П) Одно растение (15), вероятно, является ^трансформированным. При ' использовании в качестве селективного маркера npt, нетрансформированные растения, преодолевающие селективный барьер, появляются довольно часто (Horsch et ai, 1988). Как показало тестирование с помощью праймеров Jiph (рис.8Е), среди 9 растений, несущих ген npt, 5 растений (16, 19, 21, 22, 27) несут также и ген hph, то есть в составе кх генома оказались обе Т-ДНК.

Частоты переноса этих Т-ДНК, насколько их можно оценить по таким небольшим Еыборкам, оказались сходными (5 "двойных" трансформантов среди 10 растений, полученных на среде с гигромицином, и 5 "дв.ойных" трансформантов среди 9 растений, полученных на среде с канамицином).

Интересно, что для растений, полученных на среде с канамицином и несущих ген npt, при тестировании с праймерами bar ожидаемый фрагмент получен только у 3 из 9 растений (pnC.8F). Можно предположить, ЧТО Т-ДНК pMON505::bar переносится в некоторых случаях не полностью, и ген bar, расположенный дальше от правой пограничной последовательности, чем npt, оказывается поврежденным. Подобные явления неоднократно описаны, и могут- быть связаны, в частности, с -наличием в составе Т-ДНК псевдобордероз, т.е. последовательностей, которые с более низкой частотой, чем пограничные последовательности, могут быть использованы при переносе Т-ДНК.

Таким образом, штамм СВЕ21 может быть успешно

использован в качестве помощника в бинарной векторной системе, в том числе и для получения трансформированных растений с несцепленными целевым геном и селективным маркером.

вывода

1. Показано, что штамм Agrobacterlum tumefaciens А281 вирулентен по отношению к хлопчатнику Gossypium hirsutum L. 108Ф. Частота трансформации хлопчатника' бинарным вектором при помощи, штамма А281 выше, чем при использовании штамма LBA4404.

2. Определено положение онкогенов 1 и бъ Т-ДНК рТ1Во542 относительно участков узнавания рестриктаз BanHi, Sail и ХШ.

3. С помощью двойной гомологичной рекомбинации область Т-ДНК рТ1Во542, содержащая онкогены, заменена на химерный ген устойчивости к гигромицину.

4. Показано, что полученная неонкогенная ti плазмида рсве21 не .препятствует регенерации нормальных растений из. трансформированных клеток табака Hlcotl&na tabacum I.

5. При трансформации листовых дисков табака рСВЕ21 способна переносить как собственную Т-ДНК. так и Т-ДНК бинарного вектора, при этом с высокой частотой появляются трансформапты, несущие обе Т-ДНК.

Автор благодарен Г.Е.Позмоговой и Л.Падегимасу (Центр "Биоинкенерия") за предоставление праймеров для тестирования растений с помощью полимеразной цепной реакции.

Результаты диссертации изложены в следующих статьях и докладах:

1. Ревеккова Е.В., Краев A.C., Скрябин К.Г. Тезисы Всесоюзной конференции "Нозые направления биотехнологии", Пуащно, 1990, с. 16.

2. Ревенкова Е.В.,_ Краев A.C.-, Скрябин К.Г. -Трансформация хлопчатника (Gossypium hirsutua I.) при помощи супервирулентного штамма Agro bacterium tuse íасlens A281.-Молекулярная биология, 1990, т.24, еып.4, с. 1017-1023.

3. Ревенкова Е.В., Дорохов Д.Б., Багян И.Л., Краев A.C., Скрябин К.Г. Тезисы i Всесоюзного симпозиума "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, 1991, с.36.

4. Ревенкова Е.В., Багян И.Л., Краев A.C., Скрябин К.Г. -Исследование структуры Т-ДНК плазмяды рТ1Во542. -Молекулярная биология, 1993, т.27, вып.1, с.1-7.