Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Бутылин, Павел Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

003463927

Бутылки Павел Андреевич

Роль кондеисина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей БассИаготусеБ сегечтае

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2009

003463927

Работа выполнена в Институте цитологии РАН и Национальных Институтах Здоровья, Бетезда, (США).

Научные руководители: академик

Никольский Николай Николаевич Институт цитологии РАН

кандидат биологических наук Струнников Александр Владимирович

Национальные Институты Здоровья Бетезда, США

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Подгорная Ольга Игоревна Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Родионов Александр Викеитьевич Ботанический институт РАН

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский государственный

университет,

Биолого-почвенный факультет.

Защита состоится «марта 2009 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д. 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4. Факс: (812) 297-03-41 http://www.cytspb.rssi.ru, етаП:се11Ью@таП.cytspb.rssi.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан « февраля 2009 года

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Стабильность генома и передача генетического материала из поколения в поколение гарантируются точностью расхождения хромосом в митозе. Сегрегация хромосом в процессе клеточного деления требует от эукариотической клетки слаженной работы комплекса ассоциированныых с хроматином структурных белков и энзимов. Одним из этих белковых факторов является конденсин молекулярная «машина» конденсации хромосом (Losada, Hirano, 2005). У позвоночных обнаружены два конденсиновых комплекса (конденсин I и конденсин II), различающиеся динамикой экспрессии и хромосомной локализацией (Hirano, 2006). У пекарсках дрожжей Saccharomyces cerevisiae выявлен только один конденсин, состоящий из пяти жизненно важных субъединиц, две из которых, Smc2 и Smc4, относятся к белкам SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) и содержат участок связывания АТФ, а три - это вспомогательные субъединицы Brnl, Ycs4 и Ycs5. Все компоненты комплекса -высококонсервативные белки, мутации в хотя бы одной из субъединиц приводят к нарушению разделения хроматина при делении клетки (Freeman et al., 2000). Сходные фенотипы нерасхождения хроматид в митозе при инактивации конденсина описаны и у высших эукариот (Saka et al., 1994; Gerlich et al., 2006). Основной функцией конденсина in vivo является не столько компактизация хроматина, сколько разделение хроматид в ходе митотической сегрегации. Кроме того конденсин принимает участие в регуляции экспрессии генов, которые сохраняют активность в митозе (Xing et al., 2008).

У позвоночных конденсины, которые диффузно распределены в цитоплазме (конденсин I) или в ядре (конденсин II) в интерфазе, в митозе перераспределяются во внутренние домены конденсированных хромосом (Swedlow and Hirano, 2003; Maeshima et al., 2005). У 5. cerevisiae конденсин в интерфазе диффузно распределён в цитоплазме, а в митозе его основным участком связывания является рибосомная ДНК (Freeman et al., 2000).

Рибосомная ДНК (рДНК, ядрышковый организатор) S. cerevisiae состоит примерно из 150 повторов, которые располагаются на правом плече XII хромосомы. Каждый повтор рибосомной ДНК содержит ген, кодирующий 35S рРНК, транскрибируемый РНК полимеразой первого типа (Pol I), а также ген, транскрибируемый РНК полимеразой третьего типа (Pol III), кодирующий 5S рРНК (Shaw et al., 2005). Эти гены разделены двумя нетраскрибируемыми (спейсерными) участками (Рис. 6А). В предыдущих исследованиях было показано, что на рибосомной ДНК находится 4 участка, с которыми связывается конденсин, два из которых приходятся на участок, транскрибируемый Pol I (Wang et al., 2004). Около половины повторов рДНК являются транскрипционно активными, при этом число генов рДНК остается стабильным из поколения в поколение (Damman et al., 1993), а регуляция уровня рРНК у клеток, находящихся в разных фазах роста, осуществляется путём модуляции

транскрипции «активных» повторов (French et. al., 2003). Роль «молчащих» повторов рДНК остаётся неизвестной.

Инактивация конденсина в клетках S. cerevisiae приводит к тому, что преобладающая часть клеток останавливается в митофазе митоза, при этом сохраняя высокую жизнеспособность; часть клеток, которые входят в анафазу, содержат признаки неправильной сегрегации хромосом. Дефекты сегрегации наиболее ярко выражены для хромосомы XII, несущей гены ядрышкового организатора. Частота нерасхождений этой хромосомы в 2-3 раза выше, чем других хромосом (Yong-Gonzalez et al., 2007). Какие особенности организации и функционирования ядрышка обуславливают тот факт, что сегрегация именно этого локуса является особенно зависимой от конденсина? Этот вопрос, а также молекулярная природа взаимодействия конденсина и района ядрышкового организатора являются предметом настоящей работы.

Высокая пластичность дрожжевого генома предоставляет возможность исследовать анатомию взаимодействия конденсина и субдоменов рДНК. Для исследования функционального взаимодействия хроматина ядрышка с конденсином в митозе мы использовали штамм с эписомной локализацией рДНК, в котором хромосомный локус рДНК (тандемные повторы) был заменён многокопийной плазмидой, несущей одиночный повтор рДНК (Wai et al., 2000). Использование данной модели, сверх ожидания, позволило впервые показать роль ядрышка в регуляции процесса сегрегации всего генома в митозе.

Цели и задачи

Целью настоящего исследования является изучение роли конденсина в обеспечении митотической стабильности хроматина на примере хромосомного локуса ядрышкового организатора. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:

1. Определить, как влияет перераспределение рибосомной ДНК, основного сайта связывания конденсина в митозе, из хромосомы в эписому на сегрегацию хромосом и поддержание стабильности генома.

2. Исследовать влияние транскрипционной активности Pol I на взаимодействие конденсина с рДНК и выяснить роль функционального взаимодействия конденсина и транскрипции при сегрегации ядрышка в митозе.

3. Оценить функциональную роль хромосомных сайтов связывания конденсина (вне рДНК) в поддержании высокой митотической стабильности хромосом и минихромосом.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Тандемный характер повторов рДНК необходим для точного контроля динамики анафазы и обеспечения правильной сегрегации хромосом в митозе.

2. Конденсин взаимодействует с «молчащими» повторами рДНК, не транскрибируемыми РНК полимеразой I типа, и обеспечивает митотическую

сегрегацию повторов рДНК, активно транскрибируемых РНК-полимеразой первого типа.

3. Функции индивидуальных участков связывания конденсина в геноме в обеспечении стабильности хромосом в митозе гетерогенны.

Научная новизна работы

Впервые получены данные о влиянии строения локуса ядрышкового организатора на динамику клеточного цикла дрожжей S. cerevisiae. Детальный анализ штамма с эписомной рДНК позволил выявить высокую чувствительность штамма к факторам, приводящим к митотической задержке разделения хромосом - митотическому чекпоинту (mitotic checkpoint, spindle assembly checkpoint). Анализ стабильности хромосом на примере потери хромосомы III выявил отчетливое синергическое взаимодействие мутации конденсина и эписомного строения рДНК. Применение метода микроскопии в реальном времени позволило оценить динамику прохождения фаз митоза. В результате удалось обнаружить укорочение анафазы у штамма с эписомной рДНК по сравнению со штаммом, содержащим рДНК дикого типа. Таким образом, тандемное строение рДНК оказывается важным для поддержания оптимальной длительности митоза, что необходимо для обеспечения генетического гомеостаза, вероятно посредством поддержания способности клетки к коррекции ошибок расхождения хромосом.

Метод оценки потери минихромосом, использованный в модификации, дающей возможность оценить вклад мутации конденсина, позволил связать уровень транскрипции под действием Pol I и конденсин-зависимую стабильность наследования рДНК в митозе. Эти данные, дополненные экспериментами in vivo, что подтвердили связь между транскрипцией и функционированием конденсина в геноме, позволили нам выдвинуть и обосновать модель связывания конденсина с рДНК. Согласно этой модели конденсин преимущественно связывается с молчащими повторами рДНК, что необходимо для сегрегации соседних активно транскрибируемых повторов.

Теоретическое и практическое значение работы

Исследование дрожжей S. cerevisiae с отличным от дикого типа строением рДНК открывает возможность изучения связи геномной организации с одной из основных жизненных функций клетки - биосинтезом рибосом. Использование штамма с эписомной рДНК, как модели внехромосомной организации ядрышка, безусловно, является перспективным для изучения деталей функционирования рДНК. Таким образом, полученные данные будут иметь большое значение для изучения роли физиологии ядрышкового организатора и стабильности генома.

Теоретические результаты работы используются в курсе «Структура и функция хроматина» для магистров СПбГУ, а также могут быть использованы в учебных спецкурсах по клеточной биологии, читаемых на биолого-медицинских факультетах высших учебных заведений.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 1 тезисное сообщение, представленное на: 46th meeting of American Society for cell biology (San Diego, USA, 2006); NICHD retreat, (Bethesda, USA, 2007); на семинаре Laboratory of gene regulation and development, NIH/NICHD, (Bethesda, USA, 2007). Диссертация апробирована на научном семинаре отдела внутриклеточной сигнализации и транспорта, (ИНЦ РАН, Санкт-Петербург, 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста и иллюстрирована 16 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы. Характеристики штаммов дрожжей S. cerevisiae, использованных в работе, приведены в табл. 1. В работе были использованы штаммы бактерии Escherichia coli XL1- Blue (Sambrook et al., 1989).

Таблица 1. Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе.

Штамм Генотип

W303 MATa leu2-3,112 trpl-1 canl-100 ura3-l ade2-l his3-ll,15 \phi*]

W303-733 MATa 112 trpl-1 canl-100 игаЗ-l ade2-l his3-ll,15 [phf] smc2-8::LEU2

W303-Sikl-RFP, Tubl-GFP MATa 112 trpl-1 canl-100 ura3-l ade2-l his3-ll,15 fpht] sikl-mRFP::KANX, tubl-GFP::URA3

W303-sikl ,Smc4-GFP, cdcl5-2 MATa 112 trpl-1 canl-100 ura3-l ade2-l his3-ll,15 [phi*] smc2-8::LEU2, sikl-mRFP::KANX, smc4-GFP::URA3, cdcl5-l

W303-733, Sikl-RFP,Hhf2-GFP MATa 112 trpl-1 canl-100 ura3-l ade2-l his3-ll,15 [phf] smc2-8::LEU2, sikl-mRFP::KANX, hhf2-GFP::URA3

W303-733, Sikl-RFP,Hhf2-GFP,Amad2 MATa 112 trpl-1 canl-100 ura3-l ade2-l his3-ll,15 [phi+] smc2-8::LEU2, sikl-mRFP::KANX ,hhf2-GFP::URA, Amad2::TRPl

891-smc4-GFP MATa ade2-l ura3-I Íeu2-3,112 his3-3 canl-100 rdnl-AA::HIS3 SMC2:12His:3HA::1еи2-Ж::ADE2 Glu+ SIKl:mRFP::kanMX /(TRP1 pGAL:rDNA) /TRP1 Ieu2-d

YP377 MATa trpl ade2-l canl-100 his3-ll,15 ura3-l rdn-A PCH2-HA smc2-8::LEU2 sikl:RFP::KANMX/TRPl rDNA

YP377-Sikl-RFP,Tubl-GFP MATa trpl ade2-l canl-100 his3-ll,15 ura3-l rdn-A PCH2-HA smc2-8::LEU2 sikl:RFP::KANMX/TRPl rDNA, tubl-GFP::URA3

YP377-733 MATa trpl ade2-I canl-100 his3-ll,15 wa3-l rdn-A PCH2-HA smc2-8::LEU2 JTRP1 rDNA, tubl-GFP::URA3

377-733 Sikl-RFP,Hhf2-GFP MATa trpl ade2-l canl-100 his3-ll,15 ura3-l rdn-A PCH2-HA smc2-8::LEU2 / TRP1-RDN leu2-d, sikl:RFP::KANMX, hhfl-GFP::URA3/ TUPI rDNA

YPH925 / pCM23-3a -lrDNA MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trpl-63 his3-200 leu2-l cyh2R karl-15 /URA3-RDN (one сору)

YPH925 / pCM23-9a-2rDNA MATa ura3-52 iys2-801 ade2-l01 trpl-63 his3-200 leu2-l cyh2R karl-15 /URA3-RDN (double copy)

MATa tester MATa his5

Плазмиды. Были использованы коммерческие плазмиды серии pRS (Sikorsky and Hieter, 1989). Плазмиды, предоставленные авторами и полученные в ходе работы, перечислены в табл. 2. Таблица 2. Плазмиды, использованные в работе.

Название плазмиды/ 1 характеристика Белок/локус Тип/Маркер

j pAS-1497 j Siklp-mRFP KANX j

j pLF 640 ; Smc4p-GFP URA3

! pAS733 : Smc2-8 LEU2

1 HHF2-GFP: Leu/Гистон H4- GFP : Hhfip-GFP LEU2

; TUB2-GFP: Альфа тубулин-GFP : Tublp-GFP 2u/URA3

минихромосомы:

! pBW1065AVT моно рДНК \VT рДНК CEN/URA3

! pAS 1072/ рДНК дел. пром. Pol I : делеция промотора 35S рДНК j CEN/URA3

j P416-spe/pflHKGAL7p-35S \ Моно pflHK:GAL7p-35S CEN/TRP1 j

! рСМЗа/Одиночный повтор рДНК; Моно-рДНК (от D.Koshland) CEN/URA3

рСМ9а/два повтора рДНК ! Ди-рДНК (от D.Koshland)) CEN/URA3 \

; Геномные участки связывания | конденсина в векторе pRS412 ; Локусы: Ykr049c, Ygr210с, Yol085c, Rad5, ARP9, Yap5, PTR2, фланкированные геномными ¡последовательностями 500 п.н. CEN/ADE2

Среды и условия культивирования.

Для культивирования дрожжей использовали стандартные дрожжевые среды: либо полную среду YPD, либо синтетические среды (Rose et al., 1990). Для экспрессии конструкций, находящихся под контролем индуцибельного промотора GAL7, в культуральной среде 2%-ный раствор глюкозы заменяли на смесь 2%-ного раствора раффинозы и 1%-ного раствора галактозы. Для теста на чувствительность к нокодазолу в синтетическую культуральную среду добавляли нокодазол в концентрации 5 или 10 мкг/мл. Для культивирования бактерий использовали жидкую и агаризованную среды LB с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) (Sambrook et al., 1989). Дрожжевые штаммы культивировали при температурах от 23°С до 37 °С, штаммы бактерий при 37 °С. Рапамицин (rapamycin, Sigma, USA) добавляли в культуральную среду в концентрации 200 нг/мл, а циклогексимид (cycloheximide, Sigma, USA) - в концентрации 100 мкг/мл.

Молекулярно-биологические и биохимические методы.

В работе использовали стандартные методы генной инженерии. Трансформацию дрожжей проводили по стандартной методике с использованием ацетата лития (Rose et al., 1990). Выделение плазмидной ДНК из дрожжей S. cerevisiae проводили по стандартной методике (Rose et al., 1990).

Изготовление экстракта дрожжевых клеток, так же как электрофорез в полиакриламидном геле, последующий переносна синтетическую мембрану и иммуноблоттинг проводили, как описано ранее (Burke et al., 2000).

Делецию MAD2 производили так как описано ранее, используя специфические праймеры (Yong-Gonzales et al., 2007). Количественную ПЦР и реакцию обратной транскрипции проводили, как описано ранее с использованием специфических праймеров к транскрибируемым и нетранскрибируемым последовательностям рДНК (Wang et al., 2006).

Иммуноблоттинг осуществляли с использованием первичных моноклональных антител к белкам Cdc28p, Clb2p («Santa-Cruz», США) и вторичных моноклональных антител к иммуноглобулинам мыши или кролика, конъюгированными с пероксидазой хрена («Bio-Rad», США). Связывание антител выявляли методом хемилюминесценции с использованием наборов реактивов «ECL» («GE-Healthcare», США), согласно инструкции производителя.

Тест на стабильность хромосомы III.

Тест на стабильность хромосомы III проводили как описано (Runge et al., 1991). Принцип метода: штаммы содержали либо рДНК дикого тип, либо эписомную рДНК, а также температуро-чувствительную мутантную аллель конденсина (smc2-8) в гомозиготном либо в гетерозиготном состоянии. Мутация smc2-8 является рецессивной. Исследуемые штаммы инкубировали в течение 3 ч при непермиссивной для мутации конденсина температуре (37 °С), после этого штаммы доращивали при температуре 23 °С в течение 24 ч. Затем штаммы скрещивали с тестерным штаммом, перепечатывали на новую среду и выращивали еще 24 ч при 23 °С на полной среде YPD. Далее культуру клеток перепечатывали на среду, на которой могли расти только штаммы, успешно прошедшие конъюгацию. Чашки Петри с данной культурой выращивали в течение 2 сут при 23 °С, и после этого фотографировали.

Тест на потерю минихромосом.

Тест на потерю минихромосом проводили так же, как описано ранее (Surosky et al., 1986; Struimikov et. al., 1993), с незначительными изменениями. Штаммы, трансформированные соответствующей плазмидой, выращивали в синтетической селективной (без аденина) жидкой среде, содержащей в качестве источника углерода 2%-ный раствор D-Глюкозы, при 23 °С, до оптической плотности OD600, равной примерно 0.5. Затем клетки инкубировали при температуре 37 °С в течение 3 ч. Непосредственно после этого культуру клеток разбавляли стерильной водой и наносили на чашки Петри с полной агаризованной средой (YPD), обогащенной аденином (плотность не более 200 клеток на чашку). Колонии доращивали до диаметра около 1 мм при 23 °С, после этого делали отпечатки колоний на чашки Петри с селективной средой. Стабильность плазмиды Р(ст) определяли по формуле: P(ct)=(1-Y/X)*100 %, где Y - количество колоний на селективной среде, X - количество колоний на полной среде.

Для каждого индивидуального эксперимента было сделано не менее 5 повторностей. Статистическую обработку проводили с использованием средств программы Microsoft Excel. t-критерий Стьюдента вычисляли для однопараметрического распределения, уровень значимости считали равным 0.05.

Микроскопия.

Клетки с витальной флуоресцентной меткой (GFP - Green Fluorescent Protein или RFP - Red Fluorescent Protein), культуры которых находились в экспоненциальной фазе роста, концентрировали кратковременным центрифугированием при 2000g, фиксировали раствором 5%-ного формальдегида в течение 5 мин и помещали под покровное стекло. Для наблюдения использовали микроскоп Carl Zeiss Axiovert (Carl Zeiss Microimaging, Inc., Германия), с объективом Iris lOOx/1.4.

Флуоресценцию наблюдали, используя комплект фильтров «GFP» и «Rodamin» (Carl Zeiss Microimaging, Inc.).

Микроскопия живых клеток в реальном времени.

Для анализа динамики клеточного цикла использовали систему детекции на основе микроскопа Perkin Elmer Spining Disc Ultra View ERS. Для анализа и деконволюции полученных изображений, а также для видеобработки использовали программу Volocity 3.7 (Improvision, UK).

Для наблюдения культуру клеток, постоянно находившуюся в экспоненциальной фазе в течение последних 2 сут, концентрировали кратковременным центрифугированием и помещали в камеру для наблюдения. Камера для прижизненных наблюдений представляла собой подложку из раствора 10% желатина в YPD, на которую помещали клетки, закрывали покровным стеклом и заклеивали его смесью ланолина и парафина. Ланолин/парафин обеспечивал газообмен, а желатин минимизировал колебания клеток в пространстве.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Значение ядрышкового организатора в контроле продолжительности и динамики анафазы дрожжей.

1.1. Характеристика штамма с эписомной рДНК.

В работе использован штамм с делецией хромосомного локуса рДНК, а эписомная рДНК представлена многокопийной плазмидой с рДНК (Wai et al., 2000). Каждая плазмида содержала сайт инициации репликации 2-микронной плазмиды (2ц) и один повтор рДНК длиной 9.1 т.п.н. (рис. 1). У штамма дикого типа количество рДНК стабильно поддерживается на постоянном уровне около 150 копий. В штамме с эписомной рДНК количество копий составляет примерно 60 на клетку, что достаточно для обеспечения синтеза рибосом (Wang et al., 2006).

Рибосомная ДНК является основным участком связывания конденсина в геноме пекарских дрожжей, особенно хорошо это заметно в метафазе митоза,

когда конденсин накапливается в ядрышке (Freeman et al., 2000). Вместе с тем, было показано, что в штаммах, где хромосомная рДНК делетирована и замещена эписомной рДНК (ЭрДНК), а одна из субъединиц конденсина помечена GFP, конденсин не имеет чёткой ядрышковой локализации в метафазном ядре, но расположен диффузно.

трднк эрднк

хромосома XII рДНК~1 нпн п.н. ф Моно рДНК содержащая 2ц плав ми да

Рисунок 1. Схема строения хромосомы XII штамма с рДНК дикого тина (WT рДНК) и эписомной рДНК (ЭрДНК).

У ЭрДНК штамма хромосомный локус, кодирующий рДНК, делегирован и синтез рРНК поддерживается мультикопийными плазмидами, каждая из которых содержит двухмикронный репликатор и одиночный повтор рДНК.

1.2. Штаммы с эписомной рДНК имеют высокий уровень генетической нестабильности.

Штаммы с ЭрДНК потенциально предоставляют возможность изучать биологическую роль конденсина вне зависимости от его специфической роли в сегрегации рДНК, что более приближено к системам высших эукариот. Однако известно, что конденсин перераспределяется с рДНК в штамме ЭрДНК (Wang et al., 2004). Необходимо было проверить, каким образом перераспределение конденсина отражается на стабильности хромосом, не содержащих рДНК. Для количественной оценки уровня стабильности генома в таких клетках мы применили генетический тест на потерю хромосомы III. На этой хромосоме у дрожжей расположен локус МАТ, отвечающий за определение типа спаривания. В присутствии двух копий хромосомы III диплоидные дрожжи не вступают в конъюгацию с тестерным гаплоидным штаммом. В случае же потери одной из копий этого локуса, вызванной потерей гомологичной хромосомы, дрожжи способны к скрещиванию со штаммом-определителем типа спаривания. Коньюганты можно обнаружить по их способности к росту на селективной среде (рис. 2А).

У дрожжей отсутствие одной из гомологичных хромосом не приводит к быстрой гибели клетки, так как экспрессии необходимых генов за счёт второй хромосомы достаточно. Поэтому диплоидные клетки, потерявшие одну из копий хромосомы III, способны делиться и коньюгировать со штаммом другого типа спаривания. Мутация конденсина smc2-8, как известно из предыдущих работ

(Yong-Gonzalez et al., 2007), не приводит к быстрой гибели клеток и может быть обратима при возврате в пермиссивные условия. На инактивацию мутантного гена smc2-8 при повышении температуры до 37°С клетки отвечают торможением в метафазе митоза, что является, вероятно, защитным механизмом от возможных хромосомных аберраций в анафазе. При понижении температуры до 23 °С клетки smc2-8 возвращаются к делению и обычно успешно заканчивают разделение хромосом без значительной потери хромосомы III (рис. 2Б). Однако в ЭрДНК штамме мы наблюдали аномально высокий уровень потери хромосомы III в присутствии мутации smc2-8 (рис. 2Б).

ЗрДМ» SMC2I ЭрДНК SMC2

ЗДЩ ®гш2-8

т рдн* *пх>т

щдык ттОЩ

ЭрДМК sreo2-t

ЖрДНа ШЖШ %Йр#Ш ШС2

Д. хромосома III

3 часа 37°С

Одна из хромосом утеряна

скрещивание с теетерным штаммом

Рост на еелекгивной среде

Рисунок 2. (А) Схема теста на потерю хромосомы III. Диплоидные клетки, содержащие два гомолога хромосомы III, не способны к скрещиванию. При потере одной из копий хромосомы III они приобретают способность коньюгировать с теетерным штаммом и расти на селективной среде. (Б) Выявление скрещивания на селективной среде. В тесте использовали диплоидные штаммы, генотип которых приведён в колонке слева. Обозначения штаммов ЭрДНК и WT рДНК такие же, как и на рис. 1. Справа представлен результат скрещивания после выращивания на селективной среде.

Вероятность потери при делении клетки близка для всех хромосом (Runge et al., 1991). Таким образом, высокий уровень потери одной из самых коротких хромосом (III) говорит об общем высоком уровне нестабильности хромосом в ЭрДНК штамме. Следовательно, изменение локализации рДНК (с хромосомного локуса на эписому) заметно сказывается на общей стабильности дрожжевого генома в присутствии мутации конденсина, что открывает новый биологический феномен.

1.3. Отсутствие хросомного локуса рДНК повышает уровень успешной сегрегации ядрышка в мутантах втс2-8.

Инактивация конденсина в клетках зтс2-8 с нормальной рДНК приводит к тому, что часть клеток неспособна к равномерному распределению ядрышкового материала в дочерние клетки. В результате этого одна из клеток не получает материала ядрышка (рис. 3). При инактивации конденсина в случае ЭрДНК доля клеток, в которых происходит неравное расхождение ядрышка, гораздо меньше, чем в штамме с рДНК дикого типа (рис 3). Следовательно, расхождение хроматид в случае одиночной рДНК не столь сильно зависит от активности конденсина, как сегрегация нативного хромосомного локуса рДНК. При этом количество клеток, заблокированных в анафазе (клетки с неразошедшися ядрышком), практически не изменилось у штамма с ЭрДНК по сравнению со штаммом с нормальной рДНК. Это говорит о том, что активация митотического чекпоинта не была нарушена в этих клетках. Таким образом, механизм нестабильности генома в штамме с ЭрДНК не сопряжен с затруднённой сегрегацией рДНК.

Рисунок 3. Анафазлые клетки в штамме с мутацией smc2-8 при 37 °С

Показано распределение анафазных клеток по статусу расхождения ядрышка при инактивации конденсина. доля клеток оценивалась под микроскопом по расположению специфических флуоресцентных маркеров хроматина и ядрышка. Для каждого штамма было посчитано более 200 клеток. 1.4. Возможный механизм нестабильности генома в штамме с ЭрДНК: повышенная чувствительность к функциональности митотического веретена и кинетохора.

Для того чтобы проверить, насколько обнаруженный эффект нестабильности генома связан с мутацией конденсина, мы провели тест на чувствительность штамма к нокодазолу - агенту, препятствующему образованию веретена деления и, соответственно, активации митотического чекпоинта (spindle checkpoint). Мы провели тест на чувствительность к нокодазолу штамма с эписомной рДНК и штамма, содержащего рДНК дикого типа, с помощью метода последовательных разведений. В этом тесте равное количество клеток последовательно разводили 1:5 стерильной водой и высевали на чашки, содержащие нокодазол в концентрации 5 либо 10 мкг/мл, а также на среду YPD, не содержащую нокодазола. Далее чашки с посеянными дрожжами оставляли расти в течение 96 ч при температуре 23 °С.

1 ■ ■ I

■

ЯШ ■■■ ■

wt рДНК smc2-8

ЭрДНК smc2-8

3 нераснождение ядрышка

□ неравное расхождение ядрышка

€¿3

■ расхождение ядрышка

(Sy<fm)

MhM*WP dNromali» Sikl^fP-midedtt»

YPD Нокодазол 5 мкг/мл

Нокодазол 10 мкг/мл

Ш РДНК WtpflHK

эрднк

зрднк ■■■■■ Ш

Рисунок 4. Тест на чувствительность к нокодазолу.

Результат роста штаммов с различной рДНК на агаризованной среде либо полной (YPD), либо синтетической с добавлением нокодазола. Разведение клеток составляет (справа -налево, кратность разведения) 5Х, 25Х, 125Х, 625Х, 3125Х, 15625Х. На все чашки Петри наносили одинаковое количество клеток. Показан результат роста колоний через 96 час.

Тест проводили при температуре 23 °С чтобы избежать различий в скорости роста, которые могут быть вызваны различным уровнем рРНК в клетках штаммов с ЭрДНК и хромосомной рДНК. Несмотря на то, что предыдущие исследования не выявили разницы в скорости роста у этих штаммов (Oakes et al., 1998), штамм с ЭрДНК демонстрировал в несколько раз более высокую чувствительность к нокодазолу, по сравнению со штаммом с рДНК дикого типа (рис. 4). Повышенная чувствительность к нокодазолу ЭрДНК штамма свидетельствует о том, что даже при наличии конденсина дикого типа клетки испытывают трудности с успешным завершением митоза в присутствии фактора, негативно влияющего на митотический аппарат клетки.

Эти данные, вероятно, говорят о том, что в штамме с ЭрДНК снижен уровень контроля ошибок расхождения хроматина при активации митотического чекпоинта, хотя сам механизм блокировки клеточного цикла остаётся интактным (рис. 3). Следовательно, возможную природу сверхчувствительности к нокодазолу следует искать в процессе расхождения хроматид в анафазе митоза.

1.5. Анализ динамики митоза (анафаза и телофаза) в штаммах с различной структурой рДНК.

Одна из причин, по которым клетка с ЭрДНК может быть сверхчувствительна к митотическим ингибиторам и иметь высокий уровень потери хромосом - это прежде неизвестный контроль динамики митоза нативным хромосомным локусом рДНК. Для того чтобы изучать динамику деления в клетках дрожжей, мы воспользовались системой мечения одного из двух генов, кодирующих тубулин - TUB1, с помощью GFP. Мы использовали также маркер ядрышка, белок Siklp, соединённый с красным флуоресцентным белком mRFP. У S. cerevisiae разделение ядрышка является завершающим этапом разделения хромосом в митозе (Freeman et al., 2000) и, таким образом, является надёжным маркером окончания анафазы.

Наблюдения за клетками, содержащими меченый тубулин и маркер ядрышка, производили с помощью системы автоматизированной прижизненной

микроскопии. Система была снабжена камерой с контролем показателей окружающей среды, что позволяло поддерживать постоянной температуру (23°С) на всем протяжении съемки и избежать флуктуаций в скорости роста. Полученные результаты монтировали в видеофайл, анализ которого позволял определить временные показатели изменения веретена деления.

Быстрая фаза удлинения веретена является признаком начала анафазы у дрожжей. Разборка веретена деления соответствует концу телофазы и непосредственно предшествует цитокинезу (рис. 5А). Таким образом, отрезок времени от начала фазы быстрого удлинения веретена до его разрушения оценивали как суммарную продолжительность анафазы и телофазы митоза.

А.

Б.

g V ^ч.;;-—-V - - -. s , ----------------1

Ш- a/jg щ \Ф

Время прохождения фаз митоза

25 -

□ wt рДНК я ЭрДНК

анафаза телофаза фаза митоза

Рисунок 5. Время прохождения анафазы сокращается в штамме с ЭрДНК.

(А) Схема анафазы и телофазы. Приводится схема изменений веретена деления и ядра, сопровождающих смену фаз митоза у дрожжей 5. сегетяае. (Б) Результаты анализа продолжительности анафазы и телофазы. Гистограмма показывает распределение продолжительности анафазы и телофазы, определённых с помощью прижизненной микроскопии в реальном времени, у штаммов с \УТ рДНК и ЭрДНК.

Проанализировав продолжительность анафазы и телофазы отдельно в штамме с рДНК дикого типа и в штамме с эписомной рДНК, несущих одновременно два маркерных белка с различными флуоресцентными маркерами, мы обнаружили, что протяженность анафазы митоза заметно сокращена в штамме с эписомной рДНК. Таким образом, было получено доказательство, что хромомсомный локус рДНК осуществляет значимый контроль динамики митоза.

Очевидно, что дефекты сегрегации хромосом, обнаруженные нами ранее в штамме с ЭрДНК (чувствительность к нокодазолу и взаимодействие с мутацией конденсина), являются следствием изменения динамики прохождения анафазы. Вероятнее всего, эти дефекты связаны с недостаточной надёжностью уровня коррекции ошибок в штамме с ЭрДНК. Репликация и сегрегация у небольших (20 т.п.н.) плазмид, содержащих единственный повтор рДНК, отличаются от таковых у хромосом с длиной участка рДНК около 1 млн. п.н. и происходят в самом начале анафазы. Именно это различие и является, видимо, определяющим фактором укорочения времени прохождения анафазы, что, в свою очередь, приводит к ошибкам сегрегации и снижает стабильность хромосом в процессе митотического деления. Молекулярный механизм, который определяет

оптимальное время прохождения анафазы в диком типе, остаётся неясным, но убедительно продемонстрировано, что хроматин ядрышка у S. cerevisiae активно участвует в регуляции динамики митоза и поддержании надёжности передачи генетического материала из поколения в поколение.

Таким образом, в штамме с эписомной рДНК перераспределение конденсина не оказывало решающего действия на процесс стабилизации хромосом. Что же является ключевым фактором взаимодействия конденсина с рДНК?

2. Функциональное и физическое взаимодействие конденсина с ДНК ядрышкового организатора

2.1. Структура повтора рДНК у дрожжей S. cerevisiae.

3.1 lib repeat

^¿«Ш——-^««Ш.—

//—-

35S rRNA gene

gene

конден&н 1

185 385 Z3S rftNrf

orí

Рисунок 6. (А) Строение рДНК. Гены рибосомной ДНК организованы в тандемные повторы длиной 9.1 т.п.н. каждый. Pol I активно транскрибирует участок, кодирующий 35S рРНК, образуя характерный рисунок, выявляемый с помощью электронной микроскопии (по French et al. 2003)

(Б) Схема связывания конденсина с рДНК. Схема строения повтора рДНК начиная от репликатора (orí) и заканчивая 5S кодирующим участком. Стрелками показаны участки ДНК, с которыми связывается конденсин. Район, кодирующий 35S рРНК и транскрибирующийся Pol I, отмечен большой горизонтальной стрелкой (по Wang et al., 2004 с изменениями).

рДНК у S. cerevisiae состоит в среднем из 150 повторов, 9.1 т.п.н. каждый. Схема строения рДНК, а также электронная микрофотография рДНК, экспрессирующей 35S рРНК, представлены на рис 6А. Ранее в лаборатории было выявлено 4 участка связывания конденсина на рДНК (рис. 6Б). Два из них приходятся на ген, кодирующий 35S предшественник рибосомной РНК и транскрибирующийся Pol I. Активная транскрипция, как правило, несовместима со связыванием структурных белков. Сосуществование сайтов связывания

конденсина с активной транскрипцией позволяет предположить, что в локусе рДНК они, скорее всего, физически разделены. Более того, существующие данные говорят о том, что транскрипция рДНК может препятствовать нормальной сегрегации ядрышка (Tomson et al., 2007). Таким образом, для выяснения биологической роли конденсина в ядрышке необходимо охарактеризовать природу функциональной связи уровня транскрипции Pol I и активности конденсина по отношению к индивидуальному повтору рДНК.

2.2. Активность Pol I необходима для выхода конденсина из ядрышка по окончании митоза.

а. г

Клетки, содержащие кондеисин в ядрышке, %

Рапамицин Циклогексииид

р Циклогексимид

Рагашиции

cdc28

О 30 60

Время выпуска из анафазы, мин

Рисунок 7. (А) Активность Pol I обуславливает выход конденсина из ядрышка в интерфазе. По вертикальной оси показана доля клеток, содержащих конденсин в ядрышке. Локализацию конденсина (Smc4p-GFP) и маркера ядрышка (Siklp-mRFP) оценивали микроскопически. По горизонтальной оси показано время после выхода клеток из анафазы, где они были заблокированы мутацией cdcl5-2. За 30 мин до инактивации мутации и выхода клеток из митоза добавляли рапамицин или циклогексимид.

(Б) Деградация С1Ь2р - маркер выхода из митозе. Иммуноблот клеток, находившихся при пермессивной температуре после синхронизации, вызванной активацией cdcl5-2. Показан уровень циклина В (С1Ь2), а также контрольного белка cdc28.

Для того чтобы выяснить роль Pol I в перераспределении конденсина из ядрышка в интерфазе мы воспользовались специфическим ингибитором активности этой полимеразы - рапамицином. Так как блокирование синтеза рибосом в свою очередь блокирует синтез белка, то в качестве контроля использовали агент, напрямую блокирующий синтез белка, - циклогексимид. В эксперименте клетки синхронизировали в поздней анафазе с помощью мутации cdcl5-2 в течение, 2.5 ч при температуре 37 °С. После этого клетки стимулировали к выходу из митоза снижением температуры до 23 °С, что снимало блок выхода из митоза, вызванный мутацией cdcl5-2. За 30 мин до окончания инкубации добавляли рапамицин либо циклогексимид. Как можно судить по уровню деградации циклина В2 (С1р2р), часть клеток в этих условиях

не была способна к выходу из митоза и, соответственно, выходу конденсина из ядрышка при действии циклогексимида (рис. 7Б). Вероятно, это является следствием блокирования синтеза белка при действии ингибиторов. В отличие от воздействия циклогексимида, в случае действия рапамицина мы не наблюдали перераспределения конденсина (Smc4p-GFP) из районов ядрышка (Siklp-mRFP) (рис. 7А). Это говорит о том, что перераспределение конденсина из районов ядрышкового организатора в интерфазе зависит от активности Pol I.

2.3. Транскрипционный статус рДНК связан с повышением частоты ошибок сегрегации ядрышка при активации мутации конденсина.

Рисунок 8. Конденсин необходим для расхождения активно транскрибируемых повторов.

Гистограмма распределения

анафазных клеток по статусу расхождения ядрышка в различных штаммах при непермиссивной температуре (37 °С). По вертикали показана доля анафазных клеток различного типа. Генотип штамма и использованные ингибиторы кратко описаны по горизонтальной оси.

Мы проанализировали клетки, заблокированные в метафазе митоза с помощью мутации конденсина. Маркером хроматина в данном случае служил Hhf2p-GFP (гистон Н4), а ядрышка - конститутивный белок ядрышка Siklp-mRFP. В условиях инактивации конденсина примерно 85% клеток задерживается в метафазе (рис. 8). Эффект обусловлен активацией механизма контроля, связанного с веретеном деления (митотического чекпоинта). Инактивация этого механизма в мутантах конденсина приводит к высокой частоте ошибок сегрегации хроматид, которые ведут к неравному расхождению хромосом (Yong-Gonzalez et al., 2007). При делеции гена MAD2, кодирующего основной белок этого пути, около 30 % клеток теряют ядрышко после прохождения анафазы (рис. 8). Однако данный дефект может быть супрессирован обработкой рапамицином, который подавляет активность Pol I. Это свидетельствует о важности роли конденсина в разделении активно транскрибируемой ДНК ядрышка (рис. 8).

Расхождение ядрышка в анафазных клетках при активации мутации конденсина (37 "с)

Норазошедшоося ядрышко

Ш Неравно разошедшееся ядрышко

Разошедшееся ядрышко

5Л1С2.8 MAD2 Smc2-fl та с/2 smc2.8 mad2 +РЯПЯМИЦМН

2.4. Стабильность минихромосомы, содержащей мономер рДНК, зависит от функционального состояния рДНК (активности Pol I) и мутации конденсина.

Тест на стабильность хромосом явился удобным инструментом исследования роли конденсина и влияния транскрипции на точность расхождения рДНК. Мы выбрали функциональный метод анализа взаимодействия конденсина с рДНК по стабильности в митозе минихромосом, содержащих моно- и ди-повторы рДНК. Минихромосомы представляют собой элементарную самовоспроизводящуюся генетическую конструкцию, имеющую в своем составе центромерную последовательность, репликатор ДНК и ген-маркер. Как было показано ранее, наследование такого рода конструкций сходно с тем, как происходит наследование полноценных хромосом (Hartwell et al., 1985; Runge et al., 1991). Использованная нами модификация метода определения стабильности известна как надежный инструмент, позволяющий оценить роль конденсина в сегрегации специфических участков хроматина (Wang et al., 2005).

Мутация конденсина smc2-8 приводила к понижению уровня стабильности минихромосомы, содержащей единственный повтор рДНК (рис. 9Б). Из предыдущих работ известно, что сходные минихромосомы, не содержащие вставку рДНК, не дестабилизированы при инактивации конденсина. В штамме с эписомной рДНК, в котором удельный уровень транскрипции на один повтор рДНК выше, чем в штамме с рДНК дикого типа (рис. 9А), стабильность рДНК, содержащей минихромосомы, снижена в отсутствие мутации конденсина (рис. 9Б). Введение мутации конденсина не приводило к дальнейшему падению стабильности минихромосомы в этом штамме, что свидетельствует о том, что дестабилизирующее действие транскрипции рДНК на минихромосому с рДНК находится в том же биологическом пути, что и мутация smc2-8. Мы можем предположить, что повышенный уровень транскрипции рДНК в составе минихромосомы в штамме с эписомной рДНК приводит к неспособности конденсина к взаимодействию с рДНК, в результате чего повышается частота потери минихромосомы, содержащей рДНК. Мы можем сделать вывод о том, что транскрипция рДНК напрямую ингибирует связывание конденсина, что снижает митотическую стабильность хромосом и минихромосом несущих рДНК.

Контролем в эксперименте по проверке стабильности минихромосомы, содержащей рДНК служила идентичная минихромосома, в которой ген кодирующий 35S рРНК не транскрибировался по причине делеции промотора Pol I. Стабильность такой плазмиды не имела статистически достоверных различий во всех 4 исследуемых штаммах (рис 9Б).

А.

ÇJ Содержанке РДН*

Щудоымй урокмь ** »ряискирчт

с; s Ю го I-о

зе да

О 79

а m

X SO

«0

ЦВМрДИСЗМСг Ы wt рДНК smc2-8 Je Эр ДНК SM С2 [Я Эр ДНК smc2-3

wt рДНК Эр ДНК

MOHO

рДНК wt

moho рДНК дел. ri ром. Poli

минихромосом в штаммах с

Рисунок 9. Стабильность моно рДНК-содержащих различным удельным уровнем экпрессии рДНК.

(А)Удельный уровень транскрипции в штамме с рДНК дикого типа и ЭрДНК. Количество копий рДНК (в %) в штамме с ЭрДНК и штамме с рДНК дикого типа. Уровень транскрипции рДНК был определён с помощью обратной траскрипции с последующей количественной ПЦР, содержание рДНК определено с помощью количественной ПЦР (по Wang et al., 2006). (Б) Митотическая стабильность минихромосом, содержащих одиночную копию рДНК, либо в нативном виде (моно рДНК wt), либо с делецией промотора Pol I (дел.пром. Pol I), что блокирует образование 35S рРНК. По вертикальной оси - митотическая стабильность, по горизонтальной оси приведена краткая характеристика минихромосомы, использованной в анализе. Краткая генетическая характеристика штамма указана в легенде.

2.5. Транскрипция РНК-полимеразой II не оказывает дестабилизирующего действия на минихномосому, содержащую рДНК.

Собственно ли транскрипция или же факторы специфические для Pol I являются причиной дестабилизации минихромосом при полной активации транскрипции в митозе? Для проверки этого мы сконструировали минихромосому, в который участок, кодирующий 35S рРНК, находился под контролем промотора GAL7, транскрибируемого под действием РНК-полимеразы втрого типа (Pol II). Промотор GAL7 активирован при росте на галактозе и ингибируется добавлением глюкозы. Таким образом, в зависимости от источника сахара изменяется транскрипционный статус гена, кондирующего 35S рРНК. Мы не наблюдали дестабилизации такой минихромосомы вне зависимости от активности промотора GAL7. Таким образом, именно активность Pol I, а не Pol II, является причиной дестабилизации рДНК содержащей минихромосомы.

2.6. Исследование митотической стабильности минихромосом, содержащих двойной повтор рДНК.

И SMC2 ■ $тс2-8

Рисунок 10. Стабильность минихромосом, содержащих одиночный либо двойной повтор рДНК. Стабильность минихромосом, содержащих моно- и ди-рДНК в штаммах SMC2 и smc2-8. Оценку стабильности минихромосом проводили как описано в разделе материалы и методы.

моно-рДНК ди-рДНК

Для того чтобы подтвердить нашу гипотезу о взамодействии транскрипции и связывания конденсина на рДНК мы использовали минихромосому, содержащую два повтора рДНК, сравнивая ее с минихромосомой, содержащей единственный повтор рДНК (рис. 10). Введение второго повтора рДНК приводило к стабилизации минихромосомы, что согласуется с нашими предположениями о специализации повторов рДНК. При этом стабильность такой конструкции оставалась зависимой от конденсина, что говорит о том, что именно конденсин является ключевым фактором сегрегации рДНК.

2.7. Модель специализации повторов рДНК.

Опираясь на результаты наших исследований, мы можем предложить модель функционального взаимодействия конденсина и рДНК (рис. 11). Активная транскрипция рДНК под действием Pol I препятствует связыванию конденсина с рДНК. Чтобы объяснить конкуренцию конденсина и Pol I за рДНК, нами предлагается модель функциональной специализации повторов рДНК, согласно которой связывание конденсина происходит с повторами рДНК, не транскрибируемыми Pol I. Эта модель позволяет объяснить роль нетранскрибируемых повторов как эпигенетически поддерживаемого места связывания для конденсина и, возможно, других белков, необходимых для успешной репликации и сегрегации активно транскрибируемых участков рДНК.

Г .........

Модель специализации повторов рДНК:

транскрипция участи связывания конденсина 150 повторе®

—► 50 % повторов- молчащие

--Шшштштш f-jgO---i 1 U°~ - —

^ активный повтор рДНК в молчащий повтор рДНК (

Рисунок 11. Модель функциональной специализации повторов рДНК. Горизонтальными стрелками отмечено направление транскрипции под действием Pol 1, вертикальные стрелки отмечают места посадки конденсина на рДНК.

3. Определение стабильности минихромосом, содержащих последовательности связывания конденсина in situ.

Роль семи случайных сайтов оценивали в тесте стабильности минихромосом. Для этого последовательности ДНК являющиеся сайтами связывания конденсина в геноме, вместе с фланкирующими их участками длиной 500 п.н. были клонированы в дрожжевую минихромосому pRS412. Вектор pRS412 сам по себе не несет участков связывания конденсина. Стабильность оценивали в тесте, позволяющем оценить вклад мутации конденсина в этот процесс. Анализ показал, что только один из семи исследованных сайтов связвания конденсина (RAD5) участвует в поддержании стабильности хроматина в митозе (рис 12). Остальные сайты связывания конденсина не демонстрировали достоверного понижения стабильности при активации мутации конденсина smc2-8. Особый случай представляла минихромосома, содержащая участок Ykr049c, стабильность которой возрастала в клетках с мутацией конденсина (подробнее см. Бутылин и Струнников, 2008). Данное наблюдение, вероятно, объясняется тем, что конденсин, связанный с различными участками в геноме, может выполнять и другие функции, не связанные с митотической сегрегацией, или является участником кооперативного функционирования нескольких сайтов.

гтомный локус контроль Ykr049< Ygr210c ¡Yol085c Rad5 ARP9 Yap5 PTR2

SMC2 стабильность, % ^9.0 87.2 80.2 87.2 74.8 83.2 80.9 80.9

smc2's 83 8 стабильность, % 81.2 72.0 76.1 66.2 68.1 79.8 79.0

p(T<t) 0.1183 0.0043 0.3372 0.1290 0.002 0.4653 0.1013 0.2288

p(T<t) <0.05 +/- - - + - - -

Рисунок 12. Значения стабильности минихромосом, содержащих локусы связывания конденсина в геноме, в штамме с мутацией конденсина 5тс2-8 и штамме дикого типа 5Д/С2. Контролем служила минихромосома, не содержащая вставки, р -значение критерия достоверности различия, рассчитанного из значения ^критерия Стьюдента; нижняя строка -достоверность отличий при уровне значимости 0.05.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что штамм с эписомной рДНК имеет дефект сегрегации, скорее всего связанный с перераспределением конденсина с рДНК. Кроме того, в нашей работе мы показали, что рДНК 5. сегеуиме играет роль регуляторного элемента, контролирующего продолжительность анафазы. В случае, когда отсутствует геномная копия рДНК, увеличение числа образующихся ошибок сегрегации приводит к значительному снижению жизнеспособности штамма ЭрДНК. Увеличение числа таких ошибок является следствием сокращения времени, в течение которого может осуществляться коррекция правильной ассоциации

хромосом с веретеном деления. Таким образом, продемонстрировано, что у S. cerevisiae район ядрышкового организатора кроме своей основной роли в поддержании синтеза рибосом играет важную роль в контроле прохождения анафазы митоза.

Предлагаемая модель специализации повторов позволяет объяснить как сосуществование конденсина и транскрипции на рДНК, так и необходимость существования транскрипционно неактивных повторов рДНК, ранее считавшихся «избыточными». Такие повторы являются своеобразными центрами организации хромосомной структуры в локусе рДНК, обеспечивающими ее успешную сегрегацию в условиях непрекращающейся активной транскрипции в митозе.

Проведён скрининг участков связывания конденсина по их зависимости от функции конденсина в митозе. Полученные данные позволяют сделать заключение о том, что большинство участков связывания конденсина на хромосомных плечах, вне центромера, скорее всего, участвуют в обеспечении функций конденсина, не связанных с сегрегацией хромосом.

ВЫВОДЫ

1. Тандемная повторяющаяся организация рДНК необходима для оптимального контроля динамики анафазы, что обеспечивает точность разделения хромосом в митозе.

2. Конденсин необходим для успешной сегрегации хромосом, содержащих локусы, которые транскрибируются Pol I в митозе.

3. В нативной хромосоме конденсин взаимодействует с «молчащими» повторами. рДНК, не транскрибируемыми Pol I, что объясняет транскрипционную гетерогенность локуса рДНК.

4. Сайты связывания конденсина в геноме необязательно напрямую связаны с сегрегацией этих участков, а могут иметь вспомогательную или интерфазную функцию.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Wang B.D., Butylin P., Strunnikov A. 2006. Nucleolar transcription level regulates cell cycle dynamics of condensin distribution in the yeast genome. American Society for cell biology, 46th meeting. San Diego, CA. p. 701

2. Wang B.D., Butylin P., Strunnikov A. 2006. Condensin function in mitotic nucleolar segregation is regulated by rDNA transcription. Cell Cycle. 5(19):2260-2267.

3. Yong-Gonzalez V., Wang B.D., Butylin P., Ouspenski I., Strunnikov A. 2007. Condensin function at centromere chromatin facilitates proper kinetochore tension and ensures correct mitotic segregation of sister chromatids. Genes Cells. 12(9): 1075-1090

4. Бутылин П.А. Струнников A.B. 2008. Функциональная характеристика индивидуальных сатов связывания конденсина в геноме дрожжей S. cerevisiae на модели митотической сегрегации минихромосом. Цитология. 50(9):788-793

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Витке, D. et al.2000. Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A cold spring harbor laboratory Course Manual. New-York. CSHL Press.. 205 pp. Dammann, R. et al. 1993. Chromatin structures and transcription of rDNA in yeast Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 21:2331-2338 Freeman, L el al. 2000. The condensin complex governs chromosome condensation and mitotic transmission of rDNA. J. Cell Biol. 149:811-824. French, S. L. et al. 2003. In exponentially growing Saccharomyces cerevisiae cells, rRNA synthesis is determined by the summed RNA Polymerase I loading rate rather than by the number of active genes. MCB. 23(5): 1558-1568. Gerlich, D. et a!. 2006. Condensin I stabilizes chromosomes mechanically through a dynamic interaction in live cells. Current biology. 16:4(21):333-344. Hartwell, L. H. Smith D. 1985. Altered fidelity of mitotic chromosome transmission in cell cycle mutants of S. cerevisiae. Genetics. 110:381-395. Hirano, T. 2006. At the heart of the chromosome: SMC proteins in action. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 7:311-322. Jallepalli, P. V. Lengauer C. 2001. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. 1(2):109-117. Lavoie, B.D. et al. 2004. In vivo requirements for rDNA chromosome condensation reveal two cell cycle- regulated pathways for mitotic chromosome folding. Genes & Dev. 18: 76-87. Losada, A. and Hirano T. 2005. Dynamic molecular linkers of the genome: the first decade of SMC proteins. Genes. Dev. 19:1269-1287. Maeshima, K. et a!.. 2005. Chromosome structure: improved immunolabeling for electron microscopy. Chromosoma. 114:365-375. Oakes, M. et al., 1998. Mutational analysis of the structure and localization of the nucleolus in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol. 143:23-34. Rose, M.D. et al. 1990. Methods of yeast genetics: cold spring harbor laboratory. New York. CSHL press. 198 pp. Runge, K. et al. 1991. Effects of excess centromeres and excess telomeres on chromosome loss rates. MCB, 11 (6):2919-2928. Saka, Y. et al. 1994. Fission yeast cut3 and cutl4, members of a ubiquitous protein family, are required for chromosome condensation and segregation in mitosis. EMBO J. 17;13(20):4938-4952. Sambrook, J. et al. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual. NY. Cold Spring Harbor. CSHL Press. 2100pp. San-Segundo, PA. and Roeder GS. 1999. Pch2 links chromatin silencing to meiotic checkpoint control. Cell. 97:313-24. Shaw P., Doonan J. 2005. The nucleolus. Playing by different rules? Cell Cycle. 4(1): 102-105. Shero J.H. et al. 1991. Analysis of chromosome segregation in Saccharomyces cerevisiae. 194:749-773. Surosky, R., et al. 1986. The mitotic stability of deletion derivatives of chromosome III in yeast (chromosomal deletion/fluctuation analysis). Proc. Nati. Acad. Sci. USA Genetics. 83:414-418. Swedlow, J.R., Hirano T. 2003. The making of the mitotic chromosome: modern insights into classical questions. Mol. Cell. 11:557-569. Strunnikov, A. V. et al. 1993. SMC1: An essential yeast gene encoding a putative head-rod-tail protein is required for nuclear division and defines a new ubiquitous protein family. J.C.B. 123:1635-1648. Tomson, B. et al. 2006. Ribosomal DNA transcription-dependent processes interfere with chromosome segregation. MCB. 26(16):6239-6247. Wai, H.H. et al. 2000. Complete deletion of yeast chromosomal rDNA repeats and integration of a new rDNA repeat: use of rDNA deletion strains for functional analysis of rDNA promoter elements in vivo. Nucleic Acids Res. 15;28(18):3524-3534. Wang, B.D. et al. 2006. Condensin function in mitotic nucleolar segregation is regulated by rDNA transcription. Cell Cycle. 5(19):2260-2267. Wang, B.D. and Strunnikov A. 2008. Transcriptional homogenization of rDNA repeats in the episome-based nucleolus induces genome-wide changes in the chromosomal distribution of condensin. Plasmid. 59(l):45-53. Wang, B.D. et al.. 2004. Cdcl4p/FEAR pathway controls segregation of nucleolus in S. cerevisiae by facilitating condensin targeting to rDNA chromatin in anaphase. Cell Cycle 3:960-967. Xing, H. et al. 2008. The TBP-PP2A mitotic complex bookmarks genes by preventing condensin action. Nat.Cell Biol. 10(11): 1318-1323. Yong-Gonzalez V. et al. 2007. Condensin function at centromere chromatin facilitates proper kinetochore tension and ensures correct mitotic segregation of sister chromatids. Genes Cells. 12(9): 1075-1090.

Подписано в печать 24.02.2009 г. Формат 60x84 1/16. Печать цифровая. Бумага офсетная . Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 2402-01. Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Центре Оперативной Полиграфии Копи-Медиа. 199061, С-Петербург, 6 линия В.О., д.29. тел/факс: 328-61-84

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бутылин, Павел Андреевич

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цели и задачи.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,.

2.1 Белки SMC семейства.

2.2 Конденсин.

2.2.1 Конденсин: структура.

2.2.2 Конденсин: локализация в клетке, связывание с ДНК.

2.2.3 Конденсин: функции - компактизация.

2.2.4 Конденсин: функции - сегрегация хроматид.

2.2.5 Конденсин: функции - регуляция клеточного цикла.

2.2.6 Конденсин: функции - регуляция транскрипции.

2.3 рДНК, ядрышко, ядрышковый организатор.

2.4 Регуляция биосинтеза рибосом: TOR, рапамицин.

2.5 Штаммы с изменённой рибосомной ДНК.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Штаммы.

3.2 Плазмиды.

3.3 Среды и условия культивирования.

3.4 Молекулярно-биологические и биохимические методы.

3.5 Тест на стабильность хромосомы III.

3.6 Минихромосомы.

3.7 Тест на потерю минихромосом.

3.8 Микроскопия.

3.9 Микроскопия живых клеток в реальном времени.

ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ.

5.1 Значение ядрышкового организатора в контроле продолжительности и динамики анафазы дрожжей.

5.1.1 Штаммы с эписомной рДНК имеют высокий уровень генетической нестабильности.

5.1.2 Отсутствие хромосомного локуса рДНЕС повышает уровень успешной сегрегации ядрышка в мутантах smc2-8.

5.1.3 Возможный механизм нестабильности генома в штамме с ЭрДНК: повышенная чувствительность к функциональности митотического веретена и кинетохора.

1.4.1 Анализ динамики митоза (телофаза+анафаза) в штаммах с различной структурой рДНК.

5.2 Функциональное и физическое взаимодействие конденсина с ДНК ядрышкового организатора.

5.2.1 Активность Pol I необходима для выхода конденсина из ядрышка по окончании митоза.

5.2.2 Транскрипционный статус рДНК связан с повышением частоты ошибок сегрегации ядрышка при активации мутации конденсина.

5.2.3 Стабильность минихромосомы, содержащей мономер рДНК, зависит от функционального состояния рДНК (активности Pol I) и мутации конденсина.

5.2.4 Транскрипция РНК-полимеразой II не оказывает дестабилизирующего действия на минихромосому, содержащую рДНК.

2.5 Исследование митотической стабильности минихромосом, содержащих двойной повтор рДНК.

5.3 Определение стабильности минихромосом, содержащих последовательности связывания конденсина in situ.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ.

6.1 Транскирипция Pol I и связывание конденсина на рДНК.

6.2 Роль рДНК в процессе регуляции точности расхождения хромосом в митозе.

6.3 Скрининг индивидуальных сайтов связывания конденсина в геноме S. cerevisiae с использованием модели митотической сегрегации минихромосом.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

1.1 Актуальность проблемы

Стабильность генома и передача генетического материала из поколения в поколение гарантируется точностью расхождения хромосом в митозе. Сегрегация хромосом в процессе клеточного деления требует от эукариотической клетки слаженной работы комплекса ассоциированных с хроматином структурных белков и энзимов. Один из этих белковых факторов - это конденсин, молекулярная «машина» конденсации хромосом (Losada, Hirano, 2005). У позвоночных обнаружены два конденсиновых комплекса (конденсин I и конденсин II), различающиеся динамикой экспрессии и картиной хромосомной локализации (Hirano, 2006). У пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae выявлен только один конденсин, состоящий из пяти жизненно важных субъединиц, две из которых Smc2 и Smc4 относятся к SMC белкам (Structural Maintenance of Chromosomes), и содержат участок связывания АТФ, а три - это вспомогательные субъединицы Brn1, Ycs4 и Ycs5. Все компоненты комплекса - высококонсервативные белки. Мутации хотя бы одной из субъединиц приводят к нарушению разделения хроматина при делении клетки (Freeman et al., 2000). Сходные фенотипы нерасхождения хроматид в митозе при инактивации конденсина описаны и у высших эукариот (Saka et al., 1994; Gerlich et al., 2006). Основной функцией конденсина in vivo является не столько компактизация хроматина, сколько разделение хроматид в ходе митотической сегрегации. Кроме того, конденсин принимает участие в регуляции экспрессии генов, которые сохраняют активность в митозе (Xing et al., 2008).

У позвоночных конденсины, диффузно распределённые в цитоплазме (конденсин I) или в ядре (конденсин II) в интерфазе, в митозе перераспределяются во внутренние домены конденсированных хромосом (Swedlow, Hirano, 2003; Maeshima et al., 2005). У S. cerevisiae в интерфазе конденсин диффузно распределён в цитоплазме, а в митозе основным сайтом связывания конденсина является рибосомная ДНК (Freeman et al., 2000).

Рибосомная ДНК (рДНК) S. cerevisiae состоит из примерно 150 повторов, которые располагаются на правом плече XII хромосомы. Каждый повтор рибосомной ДНК содержит ген - предшественник 35S рРНК, i транскрибируемый РНК полимеразой первого типа (Pol I), а также ген, транскрибируемый РНК полимеразой третьего типа (Pol III), кодирующий 5S рРНК (Shaw et al., 2005). Эти гены разделены двумя нетраскрибируемыми (спейсерными) участками (рис. 6А). Ранее было показано, что конденсин имеет 4 главных сайта связывания на рибосомной ДНК, два из которых приходятся на участок, транскрибируемый Pol I. Около половины повторов рДНК являются транскрипционно активными, при этом число генов рДНК остается стабильным из поколения в поколение (Damman et al., 1993), при этом регуляция уровня рРНК у клеток, находящихся в разных фазах роста (French et. al., 2003), осуществляется путём модуляции транскрипции «активных» повторов. Роль «молчащих» повторов рДНК остаётся неизвестной.

Инактивация конденсина в клетках Э. сегеу/з/ае приводит к тому, что большая часть клеток останавливается в метафазе митоза, но сохраняет высокую жизнеспособность. Часть клеток, которые входят в анафазу, обладают признаками неправильной сегрегации хромосом. Дефекты сегрегации наиболее ярко выражены для хромосомы XII, несущей гены ядрышкового организатора. Частота нерасхождений этой хромосомы в 2-3 раза выше, чем других хромосом (Уопд-Оопга^г а1., 2007). Какие особенности организации и функционирования ядрышка обуславливают тот факт, что сегрегация именно этого локуса является особенно зависимой от конденсина? Этот вопрос, а также вопрос о молекулярной природе взаимодействия конденсина и района ядрышкового организатора, являются предметом настоящей работы.

Высокая пластичность дрожжевого генома предоставляет возможность исследовать анатомию взаимодействия конденсина и субдоменов рДНК. Для исследования функционального взаимодействия хроматина ядрышка с конденсином в митозе мы использовали штамм с эписомной локализацией рДНК, в котором хромосомный локус рДНК (тандемные повторы) был заменён многокопийной плазмидой, несущей одиночные повторы рДНК (\Л/а1 а1., 2000). Использование данной модели позволило впервые показать роль ядрышка в регуляции процесса сегрегации всего генома в митозе.

1.2 Цели и задачи j

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Бутылин, Павел Андреевич

выводы

2. Конденсин необходим для успешной сегрегации хромосом, содержащих локусы, которые транскрибируются Pol I в митозе. I

3. В нативной хромосоме конденсин взаимодействует с «молчащими» повторами рДНК, не транскрибируемыми Pol I, что объясняет транскрипционную гетерогенность локуса рДНК.

4. Функция сайтов связывания конденсина в геноме необязательно напрямую связана с сегрегацией этих участков, а может иметь вспомогательную или интерфазную функцию.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бутылин, Павел Андреевич, Санкт-Петербург

1. Anderson DE, Losada A, Erickson HP, Hirano Т. Condensin and cohesin display different arm conformations with characteristic hinge angles. 2002. J. Cell Biol. 156: 419^24.

2. Aono N, Sutani T, Tomonaga T, Mochida S, Yanagida M. Cnd2 has dual roles in mitotic condensation and interphase. Nature. 2002 May 9;417(6885):197-202.

3. Ball AR Jr, Schmiesing JA, Zhou C, Gregson HC, Okada Y, Doi T, Yokomori K. Identification of a chromosome-targeting domain in the human condensin subunit CNAPl/hCAP-D2/Eg7. Mol Cell Biol. 2002 Aug;22(16):5769-81.

4. Bazett-Jones DP, Kimura K, Hirano T. Efficient supercoiling of DNA by a single condensin complex as revealed by electron spectroscopic imaging. Mol Cell. 2002 Jun;9(6): 1183-90.

5. Berger C, Horlebein A, Gogel E, Grummt F. Temporal order of replication of mouse ribosomal RNA genes during the cell cycle. Chromosoma. 1997 Dec;106(8):479-84.

6. Bhalla N, Biggins S, Murray AW. Mutation of YCS4, a budding yeast condensin subunit, affects mitotic and nonmitotic chromosome behavior. Mol Biol Cell. 2002 Feb;13(2):632-45.

7. Bhat MA, Philp AV, Glover DM, Bellen HJ. Chromatid segregation at anaphase requires the barren product, a novel chromosome-associated protein that interacts with Topoisomerase II. Cell. 1996 Dec 13;87(6):1103-14.

8. Burds AA, Lutum AS, Sorger PK. Generating chromosome instability through the simultaneous deletion of Mad2 and p53. Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Aug 9;102(32):11296-301. Epub 2005 Jul 29.

9. Burke D, Dawson D, Stearns T. Methods in Yeast Genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. 2000. CSHL Press, New-York. 205 pp.

10. Camargo RS, Maeda MY, di Loreto C, Shirata NK, Anselmo Garcia E, Filho AL. Is agNOR and DNA ploidy analysis useful for evaluating thyroid neoplasms? Anal Quant Cytol Histol. 2005 Jun;27(3): 157-61.

11. Chernoff YO, Newnam GP, Liebman SW. The translational function of nucleotide

12. CI054 in the small subunit rRNA is conserved throughout evolution: genetic evidence in yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Mar 19;93(6):2517-22.

13. Chernoff YO, Vincent A, Liebman SW. Mutations in eukaryotic 18S ribosomal RNA affect translational fidelity and resistance to aminoglycoside antibiotics. EMBO J. 1994 Feb 15;13(4):906-13.

14. Ciosk R, Shirayama M, Shevchenko A, Tanaka T, Toth A, Shevchenko A, Nasmyth K. Cohesin's binding to chromosomes depends on a separate complex consisting of Scc2 and Scc4 proteins. Mol Cell. 2000 Feb;5(2):243-54.

15. Clemente-Blanco A, Mayan-Santos M, Schneider DA, Machin F, Jarmuz A, Tschochner H, Aragon L. Cdcl4 inhibits transcription by RNA polymerase I during anaphase. Nature. 2009 Jan 21. Epub ahead of print.16.

Информация о работе

Бутылин, Павел Андреевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2009
ВАК 03.00.25

Диссертация

Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Роль конденсина в стабилизации ядрышкового организатора в процессе митотического деления у дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы