Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические и генетические аспекты регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и генетические аспекты регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях"

004616277

ЛЕБЕДЕВА ИРИНА ЮРЬЕВНА

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛАКТИНОМ ОВАРИАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ КОРОВ НА МОЛЕКУЛЯРНОМ И КЛЕТОЧНОМ УРОВНЯХ

03.01.04. - Биохимия 03.02.07.-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы 2010

~ 2 ЛЕН 20Ю

004616277

Работа выполнена на кафедре генетики, разведения и биотехнологии животных зооинженерного факультета Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный аграрный университет.

Научные консультанты:

доктор сельскохозяйственных наук, профессор, академик РАСХН Эрнст Лев Константинович; доктор биологических наук, профессор Голубев Александр Константинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич; доктор биологических наук Маленко Галина Петровна; доктор биологических наук, профессор Шихов Игорь Яковлевич

Ведущее учрезвдение: ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита состоится 14 декабря 2010 года, в 10 часов, на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубро-вицы, ГНУ ВИЖ РАСХН, т/факс (4967) 65-11-01.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ РАСХН. Автореферат разослан « 2010 года.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03

И.В. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы воспроизводительная способность коров с высокой молочной продуктивностью неуклонно снижается, что связано с нарушением у них различных физиологических функций, в том числе овариальной (Chagas et al., 2007; Dobson et al., 2007). Дисфункция яичников у высокопродуктивных животных приводит к неполноценному развитию доминантных фолликулов, изменению стероидогенеза, снижению жизнеспособности ооцитов и их компетенции к эмбриональному развитию. Как известно, гонадотропные гормоны являются ключевыми регуляторами фолликуло- и оогенеза у млекопитающих, однако характер их секреции изменяется лишь незначительно у молочных коров с пониженной воспроизводительной способностью (Gong, 2002). В качестве основных эндокринных факторов, связанных с ослаблением овариальной активности у высокоудойных коров, обычно рассматриваются метаболические гормоны (Gong, 2002; Chagas et al., 2007). Важную роль в этих условиях также может играть гипофизарный гормон ПРЛ, основной функцией которого является регуляция репродукции млекопитающих (Bachelot, Binart, 2007). Ряд данных указывает на то, что нарушения в проведении сигнала ПРЛ в овариальные клетки на рецепторном или пострецепторном уровне приводят к ухудшению фертильности самок, в том числе к неадекватному развитию фолликулов, снижению качества ооцитов, оплодотворяемости яйцеклеток и их способности к дальнейшему развитию (Jinno et al., 1997; Bole-Feysot et al., 1998; Bartke, 1999). Таким образом, становится актуальным вопрос о роли ПРЛ в регуляции овариальной функции у крупного рогатого скота, в том числе на молекулярном и клеточном уровнях. Особый интерес представляет изучение влияния ПРЛ на развитие биологически полноценных яйцеклеток, что связано с возможностью его использования при экстракорпоральном созревании ооцитов коров для повышения их компетенции к эмбриональному развитию (Кузьмина и др., 2001).

В настоящее время имеется лишь незначительное число работ, затрагивающих вопросы влияния ПРЛ на созревание фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота (КРС). Поэтому комплексное исследование путей и механизмов действия ПРЛ на соматические и половые клетки овариальных фолликулов коров имеет актуальное значение как для понимания фундаментальных принципов гормональной регуляции фолликуло- и оогенеза, так и для оптимизации методов биотехнологии репродукции у КРС.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлось исследование биохимических и генетических аспектов регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях и создание на этой основе теоретической модели, описывающей механизмы влияния ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность фолликулярных клеток. В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать физиологические факторы, связанные с репродуктивным статусом животных и стадией развития/атрсзии фолликулов, детерминирующие содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости.

2. Охарактеризовать взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами на клетках гранулезы и его зависимость от интрафолликулярных компонентов и степени зрелости фолликулов.

3. Оценить роль онтогенетических и гормональных факторов в регуляции компетентности гранулезных клеток к связыванию ПРЛ.

4. Провести анализ экспрессии альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в

овариальных клетках различного типа.

5. Изучить характер действия ПРЛ на экспрессию собственного рецептора в фолликулярных клетках в зависимости от их сопряжения с ооцитом.

6. Выполнить сравнительный анализ индивидуального и совместного влияния ПРЛ и метаболических гормонов in vitro на функциональную активность соматических клеток из антральных фолликулов.

7. Исследовать регуляторные эффекты ПРЛ при созревании ооцитов, окруженных клетками кумулюса, в различных системах культивирования.

8. Провести сравнительную оценку участия клеток гранулезы в опосредовании действия ПРЛ и соматотропного гормона in vitro на ооциг-кумулюсные комплексы.

9. Охарактеризовать влияние ПРЛ in vitro на цАМФ-зависимый механизм регуляции созревания изолированных и окруженных кумулюсом ооцитов.

10. Изучить участие клеток кумулюса в проведении сигналов ПРЛ в половые клетки и оценить роль протеинкиназ как медиаторов гормонального действия на ооциты и ооцит-кумулюсные комплексы.

11. Идентифицировать сигнальный каскад, опосредующий влияние ПРЛ на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза.

12. Исследовать функцию клеток кумулюса в реализации влияния ПРЛ на приобретение ооцитами способности к эмбриональному развитию в присутствии гонадотропных гормонов.

Научная новизна. Диссертационная работа является первым комплексным исследованием характера, путей и механизмов влияния ПРЛ на половые и соматические клетки антральных фолликулов коров, а также факторов, детерминирующих реализацию и степень гормонального воздействия. При выполнении работы впервые были получены следующие результаты:

Установлена зависимость содержания ПРЛ в фолликулярной жидкости от фазы полового цикла животных и степени атрезии антральных фолликулов. Определены параметры взаимодействия ПРЛ со своими рецепторами на клетках гранулезы и обнаружено снижение концентрации лактогенных рецепторов на заключительной стадии созревания фолликулов. Охарактеризовано влияние репродуктивного статуса животных, лютеальной дифференцировки и воздействия соматотро-пина на компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ. Выявлено присутствие мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках кумулюса и гранулезы и показан тканеспецифический характер экспрессии этих альтернативных изоформ в яичнике коров. Продемонстрировано регуляторное влияние ПРЛ in vitro на экспрессию собственного рецептора в ооцит-кумулюсных комплексах на уровне транскрипции соответствующего гена и в клетках гранулезы - на уровне альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Показана зависимость ростостиму-лирующего эффекта ПРЛ в культуре гранулезных клеток от степени зрелости антральных фолликулов и выявлена модуляция соматотропином регуляторного действия ПРЛ на синтез ДНК в этих клетках. Обнаружено ингибирующее влияние ПРЛ на деструктивные процессы в культивируемых клетках гранулезы из атрети-ческих фолликулов. Продемонстрировано in vitro стимулирующее действие ПРЛ на ядерное созревание окруженных кумулюсом ооцитов, а также его тормозящее действие на дегенеративные изменения ядерного материала в яйцеклетках, связанное с освобождением ионов кальция из внутриклеточных депо. Охарактеризована роль клеток гранулезы как медиаторов влияния ПРЛ на мейотические преобразования

хромосом в ооцитах. Установлено участие тирозинкиназ в реализации прямого и опосредованного клетками кумулюса действия ПРЛ на мейоз ооцитов. Выявлено взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых ПРЛ и цАМФ в половых и соматических клетках фолликулов. Идентифицирован механизм индуцирующего влияния ПРЛ на реинициацию мейоза при повышении внутриклеточного уровня цАМФ, включающий активацию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ в ооцитах. Показано участие клеток кумулюса в опосредовании стимулирующего влияния ПРЛ на цитоплазматическое созревание ооцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Основной конструктивной характеристикой работы является полученная информация, необходимая для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции про-лактииом созревания фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота, которая может быть использована при оптимизации методов вспомогательных репродуктивных технологий. На основании полученных данных предложена и научно обоснована теоретическая модель, описывающая механизмы действия ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность клеток кумулюса. Модернизирована система созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов коров посредством предварительной синхронизации мейоза с помощью изобутилметилксантина и последующего одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ, обусловливающая повышение качества цитоплазматического созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота. Разработаны системы культивирования ооцит-кумулюсных комплексов в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ и соматотропина, позволяющие снижать частоту хромосомных нарушений при созревании ооцитов. Предложено использование ПРЛ для снятия блокады мейоза, вызванной цАМФ-повышающими реагентами.

Основные положения, выносимые на защиту.

• Содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости коров зависит от фазы полового цикла, степени зрелости и атрезии фолликулов.

• Компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ детерминируется уровнем цитодифференцировки и не зависит от репродуктивного статуса животных и воздействия соматотропина.

• В ооцитах, клетках кумулюса и гранулезы коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ; экспрессия альтернативных изоформ носит тканеспецифический характер и регулируется гомологичным гормоном.

• ПРЛ оказывает in vitro ростостимулирующее действие на клетки гранулезы, которое определяется степенью зрелости фолликулов и модулируется сомато-тропином и инсулином, а также тормозящее действие на деструктивные процессы в этих клетках.

• У коров функционируют три автономных пути реализации влияния ПРЛ на ооцит: 1) прямой, 2) через сопряженные с ооцитом клетки кумулюса и 3) опосредованный клетками гранулезы.

• Прямое и опосредованное кумулюсом влияние ПРЛ на ооциты достигается путем активации тирозинкиназ при базальном уровне внутриклеточного цАМФ.

• цАМФ играет роль триггера специфического сигнального каскада, индуцируемого пролактином непосредственно в ооцитах, который вовлекает активацию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ, что приво-

дит к реинициации мейоза.

• Клетки кумулюса опосредуют стимулирующее влияние ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на компетенцию ооцитов к последующему эмбриональному развитию.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 23 международных научных конференциях: «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных» (С.-Петербург-Пушкин, 1994), «Селекционно-биотехнологические методы повышения генетического потенциала с.-х. животных» (Киев, 1994), «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 1995; 2000), 1-й центральной европейской конференции по репродукции животных и сателлитом симпозиуме (Олыптын, Польша; Думмерсторф, Германия, 1996), «Проблемы индивидуального развития с.-х. животных» (Киев, Украина, 1997), ежегодной конференции Международного Общества по трансплантации эмбрионов (Бостон, США, 1998; Сан Диего, США, 2009), 3-й конференции по эндокринологии сельскохозяйственных животных (Брюссель, Бельгия, 1998), ежегодной конференции Европейской Ассоциации Животноводства (Цюрих, Швейцария, 1999; Рим, Италия, 2003), 8-м и 11-м конгрессе по биотехнологии в репродукции животных (Бернбург, Германия, 2001; Велке Лосины, Чехия, 2004), 8-й Балтийской конференции по разведению и генетике животных (Каунас, Литва, 2002), ежегодной конференции Европейского Общества по репродукции домашних животных (Парма, Италия, 2002), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005; 2009), «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007), «Проблемы повышения эффективности производства животноводческой продукции» (Жодино, Белоруссия, 2007), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (Дубровицы, 2008), «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных» (С.Петербург, 2008), «Актуальные проблемы ветеринарной биологии» (Москва, 2009), а также на 1-ом съезде общества генетиков и селекционеров России (Саратов, 1994), Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» и «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (С.-Петербург, 1999, 2009).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, из них 18 - в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК («Биохимия», «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», «Онтогенез», «Цитология», «Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова», «Сельскохозяйственная биология», «Theriogenology»),

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 371 странице, содержит 43 таблицы, 51 рисунок и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических предложений и библиографического списка, включающего 575 цитируемых источников.

Благодарность. Автор выражает глубокую благодарность своим научным консультантам профессору|Голубеву А.К.| и академику РАСХН Эрнсту Л.К. за неоценимую помощь и поддержку. Автор искренне признателен сотрудникам ГНУ ВНИИГРЖ профессору Кузьминой Т.И., Денисенко В.Ю., Кибардиной Т.В., Скот-ти О.С., сотрудникам ГНУ ВИЖ Волковой H.A., Гладырь Е.А., Сингиной Г.Н., Та-радайник Т.Е., а также сотруднику БиНИИ СПбГУ Гойло Т.А. за помощь в проведении исследований. Особую благодарность автор выражает чл.-корр. РАСХН Зиновьевой H.A. за всестороннюю поддержку и ценные советы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 1993 по 2009 гг. Экспериментальные исследования проводились на кафедре генетики, разведения и биотехнологии животных Санкт-Петербургского государственного аграрного университета (СПбГАУ), в отделе биотехнологии ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ПТУ ВИЖ Россельхозакадемии и в отделе ветеринарной репродукции Копенгагенского университета. Схема исследований представлена на рисунке 1.

Яичники коров

Желтое тело (ЖТ)

Клетки граиулезы (КГ)

Монослойная культура

Антральные Морфологическая

фолликулы оценка

X

Ооцит-кумулюспые комплексы (ОКК)

1

Фолликулярная жидкость (ФЖ)

РИА

концентрации

пролакгипа (ПРЛ)

ОТ-ПЦР-аиализ мРНК рецептора ПРЛ

Клетки кумулюса (КК)

Денудиро-

ванные ооцнты (ДО)

Культивирование ОКК

Суспензионное культиви-роваиие

Бессыворо-

точпая инкубация

Анализ иптепсивио-стн синтеза ДНК Получение кондиционированных сред

1

Радиорецептор-11ыи анализ лакгогепных рецепторов

РИА концентрации эстрадиола и прогестерона

Оценка жизнеспособности КГ и цито-генетический анализ КГ

Культпвиро-вапие ДО

Культивирование эмбрионов

Цитогеиетиче-ский анализ ооцитов

Оплодотворение ооцитов

Цитогенетиче-ский анализ зигот и эмбрионов Морфо-функциональная характеристика КК

ИФА содержания цАМФ в ооцитах и ОКК Флуоресцентный анализ содержания депонированного Са2+

Рис. 1. Общая схема исследований.

Объектом исследований служили антральные фолликулы, ооцит-кумулюспые комплексы (ОКК), клетки гранулезы (КГ) и жидкость из антральных фолликулов, а также желтое тело (ЖТ) яичников коров и телок. Во всех экспериментах использовали половозрелых животных с эстральным циклом, что подтверждалось присутствием функционального или регрессирующего желтого тела в одном из яичников. В отдельном исследовании (раздел 3.3.1) использовали коров на ранней стадии стельности (до 3-х месяцев) и неполовозрелых 2-6-месячных телок. Фазу эстраль-ного цикла животных (раздел 3.1.1) определяли путем обследования попарно яич-

ников, основываясь на наличии и состоянии желтого тела (Голубев и др., 1989). Качество антральных фолликулов (раздел 3.1.2) оценивали на основании известных морфологических критериев (Kruip, Dieleman, 1982). Фолликулярную жидкость (ФЖ) и КГ получали из фолликулов диаметром 1-2, 3-5, 6-10 и 11-20 мм, объединенных в группы на основании предложенной ранее классификации (Savio et al., 1990). Сразу после выделения из фолликулов и в конце культивирования проводили оценку жизнеспособности КГ и исследование их ядерного статуса. Долю живых клеток в суспензии определяли с помощью окрашивания 0,1 %-ным трипановым синим. Цитогенетический анализ состояния ядерного материала в КГ проводили после их фиксации смесыо метанола и уксусной кислоты (3:1) и окрашивания азу-ром-эозином. Наличие деструктивных изменений в клетках оценивали на основании морфологических критериев, разработанных ранее для клеток гранулезы, подвергающихся апоптозу (Jolly et al., 1997). Концентрацию ПРЛ в ФЖ и сыворотке крови определяли твердофазным радиоиммунологическим методом (Тараненко и др., 1975). ОКК выделяли из фолликулов диаметром 2-8 мм и промывали в среде ТС-199, содержащей 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 10 мкг/мл гепарина. В некоторых экспериментах в промывочную среду добавляли изобутил-метилксантин (ИБМК) до конечной концентрации 0,5 мМ (разделы 3.11 и 3.12). Для исследований отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Диссоциацию клеток кумулюса (КК) проводили путем обработки ОКК коллагеназой II (2 мг/мл) в течение 20 мин при 37 "С. Для анализа экспрессии рецепторов ПРЛ использовали развитое ЖТ, которое хранили при -70°С.

В экспериментах применяли препараты гипофизарного бычьего ПРЛ (Эндокринологический научный центр РАМН, Москва), рекомбинантного бычьего сома-тогропного гормона (СТГ; Monsanto, США) и бычьего инсулина (Sigma, США).

Изучение специфического связывания 1251-ПРЛ и 1251-СТГ с КГ выполняли стандартным методом, основанным на образовании комплекса: меченый гормон-рецептор (Варфоломеев, Зайцев, 1982). Реакционную смесь, состоящую из 100 мкл клеточной суспензии (от 0,2х106 до 3,0х106 клеток), 50 мкл инкубационного буфера и 50 мкл 1251-ПРЛ (5-7 нг, 500000-700000 имп/мин) или 1251-СТГ (5-7 нг, 350000600000 имп/мин), инкубировали 42 ч при температуре 37°С. В качестве основного служил буфер следующего состава: 10 мМ Tris-HCl, 1 мг/мл БСА, 5 мМ MgCl2, 0,2 мг/мл мертиолата, рН 7,1. Дополнительно использовали тот же буфер, содержащий MgCl2 в различной концентрации (0,1, 5, 35 и 70 мМ). Радиоиодирование гормонов проводили модифицированным хлораминовым методом (Тараненко и др., 1975). Неспецифическое связывание меченых гормонов определяли в присутствии избытка соответствующих немеченых гормонов в концентрации 250 мкг/мл. Кривые замещения получали при инкубации клеточной суспензии (1х106-2х10б клеток) с меченым ПРЛ (в фиксированной концентрации) в присутствии возрастающих концентраций немеченого ПРЛ (2,5-50 мкг/мл). Связывающие характеристики рецепторов ПРЛ определяли путем обработки данных замещения с помощью графического метода Скэтчарда (Scatchard, 1949). Для изучения конкурентного связывания ПРЛ и СТГ с гранулезными клетками смесь суспензии клеток и 1251-ПРЛ (в фиксированной концентрации) инкубировали с немеченым ПРЛ или СТГ в возрастающей концентрации (5-125 мкг/мл). Кроме того, было определено специфическое связывание 12 1-ПРЛ с клетками в присутствии 125 мкг/мл овечьего ФСГ (NIAMDD, США), бычьего ЛГ (USDA-Reproduction Lab., США) и инсулина.

Для получения моноелойной культуры КГ предварительно культивировали при 38,5°С в атмосфере с 5 % С02 в течение 24 ч в среде ТС-199, содержащей 10 % феталыюй бычьей сыворотки (ФБС), затем в течение последующих 24 ч - в среде ТС-199, содержащей 10 % ФБС и 0-500 нг/мл ПРЛ (раздел 3.5.2) или 48 ч - в среде ТС-199, содержащей 10 % ФБС и 50 нг/мл ПРЛ или 10 нг/мл СТГ (раздел 3.8). Для вызывания лютеинизации гранулезных клеток (раздел 3.3.2) последние инкубировали в среде ТС-199, содержащей 6 мг/мл БСА, в течение 24 или 48 ч. В опытные группы вносили 5, 10 или 50 нг/мл СТГ. Культивирование клеток в суспензии (раздел 3.6.3) проводили в стеклянных флаконах при непрерывном встряхивании (200 об/мин) в течение 24 и 48 ч в среде ТС-199, содержащей 2 мг/мл БСА, в отсутствие и в присутствии 50 нг/мл ПРЛ, 50 нг/мл СТГ или 100 нг/мл инсулина. Во всех экспериментах была использована суспензия с начальной концентрацией КГ от 1x10й до 2,5х10б на 1 мл среды. Доля живых клеток в суспензии составляла более 60 %, за исключением исследования фолликулов на ранней стадии атрезии (раздел 3.6.3). Концентрацию эстрадиола-17ß и прогестерона в средах, полученных после культивирования КГ, определяли в институте биологии сельскохозяйственных животных (Думмерсторф, Германия) методом радиоиммуноалализа (РИА). Интенсивность синтеза ДНК в КГ оценивали по интенсивности включения в их ДНК 3Н-тимидина. Для этого по (5-10)х104 клеток высевали в лунки 96-луночных планшетов и инкубировали в течение 1 суток в среде ТС-199, содержащей 5 % ФБС, затем в течение 2 суток - в той же среде, содержащей 0,1 % ФБС. Далее среду со сниженной концентрацией сыворотки заменяли средами, содержащими ПРЛ в различных концентрациях (от 5 нг/мл до 50 мкг/мл). В качестве сред использовали ТС-199 без добавок или ТС-199, содержащую 5 % ФБС или инсулин (100 нг/мл) или СТГ (5 и 50 нг/мл). Одновременно с гормонами в лунки вносили 3Н-тимидин (37 кБк/мл), клетки инкубировали 24 ч и определяли включение в них изотопа (Адаме, 1983).

Анализ экспрессии мРНК выполняли методом обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Синтез комплементарной ДНК (кДНК) осуществляли на матрице тотальной РНК (тотРНК). Для получения тотРНК использовали (1-2)х106 КГ или КК, 70-100 денудированных ооцитов (ДО), 100-150 ОКК или 25-50 мг ткани желтого тела. Выделение тотРНК осуществляли с применением реактива TRI Reagent (Sigma) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Процедуру синтеза первой цепи кДНК выполняли с помощью набора "RevertAid Н Minus First Strand cDNA Synthesis Kit" (Fermentas) согласно инструкции фирмы-производителя при использовании случайных 6-мерных прайме-ров (0,2 мкг праймеров на 2 мкг тотРНК). ПНР проводили в инкубационной смеси объемом 15 мкл, содержащей однократный буфер для Taq-полимеразы, 200 мкМ dNTP, 1 ед.акт. Taq-полимеразы, 1,5 мМ MgCl2 и 2 мкл смеси реакции ОТ или воды (отрицательный контроль). В пробы добавляли по 5 пМ прямого и обратного праймеров для амплификации кДНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ (табл. 5) или ß-актина быка (Degen et al., 1983). Амплификацию кДНК проводили в следующих режимах: 95 °С 30 с, 54 "С 30 с, 72 °С 90 с, 40 циклов (рецептор ПРЛ) и 95 °С 30 с, 60 °С 30 с, 72 °С 90 с, 40 циклов (ß-актин). В случае ооцитов был применен метод ПЦР с внутренними праймерами. Первый раунд ПЦР проводили в соответствии с вышеописанной методикой. Во втором раунде ПЦР в реакционную смесь вносили 1 мкл амплификата, полученного в ходе первого раунда для длинной или короткой изоформы рецептора ПРЛ (вместо продуктов реакции ОТ), и по 9 пМ прямого и обратного праймеров (табл. 5). Амплификацию проводили в течение

30 циклов в вышеуказанном режиме. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 2 %-ном агарозном геле и фотодокументировали. Соотношение уровней длинной и короткой изоформ мРНК рецептора ПРЛ в соматических клетках определяли кинетическим методом, основанным на анализе накопления продуктов конкурентной ПЦР. С этой целью в реакционную смесь вносили комбинацию праймеров одновременно для обеих изоформ. Амплификацию проводили в вышеуказанном режиме в течение 34-40 циклов. Относительную интенсивность полос на геле, соответствующих ПЦР-продуктам, определяли с помощью компьютерной программы TotalLab v2.01. Полученные данные были нормализованы на длину фрагментов. В каждом эксперименте вычисляли среднее значение соотношения продуктов конкурентной амплификации для нескольких циклов ПЦР. Для полуколичественной оценки содержания мРНК рецептора ПРЛ в культивируемых КГ и ОКК проводили анализ кинетики амплификации. С этой целью параллельно амплифицировали участок кДНК рецептора ПРЛ, общий для обеих изоформ, участки кДНК рецептора ПРЛ, специфичные для длинной или короткой изоформ, и фрагмент кДНК ß-актина (внутренний стандарт). В реакционную смесь добавляли по 20 пМ прямого и обратного праймеров для рецептора ПРЛ (табл. 5) или по 2 пМ соответствующих праймеров для ß-актина (прямой праймер: 5'-AGATGACCCAGATCATGT-3', обратный праймер: 5'-AGGTAGTTTCGTGAATGC-3'). Амплификацию кДНК выполняли в следующем режиме: 95 °С 30 с, 54 °С 30 с, 72 °С 60 с, 34-40 циклов. Относительную интенсивность полос на геле определяли по вышеописанной методике. Содержание мРНК рецептора ПРЛ выражали в относительных единицах (o.e.) интенсивности сигнала ПЦР-продуктов для ß-актина.

Культивирование ОКК и ДО проводили при температуре 38,5°С в атмосфере с 5 % С02 и 90%-ной влажностью. Время инкубации составляло от 2,5 до 24 ч. В качестве контроля применяли несколько систем культивирования: 1) среду ТС-199, содержащую 10 % ФБС, 2,5 мМ лактата кальция, 2 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина (основная среда), 2) основную среду, содержащую 500 нг/мл эстрадиола-Щ (Serva, Германия) и 15 мкг/мл свиного ФСГ (Sigma), 3) основную среду, содержащую 500 нг/мл эстрадиола-17р, 15 мкг/мл свиного ФСГ и 6 мг/мл БСА (вместо 10 % ФБС), 4) основную среду, кондиционированную клетками гра-нулезы. В зависимости от цели эксперимента в среду вносили: ПРЛ (от 5 до 500 нг/мл; 20 МЕ/мг), дибутирил цАМФ (0,5; 1 или 2 мМ; Sigma), форсколин (5, 10 или 20 мкМ; Sigma), теофиллин (2,5; 5 или 10 мМ; ICN, США), генистейн (5, 10 или 20 мкг/мл; 1CN), калпостин С (100 нМ; Calbiochem, Германия), ИБМК (0,5 мМ; Sigma), цилостамид (20 мкМ; Biomol, США), ролипрам (100 мкМ; Biomol). В серии экспериментов по оплодотворению ооцитов ОКК и ДО культивировали в течение 22 ч в 500 мкл среды ДМЕМ, содержащей 10 ME/мл лошадиного ХГ и 5 ME/мл человеческого ХГ (Intervet Scandinavia, Дания), 1 мг/мл глюкозы, 1 мМ пирувата натрия, 4 мМ глутамина, 5 % эстральной сыворотки коров и 50 мкг/мл гентамицина. Среда в опытных группах содержала дополнительно 50 нг/мл ПРЛ. В конце 24-часового периода культивирования ОКК оценивали морфологически на основании известных критериев степени экспансии кумулюса (Calder et al., 2001). Цитогенетический анализ состояния ядерного материала в КК проводили, как описано выше для КГ. Содержание Са2н во внутриклеточных депо ооцитов определяли по интенсивности флуоресценции комплекса Са-хлортетрациклин при облучении ультрафиолетовым излучением (Engelmann et al., 1990). Интенсивность свечения измеряли с помощью люминесцентного микроскопа, снабженного фотометрической на-

садкой. Флуоресценцию возбуждали при длине волны 380-400 нм, излучение регистрировали при длине волны 520±10 нм. Перед проведением анализа морфологически нормальные ооциты очищали от кумулюса, помещали в кварцевые ячейки с физиологическим раствором, содержащим 40 мкМ хлортетрациклина, и инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Интенсивность флуоресценции ооцитов измеряли как электрический сигнал. Из полученных значений вычитали величину фонового излучения. Содержание депонированного Са2+ выражали в условных единицах (у. е.) интенсивности флуоресценции ооцитов. Концентрацию цАМФ в ОКК и ооцитах определяли методом иммуноферментного анализа (Bilodeau-Goeseels, 2003). Каждый образец для анализа содержал группы из 20-40 ДО, 5-10 ОКК диаметром 0,350,40 мм или 20-40 ооцитов, изолированных из ОКК после культивирования. Все манипуляции с клетками до и после 3,5-часового культивирования проводили в промывочной среде, содержащей 0,5 мМ ИБМК. Перед анализом ДО, ОКК или ооциты, изолированные из ОКК, инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин в 200 мкл 0,1 М НС1. Образцы центрифугировали при 12000 g 5 мин, супернатант хранили при -20 °С. Концентрацию цАМФ в образцах измеряли с помощью наборов "Cyclic AMP Plus Enzyme Immunoassay Kit" после процедуры аце-тилирования согласно инструкции фирмы Biomol. Оплодотворение ооцитов выполняли по методу Парриша и соавт. (Parrish et al., 1986). Культивирование эмбрионов проводили в синтетической жидкости яйцевода, содержащей 5 % эстраль-ной сыворотки коров, 0,3 мМ цитрата натрия, 2,8 мМ миоинозитола, 0,2 мМ глута-мина и комплекс аминокислот (Holm et al., 1999), при температуре 38,5°С в атмосфере с 5 % СО;, 5 % 02 и 90 % N2. Через 48 ч после процедуры оплодотворения определяли выход эмбрионов, на 5-й и 8-й день - выход морул и бластоцист. Для цитогенетического исследования ядерного материала ооцитов, зигот и эмбрионов готовили суховоздушные препараты по методу Тарковского (Tarkowski, 1966).

Все эксперименты были выполнены в 3-7 независимых повторностях. Данные обрабатывали методом х2 или дисперсионным анализом при помощи программы SigmaStat. Достоверность различия сравниваемых значений оценивали с использованием критерия или Тьюки, при этом был принят уровень значимости р < 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Идентификация физиологических факторов, детерминирующих ин-трафолликулярное содержание пролактина у коров. Концентрация ПРЛ в ФЖ является одним из биохимических показателей степени гормонального влияния на фолликулярные клетки. В свою очередь, вариации в интрафолликулярном содержании ПРЛ могут быть следствием различных физиологических изменений, происходящих в процессе развития или регрессии фолликулов.

3.1.1. Содержание пролактина в фолликулярной жидкости и сыворотке крови в разные фазы эстрального цикла. Интенсивность процессов, связанных с развитием или регрессией антральпых фолликулов в яичниках КРС, в значительной степени зависит от фазы полового цикла (Driancourt, 2001). В этой связи был проведен сравнительный анализ содержания ПРЛ у коров в жидкости фолликулов различного диаметра в разные фазы эстрального цикла. Концентрация ПРЛ в ФЖ возрастала (р < 0,05) в фолликулярную фазу при увеличении диаметра фолликулов от 3-5 до 11-20 мм (табл. 1). В лютеальную фазу не было выявлено достоверных различий в интрафолликулярном содержании гормона между фолликулами разного размера. Также было обнаружено, что концентрация ПРЛ в жидкости малых фол-

ликулов выше в лютеальную, чем в фолликулярную фазу цикла (р < 0,01). При этом концентрация ПРЛ в сыворотке крови коров в лютеальную фазу в 2 раза превышала таковую в фолликулярную фазу (60,0±8,3 против 29,7±5,9 нг/мл, р < 0,05).

Таблица 1. Концентрация ПРЛ у коров в жидкости антральных фолликулов в

Диаметр фолликулов, мм Число исследованных яичников Концентрация ПРЛ в ФЖ в фолликулярную фазу (х ± т), нг/мл Число исследованных яичников Концентрация ПРЛ в ФЖ в лютеальную фазу (х±т), нг/мл

3-5 (малые) 13 3,7 ± 0,7а 37 7,0 ± 0,5В

6-10 (средние) 13 5,4 ± 0,5 29 7,2 ± 0,5

11 - 20 (большие) 9 6,1 ±0,3" 24 6,5 ± 0,6

Примечание. Достоверные различия: р < 0,05; а,вр < 0,01.

Таким образом, характер изменения концентрации ПРЛ в ФЖ в процессе роста и развития фолликулов различается в разные фазы эстралыгого цикла. Выявленные отличия связаны в первую очередь с повышением содержания гормона в жидкости малых фолликулов в лютеальную фазу, что может быть обусловлено, по крайней мере частично, повышением секреции ПРЛ гипофизом в этот период.

3.1.2. Концентрация проластина в жидкости фолликулов с различными признаками атрезии. В качестве основных причин гетерогенности антральных фолликулов по содержанию гормонов в ФЖ рассматриваются различия в их мик-роваскуляризации и секреторной активности фолликулярных клеток, которые обусловлены разной интенсивностью протекания атретических процессов (Roche, 1996). Взаимосвязь между различными морфологическими признаками атрезии и концентрацией ПРЛ в ФЖ была исследована при использовании антральных фолликулов диаметром 10-20 мм из яичников на стадии фолликулярного роста. Концентрация ПРЛ в жидкости нормальных фолликулов с высокой степенью васкуля-ризации была в 1,7 раза выше, чем в жидкости атретических фолликулов с низкой степенью васкуляризации (9,5±0,9 против 5,6±0,4 нг/мл, р < 0,001). Содержание ПРЛ в ФЖ также уменьшалось в 1,5 раза (с 9,0±1,1 до 6,2±0,8 нг/мл, р < 0,05) при увеличении доли пикнотических гранулезных клеток от 0-20 % до >40 %. Полученные данные показывают, что у коров снижение концентрации ПРЛ в ФЖ сопутствует усилению атретических процессов в больших антральных фолликулах.

3.1.3. Изменение интрафолликулярного содержания пролактина и уровня его связывания с клетками в процессе роста антральных фолликулов. Способность клеток связывать шрмон является одним из физиологических факторов, влияющих на его концентрацию в биологических жидкостях. В яичниках коров на стадии фолликулярного роста концентрация ПРЛ в ФЖ возрастала с 3,7±1,1 до 6,6±0,6 нг/мл при увеличении диаметра фолликулов от 1-2 до 6-10 мм (р < 0,05). Вместе с тем специфическое связывание 1251-ПРЛ с КГ из фолликулов диаметром 1-2, 3-5 и 6-10 мм не различалось. Увеличение фолликулярного диаметра до 11-20 мм приводило к значительному уменьшению уровня этого связывания (с 45,6±3,1 до 30,1+2,2 фМ на 106 клеток, р < 0,05). Следовательно, в процессе созревания фолликулов в яичниках коров происходят разнонаправленные изменения двух основных параметров, характеризующих степень воздействия ПРЛ на КГ. При этом снижение ПРЛ-связывающей способности клеток имеет место на более поздней стадии развития фолликулов, чем повышение содержания гормона в ФЖ.

3.2. Биохимическая характеристика лактогенных рецепторов на клетках гранулезы из антральных фолликулов коров. Важным условием реализации влияния ПРЛ на фолликулярные клетки является наличие у них соответствующих специфических рецепторов, связывающие свойства которых определяют эффективность гормонального воздействия.

3.2.1. Анализ специфического связывания пролактина с клетками гранулезы. В этих экспериментах была использована смешанная популяция КГ из антральных фолликулов диаметром 1-10 мм. Было обнаружено, что специфическое связывание 1251-ПРЛ с клетками приближается к насыщению через 42 ч инкубации при 37°С. Линейная зависимость между специфическим связыванием и количеством КГ наблюдалась при внесении от 0,5х10б до ЗхЮ6 клеток на пробу. Немеченые гонадотропные гормоны (ФСГ и ЛГ) и инсулин в концентрации 125 мкг/мл проявляли лишь незначительную способность вытеснять меченый ПРЛ из связывающих участков на клетках, что свидетельствовало о специфичности рецепторов. В то же время структурно родственный пролактину СТГ (5-125 мкг/мл) эффективно подавлял специфическое связывание 1 51-ПРЛ с гранулезными клетками. Константы ин-гибирования 1С50, вычисленные на основании кривых замещения 1251-ПРЛ немеченым ПРЛ или СТГ, различались лишь незначительно, составляя соответственно 13,8±1,5 и 20,4±2,5 мкг/мл. Это позволяет предположить, что СТГ может модулировать степень влияния ПРЛ на КГ коров.

3.2.2. Параметры взаимодействия пролактина с рецепторами на клетках из фолликулов различного диаметра. Связывающие характеристики гормональных рецепторов могут изменяться в процессе дифференцировки клеток, которая сопутствует созреванию антральных фолликулов (Fortune, 1994). Анализ данных замещения меченого ПРЛ немеченым в координатах Скэтчарда показал прямолинейную зависимость специфического связывания гормона с КГ из фолликулов всех исследованных диаметров. Это предполагает существование одного типа ПРЛ-связывающих участков на гранулезных клетках с различной степенью дифференцировки. При увеличении диаметра фолликулов от 1-2 до 6-10 мм не было выявлено существенных изменений в константах диссоциации ПРЛ-рецепторных комплексов ((4,58±0,79)х10"7 М против (4,37±0,26)х10"7 М) и в концентрациях лактогенных рецепторов на клетках (11,30±1,60 против 11,07±1,50 пМ на 106 клеток). В то же время число ПРЛ-связывающих участков было значительно ниже (р < 0,05) па клетках из фолликулов диаметром 11-20 мм, чем 3-5 мм, тогда как константы диссоциации не имели достоверных различий (табл. 2). Следовательно, у коров на заключительной стадии созревания фолликулов происходит снижение способности КГ связывать ПРЛ вследствие уменьшения концентрации лактогенных рецепторов.

Таблица 2. Параметры взаимодействия 1251-ПРЛ с рецепторами на клетках _гранулезы из малых и больших антральных фолликулов коров_

Диаметр фолликулов, мм Число экспериментов Константа диссоциации IQ (х±т),М Концентрация связывающих участков (х ± т), пМ на 10б клеток

3-5 3 (5,13 +0,33) х107 14,40 ± 1,08а

11-20 3 (5,61 ± 0,29) х Ю-7 8,10 ± 1,21®

Примечание. Достоверные различия: "'"р < 0,05.

3.2.3. Регуляториое влияние ионов магния на специфическое связывание пролактина с гранулезными клетками. Взаимодействие ПРЛ со своими рецеп-

торами на клетках-мишенях может зависеть не только от свойств самих рецепторов, но и от состава внеклеточной среды, в том числе от концентрации двухвалентных катионов (Ciccia-Torres, Dellacha, 1985). В этой связи было исследовано влияние ионов Mg2' на специфическое связывание ПРЛ с гранулезными клетками из фолликулов диаметром 1-10 мм. В реакционной смеси без добавления ионов Mg2' было выявлено лишь незначительное специфическое связывание 1251-ПРЛ с клетками. Внесение 1 мМ MgCl2 приводило к резкому возрастанию уровня этого связывания (с 2,4±0,3 до 9,4±1,3 %, р < 0,001), который продолжал достоверно повышаться при дальнейшем увеличении концентрации двухвалентных катионов до 70 мМ (по крайней мере, р < 0,05). Вычисленные на основании кривых замещения параметры связывания при разных концентрациях MgCl2 (0 и 5 мМ) свидетельствовали о том, что снижение уровня специфического связывания !251-ПРЛ в отсутствие экзогенных ионов Mg2+ обусловлено уменьшением числа активных связывающих участков на клетках (2,35±0,72 против 13,80±2,87 пМ на 106 клеток, р < 0,05). Таким образом, взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами на КГ в высокой степени зависит от присутствия и концентрации ионов Mg2+ в окружающей среде.

3.3. Оценка роли онтогенетических и гормональных факторов в регуляции пролактин-связывающей способности клеток гранулезы. К числу факторов, влияющих на содержание рецепторов ПРЛ в клетках различного типа, относится возраст и репродуктивный статус животных, стадия развития и физиологическое состояние ткани. При этом основную роль в регуляции содержания лактоген-ных рецепторов в клетках играют различные гормоны, в первую очередь половые стероидные гормоны, ПРЛ и структурно родственный ему СТГ (Kelly et al., 1991).

3.3.1. Связывание пролактина с клетками гранулезы при разном репродуктивном состоянии животных. Периодическая инициация синхронного роста группы антральных фолликулов и их последующая атрезия происходят в яичниках КРС не только во время эстрального цикла, но также до половой зрелости и во время ранней стельности, однако при этих состояниях отсутствует овуляция доминантного фолликула и уменьшается его максимальный диаметр (Ginther et al., 1989; Adams et al., 1994). При проведении исследований не было обнаружено достоверных различий в уровне специфического связывания !251-ПРЛ с КГ коров, находящихся в разном репродуктивном состоянии (табл. 3). Константа диссоциации ПРЛ-рецепторных комплексов ((5,34±0,49)х10"7 М) и концентрация рецепторов ПРЛ (11,07+1,35 пМ на 10б клеток) на клетках из фолликулов диаметром 1-2 мм у неполовозрелых животных также не отличались от таковых, полученных ранее у коров с эстральным циклом (раздел 3.2.2). Эти данные показывают, что у КРС компетентность клеток гранулезы в антральных фолликулах к связыванию ПРЛ приобретается до половой зрелости и не изменяется во время ранней стельности.

Таблица 3. Специфическое связывание 1251-ПРЛ с клетками гранулезы из антральных фолликулов при разном репродуктивном состоянии КРС

Репродуктивное состояние животных Число экспериментов Специфическое связывание (х ± т), фМ на 106 клеток из фолликулов диаметром:

1 - 2 мм 3 - 5 мм 6 -10 мм

Половая зрелость 5 36,9 ±0,9 38,0 ± 1,0 36,0 ±1,3

До половой зрелости 5 34,7 ± 1,6 38,8 + 1,1 36,5 + 1,1

Ранняя стельность 5 37,6 ± 1,8 39,0 ± 1,8 38,2 ±1,2

3.3.2. Пролактин-связывающая активность клеток гранулезы при лю-теинизации и воздействии соматотропина in vitro. Лютеинизация гранулезных клеток является особым типом цитодифферснцировки, которую индуцирует пре-овуляторное повышение уровня ЛГ в крови млекопитающих (Fortune, 1994). В связи с этим было проведено сравнительное исследование уровней специфического связывания 1251-ПРЛ с КГ из фолликулов диаметром 3-5 мм до и после инициации спонтанной лютеинизации клеток, вызванной путем их культивирования в отсутствие сыворотки. Инициация in vitro лютеальной дифференцировки КГ подтверждалась повышением продукции прогестерона на 2-е сутки инкубации (табл. 4). ПРЛ-связывающая активность клеток также возрастала в процессе культивирования (по крайней мере р < 0,05). При этом СТГ не оказывал влияния на уровень специфического связывания ,231-ПРЛ как с нативными, так и с лютеинизирующимися клетками. Таким образом, процесс лютеальной дифференцировки клеток гранулезы коров индуцирует повышение их ПРЛ-связывающей активности.

Таблица 4. Секреция прогестерона и специфическое связывание 1251-ПРЛ клетками гранулезы коров, культивируемыми в присутствии СТГ

Концентрация СТГ Число экспериментов Секреция прогестерона (х ± т), нг/10б клеток Специфическое связывание 1251-ПРЛ (х± т), фМ на Юб клеток

1-е сутки 2-е сутки 1-е сутки 2-е сутки

0 нг/мл (контроль)' 12 0,60 + 0,08 1,40 + 0,19*** 11,3+1,4 18,5 + 2,2**

5 нг/мл 4 0,60 ±0,18 1,64 ±0,29* 11,7 ±1,3 19,2 + 2,6*

10 нг/мл 4 0,55 ± 0,06 1,07 ±0,09** 14,4 ±3,0 28,0 ±3,5*

50 нг/мл 4 0,77 ±0,14 1,54 ±0,26* 8,1 ± 1,2 17,8 ± 3,0*

Примечание. Среда ТС-199, содержащая 6 мг/мл БСА. Достоверные различия между ¡-ми и 2-ми сутками культивирования: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001.

3.4. Анализ экспрессии альтернативных изоформ рецептора пролактина в клетках яичников коров. У КРС в различных тканях, включая желтое тело яичника, обнаружена мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ, которые различаются длиной цитоплазматического домена и биологической активностью (Schuler et al., 1997). Основываясь на этих данных, был проведен анализ экспрессии мРНК альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в половых и соматических клетках антралыгых фолликулов диаметром 2-8 мм.

3.4.1. Выявление мРНК длинной и короткой изоформ рецептора пролактина в половых и соматических клетках антральных фолликулов. В первой серии экспериментов было исследовано присутствие мРНК альтернативных изоформ лактогенного рецептора в клетках кумулюса и гранулезы. При использовании комбинации праймеров одновременно для длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ (табл. 5) на матрице тотРНК для всех типов исследованных клеток были получены два ПЦР-продукта размером 347 и 250 пар нуклеотидных оснований (п.о.), что соответствовало ожидаемым значениям (рис. 2). В случае ооцитов для повышения выхода продуктов амплификации был применен метод ПЦР с внутренними праймерами (табл. 5). В ходе двух раундов ПЦР во всех случаях были выявлены продукты амплификации ожидаемого размера 217 п.о. (рис. 3). Результаты ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что обе изоформы рецептора ПРЛ участвуют в транедук-ции гормонального сигнала в половые и соматические клетки антральных фолликулов. Данные также указывают на наличие двух путей реализации влияния ПРЛ

на ооциты: 1) прямого, через взаимодействие с рецепторами в самих ооцитах и 2) опосредованного, через рецепторы в клетках кумулюса, сопряженных с ооцитами.

Таблица 5. Последовательности олигонуклеотидов для амплификации кДНК длинной (ПРЛ-Рд) и короткой (ПРЛ-Рк) изоформ рецептора ПРЛ

кДНК Прямой праймер Обратный праймер Длина фрагментов (п.о.)

Первый раунд ПЦР

ПРЛ-Рд 5'-CAAGCCAGACCATGGATACT-3' 5'-GCTGGTCCTCACAGTCATCT-3' 347

ПРЛ-Рк 5'-GCGAGAAGGCTGTGATATCT-3' 250

Второй раунд ПЦР (ПЦР с внутренними праймерами)

ПРЛ-Рд и ПРЛ-Рк 5'-ATACTGGAGTGAGTGGAGCC-3' 5'-CTCCAGCAGATGAACATCAA-3' 217

Рис. 2. ОТ-ПЦР-анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ова-риальных клетках.

Дорожки: 1 - маркеры длины в парах нуклеотидных оснований; 2-4 - ПЦР-продук-ты, соответствующие длинной (верхняя полоса) и короткой (нижняя полоса) изо-формам рецептора ПРЛ; 5-7 - ПЦР-продукт, соответствующий ß-актину; 8 - ОТ-ПЦР, отрицательный контроль; 9 ПЦР, отрицательный контроль; 2, 5 клетки гранулезы; 3, б клетки кумулюса; 4,7 — желтое тело (позитивный контроль).

Рис. 3. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах при использовании ПЦР с внутренними праймерами (nested PCR).

Дорожки: 1 - маркеры длины в парах нуклеотидных оснований; 2, 3 - ПЦР-продукт второго раунда, полученный при использовании амплификата, соответствующего длинной изоформе рецептора ПРЛ; 4, 5 - ПЦР-продукт второго раунда, полученный при использовании амплификата, соответствующего короткой изоформе рецептора ПРЛ; 6, 7 - отрицательный контроль для длинной и короткой рецепторной изоформы соответственно; 8, 9 - ПЦР-продукт первого раунда, соответствующий ß-актину; 2, 4, 8- клетки гранулезы (позитивный контроль); 3, 5, 9 - ооциты.

3.4.2. Соотношение мРНК альтернативных изоформ рецептора пролак-тина в овариальных клетках различного типа. Характер и эффективность гормонального влияния на клетки зависят не только от общей концентрации в них соответствующего рецептора, но и от соотношения его альтернативных изоформ

1 234567 89

600 -

300 -200

(Смирнова, Богорад, 2004). Соотношение уровней экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ГХРЛ в соматических овариальных клетках было определено на основании данных конкурентного кинетического анализа. Было установлено, что в фолликулах диаметром 2-8 мм это соотношение в клетках кумулюса сходно с таковым в клетках гранулезы, прилегающих к антралыюй полости (0,58±0,07 и 0,57±0,02 соответственно). В то же время соотношение мРНК альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в фолликулярных клетках было почти в два раза ниже, чем в развитом желтом теле яичника (1,09±0,04, р < 0,01). Полученные данные указывают на тканеспецифический характер экспрессии длинной и короткой изоформ лакгогенного рецептора в яичниках коров.

3.5. Изучение модулирующего действия пролактина на экспрессию собственного рецептора в фолликулярных клетках. ПРЛ может регулировать содержание своих рецепторов в различных клетках, в том числе овариальных, как на уровне транскрипции соответствующего гена, так и на постгранскрипциоином уровне (Russell, Richards, 1999; Bowcn et al., 2000). В этой связи было исследовано in vitro влияние ПРЛ на уровень мРНК длинной и короткой изоформ лактогенного рецептора в ОКК и гранулезных клетках из антральных фолликулов коров.

3.5.1. Влияние пролактина на содержание мРНК длинной и короткой изоформ своего рецептора в культивируемых ооцит-кумулюсных комплексах. При проведении экспериментов было обнаружено, что внесение 500 нг/мл ПРЛ в среду культивирования ОКК обусловливает снижение (р < 0,05) уровней экспрессии длинной и короткой изоформ лактогенного рецептора в клетках по сравнению с таковым на 0 ч (табл. 6). Суммарное содержание мРНК рецептора ПРЛ в ОКК было ниже (по крайней мере р < 0,05) при воздействии 50 и 500 нг/мл ПРЛ, чем до культивирования. Кроме того, общий уровень экспрессии рецептора уменьшался {р < 0,05) в процессе культивирования ОКК в присутствии 500 нг/мл ПРЛ по сравнению с этим уровнем в контроле. Гормон не влиял на соотношение уровней мРНК длинной и короткой изоформ своего рецептора, которое составляло до культивирования 0,55± 0,09 и было сходно с таковым, полученным для изолированных клеток кумулюса (раздел 3.4.2). Таким образом, ПРЛ в высокой концентрации может ин-гибировать экспрессию гена своего рецептора, но не влияет на альтернативный сплайсинг соответствующего первичного транскрипта в культивируемых ОКК.

Таблица 6. Влияние ПРЛ in vitro на экспрессию длинной (ПРЛ-Рд) и короткой (ПРЛ-Рк) изоформ своего рецептора в ооцит-кумулюсных комплексах коров (п = 3)

Экспериментальная группа Содержание мРНК изоформ рецептора ПРЛ (х ± т), o.e.

ПРЛ-Рд ПРЛ-Рк ПРЛ-Рд + ПРЛ-Рк

До культивирования 0,73 ± 0,07 1,36±0,11 2,09 ±0,06

0 пг/мл ПРЛ (контроль)1 0,56 ±0,05 1,17 ± 0,10 1,73 ± 0,08a

50 нг/мл ПРЛ 0,48 ± 0,08 1,00 ±0,14 1,49 ± 0,20*

500 нг/мл ПРЛ 0,41 ±0,04* 0,95 ± 0,09* 1,36 ±0,10**"

Примечание. 'Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Достоверные различия: а,бр < 0,05; по сравнению с группой до культивирования: *р < 0,05; **р < 0,01.

3.5.2. Уровни экспрессии мРНК альтернативных изоформ лактогенного рецептора в клетках гранулезы при воздействии пролактина. Содержание мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в гранулезных клетках снижалось в процессе 48-часового культивирования (по крайне мере р < 0,01) во всех экспериментальных группах (табл. 7). Это свидетельствовало о регулируемом ха-

рактере экспрессии обеих изоформ мРНК. Содержание мРНК длинной изоформы лактогенного рецептора в КГ не зависело существенно от концентрации ПРЛ в среде культивирования. Напротив, уровень мРНК короткой изоформы рецептора в клетках был выше в присутствии 500 нг/мл ПРЛ, чем в отсутствие гормона (р < 0,05). Тем не менее ПРЛ не влиял на суммарное содержание мРНК альтернативных изоформ собственного рецептора в КГ. В то же время ПРЛ (500 нг/мл) понижал по сравнению с контролем соотношение уровней мРНК длинной и короткой изоформ своего рецептора в клетках (с 0,63±0,06 до 0,26±0,04, р < 0,01). Также была обнаружена негативная корреляция между концентрацией гормона в культуральной среде и соотношением альтернативных изоформ мРНК рецептора ПРЛ (г = - 0,67; р < 0,01). Полученные результаты показывают, что ПРЛ регулирует in vitro экспрессию собственного рецептора в КГ на уровне альтернативного сплайсинга пре-мРНК и не влияет на активность транскрипции соответствующего гена. Следовательно, ПРЛ может учасгвовать в детерминации проведения своего сигнала в гранулезные клетки, повышая долю короткой изоформы лактогенного рецептора.

Таблица 7. Влияние ПРЛ на экспрессию длинной (ПРЛ-Рд) и короткой (ПРЛ-Рк) изоформ своего рецептора в культивируемых клетках гранулезы коров (п = 4)

Эксперимепталь ная группа Содержание мРНК изоформ рецептора ПРЛ (х ± т), о.е.

ПРЛ-Рд ПРЛ-Рк ПРЛ-Рд + ПРЛ-Рк

До культивирования 1,06 ±0,14 2,00 ±0,04 3,06 ±0,17

0 нг/мл ПРЛ (контроль)1 0,49 ±0,08** 0,81 ±0,11***" 1,29 ±0,22***

5 нг/мл ПРЛ 0,44 ±0,04*** 0,86 ±0,10*** 1,28 ±0,14***

50 нг/мл ПРЛ 0,38 ±0,09*** 0,95 ±0,10*** 1,31 ±0,22***

500 нг/мл ПРЛ 0,33 ±0,06*** 1,24 ±0,10**" 1,56±0,18***

Примечание. Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Достоверные различия: а,6р < 0,05; по сравнению с группой до культивирования: **р < 0,01; ***р < 0,001.

3.6. Сравнительный анализ влияния пролактина и метаболических гормонов на функциональную активность соматических клеток из антральных фолликулов коров. Способность гормона вызывать физиологические изменения в клетках является важным критерием его функциональной активности. Регулятор-ное действие ПРЛ на пролиферативную активность, интенсивность деструктивных процессов и стероидогенез в культивируемых клетках гранулезы коров было охарактеризовано в связи с соответствующим действием двух метаболических гормонов - структурно родственного пролактину СТГ и несходного с ним инсулина.

3.6.1. Влияние пролактина на синтез ДНК в культивируемых клетках гранулезы. ПРЛ оказывал стимулирующее влияние на интенсивность синтеза ДНК в культуре КГ из фолликулов различного диаметра (рис. 4, А и Б). Характер действия ПРЛ на пролиферативную активность гранулезных клеток определялся стадией созревания фолликулов. Митогенный эффект ПРЛ в клетках из средних фолликулов (6-10 мм) был одинаковым при всех концентрациях гормона независимо от наличия сыворотки в среде культивирования. В то же время чувствительность к ПРЛ у клеток из малых фолликулов (1-2 и 3-5 мм) повышалась в присутствии сыворотки, а характер их ответа был связан с концентрацией гормона. При этом была обнаружена двухфазная зависимость ростостимулирующего влияния ПРЛ от его концентрации. С увеличением содержания гормона до 500 нг/мл в среде без сыворотки (рис. 4, А) или до 50 нг/мл в среде с сывороткой (рис. 4, Б) интенсивность синтеза ДНК в клетках возрастала, дальнейшее повышение гормональной концентрации

приводило к снижению этой интенсивности (по крайней мере р < 0,05).

Рис. 4. Влияние ГГРЛ на интенсивность включения 3Н-тимидипа в ДНК клеток гра-нулезы из фолликулов различного диаметра при культивировании в отсутствие (Л) и в присутствии (Б) феталыюй бычьей сыворотки.

Диаметр фолликулов: 1-2 мм (1), 3-5 мм (2), 6-10 мм (3). За 100 % во всех случаях принято включение 3Н-тимидина в ДНК клеток, культивируемых в среде ТС-199, содержащей 5 % ФБС. Число экспериментов: п=3-5. Достоверное различие по сравнению с предыдущим значением: *р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001.

3.6.2. Совместное действие пролактина и метаболических гормонов на пролиферативную активность гранулезных клеток. При проведении сравнительного исследования влияния СТГ и инсулина на ростостимулирующий эффект ПРЛ были использованы КГ из фолликулов диаметром 3-5, которые культивировали в среде без сыворотки. Оба метаболических гормона оказывали митогенное влияние на гранулезные клетки (рис. 5, А и Б). Совместное действие ПРЛ и инсулина на синтез ДНК было в целом аддитивным (рис. 5, А), при этом инсулин повышал чувствительность клеток к ПРЛ при концентрации последнего 50 нг/мл (р < 0,001). В то же время СТГ даун-модулировал митогенное влияние ПРЛ, что приводило к уменьшению общего эффекта гормонов, который был ниже (р < 0,05) суммы

50 500 5000 50000 Концентрация ПРЛ, нг/мл

50 500 5000 50000 Концентрация ПРЛ, нг/мл

Рис. 5. Интенсивность включения 3Н-тимидина в ДНК клеток гранулезы, культивируемых в присутствии ПРЛ и инсулина (А) или соматотропного гормона (Б). 1 - инсулин (100 нг/мл), 2 - ПРЛ, 3 - инсулин + ПРЛ (А); 1 - СТГ (50 нг/мл), 2 -ПРЛ, 3 - СТГ + ПРЛ (Б). Контроль (100%) тот же, что и на рис. 5. Число экспериментов: п-4—5. Надписи над столбиками, не содержащие одинаковые буквы, показывают достоверные различия (по крайней мере р < 0,05).

отдельных эффектов в среде, содержащей 5 и 50 нг/мл ПРЛ (рис. 5, Б). Кроме того, в присутствии СТГ максимально эффективная концентрация ПРЛ возрастала до 5 мкг/мл. Полученные результаты свидетельствуют о том, что СТГ может ослаблять, тогда как инсулин - усиливать стимулирующее действие ПРЛ в физиологических концентрациях на пролиферативную активность клеток гранулезы коров.

3.6.3. Влияние пролактина, соиатотропина и инсулина in vitro на деструктивные процессы в фолликулярных клетках. В этих экспериментах были использованы КГ из фолликулов диаметром 3-5, подвергшихся атрезии in vivo. Внесение ПРЛ, СТГ или инсулина в среду приводило к повышению относительного числа клеток без признаков деструкции ядерного материала по сравнению с контролем как на 1-е, так и на 2-е сутки культивирования (рис. 6). При этом ПРЛ и СТГ не влияли на стероидогенную активность КГ, тогда как инсулин стимулировал (р < 0,05) секрецию эстрадиола-17р клетками в течение 1-х суток инкубации.

Рис. 6. Изменение числа клеток гранулезы с нормальным хроматином, выделенных из атретиче-ских фолликулов, при культивировании в присутствии ПРЛ (50 нг/мл), СТГ (50 нг/мл) или инсулина (100 нг/мл).

Контроль: среда ТС-199, содержащая 2 мг/мл БСА. п=5 10. Достоверные различия: а,6р < 0,05; а"р < 0,001; г'др < 0,001; г'ер < 0,05; между 1-ми и 2-ми сутками культивирования: *р < 0,05; **р < 0,01.

3.7. Исследование эффектов пролактина при созревании ооцитов, окруженных клетками кумулюса, в различных системах культивирования. Присутствие мРНК лактогенного рецептора в ооцитах и кумулюсных клетках указывает на непосредственное влияние ПРЛ на ОКК. В связи с этим было изучено действие ПРЛ на преобразования хромосом в мейозе ооцитов. При культивировании ОКК в среде, содержащей 10 % ФБС (система 1), было обнаружено два эффекта ПРЛ: стимуляция (р < 0,01) завершения ядерного созревания ооцитов и снижение

Таблица 8. Влияние ПРЛ на преобразования хромосом в ооцитах при созревании ОКК в различных культуральных системах (время культивирования - 24 ч)

Система культивирования Экспериментальная группа Общее число ооцитов Число (%) ооцитов на стадиях TI-MII мейоза Частота хромосомных нарушений, %

1. ТС-199+10 % ФБС Контроль 116 72 (62,1 ±4,5) 25,0 ± 4,0a

50 нг/мл ПРЛ 132 103 (78,0 ± 3,6)** 13,6 ±3,0*

2. ТС-199+10 % ФБС +эстрадиол-17Р+ФСГ Контроль 74 49 (66,2 ±5,5) 12,2 ± 3,8й

50 нг/мл ПРЛ 70 61 (87,1 ±4,0)** 7,1 ± 3,0Г

3. ТС-199+6 мг/мл БСА + эстрадиол-17р+ФСГ Контроль 102 72 (70,6 ±4,5) 40,2 ± 4,9е

50 нг/мл ПРЛ 71 56 (78,9 ± 4,8) 23,9 ± 5,1 *д

Примечание. Число экспериментов: п~3-4. Достоверные различия в пределах системы культивирования: *р < 0,05; **р < 0,01; между системами культивирования: а'6р < 0,05; *'р < 0,001; а'"р < 0,05; г'"р < 0,05.

100

80 -

3 ¡5

5 ¡ i

с ; х

го * га

Q. X О

О I- О.

X О X

и 2

: О

5 х л х с

s ь 5 5 2е « а

к

40 ■ 20 -

б Д J.

□ 1-е сутки 92-е сутки

б .

Контроль ПРЛ

СТГ Инсулин

Среда культивирования клеток

Таблица 9. Содержание депонированного Са2+ в ооцитах при созревании ОКК _в различных культуральных системах с ПРЛ (п=4)_

Система культивирования Экспериментальная группа Содержание Са2+во внутриклеточных депо ооцитов (х + т), у.е.

Время культивирования

0ч 2,5 ч 24 ч

1. ТС-199+10 % ФБС Контроль 1,35±0,03а6 1,67±0,05в 2,01±0,06гд

50 нг/мл ПРЛ 1,35+0,03аб 1,27±0,06а 1,62+0,04ве

2. ТС-199+10 % ФБС +эстрадиол-17(3 +ФСГ Контроль 1,34±0,02а 1,33±0,03а 2,16+0,02™

50 нг/мл ПРЛ 1,34±0,02а 1,44+0,07ае 2,19+0,04ж

3. ТС-199+6 мг/млБСА + эстрадиол-17р +ФСГ Контроль 1,34+0,02а 1,52±0,026м 2,21+0,02ж

50 нг/мл ПРЛ 1,34±0,02а 1,27±0,07а 1,97±0,03д

Примечание. Число ооцитов в группах: 15-39. Надписи, не содержащие одинаковые буквы, показывают достоверные различия (по крайней мере р < 0,05).

(р < 0,05) частоты хромосомных нарушений (табл. 8). Предварительно было установлено, что оба гормональных эффекта наблюдаются при концентрации ПРЛ 50 нг/мл, которая была использована во всех дальнейших экспериментах. Характер действия ПРЛ на мейоз зависел от состава системы культивирования (табл. 8). При добавлении ПРЛ в среду, содержащую 10 % ФБС, ФСГ и эстрадиол-17р (система 2) был выявлен только один из двух гормональных эффектов, наблюдаемых в системе 1 - повышение доли ооцитов, достигших стадий телофазы I (TI) или метафазы II (МП) (р < 0,01). При этом ПРЛ не влиял на реинициацию мейоза. Замена сыворотки на БСА в среде с ФСГ и эстрадиолом-17р (система 3) приводила к отсутствию влияния ПРЛ на завершение ядерного созревания ооцитов. В то же время в системе 3 ПРЛ оказывал тормозящее действие на процессы, связанные с деструктивными изменениями хромосом (р < 0,05).

Как известно, ПРЛ может индуцировать освобождение Ca2t из внутриклеточных депо клеток-мишеней (Bole-Feysot et al., 1998). Поэтому в ооцитах, созревающих во всех трех системах культивирования, было определено содержание депонированного Са (табл. 9). Было обнаружено ингибирующее влияние ПРЛ (р < 0,05) на аккумуляцию этого катиона через 2,5 ч инкубации ооцитов в тех культуральных системах, в которых гормон снижал частоту хромосомных нарушений в яйцеклетках (в системах 1 и 3). В процессе 24-часового культивирования содержание Са2+во внутриклеточных депо ооцитов, тем не менее, возрастало во всех экспериментальных группах (по крайней мере р < 0,01). При этом ингибирующее влияние ПРЛ на содержание депонированного Са2+ в половых клетках сохранялось до конца культивирования ОКК. Таким образом, тормозящее действие ПРЛ на деструктивные изменения хромосом связано с гормональной стимуляцией освобождения Ca2t из внутриклеточных депо ооцитов на ранней стадии их созревания.

3.8. Сравнительная оценка участия клеток гранулезы в опосредовании действия пролактина и соматотропина на ооцит-кумулюсные комплексы коров in vitro. Вышеперечисленные эффекты ПРЛ наблюдались при его непосредственном влиянии на ОКК коров (раздел 3.7). В отдельной серии экспериментов была подвергнута верификации выдвинутая ранее гипотеза о функционировании опосредованного гранулезными клетками пути регуляторного влияния ПРЛ на ооциты (Кузьмина и др., 2001). С этой целью была применена модель культивирования ОКК в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ, ко-

торая позволяла исключить прямое действие гормона на окруженные кумулюсом ооциты. В этих условиях был проведен сравнительный анализ регуляторного влияния ПРЛ (50 нг/мл) и родственного ему СТГ (10 нг/мл) на созревание ОКК.

3.8.1. Ядерное созревание ооцитов в средах, кондиционированных гранулезными клетками в присутствии пролактина и соматотропина. Обработка гранулезных клеток ПРЛ или СТГ приводила к повышению по сравнению с контролем доли ооцитов, остающихся на стадии диплотены через 6 ч инкубации ОКК в кондиционированных средах (с 57,2±5,0 % до 80,3±5,3 или 80,5±6,0 % соответственно, р < 0,05). Это мейоз-тормозящее влияние сред, кондиционированных клетками гранулезы при воздействии гормонов, было кратковременным и не наблюдалось через 12, 18 и 24 ч культивирования. Внесение ПРЛ и СТГ в культуру клеток гранулезы также обусловливало снижение по сравнению с контролем доли ооцитов с дегенеративными изменениями хромосом во время последующего культивирования ОКК в кондиционированных средах (рис. 7). При этом содержание прогестерона и эстрадиола-17р в средах было сходным во всех экспериментальных группах. Полученные данные показывают, что в ответ на действие и ПРЛ, и СТГ клетки гранулезы продуцируют растворимые паракринные факторы, которые, в свою очередь, оказывают регуляторное влияние па состояние хромосом в мейозе ооцитов.

Рис. 7. Частота хромосомных нарушений в ооцитах при инкубации ОКК в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ или СТГ. Число экспериментов: п=5 (6 ч), пЫ (12 ч), п=4 (18 ч), п~6 (24 ч). Число ооцитов: 51-85. Контроль: среда TC-I99, содержащая 10 % ФБС. Достоверные различия по сравнению с контролем: **р < 0,01; ***р < 0,001.

3.8.2. Морфофункциональное состояние клеток кумулюса при культивировании в средах, кондиционированных клетками гранулезы при воздействии пролактина и соматотропина. Окружающие ооцит клетки кумулюса являются особой субпопуляцией клеток гранулезы, дифференцировка которой направляется и поддерживается ооцитом (Li et al., 2000). При созревании ОКК в средах, полученных после культивирования клеток гранулезы с ПРЛ или СТГ, было обнаружено повышение по сравнению с контролем доли клеток кумулюса в стадии митоза (с 7,80±0,26 % до 10,88±0,25 или 9,65±0,38 % соответственно, р < 0,001). Кроме того, инкубация КГ в присутствии СТГ приводила к снижению процента кумулюсных клеток с признаками деструкции хроматина при последующем культивировании ОКК в соответствующей кондиционированной среде (с 2,44±0,16 % до 1,95±0,08 %,р< 0,05). В то же время экспансия кумулюса не зависела от гормональной обработки клеток гранулезы. Результаты экспериментов свидетельствуют об участии клеток гранулезы в проведении регуляторных сигналов ПРЛ и СТГ в клетки кумулюса, причем последние по-разному отвечают на сигналы этих гормонов.

3.9. Характеристика влияния пролактина in vitro на цАМФ-зависимый

§1

5 О о а

50 -40 ■ 30 -I

20 ■

10

ik

X

□ Контроль В ПРЛ ИСТГ

X

в 12 1S 24

Время культивирования ОКК, ч

механизм регуляции созревания изолированных ооцитов и ооцит-кумулюсных комплексов коров. Циклический АМФ играет ключевую роль в регуляции созревания ооцитов млекопитающих, а также выполняет функцию вторичного посредника в передаче сигналов гонадотропных гормонов в фолликулярные клетки (Mattioli, 1994; Conti et al., 2002). Для активации цАМФ-зависимого сигнального каскада в ооцитах, приводящего к ипгибированшо мейоза, в среду созревания ОКК и денудированных ооцитов (ДО) вносили 1 мМ дибутирил цАМФ (дбцАМФ), 20 мкМ активатора аденилатциклазы форсколина (ФК), или 5 мМ неселективного ингибитора фосфодиэстераз теофиллина (ТФ). Все реагенты были использованы в минимально эффективной концентрации.

3.9.1. Анализ ядерного созревания ооцитов в присутствии пролактина и цАМФ-повышающих или поддерживающих реагентов. При инкубации ОКК в течение 24 ч в среде, содержащей дбцАМФ, было выявлено уменьшение (р < 0,01) по сравнению с контролем доли ооцитов, завершивших первое деление мейоза (рис. 8, А). Внесение ПРЛ в культуральную среду обусловливало повышение выхода созревших яйцеклеток как в отсутствие (р < 0,05), так и в присутствии дбцАМФ (р < 0,01), однако в последнем случае гормональный эффект был более значительным. Сходные результаты были получены при инкубации ОКК с ФК или 'ГФ вместо дбцАМФ. При культивировании ДО в среде, содержащей форсколин, наблюдалось снижение (р < 0,001) по сравнению с контролем относительного числа клеток, достигших стадий тслофазы I или метафазы II (рис. 8, Б). ПРЛ повышал выход ДО на завершающих стадиях созревания до уровня контроля в присутствии активатора аденилатциклазы (р < 0,01), хотя не влиял на этот выход в контрольной среде. Таким образом, ПРЛ тормозит ингибирующее влияние цАМФ-новышшощих реагентов на завершение ядерного созревания как изолированных, так и окруженных ку-мулюсом ооцитов. В то же время в отсутствие этих реагентов для реализации стимулирующего эффекта ПРЛ на мейоз ооцитов необходимы клетки кумулюса.

| юо п

га

и 80 -га

х **

а = 60 -

гц

§Р 40-

о к с о Е[

20 -

□без ПРЛ Ш50 нг/мп ПРЛ

Контроль дбцАМФ

Среда культивирования ОКК

I 100 f вон

5 S

iL- 60

О —

|р "о

О

0 20

R

1 о

□ без ПРЛ И 50 нг/мп ПРЛ

Контроль ФК

Среда культивирования ДО

Рис. 8. Влияние ПРЛ на завершение ядерного созревания ооцитов при культивировании ОКК (Л) и ДО (Б) в течение 24 ч в отсутствие и в присутствии цАМФ-повышающих реагентов.

Контроль: среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Число экспериментов: п~4-5. Число ооцитов: 58-94. Достоверные различия: а,бр < 0,05; а'"р < 0,01; 6,вр < 0,001; е'гр < 0,01 (А); а''р < 0,001; бАр < 0,01; е'гр < 0,01 (Б).

3.9.2. Сравнительное исследование влияния пролактина и цАМФ-повышающих или поддерживающих реагентов на реинициацию мейоза. При

проведении экспериментов было обнаружено возрастание по сравнению с контролем доли ооцитов, находящихся на стадии диплотены (Дп) через 6 ч инкубации

ОКК (р < 0,01) или 7,5 ч инкубации ДО (р < 0,001) в среде, содержащей цАМФ-повышающие реагенты (рис. 9, А и Б). Добавление ПРЛ в среду с дбцАМФ или ФК приводило к уменьшению относительного числа ооцитов, не возобновивших мей-оз, независимо от наличия сопряженных с ними клеток кумулюса (по крайней мере р < 0,05). В то же время при базальтом уровне цАМФ ПРЛ оказывал тормозящее действие па реинициацию мейоза в изолированных ооцитах (р < 0,05) и не влиял на этот процесс в окруженных кумулюсом ооцитах. Следовательно, кумулюсные клетки могут модулировать прямое регуляторное влияние ПРЛ на ооциты.

Рис. 9. Влияние ПРЛ на реинициацию мейоза при культивировании ОКК (А) и ДО (Б) в отсутствие и в присутствии цАМФ-повышшощих реагентов.

Контроль тот же, что и на рис. 8. Число экспериментов: п-4-6. Число ооцитов: 57-73. Время культивирования: б ч (ОКК) и 7,5 ч (ДО). Достоверные различия: ""р < 0,01; % < 0,05 (А); °-6р < 0,05; °'ер < 0,001; б'"р < 0,05; в*р < 0,05 (Б).

3.9.3. Морфофункциональная характеристика соматических клеток при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов в среде, содержащей про-лактин и дбцАМФ, форсколин или теофиллин. Было установлено, что дбцАМФ и ФК стимулируют экспансию кумулюса при культивировании ОКК в течение 24 ч (р < 0,001), тогда как ТФ оказывает на нее ингибирующее действие (р < 0,001). Обработка клеток пролактином обусловливала уменьшение (р < 0,01) относительного числа ОКК с высокой степенью разрыхления кумулюса в присутствии дбцАМФ (с 82,1 до 62,9 %) или ФК (с 72,4 до 55,3 %). Напротив, внесение ПРЛ в контрольную среду или в среду с ТФ приводило соответственно к возрастанию доли ОКК с высокой степенью кумулюсной экспансии (с 36,9 до 51,3 %,р< 0,05) или к снижению доли ОКК с низкой степенью этой экспансии (с 46,5 до 26,7 %, р < 0,05). В контрольной среде ПРЛ также повышал долю клеток кумулюса в стадии митоза (с 3,28 ±0,20 до 5,42±0,28 %, р < 0,001) и уменьшал долю клеток с признаками дегенерации ядерного материала (с 8,06± 0,41 до 4,74±0,31 %, р < 0,001). ДбцАМФ подавлял ингибирующее действие ПРЛ на деструктивные процессы в клетках (р < 0,01), но не влиял на его митогенное действие. Эти результаты указывают на пересечение сигнальных каскадов, индуцированных ПРЛ и цАМФ в клетках кумулюса.

3.10. Изучение роли протеинкиназ в проведении сигнала пролактина в ооцитах и ооцит-кумулюсных комплексах коров. ПРЛ может активировать различные сигнальные каскады в фолликулярных клетках млекопитающих, в том числе зависящие от тирозинкиназ и протеинкиназы С (УШапиеуа е1 а1., 1996; Сюгсзгко е1 а1., 2003). Поэтому была охарактеризована роль этих протеинкиназ в опосредовании влияния ПРЛ на ДО и ОКК коров при базальном уровне цАМФ. Для блоки-

рования п клетках соответствующих сигнальных путей использовали ингибитор тирозинкиназ генистейн (ГНТ) и ингибитор протешшшазы С калпостин (КП).

3.10.1. Анализ участия тирозинкиназ и протеинкиназы С в опосредовании влияния пролактина на мейоз ооцитов. Генистейн и калпостин бьши использованы в концентрациях, при которых они не оказывали влияния на состояние хромосом в мейозе при культивировании ОКК и ДО в контрольной среде. Было обнаружено, что ГНТ (10 мкг/мл) подавляет (р < 0,05) стимулирующее действие ПРЛ на завершение ядерного созревания окруженных кумулюсом ооцитов (рис. 10). В то же время КП (100 нМ) не блокировал этот мейоз-стимулирующий эффект ПРЛ. Кроме того, ГНТ ингибировал тормозящее влияние гормона на реинициацию мейо-за в ДО, уменьшая долю клеток, остающихся на стадии диплотены через 7,5 ч инкубации с ПРЛ (с 41, 1±2,8 до 27,5±4,1 %,р< 0,05), тогда как КП в этих условиях не оказывал никакого действия. Полученные данные свидетельствуют об участии тирозинкиназ в опосредовании влияния ПРЛ па мейоз при базалышм уровне цАМФ.

□без ПРЛ

Среда культивирования ОКК

Рис. 10. Влияние ПРЛ на завершение ядерного созревания ооцитов при культивировании ОКК коров течение 24 ч в присутствии 10 мкг/мл генистейна (ГНТ) или 100 нМ калпостина (КП).

Контроль тот же, что и на рис. 8. Число экспериментов: п=5. Число ооцитов: 94-120. Достоверные различия: а'6р < 0,05.

3.10.2. Реализация регуляторного действия пролактина на морфофунк-ционалыюе состояние клеток кумулюса в присутствии ингибиторов протеин-киназ. ПРЛ повышал в 1,3-1,4 раза долю ОКК с высокой степенью разрыхления кумулюса при культивировании комплексов в течение 24 ч и в отсутствие, и в присутствии КП (р < 0,05). Этот стимулирующий эффект гормона не наблюдался в среде с ГНТ. ПРЛ также увеличивал долю клеток кумулюса в стадии митоза в контрольной среде (с 2,23±0,18 до 3,71±0,24 %,р< 0,01), но не оказывал митогенного действия на клетки в среде, содержащей КП или ГНТ. В то же время регуляторное влияние гормона, связанное со снижением доли кумулюсных клеток с признаками дегенерации ядерного материала (с 7,53±0,27 до 3,76±0,30 %,р< 0,01), было блокировано только в присутствии КП. Эти данные предполагают участие сигнальных каскадов, зависящих как от тирозинкиназ, так и от протеинкиназы С, в реализации эффектов ПРЛ в клетках кумулюса.

3.11. Идентификация сигнального каскада, опосредующего влияние пролактина на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза. Задача данного этапа работы состояла в изучении механизма реализации стимулирующего действия ПРЛ на реинициацию мейоза при повышенном уровне внутриклеточного цАМФ. В этих экспериментах промывочная среда для ДО и ОКК содержала 0,5 мМ ИБМК.

3.11.1. Зависимость регуляторного действия пролактина на мейоз от содержания цАМФ в ооцитах и ооцит-кумулюсных комплексах. Для достижения высокого уровня цАМФ в ооцитах в среду культивирования вносили одновременно 0,5 мМ изобутилметилксантина (ИБМК) и 20 мкМ форсколина (ФК). Через 7 ч инкубации ДО или ОКК в присутствии этих реагентов доля ооцитов, остающихся на

стадии диплотены, была в 2,6 или в 3,8 раза выше, чем в соответствующих контрольных группах (р < 0,001). ПРЛ уменьшал (р < 0,001) относительное число ооцитов на стадии диплотены при культивировании и ДО (с 92,8±1,2 % до 61,8±3,9 %), и ОКК (с 88,2±3,2 % до 63,7±2,6 %) в среде, содержащей ИБМК и ФК. Через 3,5 ч инкубации концентрация цАМФ в ДО, ОКК и ооцитах, изолированных из комплексов после культивирования, была во много раз выше (р < 0,001) в присутствии, чем в отсутствие ИБМК и ФК (табл. 10). Внесение ПРЛ в среду, содержащую цАМФ-повышающие реагенты, приводило к 2-кратному уменьшению уровня цАМФ в ДО (р < 0,01). При этом концентрация цАМФ в ДО была позитивно связана с долей ооцитов, не возобновивших мейоз (г = 0,99; р < 0,001). Вместе с тем ПРЛ не влиял на общий уровень цАМФ в ОКК и их ооцитах в среде с ИБМК и ФК, хотя и стимулировал в этой группе реинициацию мейоза. Таким образом, ПРЛ понижает in vitro повышенное содержание цАМФ в ДО, что обусловливает мейоз-стимулирующий эффект гормона. В то же время ПРЛ не влияет на содержание цАМФ в кумулюсе и не блокирует его поступление в ооцит.

Таблица 10. Влияние ПРЛ на содержание цАМФ в ДО, окруженньк кумулюсом

ооцитах и ОКК при их культивировании в течение 3,5 ч в отсутствие или _в присутствии изобутилметилксантина (ИБМК) и форсколина (ФК)_

Среда культивирования ооцитов Число экспериментов Содержание цАМФ (х ± m)

в ДО, фМ па ооцит в ОКК, фМ на комплекс в ооцитах ОКК, фМ на ооцит

До культивирования 4 0,19 ± 0,04" 2,5 ± 0,2Г 0,19±0,04ж

Контроль1 4 0,30±0,10а 8,6 ± 2,3я 1,01 ± 0,20*3

50 нг/мл ПРЛ 4 0,25 ± 0,06" 9,6 ± 2,2Л 1,22 ± 0,25**3

0,5 мМ ИБМК+20 мкМ ФК 4 3,16 ±0,26® 425,7 ± 101,6е 6,79 ±0,71*"

ИБМК +ФК+ПРЛ 4 1,56 ± 0,45я 546,8 ± 146,3е 7,92 ± 1,56**"

Примечание. 'Среда ТС-199, содержащая 10 % ФБС. Достоверные различия: "■6р < 0,001; р < 0,01; б'"р < 0,01; г'др < 0,05; г'гр < 0,001; д'ер < 0,001 ; ж'3р < 0,05; ж'"р < 0,001; ж'"р < 0,001; ЗЛр < 0,001; хкр < 0,01. Достоверные различия между ДО и ооцитами в ОКК: *р < 0,05; **р < 0,01.

3.11.2. Исследование роли фосфодиэстераз как медиаторов пролактин-зависимого сигнального пути, индуцирующего возобновление мейоза. Было охарактеризовано участие фосфодиэстеразы 3, отвечающей за деградацию цАМФ в ооцитах коров (Thomas et al., 2002), в опосредовании мейоз-стимулирующего действия ПРЛ. С этой целью ДО и ОКК культивировали в течение 7 ч в присутствии 20 мкМ цилостамида (ЦЛС), селективного ингибитора фосфодиэстеразы 3. В качестве дополнительного контроля был применен селективный ингибитор фосфодиэс-

Рис. 11. Влияние ПРЛ на реинициацию мейоза при культивировании денуди-рованных ооцитов (ДО) в отсутствие и в присутствии 20 мкМ цилостамида (ЦЛС) или 100 мкМ ролипрама (РЛП). Контроль тот же, что и на рис. 8. Время культивирования: 7 ч. Число экспериментов: п=4. Число ооцитов: 81-91. Достоверные различия: а,6р < 0,001; а-'р < 0,05; б'"р < 0,01; б'гр <0,001.

9

юо ■

80

ï -

в 60 ■

* 40 "I

Î -I 0

Q без ПРЛ ШБ0 нг/мл ПРЛ

Контроль ЦЛС РЛП

Среда культивирования ДО

теразы 4 ролипрам (100 мкМ). Было установлено, что ЦЛС повышает (р < 0,001) по сравнению с контролем относительное число ооцитов, остающихся на стадии дип-лотены через 7 ч инкубации ДО (рис. 11) и ОКК (с 20,4±3,6 % до 82,4±4,7 %). Внесение ПРЛ в среду, содержащую ЦЛС, приводило к снижению (р < 0,01) доли ДО, не возобновивших мейоз (рис. 11). В то же время гормон не влиял на реинициацию мейоза при культивировании ОКК в присутствии ЦЛС. Кроме того, ингибитор ти-розинкиназ генистейн не блокировал мейоз-индуцирующее действие пролактина на ДО в среде с ЦЛС. Следовательно, стимулирующее влияние ПРЛ на реинициацию мейоза достигается, по крайней мере частично, путем активации фосфодиэстеразы 3 в ооцитах. 'Гирозинкиназы не участвуют в реализации этого действия ПРЛ.

3.12. Характеристика функции клеток кумулюса в реализации влияния пролактина на приобретение ооцитами способности к эмбриональному развитию в присутствии гонадотропных гормонов. У КРС способность к эмбриональному развитию окруженных кумулюсом ооцитов зависит от внутриклеточного уровня цАМФ (Luciano et al., 2004). ПРЛ оказывает модулирующее действие на функционирование цАМФ-зависимого сигнального каскада в ОКК коров (раздел 3.9). Этот каскад опосредует влияние гонадотропных гормонов, действующих на ооциты через клетки кумулюса (Hillier, 2001). На основании этих данных было проведено сравнительное исследование влияния ПРЛ па приобретение ооцитами способности к дальнейшему развитию при культивировании ОКК и ДО в присутствии гонадотропных гормонов после синхронизации мейоза с помощью ИБМК. При созревании ооцитов в среде, содержащей ХГ человека и ХГ лошади, не было выявлено влияния ПРЛ ни на долю яйцеклеток, завершивших первое деление мейоза (ОКК: 93,9-95,2 %, ДО: 83,9-85,6 %), ни на их потенцию к оплодотворению, которая была сходной для ОКК и ДО (80,0-81,3 %). Вместе с тем внесение ПРЛ в среду созревания ОКК приводило к небольшому увеличению выхода эмбрионов (р < 0,05) и к последующему 2-кратному возрастанию (р < 0,01) выхода бластоцист (табл. 11). В группе с ПРЛ также было обнаружено увеличение по сравнению с контролем среднего числа клеток на одну бластоцисту (р < 0,05). В то же время при созревании ДО пролактин не влиял ни на долю ооцитов, вступивших в первое деление дробления, ни на дальнейший выход бластоцист. В целом, развитие эмбрионов, полученных из ДО, до стадии бластоцисты не происходило, что согласуется с

Таблица 11. Способность к эмбриональному развитию после оплодотворения

окруженных кумулюсом и денудированных ооцитов, созревших in vitro __в присутствии гонадотропных гормонов и ПРЛ__

Источ- Среда Число % эмбрионов от общего числа % бласто- Число

ник культиви- экспе- оплодотворенных ооцитов (х ± т) цист от клеток на

ооци- рования римен- Всего На стадии На стадии общего бласто-

тов ооцитов тов морулы бластоци- числа эм- цисту

(ооци- сты брионов (х + т)

тов) (х±ш)

ОКК Контроль1 7(171) 72,2±2,4а 34,0±4,1 20,5±3,6 28,0±4,7 87,3±6,7

ПРЛ 7(177) 80,2±2,1*ь 54,4±4,1** 40,9±4,2** 51,6±6,2* 116,6±9,6*

ДО Контроль' 6(154) 46,7±3,8" 2,0±1,3 0 0

ПРЛ 6(157) 48,7±4,2В 3,7±1,9 0,6±0,6 1,5±1,5 —

Примечание. Среда ДМЕМ, содержащая 10 МЕ/мл ХГ лошади, 5 МЕ/мл ХГ человека и 5 % эстральной сыворотки коров. Достоверные различия по сравнению с контролем: *р < 0,05; **р < 0,01; между ОКК и ДО: р < 0,01; б'"р < 0,001.

+ - _ прерванный

—►стимуляция —► ингибирование Эффект

данными других исследователей (Aktas et al., 2003; Paula-Lopes et al., 2007). Таким образом, в присутствии гонадотропных гормонов ПРЛ оказывает позитивное влияние на компетенцию окруженных кумулюсом ооцитов к последующему эмбриональному развитию. Этот эффект ПРЛ опосредуется клетками кумулюса, которые детерминируют приобретение ооцитами способности к дальнейшему развитию.

ОБСУЖДЕНИЕ

На основании полученных результатов была разработана теоретическая модель, описывающая механизмы действия ПРЛ на ядерное созревание ооцитов коров. Основным положением данной модели является зависимость характера влияния ПРЛ на реинициацию мейоза от внутриклеточного содержания цАМФ (рис. 12, А и Б). При этом стимулирующее влияние ПРЛ на завершение ядерного созревания ооцитов не зависит от уровня цАМФ, опосредуется через активацию тирозинкиназ и достигается путем торможения ингибирующего действия клеток кумулюса.

ооцит

А: Поддержание базаль-ного уровня цАМФ в ооцитах благодаря его поступлению через щелевые контакты из клеток кумулюса блокирует мейоз-тормозящий эф-клетка фект ПРЛ. При падении внутриклеточной концентрации цАМФ ниже определенного порогового уровня ингиби-рующее влияние ПРЛ может быть реализовано путем активации тирозинкиназ в ооците.

Б: ПРЛ запускает в ооцитах специфический сигнальный каскад при высоком внутриклеточном уровне цАМФ. ПРЛ активирует фосфодиэ-стеразу 3, которая снижает локальную концентрацию цАМФ путем его гидролиза, что приводит к инактивации цАМФ-зависимого сигнального каскада и последующей реинициации мейоза.

Рис. 12. Теоретическая модель возможных механизмов действия ПРЛ на мейоз ооцитов коров при базальном (Л) и повышенном (£) внутриклеточном уровне цАМФ. Обозначения: Дп - дитютена, МП - метафаза II, ИФ - ингибирующий фактор, Р -рецептор, ТК-тирозинкиназа, ФДЭ-3 - фосфодиэстераза 3, ЩК~ щелевой контакт.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты представленной работы позволяют говорить об участии ПРЛ в регуляции тонического фолликулогенеза у крупного рогатого скота путем стимуляции пролиферативной активности и торможения деструктивных процессов в клетках гранулезы, содержащих специфические лактогенные рецепторы. Степень влияния ПРЛ па фолликулярные клетки зависит от многочисленных факторов, связанных с физиологическим состоянием самих животных и стадией развития или атре-зии антральных фолликулов. В число модуляторов действия ПРЛ на соматические клетки фолликулов входят метаболические гормоны - соматотропин и инсулин. Это свидетельствует об изменении эффективности влияния ПРЛ на овариальную функцию у высокопродуктивных молочных коров с повышенным уровнем сомато-тропииа и пониженным уровнем инсулина в крови. Пролактин способен детерминировать проведение своего сигнала в фолликулярные клетки разного типа путем регуляции экспрессии собственных рецепторов либо на уровне транскрипции соответствующего гена, либо на уровне альтернативного сплайсинга первичного транскрипта. Таким образом, характер и степень воздействия ПРЛ на антральные фолликулы у КРС определяются сложной системой регуляторных сигналов центрального и локального происхождения.

Пролактин может быть вовлечен в контроль гипофизом завершающих стадий оогенеза у коров, оказывая модулирующее влияние на ядерное созревание и сопутствующие ему цитоплазматические преобразования в ооците, а также на функциональное состояние окружающих ооцит клеток кумулюса. В антральных фолликулах присутствуют три разных пути проведения сигналов ПРЛ в ооциты: прямой, через сопряженные с ооцитом клетки кумулюса и опосредованный клетками гранулезы. Кроме того, в ооцит-кумулюсных комплексах функционируют различные внутриклеточные механизмы трансдукции сигнала ПРЛ, включающие активацию тирозинкиназ, протеинкиназы С и мобилизацию ионов кальция. Циклический АМФ играет роль триггера специфического сигнального каскада, индуцируемого пролактином в ооцитах, который вовлекает активацию фосфодиэстеразы 3 и последующую деградацию цАМФ и приводит к снятию блокады мейоза in vitro. Это дает основания полагать, что ПРЛ участвует в реинициации мейоза при повышении внутриклеточного уровня цАМФ в ответ на преовуляторную волну лютеинизи-рующего гормона.

В целом, полученная информация способствует пониманию фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции пролактином созревания фолликулов и ооцитов, и представляет научный базис для оптимизации методов биотехнологии репродукции у КРС.

ВЫВОДЫ

1. Содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости коров зависит от фазы полового цикла, стадии роста антральных фолликулов и степени их атрезии. При увеличении диаметра фолликулов от 3-5 до 11-20 мм концентрация ПРЛ в жидкости возрастает от 3,7±0,7 до 6,1±0,3 нг/мл (р < 0,05) в фолликулярную фазу и не изменяется в лютсальную фазу эстрального цикла, что обусловлено повышением ее уровня в малых фолликулах до 7,0±0,5 нг/мл (р < 0,01). Содержание ПРЛ в жидкости больших антральных фолликулов уменьшается в 1,7 раза при понижении степени их васкуляризации и в 1,5 раза - при повышении уровня дегенерации клеток гранулезы.

2. В клетках гранулезы коров присутствуют рецепторы ПРЛ, связывающие характеристики которых не изменяются при увеличении диаметра фолликулов от 1-2 до 6-10 мм. На заключительной стадии фолликулярного созревания при возрастании диаметра фолликулов до 11-20 мм происходит снижение способности клеток связывать ПРЛ вследствие уменьшения концентрации специфических рецепторов с 14,4±1,1 до 8,1±1,2 пМ на 106 клеток (р < 0,05). При этом взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами в высокой степени зависит от содержания ионов Mg2' в окружающей среде (р < 0,001).

3. Компетентность клеток гранулезы в антральных фолликулах к связыванию ПРЛ приобретается у КРС до половой зрелости и не изменяется во время ранней стельности. Процесс лютеальной дифференцировки гранулезных клеток in vitro индуцирует повышение их ПРЛ-связывающей активности с 11,3±1,4 до 18,5±2,2 фМ на 10б клеток (р < 0,01). Соматотропин при физиологических концентрациях не влияет на способность культивируемых клеток гранулезы связывать ПРЛ.

4. В ооцитах и клетках кумулюса и гранулезы коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ, что свидетельствует об участии обеих изоформ в трансдукции гормонального сигнала в половых и соматических клетках антральных фолликулов. Экспрессия альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в яичнике носит тканеспецифический характер: в клетках кумулюса и гранулезы из незрелых антральных фолликулов соотношение мРНК длинной и короткой изоформ составляет 0,58±0,07 и 0,57±0,02 соответственно, тогда как в функционально активном желтом теле это соотношение почти в два раза выше (1,09±0,04, р < 0,01).

5. Пролактин регулирует in vitro экспрессию собственного рецептора в ооцит-кумулюсных комплексах коров на уровне транскрипции гена, а в клетках гранулезы - на уровне альтернативного сплайсинга первичного транскрипта. Внесение 500 нг/мл ПРЛ в среду культивирования ооцит-кумулюсных комплексов приводит к снижению суммарного содержания в клетках мРНК длинной и короткой изоформ лактогенного рецептора с 1,73±0,08 до 1,36±0,10 о.е. (р < 0,05). В клетках гранулезы ПРЛ (500 нг/мл) повышает по сравнению с контролем уровень мРНК короткой изоформы своего рецептора с 0,81±0,11 до 1,24±0,10 о.е. (р < 0,05) и уменьшает в 2,4 раза соответствующее соотношение альтернативных изоформ (р < 0,01).

6. Пролактин оказывает стимулирующее действие на синтез ДНК в культивируемых клетках гранулезы, которое определяется степенью зрелости антральных фолликулов. Митогенное влияние ПРЛ на клетки из малых фолликулов зависит от гормональной концентрации и носит двухфазный характер, причем максимальный эффект достигается при концентрации 50-500 нг/мл (по крайней мере р < 0,05). Соматотропин модулирует ростостимулирующее действие ПРЛ на клетки гранулезы, увеличивая его максимально эффективную концентрацию до 5 мкг/мл, тогда как инсулин повышает чувствительность этих клеток к ПРЛ. Кроме того, ПРЛ и соматотропин оказывают сходное тормозящее действие на деструктивные процессы в культивируемых клетках гранулезы из атретических фолликулов, которое не обусловлено регуляцией стероидогенной активности клеток.

7. Характер влияния ПРЛ на окруженные кумулюсом ооциты коров зависит от его концентрации и состава среды культивирования. В среде с сывороткой ПРЛ (50 нг/мл) снижает частоту хромосомных нарушений в ооцитах (с 25,0 % до 13,6 %, р < 0,05), что связано с уменьшением содержания в них депонированного Са2+ на ранней стадии созревания (с 1,67±0,05 до 1,27±0,06 у.е., р < 0,01). В этих условиях ПРЛ (50 нг/мл) также стимулирует завершение первого деления мейоза, повышая

долю созревших ооцитов с 62,1 % до 78,0 % (р < 0,01), вне зависимости от освобождения Са2+ из внутриклеточных депо. Это свидетельствует о функционировании различных путей проведения сигнала ПРЛ в ооциты или различных внутриклеточных механизмов сигнальной трансдукции.

8. Инкубация ооцит-кумулюсных комплексов в течение 6 ч в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ (50 нг/мл) или соматотро-пина (10 нг/мл), приводит к кратковременному торможению реинициации мейоза, что выражается в блокировании ооцитов на стадии диплотены (80,3-80,5 % против 57,2 % в контроле, р < 0,05), и к уменьшению частоты деструктивных изменений хромосом (с 22,4 % до 8,3-9,2 %,р< 0,01), которое сохраняется на протяжении 24-часового культивирования. Таким образом, в антральных фолликулах коров присутствует опосредованный клетками гранулезы путь рсгуляторпого влияния ПРЛ и родственного ему соматотропина на ядерное созревание ооцитов.

9. Пролактин модулирует функционирование цАМФ-зависимого механизма регуляции мейоза путем прямого воздействия на ооциты независимо от их сопряжения с клетками кумулюса. При культивировании изолированных и окруженных кумулюсом ооцитов ПРЛ (50 нг/мл) стимулирует реинициацию мейоза (по крайней мере р < 0,05) и завершение ядериого созревания яйцеклеток (р < 0,01), подавляя ингибирующее действие цАМФ-повышающих реагентов.

10. В отсутствие реагентов, повышающих внутриклеточный уровень цАМФ, характер действия ПРЛ на ядерное созревание ооцитов in vitro зависит от наличия окружающих их клеток кумулюса. Пролактин (50 нг/мл) кратковременно тормозит возобновление мейоза в изолированных ооцитах, увеличивая долю клеток на стадии диплотены через 7,5 ч инкубации (с 32,7 % до 49,3 %, р < 0,05), и стимулирует завершение ядерного созревания окруженных кумулюсом ооцитов (73,3 % против 60,9 % в контроле, р < 0,05). Ингибитор тирозинкиназ генистейн подавляет это ре-гуляторное действие гормона на реинициацию и завершение первого деления мейоза (р < 0,05), что свидетельствует об участии тирозинкиназ в реализации прямого и опосредованного кумулюсом влияния ПРЛ на ооциты.

11. Повышение уровня цАМФ в изолированных ооцитах на ранней стадии созревания обусловливает активацию пролактином сигнального каскада, приводящего к снижению этого уровня (с 3,16±0,26 до 1,56±0,45 фМ на ооцт\р < 0,01), который позитивно связан с последующим выходом ооцитов, не возобновивших мейоз (г=0,99; р < 0,001). Возрастание концентрации цАМФ в окруженных кумулюсом ооцитах также предшествует стимулирующему действию ПРЛ на реинициацию мейоза, хотя гормон не влияет на содержание цАМФ в кумулюсе и не блокирует его поступление в половые клетки. Кроме того, ПРЛ уменьшает долю изолированных ооцитов, блокированных на стадии диплотены ингибитором фосфодиэстеразы 3 цилостамидом (с 79,4 % до 53,6 %, р < 0,01). Таким образом, индуцирующее влияние ПРЛ на реинициацию мейоза достигается путем активации фосфодиэстеразы 3 и последующего понижения уровня цАМФ в ооцитах.

12. В присутствии гонадотропных гормонов ПРЛ (50 нг/мл) оказывает стимулирующее влияние на компетенцию окруженных кумулюсом ооцитов к последующему эмбриональному развитию после оплодотворения in vitro, что выражается в 2-кратном повышении выхода бластоцист (с 20,5 % до 40,9 %,р< 0,01). Это позитивное действие ПРЛ опосредуется клетками кумулюса, которые детерминируют приобретение ооцитами способности к дальнейшему развитию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Специалистам в области репродуктивных клеточных технологий рекомендуем:

1. Для повышения эффективности получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота добавлять 50 нг/мл ПРЛ в среду созревания ооцит-кумулюсных комплексов, содержащую гонадотропные гормоны, и проводить синхронизацию мейо-за путем предварительной обработки клеток изобутилметилксантином (0,5 мМ).

2. С целью повышения качества ядерного материала яйцеклеток при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов коров применять среды, кондиционированные клетками гранулезы в присутствии 50 нг/мл ПРЛ или 10 нг/мл соматотро-пина.

3. При синхронизации возобновления мейоза в культивируемых ооцитах коров с помощью цАМФ-повышающих реагентов использовать ПРЛ (50 нг/мл) для последующего снятия блокады мейоза.

Материалы диссертации могут быть использованы в учебных курсах по моле-кулярно-биохимическим аспектам регуляции мейоза, а также по физиологии и биотехнологии воспроизводства сельскохозяйственных животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 65 научных работ, основными из которых являются 38 работ.

Статьи в рецензируемых научных исурналах и изданиях, определенных ВАК РФ:

1. Лебедева, И.Ю. Лактогенные рецепторы на клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, В.А. Федосимов, Т.И. Кузьмина // Биохимия. - 1994. - Т. 59, вып. 7.-С. 1062-1066.

2. Лебедева, И.Ю. Влияние пролактина на синтез ДНК в культивируемых клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, Т.А. Гойло // Цитология. - 1995. - Т. 37, № 3. - С. 220-226.

3. Лебедева, И.Ю. Изменение содержания пролактина и соматотропина и уровня их связывания с клетками в растущих антральных фолликулах коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, В.А. Лебедев // Рос. физиол, журн. им. И.М. Сеченова. -1997.-Т. 83, №10. -С. 58-62.

4. Lebedeva, I.Yu. Prolactin in follicular fluid and intracellular store calcium in follicular cells are related to morphological signs of ovarian follicle atresia in cows: work in progress / I.Yu. Lebedeva, V.Yu. Denisenko, V.A. Lebedev, T.I. Kuzmina // Therioge-nology. - 1998. - Vol. 49, No. 3. - P. 509-519.

5. Kuzmina, T.I. Effects of prolactin on intracellular stored calcium in the course of bovine oocyte maturation in vitro / T.I. Kuzmina, I.Yu. Lebedeva, H. Torner [et al.] // Theriogenology. - 1999. - Vol. 51, No. 7. - P. 1363-1374.

6. Лебедева, И.Ю. Взаимная модуляция регуляторпого действия пролактина и соматотропина на синтез ДНК в клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, В.А. Лебедев, Т.А. Гойло // Цитология. - 2000. - Т. 42, № 5. - С. 468-472.

7. Кузьмина, Т.И. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию / Т.И. Кузьмина, И.Ю. Лебедева, X. Торнер, X. Альм // Онтогенез. - 2001. - Т.32, № 2. -С. 140-147.

8. Лебедева, И.Ю. Характеристика соматотропин- и пролактинсвязывшощих

участков на клетках гранулезы коров при использовании гомологичных гормонов / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, Т.И. Кузьмина // Биохимия. - 2001. - Т. 66, вып. 9. -С. 1188-1194.

9. Лебедева, И.Ю. Регуляторное влияние ионов магния на взаимодействие пролактина и соматотропина с рецепторами на клетках гранулезы коров Bos Taurus / И.Ю. Лебедева, В. А. Лебедев, Т.И. Кузьмина // Журн. эвол. биохим. и физиол. -2004.-Т. 40,№2.-С. 118-124.

10. Лебедева, И.Ю. Пролактинсвязывающая активность клеток гранулезы коров при лютеипизации и воздействии соматотропина in vitro / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, В.А. Лебедев [и др.] // Цитология. - 2004. - Т. 46, № 6. - С. 545-549.

11. Лебедева, И.Ю. Влияние соматотропина, пролактина и инсулина на клетки гранулезы из атретических фолликулов коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, Т.В. Кибардина [и др.] // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2004. - Т. 90, № 10. -С. 1281-1288.

12. Лебедева, И.Ю. Связывание пролактина и соматотропина клетками гранулезы коров при их разном репродуктивном состоянии / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, Т.И. Кузьмина // Онтогенез. - 2004. - Т.35, № 6. - С. 457-462.

13. Лебедев, В.А. Роль метаболических гормонов в регуляции фуикции яичников у коров / В.А. Лебедев, И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, И.Ш. Шапиев // Сельскохозяйственная биология. Серия: Биология животных. - 2005. - № 2. - С. 14-22.

14. Лебедева, И.Ю. Участие клеток гранулезы в опосредовании действия пролактина и соматотропина на ооцит-кумулюсные комплексы коров in vitro / И.Ю. Лебедева, Т.В. Кибардина, Т.И. Кузьмина // Цитология. - 2005. - Т. 47, № 10. - С. 882-888.

15. Лебедева, И.Ю. Модуляция пролактином ингибирующего действия тео-филлина на созревание ооцит-кумулюсных комплексов коров in vitro / И.Ю. Лебедева, О.С. Скотти, Т.И. Кузьмина // Цитология. - 2006. - Т. 48, № 12. - С. 10101015.

16. Лебедева, И.Ю. Концентрация соматотропина и пролактина в фолликулярной жидкости и сыворотке крови коров в разные фазы астрального цикла / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, А.К. Голубев // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. -2007. - Т. 93, № 9. - С. 1055-1061.

17. Лебедева, И.Ю. Взаимодействие сигнальных каскадов, индуцированных цАМФ и пролактином в ооцит-кумулюсных комплексах коров / И.Ю. Лебедева, Г.Н. Сингина, H.A. Волкова [и др.] // Цитология. - 2008. - Т. 50, № 8. - С. 734-742.

18. Лебедева, И.Ю. Пути реализации модулирующего влияния пролактина на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах коров / И.Ю. Лебедева, Г.Н. Сингина, Л.К. Эрнст, А.К. Голубев // Цитология. - 2009. - Т. 51, № 7. - С. 559564.

Публикации в материалах международных и всероссийских научных конференций и симпозиумов:

19. Лебедева, И.Ю. Участие пролактина в регуляции фолликулогенеза у коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина, В.А. Лебедев // Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных: тр. меж-дунар. симп. / ВНИИГРЖ. - СПб.-Пушкин, 1994. - С. 32-33.

20. Lebedeva, I.Yu. Mitogenic effect of somatotropin and prolactin on bovine granulosa cells in vitro / I.Yu. Lebedeva, T.I. Kuzmina, Т.Е. Pozdnyakova, T.A. Goilo //

Proc. of the 1st Centr. Europ. Conf. on Animal Reprod., Olsztyn, Poland, 1996 / J. Physiol. Pharmacol. - 1996. - Vol. 47, No. 2, Suppl. 1. - P. 127.

21. Lebedeva, I.Yu. Comparison of characteristics of somatotropin and prolactin binding to bovine granulosa cells / I.Yu. Lebedeva, V.A. Lebedev, T.I. Kuzmina // Proc. of the 3rd Conf. on Farm Animal Endocrinology, Brussels, Belgium, 1998 / Biotechnology, Agronomy, Soc. and Environment. - 1998. - Vol. 2, Spec, issue. - P. 67.

22. Kuzmina, T. Somatotropin does not affect bovine granulosa cell luteinization in vitro / T. Kuzmina, I. Lebedeva, F. Schneider [et al.] // Proc. of the 3rd Conf. on Farm Animal Endocrinology, Brussels, Belgium, 1998 / Biotechnology, Agronomy, Soc. and Environment. - 1998. - Vol. 2, Spec, issue. - P. 65.

23. Лебедева, И.Ю. Ингибирующее действие пролактина и инсулина на процессы дегенерации в культивируемых клетках гранулезы коров из антральных фолликулов на ранней стадии атрезии / И.Ю. Лебедева, Т.В. Шелухина, Т.И. Кузьмина // Биология клетки в культуре: тр. всерос. симп., СПб., 1999 / Цитология. -1999.-Т. 41,№3/4.-С. 287.

24. Lebedeva, I.Yu. Effects of Mg2+ on prolactin and somatotropin binding to bovine granulosa cells / I.Yu. Lebedeva, V.A. Lebedev, T.I. Kuzmina // Proc. of the 50th Annu. Meet, of Europ. Assoc. for Animal Production, Zurich, Switzerland, 1999. - P. 164.

25. Lebedeva, I. Somatotropin and prolactin binding to granulosa cells from antral follicles of cattle with different reproductive status /1. Lebedeva, V. Lebedev, T. Kuzmina // Proc. of the 8th Intern. Congr. on Biotechnology in Animal Reprod., Bernburg, Germany, 2001 / Arch. Anim. Breeding. - 2001. - Vol. 44, Spec, issue. - P. 170.

26. Lebedeva, I.Yu. Nuclear maturation and levels of intracellular stored calcium in bovine oocytes exposed to prolactin in different culture systems / I.Yu. Lebedeva, T.I. Kuzmina // Proc. of the VIII Baltic Animal Breeding and Genetics Conf., Kaunas, Lithuania, 2002.-P. 41-42.

27. Lebedeva, I.Yu. Granulosa cell-mediated actions of prolactin and somatotropin on bovine cumulus cells in vitro / I.Yu. Lebedeva, T.I. Kuzmina, T.V. Kibardina [et al.] // Proc. of the 54th Annu. Meet, of Europ. Assoc. for Animal Production, Rome, Italy, 2003.-P. 227.

28. Лебедева, И.Ю. Участие цАМФ-зависимого внутриклеточного механизма в реализации действия пролактина на ооцит-кумулюсные комплексы коров / И.Ю. Лебедева, О.С. Скотта, Т.И. Кузьмина // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: тр. междунар. конф. J ПНЦ РАН. - Пущино, 2005 - С. 314-317.

29. Лебедева, И.Ю. Влияние пролактина на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза ооцитов коров / И.Ю. Лебедева, Г.Н. Сингина, А.Н. Мормышев [и др.] // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / ВИЖ. - Дубровицы-Быково, 2007. - С. 146-148.

30. Мормышев, А.Н. Рецепторные и пост-рецепторные пути проведения сигнала пролактина в клетки кумулюса ооцитов коров / А.Н. Мормышев, И.Ю. Лебедева, Н.А. Волкова [и др.] // Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных: тр. междунар. науч.-практич. конф. / ВИЖ. - Дубровицы-Быково, 2007. -С. 148-150.

31. Лебедева, И.Ю. Способность к развитию после оплодотворения ооцитов коров, созревших in vitro в присутствии гонадотропных гормонов и пролактина / И.Ю. Лебедева, А.Н. Мормышев // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: тр. 7 междунар. науч. конф. / ВИЖ. -

Дубровицы, 2008. - С. 170-172.

32. Лебедева, И.Ю. Влияние пролактина на реинициацию мейоза и внутриклеточную концентрацию цАМФ в ооцитах коров / И.Ю. Лебедева // Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: тр. 7 междунар. науч. конф. / ВИЖ. - Дубровицы, 2008. - С. 167-169.

33. Лебедева, И.Ю. Взаимодействие пролактина и форсколина при созревании in vitro денудированных и окруженных кумулюсом ооцитов коров / И.Ю. Лебедева, Г.Н. Сингина, А.Н. Мормышев, О.Л. Шатайло // Новые аспекты биотехнологии репродукции животных: тр. междунар. конф., СПб., 2008 / Междунар. вестн. ветеринарии. - 2008. - № 3. - С. 50.

34. Lebedeva, I. The direct and cumulus-mediated effects of prolactin on bovine oocytes /1. Lebedeva, M. Vejlsted, N. Volkova [et al.] // Proc. of the 35th Annu. Conf. of the Intern. Embryo Transfer Soc., San Diego, USA, 2009 // Reprod. Fértil. Dev. - 2009. -Vol. 21, No. l.-P. 222.

35. Лебедева, И.Ю. Гомологичная регуляция экспрессии альтернативных изоформ рецептора пролактина в клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Е.А. Гла-дырь, Г.Н. Сингина // Рецепция и внутриклеточная сигнализация: тр. междунар. конф. / ПНЦ РАН. - Пущино, 2009. - С. 63-68.

36. Лебедева, И.Ю. Реинициация мейоза in vitro в изолированных и окруженных кумулюсом ооцитах коров в присутствии ингибиторов фосфодиэстераз и пролактина / И.Ю. Лебедева, Г.Н. Сингина // Культивируемые клетки как основа клеточных технологий: тр. всерос. симп., СПб., 2009 / Цитология. - 2009. - Т. 51, № 9. -С. 773-774.

37. Лебедева, И.Ю. Клеточная специфичность соотношения мРНК альтернативных изоформ рецептора пролактина в яичнике коров / И.Ю. Лебедева, H.A. Волкова, Г.Н. Сингина // Актуальные проблемы ветеринарной биологии: тр. междунар. науч.-практич. конф. / ФГОУ ВПО МГАВМиБ. - М„ 2009. - С. 22-24.

Информационные карты на новые материалы, включенные в государственный банк данных:

38. Лебедева, И.Ю. Изучение механизмов, детерминирующих проведение сигнала пролактина в ооцит-кумулюсные комплексы на рецепторном и пострецеп-торном уровнях: отчет о НИР (заключ.): 07-04-01485 / ГПУ ВНИИЖ Россельхоза-кадемии; рук. И.Ю. Лебедева; исполн.: Г.Н. Сингина [и др.]. -М., 2010. - 66 с. -№ ГР 01200957411. - Инв. № 02201050975.

Издательство ВНИИ животноводства Тел. (8 - 4967) 65-15-97

Сдано в набор 08.11.2010. Подписано в печать 09.11.2010 _Заказ № 32. Печ. л. 1,6. Тираж 100 экз._

Отпечатано в типографии ВНИИ животноводства

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лебедева, Ирина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гормональный контроль фолликулогенеза у млекопитающих

1.1.1. Динамика роста и созревания овариальных фолликулов

1.1.2. Атрезия как процесс физиологической дегенерации фолли- 24 кулов

1.1.3. Центральная роль гонадотропных гормонов в регуляции 29 фолликулогенеза

1.1.4. Регуляторное влияние пролактина на функциональное со- 3 5 стояние клеточных элементов антральных фолликулов

1.1.5. Участие метаболических гормонов в модуляции процессов 41 развития и атрезии фолликулов

1.2. Интрафолликулярная система регуляции созревания ооцитов в 48 яичниках млекопитающих

1.2.1. Ядерные и цитоплазматические преобразования в созре- 49 вающем ооците

1.2.2. Молекулярные факторы, участвующие в регуляции мейоза 53 на уровне ооцита

1.2.3. Сигнальные пути в клетках кумулюса/гранулезы, связанные 60 с модуляцией мейоза ооцитов

1.2.4. Роль гипофизарных гормонов в контроле созревания ооци- 66 тов

1.3. Структурно-функциональные свойства рецептора пролактина

1.3.1. Характеристика лактогенного рецептора как члена суперсе- 74 мейства цитокиновых рецепторов

1.3.2. Множественные изоформы рецептора пролактина >

1.3.3. Внутриклеточные сигнальные каскады, сопряженные с ре- 80 цептором пролактина

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Материалы

2.1.1. Объект исследования

2.1.2. Реактивы и оборудование

2.2. Методы исследований

2.2.1. Оценка репродуктивного состояния животных и морфоло- 90 гии структурных элементов яичников

2.2.2. Выделение и оценка материала для исследований

2.2.2.1. Получение фолликулярной жидкости и сыворотки кро- 91 ви коров

2.2.2.2. Выделение и оценка качества популяции клеток грану- 91 лезы

2.2.2.3. Выделение и морфологическая характеристика ооцит- 92 кумулюсных комплексов и изоляция ооцитов

2.2.2.4. Выделение желтого тела

2.2.3. Радиоиммунологическое определение концентрации про- 93 лактина в биологических жидкостях

2.2.4. Радиорецепторный анализ

2.2.4.1. Подготовка клеток гранулезы к радиорецепторному 94 анализу

2.2.4.2. Проведение анализов связывания меченого пролактина 94 с клетками гранулезы

2.2.4.3. Характеристика специфического связывания пролакти- 96 на с гранулезными клетками

2.2.5. Культивирование клеток гранулезы из антральных фолли- 97 кулов

2.2.5.1. Получение монослойной культуры клеток

2.2.5.2. Бессывороточная инкубация клеток

2.2.5.3. Суспензионное культивирование клеток из антральных 99 фолликулов на ранней стадии атрезии

2.2.6. Оценка интенсивности синтеза ДНК в культуре клеток гра- 100 нулезы

2.2.7. Определение концентрации половых стероидных гормонов 101 в культуральных средах

2.2.8. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ 102 рецептора пролактина

2.2.8.1. Подготовка клеточного материала для выделения то- 102 тальной РНК

2.2.8.2. Выделение тотальной РНК из овариальных клеток

2.2.8.3. Синтез первой цепи комплементарной ДНК

2.2.8.4. Метод полимеразной цепной реакции

2.2.8.5. Метод конкурентной полимеразной цепной реакции

2.2.8.6. Полуколичественный анализ продуктов ОТ-ПЦР

2.2.9. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов и 107 денудированных ооцитов

2.2.10. Морфофункциональная характеристика клеток кумулюса

2.2.11. Определение содержания депонированного кальция в 108 ооцитах флуоресцентным методом

2.2.12. Иммуноферментный анализ внутриклеточного уровня 109 цАМФ

2.2.13. Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов

2.2.14. Цитогенетический анализ ооцитов, зигот и эмбрионов

2.2.15. Статистическая обработка экспериментальных данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Идентификация физиологических факторов, детерминирующих 113 интрафолликулярное содержание пролактина у коров

3.1.1. Содержание пролактина в фолликулярной жидкости и сы- 113 воротке крови в разные фазы астрального цикла

3.1.2. Концентрация пролактина в жидкости фолликулов с раз- 116 личными признаками атрезии

3.1.3. Изменение интрафолликулярного содержания пролактина и 118 уровня его связывания с клетками в процессе роста антральных фолликулов

3.2. Биохимическая характеристика лактогенных рецепторов на 120 клетках гранулезы из антральных фолликулов коров

3.2.1. Анализ специфического связывания пролактина с клетками 121 гранулезы

3.2.2. Параметры взаимодействия пролактина с рецепторами на 125 клетках из фолликулов различного диаметра

3.2.3. Регуляторное влияние ионов магния на специфическое свя- 130 зывание пролактина с гранулезными клетками

3.3. Оценка роли онтогенетических и гормональных факторов в ре- 135 гуляции пролактин-связывающей способности клеток гранулезы

3.3.1. Связывание пролактина с клетками гранулезы при разном 136 репродуктивном состоянии животных

3.3.2. Пролактин-связывающая активность клеток гранулезы при 139 лютеинизации и воздействии соматотропина in vitro

3.4. Анализ экспрессии альтернативных изоформ рецептора пролак- 143 тина в клетках яичников коров

3.4.1. Выявление мРНК длинной и короткой изоформ рецептора 144 пролактина в половых и соматических клетках антральных фолликулов

3.4.2. Соотношение мРНК альтернативных изоформ рецептора 147 пролактина в овариальных клетках различного типа

3.5. Изучение модулирующего действия пролактина на экспрессию 151 собственного рецептора в фолликулярных клетках

3.5.1. Влияние пролактина на содержание мРНК длинной и ко- 151 роткой изоформ своего рецептора в культивируемых ооцит-кумулюсных комплексах

3.5.2. Уровни экспрессии мРНК альтернативных изоформ лакто- 155 генного рецептора в клетках гранулезы при воздействии пролактина

3.6. Сравнительный анализ влияния пролактина и метаболических 160 гормонов на функциональную активность соматических клеток из антральных фолликулов коров

3.6.1. Влияние пролактина на синтез ДНК в культивируемых 160 клетках гранулезы

3.6.2. Совместное действие пролактина и метаболических гормо- 164 нов на пролиферативную активность гранулезных клеток

3.6.3. Влияние пролактина, соматотропина и инсулина in vitro на 168 деструктивные процессы в фолликулярных клетках

3.7. Исследование эффектов пролактина при созревании ооцитов, 174 окруженных клетками кумулюса, в различных системах культивирования

3.8. Сравнительная оценка участия клеток гранулезы в опосредова- 186 нии действия пролактина и соматотропина на ооцит-кумулюсные комплексы коров in vitro

3.8.1. Ядерное созревание ооцитов в средах, кондиционированных 187 гранулезными клетками в присутствии пролактина и соматотропина

3.8.2. Морфофункциональное состояние клеток кумулюса при 191 культивировании в средах, кондиционированных клетками гранулезы при воздействии пролактина и соматотропина

3.9. Характеристика влияния пролактина in vitro на цАМФ- 195 зависимый механизм регуляции созревания изолированных ооцитов и ооцит-кумулюсных комплексов коров

3.9.1. Анализ ядерного созревания ооцитов в присутствии пролак- 196 тина и цАМФ-повышающих или поддерживающих реагентов

3.9.2. Сравнительное исследование влияния пролактина и цАМФ- 205 повышающих или поддерживающих реагентов на реинициацию мейоза

3.9.3. Морфофункциональная характеристика соматических кле- 209 ток при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов в среде, содержащей пролактин и дбцАМФ, форсколин или теофиллин

3.10. Изучение роли протеинкиназ в проведении сигнала пролактина 216 в ооцит-кумулюсных комплексах коров

3.10.1. Анализ участия тирозинкиназ и протеинкиназы С в опо- 217 средовании влияния пролактина на мейоз ооцитов

3.10.2. Реализация регуляторного действия пролактина на морфо- 223 функциональное состояние клеток кумулюса в присутствии ингибиторов протеинкиназ

3.11. Идентификация сигнального каскада, опосредующего влияние 226 пролактина на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза

3.11.1. Зависимость регуляторного действия пролактина на мейоз 227 от содержания цАМФ в ооцитах и ооцит-кумулюсных комплексах

3.11.2. Исследование роли фосфодиэстераз как медиаторов про- 233 лактин-зависимого сигнального пути, индуцирующего возобновление мейоза

3.12. Характеристика функции клеток кумулюса в реализации влия- 238 ния пролактина на приобретение ооцитами способности к эмбриональному развитию в присутствии гонадотропных гормонов

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Факторы, детерминирующие реализацию и степень воздействия 247 пролактина на половые и соматические клетки антральных фолликулов

4.2. Характер и пути регуляторного влияния пролактина на функ- 265 циональную активность клеток гранулезы и созревание ооцит-кумулюсных комплексов

4.3. Внутриклеточные механизмы, связанные с трансдукцией сигна- 284 ла пролактина в ооцитах и клетках кумулюса

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические и генетические аспекты регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях"

Актуальность темы

В последние годы воспроизводительная способность коров с высокой молочной продуктивностью неуклонно снижается, что связано с нарушением у них различных физиологических функций, в том числе овариальной [103, 140]. Дисфункция яичников у высокопродуктивных животных приводит к неполноценному развитию доминантных фолликулов, изменению стероидо-генеза, снижению жизнеспособности ооцитов и их компетенции к эмбриональному развитию. Как известно, гонадотропные гормоны являются ключевыми регуляторами фолликул о- и оогенеза у млекопитающих, однако характер их секреции изменяется лишь незначительно у молочных коров с пониженной воспроизводительной способностью [198]. В качестве основных эндокринных факторов, связанных с ослаблением овариальной активности у высокоудойных коров, обычно рассматриваются метаболические гормоны [103, 198]. Важную роль в этих условиях также может играть гипофизарный гормон пролактин (ПРЛ), основной функцией которого является регуляция репродукции млекопитающих [50]. Ряд данных указывает на то, что нарушения в проведении сигнала ПРЛ в овариальные клетки на рецепторном или пострецепторном уровне приводят к ухудшению фертильности самок, в том числе к неадекватному развитию фолликулов, снижению качества ооцитов, оплодотворяемости яйцеклеток и их способности к дальнейшему развитию [58, 79, 260]. Таким образом, становится актуальным вопрос о роли ПРЛ в регуляции овариальной функции у крупного рогатого скота, в том числе на молекулярном и клеточном уровнях. Особый интерес представляет изучение влияния ПРЛ на развитие биологически полноценных яйцеклеток, что связано с возможностью его использования при экстракорпоральном созревании ооцитов коров для повышения их компетенции к эмбриональному развитию [19, 270].

В настоящее время имеется лишь незначительное число работ, затрагивающих вопросы влияния ПРЛ на созревание фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота (КРС). Поэтому комплексное исследование путей и механизмов действия ПРЛ на соматические и половые клетки овариальных фолликулов коров имеет актуальное значение как для понимания фундаментальных принципов гормональной регуляции фолликуло- и оогенеза, так и для оптимизации методов биотехнологии репродукции у КРС.

Цель и задачи исследований

Целью диссертационной работы являлось исследование биохимических и генетических аспектов регуляции пролактином овариальной функции коров на молекулярном и клеточном уровнях и создание на этой основе теоретической модели, описывающей механизмы влияния ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность фолликулярных клеток. В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать физиологические факторы, связанные с репродуктивным статусом животных и стадией развития/атрезии фолликулов, детерминирующие содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости.

2. Охарактеризовать взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами на клетках гранулезы и его зависимость от интрафолликулярных компонентов и степени зрелости фолликулов.

3. Оценить роль онтогенетических и гормональных факторов в регуляции компетентности гранулезных клеток к связыванию ПРЛ.

4. Провести анализ экспрессии альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в овариальных клетках различного типа.

5. Изучить характер действия ПРЛ на экспрессию собственного рецептора в фолликулярных клетках в зависимости от их сопряжения с ооцитом.

6. Выполнить сравнительный анализ индивидуального и совместного влияния ПРЛ и метаболических гормонов, in vitro на функциональную активность соматических клеток из антральных фолликулов.

7. Исследовать регуляторные эффекты ПРЛ при созревании ооцитов, окруженных клетками кумулюса, в различных системах культивирования.

8. Провести сравнительную оценку участия клеток гранулезы в опосредовании действия ПРЛ и соматотропного гормона in vitro на ооцит-кумулюсные комплексы.

9. Охарактеризовать влияние ПРЛ in vitro на цАМФ-зависимый механизм регуляции созревания изолированных и окруженных кумулюсом ооцитов.

10. Изучить участие клеток кумулюса в проведении сигналов ПРЛ в половые клетки и оценить роль протеинкиназ как медиаторов гормонального действия на ооциты и ооцит-кумулюсные комплексы.

11. Идентифицировать сигнальный каскад, опосредующий влияние ПРЛ на цАМФ-зависимый механизм регуляции мейоза.

12. Исследовать функцию клеток кумулюса в реализации влияния ПРЛ на приобретение ооцитами способности к эмбриональному развитию в присутствии гонадотропных гормонов.

Научная новизна

Диссертационная работа является первым комплексным исследованием характера, путей и механизмов влияния ПРЛ на половые и соматические клетки антральных фолликулов коров, а также факторов, детерминирующих реализацию и степень гормонального воздействия. При выполнении работы впервые были получены следующие результаты:

Установлена зависимость содержания ПРЛ в фолликулярной- жидкости от фазы полового цикла животных и степени атрезии антральных фолликулов. Определены параметры взаимодействия ПРЛ со своими рецепторами на клетках гранулезы и обнаружено снижение концентрации лактогенных рецепторов на заключительной стадии созревания фолликулов. Охарактеризовано влияние репродуктивного статуса животных, лютеальной дифференци-ровки и воздействия соматотропина на компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ. Выявлено присутствие мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках кумулюса и гранулезы и показан тканес-пецифический характер экспрессии этих альтернативных изоформ в яичнике коров. Продемонстрировано регуляторное влияние ПРЛ in vitro на экспрессию собственного рецептора в ооцит-кумулюсных комплексах на уровне транскрипции соответствующего гена и в клетках гранулезы — на уровне альтернативного сплайсинга пре-мРНК. Показана зависимость ростостимули-рующего эффекта ПРЛ в культуре гранулезных клеток от степени зрелости антральных фолликулов и выявлена модуляция соматотропином регулятор-ного действия ПРЛ на синтез ДНК в этих клетках. Обнаружено ингибирую-щее влияние ПРЛ на деструктивные процессы в культивируемых клетках гранулезы из атретических фолликулов. Продемонстрировано in vitro стимулирующее действие ПРЛ на ядерное созревание окруженных кумулюсом ооцитов, а также его тормозящее действие на дегенеративные изменения ядерного материала в яйцеклетках, связанное с освобождением ионов кальция из внутриклеточных депо. Охарактеризована роль клеток гранулезы как медиаторов влияния ПРЛ на мейотические преобразования хромосом в ооцитах. Установлено участие тирозинкиназ в реализации прямого и опосредованного клетками кумулюса действия ПРЛ на мейоз ооцитов. Выявлено взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых ПРЛ и цАМФ в половых и соматических клетках фолликулов. Идентифицирован механизм индуцирующего влияния ПРЛ на реинициацию мейоза при повышении внутриклеточного уровня цАМФ, включающий активацию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ в ооцитах. Показано участие клеток кумулюса в опосредовании стимулирующего влияния ПРЛ на цитоплазматиче-ское созревание ооцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Основной конструктивной характеристикой работы является полученная информация, необходимая для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции пролактином созревания фолликулов и ооцитов у крупного рогатого скота, которая может быть использована при оптимизации методов вспомогательных репродуктивных технологий. На основании полученных данных предложена и научно обоснована теоретическая модель, описывающая механизмы действия ПРЛ на мейоз ооцитов и функциональную активность клеток кумулюса. Модернизирована система созревания in vitro ооцит-кумулюсных комплексов коров посредством предварительной синхронизации мейоза с помощью изобутилметилксантина и последующего одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ, обусловливающая повышение качества цитоплазматического созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота. Разработаны системы культивирования ооцит-кумулюсных комплексов в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ и соматотропина, позволяющие снижать частоту хромосомных нарушений при созревании ооцитов. Предложено использование ПРЛ для снятия блокады мейоза, вызванной цАМФ-повышающими реагентами.

Основные положения, выносимые на защиту

• Содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости коров зависит от фазы полового цикла, степени зрелости и атрезии фолликулов.

• Компетентность клеток гранулезы к связыванию ПРЛ детерминируется уровнем цитодифференцировки и не зависит от репродуктивного статуса животных и воздействия соматотропина.

• В ооцитах, клетках кумулюса и гранулезы коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ; экспрессия альтернативных изоформ носит тканеспецифический характер и регулируется гомологичным гормоном.

• ПРЛ оказывает in vitro ростостимулирующее действие на клетки гра-нулезы, которое определяется степенью зрелости фолликулов и модулируется соматотропином и инсулином, а также тормозящее действие на деструктивные процессы в этих клетках.

• У коров функционируют три автономных пути реализации влияния ПРЛ на ооцит: 1) прямой, 2) через сопряженные с ооцитом клетки ку-мулюса и 3) опосредованный клетками гранулезы.

• Прямое и опосредованное кумулюсом влияние ПРЛ на ооциты достигается путем активации тирозинкиназ при базальном уровне внутриклеточного цАМФ.

• цАМФ играет роль триггера специфического сигнального каскада, индуцируемого пролактином непосредственно в ооцитах, который вовлекает активацию фосфодиэстеразы 3 и последующее снижение уровня цАМФ, что приводит к реинициации мейоза.

• Клетки кумулюса опосредуют стимулирующее влияние ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на компетенцию ооцитов к последующему эмбриональному развитию. t

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 23 международных научных конференциях: «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных» (С.-Петербург-Пушкин, 1994), «Селекционно-биотехнологические методы повышения генетического потенциала с.-х. животных» (Киев, 1994), «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 1995; 2000), 1-й центральной европейской конференции по репродукции животных и сателлитном симпозиуме (Ольштын, Польша; Думмерсторф, Германия, 1996), «Проблемы индивидуального развития сельскохозяйственных животных» (Киев, Украина, 1997), ежегодной конференции Международного Общества по трансплантации эмбрионов (Бостон, США, 1998; Сан Диего, США, 2009), 3-й конференции по эндокринологии сельскохозяйственных животных (Брюссель, Бельгия, 1998), ежегодной конференции Европейской Ассоциации Животноводства (Цюрих, Швейцария, 1999; Рим, Италия, 2003), 8-м и 11-м конгрессе по биотехнологии в репродукции животных (Бернбург, Германия, 2001; Велке Лосины, Чехия, 2004), 8-й Балтийской конференции по разведению и генетике животных (Каунас, Литва, 2002), ежегодной конференции Европейского Общества по репродукции домашних животных (Парма, Италия, 2002), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005; 2009), «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дубровицы, 2007), «Проблемы повышения эффективности производства животноводческой продукции» (Жо-дино, Белоруссия, 2007), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии» (Дубровицы, 2008), «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных» (С.-Петербург, 2008), «Актуальные проблемы ветеринарной биологии» (Москва, 2009), а также на 1-ом съезде общества генетиков и селекционеров России (Саратов, 1994), Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре» и «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (С.-Петербург, 1999,2009).

Публикации результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, из них 18 - в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК («Биохимия», «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», «Онтогенез», «Цитология», «Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова», «Сельскохозяйственная биология», «ТЬеио§епо1о§у»).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Лебедева, Ирина Юрьевна

выводы

1. Содержание ПРЛ в фолликулярной жидкости коров зависит от фазы полового цикла, стадии роста антральных фолликулов и степени их атрезии. При увеличении диаметра фолликулов от 3-5 до 11-20 мм концентрация ПРЛ в жидкости возрастает от 3,7±0,7 до 6,1±0,3 нг/мл (р < 0,05) в фолликулярную фазу и не изменяется в лютеальную фазу астрального цикла, что обусловлено повышением ее уровня в малых фолликулах до 7,0±0,5 нг/мл (р < 0,01). Содержание ПРЛ в жидкости больших антральных фолликулов уменьшается в 1,7 раза при понижении степени их васкуляризации и в 1,5 раза - при повышении уровня дегенерации клеток гранулезы.

2. В клетках гранулезы коров присутствуют рецепторы ПРЛ, связывающие характеристики которых не изменяются при увеличении диаметра фолликулов от 1—2 до 6-10 мм. На заключительной стадии фолликулярного созревания при возрастании диаметра фолликулов до 11-20 мм происходит снижение способности клеток связывать ПРЛ вследствие уменьшения концентрации специфических рецепторов с 14,4±1,1 до 8,1 ±1,2 пМ на 106 клеток (р < 0,05). При этом взаимодействие ПРЛ со своими рецепторами в высокой степени зависит от содержания ионов Mg2+ в окружающей среде (р < 0,001).

3. Компетентность клеток гранулезы в антральных фолликулах к связыванию ПРЛ приобретается у КРС до половой зрелости и не изменяется во время ранней стельности. Процесс лютеальной дифференцировки гранулезных клеток in vitro индуцирует повышение их ПРЛ-связывающей активности с 11,3±1,4 до 18,5±2,2 фМ на 106 клеток (р < 0,01). Соматотропин при физиологических концентрациях не влияет на способность культивируемых клеток гранулезы связывать ПРЛ.

4. В ооцитах и клетках кумулюса и гранулезы коров присутствует мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ, что свидетельствует об участии обеих изоформ в трансдукции гормонального сигнала в половых и соматических клетках антральных фолликулов. Экспрессия альтернативных изоформ рецептора ПРЛ в яичнике носит тканеспецифический характер: в клетках кумулюса и гранулезы из незрелых антральных фолликулов соотношение мРНК длинной и короткой изоформ составляет 0,58±0,07 и 0,57±0,02 соответственно, тогда как в функционально активном желтом теле это соотношение почти в два раза выше (1,09±0,04,/? < 0,01).

5. Пролактин регулирует in vitro экспрессию собственного рецептора в ооцит-кумулюсных комплексах коров на уровне транскрипции гена, а в клетках гранулезы - на уровне альтернативного сплайсинга первичного транскрипта. Внесение 500 нг/мл ПРЛ в среду культивирования ооцит-кумулюсных комплексов приводит к снижению суммарного содержания в клетках мРНК длинной и короткой изоформ лактогенного рецептора с 1,73±0,08 до 1,36±0,10 o.e. (р < 0,05). В клетках гранулезы ПРЛ (500 нг/мл) повышает по сравнению с контролем уровень мРНК короткой изоформы своего рецептора с 0,81±0,11 до 1,24±0,10 o.e. (р < 0,05) и уменьшает в 2,4 раза соответствующее соотношение альтернативных изоформ (р < 0,01).

6. Пролактин оказывает стимулирующее действие на синтез ДНК в культивируемых клетках гранулезы, которое определяется степенью зрелости антральных фолликулов. Митогенное влияние ПРЛ на клетки из малых фолликулов зависит от гормональной концентрации и носит двухфазный характер, причем максимальный эффект достигается при концентрации 50-500 нг/мл (по крайней мере р < 0,05). Соматотропин модулирует ростостимули-рующее действие ПРЛ на клетки гранулезы, увеличивая его максимально эффективную концентрацию до 5 мкг/мл, тогда как инсулин повышает чувствительность этих клеток к ПРЛ. Кроме того, ПРЛ и соматотропин оказывают сходное тормозящее действие на деструктивные процессы в культивируемых клетках гранулезы из атретических фолликулов, которое не обусловлено регуляцией стероидогенной активности клеток.

7. Характер влияния ПРЛ на окруженные кумулюсом ооциты коров зависит от его концентрации и состава среды культивирования. В среде с сывороткой ПРЛ (50 нг/мл) снижает частоту хромосомных нарушений в ооцитах (с 25,0 % до 13,6 %, р < 0,05), что связано с уменьшением содержания в них депонированного Са2+ на ранней стадии созревания (с 1,67±0,05 до 1,27±0,06 у.е., р < 0,01). В этих условиях ПРЛ (50 нг/мл) также стимулирует завершение первого деления мейоза, повышая долю созревших ооцитов с 62,1 % до 78,0 % (р < 0,01), вне зависимости от освобождения Са2+ из внутриклеточных депо. Это свидетельствует о функционировании различных путей проведения сигнала ПРЛ в ооциты или различных внутриклеточных механизмов сигнальной трансдукции.

8. Инкубация ооцит-кумулюсных комплексов в течение 6 ч в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ (50 нг/мл) или соматотропина (10 нг/мл), приводит к кратковременному торможению реи-нициации мейоза, что выражается в блокировании ооцитов на стадии дипло-тены (80,3-80,5 % против 57,2 % в контроле, р < 0,05), и к уменьшению частоты деструктивных изменений хромосом (с 22,4 % до 8,3-9,2 %, р < 0,01), которое сохраняется на протяжении 24-часового культивирования. Таким образом, в антральных фолликулах коров присутствует опосредованный клетками гранулезы путь регуляторного влияния ПРЛ и родственного ему соматотропина на ядерное созревание ооцитов.

9. Пролактин модулирует функционирование цАМФ-зависимого механизма регуляции мейоза путем прямого воздействия на ооциты независимо от их сопряжения с клетками кумулюса. При культивировании изолированных и окруженных кумулюсом ооцитов ПРЛ (50 нг/мл) стимулирует реини-циацию мейоза (по крайней мере р < 0,05) и завершение ядерного созревания яйцеклеток (р < 0,01), подавляя ингибирующее действие цАМФ-повышающих реагентов.

10. В отсутствие реагентов, повышающих внутриклеточный уровень цАМФ, характер действия ПРЛ на ядерное созревание ооцитов in vitro зависит от наличия окружающих их клеток кумулюса. Пролактин (50 нг/мл) кратковременно тормозит возобновление мейоза в изолированных ооцитах, увеличивая долю клеток на стадии диплотены через 7,5 ч инкубации (с 32,7 до 49,3 %,р< 0,05), и стимулирует завершение ядерного созревания окруженных кумулюсом ооцитов (73,3 % против 60,9 % в контроле,/? < 0,05). Ингибитор тирозинкиназ генистейн подавляет это регуляторное действие гормона на реинициацию и завершение первого деления мейоза (р < 0,05), что свидетельствует об участии тирозинкиназ в реализации прямого и опосредованного кумулюсом влияния ПРЛ на ооциты.

11. Повышение уровня цАМФ в изолированных ооцитах на ранней стадии созревания обусловливает активацию пролактином сигнального каскада, приводящего к снижению этого уровня (с 3,16±0,26 до 1,56±0,45 фМ на ооцит, р < 0,01), который позитивно связан с последующим выходом ооцитов, не возобновивших мейоз (r=0,99; р < 0,001). Возрастание концентрации цАМФ в окруженных кумулюсом ооцитах также предшествует стимулирующему действию ПРЛ на реинициацию мейоза, хотя гормон не влияет на содержание цАМФ в кумулюсе и не блокирует его поступление в половые клетки. Кроме того, ПРЛ уменьшает долю изолированных ооцитов, блокированных на стадии диплотены ингибитором фосфодиэстеразы 3 цилостамидом (с 79,4 % до 53,6 %, р < 0,01). Таким образом, индуцирующее влияние ПРЛ на реинициацию мейоза достигается путем активации фосфодиэстеразы 3 и последующего понижения уровня цАМФ в ооцитах.

12. В присутствии гонадотропных гормонов ПРЛ (50 нг/мл) оказывает стимулирующее влияние на компетенцию окруженных кумулюсом ооцитов к последующему эмбриональному развитию после оплодотворения in vitro, что выражается в 2-кратном повышении выхода бластоцист (с 20,5 % до 40,9 %, р < 0,01). Это позитивное действие ПРЛ опосредуется клетками кумулюса, которые детерминируют приобретение ооцитами способности к дальнейшему развитию.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Специалистам в области репродуктивных клеточных технологий рекомендуем:

1. Для повышения эффективности получения in vitro эмбрионов крупного рогатого скота добавлять 50 нг/мл ПРЛ в среду созревания ооцит-кумулюсных комплексов, содержащую гонадотропные гормоны, и проводить синхронизацию мейоза путем предварительной обработки клеток изобутил-метилксантином (0,5 мМ).

2. С целью повышения качества ядерного материала яйцеклеток при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов коров применять среды, кондиционированные клетками гранулезы в присутствии 50 нг/мл ПРЛ или 10 нг/мл соматотропина.

3. При синхронизации возобновления мейоза в культивируемых ооцитах коров с помощью цАМФ-повышающих реагентов использовать ПРЛ (50 нг/мл) для последующего снятия блокады мейоза.

Материалы диссертации могут быть использованы в учебных курсах по молекулярно-биохимическим аспектам регуляции мейоза, а также по физиологии и биотехнологии воспроизводства сельскохозяйственных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты представленной работы позволяют говорить об участии ПРЛ в регуляции тонического фолликулогенеза у крупного рогатого скота путем стимуляции пролиферативной активности и торможения' деструктивных процессов в клетках гранулезы, содержащих специфические лактогенные рецепторы. Степень влияния ПРЛ на фолликулярные клетки зависит от многочисленных факторов, связанных с физиологическим состоянием самих животных и стадией развития или атрезии антральных фолликулов. В число модуляторов действия ПРЛ на соматические клетки фолликулов входят метаболические гормоны - соматотропин и инсулин. Это свидетельствует об изменении эффективности влияния ПРЛ на овариальную функцию у высокопродуктивных молочных коров с повышенным уровнем соматотропина и пониженным уровнем инсулина в крови. Пролактин способен детерминировать проведение своего сигнала в фолликулярные клетки разного типа путем регуляции экспрессии собственных рецепторов либо на уровне транскрипции соответствующего гена, либо на уровне альтернативного сплайсинга первичного транскрипта. Таким образом, характер и степень воздействия ПРЛ на ан-тральные фолликулы у КРС определяются сложной системой регуляторных сигналов центрального и локального происхождения.

Пролактин может быть вовлечен в контроль гипофизом завершающих стадий оогенеза у коров, оказывая модулирующее влияние на ядерное созревание и сопутствующие ему цитоплазматические преобразования в ооците, а также на функциональное состояние окружающих ооцит клеток кумулюса. В антральных фолликулах присутствуют три разных пути проведения сигналов ПРЛ в ооциты: прямой, через сопряженные с ооцитом клетки кумулюса и опосредованный клетками гранулезы. Кроме того, в ооцит-кумулюсных комплексах функционируют различные внутриклеточные механизмы; трансдук-ции сигнала ПРЛ, включающие активацию тирозинкиназ, протеинкиназы С и мобилизацию ионов кальция. Циклический АМФ играет роль триггера специфического сигнального каскада, индуцируемого пролактином в ооцитах, который вовлекает активацию фосфодиэстеразы 3 и последующую деградацию цАМФ и приводит к снятию блокады мейоза in vitro. Это дает основания полагать, что ПРЛ участвует в реинициации мейоза при повышении внутриклеточного уровня цАМФ в ответ на преовуляторную волну лютеинизирую-щего гормона.

В целом, полученная информация способствует пониманию фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции пролактином созревания фолликулов и ооцитов, и представляет научный базис для оптимизации методов биотехнологии репродукции у крупного рогатого скота.

306

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лебедева, Ирина Юрьевна, Санкт-Петербург

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983. 263 с.

2. Богорад Р.Л., Зенкова Т.Ю., Рубцов П.М. и др. Влияние обструктив-ного холестаза и половых гормонов на соотношение двух альтернативных изоформ мРНК рецептора пролактина в гепатоцитах крысы // Биохимия. 2004. Т. 69, Вып. 10. С. 1371-1380.

3. Богорад Р.Л., Остроухова Т.Ю., Орлова А.Н. и др. Рецепторы пролактина холангиоцитов крысы: независимая от пола регуляция уровня и соотношения изоформ // Биохимия. 2006. Т. 71, Вып. 2. С. 229-236.

4. Босток К., Сампер Э. Мейотические хромосомы // Хромосомы эука-риотической клетки. М.: Мир, 1981. С. 349-350.

5. Букаров Н.Г. Контроль и управление воспроизводством генофонда молочных стад Подмосковья // Молочное и мясное скотоводство. 2007. № 1. С. 28-29.

6. Варфоломеев С.Д., Зайцев С.В. Кинетические методы в биохимических исследованиях. М.: Изд-во МГУ, 1982. 345 с.

7. Вундер П.А. Принцип плюс-минус взаимодействия и регуляция про-лактиновой функции гипофиза // Успехи совр. биологии. 1991. Т. 111, № 2. С. 288-301.

8. Голубев А.К., Завертяев Б.П., Кузьмина Т.И. и др. Методические рекомендации по культивированию ооцитов и фолликулов коров / ВНИИРГЖ. Л., 1989. 35 с.

9. Денисенко В.Ю., Кузьмина Т.И. Влияние ингибитора протеинкиназы С на вызванные пролактином изменения уровня Са2+ в клетках гранулезы свиньи // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2000. Т. 86, № 4. С. 481-487.

10. Денисенко В.Ю., Кузьмина Т.И. Участие протеинкиназы С в регуляции стимулированного пролактином освобождения Са2+ из внутриклеточныхдепо ооцитов свиней // Цитология. 2002. Т. 44, № 6. С. 551-554.

11. Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих. М.: Наука, 1988. 228 с.

12. Дыбан А.П., Баранов B.C. Оогенез млекопитающих // Современные проблемы оогенеза. М.: Наука, 1977. С. 200-239.

13. Евдонин A.JI. Белки семейства STAT: роль в проведении клеточного сигнала//Цитология. 1998. Т. 40, № 12. С. 1053-1062.

14. Завертяев Б.П. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. JL: Агропромиздат. Ленингр. отд-ние, 1989. 255 с.

15. Коток Т., Богорад Р.Л., Смирнов А.Н. и др. Влияние периовулятор-ного дисбаланса пролактина на экспрессию рецепторов пролактина в клетках яичника крысы // Онтогенез. 2000. Т. 31, № 2. С. 144-151.

16. Кузьмина Т.Н. Цитогенетические и биохимические аспекты мейоза и оплодотворения ооцитов коров in vitro: дис. . д-ра биол. наук: 03.00.15. СПб., 1993.247 с. ^

17. Кузьмина Т.И., Малышев А.Ю. Гипераккумуляция мембрансвязан-ного Ca ооцитами коров при деструктивных изменениях ооцит-кумулюсного комплекса // Бюлл. ВНИИРГЖ. Пушкин, 1991. № 129. С. 3-7.

18. Кузьмина Т.И., Лебедева И.Ю., Торнер X. и др. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию // Онтогенез. 2001. Т. 32, № 2. С. 140-147.

19. Кусень С.И., Стойка P.C. Молекулярные механизмы в действии полипептидных факторов роста. М.: Наука, 1985. 240 с.

20. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

21. Лебедева И.Ю., Лебедев В.А., Кузьмина Т.И. Характеристика сома-тотропин- и пролактинсвязывающих участков на клетках гранулезы коров при использовании гомологичных гормонов // Биохимия. 2001. Т. 66, № 9. С. 1188-1194.

22. Лебедева И.Ю., Лебедев В.А., Кузьмина Т.И. Регуляторное влияние ионов магния на взаимодействие пролактина и соматотропина с рецепторами на клетках гранулезы коров Bos Taurus // Журн. эвол. биохим. и физиол. 2004. Т. 40, №2. С. 118-124.

23. Лягин Ф.Ф. Особенности воспроизводительных качеств высокопродуктивных коров // Зоотехния. 2003. № 5. С. 25-27.

24. Маленко Г.П. Получение зародышей крупного рогатого скота вне организма: дис. . д-ра биол. наук: 03.00.23. Боровск, 2002. 227 с.

25. Смирнова О.В., Богорад Р.Л. Короткие формы мембранных рецепторов: образование и роль в проведении гормонального сигнала // Биохимия. 2004. Т. 69, Вып. 4. С. 437-452.

26. Смирнова О.В., Богорад Р.Л. Механизмы дискриминации физиологических эффектов пролактина на печень на уровне рецепторного звена гепа-тоцитов и холангиоцитов // Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова. 2005. Т. 91, №2. С. 184-194.

27. Тараненко А.Г., Касимов З.Н., Федосимов В.А. Исследование уровня пролактина в крови жвачных животных // Физиол. журн. СССР. 1975. Т. 61, № 4. С. 648-654.

28. Широкова A.B. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и водного баланса клетки // Цитология. 2007. Т.49, № 5. С 385-394.

29. Шихов И.Я. Митотическая активность клеток и распределение нуклеиновых кислот в коже плодов овец // Закономерности развития кожи и шерсти у овец. М., 1965. С. 26-38.

30. Эрнст Л.К., Янушка А.Л., Свиридов Б.Е. и др. Культивирование фолликулярных ооцитов коров // Докл. ВАСХНИЛ. 1979: № 4. С. 27-28.

31. Эрнст JI.K., Свиридов Б.Е., Галиева Л.Д. и др. Нарушение мейоза при культивировании ооцитов коров // Цитология. 1980. Т. 22, № 4. С. 475477.

32. Albertini D.F. Regulation of meiotic maturation in the mammalian oocytes: interplay between exogenous cues and the microtubule cytoskeleton // Bioessays. 1992. Vol. 14. P. 97-103.

33. Adams G.P., Matteri R.L., Kastelic J.P. et al. Association between surges of follicle-stimulating hormone and the emergence of follicular waves in heifers // J. Reprod. Fertil. 1992. Vol. 94. P. 177-188.

34. Adams G.P., Evans A.C.O., Rawlings N.C. Follicular waves and circulating gonadotrophins in 8-month old prepubertal heifers // J. Reprod. Fertil. 1994. Vol. 100. P. 27-33.

35. Agarwal S.K., Vogel K., Weitsman S.R. et al. Leptin antagonizes the insulin-like growth factor-I augmentation of steroidogenesis in granulosa sand theca cells of the human ovary // J. Clin. Endocr. Metab. 1999. Vol. 84. P. 1072-1076.

36. Aktas H.3 Wheeler M.B., Rosenkrans C.F.Jr. et al. Maintenance of bovine oocytes in prophase of meiosis I by high [cAMP]i // J. Reprod. Fertil. 1995. Vol. 105. P. 227-235.

37. Aktas H., Leibfried-Rutledge M.L., First N.L. Meiotic state of bovine oocytes is regulated by interactions between cAMP, cumulus, and granulosa // Mol. Reprod. Dev. 2003. Vol. 65. P. 336-343.

38. Ali S., Edery M., Pellegrini I. et al. The Nb2 form of prolactin receptor is able to activate a milk protein gene promoter // Mol. Endocrinol. 1992. Vol. 6. P. 1242-1248.

39. Ali S., Chen Z., Lebrun J.J. et al. PTP1D is a positive regulator of the prolactin signal leading to beta-casein promoter activation // EMBO J. 1996. Vol. 15. P. 135-142.

40. Amit T., Hochberg Z., Barkey R.J. Influence of Mg2+ on detection of somatogenic and lactogenic components of growth-hormone-binding protein in mammalian sera//Biochem. J. 1993. Vol. 293. P. 345-349.

41. Amsterdam A., Dantes A., Selvaraj N. et al. Apoptosis in steroidogenic cells: structure-functional analysis // Steroids. 1997. Vol. 62. P. 207-211.

42. Anantamongkol U., Takemura H., Suthiphongchai T. et al. Regulation of Ca2+ mobilization by prolactin in mammary gland cells: possible role of secretory pathway Ca2+-ATPase type 2 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. Vol. 352. P. 537-542.

43. Andric N., Ascoli M. The luteinizing hormone receptor-activated extracel-lularly regulated kinase-1/2 cascade stimulates epiregulin release from granulosa cells // Endocrinology. 2008. Vol. 149. P. 5549-5556.

44. Armstrong D.G., Gong J.G., Webb R. Interactions between nutrition and ovarian activity in cattle: physiological, cellular and molecular mechanisms // Re-prod. Suppl. 2003. Vol. 61. P. 403-414.

45. Avazeri N., Courtot A.M., Lefevre B. Regulation of spontaneous meiosis resumption in mouse oocytes by various conventional PKC isozymes depends on cellular compartmentalization // J. Cell Sci. 2004. Vol. 117. P. 4969-4978.

46. Ayoub M.A., Hunter A.G. Inhibitory effect of bovine follicular fluid on in vitro maturation of bovine oocytes // J. Dairy Sci. 1993. Vol. 76. P. 95-100.j

47. Bachelot A., Binart N. Reproductive role of prolactin // Reproduction. 2007. Vol. 133. P. 361-369.

48. Baltar A.E., Oliveira M.A., Catanho M.T. Bovine cumulus/oocyte complex: quantification of LH/hCG receptors // Mol. Reprod. Dev. 2000. Vol. 55. P. 433-437.

49. Baltsen M. Gonadotropin-induced accumulation of 4,4-dimethylsterols in mouse ovaries and its temporal relation to meiosis. // Biol. Reprod. 2001. Vol. 65. P. 1743-1750. i

50. Bao B., Garverick H.A. Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves:- a review //J. Anim. Sci. 1998. Vol. 76. P. 1903-1921.

51. Barash I., Cromlish W., Posner B.I. Prolactin (PRL) receptor induction in cultured rat hepatocytes: dual regulation by PRL and growth hormone // Endocrinology. 1988. Vol. 122. P. 1151-1158.

52. Barnard R., Waters M. Use of calcium dependence as a means to study the interaction between growth hormones and their binding proteins in rabbit liver // Biochem. J. 1988. Vol. 250. P. 533-538.

53. Bartke A. Role of growth hormone and prolactin in the control of reproduction: What are we learning from transgenic and knock-out animals? // Steroids. 1999. Vol. 64. P. 598-604.

54. Basini G., Mainardi G.L., Bussolati S. et al. Steroidogenesis, proliferation and apoptosis in bovine granulosa cells: role of tumour necrosis* factor-alpha and its possible signalling mechanisms // Reprod. Fertil. Dev. 2002. Vol. 14. P.141.150.

55. Beam S.W., Butler W.R. Energy balance effects on follicular development and first ovulation in postpartum cows // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1999. Vol. 54. P. 411-424.

56. Beg M.A., Ginther O.J. Follicle selection in cattle and horses: role of intrafollicular factors // Reproduction. 2006. Vol. 132. P. 365-377.

57. Bergfelt D.R., Plata-Madrid H., Ginther O.J. Counteraction of follicular inhibitory effect of follicular fluid by administration of FSH in heifers // Can. J. Anim. Sci. 1994. Vol. 74. P. 633-639.

58. Berlanga J.J., Gualillo O., Buteau H. et al. Prolactin activates tyrosyl phosphorylation of insulin receptor substrate 1 and phosphatidylinositol-3-OH kinase // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 2050-2052.

59. BesnardN., Home E.A., Whitehead S.A. Prolactin and lipopolysaccharide treatment increased apoptosis and atresia in rat ovarian follicles // Acta-Physiol. Scand. 2001. Vol. 172. P. 17-25.

60. Bevers M.M., Dieleman S J., Kruip T.A. The role of prolactin during the oestrous cycle in cattle // Tijdschr. Diergeneeskd. 1988. Vol. 113. P. 1227-1236.

61. Billig H., Furuta I., Hsueh A.J. Estrogens inhibit and androgens enhance ovarian granulosa cell apoptosis // Endocrinology. 1993. Vol. 133. P. 2204-2212.

62. Bilodeau S., Fortier M.A., Sirard M.A. The effect of adenylate cyclase stimulation on meiotic resumption and cyclic AMP content of zona-free and cumulus-enclosed bovine oocytes in vitro // J. Reprod. Fertil. 1993. Vol. 97. P. 5-11.

63. Bilodeau-Goeseels S. Effects of phosphodiesterase inhibitors on spontaneous nuclear maturation and cAMP concentrations in bovine oocytes // Therioge-nology. 2003. Vol. 60. P. 1679-1690.

64. Bilodeau-Goeseels S. Effects of manipulating the nitric oxide/cyclic GMP pathway on bovine oocyte meiotic resumption in vitro // Theriogenology. 2007. Vol. 68. P. 693-701.

65. Bilodeau-Goeseels S., Sasseville M., Guillemette C. et al. Effects of adenosine monophosphate-activated kinase activators on bovine oocyte nuclear maturation in vitro // Mol. Reprod. Dev. 2007. Vol. 74. P. 1021-1034.

66. Binart N., Imbert-Bollore P., Baran N. et al. A short form of the prolactin (PRL) receptor is able to rescue mammopoiesis in heterozygous PRL receptor mice // Mol. Endocrinol. 2003. Vol. 17. P. 1066-1074.

67. Binart N., Bachelot A., Bouilly J. Impact of prolactin receptor isoforms on reproduction // Trends Endocrinol. Metab. 2010. Vol. 21. P. 362-368.

68. Blondin P., Bousquet D., Twagiramungu H. et al. Manipulation of follicular development to produce developmentally competent bovine oocytes // Biol. Reprod. 2002. Vol. 66. P. 38-43.

69. Bolander F.F.Jr. Prolactin activation of mammary nitric oxide synthase: molecular mechanisms // J. Mol. Endocrinol. 2002. Vol. 28. P. 45-51.

70. Bole-Feysot C., Goffin V., Edery M. et al. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice // Endocr. Rev. 1998. Vol. 19. P. 225-268.

71. Borromeo V., Berrini A., Bramani S. et al. Plasma levels of GH and PRL and concentrations in the fluids of bovine ovarian cysts and follicles // Theri-ogenology. 1998. Vol. 49. P. 1377-1387.

72. Bossaert P., De Cock H., Leroy J.L. et al. Immunohistochemical visualization of insulin receptors in formalin-fixed bovine ovaries post mortem and in granulosa cells collected in vivo // Theriogenology. 2010. Vol. 73. P. 1210-1219.

73. Bossis I., Wettemann R.P., Wetly S.D. et al. Nutritionally induced anovulation in beef heifers: ovarian and endocrine function preceding cessation of ovulation//J. Anim. Sci. 1999. Vol. 77. P. 1536-1546.

74. Boutin J.M., Jolicoeur C., Okamura H. et al. Cloning and expression of the rat prolactin receptor, a member of the growth hormone/prolactin receptor gene family // Cell. 1988. Vol. 53. P. 69-77.

75. Bowen J.M., Telleria C.M., Towns R. et al. Downregulation of longform prolactin receptor mRNA during prolactin-induced luteal regression // Eur. J. Endocrinol. 2000. Vol. 143. P. 285-292.

76. Bramley T.A., Menzies G.S. Receptors for lactogenic hormones in the porcine corpus luteum: properties and luteal phase concentrations // J. Endocrinol. 1987. Vol. 113. P. 355-364.

77. Braw-Tal R., Roth Z. Gene expression for LH receptor, 17 alpha-hydroxylase and StAR in the theca interna of preantral and early antral follicles in the bovine ovary // Reproduction. 2005. Vol. 129. P. 453-461.

78. Brnjic S., Olofsson M.H., Havelka A.M. et al. Chemical biology suggests a role for calcium signaling in mediating sustained INK activation during apoptosis // Mol. Biosyst. 2010. Vol. 6. P. 767-774.

79. Brockman J.L., Schroeder M.D., Schuler L.A. PRL activates the cyclin D1 promoter via the Jak2/Stat pathway // Mol. Endocrinol. 2002. Vol. 16. P. 774

80. Brown R.L., Ord T., Moss S.B. A-kinase anchor proteins as potential regulators of protein kinase A function in oocytes // Biol. Reprod. 2002. Vol. 67. P. 981-987.

81. Brown R.J., Adams J.J., Pelekanos R.A. et al. Model for growth hormone receptor activation based on subunit rotation within a receptor dimmer // Nat. Struct. Mol. Biol. 2005. Vol. 12. P. 814-821.

82. Brunet S., Maria A.S., Guillaud P. et al. Kinetochore fibers are not involved in the formation of the first meiotic spindle in mouse oocytes, but control the exit from the first meiotic M phase // J. Cell. Biol. 1999. Vol. 146. P. 1-12.

83. Brunet S., Maro B. Cytoskeleton and cell cycle control during meiotic maturation of the mouse oocyte: integrating time and space // Reproduction. 2005. Vol. 130. P. 801-811.

84. Bu S., Xia G., Tao Y. et al. Dual effects of nitric oxide on meiotic maturation of mouse cumulus cell-enclosed oocytes in vitro // Mol. Cell. Endocrinol. 2003. Vol. 207. P. 21-30.

85. Buccione R., Vanderhyden B.C., Caron P.J. et al. FSH-induced expansion of the mouse cumulus oophorus in vitro is dependent upon a specific factor (s) secreted by the oocyte // Dev. Biol. 1990. Vol. 138. P. 16-25.

86. Buck K., Vanek M., Groner B. et al. Multiple forms of prolactin receptor messenger ribonucleic acid are specifically expressed and regulated in murine tissues and the mammary cell line HC11 // Endocrinology. 1992. Vol. 130. P. 11081114.

87. Byskov A.G., Yding Andersen C., Hossaini A. et al. Cumulus cells of oocyte-cumulus complexes secrete a meiosis-activating substance when stimulated with FSH // Mol. Reprod. Dev. 1997. Vol. 46. P. 296-305.

88. Cahill L.P., Saumande J., Ravault J.P. et al. Hormonal and follicular relationships in ewes of high and low ovulation rates // J. Reprod. Fertil. 1981. Vol. 62. P. 141-150.

89. Caliesen H., Greve T., Hyttel P. Preovulatory endocrinology and oocyte maturation in superovulated cattle // Theriogenology. 1986. Vol. 43. P. 1115-1128.

90. Castañeda T.R., Tong J., Datta R. et al. Ghrelin in the regulation of body weight and metabolism // Front. Neuroendocrinol. 2010. Vol. 31. P. 44-60.

91. Castilla A., García C., Cruz-Soto M. et al. Prolactin in ovarian follicular fluid stimulates endothelial cell proliferation // J. Vase. Res. 2010. Vol. 47. P. 45-53.

92. Chagas L.M., Bass J.J., Blache D. et al. Invited review: New perspectives on the roles of nutrition and metabolic priorities in the subfertility of high-producing dairy cows // J. Dairy Sci. 2007. Volt 90. P: 4022-4032.

93. Chan W.H. Impact of genistein on maturation of mouse oocytes, fertilization, and fetal development // Reprod. Toxicol. 2009. Vol. 28. P. 52-58.

94. Chase C.C., Kirby C.J., Hammond A.C. et al. Patterns of ovarian growth and development in cattle with a growth hormone receptor deficiency // J. Anim. Sci. 1998. Vol. 16. P. 212-219.

95. Chen X., Zhou B., Yan J. et al. Epidermal growth factor receptor activation by protein kinase C is necessary for FSH-induced meiotic resumption in porcine cumulus-oocyte complexes // J. Endocrinol. 2008. Vol. 197. P. 409-419.

96. Chin E.C., Abayasekara D.R. Progesterone secretion by luteinizing human granulosa cells: a possible cAMP-dependent but PKA-independent mechanism involved in its regulation // J. Endocrinol. 2004. Vol. 183. P. 51-60.

97. Choi T., Fukasawa K., Zhou R. et al. The Mos/mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway regulates the size and degradation of the first polar body in maturing mouse oocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93. P. 7032-7035.

98. Christmann L., Jung T., Moor R.M. MPF components and meiotic competence in growing pig oocytes // Mol. Reprod. Dev. 1994. Vol. 38. P. 85-90.

99. Ciccia-Torres G.N., Dellacha J.M. Influence of divalent cations on the detection of somatogenic and lactogenic binding sites in mouse liver cells // Bio-chem. J. 1985. Vol. 228. P. 761-764.

100. Ciereszko R.E., Petroff B.K., Ottobre A.C. et al. Assessment of the mechanism by which prolactin stimulates progesterone production by early corpora lutea of pigs // J. Endocrinol. 1998. Vol. 159. P. 201-209.

101. Ciereszko R., Opalka M., Kaminska B. et al. Luteotrophic action of*1 prolactin during the early luteal phase in pigs: the involvement of protein kinases and phosphatases // Reprod. Biol. 2001. Vol. 1. P. 62-83. j,

102. Ciereszko R., Opalka M., Kaminska B. et al. Prolactin signalling in porcine theca cells: the involvement of protein kinases and phosphatases // Reprod. Fertil. Dev. 2003. Vol. 15. P. 27-35.

103. Clarke D.L., Linzer D.I. Changes in prolactin receptor expression during pregnancy in the mouse ovary // Endocrinology. 1993. Vol. 133. P. 224-232.

104. Clarke D.L., Arey B.J., Linzer D.I. Prolactin receptor messenger ribonucleic acid expression in the ovary during the rat estrous cycle // Endocrinology. 1993. Vol. 133. P. 2594-2603.

105. Clarke L.A., Wathes D.C., Jabbour H.N. Expression and localization of prolactin receptor messenger ribonucleic acid in red deer ovary during the estrous cycle and pregnancy // Biol. Reprod. 1997. Vol. 57. P. 865-872.

106. Clevenger C.V., Furth P. A., Hankinson S.E. et al. The role of prolactin in mammary carcinoma // Endocr. Rev. 2003. Vol. 24. P. 1-27.

107. Conti M., Andersen C.B., Richard F. et al. Role of cyclic nucleotide signaling in oocyte maturation // Mol. Cell. Endocrinol. 2002. Vol. 187. P. 153159.

108. Conti M., Hsieh M., Park J.Y. et al. Role of the epidermal growth factor network in ovarian follicles // Mol. Endocrinol. 2006. Vol. 20. P. 715-723.

109. Conti M. Signaling networks in somatic cells and oocytes activated during ovulation // Ann. Endocrinol. (Paris). 2010. Vol. 71. P. 189-190.

110. Cox N.M. Control of follicular development and ovulation rate in pigs // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1997. Vol. 52. P. 31-46.

111. Cran D.G. Qualitative and quantitative structural changes during pig oocyte maturation // J. Reprod. Fertil. 1985. Vol. 74. P. 237-245.

112. Cran D.G. Cortical granules during oocyte maturation and fertilization //J. Reprod. Fertil. Suppl. 1989. Vol. 38. P. 49-62.

113. Crosby J., Osborn J., Moor R. Changes in protein phosphorylation during the maturation of mammalian oocytes in vitro // J. Exp. Zool. 1984. Vol-. 229. P. 459-466.

114. Cunningham B.C., Bass S., Fuh G. et al. Zinc mediation of the binding of human growth hormone to the human prolactin receptor // Science. 1990. Vol. 250. P. 1709-1712.

115. Cushman R.A., DeSouza J.C., Hedgpeth V.S. et al. Alteration of activation, growth, and atresia of bovine preantral follicles by long-term treatment ofcows with estradiol and recombinant bovine somatotropin // Biol. Reprod. 2001. Vol. 65. P. 581-586.

116. Dajee M., Kazansky A.V., Raught B. et al. Prolactin induction of the alpha 2-macroglobulin gene in rat ovarian granulosa cells: stat 5 activation and binding to the interleukin-6 response element // Mol. Endocrinol. 1996. Vol. 10. P. 171-184.

117. Dayi A., Bediz C.S., Musai B. et al. Comparison of leptin levels in serum and follicular fluid during the oestrous cycle in cows // Acta Vet. Hung. 2005. Vol. 53. P. 457-467.

118. Demura R., Suzuki T., Komatsu H. et al. Prolactin interacts with gonadotropin through a suppression of c-AMP production probably as a LH-sensitive adenylate cyclase inhibitor//Endocrinol. Japon. 1986. Vol. 33. P. 29-35.

119. Deng J., Carbajal L., Evaul K. et al. Nongenomic steroid-triggered oocyte maturation: of mice and frogs // Steroids. 2009. Vol. 74. P. 595-601.

120. Di Rosa M., Zambito A.M., Marsullo A.R. et al. Prolactin induces chi-totriosidase expression in human macrophages through PTK, PI3-K, and MAPK pathways //J. Cell. Biochem. 2009. Vol. 107. P. 881-889.

121. Dieleman S.J., Hendriksen P.J.M., Viuf D. et al. Effects of in vivo prematuration and in* vivo final maturation* on developmental capacity and qualityof pre-implantation embryos // Theriogenology. 2002. Vol. 57. P. 5-20.

122. Diskin M.G., Mackey D.R., Roche J.F. et al. Effects of nutrition and metabolic status on circulating hormones and ovarian follicle development in cattle // Anim. Reprod: Sci: 2003. Vol. 78. P. 345-370.

123. Dixit V.D., Parvizi N. Nitric oxide and the control of reproduction // Anim. Reprod. Sci. 2001. Vol. 65. P. 1-16.

124. Dobson H., Smith R., Royal M. et al. The high-producing dairy cow and its reproductive performance // Reprod. Domest. Anim. 2007. Vol. 42, Suppl. 2. P. 17-23.

125. Dodge-Kafka K.L., Kapiloff M.S. The mAKAP signaling complex: integration of cAMP, calcium, and MAP kinase signaling pathways // Eur. J. Cell. Biol. 2006. Vol. 85. P. 593-602.

126. Doldi N., Papaleo E., De Santis L. et al. Treatment versus no treatment of transient hyperprolactinemia in patients undergoing intracytoplasmic sperm injection programs//Gynecol. Endocrinol. 2000. Vol. 14. P. 437-441.

127. Doppler W. Regulation of gene expression by prolactin // Reviews, of Physiology, Biochemistry and Pharmacology; eds: M.P. Blaustein, H. Grunicke, E. Habermann et al.. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 1994. P. 93-130.

128. Downs S.M., Hunzicker-Dunn M. Differential: regulation of oocyte maturation and cumulus expansion in the mouse oocyte-cumulus cell complex by site-selective analogs of cyclic adenosine monophosphate // Dev. Biol. 1995. Vol. 172. P. 72-85.

129. Downs S.M., Cottom J., Hunzicker-Dunn M. Protein kinase C and mei-otic regulation in isolated mouse oocytes // Mol. Reprod. Dev. 2001. Vol. 58. P. 101-115.

130. Driancourt M;A. Follicular dynamics in sheep and cattle // Theriogenol-ogy. 1991. Vol. 35. P. 55-79.

131. Driancourt M.A, Thuel B. Control of oocyte growth and maturation by follicular cells and molecules present in fluid // Reprod. Nutr. Dev. 1998. Vol. 38. P. 345-362.

132. Driancourt M.A. Regulation of ovarian follicular dynamics in farm animals. Implications for manipulation of reproduction // Theriogenology. 2001. Vol. 55. P. 1211-1239.

133. Duan W.R., Linzer D.I.H., Gibori G. Cloning and characterization of an ovarian-specific protein that associates with the short form of the prolactin receptor //J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 15602-15607.

134. Ducibella T., Duffy P., Buetow J. Quantification and localization of cortical granules during oogenesis in the mouse // Biol. Reprod. 1994. Vol. 50. P. 467473.

135. Duckworth B.C., Weaver J.S., Ruderman J.V. G2 arrest in Xenopus oocytes depends on phosphorylation of cdc25 by protein kinase A // PNAS. 2002. Vol. 99. P. 16794-16799.

136. Dunaif A.E., Zimmerman E.A., Friesen H.G. et al. Intracellular localization of prolactin receptor and prolactin in the rat ovary by immunocytochemistry //Endocrinology. 1982. Vol. 110. P. 1465-1471.

137. Duranthon V., Renard J.P. The developmental competence of mammalian oocytes: a convenient but biologically fuzzy concept // Theriogenology. 2001. Vol. 55. P. 1277-1289.

138. Dusza L. Effect of prolactin on ovarian steroidogenesis // Acta Physiol. Pol. 1989. Vol. 40. P. 74-84.

139. Dusza L., Tilton J.E. Role of prolactin in the regulation of ovarian function in pigs // J. Reprod. Fert. Suppl. 1990. Vol. 40. P. 33-45.

140. Engelmann B., Schumacher U., Duhm J. Use of chlortetracycline fluorescence for the detection of Ca storing intracellular vesicles in normal humanerythrocytes // J. Cell. Physiol. 1990. Vol. 143. P. 357-363.

141. Eppig J,J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals // Reproduction. 2001. Vol. 122. P. 829-838.

142. Eppig J.J., Vivieros M.M., Marin-Bivens C. et al. Regulation of mammalian oocyte maturation / Leung P.C., Adashi E.Y. (eds) // The ovary. Amsterdam: Elsevier Academic Press, 2004. P. 113-129.

143. Evans A.C.O., Adams G.P., Rawlings N.C. Endocrine and ovarian follicular changes leading up to the first ovulation in prepubertal heifers // J. Reprod. Fertil. 1994. Vol. 100. P. 187-194.

144. Evans A.C.O., Adams G.P., Rawlings N.C. Follicular and hormonal development in prepubertal heifers from 2 to 36 weeks of age // J. Reprod. Fertil. 1994. Vol. 102. P. 463-470.

145. Evans A.C., Ireland J.L., Winn M.E. et al. Identification of genes involved in apoptosis and dominant follicle development during follicular waves in cattle //Biol. Reprod. 2004. Vol. 70. P. 1475-1484.

146. Fair T., Hyttel P., Greve T. Bovine oocyte diameter in relation to matura-tional competence and transcriptional activity // Mol. Reprod. Dev. 1995. Vol. 42. P. 437-442.

147. Fair T. Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence // Anim. Reprod. Sci. 2003. Vol. 78. P. 203-216.

148. Fan H.Y., Li M.Y., Tong C. et al. Inhibitory effects of cAMP and protein kinase C on meiotic maturation and MAP kinase phosphorylation in porcine oocytes // Mol. Reprod. Dev. 2002. Vol. 63. P. 480-487.

149. Fan H.Y., Huo L.J., Chen D.Y. et al. Protein kinase C and mitogen-activated protein kinase cascade in mouse cumulus cells: cross talk and effect onmeiotic resumption of oocyte // Biol. Reprod. 2004. Vol. 70. P. 1178-1187.

150. Fan H.Y., Sun Q.Y. Involvement of mitogen-activated protein kinase cascade during oocyte maturation and fertilization in mammals // Biol. Reprod. 2004. Vol. 70. P. 535-547.

151. Farin C.E., Rodriguez K.F., Alexander J.E. et al. The role of transcription in EGF- and FSH-mediated oocyte maturation in vitro // Anim. Reprod. Sci. 2007. Vol. 98. P. 97-112.

152. Fernandez-Botran R., Sanders V.M., Vitetta E.S. Interactions between receptors for interleukin 2 and interleukin 4 on lines of helper T cells // J. Exp. Med. 1989. Vol. 169. P. 379-391.

153. Finidori J., Kelly P.A. Cytokine receptor signalling through two novel families of transducer molecules: Janus kinases, and signal transducers and activators of transcription // J. Endocrinol. 1995. Vol. 147. P. 11-23.

154. Fissore R.A., Pinto-Correia C., Robl J.M. Inositol trisphosphate-induced calcium release in the generation of calcium oscillations in bovine eggs // Biol. Reprod. 1995. Vol. 53. P. 766-774.

155. Flores R., Looper M.L., Rorie R.W. et al. Endocrine factors and ovarian follicles are influenced by body condition and somatotropin in postpartum beef cows//J. Anim. Sci. 2008. Vol. 86. P. 1335-1344.

156. Folch J., Ramon J.P., Cocero M.J. et al. Exogenous growth hormone improves the number of transferable embryos in superovulated ewes // Therioge-nology. 2001. Vol. 55. P. 1777-1785.

157. Fortune J.E., Wissler R.N., Vincent S.E. Prolactin modulates steroidogenesis by rat granulosa cells: II. Effects on estradiol // Biol. Reprod. 1986. Vol. 35. P. 92-99.

158. Fortune J.E. Ovarian follicular growth and development in mammals // Biol. Reprod. 1994. Vol. 50. P. 225-232.

159. Fortune J.E. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles // Anim. Reprod. Sci. 2003.1. Vol. 78. P. 135-163.

160. Fresno Vara J.A., Carretero M.V., Geronimo H. et al. Stimulation of c-Src by prolactin is independent of Jak2 // Biochem. J. 2000. Vol. 345, Pt. 1. P. 1724.

161. Fresno Vara J.A., Caceres M.A., Silva A. et al. Src family kinases are required for prolactin induction of cell proliferation // Mol. Biol. Cell. 2001. Vol. 12. P. 2171-2183.

162. Fu M., Chen X., Yan J. et al. Luteinizing hormone receptors expression in cumulus cells closely related to mouse oocyte meiotic maturation // Front. Biosci. 2007. Vol. 12. P. 1804-1813.

163. Fukuda S., Orisaka M., Tajima K. et al. Luteinizing hormone-induced Akt phosphorylation and androgen production are modulated by MAP Kinase in bovine theca cells // J. Ovarian Res. 2009. Vol. 2. P. 17.

164. Fulka J.Jr., Jung T., Moor R.M. The fall of biological maturation promoting factor (MPF) and histone HI kinase activity during anaphase and telophase in mouse oocytes // Mol. Reprod. Dev. 1992. Vol. 32. P. 378-382.

165. Gadd S.L., Clevenger C.V. Ligand-independent dimerization of the human prolactin receptor isoforms: functional implications // Mol. Endocrinol. 2006. Vol. 20. P. 2734-2746.

166. Gasco V., Beccuti G., Marotta F. et al. Endocrine and metabolic actions of ghrelin // Endocr. Dev. 2010. Vol. 17. P. 86-95.

167. Gaytan F., Bellido C., Morales C. et al. Follicular growth pattern in cyclic rats from late pro-oestrus to early oestrus // J. Reprod. Fertil. 1997. Vol. 110. P. 153-159.

168. Gilchrist R.B., Ritter L.J., Armstrong D.T. Oocyte-somatic cell interactions during follicle development in mammals // Anim. Reprod. Sci. 2004. Vol. 82/83. P. 431-446.

169. Ginther O.J., Knopf L., Kastelic J.P. Ovarian follicular dynamics in heifers during early pregnancy // Biol. Reprod. 1989. Vol. 41. P. 247-254.

170. Ginther O.J., Knopf L., Kastelic J.P. Temporal associations among ovarian events in cattle during oestrous cycles with two and three follicular waves // J. Reprod. Fertil. 1989. Vol. 87. P. 223-230.

171. Ginther O.J., Kot K., Kulick L.J. et al. Relationships between FSH and ovarian follicular waves during the last six months of pregnancy in cattle // J. Reprod. Fertil. 1996. Vol. 108. P. 271-279.

172. Gitay-Goren H., Lindenbaum E.S., Kraiem Z. Prolactin inhibits hCG-stimulated steroidogenesis and cAMP accumulation, possibly by increasing phosphodiesterase activity, in rat granulosa cell cultures // Mol. Cell. Endocrinol. 1989. Vol. 61. P. 69-76.

173. Goffin V., Kinet S., Ferrag F. et al. Antagonistic properties of human prolactin analogs that show paradoxical agonistic activity in the Nb2 bioassay // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 16573-16579.

174. Goffin. V., Bouchard B., Ormandy C.J. et al. Prolactin: a hormone atithe crossroads of neuroimmunoendocrinology // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1998. Vol. 840. P. 498-509.

175. Goffin V., Binart N., Touraine P. et al. Prolactin: the new biology of an old hormone // Annu. Rev. Physiol. 2002. Vol. 64. P. 47-67.

176. Gong J.G., Bramley T., Webb R. The effect of recombinant bovine somatotropin on ovarian function in heifers: follicular populations and peripheral hormones // Biol. Reprod. 1991. Vol. 45. P. 941-949.

177. Gong J.G., McBride D., Bramley T.A. et al. Effects of recombinant bovine somatotrophin, insulin-like growth factor-I and insulin on the proliferation of bovine granulosa cells in vitro // J. Endocrinol. 1993. Vol. 139. P. 67-75.

178. Gong J.G., McBride D., Bramley T.A. et al. Effects of recombinantbovine somatotropin, insulin-like growth factor-I and insulin on bovine granulosa cell steroidogenesis in vitro //J. Endocrinol. 1994. Vol. 143. P. 157-164.

179. Gong J.G. Influence of metabolic hormones and nutrition on ovarian follicle development in cattle: practical implications // Domest. Anim. Endocrinol. 2002. Vol. 23. P. 229-241.

180. Gong J.G., Armstrong D.G., Baxter G. et al. The effect of increased dietary intake on superovulatory response to FSH in heifers // Theriogenology. 2002. Vol. 57. P. 1591-1602.

181. Gregoraszczuk E., Slomczyñska M., Stoklosowa S. Effect of genistein, tyrphostin and herbimycin on prolactin-stimulated progesterone production by porcine theca and luteal cells // J. Physiol. Pharmacol. 1999. Vol. 50. P. 477-484.

182. Gregoraszczuk E.L., Rak A., Wójtowicz A. et al. Gh and IGF-I increase leptin receptor expression in prepubertal pig ovaries: the role of leptin in steroid secretion and cell apoptosis // Acta Vet. Hung. 2006. Vol. 54. P. 413-426.

183. Guthrie H.D., Garrett W.M. Apoptosis during folliculogenesis in pigs // Reprod. Suppl. 2001. Vol. 58. P. 17-29.

184. Hagstrom K.A., Meyer B.J. Condensin and cohesin: more than* chromosome compactor and glue // Nat. Rev. Genet. 2003. Vol. 4. P. 520-534.

185. Halperin J., Devi S.Y., Elizur S. et al. Prolactin signaling through the short form of its receptor represses forkhead transcription factor F0X03 and its target gene Gait causing a severe ovarian defect // Mol. Endocrinol. 2008. Vol. 22. P. 513-522.

186. Han S J., Vaccari S., Nedachi T. et al. Protein kinase B/Akt phosphorylation of PDE3A and its role in mammalian oocyte maturation // EMBO J. 2006. Vol. 25. P. 5716-5725.

187. Hanafy K.A., Krumenacker J.S., Murad F. NO, nitrotyrosine, and cyclic GMP in signal transduction//Med. Sci. Monit. 2001.Vol. 7. P. 801-819.

188. Hashimoto S. Application of in vitro maturation to assisted reproductive technology // J. Reprod. Dev. 2009. Vol. 55. P. 1-10.

189. Haughian J.M., Ginther O.J., Kot K. et al. Relationships between FSH patterns and follicular dynamics and the temporal associations among hormones in natural and GnRH-induced gonadotropin surges in heifers // Reproduction. 2004. Vol. 127. P. 23-33.

190. Henderson K.M., McNeilly A., Swanston I. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicular size // J. Reprod. Fertil. 1982. Vol. 65. P.467-473.

191. Henderson K.M., McNatty K.P., Smith P. et al. Influence of follicular health on the steroidogenic and morphological characteristics of bovine granulosa cells in vitro // J. Reprod. Fertil. 1987. Vol. 79. P. 185-193.

192. Hillier S.G. Gonadotropic control of ovarian follicular growth and development // Mol. Cell. Endocrinol. 2001. Vol. 179. P. 39-46.

193. Hinrichs K. Manipulation of oocyte maturation in vitro // Arch. Anim. Breed. 1996. Vol. 39, Spec, issue. P. 43-50.

194. Hirshfield A.N. Development of follicles in the mammalian ovary // Internal:. Rev. Cytol. 1991. Vol. 124. P.43-101.

195. Holt J.E., Jones K.T. Control of homologous chromosome division in the mammalian oocyte //Mol. Hum. Reprod. 2009. Vol. 15. P. 139-147.

196. Homa S.T. Neomycin, an inhibitor of phosphoinositide hydrolysis, inhibits the resumption of bovine oocyte spontaneous meiotic maturation // J. Exp. Zool. 1991. Vol. 258. P. 95-103.

197. Homa S.T. Calcium and meiotic maturation of the mammaliantoocyte // Mol. Reprod. Dev. 1995. Vol. 40. P. 122-134.

198. Horner K., Livera G., Hinckley M. et al. Rodent oocytes express an active adenylyl cyclase required for meiotic arrest // Dev. Biol. 2003. Vol. 258. P. 385-396.

199. Houslay M.D. Underpinning compartmentalised cAMP signalling through targeted cAMP breakdown // Trends Biochem. Sci. 2010. Vol. 35. P. 91100.

200. Hsueh A.J., Adashi E.Y., Jones P.B. et al. Hormonal regulation of the differentiation of cultured ovarian granulosa cells // Endocr. Rev. 1984. Vol. 5. P. 76-127.

201. Hu Z., Dufau M.L. Multiple and differential regulation of ovarian prolactin receptor messenger RNAs and their expression // Biochem. Biophys. Res. Com. 1991. V. 181. P. 219-225.

202. Hu Z., Zhuang L., Dufau M.L. Multiple and tissue-specific promoter control of gonadal and non-gonadal prolactin receptor gene expression // J. Biol.

203. Chem. 1996. Vol. 271. P. 10242-10246.

204. Hu Z.Z., Zhuang L., Dufau M.L. Prolactin receptor gene diversity: structure and regulation // Trends Endocrinol. Metab. 1998. Vol. 9. P. 94-102.

205. Hu Z.Z., Meng J., Dufau M.L. Isolation and characterization of two novel forms of the human prolactin receptor generated by alternative splicing of a newly identified exon 11 // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 41086-41094.

206. Hu Z.Z., Zhuang L., Meng J. et al. Complex 5' genomic structure of the human prolactin receptor: multiple alternative exons 1 and promoter utilization // Endocrinology. 2002. Vol. 143. P. 2139-2142.

207. Hu C.L., Cowan R.G., Harman R.M. et al. Apoptosis of bovine granulosa cells after serum withdrawal is mediated by Fas antigen (CD95) and Fas li-gand // Biol. Reprod. 2001. Vol. 64. P. 518-526.

208. Huang K.T., Ueda E., Chen Y.H. et al. Paradigm-shifters: phosphory-lated prolactin and short prolactin receptors // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2008. Vol. 13. P. 69-79.

209. Hull K.L., Harvey S. Growth hormone: roles in female reproduction // J. Endocrinol. 2001. Vol. 168. P. 1-23.

210. Hull K.L., Harvey S. GH as a co-gonadotropin: the relevance of correlative changes in GH secretion and reproductive state // J. Endocrinol. 2002. Vol. 172. P. 1-19.

211. Hunzicker-Dunn M., Maizels E.T. FSH signaling pathways in immature granulosa cells that regulate target gene expression: branching out from protein kinase A // Cell. Signal. 2006. Vol. 18. P. 1351-1359.

212. Huo L.J., Liang C.G., Yu L.Z. et al. Inducible nitric oxide synthase-derived nitric oxide regulates germinal vesicle breakdown and first polar body emission in the mouse oocyte // Reproduction. 2005. Vol. 129. P. 403-409.

213. Hussein M.R. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms // Hum. Reprod. Update. 2005. Vol. 11. P. 162-177.

214. Hussein T.S., Froiland D.A., Amato F. et al. Oocytes prevent cumuluscell apoptosis by maintaining a morphogenic paracrine gradient of bone morpho-genetic proteins // J. Cell. Sci. 2005. Vol. 118. P. 5257-5268.

215. Hyttel P., Xu K.P., Smith S. Ultrastructure of in-vitro oocyte maturation in cattle // J. Reprod. Fertil. 1986. Vol. 78. P. 615-625.

216. Hyttel P., Fair T., Callesen H. et al. Oocyte growth, capacitation and final maturation in cattle // Theriogenology. 1997. Vol. 47. P. 23-32.

217. Ihle J.N., Kerr I.M. Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptor superfamily // Trends Genet. 1995. Vol. 11. P. 69-74.

218. Ihle J.N. STATs and MAPKs: obligate or opportunistic partners in signaling // Bioessays. 1996. Vol. 18. P. 95-98.

219. Ikeda S., Imai H., Yamada M. Apoptosis in cumulus cells during in vitro maturation of bovine cumulus-enclosed oocytes // Reproduction. 2003. Vol. 125. P. 369-376.

220. Inoue N., Manabe N., Matsui T. Roles of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand signaling pathway in granulosa cell apoptosis during atresia in pig ovaries // J. Reprod. Develop. 2003. Vol. 49. P. 313-321.

221. Irving-Rodgers H.F., van Wezel I.L., Mussard M.L. et al. Atresia revisited: two basic patterns of atresia of bovine antral follicle // Reproduction. 2001. Vol. 122. P. 761-775.

222. Isobe N., Fujihara M., Terada T. Cumulus cells suppress meiotic progression in pig oocytes cultured in vitro // Theriogenology. 1996. Vol. 45. P. 14791489.

223. Itoh T., Kacchi M., Abe H. et al. Growth, antrum formation, and estradiol production of bovine preantral follicles cultured in a serum-free medium // Biol. Reprod. 2002. Vol. 67. P. 1099-1105.

224. Itoh F., Komatsu T., Kushibiki S. et al. Effects of ghrelin injection on plasma concentrations of glucose, pancreatic hormones and Cortisol in Holstein daiiy cattle // Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol. 2006. Vol. 143. P. 97-102.

225. Izadyar F., Colenbrander B., Bevers M.M. In vitro maturation of bovine oocytes in the presence of growth hormone accelerates nuclear maturation and promotes subsequent embryonic development // Mol. Reprod. Dev. 1996. Vol. 45. P. 372-377.

226. Izadyar F., Colenbrander B., Bevers M.M. Stimulatory effect of growth hormone on in vitro maturation of bovine oocytes is exerted through the cyclic adenosine 3',5'-monophosphate signaling pathway // Biol Reprod. 1997. Vol. 57. P. 1484-1489.

227. Izadyar F., Van Toi H.T.A., Colenbrander B. et al. Stimulatory effect of growth hormone on in vitro maturation of bovine oocytes is exerted through cumulus cells and not mediated by IGF-I // Mol. Reprod. Dev. 1997. Vol. 47. P. 175-180.

228. Izadyar F., Hage W.J., Colenbrander B. et al. The promotory effect of growth hormone on the developmental competence of in vitro matured bovine oocytes is due to improved cytoplasmic maturation // Mol. Reprod. Dev. 1998. Vol. 49. P. 444-453.

229. Izadyar F., Zeinstra E., Bevers M.M. Follicle-stimulating hormone and growth hormone act differently on nuclear maturation while both enhance developmental competence of in vitro matured bovine oocytes // Mol. Reprod. Dev. 1998. Vol. 51. P. 339-345.

230. Jabbour H.N., Kelly P.A. Prolactin receptor subtypes: a possible mode of tissue specific regulation of prolactin function // Rev. Reprod. 1997. Vol. 2. P. 1418.

231. Jabbour H.N., Clarke L.A., Bramley T. et al. Alternative splicing of the prolactin receptor gene generates a 1.7 kb RNA transcript that is linked to prolactinfunction in the red deer testis // J. Mol. Endocrinol. 1998. Vol. 21. P. 51-59.

232. Jamnongjit M., Gill A., Hammes S.R. Epidermal growth factor receptor signaling is required for normal ovarian steroidogenesis and oocyte maturation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. Vol. 102. P. 16257-16262.

233. Jerry D.J., Griel Jr.L.C., Kavanaugh J.F. et al. Binding and bioactivity of ovine and porcine prolactins in porcine mammary tissue // J. Endocrinol. 1991. Vol. 130. P. 43-51.

234. Jessberger R. The many functions of SMC proteins in chromosome dynamics //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2002. Vol. 3. P. 767-778.

235. Jessberger R. SMC proteins at the crossroads of diverse chromosomal processes // IUBMB Life. 2003. Vol. 55. P. 643-652.

236. Jinno M., Katsumata Y., Hoshiai T. et al. A therapeutic role of prolactin supplementation in ovarian stimulation for in vitro fertilization: the bromocrip-tine-rebound method // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1997. Vol. 82. P. 3603-3611.

237. Johannessen M., Delghandi M.P., Moens U. What turns CREB on? // Cell. Signal. 2004. Vol. 16. P. 1211-1227.

238. Johnson A.L. Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles // Anim. Reprod. Sci. 2003. Vol. 78. P. 185-201.

239. Johnson A.L., Bridgham J.T., Swenson J.A. Activation of the Akt/protein kinase B signaling pathway is associated with granulosa cell survival // Biol. Reprod. 2001. Vol. 64. P. 1566-1574.

240. Johnson A.L., Bridgham J.T. Caspase-mediated apoptosis in the vertebrate ovary // Reproduction. 2002. Vol. 124. P. 19-27.

241. Jones K.T., Carroll J., Whittingham D.G. Ionomycin, thapsigargin, ryanodine and sperm sensitive calcium release increase during meiotic maturation ofmouse oocytes // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 6671-6677.

242. Jones K.T. Meiosis in oocytes: predisposition to aneuploidy and its increased incidence with age // Hum. Reprod. Update. 2008. Vol. 14. P. 143-158.

243. Joyce I.M., Khalid M., Haresign W. The effect of recombinant GH treatment on ovarian growth and atresia in sheep // Theriogenology. 2000. Vol. 54. P. 327-338.

244. Kane M.T. A review of in vitro gamete maturation and embryo culture and potential impact on future animal biotechnology // Anim. Reprod. Sci. 2003. Vol. 79. P. 171-190.

245. Kanitz W., Torner H., Aim H. et al. Aspects of in vitro production of cattle embryos // J. Physiol. Pharmacol. 1996. Vol. 47, Suppl. 1. P. 55-70.

246. Karamouti M., Kollia P., Kallitsaris A. et al. Growth hormone, insulinlike growth factor I, and leptin interaction in human cultured lutein granulosa cells steroidogenesis // Fertil. Steril. 2008. Vol. 90, Suppl. P. 1444-1450. 1

247. Kawagoe S., Hiroi M. Involvement of prolactin in the control of follicular maturation // Gynecol. Obstet. Invest. 1990. Vol. 29. P. 51-55.

248. Kazmer G.W., Barnes M.A., Akers R.M. et al. Lactogenic hormone receptors in mammary membrane preparations from prepartum and 60 and l80 day post-partum Holstein cattle //J. Endocrinol. 1986. Vol. 109. P. 175-180.

249. Kelly P.A., Djiane J., Postel-Vinay M.C. et al. The prolactin/growth hormone receptor family // Endocr. Rev. 1991. Vol. 12. P. 235-251.

250. Kelly P.A., Edery M., Finidori J. et al. Receptor domains involved in signal transduction of prolactin and growth hormone // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1994. Vol. 206. P. 280-283.

251. Kiapekou E., Loutradis D., Patsoula E. et al. Prolactin receptor mRNA expression in oocytes and preimplantation mouse embryos // Reprod: Biomed. Online. 2005. Vol. 10. P. 339-346.

252. Kiapekou E., Loutradis D., Drakakis P. et al. Effects of GH and IGF-I on the in vitro maturation of mouse oocytes // Hormones (Athens): 2005. . Vol. 4. P.155.160.

253. Kiapekou E., Zapanti E., Mastorakos G. et al. Effect of prolactin in the absence of hCG on maturation, fertilization, and embryonic development of in vitro matured mouse oocytes // Ann. NY Acad. Sci. 2006. Vol. 1092. P. 450-459.

254. Kiapekou E., Loutradis D., Mastorakos G. et al. Effect of PRL on in vitro follicle growth, in vitro oocyte maturation, fertilization and early embryonic development in mice // Cloning Stem Cells. 2009. Vol. 11. P. 293-300.

255. Kidder G.M., Mhawi A. A. Gap junctions and ovarian folliculogenesis // Reproduction. 2002. Vol. 123. P. 613-620.

256. Kim J.H., Han J.S., Yoon Y.D. Biochemical and morphological identification of ceramide-induced cell cycle arrest and apoptosis in cultured granulosa cells // Tissue Cell. 1999. Vol. 31. P. 531-539.

257. Kinoshita H., Yasui T., Ushigoe K. et al. Expression of ovarian prolactin receptor in relation to hormonal changes during induction of ovulation-in the rat // Gynecol. Obstet. Invest. 2001. Vol. 52. P. 132-138.

258. Kitajima T.S., Sakuno T., Ishiguro K. et al. Shugoshin collaborates with protein phosphatase 2A to protect cohesion // Nature. 2006. Vol. 441. P. 4652.

259. Kitamura T., Ogorochi T., Miyajima A. Multimeric cytokine receptors // Trends Endocrinol. Metab. 1994. Vol. 5. P. 8-14.

260. Kline J.B., Roehrs H., Clevenger C.V. Functional characterization of the intermediate isoform of the human prolactin receptor // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P: 35461-35468.

261. Knight P.G. Roles of inhibins, activins, and follistatin in the female reproductive system // Front. Neuroendocrinol. 1996. Vol. 17. P. 476-509.

262. Kôlle S., Sinowatz F., Boie G. et al. Developmental changes in the expression of the growth hormone receptor messenger ribonucleic acid and protein in the bovine ovary//Biol. Reprod. 1998. Vol. 59. P. 836-842.

263. Kôlle S., Stojkovic M., Boie G. et al. Growth hormone-related effects on apoptosis, mitosis, and expression of connexin 43 in bovine in vitro maturation cumulus-oocyte complexes // Biol. Reprod. 2003. Vol. 68. P. 1584-1589.

264. Krasnow J.S., Hickey G.L., Richards J.S. Regulation of aromatase messenger RNA and estradiol biosynthesis in rat ovarian granulosa and luteal cells by prolactin //Mol. Endocrinol. 1990. Vol. 4. P. 13-21.

265. Kruip Th.A.M., Dieleman S.J. Macroscopic classification of bovine follicles and its validation by micromorphological and steroid biochemical procedures //Reprod. Nutr. Develop. 1982. Vol. 22. P. 465-473.

266. Kruip T.A., Cran D.G., Van Beneden T.H. et al. Structural changes in bovine oocytes during final maturation in vivo // Gamete Res. 1983. Vol. 8. P. 2947.

267. Kubiak J.Z., Weber M., de Pennart H. et al. The metaphase II arrest in mouse oocytes is controlled through microtubule-dependent destruction of cyclin B in the presence of CSF // EMBO J. 1993. Vol. 12. P. 3773-3778.

268. Kudo N.R., Wassmann K., Anger M. et al. Resolution of chiasmata in oocytes requires separase-mediated proteolysis // Cell. 2006. Vol. 126. P. 135-146.

269. Kuzmina T.I., Pôzdnyakova T. Effects of recombinant bovine somatotropin on in vitro maturation and fertilization of bovine oocytes // Proc. of the 47th Annu. Meet, of Europ. Assoc. for Aimal Production. Norway, 1996. P. 431

270. Kuzmina T.I., Torner H., Aim H. Effect of somatotropin on bovine oocyte maturation and early embryonic development in different culture systems // Biotechnology, Agronomy, Soc. and Environment. 1998. Vol. 2, Spec, issue. P. 73.

271. Landefeld T.D., Suttie J.M. Changes in messenger ribonucleic acid concentrations and plasma levels of growth hormone during the ovine estrous cycleand in response to exogenous estradiol // Endocrinology. 1989. Vol. 125. P. 14741478.

272. Lebrun J.J., Ali S., Ullrich A. et al. Proline-rich sequence-mediated Jak2 association to the prolactin receptor is required but not sufficient for signal transduction // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P. 10664-10670.

273. Lee J., Miyano T., Moor R.M. Localization of phosphorylated MAP kinase during the transition from meiosis I to meiosis II in pig oocytes // Zygote. 2000. Vol. 8. P. 119-125.

274. Lee J., Kitajima T.S., Tanno Y. et al. Unified mode of centromeric protection by shugoshin in mammalian oocytes and somatic cells // Nat. Cell. Biol. 2008. Vol. 10. P. 42-52.

275. Leung D.W., Spencer S.A., Cachianes G. et al. Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression // Nature. 1987. Vol. 330. P. 537-543.

276. Levi M., Shalgi R. The role of Fyn kinase in the release from metaphase in mammalian oocytes // Mol. Cell. Endocrinol. 2010. Vol. 314. P. 228-233.

277. Levi M., Maro B., Shalgi R. The involvement of Fyn kinase in resumption of the first meiotic division in mouse oocytes // Cell Cycle. 2010. Vol. 9. P. 1577-1589.

278. Li R., Norman R.J., Armstrong D.T. et al. Oocyte-secreted factor(s) determine functional differences between bovine mural granulosa cells and. cumulus cells // Biol. Reprod. 2000. Vol. 63. P. 839-845.

279. Liang C.G., Su Y.Q., Fan H.Y. et al. Mechanisms regulating oocyte meiotic resumption: roles of mitogen-activated protein kinase // Mol. Endocrinol. 2007. Vol. 21. P. 2037-2055.

280. Liu Y.X., Peng X.R., Chen Y.J. et al. Prolactin delays gonadotrophin-induced ovulation and down-regulates expression of plasminogen-activator system in ovary // Hum. Reprod. 1997. Vol. 12. P. 2748-2755.

281. Liu Y.X., Peng X.R., Liu H.Z. et al. Prolactin regulation of tissue type plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor type-I gene expression in eCG-primed rat granulosa cells in culture // Biol. Reprod. 1998. Vol. 59. P. 409416.

282. Llano E., Gomez R., Gutierrez-Caballero C. et al. Shugoshin-2 is essential for the completion of meiosis but not for mitotic cell division in mice // Genes Dev. 2008. Vol. 22. P. 2400-2413.

283. Lonergan P., Monaghan P., Rizos D. et al. Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence following maturation,.fertiliza-, tion, and culture in vitro // Mol. Reprod. Dev. 1994. Vol. 37. P. 48-53.

284. Lopez H., Satter L.D., Wiltbank M.C. Relationship between level of milk production and estrous behavior of lactating dairy cows // Anim. Reprod. Sci. 2004. Vol. 81. P. 209-223.

285. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265-275.

286. Lu Z., Xia G., Zhang J. Protein kinase C, rather than protein kinase A is involved in follicle-stimulating hormone-mediated meiotic resumption of mouse cumulus cell-enclosed oocytes in hypoxanthine-supplemented: medium' // Mol.

287. Cell. Endocrinol. 2001. Vol. 182. P. 225-232.

288. Luck M.R., Rodgers R.J., Findlay J.K. Secretion and gene expression of inhibin, oxytocin and steroid hormones during the in vitro differentiation of bovine granulosa cells // Reprod. Fertil. Dev. 1990. Vol. 2. P. 11-25.

289. Luo J., McGinnis L.K., Kinsey W.H. Role of Fyn kinase in oocyte developmental potential // Reprod/ Fertil/ Dev. 2010. Vol. 22. P. 966-976.

290. Lussier J.G., Matton P., Dufour J J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow // J. Reprod. Fertil. 1987. Vol. 81. P. 301-307.

291. Mani A.M., Fenwick M.A., Cheng Z. et al. IGF1 induces up-regulation of steroidogenic and apoptotic regulatory genes via activation of phosphatidylino-sitol-dependent kinase/AKT in bovine granulosa cells // Reproduction. 2010. Vol. 139. P. 139-151.

292. Manna P.R., El-Hefnawy T., Kero J. et al. Biphasic action of prolactinin the regulation of murine Leydig tumor cell functions // Endocrinology. 2001. Vol. 142. P. 308-318.

293. Mao J., Wu G., Smith M.F. et al. Effects of culture medium, serum type, and various concentrations of follicle-stimulating hormone on porcine prean-tral follicular development and antrum formation in vitro // Biol. Reprod. 2002. Vol. 67. P. 1197-1203.

294. Markstrôm E., Svensson E.C., Shao R. et al. Survival factors regulating ovarian apoptosis dependence on follicle differentiation // Reproduction. 2002. Vol. 123. P. 23-30.

295. Martin G.B., Milton J.T., Davidson R.H. et al. Natural methods for increasing reproductive efficiency in small ruminants // Anim. Reprod. Sci. 2004. Vol. 82/83. P. 231-245.

296. Masui Y., Clarke H.J. Oocyte maturation // Int. Rev. Cytol. 1979. Vol. 57. P. 185-282.

297. Matamoros I.A., Cox N.M., Moore A.B. Effects of exogenous insulin and body condition on metabolic hormones and gonadotropin-induced follicular development in prepubertal gilts //J. Anim. Sci. 1991. Vol. 69. P. 2081-2091.

298. Matsuda-Minehata F., Inoue N., Goto Y. et al. The regulation-of ovarian granulosa cell death by pro- and anti-apoptotic molecules // J. Reprod. Dev. 2006. Vol. 52. P. 695-705.

299. Mattioli M. Molecular aspects of gonadotropin-induced oocyte maturation // Arch. Animal Breeding. 1996. Vol. 39. P. 31-41.

300. Mattioli M., Gioia L., Barboni B. Calcium elevation in sheep cumulus-oocyte complexes after luteinising hormone stimulation // Mol. Reprod: Dev. 1998.1. Vol. 50. P. 361-369.

301. Mattioli M., Barboni B. Signal transduction mechanism for LH in the cumulus-oocyte complex // Mol. Cell. Endocrinol. 2000. Vol. 161. P. 19-23.

302. Mayes M:A., Sirard M.A. Effect of type 3 and type 4 phosphodiesterase, inhibitors on the maintenance of bovine oocytes in meiotic arrest // Biol. Reprod. 2002. Vol. 66. P. 180-184.

303. McArdle C.A., Kohl C., Rieger K. et al. Effects of gonadotropins, insulin and insulin-like growth factor I on ovarian oxytocin and progesterone production // Mol. Cell. Endocrinol. 1991. Vol. 78. P. 211-220.

304. McGee E.A., Hsueh A.J. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles // Endocr. Rev. 2000. Vol. 21. P. 200-214.

305. McGinnis L.K., Kinsey W.H., Albertini D.F. Functions of Fyn kinase in the completion of meiosis in mouse oocytes // Dev. Biol. 2009. Vol. 327. P. 280287.

306. McNatty K.P., Gibb M., Dobson C. et al. Changes in the concentration of gonadotropic and steroidal hormones in the antral fluid, of ovarian, follicle throughout the oestrous cycle of the sheep // Aust. J. Biol. Sci. 1981. Vol. 34. P. 67-80.

307. McNeilly A.S., Glasier A., Jonassen J. et al. Evidence for direct inhibition of ovarian function by prolactin // J. Reprod. Fertil. 1982. Vol. 65. P. 559-569.

308. McNeilly A.S. Lactational control of reproduction // Reprod. Fertil. Dev. 2001. Vol. 13. P. 583-590.

309. Meduri G., Charnaux N., Driancourt M.A. et al. Follicle-stimulating hormone receptors in oocytes? // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2002. Vol. 87. P. 2266-2276.

310. Mehlmann L.M., Kline D. Regulation of intracellular calcium in the mouse egg: calcium release in response to sperm or inositol trisphosphate is enhanced after meiotic maturation // Biol. Reprod. 1994. Vol. 5L P. 1088-1098:

311. Mehlmann L.M., Saeki Y., Tanaka S. et al. The Gs-linked; receptor

312. GPR3 maintains meiotic arrest in mammalian oocytes // Science. 2004. Vol. 306. P. 1947-1950.

313. Mehlmann L.M. Stops and starts in mammalian oocytes: recent advances in understanding the regulation of meiotic arrest and oocyte maturation // Reproduction. 2005. Vol. 130. P. 791-799.

314. Meikrantz W., Schlegel R. Apoptosis and the cell cycle // J. Cell. Biochem. 1995. Vol. 58. P. 160-174.

315. Mellado M., Rodriguez-Frade J.M., Kremer L. et al. Conformational changes required in the human growth hormone receptor for growth hormone signaling // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 9189-9196.

316. Mendes M.C., Ferriani R.A., Sala M.M. et al. Effect of transitory hyperprolactinemia on in vitro fertilization of human oocytes // J. Reprod. Med.,. 2001. Vol. 46. P. 444-450.

317. Mendoza C., Cremades N., Ruiz-Requena E. et al. Relationship between fertilization results after intracytoplasmic sperm injection, intrafollicular steroid, pituitary hormone and cytokine concentrations // Hum. Reprod. 1999. Vol. 14. P. 628-635.

318. Menezo Y.J., el Mouatassim S., Chavrier M. et al. Human oocytes and preimplantation embryos express mRNA for growth hormone receptor // Zygote. 2003. Vol. 11. P. 293-297.

319. Merton J.S., de Roos A.P.W., Mullaart E. et al. Factors affecting oocyte quality and quantity in commercial application of embryo technologies in the cattle breeding industry // Theriogenology. 2003. Vol. 59. P. 651-674.

320. Mihm M., Good T.E., Ireland J.L. et al. Decline in serum follicle-stimulating hormone concentrations alters key intrafollicular growth factors involved in selection of the dominant follicle in heifers // Biol. Reprod. 1997. Vol. 57. P. 1328-1337.

321. Mihm M. Intrafollicular health markers during antral follicle wave development in cattle // Arch. Tierzucht. 2001. Vol. 44, Special Issue. P. 24-29.

322. Mihm M., Austin E.J. The final stages of dominant follicle selection in cattle // Domest. Anim. Endocrin. 2002. Vol. 23. P. 155-166.

323. Mihm M., Bleach E.C. Endocrine regulation of ovarian antral follicle development in cattle // Anim. Reprod. Sci. 2003. Vol. 78. P. 217-237.

324. Miller S.L., DeMaria J.E., Freier D.O. et al. Novel association of Vav2 and Nek3 modulates signaling through the human prolactin receptor // Mol. Endocrinol. 2005. Vol. 19. P. 939-949.

325. Mondadori R.G., Neves J.P., Gonfalves P.B. Protein kinase C (PKC) role in bovine oocyte maturation and early embryo development // Anim. Reprod. Sci. 2008. Vol. 107. P. 20-29.

326. Moor R.M., Seamark R.F. Cell signaling, permeability and microvascu-latoiy changes during antral follicle development in mammals // J. Dairy Sci. 1986. Vol. 69. P. 927-943.

327. Moor R, Dai Y. Maturation of pig oocytes in vivo and in // Reprod. Suppl. 2001. Vol. 58. P. 91-104.

328. Morita Y., Tilly J.L. Oocyte apoptosis: like sand through an hourglass // Dev. Biol. 1999. Vol. 213. P. 1-17.

329. Murakami M., Narazaki M., Hibi M. et al. Critical cytoplasmic region of the interleukin-6 signal-transducer, gp 130, is conserved in the cytokine receptor family // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. P. 11349-11353.

330. Murray S.C., Keeble S.C., Muse K.N. Regulation of granulosa cell-derived ovarian metalloproteinase inhibitor(s) by prolactin // J. Reprod. Fertil. 1996. Vol. 107. P. 103-108.

331. Nagai T. The improvement of in vitro maturation systems for bovine and porcine oocytes // Theriogenology. 2001. Vol. 55. P. 1291-1301.

332. Nakamura Y., Yamagata Y., Sugino N. et al. Nitric oxide inhibits oocyte meiotic maturation // Biol. Reprod. 2002. Vol. 67. P. 1588-1592.

333. Nakamura E., Otsuka F., Inagaki K. et al. A novel antagonistic effect of the bone morphogenetic protein system on prolactin actions in regulating steroidogenesis by granulosa cells // Endocrinology. 2010. Vol. 151. P. 5506-5518.

334. Nevalainen M.T., Valve E.M., Ingleton P.M. et al. Expression and hormone regulation of prolactin receptors in rat dorsal and lateral prostate // Endocrinology. 1996. Vol. 137. P. 3078-3088.

335. Newhall K.J., Criniti A.R., Cheah C.S. et al. Dynamic anchoring of PKA is essential during oocyte maturation // Curr. Biol. 2006. Vol. 16. P. 321-327.

336. Niall H.D., Hogan M.L., Sayer R. et al. Sequences of pituitary and placental lactogenic and growth hormones. Evolution from a primordial peptide by gene duplication // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. Vol. 68. P. 866-869.

337. Nicola N.A. Why do hemopoietic growth factor receptors interact with each other? // Immunol. Today. 1987. Vol. 8. P. 134-142.

338. Nogueira M.F., Buratini J.Jr., Price C.A. et al. Expression of LH receptor mRNA splice variants in bovine granulosa cells: changes with follicle size and regulation by FSH in vitro // Mol. Reprod. Dev. 2007. Vol. 74. P. 680-686.

339. Norbury C., Blow J., Nurse P. Regulatory phosphorylation of the p34cdc2 protein kinase in vertebrates // EMBO J. 1991. Vol. 10. P. 3321-3329.

340. Norris R.P., Ratzan W.J., Freudzon M. et al. Cyclic GMP from the surrounding somatic cells regulates cyclic AMP and meiosis in the mouse oocyte // Development. 2009. Vol. 136. P. 1869-1878.

341. Noubani A., Farookhi R., Gutkowska J. B-type natriuretic peptide receptor expression and activity are hormonally regulated in rat ovarian cells // Endocrinology. 2000. Vol. 141. P. 551-559.

342. Oh J.S., Han S.J., Conti M. WeelB, Mytl, and Cdc25 function in distinct compartments of the mouse oocyte to control meiotic resumption // J. Cell. Biol. 2010. Vol. 188. P. 199-207.

343. Ohta S., Wakabayashi K. Rat ovarian and adrenal prolactin receptors. Sizes and effects of divalent metal ions // Endocrinol. Jpn. 1986. Vol. 33. P. 239249.

344. Ohwaki M., Suganuma N., Seo H. et al. Source of prolactin in human follicular fluid // Endocrinol. Jpn. 1992. Vol. 39. P. 601-607.

345. Ormandy C.J., Binart N., Helloco C. et al. Mouse prolactin receptor gene: genomic organization reveals alternative promoter usage and generation of isoforms via alternative 3'-exon splicing // DNA Cell. Biol. 1998. Vol. 17. P. 761770.

346. Oxberry B.A., Greenwald G.S. Down regulation of prolactin receptors in the hamster ovary by the preovulatory gonadotropin surge // Biol. Reprod. 1984. Vol. 31. P. 464-470.

347. Pache T.D., Wladimiroff J.W., de Jong F.H. et al. Growth patterns of nondominant ovarian follicles during the normal menstrual cycle // Fertil. Steril. 1990. Vol. 54. P. 638-642.

348. Pansini F., Bergamini C.M., Cavallini A.R. et al. Prolactinemia during the menstrual cycle. A possible role for prolactin in the regulation of ovarian function // Gynecol. Obstet. Invest. 1987. Vol. 23. P. 172-176.

349. Park J.I., Kim S.G., Chun J.S. et al. Activation of protein kinase Czeta mediates luteinizing hormone- or forskolin-induced NGFI-B expression in preovulatory granulosa cells of rat ovary // Mol. Cell. Endocrinol. 2007. Vol. 270. P. 79

350. Parra M.T., Viera A., Gomez R. et al. Involvement of the cohesin Rad21 and SCP3 in monopolar attachment of sister kinetochores during mouse meiosis I // J. Cell Sci. 2004. Vol. 117. P. 1221-1234.

351. Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge M.L. et al. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen // Theriogenology. 1986. Vol. 25. P. 591-600.

352. Paula-Lopes F.F., Boelhauve M., Habermann F.A. et al. Leptin promotes meiotic progression and developmental capacity of bovine oocytes via cumulus cell-independent and -dependent mechanisms // Biol. Reprod. 2007. Vol. 76. P. 532-541.

353. Peluso J J. Role of the peripubertal pattern of FSH, LH and prolactin secretion in regulating in-vitro steroidogenesis and follicular growth within juvenile rat ovaries // J. Reprod. Fertil. 1989. Vol. 86. P. 705-711. :

354. Perks C.M., Newcomb P.V., Grohmann M. et al. Prolactin acts as a potent survival factor against C2-ceramide-induced apoptosis in human granulosa cells // Hum Reprod. 2003. Vol. 18. P. 2672-2677.

355. Perrot-Applanat M., Gualillo O., Pezet A. et al. Dominant negative and cooperative effects of mutant forms of prolactin receptor // Mol. Endocrinol. 1997. Vol. 11. P. 1020-1032.

356. Peter A.T., Dhanasekaran N. Apoptosis of granulosa cells: a review on the role of MAPK-signalling modules // Reprod. Domest. Anim. 2003. Vol. 38. P. 209-213.

357. Peters J.M. The anaphase promoting complex/cyclosome: a machine designed to destroy // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 7. P. 644-456.

358. Petridou B., Cahoreau C., Djiane J. Rapidly reversible binding of rabbit prolactin to the rabbit prolactin receptor accounts for the differences between homologous and heterologous binding // J. Endocrinol. 1997. Vol. 153. P. 207-219.

359. Phelps J.Y., Bugg E.M., Shamblott MJ. et al. Prolactin gene expression in human ovarian follicular cells // Fértil. Steril. 2003. Vol. 79. P. 182^185.

360. Picazo R.A., Garcia Ruiz J.P., Santiago Moreno J. et al. Cellular localization and changes in expression of prolactin receptor isoforms in sheep ovary throughout the estrous cycle // Reproduction. 2004. Vol. 128. P. 545-553.

361. Picton H.M. Activation of follicle development: the primordial follicle // Theriogenology. 2001. Vol. 55. P. 1193-1210.

362. Pires P.R., Santos N.P., Adona P.R. et al. Endothelial and inducible nitric oxide synthases in oocytes of cattle // Anim. Reprod. Sci. 2009. Vol. 116. P. 233-243.

363. Poindexter A.N., Buttram V.C., Besch P.K. et al. Prolactin receptors in the ovary // Fértil. Steril. 1979. Vol. 31. P. 273-277.

364. Polanski Z., Ledan E., Brunei S. et al. Cyclin synthesis controls the progression of meiotic maturation in mouse oocytes // Development. 1998. Vol. 125. P. 4989-4997.

365. Porter D.A., Harman R.M., Cowan R.G. et al. Susceptibility of ovarian granulosa cells to apoptosis differs in cells isolated before or after the preovulatory LH surge // Mol. Cell. Endocrinol. 2001. Vol. 176. P. 13-20.

366. Porter D.A., Harman R.M., Cowan R.G. et al. Relationship of Fas li-gand expression and atresia during bovine follicle development // Reproduction. 2001. Vol. 121. P. 561-566.

367. Postel-Vinay M.C., Finidori J. Growth hormone receptor: structure and signal transduction//Eur. J. Endocrinol. 1995. Vol. 133. P. 654-659.

368. Postel-Vinay M.C. Growth hormone- and prolactin-binding proteins: soluble forms of receptors // Horm. Res. 1996. Vol. 45. P. 178-181.

369. Prins G.S., Lee C. Biphasic response of the rat lateral prostate to, increasing levels of serum prolactin // Biol. Reprod. 1983. Vol. 29. P. 938-945. .

370. Przala J.s Grazul A., Wiesak T. et al. Steroid hormones and prolactin in porcine follicular fluid in estrous cycle and early pregnancy // Exp. Clin. Endocrinol. 1985. Vol. 86. P. 291-296.

371. Qazi A.M., Tsai-Morris C.H., Dufau M.L. Ligand-independent homo-and heterodimerization of human prolactin receptor variants: inhibitory action of the short forms by heterodimerization // Mol. Endocrinol. 2006. Vol. 20. P. 19121923.

372. Quesnel H. Nutritional and lactational effects on follicular development in the pig // Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 2009. Vol. 66. P. 121-134.

373. Quirk S.M., Cowan R.G., Harman R.M. et al. Ovarian follicular growth and atresia: the relationship between cell proliferation and survival // J. Anim. Sci. 2004. Vol. 82, E. Suppl. P. 40-52.

374. Quirk S.M., Cowan R.G., Harman R.M. The susceptibility of granulosa cells to apoptosis is influenced by oestradiol and the cell cycle // J. Endocrinol. 2006. Vol. 189. P. 441-453.

375. Racedo S.E., Wrenzycki C., Herrmann D. et al. Effects of follicle size and stages of maturation on mRNA expression in bovine in vitro matured oocytes // Mol. Reprod. Dev. 2008. Vol. 75. P. 17-25.

376. Rak A., Szczepankiewicz D., Gregoraszczuk E.L. Expression of ghrelin receptor, GHSR-la, and its functional role in the porcine ovarian follicles // Growth Horm. IGF Res. 2009. Vol. 19. P. 68-76.

377. Raymond D.R., Wilson L.S., Carter R.L. et al. Numerous distinct PKA-, or EPAC-based, signalling complexes allow selective phosphodiesterase 3 and phosphodiesterase 4 coordination of cell adhesion // Cell. Signal. 2007. Vol. 19. P. 2507-2518.

378. Reis A., Madgwick S., Chang H.Y. et al. Prometaphase APCcdhl activity prevents non-disjunction in mammalian oocytes // Nat. Cell. Biol. 2007. Vol. 9. P. 1192-1198.

379. Revenkova E., Jessberger R. Keeping sister chromatids together: cohe-sins in meiosis // Reproduction. 2005. Vol. 130. P. 783-790.

380. Richard F.J., Sirard M.A. Effect of follicular cells on oocyte maturation. I: Effects of follicular hemisections on bovine oocyte maturation on vitro // Biol. Reprod. 1996. Vol. 54. P. 16-21.

381. Richards J.S., Russell D.L., Robker R.L. et al. Molecular mechanisms of ovulation and luteinization // Mol. Cell. Endocrinol. 1998. Vol. 145. P. 47-54.

382. Rivera G.M., Fortune J.E. Proteolysis of insulin-like growth factor binding proteins -4 and -5 in bovine follicular fluid: implications for ovarian follicular selection and dominance // Endocrinology. 2003. Vol. 144. P. 2977-2987-.

383. Roche J.F. Control and regulation of folliculogenesis a symposium in perspective // Rev. Reprod. 1996. Vol. 1. P. 19-27.

384. Rodgers R.J., Irving-Rodgers H.F. Morphological classification of bovine ovarian follicles // Reproduction. 2010. Vol. 139. P. 309-318.

385. Rolland R., Hammond J.M. Demonstration of a specific receptor for prolactin in porcine granulosa cells // Endocr. Res. Coramun. 1975. Vol. 2. P. 281298.

386. Rose-Hellekant T.A., Bavister B.D. Roles of protein kinase A and C in spontaneous maturation and in forskolin or 3-isobutyl-1 -methylxanthine maintained meiotic arrest of bovine oocytes // Mol. Reprod. Dev. 1996. Vol. 44. P. 241249.

387. Roy S.K., Greenwald G.S. In vitro steroidogenesis by primary to antral follicles in the hamster during the periovulatory period: effects of follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, and prolactin // Biol. Reprod. 1987. Vol. 37. P. 39-46.

388. Roy S.K., Wang S.C., Greenwald G.S. Radioreceptor and autoradiographic analysis of FSH, hCG and prolactin binding sites in primary to antral hamster follicles during the periovulatory period // J. Reprod. Fertil. 1987. Vol. 79. P. 307-313.

389. Roy S.K., Greenwald G.S. In vitro effects of follicle-stimulating hormone, luteinizing hormone, and prolactin on follicular deoxyribonucleic acid synthesis in the hamster // Endocrinology. 1988. Vol. 122. P. 952-958.

390. Rubio Pomar F.J., Roelen B.A., Slot K.A. et al. Role of Fas-mediated apoptosis and follicle-stimulating hormone on the developmental capacity of bovine cumulus oocyte complexes in vitro // Biol. Reprod. 2004. Vol. 71. P. 790-796.

391. Riisse I. Oogenesis in cattle and sheep // Bibl. Anat. 1983. Vol. 24. P. 77-92.

392. Russell D.L., Richards J.S. Differentiation-dependent prolactin responsiveness and stat (signal transducers and activators of transcription) signaling in rat ovarian cells // Mol. Endocrinol. 1999. Vol. 13. P. 2049-2064.

393. Saeki K., Hoshi M., Leibfried-Rutledge M.L. et al. In vitro fertilization and development of bovine oocytes matured in serum-free medium // Biol. Reprod. 1991. Vol. 44. P. 256-260.

394. Sakaguchi K., Ohkubo T., Sugiyama T. et al. Differential regulation ofprolactin receptor mRNA expression in rat liver and kidney by testosterone andioestradiol // J. Endocrinol. 1994. Vol. 143. P. 383-392.

395. Sakal E., Elberg G., Gertler A. Direct evidence that lactogenic hormones induce homodimerization of membrane-anchored prolactin receptor in intact Nb2-11C rat lymphoma cells // FEBS Lett. 1997. Vol. 410. P. 289-292.

396. Sanfins A., Plancha C.E., Overstrom E.W. et al. Meiotic spindle morphogenesis in in vivo and in vitro matured mouse oocytes: insights into the relationship between nuclear and cytoplasmic quality // Hum. Reprod. 2004. Vol. 19. P. 2889-2899.

397. Sarkar M., Schilffarth S., Schams D. et al. The expression of leptin and its receptor during different physiological stages in the bovine ovary // Mol. Reprod. Dev. 2010. Vol. 77. P. 174-181.

398. Sasseville M., Côté N., Guillemette C. et al. New insight into the role of phosphodiesterase 3A in porcine oocyte maturation // BMC Dev. Biol. 2006. Vol. 6. P. 47.

399. Sasseville M., Côté N., Vigneault C. et al. 3'5-cyclic adenosine mono-phosphate-dependent up-regulation of phosphodiesterase type 3A in porcine cumulus cells // Endocrinology. 2007. Vol. 148. P. 1858-1867.

400. Sasseville M., Albuz F.K., Côté N., et al. Characterization of novel phosphodiesterases in the bovine ovarian follicle // Biol. Reprod. 2009. Vol. 81. P. 415-425.

401. Saumande J. Culture of bovine granulosa cells in a chemically defined serum-free medium: the effect of insulin and fibronectin on the response to FSH //

402. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 1991. Vol. 38. P. 189-196.

403. Savio J.D., Boland M.P., Hynes N. et al. Resumption of follicular activity in the early post-partum period of dairy cows // J. Reprod. Fertil. 1990. Vol. 88. P. 569-579.

404. Savio J.D., Boland M.P., Roche J.F. Development of dominant follicles and length of ovarian cycles in post-partum dairy cows // J. Reprod. Fertil. 1990. Vol. 88. P. 581-591.

405. Scatchard G. The attraction of proteins for small molecules and ions // Ann. NY Acad. Sci. 1949. Vol. 51. P. 660-672.

406. Schams D., Berisha B., Kosmann M. et al. Possible role of growth hormone, IGFs, and IGF-binding proteins in the regulation of ovarian function in large farm animal //Domest. Anim. Endocrinol. 1999. Vol. 17. P. 279-285.

407. Schindler C. Cytokine signal transduction // Receptor. 1995. Vol. 5. P. 51-62.

408. Schneiter P., Reymond M.J., Lemarchand-Beraud T. Age-related alterations in prolactin binding sites in the female rat // Acta Endocrinol. 1991. Vol. 124. P. 314-321.

409. Schuetz A.W., Whittingham D.G., Snowden R. Alterations in the cell cycle of mouse cumulus granulosa cells during expansion and mucification in vivo and in vitro // Reprod. Fertil. Dev. 1996. Vol. 8. P. 935-943.

410. Schuler L.A., Nagel R.J., Gao J. et al. Prolactin receptor heterogeneity in bovine fetal and maternal tissues // Endocrinology. 1997. Vol. 138. P. 31873194.

411. Sela-Abramovich S., Chorev E., Galiani D. et al. Mitogen-activated protein kinase mediates luteinizing hormone-induced breakdown of communication and oocyte maturation in rat ovarian follicles // Endocrinology. 2005. Vol. 146. P. 1236-1244.

412. Shao R., Nutu M., Weijdegard B. et al. Differences in prolactin receptor (PRLR) in mouse and human fallopian tubes: evidence for multiple regulatory mechanisms controlling PRLR isoform expression in mice // Biol. Reprod. 2008. Vol. 79. P. 748-757.

413. Shibaya M., Murakami S., Tatsukawa Y. et al. Bovine corpus luteum as an extrapituitary site of prolactin production // Mol. Reprod. Dev. 2006. Vol. 73. P. 512-519.

414. Shimada M., Maeda T., Terada T. Dynamic changes of connexin-43, gap junctional protein, in outer layers of cumulus cells are regulated by PKC and PI 3-kinase during meiotic resumption in porcine oocytes // Biol. Reprod. 2001. Vol. 64. P. 1255-1263.

415. Shimada M., Terada T. Roles of cAMP in regulation of both MAP kinase and p34 (cdc2) kinase activity during meiotic progression, especially beyond the MI stage // Mol. Reprod. Dev. 2002. Vol. 62. P. 124-131.

416. Shimaoka T., Nishimura T., Kano K. Critical effect of pigWeelB on the regulation of meiotic resumption in porcine immature oocytes // Cell Cycle. 2009. Vol. 8. P. 2375-2384.

417. Shirazi A., Shams-Esfandabadi N., Ahmadi E. et al. Effects of growth hormone on nuclear maturation of ovine oocytes and subsequent embryo development // Reprod. Domest. Anim. 2010. Vol. 45. P. 530-536.

418. Shitsukawa K., Andersen C.B., Richard FJ. et al. Cloning and characterization of the cGMP-inhibited phosphodiesterase PDE3A expressed in mouse oocyte //Biol. Reprod. 2001. Vol. 65. P. 188-196.

419. Shu Y.M., Zeng H.T., Ren Z. et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes //Hum. Reprod. 2008. Vol. 23. P. 504-513.

420. Singh J., Adams G.P. Immunohistochemical distribution of follistatin in dominant and subordinate follicles and the corpus luteum of cattle // Biol. Reprod. 1998. Vol. 59. P. 561-570.

421. Sirard M.A., First N.L. In vitro inhibition of oocyte nuclear maturationin the bovine // Biol. Reprod. 1988. Vol. 39. P. 229-234.

422. Sirard M.A., Florman H.M., Leibfried-Rutledge M.L. et al. Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes // Biol. Reprod. 1989. Vol. 40. P. 1257-1263.

423. Sirard M.A. Resumption of meiosis: mechanism involved in meiotic progression and its relation with developmental competence // Theriogenology. 2001. Vol. 55. P. 1241-1254.

424. Sirard M.A., Desrosier S., Assidi A. In vivo and in vitro effects of FSH on oocyte maturation and developmental competence // Theriogenology. 2007. Vol. 68, Suppl. l.P. 71-76.

425. Sirotkin A.V., Nitray J. Effects of prolactin on estrogen, cAMP and oxytocin secretion by porcine granulosa cells in vitro // Reprod. Nutr. Dev. 1994. Vol. 34. P. 141-148.

426. Sirotkin A.V., Nitray J., Skokanova A. et al. Release of a prolactin-like substance by bovine granulosa cells in vitro: effects of ovarian steroids // Ann. Endocrinol. (Paris). 1994. Vol. 55. P. 279-82.

427. Sirotkin A.V., Makarevich A.V. GH regulates secretory activity and apoptosis in cultured bovine granulosa cells through the activation of the cAMP/protein kinase A system // J. Endocrinol. 1999. Vol. 163. P. 317-327.

428. Sirotkin A.V., Rafay J., Kotwica J. et al. Role of ghrelin in regulating rabbit ovarian function and the response to LH and IGF-I // Domest. Anim. Endocrinol. 2009. Vol. 36. P. 162-172.

429. Sirotkin A.V., Meszarosova M. Comparison of effects of leptin and ghrelin on porcine ovarian granulosa cells // Domest. Anim. Endocrinol. 2010. Vol. 39. P. 1-9.

430. Skalhegg B.S., Tasken K. Specificity in the cAMP/PKA signaling pathway. Differential expression, regulation, and subcellular localization of subunits of PKA // Front. Biosci. 2000. Vol. 5. P. 678-693.

431. Slomczynska M., Gregoraszczuk E., Kochman K. et al. Prolactin binding analysis and immunohistochemical localization of prolactin receptor in porcine ovarian cells // Endocr. J. 2001. Vol. 48. P. 71-80.

432. Sole P., Schultz R.M., Motlik J. Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells // Mol. Hum. Reprod. 2010.Vol. 16. P. 654-664.

433. Spicer L.J., Alvarez P., Prado T.M. et al. Effects of intraovarian infusion of insulin-like growth factor-I on ovarian follicular function in cattle // Dom-est. Anim. Endocrinol. 2000. Vol. 18. P. 265-278.

434. Spicer L J. Leptin: a possible metabolic signal affecting reproduction // Domest. Anim. Endocrinol. 2001. Vol. 21. P. 251-270.

435. Spicer L.J., Chamberlain C.S., Maciel S.M. Influence of gonadotropins on insulin- and insulin-like growth factor-I (IGF-I)-induced steroid production by bovine granulosa cells // Domest. Anim. Endocrinol. 2002. Vol. 22. P. 237-254.

436. Stahl N., Yancopoulos G.D. The alphas, betas and kinases of cytokine receptor complexes // Cell. 1993. Vol. 74. P. 587-590.

437. Steegers E.A., Hollanders J.M., Jongsma H.W. Atrial natriuretic peptide and progesterone in ovarian follicular fluid // Gynecol. Obstet. Invest. 1990. Vol. 29. P. 185-187.

438. Su Y.Q., Wigglesworth K., Pendola F.L. et al. Mitogen-activated protein kinase activity in cumulus cells is essential for gonadotropin-induced oocyte meiotic resumption and cumulus expansion in the mouse // Endocrinology. 2002. Vol. 143. P. 2221-2232.

439. Su Y.Q., Denegre J.M., Wigglesworth K. et al. Oocyte-dependent activation of mitogen-activated protein kinase (ERK1/2) in cumulus cells is required for the maturation of the mouse oocyte-cumulus cell complex // Dev. Biol. 2003. Vol. 263. P. 126-138.

440. Subramanian M.G., Sacco A.G., Moghissi K.S. et al. Prolactin size heterogeneity in human follicular fluid: a preliminary study // Int. J. Fertil. 1991. Vol. 36. P. 367-371.

441. Sun L., Haun S., Jones R.C. et al. Kinase-dependent regulation of inositol 1,4,5-trisphosphate-dependent Ca2+ release during oocyte maturation // J. Biol. Chem. 2009. Vol. 284. P. 20184-20196.

442. Sun Q.Y., Miao Y.L., Schatten H. Towards a new understanding on the regulation of mammalian oocyte meiosis resumption // Cell Cycle. 2009. Vol. 8. P. 2741-2747.

443. Sunderland S.J., Crowe M.A., Boland M.P. et al. Selection, dominance and atresia of follicles during the oestrous cycle of heifers // J. Reprod. Fertil. 1994. Vol. 101. P. 547-555.

444. Swaminathan G., Varghese B., Fuchs S.Y. Regulation of prolactin receptor levels and activity in breast cancer // J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 2008. Vol. 13. P. 81-91.

445. Taga T., Kishimoto T. Cytokine receptors and signal, transduction //

446. FASEB J. 1992: Vol. 6. P. 3387-3396.

447. Tajima K., Orisaka M., Hosokawa K. et al. Effects of ovarian theca cells on apoptosis and proliferation of granulosa cells: changes during bovine follicular maturation // Biol. Reprod. 2002. Vol. 66. P. 1635-1639:

448. Talmor-Cohen A., Tomashov-Matar R., Eliyahu E. et al. Are Src family kinases involved in cell cycle resumption in rat eggs? // Reproduction. 2004. Vol. 127. P. 455-463.

449. Tanghe S., Van Soom A., Nauwynck H. et al. Minireview: Functions of the cumulus oophorus during oocyte maturation, ovulation, and fertilization // Mol. Reprod. Dev. 2002. Vol. 61. P. 414-424.

450. Tarkowski A.K. An air-drying method for chromosome preparations from mouse eggs // Cytogenetics. 1966; Vol. 5. P. 394-400;

451. Tatemoto H., Terada T. Activation of p34(cdc2) kinase around the mei-otic resumption in bovine oocytes cultured in vitro // Theriogenology. 1996. Vol. 45. P. 427-437.

452. Terret M.E., Wassmann K., Waizenegger I. et al. The meiosis I-to-meiosis II transition in mouse oocytes requires separase activity // Curr. Biol. 2003. Vol. 13. P. 1797-1802.

453. Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova // J. Reprod. Fertil. 1972. Vol. 30. P. 493-497.

454. ThanThan S., Mekaru C., Seki N. et al. Endogenous ghrelin released in response to endothelin stimulates growth hormone secretion in cattle // Domest. Anim. Endocrinol. 2010. Vol. 38. P. 1-12.

455. Thomas R.E., Armstrong D.T., Gilchrist R.B. Differential effects of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors on bovine oocyte meiotic maturation //Dev. Biol. 2002. Vol. 244. P. 215-225.

456. Tilly J.L. Apoptosis and ovarian function // Rev. Reprod. 1996. Vol. 1. P. 162-172.

457. Tilly J.L. Commuting the death sentence: how oocytes strive to survive // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2001. Vol. 2. P. 838-848.

458. Tornell J., Carlsson B., Billig H. Atrial natriuretic peptide inhibits spontaneous rat oocyte maturation // Endocrinology. 1990. Vol. 126. P. 1504-1508.

459. Tomer H., Kubelka M., Heleil B. et al. Dynamics of meiosis and protein kinase activities in bovine oocytes correlated to prolactin treatment and follicle size // Theriogenology. 2001. Vol. 55. P. 885-899.

460. Torner H., Briissow K.P., Aim H. et al. Mitochondrial aggregation patterns and activity in porcine oocytes and apoptosis in surrounding cumulus cells depends on the stage of pre-ovulatory maturation // Theriogenology. 2004.;Vol. 61. P. 1675-1689.

461. Touyz R.M., Jiang L.3 Sairam M.R. Follicle-stimulating hormone mediated calcium signaling by the alternatively spliced growth factor type I receptor // Biol. Reprod. 2000. Vol. 62. P. 1067-1074.

462. Trott J.F., Hovey R.C., Koduri S. et al. Alternative splicing to exon 11 of human prolactin receptor gene results in multiple isoforms including a secreted prolactin-binding protein // J. Mol. Endocrinol. 2003. Vol. 30. P. 31-47.

463. Trott J.F., Horigan K.C., Gloviczki J.M. et al. Tissue-specific regulation of porcine prolactin receptor expression by estrogen, progesterone, and prolactin // J. Endocrinol. 2009. Vol. 202. P. 153-166.

464. Tsafriri A., Cao X., Vaknin K.M et al. Is meiosis activating sterol

465. MAS) an obligatory mediator of meiotic resumption in mammals // Mol. Cell. Endocrinol. 2002. Vol. 187. P. 197-204.

466. Tsafriri A., Cao X., Ashkenazi H. et al. Resumption of oocyte meiosis in mammals: on models, meiosis activating sterols, steroids and EGF-like factors // Mol Cell Endocrinol. 2005. Vol. 234. P. 37-45.

467. Tsukamura H., Maeda K. Non-metabolic and metabolic factors causing lactational anestrus: rat models uncovering the neuroendocrine mechanism underlying the suckling-induced changes in the mother // Prog. Brain Res. 2001. Vol. 133. P. 187-205.

468. Uhlmann F. The mechanism of sister chromatid cohesion // Exp. Cell Res. 2004. Vol. 296. P. 80-85.

469. Vaccari S., Weeks J.L. 2nd, Hsieh M. et al. Cyclic GMP signaling is involved in the luteinizing hormone-dependent meiotic maturation of mouse oocytes // Biol. Reprod. 2009. Vol. 81. P. 595-604. / .

470. Valdez K.E., Cuneo S.P., Turzillo A.M. Regulation of apoptosis in the atresia of dominant bovine follicles of the first follicular wave following ovulation //Reproduction. 2005. Vol. 130. P. 71-81.

471. Van den Hurk R., Bevers M.M., Beckers J.F. In vivo and in vitro development of preantral follicles // Theriogenology. 1997. Vol. 47. P. 73-82.

472. Van den Hurk R., Zhao J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles // Theriogenology. 2005. Vol. 63. P. 1717-1751.

473. Van Tol H.T., van Eijk M.J., Mummery C.L. et al. Influence of FSH and hCG on the resumption of meiosis of bovine oocytes surrounded by cumulus cells connected to membrana granulosa // Mol. Reprod. Dev. 1996. Vol. 45. P. 218-224.

474. Van Wezel I.L., Rodgers R. J. Morphological characterization of bovine follicles and their environment in vivo // Biol. Reprod. 1996. Vol. 55. P. 10031011.

475. Van Wezel I.L., Dharmarajan A.M., Lavranos T.C. et al. Evidence for alternative pathways of granulosa cell death in healthy and slightly atretic bovine antral follicles //Endocrinology. 1999. Vol. 140. P. 2602-2612.

476. Vanderhyden B.C. Species differences in the regulation of cumulus expansion by an oocyte-secreted factor (s) // J. Reprod. Fértil. 1993. Vol. 98. P. 219227.

477. Vejlsted M., Avery B., Schmidt M. et al. Ultrastructural and immuno-histochemical characterization of the bovine epiblast // Biol. Reprod. 2005. Vol. 72. P. 678-686.

478. Veldhuis J.D., Klase P., Hammond J.M. Divergent effects of prolactin upon steroidogenesis by porcine granulosa cells in vitro: influence of cytodifferen-tiation // Endocrinology. 1980. Vol. 107. P. 42-46.

479. Verlhac M.H., Kubiak J.Z., Clarke H.J. et al. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes//Development. 1994. Vol. 120. P. 1017-1025.

480. Vigil D., Blumenthal D.K., Brown S. et al. Differential effects of substrate on type I and type II PKA holoenzyme dissociation // Biochemistry. 2004. Vol. 43. P. 5629-5636.

481. Visintin R., Prinz S., Amon A. CDC20 and CDH1: a family of substrate-specific activators of APC-dependent proteolysis // Science. 1997. Vol. 278. P. 460-463.

482. Viste K., Kopperud R.K., Christensen A.E. et al. Substrate enhances the sensitivity of type I protein kinase A to cAMP // J. Biol. Chem. 2005. Vol. 280. P. 13279-13284.

483. Vlahos N.P., Bugg E.M., Shamblott M.J. et al. Prolactin receptor geneexpression and immunolocalization of the prolactin receptor in human« luteinized granulosa cells // Mol. Hum. Reprod. 2001. Vol. 7. P. 1033-1038.

484. Vodkova Z., Rajmon R., Petr J. et al. Effects of genistein and genistin on in vitro maturation of pig oocytes // Czech. J. Anim. Sci. 2008. Vol. 53. P. 1-8.

485. Vogt E., Kirsch-Volders M., Parry J. et al. Spindle formation, chromosome segregation and the spindle checkpoint in mammalian oocytes and susceptibility to meiotic error // Mutat. Res. 2008. Vol. 651. P. 14-29.

486. Vozzi C., Formenton A., Chanson A. et al. Involvement of connexin 43 in meiotic maturation of bovine oocytes // Reproduction. 2001. Vol. 122. P. 619628.

487. Wandji S.A., Fortier M.A., Sirard M.A. Differential response to gonadotropins and prostaglandin E2 in ovarian tissue during prenatal and postnatal development in cattle // Biol. Reprod. 1992. Vol. 46. P. 1034-1041.

488. Wandji S.A., Eppig J.J., Fortune J.E. FSH and growth factors affect the growth and endocrine function in vitro of granulosa cells of bovine preantral follicles // Theriogenology. 1996. Vol. 45. P. 817-832.

489. Watches D.C., Taylor V.J., Cheng Z. et al. Follicular growth, corpus luteum function and their effects on embryo development in postpartum dairy cows //Reprod. Suppl. 2003. Vol. 61. P. 219-237.

490. Webb R., Campbell B.K., Garverick H.A. et al. Molecular mechanisms regulating follicular recruitment and selection // J. Reprod. Fertil. Suppl. 1999. Vol. 54. P. 33-48.

491. Webb R., Garnsworthy P.C., Gong J.G. et al. Control of follicular growth: local interactions and nutritional influences // J. Anim. Sci. 2004. Vol. 82, E. Suppl. P. 63-74.

492. Weiss-Messer E., Ber R., Barkey R.J. Prolactin and MA-10 Leydig cell steroidogenesis: biphasic effects of prolactin and signal transduction // Endocrinology. 1996. Vol. 137. P. 5509-5518.

493. Wells J.A., De Vos A.M. Hematopoietic receptor complexes // Annu. Rev. Biochem. 1996. Vol. 65. P. 609-634.

494. Williams G.L., Amstalden M., Garcia M.R. et al. Leptin and its role in the central regulation of reproduction in cattle // Domest. Anim. Endocrinol. 2002. Vol. 23. P. 339-349.

495. Wojtowicz A., Szoltys M. Preovulatory secretion of steroids by cultured cumulus oophorus complexes of the rat: effects of FSH and LH // Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 1998. Vol. 106. P. 500-505.

496. Wook Kim J., Rhoads R.P., Block S.S. et al. Dairy cows experience selective reduction of the hepatic growth hormone receptor during the periparturient period // J. Endocrinol. 2004. Vol. 181. P. 281-290.

497. Wu X.Q., Zhang X., Li X.H. et al. Translocation of classical-PKC andcortical granule exocytosis of human oocyte in germinal vesicle and metaphase II stage // Acta Pharmacol. Sin. 2006. Vol. 27. P. 1353-1358.

498. Xie Y.L., Hassan S.A., Qazi A.M. et al. Intramolecular disulfide bonds of the prolactin receptor short form are required for its inhibitory action on the function of the long form of the receptor // Mol. Cell. Biol. 2009. Vol. 29. P. 25462555.

499. Yamagata Y., Nakamura Y., Sugino N. et al. Alterations in nitrate/nitrite and nitric oxide synthase in preovulatory follicles in gonadotropin-primed immature rat // Endocr. J. 2002. Vol. 49. P. 219-226.

500. Yamashita Y., Shimada M., Okazaki T. et al. Production of progesterone from de novo-synthesized cholesterol in cumulus cells and its physiological role during meiotic resumption of porcine oocytes // Biol. Reprod. 2003. Vol. 68. P. 1193-1198.

501. Yamashita Y., Nishibori M., Terada T. et al. Gonadotropin-rinduced deltal4-reductase and delta7-reductase gene expression in cumulus cells during meiotic resumption of porcine oocytes // Endocrinology. 2005. Vol. 146. P. 186194.

502. Yamoto M., Nakano R. Effect of oestrogen on prolactin receptors in poricine granulosa cells //Exp. Clin. Endocrinol. 1986. Vol. 88. P. 45-49.

503. Yang P., Roy S.K. A novel mechanism of FSH regulation of DNA synthesis in the granulosa cells of hamster preantral follicles: involvement of a protein kinase C-mediated MAP kinase 3/1 self-activation loop // Biol. Reprod. 2006. Vol. 75. P. 149-157.

504. Yang M.Y, Fortune J.E. The capacity of primordial follicles in fetal bovine ovaries to initiate growth in vitro develops during mid-gestation and is associated with meiotic arrest of oocyte // Biol. Reprod. 2008. Vol. 78. P. 1153-1161.

505. Yokoo M., Sato E. Cumulus-oocyte complex interactions during oocyte maturation // Int. Rev. Cytol. 2004. Vol. 235. P. 251-291.

506. Yong E.L., Baird D.T., Hillier S.G. Mediation of gonadotrophin-stimulated growth and differentiation of human granulosa cells by adenosine-3',5'-monophosphate: one molecule, two messages // Clin. Endocrinol. (Oxf). 1992. Vol.37. P. 51-58.

507. Yoshimura Y., Hosoi Y., Iritani A. et al. Developmental potential of rabbit oocyte matured in vitro: the possible contribution of prolactin // Biol. Reprod. 1989. Vol. 41. P. 26-33.

508. Yoshimura Y., Nakamura Y., Oda T. et al. Induction of meiotic maturation of follicle-enclosed oocytes of rabbits by a transient increase followed by an abrupt decrease in cyclic AMP concentration // J. Reprod. Fertil. 1992. Vol. 95. P. 803-812.

509. Young K.H., Bazer F.W. Porcine endometrial prolactin receptors detected by homologous radioreceptor assay // Mol. Cell. Endocrinol. 1989. Vol. 64. P. 145-154.

510. Yu H. Regulation of APC-Cdc20 by the spindle checkpoint // Curr. Opin. Cell Biol. 2002. Vol. 14. P. 706-714.

511. Yuan Y.Q., Van Soom A., Leroy J.L. et al. Apoptosis in cumulus cells, but not in oocytes, may influence bovine embryonic developmental competence // Theriogenology. 2005. Vol. 63. P. 2147-2163.

512. Zhang M., Tao Y., Zhou B. et al. Atrial natriuretic peptide inhibits the actions of FSH and forskolin in meiotic maturation of pig oocytes via different signalling pathways // J. Mol. Endocrinol. 2005. Vol. 34. P. 459-472.

513. Zhang H., Li Q., Lin H. et al. Role of PPARgamma and its gonado-trophic regulation in rat ovarian granulosa cells in vitro // Neuro Endocrinol. Lett. 2007. Vol. 28. P. 289-294.

514. Zhang Y., Zhang Z., Xu X.Y. et al. Protein kinase A modulates Cdc25B activity during meiotic resumption of mouse oocytes // Dev. Dyn. 2008. Vol. 237. P. 3777-3786.

515. Zhang M., Ouyang H., Xia G. The signal pathway of gonadotrophins-induced mammalian oocyte meiotic resumption // Mol. Hum. Reprod. 2009. Vol. 15. P. 399-409.

516. Zheng K.G., Meng X.Q., Yang Y. et al. Requirements of Src family kinase during meiotic maturation in mouse oocyte // Mol. Reprod. Dev. 2007. Vol. 74. P. 125-130.

517. Zhuang S., Lynch M.C., Kochevar I.E. Activation of protein kinase C is required for protection of cells against apoptosis induced by singlet oxygen / FEBS Lett. 1998. Vol. 437. P. 158-162.1. БЛАГОДАРНОСТЬ