Анализ нарушений раннего эмбрионального развития и их коррекция с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов

Кошелева, Настасья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ нарушений раннего эмбрионального развития и их коррекция с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов
ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Анализ нарушений раннего эмбрионального развития и их коррекция с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов"

□03055386

На правах рукописи УДК 591.3:577.113

КОШЕЛЕВА НАСТАСЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ РАННЕГО ЭМБРИОНАЛЬНОГО

РАЗВИТИЯ И ИХ КОРРЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ

03.00.30 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -2007-

003055386

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой - профессор В.А. Голиченков)

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Мария Львовна Семенова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Татьяна Клеониковна Дубовая

кандидат биологических наук Дмитрий Александрович Исаев

Ведущая организация: Институт Биологии Развития РАН

Защита диссертации состоится 17 апреля 2007 года в 15 часов 30 минут

на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, д.1, корпус 12, Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " 16 " марта 2007 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, E.H. Калистратова

кандидат биологических наук '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Закономерности раннего эмбрионального развития активно изучают, начиная с 60-ых годов прошлого столетия, когда была разработана методика культивирования ранних эмбрионов in vitro [Biggers et al., 1965]. Высокая исследовательская активность в изучении доимплантационного периода развития млекопитающих связана не только с изучением фундаментальных закономерностей и познавательным интересом, но имеет большое медико-биологическое и социальное значение. Практические задачи этого направления исследований связаны с усовершенствованием методов искусственного оплодотворения, сохранением биоразнообразия и генофонда, племенным разведением сельскохозяйственных животных [Pope, 2000; Solti et al., 2000; Allen, 2005]. Проблема лечения бесплодия человека в настоящее время приобретает не только медицинское, социально-демографическое, но и экономическое значение. Результативность лечения бесплодия методами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от способности полученных ооцитов к оплодотворению in vitro и последующему развитию. Одним из отягчающих факторов при лечении бесплодия является возраст пациенток - после 30 лет резко снижается жизнеспособность эмбрионов и частота рождения детей после программы ЭКО [Templeton et al, 1996; Боярский, Василевская, J998].

Zheng et ai, 2005; Chandrakanthan et al., 2006], нарушает экспрессию импринтированных генов [Gardner, Lane, 2005; Исаев и др., 2005], снижает количество жизнеспособных и увеличивает число гибнущих и фрагментированных клеток в эмбрионах [Hardy, 1999]. Но в условиях культивирования in vitro трудно разграничить аномалии, вызванные условиями культивирования, и нарушения, связанные с генетикой объекта. Поэтому представляется актуальным исследование нарушений раннего развития, обусловленных генетикой объекта.

Качество развивающихся эмбрионов оценивают по ряду морфологических признаков, учитывающих степень фрагментации, форму и размеры бластомеров. Многие исследователи связывают нарушения раннего развития с апоптотической гибелью клеток в эмбрионах [Exley et а!., 1999; Van Blerkom et al., 2001; Jurisicova et al., 2003], поэтому перспективным представляется изучение возможности коррекции спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития путем воздействия на проапоптотические факторы. В последнее время для специфического блокирования экспрессии генов все чаще применяют антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (АсОДН), представляющие собой короткие дезоксирибонуклеотидные последовательности. АсОДН присоединяются к специфической мРНК, препятствуют трансляции и, следовательно, выработке белка (рис. 1). Эта технология дает возможность временно и направленно воздействовать нракшчески на любой процесс в клетке с высочайшей специфичностью, не затрагивая целостность генома. Создание препаратов на основе ангисмысловых олигонуклеотидов - одно из новейших направлений лекарственных разработок для лечения ряда заболеваний, например в онкологии [Mullen et al., 2004], для лечения гипертонической болезни [Phillips et al., 2005], аллергических расстройств [Ball et al., 2004], некоторых вирусных и бактериальных инфекций [Geller, 2005].

В связи с этим, изучение генетически обусловленных и индуцированных нарушений раннего развития эмбрионов млекопитающих и возможность их коррекции посредством обратимых воздействий является актуальным вопросом, как биологии развития, так и практической репродуктивной медицины.

Рис 1. Принцип действия антисмысловых

олигодезоксинуклеотидов (АсОДН)

Существует два основных механизма действия АсОДН. Первый, приводящий к деградации мРНК, связан с активацией РНК-азы Н, расщепляющей РНК в месте образования гетеродуплекса ДНК-РНК (РНК-аза Н присутствует в цитоплазме и в ядре клеток и в норме принимает участие в репликации ДНК). Второй механизм действия АсОДН останавливает трансляцию белка с молекулы мРНК за счет создания стерического препятствия для посадки и скольжения рибосомы

Цели и задачи работы. Целью явилось изучение генетически обусловленных и индуцированных нарушений раннего развития, исследование возможности их коррекции в культуре in vitro. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать генетически обусловленные нарушения раннего развития у мышей линий SAM.

2. Изучить нарушения раннего эмбрионального развития при проапоптотическом воздействии.

3. Изучить особенности раннего эмбрионального развития в условиях введения ксеногенных низкодифференцированных клеток в эмбрион.

4. Исследовать возможные токсические эффекты олигонуклеотидных последовательностей на эмбриональное и постнатальное развитие.

5. Изучить влияние ^модифицированных АсОДН на дифференцировку клеток.

6. Исследовать влияние ^модифицированных АсОДН к мРНК гена Harakiri (Hrk) на раннее эмбриональное развитие.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы спектр и динамика генетически обусловленных нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1, склонной к ускоренному старению. Впервые показано влияние проапоптотического агента блеомицина на раннее эмбриональное развитие в случае высокого уровня нарушений доимплантационного развития (SAMP1) и при нормальных репродуктивных показателях (ICR, C57B16/DBA). При введении в полость бластоцисты мыши ксеногенных низкодифферен-

ДНК 4 '

цированных клеток (нейральных и стромальных клеток костного мозга человека) показано их включение в состав как трофэктодермы, так и внутренней клеточной массы. Обнаружено отсутствие отсроченного действия немодифицированных олигонуклеотидных последовательностей на развитие, поведение и репродуктивные показатели мыши. Показано воздействие немодифицированных АсОДН на дифференцировку клеток на модели адипогенной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани в культуре in vitro. Выявлена возможность стабилизации адипогенной дифференцировки в культуре стромальных клеток жировой ткани с использованием АсОДН. Впервые установлено, что в случае индуцированных нарушений раннего развития, АсОДН к мРНК гена Hrk улучшают качество выживших эмбрионов.

Практическая значимость работы. Исследованные в работе генетически обусловленные (у линии мышей SAMP1) и индуцированные аномалии раннего развития могут быть использованы как модель нарушений развития эмбрионов человека в области вспомогательных репродуктивных технологий. Подобраны условия химеризации ранних эмбрионов, обеспечивающие эффективное включение нейральных стволовых и прогениторных клеток человека в состав внутренней клеточной массы бластоцист. Выявленное стабилизирующее влияние специфичных немодифицированных АсОДН на уровень адипогенной дифференцировки в культуре in vitro (снижение и поддержание на низком уровне количества жировых клеток) расширяет возможность использования этих соединений в клеточной терапии. Проведенное исследование эмбрионального и постнатального развития мыши после кратковременной экспозиции с немодифицированными олигонуклеотидами в доимплантационный период показало отсутствие немедленных и отсроченных токсических и тератогенных эффектов. Продемонстрировано, что культивирование доимплантационных эмбрионов в среде с олигонуклеотидами в дальнейшем не влияет на поведенческие и репродуктивные показатели взрослых животных. Также было показано положительное влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена Hrk мыши, на индуцированные проапоптотическим воздействием in vitro нарушения раннего развития. На основании полученных результатов разработан способ управления качеством ооцитов и эмбрионов и разработаны

композиции для добавления в среду культивирования ооцитов и эмбрионов (патенты РФ № 2281777 и № 2281778 от 20 августа 2006).

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научном семинаре кафедры эмбриологии Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова и на следующих конференциях: V Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2002); III всероссийской конференции с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научной конференции "Гистологическая наука в России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы" (Москва, 2003); XI международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии IT+ME 2003" (Гурзуф, Украина, 2003); VIII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004); Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005); конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты" (Москва, 2005); "Bioscience 2005: from genes to systems" (Glasgow, UK, 2005); 22th Annual Meeting of the ESHRE (Prague, Czech Republic, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них два патента РФ на изобретение.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю доценту М.Л.Семеновой и всем сотрудникам кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова. Автор глубоко признателен И.Н.Сабуриной, Е.Е.Захаровой, С.Ю.Залетову, В.В.Заевой, Р.А.Шафеи, И.И.Полетаевой и Е.Б.Яровой.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и сгруппированы в следующие разделы: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение экспериментальных результатов, обсуждение, заключение, выводы, список литературы и приложение. Работа содержит 32 иллюстрации (микрофотографии, графики и рисунки), 31 таблицу. Список цитированной литературы включает источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. Эксперименты были выполнены на мышах инбредных линий SAM (senescence-accelerated mouse): SAMP1 (senescence-accelerated mouse prone) и SAMR1 (senescence-accelerated mouse resistant), любезно предоставленных проф. Т.Такедой и проф. М.Хосокавой (Университет Киото, Япония). С 1995 года эти линии мышей разводят в виварии кафедры эмбриологии Биологического ф-та МГУ. В работе также использовали мышей линий СВА, ICR и мышей-гибридов C57B16/DBA, BALB/DBA. Объектом служили ранние эмбрионы мыши (от двухклеточной стадии до бластоцисты), плоды на стадиях 17.5 и 18.5сут. развития, мышата в возрасте 2-3 месяцев (табл. 1). В серии опытов на культурах клеток использовали культуры стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) человека. Материал был получен в хирургических отделениях городских больниц при плановых операциях с добровольного согласия пациентов.

Таблица 1. Общая структура исследования (эксперименты на животных).

Серии экспериментов кол-во животных кол-во эмбрионов линия животных

Изучение нарушений раннего развития in vivo 109 853 SAMP1

25 131 SAMR1

19 144 ICR

49 356 C57B16/DBA

51 358 BALB/DBA

Исследование спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития in vitro; влияние АсОДН к мРНК гена Нгк мыши 82 280 SAMP1

21 90 ICR

60 317 C57B16/DBA

Изучение раннего развития после введения ксеногенных клеток 53 339 СВА

Исследование влияния АсОДН к мРНК генов HRK, FASLhBAX человека на раннее эмбриональное развитие 131 623 C57B16/DBA

на постимплан-тационное развитие 110 плодов C57B16/DBA

на поведение и репродукцию 70 C57B16/DBA

94 F1 C57B16/DBA

Олигонуклеотидные последовательности. Поиск нуклеотидных

последовательностей мРНК генов НЯК РАБЬ, ВАХ, РРАЯу человека, а также гена Нгк мыши, осуществляли с помощью интегрированной базы данных N081. Вторичные структуры мРНК генов НЯК (СепеЮ: 8739), РАБЬ (СепеГО: 356)

В AX (GenelD: 581), PPARy (GenelD: 5468) человека и гена Hrk мыши (GenelD: 12123), а также АсОДН к данным мРНК были подобраны с использованием программы «Mmfold» для 37°С [Zitker,' 2003]. Специфичность подобранных АсОДН была проверена при помощи программы BLAST 2.2 (Basic Local Alignment Search Tool). В работе применяли немодифицированные АсОДН, синтез которых был осуществлен по нашему заказу ЗАО «Синтол», олигонуклеотиды были очищены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, обессолены и лиофилизированы.

Изучение спонтанных нарушений раннего развития. Для анализа спектра и динамики нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению, анализировали состояние доимплантационных эмбрионов на сроках 1.5, 2.5 и 3.5сут. На 18.5сут. развития у самок оценивали доимплантационную смертность по разности между количеством желтых тел и числом мест имплантации. Эмбрионы оценивали по морфологическому критерию и с использованием флуоресцентных красителей: бис-бензимида (3,2нмоль/мл, 30 минут, 37°С) - для маркировки ядер, красителей кита LIVE/DEAD (30 минут, 25°С) - для выявления погибших клеток. По морфологическому критерию эмбрионы разделяли на нормальные и имеющие аномалии развития. Группу с аномалиями развития подразделяли на подгруппы в зависимости от формы аномалии: фрагментация, дегенерация, остановка развития в период дробления, отставание в развитии, нарушения компактизации, нарушения кавитации.

Оценка влияния ксеногенных клеток на раннее развитие. Влияние ксеногенных низкодифференцированных клеток на раннее развитие и оптимальные условия включения клеток в состав бластоцисты оценивали на модели получения инъекционных химер по методу, предложенному Гарднером и Бринстером [Gardner, Johnson, 1975; Brinster, 1979]. Суспензии нейральных стволовых и прогениторных клеток (НСК) и мультипотентных мезенхимапьных стромальных клеток костного мозга (МСК) человека, меченые витальным флуоресцентным красителем бис-бензимидом, были любезно предоставлены лабораторией новых клеточных технологий Института реабилитации и клеточных технологий им. А.Я.Фриденштейна. Использовали следующие суспензии клеток: свежие и после 24 часовой экспозиции при +4°С. Клетки суспендировали в растворе Хэнкса или в 10% растворе инфукола ГЭК, хорошо

удерживающем воду и способствующем сохранности суспензий. Состояние бластоцист и распределение введенных клеток оценивали через сутки после инъекции.

Культивирование эмбрионов мыши in vitro. Доимплантационные эмбрионы мыши культивировали со стадии ранней морулы (6-8 клеток; -2.5сут.) в течение 48 часов в среде Т6 с БСА. Для оценки спонтанных нарушений раннего развития эмбрионы мышей различных линий культивировали в среде без добавок. Химическую индукцию нарушений раннего развития осуществляли добавлением в среду антибиотика блеомицина (1мкг/мл). Для изучения влияния на частоту спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития, в культуральную среду добавляли АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотического гена Hrk мыши. Воздействие АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека, оценивали на эмбрионах мышей С57В16/СВА, подсчитывая долю эмбрионов с нормальной морфологией и долю бластоцист с хэтчингом от общего числа бластоцист. Все олигонуклеотидные последовательности добавляли в среду в концентрации 0,1нмоль/мл, подобранной ранее в нашей лаборатории [Захарова, 2006].

Трансплантация эмбрионов мыши и анализ постимплантационных стадий развития. Эмбрионы мышей C57B16/DBA на стадии бластоцисты после 48 часов культивирования с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов человека HRK, FASL и ВАХ (опытные группы) или без добавок (контрольные группы) трансплантировали псевдобеременным самкам белых беспородных мышей в количестве не более 7 эмбрионов в 1 рог матки. На 17.5 и 18.5сут. самок умерщвляли дислокацией шейных позвонков. По разности между количеством желтых тел и числом мест имплантации оценивали индекс имплантации эмбрионов, отмечали количество нормальных плодов и исследовали их состояние. У плодов выявляли аномалии внутренних органов и оценивали нарушения формирования скелета по стандартной методике [Neubert et al„ 1977]. Часть оперированных самок были оставлены до родов, в дальнейшем у полученных мышат оценивали поведенческие и репродуктивные показатели.

Оценка поведенческих показателей. Поведение животных исследовали параллельно в трех группах: (1) опытная группа - животные, полученные после трансплантации эмбрионов, которые культивировали в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK и FASL человека, (2) контрольная

группа - животные, полученные после трансплантации эмбрионов, которые культивировали в среде без добавок, (3) интактный контроль. Тестирование проводили в течение 6 дней на базе лаборатории физиологии и генетики поведения кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова под руководством д.б.н. И.И.Полетаевой. Общий уровень активности, исследовательского поведения, поведения страха-тревоги и склонность к депрессии оценивали в четырех тестах: "открытое поле", "скользкая воронка", "стартл-реакция" и в закрытом крестообразном лабиринте.

Эксперименты в культуре in vitro на клетках человека были выполнены на базе лаборатории новых клеточных технологий Института реабилитации и клеточных технологий им. А.Я.Фриденштейна под руководством к.б.н. И.Н.Сабуриной. В культурах СКЖТ на пятом пассаже визуально по количеству клеток с липидными гранулами в течение пяти дней оценивали спонтанную адипогенную дифференцировку. Параллельно ставили следующие серии культивирования: (1) культивирование в ростовой среде без добавок, (2) культивирование в ростовой среде с добавлением гепарин-зависимого фактора роста bFGF (2нг/мл), (3) культивирование в ростовой среде с добавлением bFGF (2нг/мл) и немодифицированных АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy человека (1нмоль/мл).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и SPSS 11.5. С использованием критериев Шапиро-Вилка и %2 Пирсона были проверены гипотезы о нормальности распределений исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших нормальное распределение, использовали t-тест для независимых выборок в предположении неравных дисперсий или однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Манна-Уитни или критерий Крускалла-Уоллиса. Для анализа таблиц сопряженности 2x2 применяли либо точный двусторонний критерий Фишера, либо критерий у? с поправкой на непрерывность Йейтса. Для выявления временных изменений использовали непараметрический критерий Фридмана. С использованием бинарной логистической регрессионной модели вычисляли отношение шансов наличия

определенного признака в двух сравниваемых группах. Критический уровень значимости для всех статистических критериев принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Спонтанные нарушения раннего развития v мышей лини» SAM. У мышей линий SAM с укороченной средней продолжительностью жизни отмечено снижение плодовитости [Miyamoto et al. 1995; Semenova et qf., 200!]. Мы исследовали Состояние донмплаитаиконных эмбрионов мышей линии SAMPI на разных сроках развития (1.5, 2.5 и 3.5сут.), охарактеризовав спектр генетически обусловленных нарушений раннего развития. Были обнаружены следующие формы аномалий: фрагментация и дегенерация (в течение всего доймплантащюнного периода), остановки развития в период дробления и нарушения компактизации (с 2.5сут.), нарушения кавитации (с 3.5 сут.), а также отставания в развитии (рис. 2).

ш т

# <*" 0 Е W Ж ' 3

с ,. ' i

Рис, 2. Морфология ¡морионов мышей линии SAMP1 in vivo

nti стадиях 1.5 (А, Б,Д), 2.5 (В, 3, И) и 3.5 (Г, Е, Ж, К-М) суток разлития

Нормальные эмбрионы. 2-ух (A i; 4-ex клеточные (Б); морули (В); бластоциста (Г). Нарушения уст него ¡хтнтия: остановки развития в период дробления (Д, Е) с фрагментацией бластомеров (Д); дегенерация (Ж); аномалии компактизации - два иентра компактизации (3. обозначены стрелками); компактизация из малого числа клеток (И); бластоциста с клетками, не участвовавшими в процессе компактизации (отмечены стрелкой, К); аномалии кавитации - бластоциста с малым числом клеток в трофэктодермё (Л); бластоциста с двумя полостями (обозначены звездочками, М).

Стадии 1.5 и 2.5сут. не различались по числу полученных от одного животного эмбрионов, а также по числу нормальных и аномальных эмбрионов (рис. 3). На 3.5сут., по сравнению с 1.5сут.; нарушения были зарегистрированы в большем числе случаев (р<0,000). В течение всего доим плантационного периода развития у мышей линии 8АМР1 примерно треть эмбрионов фрагментировалась и дегенерировала (рис, 3). На 3.5сут. по сравнению с 2.5сут. было обнаружено увеличение числа эмбрионов с остановками развития в период дробления (р<0,000). Данная особенность, вероятно, связана с накоплением ошибок при прохождении клеточных циклов, которые в бластомерах идут быстрее, чем в соматических клетках [Неуег е! а!., 2000].

1.5 суток развития 2.5 суток развития 3.5 суток развития

0 нормальные эмбрионы

Гу1 эмбрионы, отстающие в развитии

1 эмбрионы с фрагментацией

□ эмбрионы с нарушениями компактизации

Я дегенерирующие эмбрионы

_ эмбрионы, остановившиеся в П эмбрионы с нарушениями кавитации развитии в период дробления

Рис. 3. Распределение эмбрионов у с(шок мышей линии SAMP1 по морфологическим группам в доимплантационнмй период развития

В процессе компактизации у SAMP1 были отмечены следующие нарушения: компактизация не из 8-16 (норма), а из 4-5 клеток (рис. 2, И); появление нескольких центров компактизации (рис. 2, 3); компактизация, в которой не участвовала часть бластомеров {рис. 2, К). Аномалии в процессе кавитации были связаны с отсутствием внутренней клеточной массы (ВКМ), небольшим (1-3) числом клеток а трофэктодерме (рис, 2, Л), формированием нескольких полостей (рис. 2, М), образованием бластоцист из небольшого числа клеток с исключением и оттеснением на периферию отдельных бластомеров (рис. 2, К).

Цветная вставка I

Г \ W4r 1 "' • • « А * г. * в ♦ г

Д гГ * s Е ж 3

Рис, 4. Морфология ядер ранних эмбрионов мышей линии SAMPJ после окрашивания бис-бензимидом (красителем Хехст 33258)

Интерфазные и метафазное (звездочка) ядра в бластоцисте (А, Б); сперматозоиды на поверхности блестящей оболочки морулы (В, Г): ядра с пристеночной конденсацией хроматина в бластомере (стрелка) муральной трофэктодермы бластоцисты IД, Е); дегенерирующее редукционное тельце с пикнотическим ядром (стрелка) (Ж, 3)

<3 А > Б >Щ Х^*" / в г

д Е № Г.1 Ш ж Км 3

« , к 0 Ф л м

Рис. 6. Нарушения коми актизац и и и кавитации после культивирования с блеомицином эмбрионов мышей линий ICR (А -3) и SAMP1 (И-М)

Бластоцисты с кавитацией т малого числа клеток (А, В, Ж, И, К), красителем кита LIVE/DEAD окрашены отдельные погибшие клетки, не участвовавшие в компактизации (Б, Г, 3); звездочками отмечены живые клетки, не участвующие в развитии и находящиеся в полости эмбриона (Ж, К); бластоциста с двумя ВКМ (Л, стрелки): бластоциста с двумя полостями (звездочки, М): эмбрион с нарушением компактизации и кавитацией единичных бластомеров (Д, Е)

Цветная вставка 2

1) вариант:

клетки не вошли в состав бластоцисты

2) вариант:

клетки в трофэктодермс бласто цисты

3) вариант:

клетки в грофэктодерме и ВКМ бластоцисты

Рис. 8. Распределение клеток человека (красным) в бластоцистах мыши через 24 часа после инъекции; ВКМ - внутренняя клеточная масса

Рис. 9. Бластоцисты мыши через 24 часа после инъекции свежей суспензии МСК человека в растворе Хэнкса

Бластоцисты (А): инъецированные клетки и их потомки окрашены витальным флуоресцентным красителем бис-бензимидом - Хехст 33258 (Б); лишь некоторые инъецированные клетки окрашены красителем кита LIVE/DEAD, то есть погибли (В); у бластоцисты, отмеченной звездочкой, инъецированные клетки не окрашены красителем кита LIVE/DEAD, они сохранили жизнеспособность (В)

UptueAeHK среди не лючеию а 0.95 довсршиеяьныЛ нмнсрФЯЯ екм ijv&rtvo

Z-l часа 4S часов "2 чяся 96 часов 120 часов

Рис. 10. Динамика изменения количества адипоцитов в течение 120 часов кул ь тивировачия стромальных клеток из подкожной жировой ткани в среде вез добавок (1), с добавлением ЬГСР (2), или с добавлением ЬРСР и АсОДН, специфичных к мРНК гена РРАКу(З). Культуры пассировали в начале эксперимента (0 часов) и через 72 часа

Последнее может быть связано с отставанием исключенных из развития бластомеров по фазам клеточного цикла. В отдельных клетках муральной трофэктодермы нормальных бластоцист были выявлены ядра с пристеночной конденсацией хроматина (рис. 4; цветная вставка 1). Подобные особенности отмечены и в ранних эмбрионах человека [Hardy et al, 2003], что указывает на сходство генетически обусловленных нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1 и аномалий раннего развития человека.

Оценка функциональной значимости выявленных нарушений была произведена путем сопоставления общего количества аномальных эмбрионов, обнаруженных у мышей на стадиях 1.5, 2.5, 3.5сут. развития и доимплантационной гибели эмбрионов, определенной на стадии 18.5сут. Только на стадии 3.5сут. количество эмбрионов с нарушениями развития превышало количество эмбрионов, погибших в доимплантационный период (р<0,000). По-видимому, часть эмбрионов, попавших согласно нашей классификации в группу «аномалии развития», способна имплантироваться и развиваться дальше. Отставание по стадии и нарушения компактизации могут не влиять на формирование полноценных бластоцист [Bevilacqua et al., 1989].

При проведении сравнения раннего развития у мышей линий SAM (SAMP1 и SAMR1), ICR и гибридов независимо от линейных особенностей, на 2.5сут. были обнаружены одинаковые виды аномалий. В общей структуре аномалий развития во всех линиях преобладала дегенерация. Между линией ICR и гибридами не было выявлено различий в количественных характеристиках полученных эмбрионов, нормальных и аномальных (рис. 5). Это позволило произвести дальнейший анализ эмбрионов линий SAM, используя ICR в качестве контроля. Самки мышей линий SAMP1 и ICR не различались по общему количеству эмбрионов и по количеству нормальных эмбрионов, но число аномальных эмбрионов у самок SAMP1 и SAMR1 было повышено (р<0,005 и р<0,001, сравнение с ICR). Самки SAM не отличались от ICR по количеству эмбрионов, остановившихся в период дробления и фрагментирующихся эмбрионов, но у них было увеличено количество дегенерирующих эмбрионов (р<0,012 - SAMP1; р<0,039 - SAMR1). После культивирования in vitro у эмбрионов всех проанализированных линий мышей были выявлены все виды нарушений развития, обнаруженные in vivo.

Таким образом, для мышей линий SAM характерен генетически обусловленный высокий уровень нарушений развития эмбрионов в

дои.мплантационный период, как in vivo, так и после культивирования in vitro. Нарушения компактизации, обнаруженные у мышей линии SAM I' 1 in vivo и после культивирования in vitro полностью соответствуют одной из систем оценки качества эмбрионов человека [АН кап i el al., 2000]. Эмбрионы мышей линий SAM могут быть использованы, как модель нарушений развития эмбрионов человека в области вспомогательных репродуктивных технологий.

.44 MP) SAMR1

2,1% 12,3%

32.5%

36,7%

„ . „ 4,4% í¡ALB/DBA

2,3%

46,6%

|~| нормальные эмбрионы

ЕЕ эмбрионы с фрагментацией

Щ дегенерирующие ^морионы

эмбрионы, остановившиеся в ратштш а период дробления

Рис. 5. Распределение эмбрионов у самок мышей разных линии по морфологическим группам па 2.5 сутки развития in vivo

Нарушении раиною эмбрионального развития v мышей psmn.ix линий in vitro при нрошшн п> гичсскчш попепствпи Эмбрионы мышей с изначально высоким (SAMPI) и низким (ICR, C57BI6/DBA) уровнями нарушений раннего развития культивировали in vitro в среде без добавок (контроль) и с добавлением антибиотика блеомицина (опыт). Блеомицин обладает выраженным нитогоксическим действием, связанным с разрушением ДНК и индукцией апоптотической гибели клеток [Wingard et al., ¡99/]. В опыте как у эмбрионов мышей SAMP1, так и у ICR и гибридов наблюдали описанные выше варианты аномалий процессов компактизации и кавитации, отмечали гибель исключенных из развития клеток (рис. 6; цветная вставка I). Независимо от линии мышей добавление блеомицина увеличивало количество нарушений

развития, а доля нормальных эмбрионов уменьшалась; (рис. 7). Однако в спектре аномалий у SAMP1 преобладали аномалии процессов компактизации и кавитации (р<0,008 и р<0,000, сравнение с контролем), у ICR возрастало количество отстающих в развитии и дегенерирующих эмбрионов (р<0,019 и р<0,009, сравнение с контролем), у C57BI6/DBA увеличивались нарушения компактизации и дегенерация (р<0,001 и р<0,019, сравнение с контролем). Можно предположить, что при воздействии проапоптотического агента на эмбрионы линии мышей с исходно высоким уровнем генетических аномалий (SAMP1) нарушения развития в основном связанны с аномалиями морфогенетических процессов. А в случае воздействия проапоптотического агента на эмбрионы мышей с нормальными репродуктивными показателями гибель эмбрионов преимущественно связана с цитотоксическим действием блеомицина.

SAMPl

8,0% 2 3%

5.7%

23.9%|

КОНТРОЛЬ ICR

1,5% 77%-. 6,2%

С 57ВI6/D ВЛ

8.0%

3.1%

40.9%

34.0%

11.4%

8ЛМР1

22.7%

14.7%

ОПЫТ

8,0%

в 1.5%

ICR

С57 В ¡(¡/DBA

8,0%

24,0%

14.7%

16.7%

21,3%

36,0%

20,0%

8,0%

37,3%

5.3% 20,0%

Q нормальные эмбрионы IZ эмбрионы, отстающие е развитии

Щ эмбрионы с фрагментацией □ эмбрионы с нарушениями компактикщии

Ш дегенерирующие эмбрионы Q эмбрионы с наруи/енншги кавитации

Рис. 7, Распределение эмбрионов мышей разных линий по морфологическим группам после культивирования без (контроль) и е блеомицшшм (опыт)

Раннее развитие после введения в бластоцисты мыши ннзкодифферениированных клеток человека. В данной работе для получения инъекционных химер были использованы суспензии нейральных прогениторных и стволовых клеток (НСК) и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (МСК) человека. В целом, независимо от типа вводимых клеток через сутки после инъекции было отмечено три варианта их распределения в бластоцистах (рис. 8; цветная вставка 2). Инъекция в бластоцисты мыши ксеногенных низкодифференцированных клеток не влияла на жизнеспособность эмбрионов (рис. 9; цветная вставка 2). Включение инъецированных клеток в состав бластоцист зависело от типа клеток, а также от состава и условий хранения суспензий. Ни в одной из суспензий мы не обнаружили различий между МСК и НСК по частоте включения клеток только в состав трофэктодермы (вариант 2). При инъекции свежей суспензии клеток в растворе Хэнкса шанс включения в состав не только трофэктодермы, но и ВКМ (вариант 3) у МСК был в 5,09 раз больше, чем у НСК (р<0,035). Однако 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С или использование 10% раствора инфукола ГЭК уравнивали шансы НСК и МСК, не влияя на МСК, но увеличивая вероятность попадания НСК в формирующийся зародыш. НСК в большей степени, чем МСК экспрессируют белки клеточной адгезии [Campos, 2004; Yu, Yanagisawa, 2006]. Раствор инфукола, используемый для клинической инфузии, снижает агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, уменьшает высвобождение циркулирующих молекул адгезии [Гольдина, Горбачевский, 1998]. Возможно, в наших экспериментах применение 10% раствора инфукола и 24 часовая экспозиция при +4°С изменяли адгезивные свойства НСК, способствуя их дезагрегации и увеличивали вероятность встраивания этих клеток в состав ВКМ бластоцист.

Исследование эмбрионального и постнатального воздействия олигонуклеотидных последовательностей, добавляемых в среду при культивировании in vitro. В молекулярной медицине для генной терапии широко используют антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (АсОДН) [Зеленин и др., 1998; Kim et al., 2005]. Мы исследовали АсОДН, специфичные к мРНК генов HRK, FASL, ВАХ человека, контролем служили параллельные культуры без олигонуклеотидных последовательностей. Ни в одной из серий экспериментов не было выявлено достоверных различий между опытными и соответствующими им контрольными группами по количеству эмбрионов,

достигших стадии бластоцисты и по количеству бластоцист, прошедших хэтчинг. После трансплантации эмбрионов псевдобеременным самкам между контрольной и опытными группами не было обнаружено различий в индексе беременности, индексе имплантации и постимплантационной смертности. На 17.5 и 18.5сут. в опытных группах (87 плодов) не было обнаружено аномалий в состоянии внутренних органов и скелета; опытная и контрольная группы не различались по кранио-каудальным размерам плодов, массе и диаметру плацент. На 17.5сут. масса плодов в опытной группе с добавлением АсОДН к мРНК генов НИК и РАБЬ человека (0,78±0,18г) была больше, чем в контрольной группе (0,91±0,16г; р<0,047), но к 18.5сут. это различие исчезало. В дальнейшем был проведен анализ поведения мышат, полученных от суррогатных матерей после имплантации им эмбрионов опытной и контрольной групп. Мышата того же возраста, что и животные опытной и контрольной групп (2-3 месяца) составили группу интактного контроля. Нарушений поведения ни в одной из групп не было выявлено. В целом, зарегистрированные показатели поведения мышей опытной и контрольных групп находились в пределах вариации величин, свойственных лабораторным мышам [Магкта а а1„ 2001]. Животные опытной и контрольных групп не различались и по репродуктивным показателям.

Таким образом, результаты изучения последствий влияния АсОДН на ранние эмбрионы свидетельствовали об отсутствии немедленных и отсроченных токсических и тератогенных эффектов. Культивирование доимплантационных эмбрионов в среде с олигонуклеотидными последовательностями в дальнейшем не влияет на поведенческие и репродуктивные показатели взрослых животных.

Влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена РРАЯу. на адипогенную дифференцировку клеток, полученных из жировой ткани. Изучение эффектов антисмыслового ингибирования т \'Иго обычно осуществляют с помощью модифицированных устойчивых, но токсичных фосфотиоатных производных АсОДН \Baertschi, 1994]. Вопрос о возможности влияния немодифицированных АсОДН на дифференцировочные процессы остается открытым. Мы оценили влияние немодифицированных АсОДН, специфичных к мРНК гена РРАЯу, на формирование адипоцитов в культуре стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ). В полученной культуре СКЖТ клетки имели

фибробластоподобный фенотип, экспрессировали CD 105, CD90 и не экспрессировали CD45, CD34, CDllb. При культивировании СКЖТ была отмечена адипогенная дифференцировка, причем, в случае добавления bFGF, доля адипоцитов была выше, чем в среде без фактора роста в течение всего периода наблюдения (р<0,0002); после пассирования доля адипоцитов, независимо от присутствия bFGF, кратковременно увеличивалась (рис 10, 1,2, цветная вставка 2). Для подавления адипогенной дифференцировки в культурах СКЖТ к ростовой среде каждые 24 часа добавляли АсОДН, специфичные к мРНК гена PPARy. Ген PPARy кодирует один из ключевых транскрипционных факторов адипогенеза, регулирующий начальные этапы дифференцировки преадипоцитов [Gregoire et al., 1998; Floyd et al., 2006]. Через сутки после начала эксперимента доля адипоцитов в среде с bFGF превышала долю адипоцитов в среде без добавок (р<0,000). Добавление АсОДН в присутствии bFGF позволило уменьшить число адипоцитов (р<0,002, сравнение со средой с bFGF), уравняв их с числом адипоцитов в среде без добавок. Наблюдение за динамикой изменения адипоцитов в течение 5 суток показало, что доля адипоцитов колебалась в среде без добавок (р<0,000) и в среде с bFGF (р<0,000), а под действием АсОДН к мРНК гена PPARy этот показатель стабилизировался (рис. 10; цветная вставка 2).

Считается, что СКЖТ, обладающие способностью дифференцироваться в различные производные, в том числе и в адипоциты, являются перспективными кандидатами для аутологических трансплантаций [Трактуев и др., 2006]. Выявленное влияние специфичных немодифицированных АсОДН на уровень адипогенной дифференцировки в культуре in vitro (снижение и поддержание на низком уровне количества жировых клеток) расширяет возможность использования этих соединений в клеточной терапии.

Влияние АсОДН. специфичных к мРНК гена Hrk мыши, на динамику спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития. Последствия антисмыслового ингибирования проапоптотического гена Hrk были изучены с использованием моделей, для которых ранее нами был выявлен широкий спектр нарушений раннего развития - спонтанных или индуцированных. Моделью спонтанных нарушений явились мыши линии SAMP1, индуцированные нарушения провоцировали добавлением блеомицина. Добавление в культуральную среду АсОДН, специфичных к мРНК гена Hrk, не

повлияло на спектр и частоту генетически обусловленных нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1. Однако в серии с добавлением блеомицина и с дополнительной добавкой АсОДН к мРНК Hrk доля бластоцист от общего числа эмбрионов составила 11/70 (15,7%), шесть из них прошли хэтчинг, в то время как в среде с антибиотиком без АсОДН бластоцист было только 6/75 (8,0%), и ни одна не прошла хэтчинг (р<0,043). Итак, при химически индуцированных нарушениях доимплантационного развития добавление АсОДН к мРНК гена Hrk не влияло на количество нарушений, но улучшало качество выживших эмбрионов - увеличивало хэтчинг бластоцист.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для мышей линии SAMP1, склонной к ускоренному старению, характерен высокий уровень нарушений раннего развития. Наряду с фрагментирующимися и дегенерирующими эмбрионами у этой линии in vivo и in vitro в значительном количестве присутствуют эмбрионы, отстающие по стадии и остановившиеся в развитии, эмбрионы с нарушениями процессов компактизации и кавитации. Эти генетически обусловленные нарушения не поддавались коррекции с помощью АсОДН, специфичных к мРНК проапоптотического гена Hrk. Блеомицин - агент, индуцирующий апоптотическую гибель клеток, у мышей SAMP1 увеличивал количество эмбрионов с нарушениями компактизации и кавитации, не влияя на число дегенерировавших эмбрионов. Как правило, ошибки в раннем развитии вызывают гибель бластомеров или всего эмбриона, после воздействия блеомицина на эмбрионы мышей с нормальными репродуктивными показателями (ICR, C57B16/DBA) отмечалось увеличение числа дегенерировавших эмбрионов. Возможно, у мышей линии SAMP1 нарушены механизмы естественной элиминации поврежденных бластомеров и эмбрионов.

жизнеспособность эмбрионов. Включение инъецированных клеток в бластоцисты мыши зависело от типа клеток, а также от условий хранения и состава суспензий. Использование 10% раствора инфукола или 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С увеличивали вероятность попадания ИСК в формирующийся зародыш (ВКМ бластоцист), уравнивая их по этому показателю с МСК, возможно за счет изменения адгезивных свойств.

Широкую возможность корректирующего не затрагивающего целостность генома влияния на клетки предоставляют АсОДН [Зеленин и др., 1998; Киггеск, 2003]. В проведенном комплексном исследовании было показано, что немодифицированные олигонуклеотиды не обладают эмбриотоксическим и отсроченным тератогенным эффектами, в дальнейшем не влияют на поведение и репродукцию взрослых животных. В культуре in vitro на модели адипогенной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани было продемонстрировано влияние АсОДН на адипогенез. Полученный результат (уменьшение количества адипоцитов) показывает специфичность влияния немодифицированных АсОДН на дифференцировку клеток в культуре. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотического гена Hrk, улучшали качество эмбрионов мыши с индуцированными блеомицином нарушениями раннего развития. По-видимому, частичное подавление трансляции белка harakiri сохраняло целостность мембран митохондрий, препятствовало высвобождению проапоптотических факторов и предохраняло эмбрионы от токсического воздействия блеомицина.

Положительное действие АсОДН, специфичных к мРНК проапоптотических генов, на раннее развитие эмбрионов in vitro получило подтверждение в области вспомогательных репродуктивных технологий. Так АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотических генов HRK и FASL человека, улучшают качество эмбрионов человека и увеличивают частоту наступления беременности после культивирования ооцитов и эмбрионов в среде с добавлением АсОДН к мРНК генов HRK и FASL [Захарова, 2006, Семенова и др. 2006; Zaletov et ai, 2006]. Разработанная композиция для добавления в среду культивирования ооцитов и эмбрионов (патенты РФ № 2281777 и № 2281778 от 20 августа 2006) позволяет улучшать качество ранних эмбрионов.

ВЫВОДЫ

1. Родственные линии мышей SAMP1 и SAMR1 характеризуются высоким уровнем нарушений раннего эмбрионального развития как in vivo, так и при культивировании in vitro. Это выражается в аномалиях процессов компактизации и кавитации, отставаниях по стадии и остановках развития, фрагментации и дегенерации.

2. При воздействии проапоптотического агента блеомицина на эмбрионы линии мышей с исходно высоким уровнем генетических аномалий (SAMP1) нарушения развития в основном связаны с нарушениями процессов компактизации и кавитации. При воздействии на эмбрионы мышей с нормальными репродуктивными показателями (ICR, C57B16/DBA) гибель эмбрионов преимущественно связана с увеличением числа дегенерирующих эмбрионов.

3. Инъекция в бластоцисты мыши ксеногенных клеток (ИСК и МСК человека) не влияет на жизнеспособность эмбрионов. Использование 10% раствора инфукола ГЭК или 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С приводят к возрастанию числа случаев встраивания донорских ИСК во внутреннюю клеточную массу бластоцисты.

4. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК генов HRK, FASL и В АХ человека, в концентрации 0,1нмоль/мл не обладают токсическим влиянием на эмбрионы и отсроченным тератогенным воздействием на плоды мыши, и в дальнейшем не влияют на поведенческие и репродуктивные показатели взрослых животных.

5. Воздействие немодифицированных АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy, на культуру стромальных клеток жировой ткани человека приводит к уменьшению доли адипоцитов и стабилизации этого показателя после пассирования культуры.

6. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотического гена Hrk, улучшают качество выживших эмбрионов мыши с индуцированными блеомицином нарушениями раннего развития.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кошелева Н.В. Нарушения доимплантационного эмбрионального развития у мышей линии SAMP1. // Материалы V Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург. 2002. С.130-131.

2. Захарова Е.Е., Семенова М.Л., Есипов Д.С, Кошелева Н.В., Козлова А.Ю, Голиченков В.А. Возможности использования эмбриональной модели для изучения модуляции генной экспрессии методом антисмыслового ингибирования. // Приложение к журналу «Открытое образование» «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». 2003. С.375-377.

3. Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Есипов Д.С., Кошелева Н.В.. Козлова А.Ю., Ходаков Д.А., Голиченков В.А. Антисмысловые олигонуклеотиды как действующие агенты для эмбриональной генной терапии. // Сборник статей "Труды Международного биотехнологического центра МГУ". 2003. С. 17-22.

4. Кошелева Н.В.. Захарова Е.Е., Семенова М.Л. Особенности нарушений раннего эмбрионального развития у мышей линии SAMP1. // Материалы Всероссийской научной конференции "Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы". Москва. 2003. С.63-64.

5. Захарова Е.Е., Кошелева Н.В., Есипов Д.С, Козлова А.Ю, Ходаков Д.А., Семенова М.Л. Введение in utero тиомодифицированных антисмысловых олигонуклеотидов, специфических к мРНК гена Sry мыши. // Материалы Всероссийской научной конференции "Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы". Москва. 2003. С.221-222.

6. Кошелева Н.В.. Захарова Е.Е., Семенова М.Л. Влияние прерывистой гипоксической тренировки на эмбриогенез мышей линии SAMP1. // Тезисы докладов III Всероссийской конференции с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем". Санкт-Петербург. 2003. С.159-160.

7. Захарова Е.Е., Козлова А.Ю., Кошелева Н.В., Есипов Д.С, Семенова М.Л. Антисмысловое ингибирование генной экспрессии в эмбриональный период развития на модели формирования мужской половой системы. // Материалы VIII Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино. 2004. С.112.

8. Кошелева Н.В.. Комарова М.Н. Трансплантация стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, в полость бластоцисты мыши. // Биотехнология, экология, охрана окружающей среды. Сборник научных

трудов под ред. А.П. Садчикова, С.В. Котелевцева Москва: Изд-во ООО «Графикон-принт». 2005. С.136-139.

9. Кошелева Н.В.. Захарова Е.Е., Семенова M.JI. Химерные эмбрионы как модель для исследования потенций стволовых и прогениторных клеток. // Материалы Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина", Санкт-Петербург. 2005. С.58.

10. Кошелева Н.В.. Сабурина И.Н., Комарова М.Н., Семенова М.Л. Влияние инъекционной среды на результаты трансплантации клеток в полость бластоцисты. // Материалы конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты". Москва. 2005. С.39-40.

11.Zakharova Е., Semenova М., Kosheleva N.. Zaeva V., Zaletov S. Using of antisense oligonucleotides for modulation of gene expression in early human embryo. Abstracts of the Bioscience 2005 - From genes to systems, SECC, Glasgow UK. 2005. P. 190.

12. Захарова E.E., Семенова М.Л., Кошелева H.B. «Дети из пробирки»: экстракорпоральное оплодотворение // Биология в школе. 2005. №6. С. 10-15.

13. Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Кошелева Н.В., Заева В.В., Залетов С.Ю. Антисмысловые олигонуклеотиды как действующие агенты для улучшения качества эмбрионов человека при культивировании in vitro. II Проблемы репродукции. 2006. № 1. С.46-52.

14. Zaletov S., Zaeva V., Semenova М., Zakharova Е., Kosheleva N. An antisense approach can improve pregnancy rate. // Abstracts of the 22th Annual Meeting of the ESHRE. Prague Czech Republic. 2006. P. 122.

15. Kosheleva N.V.. Semenova M.L. Preimplantation development of SAMP1 mice and the influence of intermittent hypoxic training on SAMP1 embryogenesis. //Ann. reports on SAM studies. 2006. V.21. P.49-50.

16. Семенова М.Л., Захарова E.E., Кошелева H.B., Залетов С.Ю., Заева В.В Способ управления качеством ооцитов и композиция для добавления в среду культивирования ооцитов. // Патент РФ на изобретение № 2281777 от 20 августа 2006.

П.Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Кошелева Н.В.. Залетов С.Ю., Заева В.В Способ культивирования зиготы и/или эмбриона и композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов. // Патент РФ на изобретение № 2281778 от 20 августа 2006.

Заказ № 72/03/07 Подписано в печать 13 03 2007 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

.'-^л ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 V \ _* ' \v\vw. с/г. ги ; е-таИ:т/о@с/г. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кошелева, Настасья Владимировна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1.1. Некоторые аспекты раннего эмбрионального развития.

1.1.1. Активация эмбрионального генома.

1.1.2. Компактизация.

1.1.3. Стадия бластоцисты.

1.2. Нарушения раннего эмбрионального развития.

1.2.1. Остановки развития.

1.2.2. Фрагментация доимплантационных эмбрионов.

1.2.3. Клеточная гибель в раннем развитии млекопитающих.

Характерные черты апоптоза и некроза.

Апоптоз в раннем развитии млекопитающих.

1.3. Антисмысловые олигонуклеотиды в генной терапии.

1.3.1. Генная терапия.

1.3.2. Способы подавления синтеза белков.

1.3.3. Антисмысловые олигонуклеотиды.

Химические модификации антисмысловых олигонуклеотидов.

Проникновение и системы доставки олигонуклеотидов в клетки.

АсОДН как действующие агенты для терапии клеток в культурах in vitro.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Животные и получение эмбрионов.

3.1.2. Выделение и культивирование клеток из подкожной жировой ткани человека

3.1.3. Реактивы и среды для культивирования.

3.1.4. Олигонуклеотидные последовательности.

3.2. Эксперименты на животных.

3.2.1. Манипуляции с доимплантационными эмбрионами.

3.2.2. Оценка интактных эмбрионов и эмбрионов после культивирования in vitro на разных сроках развития.

3.2.3. Оценка поведенческих и репродуктивных показателей мышей.

3.3. Эксперименты на клетках в культуре in vitro.

3.4. Статистическая обработка данных.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Спонтанные нарушения раннего развития у мышей линий SAM.

4.1 Л. Нарушения развития у мышей линии SAMP1 in vivo, доимплантационная гибель.

4.1.2. Сравнение аномалий развития у мышей линий SAM, мышей ICR и гибридов BALB/DBA, C57B16/DBA на стадии 2.5 суток развития.

4.1.3. Нарушения развития у мышей линий SAMP1, ICR и гибридов C57B16/DBA in vitro.

4.2. Нарушения раннего эмбрионального развития мыши при проапоптотическом воздействии.

4.3. Раннее развитие после введения в бластоцисты мыши низкодифференцированных клеток человека.

4.3.1. Выживаемость суспензий НСК и МСК при различных условиях хранения и изменении состава суспензионной среды.

4.3.2. Получение инъекционных химер с НСК и МСК при различных условиях хранения и изменении состава суспензионной среды.

4.4. Исследование эмбрионального и постэмбрионального воздействия олигонуклеотидных последовательностей, добавляемых в среду при культивировании in vitro.

4.4.1. Раннее развитие после культивирования эмбрионов мыши в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека и бессмысленной олигонуклеотидной последовательности.

4.4.2. Постимплантационное развитие после культивирования эмбрионов мыши в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека.

4.4.3. Оценка поведения и репродуктивных способностей мышей, полученных после культивирования эмбрионов в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK и FASL человека.

4.4.4. Влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy, на адипогенную дифференцировку клеток, полученных из жировой ткани.

4.5. Влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена Hrk мыши, на динамику спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1. Спонтанные нарушения раннего развития у мышей линий SAM.

5.2. Нарушения раннего эмбрионального развития мыши при проапоптотическом воздействии.

5.3. Раннее развитие после введения в бластоцисты мыши низкодифференцированных клеток человека.

5.4. Неспецифические и специфические эффекты антисмысловых олигодезоксинуклеотидов.

5.5. Влияние АсОДН, специфичных к мРНК проапоптотических генов на раннее эмбриональное развитие.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Анализ нарушений раннего эмбрионального развития и их коррекция с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов"

Закономерности раннего эмбрионального развития активно изучают, начиная с 60-ых годов прошлого столетия, когда была разработана методика культивирования ранних эмбрионов in vitro [Biggers et al, 1965]. Высокая исследовательская активность в изучении доимплантационного периода развития млекопитающих связана не только с изучением фундаментальных закономерностей и познавательным интересом, но имеет большое медико-биологическое и социальное значение. Практические задачи этого направления исследований связаны с усовершенствованием методов искусственного оплодотворения, сохранением биоразнообразия и генофонда, племенным разведением сельскохозяйственных животных [Pope, 2000; Solti et al, 2000; Allen, 2005]. Проблема лечения бесплодия человека в настоящее время приобретает не только медицинское, социально-демографическое, но и экономическое значение. Результативность лечения бесплодия методами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от способности полученных ооцитов к оплодотворению in vitro и последующему развитию. Одним из отягчающих факторов при лечении бесплодия является возраст пациенток - после 30 лет резко снижается жизнеспособность эмбрионов и частота рождения детей после программы ЭКО [Templeton et al, 1996; Боярский, Василевская, 1998].

Жизнеспособность ранних эмбрионов обусловлена многими факторами, в том числе, зрелостью и генетическим статусом гамет, активацией эмбрионального генома, стадиоспецифичной экспрессией генов, межклеточными взаимодействиями. У всех млекопитающих некоторая часть эмбрионов погибает на доимплантационных стадиях развития. При культивировании эмбрионов in vitro нарушения могут быть вызваны как генетическим статусом развивающегося зародыша, так и влиянием ряда внешних факторов (например, нехваткой факторов роста, увеличением количества токсичных метаболитов, окислительным стрессом) [O'Neill, 1998; Agarwal et al, 2005]. Эмбрионы млекопитающих до компактизации обладают наибольшей чувствительностью к изменениям микроокружения и внешним воздействиям [Ribas et al, 2006; Zander et al, 2006]. Культивирование in vitro замедляет темпы развития [Fischer, 1987; Van der Auwera, D'Hooghe, 2001], изменяет уровень экспрессии ряда регуляторных факторов [Lee et al, 2001; Zheng et al, 2005; Chandrakanthan et al, 2006], нарушает экспрессию импринтированных генов [Исаев и др., 2005; Gardner, Lane, 2005], снижает количество жизнеспособных и увеличивает число гибнущих и фрагментированных клеток в эмбрионах [Hardy, 1999]. Но в условиях культивирования in vitro трудно разграничить аномалии, вызванные условиями культивирования, и нарушения, связанные с генетикой объекта. Поэтому представляется актуальным исследование нарушений раннего развития, обусловленных генетикой объекта.

Качество развивающихся эмбрионов оценивают по ряду морфологических признаков, учитывающих степень фрагментации, форму и размеры бластомеров. Многие исследователи связывают нарушения раннего развития с апоптотической гибелью клеток в эмбрионах [Exley et al, 1999; Van Blerkom et al, 2001; Jurisicova et al, 2003], поэтому перспективным представляется изучение возможности коррекции спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития путем воздействия на проапоптотические факторы. В последнее время для специфического блокирования экспрессии генов все чаще применяют антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (АсОДН), представляющие собой короткие дезоксирибонуклеотидные последовательности. АсОДН присоединяются к специфической мРНК, препятствуют трансляции и, следовательно, выработке белка [Stein, Cohen, 1988]. Эта технология дает возможность временно и направленно воздействовать практически на любой процесс в клетке с высочайшей специфичностью, не затрагивая целостность генома. Создание препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов - одно из новейших направлений лекарственных разработок для лечения ряда заболеваний, например в онкологии [Mullen et al, 2004], для лечения гипертонической болезни [Phillips, Kimura, 2005], аллергических расстройств [Ball et al, 2004], некоторых вирусных и бактериальных инфекций [Geller, 2005].

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Кошелева, Настасья Владимировна

7. ВЫВОДЫ

3. Инъекция в бластоцисты мыши ксеногенных клеток (НСК и МСК человека) не влияет на жизнеспособность эмбрионов. Использование 10% раствора инфукола ГЭК или 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С приводят к возрастанию числа случаев встраивания донорских НСК во внутреннюю клеточную массу бластоцисты.

4. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека, в концентрации 0,1нмоль/мл не обладают токсическим влиянием на эмбрионы и отсроченным тератогенным воздействием на плоды мыши, и в дальнейшем не влияют на поведенческие и репродуктивные показатели взрослых животных.

5. Воздействие ^модифицированных АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy, на культуру стромальных клеток жировой ткани человека приводит к уменьшению доли адипоцитов и стабилизации этого показателя после пассирования культуры.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для мышей линии SAMP1, склонной к ускоренному старению, характерен высокий уровень нарушений раннего развития. Наряду с фрагментирующимися и дегенерирующими эмбрионами у этой линии in vivo и in vitro в значительном количестве присутствуют эмбрионы, отстающие по стадии и остановившиеся в развитии, эмбрионы с нарушениями процессов компактизации и кавитации. Эти генетически обусловленные нарушения не поддавались коррекции с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов (АсОДН), специфичных к мРНК проапоптотического гена Hrk. Блеомицин - агент, индуцирующий апоптотическую гибель клеток, у мышей SAMP1 увеличивал количество эмбрионов с нарушениями компактизации и кавитации, не влияя на число дегенерировавших эмбрионов. Как правило, ошибки в раннем развитии вызывают гибель бластомеров или всего эмбриона. После воздействия блеомицина на эмбрионы мышей с нормальными репродуктивными показателями (ICR, C57B16/DBA) отмечалось увеличение числа дегенерировавших эмбрионов. Возможно, у мышей линии SAMP1 нарушены механизмы естественной элиминации поврежденных бластомеров и эмбрионов.

При исследовании раннего развития, проблемы, связанные с изучением взаимного влияния клеток, можно оценить в условиях создания химерных организмов. Работы по инъекции ксеногенных клеток в полость бластоцисты мыши немногочисленны, полученные результаты противоречивы [Макашовский и др., 1998; Harder et al., 2002; Koestenbauer et al., 2007]. Оставался неясным вопрос о влиянии инъекции клеток на жизнеспособность эмбрионов. Мы показали, что инъекция в бластоцисты мыши ксеногенных низкодифференцированных клеток (нейральных стволовых и прогениторных клеток человека и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека) не влияла на жизнеспособность эмбрионов. Включение инъецированных клеток в бластоцисты мыши зависело от типа клеток, а также от условий хранения и состава суспензий. Использование 10% раствора инфукола или 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С увеличивали вероятность попадания нейральных стволовых и прогениторных клеток человека в формирующийся зародыш (внутреннюю клеточную массу бластоцист), уравнивая их по этому показателю с мультипотентных мезенхимальными стромальными клетками костного мозга человека. Возможно, это связано с изменением адгезивных свойств нейральных стволовых и прогениторных клеток под действием инфукола или после 24 часововой экспозиции суспензии при +4°С.

Широкую возможность корректирующего не затрагивающего целостность генома влияния на клетки предоставляют АсОДН [Зеленин и др., 1998; Киггеск, 2003]. В проведенном комплексном исследовании было показано, что ^модифицированные олигонуклеотиды не обладают эмбриотоксическим и отсроченным тератогенным эффектами, в дальнейшем не влияют на поведение и репродукцию взрослых животных. В культуре in vitro на модели адипогенной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани было продемонстрировано влияние АсОДН на адипогенез. Полученный результат (уменьшение количества адипоцитов) показывает специфичность влияния ^модифицированных АсОДН на дифференцировку клеток в культуре. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотического гена Hrk, улучшали качество эмбрионов мыши с индуцированными блеомицином нарушениями раннего развития. По-видимому, частичное подавление трансляции белка harakiri сохраняло целостность мембран митохондрий, препятствовало высвобождению проапоптотических факторов и предохраняло эмбрионы от токсического воздействия блеомицина.

Положительное действие АсОДН, специфичных к мРНК проапоптотических генов, на раннее развитие эмбрионов in vitro получило подтверждение в области вспомогательных репродуктивных технологий. Так АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотических генов HRK и FASL человека, улучшают качество эмбрионов человека и увеличивают частоту наступления беременности после культивирования ооцитов и эмбрионов в среде с добавлением АсОДН к мРНК генов HRK и FASL [Захарова, 2006; Семенова и др. 2006; Zaletov et al., 2006]. Разработанная композиция для добавления в среду культивирования ооцитов и эмбрионов (патенты РФ № 2281777 и № 2281778 от 20 августа 2006) позволяет улучшать качество ранних эмбрионов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кошелева, Настасья Владимировна, Москва

1. Белоусов JI.B., Дабагян Н.В., Чунаева М.З. Пособие к большому практикуму по эмбриологии. 4.2. М.: Изд-во МГУ. 1990.

2. Боярский К.Ю., Василевская С.Е. Цитогенетический анализ ооцитов, полученных у женщин старшей возрастной группы в программе ЭКО. // Проблемы репродукции. 1998. - №2. - С.34-36.

3. Воробьева O.A., Корсак B.C., Северова E.JI., Кирсанов A.A., Козлов В.В. Влияние возраста женщины на процесс оплодотворения ооцитов и развитие эмбрионов в культуре. // Проблемы репродукции. 1998. - № 6. -С.48-51.

4. Голиченков В.А. Методы эмбриологических исследований (пособие к Большому практикуму по эмбриологии). М.: Изд-во МГУ. 1996.

5. Гольдина O.A., Горбачевский Ю.В. Преимущество современных препаратов гидроксиэтилированного крахмала в ряду плазмозамещающих инфузионных растворов. // Вестник службы крови России. 1998. - №3. -С.41-45.

6. Гопко A.B., Захидов С.Т., Маршак Т.Д., Кулибин А.Ю., Семенова M.JI., Макаров A.A. Генетическая нестабильность мужских половых клеток у мышей-долгожителей SAMP1, склонных к ускоренному старению. // Доклады Академии Наук. 2003. - Т.392, №2. - С.267-270.

7. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. JL: Наука. 1988.

8. Дыбан А.П., Пучков В.Ф., Баранов B.C., Самошкина H.A., Чеботарь H.A. Лабораторные млекопитающие: мышь (Mus musculus), крыса (Ratus norvegicus), кролик (Orictolagus cuniculus), хомячок (Cricetus griseous). Объекты биологии развития. M: «Наука». 1975.

9. Захарова Е.Е. Применение антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК генов HRK и FASL при культивировании in vitro ооцитов и эмбрионов человека: Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 2006.

10. Ю.Захидов С.Т., Семенова М.Л., Гордеева О.Ф., Беляева A.A. Сперматогенез у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению. // Доклады Академии Наук. 1999. - Т.365, №3. - С.403-405.

11. И.Зеленин A.B., Кайгородов В.А., Прасолов B.C. Генная терапия сегодня и завтра. // Молекулярная биология. 1998. - Т.32. - С.219-228.

12. Исаев Д.А., Заева В.В.,. Болт А.И, Володина О.Ю. Вспомогательная репродукция человека и болезни геномного импринтинга. // Проблемы репродукции. 2005. - №2. - С. 14-18.

13. Колесников В.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л., Шафеи P.A., Зеленин A.B. Баллистическая трансфекция клеток млекопитающих in vivo. // Онтогенез. 1995. - Т.26. - С.467-480.

14. Н.Кулибин А.Ю., Захидов С.Т., Маршак Т.Д., Гопко A.B., Михалева Я.Ю., Семенова M.JI. Изучение сперматогенной структуры у мышей-долгожителей SAMP1, склонных к ускоренному старению. // Доклады Академии Наук. 2005. - Т.404, №6. - С.831-834.

15. Мак-Ларен Э. Химеры млекопитающих. М: Мир. 1979.

16. Максимовский Л.Ф., Кизилова Е.А. Железнова А.И., Голубица А.Н., Мазуров М.М. Взаимодействие гомо- и гетеротипических эмбриональных стволовых клеток с развивающимися зародышами. // Онтогенез. 1998. -Т.29, №2. - С.96-103.

17. Манк М. Биология развития млекопитающих. Методы. -М: Мир. 1990.

18. B.И., Леонова Б.В. М: Медицинское информационное агентство. 2000.1. C.15-36.

19. Новиков В.С.Программированная клеточная гибель. СПб: Наука. 1996.

20. Подобед О.В., Жданов Р.И. Генный перенос с помощью невирусных векторов на основе поликатионов и гидрофобных поликатионов в целях генной терапии. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999. - №4. - С.7-15.

21. Позмогова Г.Е., Кнорре Д.Г. Белковые и пептидные конструкции для доставки в клетку олигонуклеотидов и ДНК. // Вопросы медицинской химии. 1999. - №6.

22. Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Кошелева Н.В., Заева В.В., Залетов С.Ю. Антисмысловые олигонуклеотиды как действующие агенты для улучшения качества эмбрионов человека при культивировании in vitro. II Проблемы репродукции. 2006. - № 1. - С.46-52.

23. Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Кошелева Н.В., Залетов С.Ю., Заева В.В Способ управления качеством ооцитов и композиция для добавления всреду культивирования ооцитов. // Патент РФ на изобретение № 2281777 от 20 августа 2006.

24. Семенова M.JL, Захарова Е.Е., Кошелева Н.В., Залетов С.Ю., Заева В.В Способ культивирования зиготы и/или эмбриона и композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов. // Патент РФ на изобретение № 2281778 от 20 августа 2006.

25. Тарантул В.З. Таргетинг генов как современная методология изучения их функции. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -1996. №2. - С.3-13.

26. Трактуев Д.О., Парфенова Е.В., Ткачук В.А., Марч K.JI. Стромальные клетки жировой ткани пластический тип клеток, обладающих высоким терапевтическим потенциалом. // Цитология. - 2006. - т.48, №2. - С.83-93.

27. Челобанов Б.П., Лактионов П.П, Власов В.В Белки, участвующие в связывании и поглощении клетками нуклеиновых кислот // Биохимия. -2006. Т.71, вып. 6. - С.725-741.

28. ЗО.Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. // Биохимия. 2000. - Т. 65, № 1. - С.34-47.

29. ЗЬЯрилин А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и патологии. // Актуальные проблемы патофизиологии: избранные лекции / Под ред. Мороза Б.Б. -М: Медицина. 2001. С. 13-56.

30. Ailhaud G., Grimaldi P., Negrel R. Cellular and molecular aspects of adipose tissue development. // Annu. Rev. Nutr. 1992. - v. 12. - P.207-215.

31. Agarwal A., Gupta S., Sharma R. Oxidative stress and its implications in female infertility a clinician's perspective. // Reprod. Biomed. Online. - 2005. - V.ll,№5.-P.641-650.

32. Akhtar S., Juliano R.L. Cellular uptake and intracellular fate of antisense oligonucleotides // Trends Cell Biol. 1992. - V.2, №5. - P. 139-144.

33. Alikani M., Calderon G., Tomkin G., Garrisi J., Kokot M., Cohen J. Cleavage anomalies in early human embryos and survival after prolonged culture in-vitro. // Hum. Reprod. 2000. - V.15, №12. - P.2634-2643.

34. Alikani M., Cohen J., Tomkin G., Garrisi G.J., Mack C., Scott R.T. Human embryo fragmentation in vitro and its implications for pregnancy and implantation. // Fertil. Steril. 1999. - V.71, № 5. - P.836-842.

35. Allen W.R. The development and application of the modern reproductive technologies to horse breeding. // Reprod. Domest. Anim. 2005. - V.40, №4. -P.310-329.

36. Aoki F., Hara K.T., Schultz R.M. Acquisition of transcriptional competence in the 1-cell mouse embryo: requirement for recruitment of maternal mRNAs. // Mol. Reprod. Dev. 2003. - V.64. - P.270-274.

37. Baertschi A J. Antisense oligonucleotide strategies in physiology. // Mol. Cell. Endocrinol. 1994. - V. 101, №1-2. - P.R15-R24.

38. Balcerzak D., Poussard S., Brustis J.J., Elamrani N., Soriano M., Cottin P., Ducastaing A. An antisense oligodeoxyribonucleotide to m-calpain mRNA inhibits myoblast fusion // J. Cell Sci. 1995. - V.108. - P.2077-2082.

39. Ball H.A., Van Scott M.R., Robinson C.B. Sense and antisense: therapeutic potential of oligonucleotides and interference RNA in asthma and allergic disorders. // Clin. Rev. Allergy Immunol. 2004. - V.27, №3. - P.207-17.

40. Ball H.A., Sandrasagra A., Tang L., Van Scott M., Wild J., Nyce J.W. Clinical potential of respirable antisense oligonucleotides (RASONs) in asthma. // Am. J. Pharmacogenomics. 2003. - V.3, №2. - P.97-106.

41. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues // Tetrahedron Lett. 1967. - V.37. - P.3557-3562.

42. Beraldi R., Pittoggi C., Sciamanna I., Mattei E., Spadafora C. Expression of LINE-1 retroposons is essential for murine preimplantation development. // Mol. Reprod. Dev. 2006. - V.73, №3. - P.279-287.

43. Biggers J.D., Moore B.D., Whittingham D.G. Development of mouse embryos in vivo after cultivation from two-cell ova to blastocysts in vitro. // Nature. -1965. V.206, №985. - P.734-735.

44. Blake KR, Murakami A, Spitz SA, Glave SA, Reddy MP, Ts'o PO, Miller PS. Hybridization arrest of globin synthesis in rabbit reticulocyte lysates and cells by oligodeoxyribonucleoside methylphosphonates // Biochemistry. 1985. -V.24, №22. - P.6139-6145.

45. Bondurant M.C., Yamashita T., Muta K., Krantz S.B., Koury M.J. C-myc expression affects proliferation but not terminal differentiation or survival of explanted erythroid progenitor cells // J. Cell. Physiol. 1996. - V.168, №2. -P.255-263.

46. Bongso A, Ng SC, Lim J, Fong CY, Ratnam S. Preimplantation genetics: chromosomes of fragmented human embryos. // Fértil. Steril. 1991. - V.56, №1. -P.66-70.

47. Borland R.M. Transport processes in the mammalian blastocyst. // Development in mammals. / Ed. Johnson M.H., Elsevier/North-Holland Biomedical Press, 1977. P.31-67.

48. Brenner C.A., Adler R.R., Rappolee D.A., Pedersen R.A., Werb Z. Genes for extracellular-matrix-degrading metalloproteinases and their inhibitor, TIMP, are expressed during early mammalian development. // Genes Dev. 1989. -V.6. - P.848-859.

49. Brinster R.L., Troike D.E. Requirements for blastocyst development in vitro. II J. Anim. Sci. 1979. - V.49, №2. - P.26-34.

50. Campos L.S. Neurospheres: insights into neural stem cell biology // J. Neurosci. Res. 2004. - V.78. - P.761-769.

51. Chandrakanthan V., Li A., Chami O., O'Neill C. Effects of in vitro fertilization and embryo culture on TRP53 and Bax expression in B6 mouse embryos. // Reprod. Biol. Endocrinol. 2006. - V.4. - P.61-71.

52. Chou W.Y., Marky L.A., Zaunczkowski D., Breslauer K.J. The thermodynamics of drug-DNA interactions: ethidium bromide and propidium iodide. // J. Biomol. Struct. Dyn. 1987. - V.2. - P.345-359.

53. Christians E., Campion E., Thompson E.M., Renard J.P. Expression of the HSP 70.1 gene, a landmark of early zygotic activity in the mouse embryo, is restricted to the first burst of transcription. // Development. 1995. - V.121. -P.l 13-122.

54. Clarke D.L., Johansson C.B., Wilbertz J., Veress B., Nilsson E., Karlstrom H., Lendahl U., Frisen J. Generalized potential of adult neural stem cells. // Science. -2000. V.288. - P.l660-1663.

55. Collins J.E., Fleming T.P. Epithelial differentiation in the mouse preimplantation embryo: making adhesive cell contacts for the first time. // Trends Biochem. Sci. 1995. - V.20, №8. - P.307-312.

56. Coucouvanis E., Martin G.R. Signals for death and survival: a two step mechanism for cavitation in the vertebrate embryo. // Cell. 1995. - V.84. -P.279-287.

57. Cui X.S., Li X.Y., Shen X.H., Bae Y.J., Kang J.J., Kim N.H. Transcriptional profile in mouse four-cell, morula, and blastocyst: Genes implicated in compaction and blastocoel formation. // Mol. Reprod. Dev. 2007. - V.74, №2. - P.133-143.

58. Dandekar P.V., Glass R.H. Development of mouse embryos in vitro is affected by strain and culture medium. // Gamete Res. 1987. - V.17, №4. P.279-285.

59. Denker H.W. Implantation: a cell biological paradox. // J. Exp. Zool. 1993. -V.266, №6. - P.541-558.

60. Devreker F., Englert Y. In vitro development and metabolism of the human embryo up to the blastocyst stage. // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. -2000.-V.92.-P.51-56.

61. Dharma S.J., Kelkar R.L., Nandedkar T.D. Fas and Fas ligand protein and mRNA in normal and atretic mouse ovarian follicles. // Reproduction. 2003. -V.126, №6. - P.783-789.

62. Dohi Y., Shimaoka H., Ikeuchi M., Ohgushi H., Yonemasu K., Minami T. Role of metallothionein isoforms in bone formation processes in rat marrow mesenchymal stem cells in culture // Biol. Trace Elem. Res. 2005. - V.104, №1. -P.57-70.

63. Dokka S, Toledo-Velasquez D, Shi X, Wang L, Rojanasakul Y. Cellular delivery of oligonucleotides by synthetic import peptide carrier. // Pharm. Res. 1997. V.14, №12. - P.1759-1764.

64. Downs S.M., Dow M.P. Hypoxanthine-maintained two-cell block in mouse embryos: dependence on glucose and effect of hypoxanthine phosphoribosyltransferase inhibitors. // Biol. Reprod. 1991. - V.44, №6. -P.1025-1039.

65. Dozortsev D., Ermilov A., El-Mowafi D.M., Diamond M. The impact of cellular fragmentation induced experimentally at different stages of mouse preimplantation development. // Hum. Reprod. 1998. - V.13, № 5. - P.1307-1311.

66. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. Oligonucleotidebased inhibition of embryonic gene expression // Nat. Biotechnol. 1999. - V.17. - P. 1184-1187.

67. Ducibella T. Surface changes of the developing trophoblast cell. // Development in mammals / Ed. Johnson M.H., Elsevier/North-Holland Biomedical Press. 1977. P.5-30.

68. Dvorak M. The differentiation of rat ova during cleavage. // Advances in anatomy, embryology, and cell biology; V.55, fasc.2, Spinger-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1978.

69. Ebner T. Yaman C., Moser M., Sommergruber M., Polz W., Tews G. Embryo fragmentation in vitro and its impact on treatment and pregnancy outcome. // Fertil. Steril. 2001. - V.76, №2. -P.281-285

70. Exley G.E., Tang C., McElhinny A.S., Warner C.M. Expression of caspase and Bcl-2 apoptotic family members in mouse preimplantation embryo. // Biol. Reprod. 1999. - V.61. - P.231-239.

71. Fischer B. Development retardation in cultured preimplantation rabbit embryos. // J. Reprod. Fertil. 1987. - V.79, №1. - P. 115-123.

72. Fleming T.P., Kwong W.Y., Porter R., Ursell E., Fesenko I., Wilkins A., Miller D.J., Watkins A.J., Eckert J.J. The embryo and its future. // Biol. Reprod. -2004. -V.71.- P. 1046-1054.

73. Fleming J.V., Fontanier N., Harries D.N., Rees W.D. The growth arrest genes gas5, gas6, and CHOP-10 (gaddl53) are expressed in the mouse preimplantation embiyo. // Mol. Reprod. Dev. 1997. - V.48. - P.310-316.

74. Floyd Z.E., Zvonic S., Nuttall M.E., Gimble J.M. Fine-Tuning Reception in the Bone: PPARgamma and Company // PPAR Res. 2006. - V.2006: 52950. -P.1-7.

75. Fuchimoto D., Mizukoshi A., Schultz R.M., Sakai S., Aoki F. Posttranscriptional regulation of cyclin A1 and cyclin A2 during mouse oocyte meiotic maturation and preimplantation development. // Biol. Reprod. 2001. -V.65. - P.986-993.

76. Fulka J.Jr., First N.L., Fulka J., Moor R.M. Checkpoint control of the G2/M phase transition during the first mitotic cycle in mammalian eggs. // Hum. Reprod. 1999. - V.14, №6. - P.1582-1587.

77. Gardner D.K., Lane M. Ex vivo early development and effects on gene expression and imprinting. // Reprod. Fertil. Dev. 2005. - V.17. - P.361-370.

78. Gardner R.L., Johnson M.H. Investigation of cellular interaction and deployment in the early mammalian embryo using interspecific chimaeras between the rat and mouse. // Ciba Found. Symp. 1975. - V.0, №29. - P. 183200.

79. Garrett D.J., Larson J.E., Dunn D., Marrero L., Cohen J.C. In utero recombinant adeno-assotiated virus gene transfer in mice, rats, and primates // BMC Biotechnology. 2003. - V.3. - P. 16.

80. Gasparro F.P., Dall'Amico R., O'Malley M., Heald P.W., Edelson R.L. Cell membrane DNA: a new target for psoralen photoadduct formation // Photochem. Photobiol. 1990. - V.52, №2. - P.315-321.

81. Geiger H., Sick S., Bonifer C., Muller A.M. Globin gene expression is reprogrammed in chimeras generated by injecting adult hematopoietic stem cells into mouse blastocysts. // Cell. 1998. - V.93, №6. - P. 1055-1065.

82. Geller B.L. Antibacterial antisense //Curr. Opin. Mol. Ther. 2005. - V.7, №2 -P.109-113.

83. Greco B., Low H.P., Johnson E.C., Salmonsen R.A., Gallant J., Jones S.N., Ross A.H., Recht L.D. Differentiation prevents assessment of neural stem cell pluripotency after blastocyst injection. // Stem Cells. 2004. - V.22, №4. -P.600-608.

84. Gregoire F.M., Smas C.M., Sul H.S. Understanding adipocyte differentiation. // Physiol. Rev. 1998. - V.78, №3. - P.783-809.

85. Hamilton AJ, Baulcombe DC A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 1999. - V.286, №5441. - P.950-952.

86. Hardy K., Stark J., Winston R.M.L. Maintanance of the inner cell mass in human blastocysts from fragmented embryos. // Biol. Reprod. 2003. - V.68. -P.l 165-1169.

87. Hardy K., Spanos S. Growth factor expression and function in the human and mouse preimplantation embryo. // J. Endocrinol. 2002. - V.172. - P.221-236.

88. Hardy K. Apoptosis in the human embryo. // Rev. Reprod. 1999. - V.4. -P.125-134.

89. Hardy K., Warner A., Winston R.M., Becker D.L. Expression of intercellular junctions during preimplantation development of the human embryo. // Mol. Hum. Reprod. 1996. - V.2, №8. -P.621-632.

90. Harder F., Kirchhof N., Petrovic S., Wiese S., Muller A.M. Erythroid-like cells from neural stem cells injected into blastocysts.// Exp. Hematol. 2004. -V.32, №7. - P.673-682.

91. Harder F., Henschler R., Junghahn I., Marimes C. Lamers, Albrecht M. Müller. Human hematopoiesis in murine embryos after injecting human cord blood-derived hematopoietic stem cells into murine blastocysts.// Blood. -2002. V.99, №2.-P.719-721.

92. Harris C.A., Johnson E.M. Jr. BH3-only Bcl-2 family members are coordinate^ regulated by the JNK pathway and require Bax to induce apoptosis in neurons. // J. Biol. Chem. 2001. - V.276, №41. - P.37754-37760.

93. Hartleberg G.M., Haugland R.P., Haugland R.P. Single color reduced-biohazard viability assay. // International Society for analitical cytology Meeting, 2002.

94. Hawley P., Gibson I. Interaction of oligodeoxynucleotides with mammalian cells // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996. - V.6, №3. - P.185-195.

95. Heasman J. Morpholino oligos: making sense of antisense? // Dev. Biol. -2002. V.243. -P.209-214.

96. Heichman K.A., Roberts J.M. Rules to replicate by. // Cell. 1994. - V.79, №18. -P.557-562.

97. Hengartner M.O. The biochemistry of apoptosis. // Nature. 2000. - V.407, №6805. - P.770-776.

98. Herdewijn P. Antisense oligonucleotides. // Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 1996. - V.58, № 4. - P.359-381.

99. Heyer B., MacAuley A., Behrendtsen O., Werb Z. Hypersensitivity to DNA damage leads to increased apoptosis during early mouse development. // Genes Dev. -2000. V.14. - P.2072-2084.

100. Hill M.A. Early human development. // Clin. Obstet. Gynecol. 2007. -V.50, №1. - P.2-9.

101. Hnida C., Engenheiro E., Ziebe S. Computer-controlled, multilevel, morphometric analysis of blastomere size as biomarker of fragmentation and multinuclearity in human embryos. // Hum. Reprod. 2004. V.19, №2. -P.288-293.

102. Hogan B., Beddington R., Costantini F., Lacy E. Manipulation the Mouse Embryo. A laboratory manual. Second edition. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.

103. Hosokawa M. A higher oxidative status accelerates senescence and aggravates age-dependent disorders in SAMP strains of mice. // Mech. Ageing Dev. -2002. V.123. - P.1553-1561.

104. Hosokawa M., Fujisawa H., Bing-Hua Z., Juro H., Higuchi K. In vitro study of the mechanisms of senescence acceleration. // Exp. Gerontol. 1997b. -V.32, №1/2.-P. 197-203.

105. Howell S.J., Shalet S.M. Effect of cancer therapy on pituitary-testicular axis. // Int. J. Androl. 2002. - V.25. - P.269-276.

106. Igney F.H., Krammer P.H. Death and anti-death: tumour resistance to apoptosis. // Nat. Rev. Cancer. 2002. - V.2. - P.277-288.

107. Inohara N., Ding L., Chen S., Nuenz G. Harakiri, a novel regulator of cell death, encodes a protein that activates apoptosis and interects selectively with survival- promoting proteins Bcl-2 and Bcl-XL. // EMBO J. 1997. - V.16, №7.-P. 1686-1694.

108. Iversen P.L., Zhu S., Meyer A., Zon G. Cellular uptake and subcellular distribution of phosphorothioate oligonucleotides into cultured cells. // Antisense Res. Dev. 1992. - V.2, № 3. - P.211-222.

109. Jaeger L.B., Banks W.A. Antisense therapeutics and the treatment of CNS disease. // Front. Biosci. 2004. - V.9. - P. 1720-1727.

110. Janny L., Menezo Y.J. Maternal age effect on early human embryonic development and blastocyst formation. // Mol. Reprod. Dev. 1996. - V.45, № 1. -P.31-37.

111. Jen K-Y., Gewirtz A.M. Suppression of gene expression by targeted distruption of messenger RNA: available options and current strategies. // Stem cells.-2000.-№ 18.-P.307-319.

112. Johnson M.H., Ziomek C.A. Induction of polarity in mouse 8-cell blastomeres: specificity, geometry, and stability. // J. Cell Biol. 1981. - V.91.- P.303-308.

113. Junghans M., Kreuter J., Zimmer A. Phosphodiester and phosphorothioate oligonucleotide condensation and preparation of antisense nanoparticles // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V. 1544. - P. 177-188.

114. Junghans M., Kreuter J., Zimmer A. Antisense delivery using protamine-oligonucleotide particles // Nucleic Acids Res. 2000. - V.28, №10. - E45.

115. Jurisicova A., Acton B.M. Deadly decisions: the role of genes regulating programmed cell death in human preimplantation embryo development // Reproduction. 2004. - V.128. - P.281-291.

116. Jurisicova A., Latham K.E., Casper R.F., Varmuza S.L. Expression and regulation of genes associated with cell death during murine preimplantation embryo development. // Mol. Reprod. Dev. 1998a. - V.51. - P.243-253.

117. Jurisicova A., Rogers I., Fasciani A., Casper R., Varmuza S. Effect of maternal age and conditions of fertilization on programmed cell death during murine preimplantation embryo development. // Mol. Hum. Reprod. 1998b. -V.4,№2.-P. 139-145.

118. Kakinuma Y., Saito F., Ohsawa S., Furuichi T., Miura M. A sulfatase regulating the migratory potency of oligodendrocyte progenitor cells through tyrosine phosphorylation of beta-catenin // J. Neurosci. Res. 2004. - V.77, №5. -P.653-661.

119. Kaneko K.J., Cullinan E.B., Latham K.E., DePamphilis M.L. Transcription factor mTEAD-2 is selectively expressed at the beginning of zygotic gene expression in the mouse. // Development. 1997. - V.124. - P. 1963-1973.

120. Katovich M.J., Grobe J.L., Huentelman M., Raizada M.K. Angiotensinconverting enzyme 2 as a novel target for gene therapy for hypertension. //Exp. Physiol. 2005. - V.90, №3. - P.299-305.

121. Kawamura K., Fukuda J., Kodama H., Kumagai J., Tanaka T. Expression of Fas and Fas ligand mRNA in rat and human preimplantation embryos. // Mol. Hum. Reprod. -2001. V.7, №5. - P.431-436.

122. Kawanishi S., Hiraku Y. Amplification of anticancer drug-induced DNA damage and apoptosis by DNA-binding compounds.// Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. 2004. - V.4, №5. - P.415-419.

123. Khosla S., Dean W., Reik W., Feil R. Culture of preimplantation embryos and long-term effects on gene expression and phenotype // Hum. Reprod. Update. -2001. V.7, №4. - P.419-427.

124. Kim J.H., Do H.J., Choi S.J., Cho H.J., Park K.H., Yang H.M., Lee S.H., Kim D.K., Kwack K., Oh S.K., Moon S.Y., Cha K.Y., Chung H.M. Efficient gene delivery in differentiated human embryonic stem cells // Exp. Mol. Med. -2005. -V. 37, №l.p. 36-44.

125. Kim S.U., Han Y.H., Lee T.H., Hyun B.H., Lee S.H., Lee D.S., Yu D.Y. Effective production of microinjectable blastocysts for germ-line transmission of embryonic stem cells.// Exp. Anim. 2004. - V.53, №5. - P.475-477.

126. Kimber S.J. Spanswick C. Blastocyst implantation: the adhesion cascade. // Semin. Cell Dev. Biol. 2000. - V.l 1, №2. - P.77-92.

127. King R.W., Jackson P.K., Kirschner M.W. Mitosis in transition // Cell. -1994. V.79, № 18. - P.563-571.

128. Koestenbauer S., Vanderzwalmen P., Hammer A., Schoonjans L., Danloy S., Zech H., Dohr G., Zech N.H. Apoptosis affects integration frequency: Adult stem cells injected in blastocysts show high caspase-3 activity. // Cell Biol. Int. 2007, in press.

129. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications // Eur. J. Biochem. 2003. - V.270, №8. - P. 1628-1644.

130. Laktionov P.P., Dazard J.E., Vives E., Rykova E.Y., Piette J., Vlassov V.V., Lebleu B. Characterisation of membrane oligonucleotide-binding proteins and oligonucleotide uptake in keratinocytes // Nucleic Acids Res. 1999. - V.27, №11.-P.2315-2324.

131. Ledley F. D. Nonviral gene therapy: the promise of genes as pharmaceutical products. // Hum. Gene Ther. 1995. - V.6. - P. 1129-1144.

132. Lee R.H., Kim B.C., Choi I.S., Kim H., Choi H.S., Suh K.T., Bae Y.C., Jung J.S. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. // Cell. Physiol. Biochem. 2004. -V.14.-P.311-324.

133. Levy R., Benchaib M., Cordonier H., Souchier C., Guerin J.F. Annexin V labelling and terminal transferase-mediated DNA end labelling (TUNEL) assay in human arested embryos. // Mol. Hum. Reprod. 1998. - V.4, №8. - P.775-783.

134. Liang L., Bickenbach J.R. Somatic epidermal stem cells can produce multiple cell lineages during development. // Stem Cells. 2002. - V.20, №1. -P.21-31.

135. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H., Mori K., Nakanishi M., Subasinghe C., Cohen J.S., Neckers L.M. Characterization of oligonucleotide transport into living cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989. - V.86, №10. - P.3474-3478.

136. Los M., Wesselborg S., Schulze-Osthoff K. The role of caspases in development, immunity, and apoptotic signal transduction: lessons from knockout mice. // Immunity. 1999. - V.10. - P.629-639.

137. Lundstrom K., Boulikas T. Viral and non-viral vectors in gene therapy: technology development and clinical trials // Technol. Cancer Res. Treat. -2003. V.2, №5. - P.471-486.

138. Lv W, Zhang C, Hao J. RNAi technology: a revolutionary tool for the colorectal cancer therapeutics. // World J. Gastroenterol. 2006. - V.12, №29. -P.4636-4639.

139. Lysik M.A., Wu-Pong S. Innovations in oligonucleotide drug delivery. // J. Pharm. Sci. 2003. - V.92, №8. - P.1559-1573.

140. Markina N.V., Salimov R.M., Poletaeva I.I. Behavioral screening of two mouse lines selected for different brain weight. // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2001. - V.25. - P. 1083-1109.

141. Menendez P., Wang L., Bhatia M. Genetic manipulation of human embryonic stem cells: a system to study early human development and potential therapeutic applications // Curr. Gene Ther. 2005. - V.5, №4. - P.375-385.

142. Michaelson J.S., Bader D., Kuo F., Kozak C., Leder P. Loss of Daxx, a promiscuously interacting protein, results in extensive apoptosis in early mouse development. // Genes Dev. 1999. - V. 13. - P. 1918-1923.

143. Miyamoto H., Manabe N., Mitani Y., Sugimoto N., Watanabe T., Aruga C., Sato E. Female reproductive properties and prenatal development of a senescence-accelerated mouse strain. // J. Exp. Zool. 1995. - V.272, №2 -P.l 16-122.

144. Morris M.C., Chaloin L., Mery J., Heitz F., Divita G. A novel potent strategy for gene delivery using a single peptide vector as a carrier // Nucleic Acids Res. 1999. - V.27, №. 17. - P.3 510-3 517.

145. Munne S., Cohen J. Chromosome abnormalities in human embryos. // Hum. Reprod. Update. 1998. - V.4, №6. - P.842-855.

146. Munne S., Magli C., Adler A., Wright G., de Boer K., Mortimer D., Tucker M., Cohen J., Gianaroli L. Treatment-related chromosome abnormalities in human embryos. // Hum. Reprod. 1997. - V.12, №4. - P.780-784.

147. Muroya S, Nakajima I, Oe M, Chikuni K. Effect of phase limited inhibition of MyoD expression on the terminal differentiation of bovine myoblasts: no alteration of Myf5 or myogenin expression // Dev. Growth Differ. 2005. -V.47, №7. - P.483-492.

148. Nakagami H., Morishita R., Maeda K., Kikuchi Y., Ogihara T., Kaneda Y. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. // J. Atheroscler. Thromb. 2006. - V.13, №2. - P.77-81.

149. Neubert D., Merker H.-J., Kwasigroch T.E. et al. Methods in Prenatal Toxicology.//Germany 1977; 123-125.

150. Nowak K.J., Davies K.E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment // EMBO Rep. 2004. - V.5. -P.872-876.

151. Odagiri Y., Uchida H., Hosokawa M., Takemoto K., Morley A.A., Takeda T. Accelerated accumulation of somatic mutations in the senescence-accelerated mouse. //Nat. Genet. 1998. - V.l9, №2. - P. 116-117.

152. Oltvai Z.N., Korsmeyer S.J. Checkpoints of dueling dimers foil death wishes. // Cell. 1994. - V.79, №21. - P. 189-192.

153. Oltvai Z.N., Milliman C.L., Korsmeyer S.J. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programed cell death. // Cell. -1993.-V.74.-P.609-619.

154. O'Neill C. Role of autocrine mediators in the regulation of embryo viability: lessons from animal models. // J. Assist. Reprod. Genet. 1998. - V.15, №8. -P.460-465.

155. Orgel L.E. The maintenance of the accuracy of protein synthesis and its relevance to ageing. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1963. - V.49. - P.517-521.

156. Ovitt C.E., Scholer H.R. The molecular biology of Oct-4 in the early mouse embryo. // Mol. Hum. Reprod. 1998. - V. 11. - P. 1021 -1031.

157. Pampfer S. Apoptosis in rodent peri-implantation embryos: differential susceptibility of inner cell mass and trophectoderm cell lineages a review. // Placenta. - 2000. - V.21. Supplement A, Trophoblast Research. V.14. - P.S3-S10.

158. Pampfer S., Donnay I. Apoptosis at the time of embryo implantation in mouse and rat. // Cell Death Differ. 1999. - V.6. - P.533-545.

159. Paria BC, Dey SK, Andrews GK. Antisense c-myc effects on preimplantation mouse embryo development. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1992. V.89, №21. - P. 10051-10055.

160. Perez G.I., Tao X-J, Tilly J.L. Fragmentation and death (a.k.a. apoptosis) of ovulated oocytes. // Mol. Hum. Reprod. 1999. - V.5, №5. - P.414-420.

161. Persengiev SP, Zhu X, Green MR Nonspecific, concentration-dependent stimulation and repression of mammalian gene expresssion by small interfering RNAs (siRNAs) // RNA. 2004. - V. 10. - P. 12-18.

162. Phillips M.I., Kimura B. Antisense therapeutics for hypertension: targeting the renin-angiotensin system //Methods Mol. Med. 2005. - V.106. - P.51-68.

163. Pignatelli M., Cortes-Canteli M., Santos A., Perez-Castillo A. Involvement of the NGFI-A gene in the differentiation of neuroblastoma cells // FEBS Lett.- 1999. V.461, №1-2. - P.37-42.

164. Plank C., Zauner W., Wagner E. Application of membrane-active peptides for drug and gene delivery across cellular membranes. // Adv. Drug Deliv. Rev.- 1998.-V.34, №l.-P.21-35.

165. Pooga M., Land T., Bartfai T., Langel. PNA oligomers as tools for specific modulation of gene expression. // Biomol. Eng. 2001. - V.17, №6. - P. 183192.

166. Pool T.B. Development of culture media for human assisted reproductive technology. // Fértil. Steril. 2004. - V.81. - P.287-289.

167. Pope C.E. Embryo technology in conservation efforts for endangered felids. // Theriogenology. 2000. - V.53, №1. - P. 163-174.

168. Quinn P., Barros C., Whittingam D.G. Preservation of hamster oocytes to assay the fertilization capacity for human speematozoa. // J. Reprod. Fértil. -1982. V.66, №1. - P.161-168.

169. Rappolee D.A., Brenner C.A., Schultz R., Mark D., Werb Z. Developmental expression of PDGF, TGF-alpha, and TGF-beta genes in preimplantation mouse embryos. // Science. 1988. - V.241. - P. 1823-1825.

170. Reed J.C. Cytochrome c: can't live with it can't live without it. // Cell. -1997a. -V.91.-P.559-562.

171. Reed J.C. Double identity for proteins of the Bcl-2 family. // Nature. -1997b.-V.387.-P.773-776.

172. Ribas R.C., Taylor J.E., McCorquodale C., Mauricio A.C., Sousa M., Wilmut I. Effect of zona pellucida removal on DNA methylation in early mouse embryos. // Biol. Reprod. 2006. - V.74, №2. - P.307-313.

173. Romanov Y.A., Darevskaya A.N., Merzlikina N.V., Buravkova L.B. Mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue: isolation, characterization, and differentiation potentialities // Bull. Exp. Biol. Med. 2005. - V.140, №1. - P.138-143.

174. Schmajuk G., Sierakowska H., Kole R. Antisense oligonucleotides with different backbones. Modification of splicing pathways and efficacy of uptake //J. Biol. Chem. 1999. - V.274, №31. -P.21783-21789.

175. Schultz R.M. Preimplantation embryo development. // Molecular biology in reproductive medicine / Ed. Fauser B.C.J.M., The Parthenon Publishing Group. 1999.-P.313-332.

176. Schultz R.M., Davis WJr., Stein P., Svoboda P. Reprogramming of gene expression during preimplantation development. // J. Exp. Zool. 1999. -V.285. - P.276-282.

177. Scott L., Alvero R., Leondires M., Miller B. The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation. // Hum. Reprod. 2000. - V.15, №11. - P.2394-2403.

178. Semenova M.L., Kramarenko G.G., Aleksandrova A.A., Galllant S., Boldyrev A.A. Na/K-ATPase activity and postimplantation embryo loss in SAMP1 mice. // Ann. reports on SAM studies. 2001. - V.7, № 12/13. - P. 107-108.

179. Sharpe C.C., Dockrell M.E., Noor M.I., Monia B.P., Hendry B.M. Role of Ras isoforms in the stimulated proliferation of human renal fibroblasts in primary culture // J. Am. Soc. Nephrol. 2000. - V. 11, №9. - P. 1600-1606.

180. Sharp P.A. RNAi and double-strand RNA // Genes Dev. 1999. - V.13, №2. -P.139-141.

181. Shiel M.J., Caplan M.J. The generation of epithelial polarity in mammmalian and Drosophila embryos. // Dev. Biol. 1995. - V.6. - P.39-46.

182. Siddall L.S., Barcroft L.C., Watson A.J. Targeting gene expression in the preimplantation mouse embryo using morpholino antisense oligonucleotides. // Mol. Reprod .Dev. 2002. - V.63, №4. - P.413-421.

183. Skiadas C.C., Jackson K.V., Racowsky C. Early compaction on day 3 may be associated with increased implantation potential. // Fertil. Steril. 2006. -V.86, №5. -P.1386-1391.

184. Solti L., Crichton E.G., Loskutoff N.M., Cseh S. Economical and ecological importance of indigenous livestock and the application of assisted reroduction to their preservation. // Theriogenology. 2000. - V.53, №1. - P.149-162.

185. Spanos S., Rice S., Karagiannis P., Taylor D., Becker D.L., Winston R.M.L., Hardy K. Caspase activity and expression of cell deth during development of human preimplantation embryos. // Reproduction. 2002. -V.124. - P.353-363.

186. Spink N., Brown D.G., Skelly J.N., Neidle S. Sequence-dependent effects in drug-DNA interaction: the crystal structure of Hoechst 33258 bound to the d (CGCAAATTTGCG) 2 duplex. // Nucleic Acids Res. 1994. - V.22, №9. -P.1607-1612.

187. Stein C.A., Cohen J.S. Oligodeoxynucleotides as inhibitors of gene expression: a review. // Cancer Res. 1988. - V.48, №10. - P.2659-2668.

188. Suzuki O., Asano T., Yamamoto Y., Takano K., Koura M. Development in vitro of preimplantation embryos from 55 mouse strains. // Reprod. Fertil. Dev.- 1996. V.8, №6. - P.975-980.

189. Takeda T., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence- accelerated mouse (SAM): a novel murine model of senescence. // Exp. Gerontol. 1997a. - V.32, №1/2. - P.105-109.

190. Takeda T., Matsushita T., Kurozumi M., Takemura K., Higuchi K., Hosokawa M. Pathobiology of the senescence-accelerated mouse (SAM). // Exp. Gerontol. 1997b. - V.32, №1/2. - P.l 17-127.

191. Tam P.P.L., Rossant J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development.// Development. 2003. - V. 130, № 25. - P. 61556163.

192. Templeton A., Morris J.K., Parslow W. Factors that affect outcome of in-vitro fertilisation treatment. // Lancet. 1996. - V.348. - P. 1402-1406.

193. Tilly J.L., Robles R. Apoptosis and its impact in clinical reproductive medicine. // Molecular biology in reproductive medicine / Ed. Fauser B.C.J.M., The Parthenon Publishing Group. 1999. P.79-101.

194. Tsujimoto Y., Shimizu S. Bcl-2 family: life-or-death switch. // FEBS Lett. -2000.-V.466.-P.6-10.

195. Van Blerkom J., Davis P., Mathwig V., Alexander S. Domains of high-polarized and low-polarized mitochondria may occur in mouse and human oocytes and early embryos. // Hum. Reprod. 2002. - V.17, №2. - P.393-406.

196. Van Blerkom J., Davis P., Alexander S. A microscopic and biochemical study of fragmentation phenotypes in stage-appropriate human embryos. // Hum. Reprod. 2001. - V. 16, №4. - P.719-729.

197. Van Blerkom J., Davis P. DNA strand breaks and phosphatidylserine redistribution in newly ovulated and cultured mouse and human oocytes: occurence and relationship to apoptosis. // Hum. Reprod. 1998. - V.13, № 5.1. P.1317-1324.

198. Van der Auwera I., D'Hooghe T. Superovulation of female mice delays embryonic and fetal development. // Hum. Reprod. 2001. - V.16, №6. -P.1237-1243.

199. Vaux D.L., Korsmeyer S.J. Cell death in development. // Cell. 1999. -V.96. -P.245-254.

200. Vaux D.L., Strasser A. The molecular biology of apoptosis (review). // Proc. Natl. Acad. U.S.A. 1996. - V.93. - P.2239-2244.

201. Voss A.K., Thomas T., Petrou P., Anastassiadis K., Scholer H., Gruss P. Taube nuss is a novel gene essential for the survival of pluripotent cells of early mouse embryos. // Development. 2000. - V.127. - P.5449-5461.

202. Waid D.K., McLoon S.C. Ganglion cells influence the fate of dividing retinal cells in culture // Development. 1998. - V.125, №6. - P. 1059-1066.

203. Wang X., Sharma R.K., Sikka S.C., Thomas A.J. Jr., Falcone T., Agarwal A. Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility. // Fertil. Steril. 2003. -V.80,№3.-P.531-535.

204. Warner C.M., McElhinny A.S., Wu L., Cieluch C., Ke X., Cao W., Tang C., Exley G.E. Role of the Ped gene and apoptosis genes in control of preimplantation development. // J. Assist. Reprod. Genet. 1998. - V.15, №5. -P.331-337.

205. Watson A.J., Barcroft L.C. Regulation of blastocyst formation. // Front. Biosci. 2001. - V.6. - P.d708-d730.

206. Weigent D.A., Blalock J.E., LeBoeuf R.D. An antisense oligodeoxynucleotide to growth hormone messenger ribonucleic acid inhibits lymphocyte proliferation. // Endocrinology. 1991. - V. 128. - P.2053-2057.

207. Weiss B., Davidkova G., Zhou L.W. Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. // Cell. Mol. Life Sci. 1999. -V.55, №3. - P.334-358.

208. West A.P., Cooke B.A. A novel method to modulate desensitization and truncation of luteinizing hormone receptors using antisense oligodeoxynucleotides. // Mol. Cell. Endocrinol. 1991. - V.79. - P.R9-R14.

209. Weyermann J., Lochmann D., Zimmer A. Comparison of antisense oligonucleotide drug delivery systems // J. Control. Release. 2004. - V.100. -P.411-423.

210. Wiley L.M. Trophectoderm: the first epithelium to develop in the mammalian embryo. // Scanning Microsc. 1988. - V.2, №1. - P.417-426.

211. Wingard L.B., Brody T.M., Larner J., Schwartz A. Human pharmacology: molecular-to-clinic // United States of America Mosby-Year Book. 1991.

212. Winston N. Regulation of early embryo development: functional redundancy between cyclin subtypes. // Reprod. Fértil. Dev. 2001. - V.13. -P.59-67.

213. Wu L., Exley G.E., Warner C.M. Differential expression of Ped gene candidates in preimplantation mouse embryos. // Biol. Reprod. 1998. - V.59. - P.941-952.

214. Wuu Y.D., Pampfer S., Becquet P., Vanderheyden I., Lee K.H., De Hertogh R. Tumor necrosis factor a decreases the viability of mouse blastocysts in vitro and in vivo. // Biol. Reprod. 1999. - V.60. - P.479-483.

215. Wu-Pong S. Alternative interpretations of the oligonucleotide transport literature: insights from nature. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2000. - V.44, № 1. -P.59-70.

216. Wu-Pong S, Weiss TL, Hunt CA. Antisense c-myc oligodeoxyribonucleotide cellular uptake. // Pharm. Res. 1992. - V.9, №8. -P.1010-1017.

217. Xu J., Cheung T., Chan S.T., Ho P., Yeung W.S. The incidence of cytoplasmic fragmentation in mouse embryos in vitro is not affected by inhibition of caspase activity. // Fértil. Steril. 2001. - V.75, № 5. - P.986-991.

218. Yao G.-Q., Sun B.H., Weir E.C., Insogna K.L. A role for cell-surface CSF-1 in osteoblast-mediated osteoclastogenesis // Calcif. Tissue Int. 2002. - V.70. -P.339-346.

219. Yakubov L.A., Deeva E.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M., Ryte A.S., Yurchenko L.V., Vlassov V.V. Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: involvement of specific receptors? // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989. -V.86, №17. - P.6454-6458.

220. Yang J., Ding X., Zhang Y., Bo X., Zhang M., Wang S. Fibronectin is essential for hepatitis B virus propagation in vitro: May be a potential cellular target? // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. - V.344. - P.757-764.

221. Yang H.W, Hwang K.J., Kwon H.C., Kim H.S., Choi K.W., Oh K.S. Detection of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis in human fragmented embryos. // Hum. Reprod. 1998. - V.4, № 4. - P.998-1002.

222. Yoshinaga K. Uterine receptivity for blastocyst implantation. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988. - V.541. - P.424-431.

223. Yu R.K., Yanagisawa M. Glycobiology of neural stem cells. // CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2006. - V.5, №4. - P.415-423.

224. Zakeri Z., Lockshin R.A., Criado-Rodríguez L.M., Martinez-A.C. A generalized caspase inhibitor disrupts early mammalian development. // Int. J. Dev. Biol. 2005. - V.49, № 1. - P.43-47.

225. Zaletov S., Zaeva V., Semenova M., Zakharova E., Kosheleva N. An antisense approach can improve pregnancy rate. // Abstracts of the 22th Annual Meeting of the ESHRE, Prague, Czech Republic. 2006. - P. 122.

226. Zamecnik P.C., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1978. - V. 75, №1. -P.280-284.

227. Zander D.L., Thompson J.C., Lane M. Perturbations in mouse embryo development and viability caused by ammonium are more sereve after exposure at the cleavage stages. // Biol. Reprod. 2006. - V.74. - P.288-294.

228. Zheng P., Schramm R.D., Latham K.E. Developmental regulation and in vitro culture effects on expression of DNA repair and cell cycle checkpoint control genes in rhesus monkey oocytes and embryos. // Biol. Reprod. 2005. -V.72, №6. P.1359-1369.

229. Zhou B-B.S., Elledge S.J. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective. // Nature. 2000. - V.408. - P.433-439.

230. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. // Tissue Eng. 2001. - V.7, №2. - P.211-228.

231. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridixation prediction. //Nucleic Acids Res. 2003. - V.31, №13. - P.3406-3415.

Информация о работе

Кошелева, Настасья Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.30

Диссертация

Анализ нарушений раннего эмбрионального развития и их коррекция с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы