Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика новых бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика новых бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4"

□оз

На правах рукописи

ЛАТЫПОВ Олег Рустамович

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ БЕТА-ПРОПЕЛЛЕРНЫХ БЕЛКОВЫХ ДОМЕНОВ, ГОМОЛОГИЧНЫХ ФОЛДОНУ ФИБРИТИНА БАКТЕРИОФАГА Т4

Специальность 03 00 04. - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 АП Р 2008

Казань-2008

003166945

Работа выполнена в лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии им. С.Н Винотрадского РАН

Научный руководитель- кандидат биологических наук

Летаров Андрей Викторович

Официальные оппоненты. доктор биологических наук, профессор

Шарапова Маргарита Рашидовна

доктор биологических наук, Шевелев Алексей Борисович

Ведущая организация:

Институт Вирусологии

им Д.И Ивановского РАМН, г Москва

Защита диссертации состоится 24 апреля 2008 года в /3часов на заседании Диссертационного совета Д 212,081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, аудитория 209.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина

Автореферат разослан «24» марта 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Фибриллярный аппарат бактериофагов представляет собой уникальный объект для исследований, интерес к которому не ослабевает уже многие годы В первую очередь, фаговые фибриллы привлекательны для исследователей простотой своего строения, которая при этом, в ряде случаев, сопряжена с бифункциональной нагрузкой Кроме того, гены, кодирующие фибриллярный аппарат являются наиболее пластичным компонентом фаговых геномов, а потому представляют немалый интерес для исследования эволюции бактериофагов

Одним из наиболее исследованных на данный момент фаговых фибриллярных белков является фибритин бактериофага Т4 (Letarov et al, 2005) Фибритин представляет собой комплекс «воротничок-бакенбарды», и кодируется геном wac «Бакенбарды» представляют собой шесть фибрилл длинои 480 А, отходящих от шейки фаговой частицы (Coombs et al ,1977) Эти фибриллы способны временно связываться с длинными хвостовыми фибриллами (ДХФ) и должным образом ориентировать их для присоединения к базальной пластинке при сборке фаговой частицы (Efimov et al, 1994) Кроме того, «бакенбарды» в случае бактериофага Т4 несут функцию молекулярного сенсора, предотвращающего инфекцию в неблагоприятных условиях (например, высокая ионная сила раствора, низкий рН) Данный сенсор функционирует за счет временного связывания С-концевого домена фибритина («бакенбарды») со средним участком ДХФ, что обеспечивает удерживание последней в поднятом состоянии (Conley et al, 1975) Фибритин представляет собой тримерную альфа-спиральную coiled-coil структуру, фланкированную маленькими глобулярными N- и С-концевыми доменами (Efimov et al, 1994). В то время как N-домен (50 а о) необходим для прикрепления тримера к «шейке» бактериофага, С-концевой домен, состоящий из 30 а о, является затравкой фолдинга всей молекулы (фолдо-ном), а также играет важную роль в упомянутом выше связывании с ДХФ (Letarov etal, 1999)

Механизм инициации фолдинга фибритина бактериофага Т4 на данный момент описан весьма подробно (Guthe et al, 2004, Meier et al, 2004) Методами рентгеноструктурной кристаллографии и ЯМР было показано, что гидрофобный кор и межмолекулярные связи внутри тримерной молекулы формируются за счет аминокислотного мотива GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL Данный мотив (фолдон), в процессе фолдинга образует бета-шпильку, взаимодействие которой с такими же шпильками на двух других цепях фибритина приводит к образованию так называемой бета-пропеллерной структуры Бета-пропеллер, как было показано в нескольких работах, является необходимым для эффективной

инициации тримеризации и последующего фолдинга фибритина Способность фолдона фибритина фага Т4 к автономной тримеризации может быть использована при конструировании искусственных химер, например, как это было сделано в случае получения гибридного белка, состоящего из фолдона на М-конце, слитого с последовательностью бета-спиральной тримерной фибриллы аденовируса (Рарагико1орои1ои е? о/, 2004)

Современная биотехнология и практическая молекулярная биология испытывают необходимость в новых методах получения тримерных химерных белков Без привнесения в аминокислотную последовательность надежных доменов, инициирующих тримеризацию, очень сильно усложняется исследование трансмембранных тримерных белков, а также отдельных доменов тримерных фибриллярных белков Физико-химические характеристики обнаруженной в последовательности фибритина бактериофага 1Б98СЗ новой разновидности бета-пропеллерного фолдона делают его перспективным в отношении использования в белковой инженерии как домена, инициирующего тримеризацию химерных белков

Цепи и задачи исследования

Цель проделанной нами работы - исследовать распространенность и разнообразие белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4 и охарактеризовать некоторые из них

Задачи исследования состояли в следующем

] Поиск бактериофага, имеющего фибритин с фолдоном, отличающимся по аминокислотной последовательности от фолдона фибритина бактериофага Т4

2 Дифференциальная физико-химическая характеристика фибритина вновь обнаруженного фага и его делеционных вариантов

3 Поиск новых белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4 методами биоинформатики

4 Моделирование вторичных и третичных структур обнаруженных нами доменов т зйгсо

Научная новизна и практическая значимость работы

До последнего времени фолдон фибритина бактериофага Т4 считался уникальной структурой Впервые было продемонстрировано широкое распространение бета-пропечлерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина, причем большая часть выявленных гомологов данной структуры была обнаружена в последовательности белков бактериофагов, не родственных Т4 Также была показана возможность отклонения аминокислотной последовательности бета-пропеллерных доменов от «канонической» последовательности фолдона фибритина фага Т4 1п ягЬсо моделирование третичной структуры одного из подобных доменов, обнаруженного в

последовательности фибритина бактериофага JS98C3 показало вероятное наличие в ней дополнительного участка альфа-спирали, что делает кон-формацию данного фолдона более энергетически выгодной и более прочной, чем у фолдона фибритина бактериофага Т4 Исследование физико-химических свойств данной структуры in vitro с высокой степенью достоверности подтвердило результаты моделирования

Дальнейшее исследование аминокислотного «контекста», в котором были обнаружены многочисленные гомологи фолдона фибритина бактериофага Т4, в перспективе позволит получать химерные белковые конструкции с большей, чем в настоящий момент, эффективностью

Положения. выносимые на защиту

1 В С-концевом домене фибритина бактериофага JS98C3 обнаружены два аминокислотных домена, гомологичных фолдону фибритина фага Т4 Данные домены, несмотря на имеющиеся отличия от последовательности фолдона фибритина бактериофага Т4, способны к автономной тримериза-ции

2 С-концевой фолдон фибритина фага JS98C3 превосходит по прочности фолдон фибритина фага Т4 и может быть применен в белковой инженерии в качестве более надежного домена, инициирующего тримериза-цию химерных белков

3 Фолдон фибритина бактериофага Т4 не является уникальной структурой Его гомологи широко распространены среди бактериофагов, относящихся к семействам Myoviridae и Siphoviridae

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «Ist Texas - Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting», а также Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2005» и «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2006»

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 8 печатных работ (4 статьи и 4 тезиса).

Место проведения работы

Работа выполнена в лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии им С Н Виноградского РАН Спектры кругового дихроизма белков были получены в лаборатории структурной биологии Института Биоорганической Химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 84 страницах машинописного текста и включает 22 рисунка и 2 таблицы Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, который содержит 104 ссылки

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Методы исследования

Бактериальные штаммы и культивирование бактерий и бактериофагов. В качестве индикаторного штамма мы использовали дериват штамма Е coli К12 С600 (F-, thi-1, thr-1, leuBó, lacYl, tonA21, supE44) Для клонирования и получения плазмидной ДНК нами применялся штамм Е coli DH5alfa (F-, thi-1, gyrA96, supE44, hsdR17, recAl, endAl, relAl) Экспрессию гена wac проводили в клетках Е coli штамма BL21 (DE3) (gal hsdS {le1857 ind-1 Sam7 mn5 lacUV5-T7 gene)

Изоляция бактериофагов. Проба фекалий лошади (20 г) была гомо-генизована в 80 мл фагового буфера (0 2 M NaCl, 0 1 г/л азида натрия, 1 г/л Tween 20) Затем суспензия перемешивалась на роторной качалке 1 ч при комнатной температуре, после чего аликвоты были центрифугированы в течение 2 мин на микроцентрифуге при 12000 об/мин Супернатант использовался для высева на газон индикаторного штамма

Библиотека случайных клонов, клонирование и выделение плазмидной ДНК. Для получения случайных клонов ДНК бактериофага JS98C3, гидролизованную эндонуклеазой рестрикции Dral, осаждали этанолом, после чего ресуспендировали в деионизованной воде и клонировали в плазмидный вектор T-system PCR cloning kit (Promega, США) в соответствии с инструкциями производителя В этот же вектор клонировали фрагмент генома фага JS98C3, кодирующий ген wac Для клонирования фрагментов гена wac фага JS98C3, кодирующих варианты С-концевого домена фибритина мы использовали плазмидный вектор рЕТ-32а (Novagen, США)

Плазмидную ДНК выделяли при помощи набора Wizard Plus Mmipreps DNA Purification System (Promega, США)

ПЦР, олигонуклеотидные праймеры и секвенирование. Для ПЦР-амплификации и секвенирования случайных клонов из плазмидной библиотеки нами применялись стандартные праймеры M13F и Sp6 (Fermentas, Литва) Для обнаружения бактериофагов, родственных Т4 мы применяли вырожденные олигонуклеотидные праймеры к гену 23, MZIAlbis (5'-GAT ATT TGI GGI GTT CAG CCI ATG А) и MZIA6 (5'-CGC GGT TGA TIT

CCA GCA TGA TTT С) в концентрации 0 5 пМ/мкл Ген wac амплифици-ровали и секвенировали с использованием олигонуклеотидов JST12up (5'-AGT TAC CAT (T\A)(T\C)G TTG A(C\T)G GC), JS131o (5'-ATA AAA AGC CTG ATA ACC TTT), JS98_wacM (5'-AAC CGA GTT GAT ATT CTG G) и jsNdlo (5' -TTT TTT CCA TGG TTA AGT GTC АТС AAG GAT TTC AGC CC) Для амплификации и секвенирования гена 36 использовали олигонук-леотиды JS98_35up (5'-GAA TTT GG(T/C) GT(A/C) AAT GGT ATT CG) и JS98_g371o (5'-TCT TTT AAG TTA ATA GCC AG(C/T) TC(G/A) CCT TC(AIG) GC) Фрагменты С-концевого домена амплифицировали при помощи олигонуклеотидов js_Cdlup (5' -TTT TTT CCA TGG GTC AAA TGC СТА СТА AAT TGG G), js_Cd2up (5' -TTT TTT CCA TGG GTA CAG AAA TTG ATA CGG ТС) и jsCdlo (5' -TTT TTT CTC GAG GCC CTT TTG TTA TGG TGC TGG G)

Электронная микроскопия. Каплю фагового лизата наносили на медную сетку с формвар-углеродным покрытием, после 5 мин инкубации на столе каплю отбирали фильтровальной бумагой Затем препарат контрастировали 1%-ным уранилацетатом и исследовали при помощи электронного микроскопа Jeol 100S (Япония) при 25000х увеличении

Экспрессия, выделение и очистка пг wac и вариантов его С-концевого домена. Экспрессию целевых белков в клетках Е coli BL21 (DE3), проводили согласно методам, описанным в руководстве Маниатис и соавторов Биомассу осаждали центрифугированием при 6000g и температуре 4°С в течение 20 мин, после чего ресуспендировали осадок в буфере для лизиса (50 мМ натриево-фосфатный буфер (pH 7 0), 300 мМ NaCl) К клеточной суспензии добавляли лизоцим до 300 мкг/мл и ДНКазу I до 5 мкг/мл, после 20 мин инкубации на столе она была разрушена при помощи ультразвукового дезинтегратора Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 10000 g и 4°С в течение 10 мин К осветленному лизату по каплям при интенсивном перемешивании добавляли (NH4)2S04 до 25% от насыщения, затем после 20 мин инкубации при 4°С высоленный белок осаждался центрифугированием при 10000 g и 4°С в течение 10 мин Грубую очистку целевого белка проводили несколькими циклами дифференциального высаливания насыщенным раствором сульфата аммония

Варианты С-концевого домена пг wac очищали при помощи аффинной хроматографии на колонке с Co-NTA смолой Talon (Clontech, США) в соответствии с инструкцией производителя После очистки раствор белка диатизовали против 500 мл буфера для гидролиза тромбина (20 rnM Tris-НС1 pH 8 4, 150 мМ NaCl, 2,5 mM СаС12) в течение ночи при 4°С После гидролиза тромбином, белки вновь диализовали против буфера для лизиса, затем проводили еще один цикл очистки на колонке с Co-NTA Степень очистки целевых белков оценивали при помощи ДСН-ПААГ электрофореза в 10% (пг wac и его N-концевой домен) или 15% (варианты

С-концевого домена) акриламидном геле по методике Лэммли (Fritch et al, 1989)

Ограниченный протеолиз. К белку в буфере 50 мМ трис-HCl, pH 8 0, 1 мМ СаС12 добавляли трипсин (Serva, США) в различных соотношениях и инкубировали в течение 30 мин при 37°С Реакцию останавливали добавлением ФМСФ до концентрации 2 мМ Затем добавляли двукратный буфер для образцов, нагревали 3-5 мин в кипящей воде и наносили на ПААГс ДСН

Гидролиз тромбином. Для отщепления вариантов С-концевого домена пг wac от слитого с ними тиоредоксина, их обрабатывали сайт-специфической протеиназой тромбин (Novagen, США) согласно инструкции фирмы производителя К 1 мл раствора целевого белка в концентрации 5 mi/мл в буфере для гидролиза тромбином добавляли 5 ед активности тромбина, затем тщательно перемешивали и инкубировали при 37°С в течении 1 часа

Спектроскопия кругового дихроизма. Спектры кругового дихроизма целевых белков в дальнем ультрафиолете снимали при помощи спек-трополяриметра Jasco J-810 (JASCO, Япония) Запись спектра производили при длине волны от 190 до 250 нм с шагом в 1 нм при 24°С Полученные данные были проанализированы на предмет наличия вторичных структур при помощи последних версий программ CONTINLL и CDSSTR (http /Л amar colostate edu/~sreeram/CDPro/)

Предсказание вторичной и третичной структуры. Предсказанные аминокислотные последовательности мотивов пг wac бактериофага JS98C3, гомологичных фолдону фибритина фага Т4, а также данные, полученные в результате поиска их гомологов в GenBank (программа BLAST http //www nebí nlm nih gov/blast/Blast cgi) анализировали при помощи программы Chimera В качестве матрицы для построения моделей предполагаемых вторичных и третичных структур использовали модель фолдона фибритина бактериофага Т4, депонированную в Protein Data Bank по результатам рентгеноструктурного анализа (Guthe et al, 2004).

2. Результаты исследования и их обсуждение 2.1. Выделение Т4-подобного бактериофага JS98C3. В лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии им С H Вино-градского РАН уже продолжительное время ведется работа по исследованию смешанных бактериально-фаговых сообществ из кишечника лошади (Е Е Куликов и соавт, 2007) Мы провели скрининг коллекции полевых изолятов колифагов, полученных в ходе этого исследования, с целью обнаружения бактериофагов, родственных Т-четным

Вырожденные олигонуклеотидные праймеры к консервативным участкам гена 23, кодирующего основную субъединицу головки Т4-подобных

бактериофагов были подобраны в 2000 г группой Н М Krisch (Tetart et al, 2004) За прошедшие годы эти олигонуклеотиды зарекомендовали себя как надежное и удобное средство для быстрой идентификации бактериофагов, родственных Т4, а также установления их систематического положения (Nolan et al, 2006, Yoshida et al, 2006) Нами были проскринированы путем ПЦР-амплификации экстракты ДНК из 50 фаговых бляшек различной морфологии, высеянных из фекалий лошади Только в одном случае был получен ПЦР-продукт, который имел размеры около 540 п о Данный ПЦР-продукт был секвенирован с тех же олигонуклеотидных праймеров Поиск гомологий в базе данных GenBank дал 95%-ное совпадение с последовательностью гена 23 бактериофага JS98, изолированного группой Н Brussow в 2004 г в Бангладеш из стула педиатрических пациентов с симптомами диареи (Chibam-Chennoufi et al, 2004) Сконцентрированный и очищенный дифференциальным центрифугированием препарат фага был исследован методами электронной микроскопии, его морфология оказалась крайне близкой к морфологии бактериофага Т4 (рис 1)

Были секвенированы 3 случайных клона из полученной нами плаз-мидной библиотеки ДНК этого фага Первый из этих клонов оказался фрагментом гена 55 (сигма-фактор РНК-полимеразы Т4-подобных фагов) и показал 88%-ное совпадение нуклеотидной последовательности с аналогичным геном фага JS98 (аминокислотная последовательность транслированного клона совпала на 96%) Последовательность второго клона, фрагмента гена 7 (одна из субъединиц базальной пластинки), имела гомологию в 87% (95% - в транслированном виде) Третий клон имел в транслированном виде 89% гомологию с предсказанной последовательностью большой субъединицы топоизомеразы II (пг 39) фага JS98 Нуклеотидные последовательности этих трех клонов депонированы в GenBank под номерами EF618561 1, EF618562 1 HEF618563 1 соответственно

Таким образом, полученные данные подтвердили генетическое сходство фага JS98C3 с фагом JS98

Физико-химические условия, с которыми сталкиваются бактериофаги и их хозяева в кишечнике лошади, имеют массу отличий от условий кишечника человека, из которого был изолирован фаг JS98 Мы сделали предположение, что в силу этих отличий, компоненты молекулярного сенсора фага JS98C3, ответственного за предотвращение инфекции в неблагоприятных условиях, должны нести соответствующие изменения

2.2. Последовательность гена wac ПЦР-амплификация с использованием подобранных нами вырожденных олигонуклеотидных праймеров с последующим секвенированием ПЦР-фрагмента позволила нам определить полную последовательность гена wac фага JS98C3 Нуклеотидная последовательность этого гена депонирована в GenBank под номером EU2244220 Предсказанная аминокислотная последовательность

Рис. I. Электронная микрофотография бактериофага JS98C3.

N'-концевого участка пг wac (а.о. 1-48), имеющая значительную гомологию с последовательностью фибритина фага Т4, была практически идентичной в геномах фагов JS98C3 и JS98. Последующие 379 а.о. последовательности фибритинов фагов JS98C3 и JS98 также имеют высокую степень гомологии и сходны по своей гептадной coiled-coil периодичности с фибритином бактериофага ТА. Однако пг wac JS98 имеет дополнительный С-концевой домен, отсутствующий в пг wac фага Т4. Длина этого домена составляет 298 а.о. В фибритине фага JS98C3 также имеется «дополнительный» домен, однако его длина составляет только 54 а.о.

Последовательность С-концевой области пг wac фага JS98C3 почти идентична С-концевой последовательности пг wac фага JS98. Таким образом, по отношению к последнему пг wac фага JS98C3 имеет внутреннюю делению 237 а.о. (Рис.2).

Рис. 2. Схема строения, фибритинов бактериофагов Т4, JS98 и JS98C3. Овалами отмечены аминокислотные последовательности фопдонов.

2.3. Последовательное гь гена 36. Продукт гена 36 является одним из компонентов молекулярного сенсора Т4-подобных бактериофагов «Колено» ДХФ (пгЗб) принимает участие в первой стадии приведения фибрилл в состояние «ир» в неблагоприятных условиях путем взаимодействия с С-концевым доменом фибритина Для того, чтобы выяснить, отразилась ли обнаруженная нами делеция в гене wac на последовательности гена 36, нами были подобраны вырожденные олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие данный ген Полученный ПЦР-фрагмент по размерам и нуклео-тидной последовательности оказался очень близким к гену 36 фага JS98 (номер в GenBank EU224421) Аминокислотная последовательность, кодируемая данными генами, оказалась практически идентичной Это говорит о том, что связывание ДХФ с фибритином у фагов JS98C3 и JS98 происходит за счет одинаковых белок-белковых взаимодействий

2.4. Фибритин бактериофага JS98C3 и его свойства. Фрагмент генома фага JS98C3 содержащий ген wac с естественным сайтом инициации трансляции был амплифицирован при помощи олигонуклеотидов, комплементарных З'-концу гена 12 и 5'- концу гена 13, и клонирован в плазмид-ный вектор pGEM-T ПЦР-амплификацией были отобраны клоны с ориентацией вставки, совпадающей с ориентацией промотора Т7 РНК-полимеразы

Для нативной гримерной молекулы фибритина была показана способность к ренатурации после нагревания, а также свойства ограниченной устойчивости к ДСН (додецилсульфату натрия) и ограниченной устойчивости к действию протеаз (Boudko et ai, 2002) Экспрессия гена wac в клетках Е coli BL21 (DE3) под контролем 11 промотора привела к суперпродукции растворимого и ограниченно ДСН-устойчивого фибритина Олигомерность белка анализировали путем электрофореза в 10% ДСН-ПААГ, на который наносили препараты белка в стандартном ДСН-буфере для образцов Образцы были нанесены в двух вариантах в первом варианте перед нанесением их прогревали 3-5 мин на кипящей водяной бане, во втором варианте их наносили сразу же после смешивания белкового препарата с буфером для образцов (рис 3)

Не прогретые образцы после окрашивания давали тонкую, высокоплотную полосу в верхней части геля, которая свидетельствует о том, что целевой белок находится в ДСН-устойчивом олигомерном состоянии

Для подтверждения того, что фибритин фага JS98C3 образует компактную нативную структуру, мы подвергли его ограниченному протеоли-зу К очищенному препарату фибритина в буфере для гидролиза мы добавляли трипсин в разных концентрациях

После 30 мин гидролиза при 37°С мы останавливали реакцию добавлением ФМСФ и анализировали продукты гидролиза электрофорезом в 10% ДСН-ПААГ(рис 3)

12 3 4 56 7 8 9

Рис. 3. Анализ экспрессии пг и'ас фага №98СЗ и его трипсинолиза в 10% ПААГ-ДСН: 1 - маркеры молекулярного веса; 2 - осветленный лизат; 3 -не прогретый перед нанесением осветленный лизат в ДСН-буфере для образцов; 4 - высоленный препарат пг чиас; 5 - тот же препарат, не прогретый перед нанесением; 6 - пг у/ас после обработки трипсином в концентрации 0,01 мг/мл; 7 — он же, не прогретый перед нанесением; 8 — пг \уас после обработки трипсином в концентрации 0,05 мг/мл; 9 - тот же препарат, не прогретый перед нанесением.

Анализ геля показал, что молекулярная масса пг м/ас после гидролиза трипсином несколько уменьшается, однако, даже при внесении трипсина до концентрации 0.05 мг/мл данный белок не гидролизуется полностью и остается олигомерным. Это свидетельствует об эффективном сворачивании исследуемого белка в компактную нативную структуру. Следовательно, имеющаяся делеция в «дополнительном» С-концевом домене не препятствует нормальному фолдингу этого белка.

2.5. Фибритин фага 1898СЗ с делецией части С-концевого домена. Для установления влияния С-концевого домена на фолдинг пг упас фибритина фага 1898СЗ, нами был получен его делеционный вариант,

оканчивающийся на С-конце стоп-кодоном в регионе, в котором происходит терминация трансляции гена \vcic бактериофага Т4 (сразу же за первым фолдоном) Для амплификации и секвенирования этого фрагмента гена мы использовали олигонуклеотидные праймеры 18Т12ир и (рис 4) Исходя из степени гомологии между фолдоном фибритина бактериофага Т4 и аминокислотным мотивом, фланкирующим проклонированную нами последовательность, мы ожидали получить в результате экспрессии растворимый олигомерный и ДСН-устойчивый продукт Однако уровень экспрессии оказался крайне низким, на уровне мажорных клеточных белков Исходя из полученных данных, мы предполагаем, что наличие аминокислотного мотива, гомологичного фолдону фибритина фага Т4 не обеспечивает быстрого принятия молекулой пг -мае фага 1598СЗ нативной конфор-мации Белок, находящийся в состоянии «расплавленной глобулы» в течение продолжительного времени, становится уязвимым для клеточных про-теаз, чем и объясняется наблюдаемое нами небольшое количество растворимого белкового продукта

2.6. С-концевой домен фибритина фага 1898СЗ. Для того, чтобы выяснить, способен ли С-концевой домен фибритина фага ^98СЗ к самостоятельной тримеризации, мы проклонировали последовательность, кодирующую С-концевой домен в плазмидный вектор Подобранные нами олигонуклеотидные праймеры ^Сё_ир ^Сс12_ир и ^СсПо (рис 4) позволили нам амплифицировать и проклонировать последовательность С-концевого домена в двух вариантах как с мотивом, гомологичным фолдону фибритина фага Т4 на М-конце, так и без него

1 ! I 3 4

6 5 2

Рис 4. Схеча расположения олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе. 1 - ЖП2ир, 2 - JSglЗlo, 3 - рСйир, 4 - }$Сс12ир, 5 -рСс11о, 6 - JsNdlo Серыми прямоугольниками отмечены последовательности, кодирующие аминокислотные мотивы, гомологичные фолдону бактериофага Т4

В силу того, что небольшие размеры С-концевого домена представляют препятствие для его экспрессии и осложняют манипуляции по очистке, мы проклонировали кодирующие его последовательности в плазмидный вектор рЕТ-32а, в одной рамке считывания с тиоредоксином Е сок (рис 5)

I 1 л 2 |l Thioredoxm || 3 [ [ C-domain

Рис 5 Схема участка плазмидной конструкции с С-концевым доменом фибритина фага JS98C3 Цифрами обозначены I - промотор Т7 РНК-попшеразы, 2 - öxHis tag, 3 - сайт узнавания сайт-специфической про-теиназы тромбин

Экспрессия С-концевого домена пг wac с такой относительно крупной глобулярной структурой как тиоредоксин на N-конце также позволяет оценить его способность образовывать стабильные химерные тримеры

Таким образом, нами были получены плазмидные конструкции pETCd (С-концевой домен обоими фолдонами) и pETCd2 (тот же домен без N-концевого фолдона) Соответствие нуклеотидной последовательности вставок расчетным последовательностям в обеих конструкциях было проверено секвенированием.

Белки, представляющие собой варианты С-концевого домена фибритина фага JS98C3, экспрессировались в Е coli в количестве, превышающем 40% суммарного клеточного белка Их электрофоретическая подвижность в 15% ДСН-ПААГ в прогретых образцах соответствовала предсказанной молекулярной массе (рис 6) Не прогретые перед нанесением образцы дали на ПААГ полосы, характерные для олигомерных белков, в верхней части геля. Мы очистили белки из осветленного лизата путем аффинной хроматографии на Co-NT А, после чего отщепили тиоредоксин гидролизом их сайт-специфической протеиназой тромбин Следующий цикл очистки на Co-NTA позволил нам очистить белки от тиоредоксина, который остался связанным со смолой Целевые белки прошли через колонку в свободном объеме сорбента После промывки промывочным буфером, мы элюировали тиоредоксин имидазолом, для того, чтобы убедиться в полноте гидролиза тромбином

Не прогретые перед нанесением на ПААГ образцы элюата не показали аномальной подвижности, характерной для олигомеров, в то время как образцы целевого белка из фракции «проскока» этим свойством обладали Это говорит о том, что гидролиз рекомбинантных вариантов С-концевого домена пг wac прошел полностью

В процессе очистки варианта С-концевого домена пг wac без N-концевого фолдона, нами было показано его уникальное свойство частично сохранять условно нативную конформацию после прогревания образца с ДСН до 90°С в течении 5-6 минут Полная утрата олигомерной конфор-мации данным белком происходила только прогревания его препарата с ДСН-буфером в течении 10-12 минут

123 45 678 9 10

Рис. 6. Анализ очистки вариантов С-концевого домена фибритина бактериофага №98СЗ в 17% ДСН-ПААГ. Порядок нанесения: 1, 10 - маркеры молекулярной массы; 2, б - тотальный препарат белков: с двумя фолдо-нами и без первого фолдона соответственно; 3, 7 — те же препараты, не прогретые перед нанесением; 4, 8 - второй этап очистки на Со-МТА (после гидролиза тромбином) с двумя фолдонами и без первого фолдона соответственно; 5, 9 - те же препараты, не прогретые перед нанесением.

Подобное свойство, ранее показанное только для фолдона пг 5 бактериофага Т4 (К.А. Мирошников, личное сообщение) говорит об очень высокой энергии, необходимой для плавления данного домена, либо о его способности к очень быстрой эффективной тримеризации, и может быть использовано для конструирования химерных тримерных белков.

2.7, Спектроскопия кругового дихроизма. Нами были сняты спектры кругового дихроизма полноразмерного фибритина фага 1898СЗ и его делеционных вариантов. Математическая обработка полученных спектров показала высокое содержание альфа-спиральных вторичных структур во всех исследованных образцах. Эти данные подтверждают наши предположения о высоком сходстве между вторичными и третичными структурами фибритинов бактериофагов Т4 и 1898СЗ. Обращает на себя внимание резкое отличие в соотношениях альфа- и бета- структур между двумя делеци-онными вариантами С-концевого домена фибритина. Выявленное большее количество альфа-спиралей в варианте С-концевого домена фибритина с одним фолдоном говорит в пользу того, что отсутствующий в этом белке И-концевой фолдон действительно представляет собой бета-пропеллерную структуру (рис. 7, табл. 1).

Табл. 1

Содержание элементов вторичных структур в целевых белках, рассчр-таняое по данным спектроскопии кругового дихроизма

Содержание элементов вторичной структуры, %

альфа- бета- Бета-

Образец спираль лист поворот непериодическая

Полноразмерный фиб-ритин 38 16 18 28

С-концевой домен с двумя фолдонами 25 20 22 33

С-концевой домен с одним фолдоном 42 16 14 28

180 190 200 210 220 230 240 250 250

Л, нм

Рис 7. Спектры кругового дихроизма в дальней УФ обчасти фибритина фага №98СЗ и его делеционных вариантов

2.8. Поиск последовательностей, гомологичных фолдону фибритина фага Т4 в СепВапк. Современные данные говорят о том, чго фолдон фибритина бактериофага Т4 представляет собой энергетически выгодное и очень стабильное состояние белковой молекулы (БиЛе е? а1, 2004) Ранее эта структура считалась уникальной Обнаруженные нами в фибритине фа-

ra JS98C3 аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомотогии с фолдоном фибритина фага Т4, а показанные физическими методами их свойства говорят об их сходной функциональной нагрузке

Факт того, что в фолдонах фаговых фибрилл возможны отклонения от «канонической» последовательности фолдона фибритина фага Т4, позволил нам сделать предположение о возможной широкой распространенности различных вариантов данного фолдона В связи с этим, нами был произведен поиск гомологий в базе данных GenBank

Для поиска нами была использована программа BLAST В качестве матрицы для запроса мы использовали аминокислотные последовательности фолдонов пг wac фага Т4, а также изолированного нами фага JS98C3 Извлеченные таким образом из базы данных последовательности были выровнены при помощи программы ClustalW 1 4 (рис 8)

10

20

I

Т4 RB32 RB69 KVP40

Geobacter benndjiensis Bern

BcepNazgul_l

BcepNazgul_2

BcepNazguI_3

BcepNazgul_4

JS98-C3_1 ~

JS98-C3~2

JS98_1 ~~

JS98_2

D3112

MP22

RB49

DMS3

Aehl_l

Aehl_2

Aehl_3

BeepFl

-MTIPEaPRDvQWVRKD' EWVLLSTFL--^YIPEAPKD CAYVRKD.EWVLLSTKL--.YIEDAPSD KFIVRKD OTVELPT^---DrvXiEAP?J5~QEIVBKDrQBVLPTXPT-

- AV DAPKD.KLiVRQtKRWVEIiVTWi--ar.IPDAPSDuVuIAKKDb^WTPVATGS-

- S&IPEAPAD . KQIARKNS >WREVQI PA-TAGIADAPSD1 ■TKYMRQN'NTWASFFTK—

- f СIPDR PNNA&Q?TRCQATWNVL<- AFV--TlabDAPMir.KL'yCRKDAaWAEIUJDT--RPPVAPTijy.LPiVLVDNAWVLLSDFV--OKL ~D=iP£D' KLi ARRMV WAE'ITVI. E --RPPVAPAAD LPtVLVDNAWVLLSD^-V-

- ,rMiXia.PSD^SNyAR!TM;EW КЬ~Тчй--J J4SDAP5D^SN1.KRNH AUiKL ТДЪ--•CKVDDVPDDOrHILRKR. EOTQV„Y? Л- "JMADAPSD' KRXARLNIWWA L* ГДД-FICL-DAPKDDAMYARKil VWT-?r\P ' HDbX-DAPSD^SYSaRNMSTWgKV.'J- V -TSAFDVPTDDKRYSRRii.. KWIQSYyiTC--- -.IQDAPDD FPYVRDSKEWSRLQ L3-

Рис. 8 Выравнивание аминокислотных последовательностей выявленных нами гомологов фолдона фибритина фага Т4

Данные гомологи были выявлены не только в последовательностях фибритинов бактериофагов, родственных Т4, но и в предполагаемых аминокислотных последовательностях белков некоторых бактериофагов, относящихся к семейству Лрйоуш^ае Обращает на себя тот факт, что в нескольких случаях, при больших размерах белка, фолдон-подобные по-

следовательности встречались неоднократно, например, в белке хвостовой фибриллы бактериофага BcepNazgul или в фибритине родственного Т4 фага Aehl Кроме того, последовательность, гомологичная фолдону фибри-тина Т4 была обнаружена в предсказанной аминокислотной последовательности гипотетического белка GbemDRAFT_3444 бактерии Geobacter betmdjiensis Bern

2.9. Моделирование вторичных и третичных структур фолдонов фибритина бактериофага JS98C3 in silico. Мы смоделировали вторичные и третичные структуры фолдонов фибритина фага JS98C3 при помощи программы Chimera В качестве матрицы для построения структур нами была использована pdb-модель фолдона фибритина фага Т4 1RFO (рис 9), депонированная в базе данных Protein Data Bank (http //www rcsb org/pdb/home/home do) под номером PF07921

Моделирование in silico возможных вторичных и третичных структур фолдонов фибритина бактериофага JS98C3 показало высокую степень их сходства с вторичными и третичными структурами фолдона фибритина фага Т4

Построенные нами модели с некоторой степенью достоверности объясняют результаты экспериментов с экспрессией делеционных вариантов пг wac фага JS98C3

1) Недостаточная эффективность фолдинга, а, следовательно, и низкий уровень экспрессии варианта фибритина без части С-концевого домена можно объяснить более релаксированной по сравнению с фол-доном фибритина фага Т4 структурой N-концевого фолдона (рис 9, 10)

2) Сохранение частично олигомерного состояния С-концевого домена после прогревания с ДСН возможно объяснить наличием в С-концевом фолдоне дополнительному альфа-спирального участка, не характерного для фолдона фибритина фага Т4 Этот участок предположительно стабилизирован относительно полипептидной цепи двумя водородными связями, и придает третичной структуре фолдона дополнительную жесткость, а также повышает температуру его плавления (рис 11,12,13)

Рис. 9. Модель четвертичной структуры фолдона фибритина фага Т4.

Рис. 10. Модель четвертичной структуры первого фолдона фибритина фага№8СЗ.

Рис. 11. Модель четвертичной структуры второго (С-кот1евого) фолдона фибритина фага ,1598СЗ. Стрелкой показан дополнительный участок альфа-спирали.

.А

/ : р

^I Р

Рис. 12. Предсказанная третичная структура С-концевого фолдона фибритина фага №98СЗ, Показаны водородные связи.

Рис. 13. Наложение третичной, структуры фолдона фибритина фага Т4 и С-концевого фолдона фибритина фага JS98C3. Светло-серым цветом обозначен фолдон фибритина фага Т4.

4. Выводы

1. Изолирован новый Т4-подобный энтеробактериофаг JS98C3. В последовательности фибритина этого бактериофага обнаружены аминокислотные мотивы, имеющие высокую степень гомологии с фолдоном фибритина фага Т4.

2. Показано, что С-концевой домен фибритина бактериофага JS98C3 способен к эффективной автономной тримеризации, что делает перспективным использование входящих в его состав фолдонов в белковой инженерии в качестве модулей, инициирующих фолдинг химерных белков.

3. В результате проведенного поиска в базе данных GenBank выявлено 16 новых аминокислотных мотивов, гомологичных фолдону фибритина фага Т4. Девять из вновь обнаруженных последовательностей находятся в последовательностях белков, не родственных фибритину, бактериофагов, относящихся к семейству Siphoviridae, что говорит о широкой распространенности подобных структур.

4. In silico моделирование вторичных и третичных структур вновь обнаруженных нами в GenBank аминокислотных мотивов подтвердило пред-

положение о сходстве их конформации с фолдоном фибритина бактериофага Т4, что может свидетельствовать об их сходной роли в фолдинге соответствующих белков

Список публикаций по теме диссертации

1 Латыпов O.P. Характеристика продукта гена wac бактериофага JS98C3, близкородственного фагу JS98 / O.P. Латыпов, А К Голо-мидова, А В Летаров // Ученые записки Казанского Государственного Университета, 2007, том 149, кн 4 стр 112-121

2 Латыпов O.P. Бактериофаг Т4 и семейство Т4-подобных бактериофагов Основы современной классификации бактериофагов, родственных Т4 / O.P. Латыпов, Д И Тазетдинова // деп в ВИНИТИ, 07 02 08, № 94-В2008

3 Латыпов O.P. Особенности структурной организации фибритина бактериофага JS98C3 / O.P. Латыпов, Д И Тазетдинова, А В Летаров // деп. в ВИНИТИ, 06 02 08, № 89-В2008

4 Латыпов O.P. Особенности фолдинга фибритина бактериофага Aehï роль продуктов дополнительных открытых рамок считывания и внутренних фолдонов / O.P. Латыпов, Е Е Куликов, Г M Криш, AB. Летаров // I Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» Тезисы докладов - Москва, 2005 - С. 74

5 Ботвинник Е.О Новая мутация, приводящая к фенотипической компенсации взаимодействия фибритин-ДХФ бактериофага Т4 / ЕО Ботвинник, O.P. Латыпов, А В Летаров // II Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» Тезисы докладов - Москва, 2006 - С 62

6 Латыпов О.Р Характеристика вирусных сообществ термальных источников кальдеры Узон (Камчатка) / O.P. Латыпов, Е С Баринова, Е,Е Куликов, А.В Летаров // II Международная молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии» Тезисы докладов - Москва, 2006 - С 25

7 Letarov A The function and evolution of fibntins in T4-related phages C-end of the story / A Letarov, O. Latypov and H M Krisch //1st Texas - Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting Book of Abstracts, - Kmgsville, Texas, 2006 - p 9

8 Тазетдинова Д И Перспективные методы сельскохозяйственной биотехнологии / ДИ. Тазетдинова, ФК Алимова, O.P. Латыпов, Р И. Тухбатова, А X Яппаров // Рекомендации - Казань, 2008 - С 11-24

Благодарности

Автор приносит свою искреннюю благодарность Ольге Воронцовой (ИБХ РАН) за помощь в получении спектров кругового дихроизма, а также Максиму Фильчикову (ИБХ РАН) за помощь в построении моделей вторичных и третичных структур.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел• 272-74-59, 541-76-41,541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 20 03.2008г. Усл. п.л 143 Заказ № К-6514. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать • ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Латыпов, Олег Рустамович

I. Введение.

I.I. Актуальность проблемы.

I.II. Цель и задачи работы.

I.III. Положения, выносимые на защиту.

I.IV. Научная новизна и практическая ценность работы.

I.V. Anpo6áijHH работы.

I.VI. Публикации по теме диссертации.

I.VII. Место проведения работы.

И. Обзор литературы.

II.I. Фолдинг белков и его основные закономерности.

II.IL Бактериофаг Т4. Семейство Т4-подобных бактериофагов.

II.IIL Современная теория эволюции Т4-подобных бактериофагов.20 II.IV. Фибритины Т4-подобных бактериофагов: особенности структуры, функции и эволюции.

ILV. Особенности структурной организации и олигомеризации фолдона фибритина бактериофага Т4.

II. VI. Методы предсказания и моделирования белковых структур.

III. Материалы и методы.

III.I. Штаммы бактерий.

III.II. Среды для культивирования и хранения бактерий.

IILIII. Изоляция бактериофагов.

III.IV. Библиотека случайных клонов, клонирование и выделение плазмидной ДНК.

III.V. ПЦР, олигонуклеотидные праймеры и секвенирование.

III.VI. Электронная микроскопия.

III.VIL Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация плазмидной ДНК.

III.VIII. Экспрессия, выделение и очистка пг wac и вариантов его Сконцевого домена.

III.IX. Ограниченный протеолиз.

III.X. Гидролиз тромбином.

III.XI. Спектроскопия кругового дихроизма.

III.XII. Предсказание вторичной и третичной структуры. i I I '

IV. Результаты исследования.

IV.I. Изоляция нового Т-чётного бактериофага JS98C3.

IV.II. Последовательность гена wac.

IV.III. Последовательность гена 36.

IV.IV. Анализ последовательности генов wac бактериофагов JS98 и

JS98C3.

IV.V. Экспрессия фибритина бактериофага JS98C3.

IV. VI. Ограниченный протеолиз фибритина бактериофага

JS98C3.

IV.VII. Экспрессия фибритина фага JS98C3 с делецией части Сконцевого домена.

IV.VIII. С-концевой домен фибритина фага JS98C3.

IV.IX. Спектроскопия кругового дихроизма.

IV.X. Поиск последовательностей, гомологичных фолдону фибритина фага Т4 в GenBank.

IV.XI. Моделирование вторичных и третичных структур фолдонов фибритина фага JS98C3 in silico.

V. Обсуждение результатов.

V.l. Изоляция бактериофага JS98C3 близкородственного фагу

JS98.

V.U. Анализ нуклеотидной последовательности гена wac бактериофага JS98C3.

V.Ш. Новые гомологи фолдона фибритина фага Т4.

VI. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика новых бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4"

I.I. Актуальность проблемы

Фибриллярный аппарат бактериофагов представляет собой уникальный объект для исследований, интерес к которому не ослабевает уже многие годы. В первую очередь, фаговые фибриллы привлекательны для исследователей простотой своего строения, которая при этом, в ряде случаев, сопряжена с бифункциональной нагрузкой. Кроме того, гены, кодирующие фибриллярный аппарат являются наиболее пластичным компонентом фаговых геномов, а потому представляют немалый интерес для иccлeдoвäния микроэволюционных событий.

Одним из наиболее исследованных на данный момент фаговых фибриллярных белков является фибритин бактериофага Т4 [Letarov A.V. et al., 2005]. Фибритин представляет собой комплекс «воротничок-бакенбарды», и кодируется геном wac. «Бакенбарды» представляют собой шесть фибрилл длиной 480 Á, отходящих от шейки фаговой частицы [Coombs D.H. et al. 1977]. Эти фибриллы способны временно связываться с ДХФ и должным образом ориентировать их для присоединения к базальной пластинке при сборке фаговой частицы [Efimov V.P. et al., 1994]. Кроме того, «бакенбарды» в случае бактериофага Т4 несут функцию молекулярного сенсора, предотвращающего инфекцию в неблагоприятных условиях (например, высокая ионная сила раствора, низкий pH). Данный сенсор функционирует за счет временного связывания С-концевого домена фибритина («бакенбарды») со средним участком ДХФ, что обеспечивает удерживание последней в поднятом состоянии [Conley М.Р., et al:, 1975]. Фибритин представляет собой тримерную альфа-спиральную coiled-coil структуру, фланкированную маленькими глобулярными N- и С-концевыми доменами [Efimov V.P. et al, 1994]. В то время как N-домен (50 а.о.) необходим только для прикрепления тримера к «шейке» бактериофага, С-концевой домен, состоящий из 30 а.о., несет двойственную функцию: он является затравкой фолдинга всей молекулы (фолдоном), а также играет важную роль в упомянутом выше связывании с ДХФ [Letarov A.V. et al., 1999].

Механизм инициации фолдинга фибритина бактериофага Т4 на данный момент описан весьма подробно [Meier S. et al., 2004, Guthe S., et al., 2004]. Методами рентгеноструктурной кристаллографии и ЯМР было показано, что гидрофобный кор и межмолекулярные связи внутри тримерной молекулы формируются за счет аминокислотного мотива GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL. Данный мотив (иначе называемый фолдон), как было показано в нескольких работах, является необходимым для эффективной инициации тримеризации и последующего фолдинга фибритина.

Для нативной тримерной молекулы фибритина была показана способность к ренатурации после нагревания, а также свойства ограниченной ДСН-устойчивости и ограниченной устойчивости к действию протеаз [Boudko S. et al., 2002]. Эти замечательные качества фолдона фибритина фага Т4 могут быть использованы при конструировании искусственных химер, например, как это было сделано в случае получения гибридного белка, состоящего из фолдона на N-конце, слитого с последовательностью бета-спиральной тримерной фибриллы аденовируса [Papanikolopoulou К. et al., 2004].

Современная биотехнология и практическая молекулярная биология испытывают острую необходимость в новых методах получения тримерных химерных белков. Без привнесения в аминокислотную последовательность надежных доменов, инициирующих тримеризацию, очень сильно усложняется исследование трансмембранных тримерных белков, а также отдельных доменов тримерных фибриллярных белков. Фолдон фибритина бактериофага Т4, несмотря на ряд его достоинств в качестве домена, инициирующего тримеризацию, во многих случаях не обеспечивает должной эффективности фолдинга тримерных химер. В связи с этим, в настоящий момент представляется актуальным поиск структур, альтернативных фолдону фибритина фага Т4, но способных инициировать тримеризацию более эффективно.

Помимо прикладного значения, обнаружение гомологов фолдона фибритина фага Т4 проливает новый свет на процессы горизонтального переноса генетического материала среди бактериофагов, а также позволяет сделать предположения о закономерностях фолдинга некоторых тримерных фаговых фибриллярных белков.

1.11. Цели и задачи работы

Цель проделанной нами работы - показать широкое распространение и разнообразие белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4 и охарактеризовать некоторые из них.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Поиск бактериофага, имеющего фибритин с фолдоном, отличающимся по аминокислотной последовательности от фолдона фибритина бактериофага Т4.

2. Дифференциальная физико-химическая характеристика фибритина вновь обнаруженного фага и его делеционных вариантов.

3. Поиск новых белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина бактериофага Т4 методами биоинформатики.

4. Моделирование вторичных и третичных структур обнаруженных нами доменов in silico.

I.III Положения, выносимые на защиту

1. В С-концевом домене фибритина бактериофага JS98C3 обнаружены два аминокислотных домена, гомологичных фолдону фибритина фага Т4. Данные домены, несмотря на имеющиеся отличия от последовательности фолдона фибритина бактериофага Т4, способны к автономной тримеризации.

2. С-концевой фолдон фибритина фага JS98C3 превосходит по прочности фолдон фибритина фага Т4 и может быть применен в белковой инженерии в качестве более надежного домена, инициирующего тримеризацию химерных белков.

3. Фолдон фибритина бактериофага Т4 не является уникальной структурой. Его гомологи широко распространены среди бактериофагов, относящихся к семействам Myoviridae и Siphoviridae.

I.IV. Научная новизна и практическая ценность работы

До последнего времени фолдон фибритина бактериофага Т4 считался уникальной структурой. Впервые было продемонстрировано широкое распространение бета-пропеллерных белковых доменов, гомологичных фолдону фибритина, причем большая часть выявленных гомологов данной структуры была обнаружена в последовательности белков бактериофагов, не родственных Т4. Также была показана возможность отклонения аминокислотной последовательности бета-пропеллерных доменов от «канонической» последовательности фолдона фибритина фага Т4. In silico моделирование третичной структуры одного из подобных доменов, обнаруженного в последовательности фибритина бактериофага JS98C3 показало наличие в ней дополнительного участка альфа-спирали, что делает данный фолдон более энергетически выгодным и более прочным, чем фолдон фибритина бактериофага Т4. Исследование физико-химических свойств данной структуры in vitro с высокой степенью достоверности- подтвердило результаты моделирования.

Дальнейшее исследование аминокислотного окружения, в котором были обнаружены многочисленные гомологи фолдона фибритина бактериофага Т4, в перспективе позволит получать химерные белковые конструкции с большей, чем в настоящий момент, эффективностью.

I.V. Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международной конференции «1st Texas — Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting», а также Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии — 2005» и «Актуальные аспекты современной микробиологии - 2006».

I.VI. Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано и сдано в печать 8 печатных работ (4 статьи и 4 тезиса). щ

I.VII. Место проведения работы

Работа выполнена в лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Спектры кругового дихроизма белков были получены в лаборатории структурной биологии Института Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. f

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

II.I. Фолдинг белков и его основные закономерности

Вопрос о механизмах, благодаря которым полипептидная цепь принимает свою нативную пространственную структуру, уже многие годы остается одним из наиболее актуальных в молекулярной биологии.

Изначально чисто фундаментальный вопрос о том, как же происходит фолдинг белка, стал в последние годы жизненно важным в познании природы самых разнообразных болезней. Такие тяжелые заболевания как боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, и муковисцидоз, как это было показано в последние годы, вызываются нарушениями в процессе фолдинга соответствующих белков [Hensley К. et al., 2006, Games D. et al., 2006, Harris D.A. et al., 2003]. Кроме того, понимание механизмов фолдинга существенно также для развития биотехнологии и биоинженерии. При экспрессии различных генов в гетерологичных системах, в следствие абберантного фолдинга, генно-инженерные белки часто накапливаются в клетках в виде нерастворимых тел включения [Lilie H. et al., 1998]. Дизайн белковых молекул de novo также ограничивается недостаточным пониманием механизмов фолдинга.

Со времен классической работы Анфинсена, в которой он показал, что рибонуклеаза А способна складываться в нативную структуру без внешнего воздействия, прошло уже более сорока лет [Anfinsen C.B. et al, 1961]. За это время молекулярная биология накопила уже довольно большой багаж знаний, который существенно расширил наше понимание механизмов фолдинга.

Еще в ранних исследованиях in vitro было показано, что процесс фолдинга происходит, как правило, во временном интервале от миллисекунд до секунд. Этот промежуток времени на порядки меньше, чем то время, которое потратила бы молекула белка, если бы в процессе фолдинга она принимала все возможные конформации. Основываясь на этом наблюдении, Левинталь сделал вывод, что в момент фолдинга не происходит случайного поиска конформации, и белки укладываются в соответствии с особыми «путями фолдинга» [Levinthal С., 1966]. В соответствии с этими путями, молекула белка проходит в процессе фолдинга через несколько строго определенных промежуточных частично структурированных состояний, которые часто называют «расплавленной глобулой». Естественно, что для коротких белков, состоящих из одного домена, нет необходимости в прохождении нескольких стадий фолдинга, и их укладка в нативное состояние происходит без интермедиатов [Jackson S.E. et al., 1991].

В настоящий момент основной теорией, описывающей закономерности фолдинга, является модель нуклеации-конденсации [Abkevich V.I. et al., 1994, Fersht A.R., 1997, Shakhnovich E.I., 1997]. В соответствии с этой моделью, для инициации фолдинга необходимо образование связей между небольшим количеством аминокислотных остатков с возникновением так называемого «ядра фолдинга» или фолдона. Сразу же после образования фолдона, белок быстро переходит в нативное состояние. Кооперативность процесса фолдинга белка аналогична кооперативности, показанной для реакций фазового перехода первого рода, которые протекают по механизму нуклеации и роста [Lifshits Е.М., 1981].

Модель нуклеации-конденсации основывается на данных, полученных in vitro и in silico, однако фолдинг белков in vivo часто происходит под влиянием двух важных факторов, которые тяжело рассчитать и учесть в эксперименте. Во-первых, фолдинг белков в клетке обычно осуществляется с участием молекулярной машинерии, например, шаперонов, причем зачастую в нем принимают участие мелкие молекулярные кофакторы. Молекулярные шапероны, такие, как, например, белок теплового шока Hsp70 и шаперонины, частично облегчают фолдинг, изолируя белки от основного объема цитозоля, а также препятствуя их неправильному сворачиванию и агрегации [Frydman J. et al., 1996, Martin J. et al., 1997]. Мелкие молекулярные кофакторы способны стабилизировать нативный фолд многих белков, а также ускорять их фолдинг [Wittung-Stafshede Р., 2002, Leckner J. et al., 1997]. Во-вторых, большое влияние на скорость фолдинга белков оказывает их концентрация, которая в клетках может достигать сотен граммов на литр [Luby-Phelps К., 2000].

II.II. Бактериофаг Т4. Семейство Т4-подобных бактериофагов

Бактериофаги, вирусы бактерий, - наиболее распространенные биологические объекты на нашей планете. По некоторым оценкам их количество превосходит количество бактерий в 5-25 раз [Baiter M., 2000, Fuhrman J.A., 1999], и в масштабах всей биосферы достигает лл

10JU [Brussow H. et al., 2002]. Только в океане бактериофаги ежедневно лизируют порядка 20% бактериальной биомассы (22% от тотальной океанической биомассы) [Suttle С.А., 2006].

Т4-подобные бактериофаги - это широко распространенная группа литических бактериофагов, имеющих генетические гомологии и морфологическое сходство с хорошо изученным фагом Е. coli Т4. Впервые Т4 и очень близкие к нему бактериофаги Т2 и Т6 были описаны в 1945 году, в классической работе Демерек и- Фано [Demerec M. et al., 1945]. Последующие работы Р. Эдгара и Д. Эпштайна показали максимальное удобство данного объекта для генетических исследований среди всех существовавших на то время моделей и сделали Т4 «рабочей лошадкой» зарождавшейся тогда молекулярной биологии.

На настоящий момент, бактериофаг Т4 является одним из наиболее подробно исследованных биологических объектов. Появившиеся вскоре после первых исследований фагов, методы электронной микроскопии [Ruska, H., 1940] позволили визуализировать фаговые частицы, и подразделить их на основе морфологического строения на семейства. Фаг Т4, в соответствии с его морфологией, был отнесен к семейству Myoviridae — бактериофаги с сократимым хвостовым отростком. Геном бактериофага Т4, картированный условно летальными мутациями еще в 1960-е годы, к настоящему моменту полностью секвенирован, и составляет без концевой избыточности 168 903 п.о. В данном геноме обнаружено 278 открытых рамок считывания, из них всего 62 являются необходимыми для нормальной репликации фага в лабораторных условиях [Miller, E.S. et al., 2003]. Экспрессия генов фага Т4 регулируется при помощи трех типов промоторов: ранних, средних и поздних [Mosig G. et al., 1994]. Несмотря на то, что фаг Т4 уже давно является объектом самого пристального внимания исследователей, функции 127 открытых рамок считывания в его геноме до сих пор остаются неизвестными.

Вирион фага Т4 состоит из головки, хвостового отростка с сократимым чехлом и стрежнем, базальной пластинки, а также длинных и коротких хвостовых фибрилл (Рис. 1). В районе «шейки» фаговой частицы, отделяющей головку от хвостового отростка располагается комплекс «воротничок-бакенбарды».

Головка бактериофага состоит из основного головочного белка (пг23), пг24, формирующего углы икосаэдра, а также инкрустирующих белков Нос и Soc [Fokine A. et al., 2004]. Через портальный' белок (пг20) и продукты генов 3, 13, 14 и 15 головка присоединяется к стержню хвостового отростка (пг19), окруженному сократимым чехлом (пг18). Оканчивается хвостовой отросток базальной пластинкой, состоящей из комплекса продуктов генов 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 и 12 [Ко81уисЬепко У.А. еГа1., 2005].

Рис. 1. Схема строения бактериофага Т4.

Пг 12 (короткие хвостовые фибриллы), а также присоединенные к базальной пластинке изогнутые длинные хвостовые фибриллы (ДХФ), сформированные из продуктов генов 34, 35, 36, и 37 являются

Головка

Длинные хвостовые фибриллы

Хвостовой отросток

Короткие хвостовые фибриллы

Базальная пластинка структурами, необходимыми бактериофагу для адсорбции на поверхность клетки-хозяина.

Комплекс «воротничок-бакенбарды», состоящий из гетероолигомера продуктов генов 13 и 14 («воротничок») [АкМег Т. et а1, 2007], а также шести тримерных молекул фибритина («бакенбарды») отделяет головку фаговой частицы от ее хвоста. Подробнее о структуре и функциях этого комплекса рассказывается в главе «Фибритины Т4-подобных бактериофагов: особенности структуры, функции и эволюции» данного обзора.

К концу 1990-х годов коллекция изолированных бактериофагов с морфологией близкой к Т4 выросла до такой степени, что назрела необходимость в четкой системе, позволяющей определить филогенетическое положение того или иного фага. Подобная система была создана в 2000 году Г. Криш и соавторами [Тё1аг1 Б. а а1., 2000]. В основу классификации помимо чисто морфологических признаков, таких как размеры головки фаговой частицы, легла степень гомологии нуклеотидной последовательности геномов бактериофагов, в частности - гомологий в генах основного структурного белка головки (ген 23), а также генах, кодирующих структурные белки хвостового отростка: стрежня (ген 19) и сократимого чехла (ген 18). В соответствии с данными признаками, Т4-подобные бактериофаги были подразделены на 4 группы (рис. 2).

Наиболее близко родственные Т4 бактериофаги относятся к группе истинно Т-чётных. Эти фаги имеют морфологию частицы, практически идентичную Т4 и отличаются друг от друга по нуклеотидной последовательности не более, чем на 5% \Lodiyzsi Б. et а1., 1991, МсРЬее1егБ Б.Б. et а1., 1988, Мопос! С. et а1, 1997, БеНск Н.Е. а/., 1993, ТИетег С.А. а1., 1998]. К этому семейству относятся такие бактериофаги, как Т2, Т4 и Т6.

Рис. 2. Филогенетическое дерево семейства Т4-подобных бактериофагов по Г. Крит и соавторам (Tetart et al., 2004).

К группе исевдо-Т-четных относятся эволюционно удаленные от Т4 бактериофаги, такие как RB42, RB43, RB49 и 44RR. Несмотря на то, что их морфология очень напоминает Т4, только 10% их ДНК гибридизуется с ДНК фага Т4 при жестких условиях. Нуклеотидные последовательности наиболее консервативного гена Т4-подобных бактериофагов, кодирующего основную структурную единицу головки (ген 23), у фагов этой группы имеют отличия от гена 23 фага Т4 до 30%. Для наиболее хорошо изученного бактериофага, относящегося к данной группе, RB49, показано еще одно яркое отличие от представителей истинно Т-четной группы, а именно — отсутствие средних промоторов.

Между истинно- и псевдо-Т-чётными фагами находится промежуточная группа, представленная RB69, Tula, SV40, JS98 и прочими фагами — химерами. Несмотря на последовательность гена 23, типичную для истинно Т-четных фагов, эти бактериофаги по свойствам своего генома близки к псевдо-Т-четным [Yeh L.S. et al., 1998]. Наличие данной группы говорит о наличии постоянного генетического обмена между истинно- и псевдо-Т-четными бактериофагами.

Третья группа Т4-подобных бактериофагов - шизо-Т-четные. К этой группе относят бактериофаги, изолированные на хозяевах, филогенетически удаленных от Е. coli, таких как представители родов Aeromonas и Vibrio. Подавляющее большинство фагов этого семейства имеет головку большего размера, чем у Т4 (137 нм вместо 111 нм). Соответственно, и их геном превосходит размерами геном фага Т4 (230-250 тыс. п.о. вместо 169 тыс. п.о. у Т4) [Matsuzaki S. et al., 1998]. Отличия в нуклеотидной последовательности геномов этих бактериофагов от истинно Т-четных бактериофагов еще больше, чем у псевдо-Т-четных, что можно объяснить не только их большими размерами, но и иным спектром хозяйской специфичности. Стоит отметить, что еще в 1987 году для Т4 были получены точечные мутации в гене 23, приводящие к увеличению длины головки фаговой частицы [Doermann А. Н. et al., 1987]. Возможность подобных преобразований говорит о том, что эволюционные трансформации от истинно- и псевдо-Т-четных фагов к шизо-Т-четным. могут происходить без особых препятствий.

Наиболее филогенетически и морфологически удаленной группой Т4-подобных фагов являются экзо-Т-четные бактериофаги. Для представителей данной группы характерна головка, имеющая форму изометрического икосаэдра (85 нм), а также более длинный, чем у Т4 хвостовой отросток (180 нм вместо 113 нм) [Hambly Е. et al., 2001]. Несмотря на столь явные отличия в морфологии, гомологии в нуклеотидных последовательностях генов 23, 18 и 19 позволяют отнести этих фагов к семейству Т4-подобных. Экзо-Т-четные бактериофаги были изолированы на цианобактериях родов Synechococcus и Prochlorococcus,

В настоящее время работы по секвенированию и систематизации геномов Т4-подобных бактериофагов активно продолжаются при поддержке Национального Фонда Науки США в лабораториях Г. Криш и Д. Карам. Вся собранная в результате этих исследований информация депонируется на Интернет-сайте http://phage.bioc.tulane.edu. Предполагается, что дальнейшее изучение геномов бактериофагов, имеющих морфологию, близкую к Т-чётным, позволит обнаружить фагов, еще более филогенетически удаленных от Т4, чем известные ныне шизо- и экзо-Т-четные. Исследования в этом направлении со временем, несомненно, смогут позволить нам реконструировать эволюционную историю Т4-подобных бактериофагов, а также расширить наше понимание биологии этих замечательных вирусов.

II.III. Современная теория эволюции Т4-подобных бактериофагов

За последние годы в нескольких лабораториях был проведен ряд сравнительных исследований геномов Т4-подобных бактериофагов [Mann N.H. et al, 2005, Miller E.S. et al., 2003, Nolan J. et al., 2006, Petrov V. et al., 2006, Sullivan M.B. et al., 2005]. На основании результатов этих исследований можно построить полный портрет Т4-подобного семейства, который по сути своей представляет собой кор из примерно 75 ключевых генов, окруженный пластичной периферией. При этом, количество ключевых генов зависит от исследуемой группы фагов. Так, например, если для бактериофагов Т4, RB49 и Aehl можно выделить примерно 90 коровых генов, то для филогенетически удаленных цианофагов количество общих с Т4 коровых генов составляет даже меньше, чем 45 для каждого. Подобные гены составляют костяк геномов фагов Т4-подобного семейства, и включают в себя большинство (но не все) необходимых генов фага Т4, такие как гены структурных белков вириона и ДНК-реплицирующего аппарата. Удивительно, но среди коровых генов также оказалось и несколько генов, функции которых пока не определены [Comeau A.M. et al., 2007]. Как и предполагалось ранее, гены, отвечающие за взаимодействие с клеткой-хозяином, такие как короткие и длинные хвостовые фибриллы, гены тРНК, гены ДНК-модифицирующих ферментов и прочие, оказались расположенными в гиперпластичных регионах геномов.

Лоскутная» структура генома включающая в себя как гиперпластичные регионы, так и консервативный кор, похоже, является исключительным свойством Т4-подобных фагов. В основанном на полных геномах филогенетическом древе по Роуэр и Эдварде [Rohwer F. et al., 2002], семейство Т4-подобных бактериофагов находится далеко не только от всех остальных фагов, но даже и от прочих фагов с сократимым хвостовым отростком. В общих чертах, фаги с несократимым хвостовым отростком, очевидно, имеют менее ограниченную эволюцию из-за того, что они способны обмениваться большими генетическими модулями с не родственными бактериофагами. Сравнения полных геномов показывают, что все Т4-подобные фаги имеют общие предковые последовательности, распределенные по геному. Множественные выравнивания геномов этих бактериофагов показывают более чем 50% идентичность последовательностей в вышеупомянутых коровых регионах.

Лямбдоидные фаги, представители семейства фагов с несократимым хвостовым отростком (Siphoviridae), напротив, обнаруживают намного меньшее количество предкового кора, который чаще всего располагается в правой половине их генома.

Бактериофаги этого семейства, включающего в себя колифаги и микобактериофаги [Pedulla M.L. et al2003] несомненно, могут замещать свои необходимые гены абсолютно неродственными функционально эквивалентными последовательностями [Hendrix R.W. et al., 2003, Lawrence J.G. et al., 2002]. Это свойство прямо противоположно свойствам Т4-подобных бактериофагов, которые, по всей видимости, имеют прочные барьеры, препятствующие обмену с близкими гомологами и защищающие общую синтению коровой группы генов [Filée J. et al., 2006]. К этим барьерам можно отнести большую комплексность фагов, родственных Т4, с их многочисленными белок-белковыми взаимодействиями между составными частями вириона и репликативной машины [Karam J.D. et al., 2000, Leiman P.G. et al., 2003]. Вне зависимости от этих утверждений, более строгое сохранение кластеров коровых генов ведет к «более вертикальному» пути эволюционного развития с ограниченным латеральным переносом генов,внутри этих кластеров и бурным латеральным переносом в гиперпластичных регионах.

Предполагается, что важность и протяженность латерального переноса генов зависит от комплексности бактериофага. Более просто организованные фаги могут извлекать из этого переноса гораздо большую пользу, чем сложные, в силу своей неприхотливой морфологической и энзиматической архитектуры. В качестве примера, здесь можно привести две подгруппы липид-содержащих бактериофагов семейства Tectiviridae, которые имеют простое строение, маленькие геномы (примерно 15' т.п.н.), организованные сходным образом, но не имеют сколько-либо значимых гомологий в последовательностях [Ravantti J.J. et al., 2003, Saren A.M. et al., 2005]. Что же касается больших и комплексных фагов, родственных Т4, то они могут извлекать пользу из латерального переноса в ограниченных гиперпластичных регионах генома, не затрагивающих их слаженный и живучий генетический кор.

Комо с соавторами [Comeau A.M. et al2007] полагают, что консервативный кор, состоящий из генов репликативной машины и структурных генов вириона, изначально возник в результате сборки из модульных составляющих. Однако, как только эти составляющие более «притерлись» друг к другу, возможностью больших модульных перестановок было пожертвовано.

II.IV. Фибритины Т4-подобных бактериофагов: особенности структуры, функции и эволюции

Продукт гена wac бактериофага Т4, белок фибритин, входит в состав комплекса "воротничок-бакенбарды", который локализован на частице бактериофага в месте соединения головки фаговой частицы и хвостового отростка - "шейке" (Рис. 3).

Рис. 3. Схема строения бактериофага Т4 и его фибритина. Справа — схема структурной организации фибритина - тримерной альфа-спиральной соИей-соИ (из Ье1аго\ е1 а!., 2005).

Воротничковые нити, которые представляют собой фибриллы, размерами примерно 48x2 нм, впервые были обнаружены при помощи электронной микроскопии еще в 1970 году в лабораториях Янагида и Диксона [Yanagida M. et al., 1970, Dickson R. et al., 1970]. Свое название, «фибритин», данный белок получил в 1988 году, когда он привлек внимание группы исследователей под руководством В.В. Месянжинова [Prilipov A.G. et al., 1988].

Несколько позже, основываясь на анализе аминокислотной последовательности, данных спектроскопии кругового дихроизма и экспериментах с делеционными вариантами фибритина, В.В. Месянжинов с коллегами сделали вывод о том, что фибритин имеет параллельную альфа-спиральную coiled-coil структуру [Efimov V.P. et al.,, 1994]. К, настоящему моменту методами рентгеноструктурной кристаллографии разрешены структуры целой серии делеционных вариантов фибритина бактериофага Т4 [Boudko S.P. et. al., 2004, Strelkov. S.V. et al., 1998, Strelkov S.V. et al., 1996]. Согласно данным,, полученным, на основании этих структур, фибритин представляет собой тримерную фибриллу, длиной 480 А, которую можно разделить на три домена, отличающихся по своему строению и функции. Глобулярный N-концевой домен фибритина состоит из 50 а.о. и служит для прикрепления данного белка к «шейке» фаговой частицы. Средняя часть фибритина представляет собой тримерную параллельную альфа-спиральную coiled-coil фибриллу, содержащую 13 сегментов с гептадными повторами, перемежающиеся- петлями [Efimov V.P. et al., 1994]. На С-конце фибритин оканчивается еще небольшим (30 а.о.) глобулярным доменом, который служит затравкой для фолдинга всей молекулы [Letarov A.V. et al., 1999].

Фибритин функционирует как молекулярный шаперон, ускоряющий объединение проксимальной и дистальной половинок длинных фибрилл и их присоединение к частице фага [Wood W.B. et al., 1994].

Мутации по гену wac в непермиссивных условиях не имеют летального характера. При росте штаммов фага с амбер мутацией длительность инфекционного цикла на семь минут больше, чем у дикого типа фага. В культуре на твердой среде бляшки wac — дефективных штаммов имеют уменьшенный размер, а в жидкой культуре выход инфекционных фаговых частиц уменьшается в 5-10 раз по сравнению с диким типом [Conley М.Р. et al., 1975]. Фибритин также может рассматриваться как простейший молекулярный сенсор, позволяющий модулировать адсорбцию бактериофага в зависимости от условий среды. Известно, что длинные хвостовые фибриллы на частице фага могут находиться в двух положениях: "down", при котором они направлены вниз и способны к адсорбции на клеточной стенке, и "up", при котором они, взаимодействуя с бакенбардами, отогнуты вверх, вдоль стержня хвостового отростка, и не активны [Conley М.Р. et al., 1975, Follansbee S.E. et al., 1974]. Положение "up" является реакцией на ряд внешних условий окружающей среды - оно имеет место при рН ниже 5, низкой ионной силе, низкой температуре, а так же низких концентрациях полиэтиленгликоля [Follansbee S.E. et al., 1974]. Таким образом, с помощью пг wac бактериофаг Т4 обеспечивает простейшую реакцию на изменение внешней среды. Этим объясняется также способность мутантов фага Т4 по гену wac адсорбироваться на клетках в присутствии полиэтиленгликоля, тогда как адсорбция фага дикого типа полностью подавляется в этих условиях.

Также высказано предположение, что переход длинных фибрилл в опущенное положение в определённых условиях может модулироваться следовыми концентрациями различных метаболитов бактерий и / или изменением кластерной структуры воды в ближайшей окрестности бактериальной клетки. Опускание фибрилл приводит к резкому увеличению эффективного гидродинамического радиуса вирусной частицы и уменьшению амплитуды броуновских движений, что должно приводить к некоторому концентрированию вируса вблизи бактерии (то есть к таксису) [Ivanitskii G.R. et al., 1975].

Бактериофаги, наиболее близко родственные Т4, истинно Т-четные, такие как Т2 и Т6, имеют пг wac, практически идентичные фибритину фага Т4. Однако, подобная картина отнюдь не характерна для бактериофагов, принадлежащих к более удаленным филогенетическим группам. В 2005 году Летаровым и соавторами была определена нуклеотидная последовательность генов wac серии бактериофагов, относящихся к истинно- шизо- и псевдо-Т-четным [Letarov A.V. et al,, 2005]. Анализ данных последовательностей показал, что наиболее консервативной частью гена wac является его фрагмент, кодирующий N-концевой домен.

Центральная, фибриллярная часть оказалась более пластичной, что связано с тем, что она не участвует в белок-белковых взаимодействиях. Единственное ограничение, которое накладывается на ее последовательность, связано с периодичностью гидрофобных аминокислотных остатков, формирующих гидрофобный кор coiled-coil. Стоит отметить, что в coiled-coil альфа-спирали вытянуты, и потому на один оборот спирали приходится 3,5 а.о., вместо обычных 3,6 а.о. Вследствие этого, аминокислотные остатки а и d из гептады (abc<sfefg) образуют гидрофобную полосу на одной из сторон спирали. Взаимодействие между этими гидрофобными полосами трех скрученных субъединиц coiled-coil является необходимым для формирования кора и важным для стабилизации нативной фибриллы. Присутствие отличающихся гидрофобных остатков в позициях гептады and может сказываться на количестве альфа-спиралей, формирующих coiled-coil, однако, в случае молекул, сходных с фибритином, которые имеют ядро фолдинга на С-конце, это количество становится не столь важным. Летаровым и соавторами было показано на примере пг \vcic фагов ЯВ49 АеЫ, что фибритины, имеющие отклонения в гептадной периодичности соПеё-сой способны к эффективной тримеризации, и входят в нативном состоянии в состав зрелых фаговых частиц [Ье1агоу А.У. а1., 2005].

Наибольший интерес в плане разнообразия представляет С-концевой домен фибритинов фагов, родственных Т4. У всех бактериофагов, имеющих отличие от Т4 по аминокислотной последовательности более 20%, С-концевые домены оказались различными (Рис. 4).

Так, например, у бактериофага ЯВ49 гомология с фибритином фага Т4 заканчивается в районе Тгр476 (по координатам Т4), и последние 10 а.о. С-концевого домена замещены на 143 а.о. неизвестного происхождения. Аналогично, у фагов ЯВ42 и 11В43 после в1п455 располагается новый С-концевой домен длиной в 322 а.о., имеющий гомологии с белками, содержащими иммуноглобулин-подобный фолд [На1аЬу Б.М. а1., 1999].

Иммуноглобулин-подобно уложенные фрагменты трижды повторяются в данном домене в виде дефектных тандемных повторов. Не менее интересен гигантский фибритин шизо-Т-четного бактериофага АеЫ, который состоит из 1035 а.о. и нуждается в специфическом молекулярном шапероне для корректной укладки в нативную конформацию [Ье1агоу А.У. е? а1., 2006]. Его С-концевой домен, длиной 612 а.о. имеет слабые гомологии с некоторыми фибриллярными белками профагов, что может говорить о сходстве их структур и возможном общем происхождении.

Т4

40fia.a

RB49

375a. a Г

143.a.a

KB42

320a. a.

Ч>. а. а 11

394а. а

42

34la,a

Aehl

373a.a.

612 a,a.

Рис. 4. Структурная организация пг и'ас бактериофагов, родственных Т4. Светло-серым цветом обозначен центральный, соИес1-соИ домен, серым квадратом — И-концевой домен, серым кругом - фолдон фибритина Т4, прямоугольниками разных оттенков - новые С-копцевые домены, (из ЬеХагом е( а!., 2005).

Наиболее интересным из исследованных Летаровым и соавторами фибритинов, представляется фибритин бактериофага 42, изолированного на Burkholderia cepacia. Пг wac этого фага имеет стоп-кодон в регионе гомологии с coiled-coil частью фибритина бактериофага Т4 (то есть не имеет фолдона), и в Е. coli экспрессируется в виде телец включения. Исследователи остановились на двух вариантах в отношении данного гена: либо фолдинг его продукта осуществляется при помощи каких-либо молекулярных шаперонов бактерии-хозяина или самого фага, либо уровень его экспрессии с естественными регуляторными последовательностями настолько низок, что не допускает агрегации.

Авторами также был проведен генетический анализ генов 36 бактериофагов, у которых были обнаружены новые разновидности С-концевого домена фибритина. Этот ген кодирует изгибающуюся часть длинных хвостовых фибрилл Т4-подобных фагов, которая у бактериофага Т4 отвечает за взаимодействие «фибритин-ДХФ» [Letarov A.V. et al., 2005]. Во всех проанализированных случаях имели место изменения в области, отвечающей за С-концевой домен пгЗб, в котором, по всей вероятности, расположена мишень вышеупомянутого взаимодействия.

Таким образом, на данный момент очевидно, что часть гена wac, кодирующая С-концевой домен фибритина, у бактериофагов, родственных Т4 относится к гиперпластичным регионам, наряду с генами, кодирующими длинные хвостовые фибриллы, что может быть объяснено необходимостью согласованной замены взаимодействующих компонентов молекулярного сенсора.

II.V. Особенности структурной организации и олигомеризации фолдона фибритина бактериофага Т4

Роль С-концевого домена в фолдинге фибритина стала очевидной при первых же попытках экспрессии мутантных вариантов пг wac с делециями, затрагивающими последние 30 а.о. [Efimov V.P. et al., 1994]. Именно в отношении этого домена, за его способность инициировать тримеризацию белков in vitro и in vivo, впервые был применен термин «фолдон» [Sobolev B.N. et al., 1995]. Небольшие размеры структурированной части (27 а.о.) и простой фолд делают фолдон фибритина бактериофага Т4 исключительно удобным объектом для изучения закономерностей фолдинга. Во всех предыдущих исследованиях фолдинга гримерных белков применялись большие фибриллярные белки, для которых характерна крайне медленная и комплексная кинетика фолдинга, зачастую сопровождающаяся необратимыми реакциями агрегации [Seckler R., 2000].

Фолдон фибритина бактериофага Т4 представляет собой три мерный бега-пропеллер, собранный из м он о мерных бета-шпилек (Рис. 5).

Тример стабилизируется за счет гидрофобных взаимодействий между Тгр476 (по нумерации с начала фолдона Тгр20 (W20)) каждой субъединицы, межмолекулярных солевых мостиков между Glu461 (Е5) и Arg471 (R15), а также межмолекулярных водородных связей между Туг469(У13)и Arg471(R15). Экспрессия изолированного фолдона (аминокислотные остатки 457-483) приводит к образованию стабильного тримера, для которого характерна двустадийная кривая плавления [Frank S. el al., 2001].

Рис. 5. Строение фолдона фибритина бактериофага Т4. Слева -схема внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий. Справа - модель четвертичной структуры (из Meier et al., 2004).

Тримеризация фолдона также происходит в две стадии, причем скорость образования тримерного фолдона настолько высока, что ее можно сравнить с скоростью образования димеров у самых быстро укладывающихся димерных белков [Guthe S. et al., 2004]. Ассоциация начинается с мономеров с частично скрытыми гидрофобными аминокислотными остатками, в эту же форму белок переходит при понижении рН до 2 [Guthe S. et al., 2004]. Диссоциация комплекса при понижении рН происходит за счет нейтрализации заряда Е5 в сильном межсубъединичном солевом мостике E5-R15, при этом мономеры сохраняют свою структуру - бета-поворот 1 типа. Стабильность этой структуры обеспечивается наличием в ней временных гидрофобных внутрицепочечных взаимодействий и локальной склонности полипептидной цепи к образованию поворота [Muñoz V. et al., 1998, Espinosa J.F. et al., 2001]

К настоящему моменту для фолдона фибритина фага Т4 детально охарактеризованы большое количество физико-химических характеристик равновесного состояния «мономер-тример», а также высокотемпературной денатурации его мономерной формы, полученной при низких значениях рН. Кроме того, методами ядерно-магнитного резонанса выявлены, практически все диполь-дипольные взаимодействия в данном белке [Meier S. et al., 2004]. Таким образом, несмотря на некоторое количество «белых пятен»,, фолдон можно считать одним из наиболее подробно изученных олигомерных белков.

II.VI. Методы предсказания и моделирования белковых структур

Понимание структурной организации белков остается краеугольным вопросом в молекулярной биологии уже более 50 лет. Вплоть до последних двух десятилетий, единственным надежным инструментом для исследования белковых структур был метод непосредственного разрешения структуры исследуемого белка.

Однако, бурное развитие компьютерных технологий не могло не повлиять на изменение подходов к данной проблеме, и к настоящему моменту появилась возможность предсказания структуры многих простых белков in silico.

Современные методы предсказания белковых структур по своим походам разделяются на два направления: предсказание ab initio (на основании первых основополагающих принципов структурной организации белков, без привлечения дополнительных эмпирических предположений) и предсказание. на основе матрицы (белков, структура которых уже разрешена физическими методами).

Подход ab initio считается очень, перспективным, и со временем, несомненно, станет основным методом предсказаний. К сожалению, на данный момент он позволяет делать предсказания структур с очень низкой точностью, причины которой лежат в высокой комплексности проблемы, недостаточном уровне наших познаний, а также низкой вычислительной мощности современных компьютеров [Helles G., 2007].

Другой подход, предсказание по матрице, уже сейчас позволяет довольно точно предсказать структуры многих простых белков. В основе данного подхода лежит построение моделей структур белков на основе матриц — фолдов белков, структура которых уже разрешена и депонирована в базе данных PDB (Protein Data Bank). К настоящему моменту в этой базе данных, расположенной по адресу http://www.pdb.org/ депонированы структуры 48780 белков^ причем ежемесячно их список увеличивается на 300 структур.

Ключевым шагом в предсказании, основанном на матрице, является распознание белков, которые имеют сходные четвертичные структуры. Для идентификации сходных фолдов исходно применяются несколько методов выравнивания последовательностей: «последовательность-последовательность», «последовательностьпрофиль», «профиль-профиль» и «последовательность-структура».

Наиболее старый метод, «последовательностьпоследовательность», разработанный в 1970-е годы, лег в основу широко применяемого инструмента BLAST [Altschul S.F. et al., 1990]. Данный метод относительно прост и эффективен при работе с большими массивами информации, однако точность его ограничивается возможностью обнаружения гомологов лишь среди белков с 40% идентичностью последовательностей [Vingron M. et al., 1994].

Выравнивания по методам «последовательность-профиль» или «профиль-последовательность» [Baldi P. et al., 1994, Bailey T. et al., 1991, Park J. et al., 1998, Gough J. et al., 2001] более чувствительны при обнаружении удаленных гомологов с идентичностью последовательностей от 20%. Профили могут относиться к простым множественным выравниваниям, позиция-специфичным матрицам подсчета (PSSM), или скрытым моделям Маркова.

Методы выравнивания «профиль-профиль», такие как CLUSTALW [Thompson J. et al., 1994] выгодно отличаются от методов «последовательность-профиль» тем, что их алгоритмы учитывают индивидуальный вес каждого фрагмента выравниваемых последовательностей, варьированием матриц аминокислотных замен, а также учетом значимости коротких инсерций/вставок [Wang G. et al., 2004, Edgar R. et al., 2003, Edgar R. et al., 2004, Soding J., 2005].

Наиболее сложный метод, «последовательность-структура», основывается на выравнивании исходной последовательности с шаблонами структур, уже разрешенных физическими методами, с последующей оценкой совместимости в соответствии с структурной адекватностью внешней среде и контактным потенциалам [Bowie J. et al., 1991, Murzin A. et al., 1995, Murzin A. et al., 1997, Kim D. et al., 2003]. Этот метод наиболее подходит для обнаружения белков, имеющих сходный фолд, однако не имеющих распознаваемого эволюционного родства.

К настоящему времени границы между методами, основанными на последовательности и методами, основанными на структуре, становятся все более зыбкими. Разрабатываются новые и новые методы, сочетающие оба вида информации, что повышает как качество распознания фолда [Panchenko A. et al., 2000, Shan Y. et al., 2001], так и качество выравнивания [Tang С. et al., 2003, O'Sullivan О. et al., 2004].

Один из наиболее популярных в настоящий момент методов — алгоритм TASSER представляет собой иерархический подход к предсказанию белковых структур (Рис. 6).

Он основан на выравнивании «последовательность-структура» с последующей сборкой четвертичной структуры путем перестановки протяженных фрагментов шаблона. На момент своей разработки этот алгоритм позволил построить на основании последовательностей модели 1487 из 1498 протестированных белков с среднеквадратичным отклонением менее чем в 6 Â. При этом, довольно высокая точность была получена даже при построении моделей нерегулярных участков белков [Zhang Y. et al., 2004]. В случае со структурами, близкие гомологи которых имеются в Protein Data Bank, среднеквадратичное отклонение в моделях TASSER уменьшается до 2 À [Zhang Y. et al., 2008].

Structure assembly kyy

Template Native Final Model

Рис. 6. Схема работы метода предсказания белковых структур I-TASSER (из Zhang К, 2008).

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

III.I. Штаммы бактерий

В качестве индикаторного штамма мы использовали дериват штамма coli К12 С600 (F-, thi-1, thr-1, leuBó, lacYl, tonA21, supE44). Для клонирования и получения плазмидной ДНК нами применялся штамм Е. coli DH5 (F-, thi-1, gyrA96, supE44, hsdR17, recAl, endAl, relAl). Экспрессию гена wac проводили в клетках Е. coli штамма BL21 (DE3) (gal hsdS (Лс/857 ind-1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene).

III.II. Среды для выращивания ихраиеиия бактерий t

Для культивирования бактерий использовали жидкие питательные среды LB и 2xTY бульон [Sambrook J. et al., 1989].

В качестве твердых питательных сред использовали LB и 2xTY среды содержащие 1,5% агара (Difco, США). Все среды стерилизовали автоклавированием. Для отбора клонов бактерий, устойчивых к антибиотикам, использовали среды, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Для кратковременного хранения бактериальных культур использовали чашки Петри с LB-агаром, которые хранили при 4°С. Для длительного хранения при — 70°С в жидкую среду с бактериальной культурой добавляли глицерин до конечной концентрации 15% (по объему).

III.III. Изоляция бактериофагов

Проба фекалий лошади (20 г) была гомогенизована в 80 мл фагового буфера (0.2 М NaCl, 0.1 г/л азида натрия, 1 г/л Tween 20).

Затем суспензия перемешивалась на роторной качалке 1 ч при комнатной температуре, после чего аликвоты были центрифугированы в течение 2 мин на микроцентрифуге при 12000 об/мин. Супернатант использовался для высева на газон индикаторного штамма.

III.IV. Библиотека случайных клонов, клонирование и выделение плазмидной ДНК

Для получения случайных клонов ДНК бактериофага JS98C3, гидролизованную эндонуклеазой рестрикции Dral, осаждали этанолом, после чего ресуспендировали в деионизованной воде и клонировали в плазмидный вектор T-system PCR cloning kit (Promega, США) в соответствии с инструкциями производителя. В этот же вектор клонировали фрагмент генома фага JS98C3, кодирующий ген wac.

Для клонирования фрагментов гена wac фага JS98C3, кодирующих варианты С-концевого домена фибритина мы использовали плазмидный вектор рЕТ-32а (Novagen, США). Вектор и вставки гидролизовали в течение 1 часа при 37°С эндонуклеазами рестрикции Ncol и Xhol (Fermentas, Литва) в буфере, рекомендованном производителем, затем, после осаждения этанолом и отмывки лигировали ДНК-лигазой бактериофага Т4 (Fermentas, Литва) в течение часа на столе.

Плазмидную ДНК выделяли при помощи набора Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, США).

III.V. ПЦР, олигонуклеотидные праймеры и секвенирование

Для ПЦР-амплификации и секвенирования случайных клонов из плазмидной библиотеки нами применялись стандартные праймеры M13F и Sp6 (Fermentas, Литва). Для обнаружения бактериофагов, родственных Т4 мы применяли вырожденные олигонуклеотидные праймеры к гену 23, MZIAlbis (5'-GAT ATT TGI GGI GTT CAG CCI ATG А) и MZIA6 (5'-CGC GGT TGA TTT CCA GCA TGA TTT С) в концентрации 0.5 пМ/мкл. Ген wac амплифицировали и секвенировали с использованием олигонуклеотидов JST12up (5'-AGT TAC CAT (T\A)(T\C)G TTG A(C\T)G GC), JS131o (5'-ATA AAA AGC CTG ATA ACC TTT), JS98wacM (5'-AAC CGA GTT GAT ATT CTG G) и jsNdlo (5' -TTT TTT CCA TGG TTA AGT GTC АТС AAG GAT TTC AGC CC). Для амплификации и секвенирования гена 36 использовали олигонуклеотиды JS9835up (5'-GAA TTT GG(T/C) GT(A/C) AAT GGT ATT CG) и JS98g371o (5'-TCT TTT AAG TTA ATA GCC AG(C/T) TC(G/A) CCT TC(A/G) GC). Фрагменты C-концевого домена амплифицировали при помощи олигонуклеотидов jsCdlup (5' -TTT TTT CCA TGG GTC AAA TGC СТА СТА AAT TGG G), jsCd2up (5' -TTT TTT CCA TGG GTA CAG AAA TTG ATA CGG ТС) и jsCdlo (5' -TTT TTT CTC GAG GCC CTT TTG TTA TGG TGC TGG G).

ПНР-амплификация производилась в 50 мкл ПЦР-буфера (67 мМ Tris-HCl (pH 8.3), 17 мМ (NH4)2S04, 0.001% Tween 20, 2.5 мМ MgCl2) с Taq- полимеразой производства Sigma (США), 1.25 ед. акт. В т качестве матрицы для скрининга использовался 1 мкл экстракта фаговой бляшки. Матрицей для амплификации генов wac и 36 служил 1 мкл лизата бактериофага JS98C3 с титром 10б б. о. е./мл.

Полимеразную цепную реакцию проводили в приборе MJ Mini (Bio-Rad, США) в соответствии с программой: первичная денатурация - 3 мин при 93°С, затем 25 циклов, состоящих из 40 с денатурации при 93°С, 30 с отжига при 56°С и 45 с элонгации при 72°С. Завершалась программа финальной достройкой в течение 3 мин при 72°С. ПЦР-продукты анализировались путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле в IxTAE буфере с окрашиванием бромистым этидием [Sambrook J. et al., 1989]. Секвенирование ПЦР-продуктов и случайных клонов проводили на автоматическом секвенаторе Avant 3150 (Applied Biosystems, США) с использованием реактивов фирмы-производителя.

III.VI. Электронная микроскопия.

Каплю фагового лизата наносили на медную сетку с формвар-углеродным покрытием, после 5 мин' инкубации на столе каплю отбирали фильтровальной бумагой. Затем препарат контрастировали 1%-ным уранилацетатом и* исследовали при помощи электронного микроскопа Jeol 100S (Япония) при 25000хувеличении.

III. VII. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация плазмидной ДНК

Клетки Е. coli из одиночной колонии вносили в 2 мл 2xYT бульона и выращивали при 37°С в течение ночи. Ночную культуру разводили в 100 раз 2xYT бульоном и подращивали при 37°С до достижения оптической плотности 0,6 (при длине волны 600 нм). Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 1/5 исходного объема 0,1 M MgCl2, охлажденном во льду. Смесь инкубировали во льду 10 мин, затем добавляли равный объем 0,1 M СаС12 и инкубировали еще 20 мин во льду. Затем клетки осаждали центрифугированием при тех же условиях и осадок ресуспендировали в 1/25 исходного объема 0,1 M СаС12. Затем добавляли 1/100 исходного объема 80% глицерина и расфасовывали клеточную суспензию по 0,2 мл. Полученные таким образом препараты хранили при -70°С.

Для проведения трансформации 100-200 мкл суспензии компетентных клеток Е. coli размораживали во льду, добавляли ДНК и инкубировали 20-40 мин во льду. Затем нагревали при 42°С в течение 1,5-2 мин, охлаждали 1-2 мин во льду, добавляли 500 мкл 2xYT бульона и инкубировали 45-60 мин при 37°С. Клеточную суспензию высевали на чашки Петри, содержащие твердые среды.

III.VIII Экспрессия, выделение и очистка пг wac и вариантов его С-копцевого домена

Культуру клеток Е. coli BL21 (DE3), трансформированных плазмидной конструкцией с геном, кодирующим целевой белок, подращивали при интенсивной аэрации на среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, при 37°С до OD590 = 0.7. Затем мы индуцировали экспрессию целевого гена добавлением ИПТГ (изопропил-Р-О-тиогалактопиранозид) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали культуру при интенсивной аэрации и 37°С еще 4 ч. Биомассу осаждали центрифугированием при 6000 g и температуре 4°С в течение 20 мин, после чего ресуспендировали осадок в буфере для лизиса (50 мМ натриево-фосфатный буфер (pH 7.0), 300 мМ NaCl). К клеточной суспензии добавляли лизоцим до 300 мкг/мл и ДНКазу I до 5 мкг/мл, после 20 мин инкубации на столе она была разрушена при помощи ультразвукового дезинтегратора. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 10000 g и 4°С в течение 10 мин. К осветленному лизату по каплям при интенсивном перемешивании добавляли (NH4)2S04 до 25% от насыщения, затем после 20 мин инкубации при 4°С высоленный белок осаждался центрифугированием при 10000 g и 4°С в течение 10 мин.

Грубую очистку целевого белка проводили несколькими циклами дифференциального высаливания насыщенным раствором сульфата аммония.

Варианты С-концевого домена пг wac очищали при помощи аффинной хроматографии на колонке с Co-NTA смолой Talon (Clontech, США) в соответствии с инструкцией производителя. Предварительно очищенный высаливанием раствор целевого белка наносили на колонку с 1 мл смолы. После промывки 10 мл промывочного буфера (50 мМ натриево-фосфатный буфер (pH 7.0), 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазол), белок элюировали 2 мл буфера для элюции (pH 7.0), 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол). Затем раствор белка диализовали* против 500 мл буфера.для гидролиза тромбина (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 150 мМ NaCl, 2,5 тМ СаС12) в течение ночи при 4°С.

После гидролиза тромбином, белки вновь диализовали против буфера для лизиса, затем проводили еще один цикл очистки на колонке с Co-NTA.

Степень очистки целевых оценивали при помощи ДСН-ПААГ электрофореза в 10% (пг wac и его N-концевой домен) или 15% (варианты С-концевого домена) акриламидном геле по методике Лэммли [Sambrook J. et al., 1989] с окраской Кумасси R-250, а также путем измерения соотношения оптической плотности раствора при длинах волн в 260 и 280 нм. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Брэдфорд, с использованием набора реактивов BioRad (Bio-Rad, США), согласно инструкции фирмы-изготовителя.

III.IX. Ограниченный протеолиз

К белку в буфере 50 мМ трис-HCl, pH 8.0, 1 мМ СаСЬ добавляли трипсин (Serva, США) в различных соотношениях и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением ФМСФ до концентрации 2 мМ. Затем добавляли двукратный буфер для образцов, нагревали 3-5 мин в кипящей воде и наносили на ПААГ с ДСН.

III.X. Гидролиз тромбином

Для отщепления вариантов С-концевого домена пг wac от слитого с ними тиоредоксина, их обрабатывали сайт-специфической протеиназой тромбин (Novagen, США) согласно инструкции фирмы производителя. К 1 мл раствора целевого белка в концентрации 5 мг/мл в буфере для гидролиза тромбином добавляли 5 ед. активности тромбина, затем тщательно перемешивали и инкубировали при 37°С в течении 1 часа.

III.XI. Спектрскопия кругового дихроизма

Спектры кругового дихроизма целевых белков в дальнем ультрафиолете снимали при помощи спектрополяриметра Jasco J-810 (JASCO, Япония). Концентрация составляла 0,4 мг/мл в 10 мМ натриево-фосфатном буфере. Запись спектра производили при длине волны от 190 до 250 нм с шагом в 1 нм при 24°С. Полученные данные были проанализированы на предмет наличия вторичных структур при помощи последних версий программ CONTINLL и CDSSTR (http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/).

III.XII. Предсказание вторичной и третичной структуры

Предсказанные аминокислотные последовательности мотивов пг wac бактериофага JS98C3, гомологичных фолдону фибритина фага Т4, а также данные, полученные в результате поиска их гомологов в GenBank (программа BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) анализировали при помощи программы Chimera (http://www.cgl.ucsf.edu/chimera). В качестве шаблона для построения моделей предполагаемых вторичных и третичных структур использовали модель фолдона фибритина бактериофага Т4, депонированную в Protein Data Bank по результатам рентгеноструктурного анализа [Guthe S. et al., 2004].

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

IV.I. Изоляция нового Т-чётного бактериофага JS98C3

В лаборатории вирусов микроорганизмов Института Микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН уже продолжительное время ведется работа по исследованию смешанных бактериально-фаговых сообществ из кишечника лошади [Куликов Е.Е. и соавт., 2007]. Мы провели скрининг коллекции полевых изолятов колифагов, полученных в ходе этого исследования, с целью обнаружения бактериофагов, родственных Т-чётным.

Вырожденные олигонуклеотидные праймеры к консервативным участкам гена 23, кодирующего основную субъединицу головки Т4-подобных бактериофагов были подобраны в 2000 г. группой Н.М. Krisch [Tetart F. et al., 2001]. За прошедшие годы эти олигонуклеотиды зарекомендовали себя как надежное и удобное средство для быстрой идентификации бактериофагов, родственных Т4, а также установления их систематического положения [Nolan J. et al., 2006, Yoshida Т. et al.,, 2006]. Нами были проскринированы путем ПЦР-амплификации экстракты ДНК из 50 фаговых бляшек различной морфологии, высеянных из фекалий лошади. Только в одном случае был получен ПЦР-продукт, который имел размеры около 540 п.о. Данный ПЦР-продукт был секвенирован с тех же олигонуклеотидных праймеров. Поиск гомологий в базе данных GenBank дал 95%-ное совпадение с последовательностью гена 23 бактериофага JS98, изолированного группой Н. Brussow в 2004 г. в Бангладеш из стула педиатрических пациентов с симптомами диареи [Chibani-Chennoufi S. et ah, . 2004]. Сконцентрированный и очищенный дифференциальным центрифугированием препарат фага был, исследован методами электронной микроскопии, его морфология оказалась крайне близкой к морфологии бактериофага Т4 (рис. 1).

Были секвенированы 3 случайных клона из полученной нами плазмидной библиотеки ДНК этого фага. Первый из этих клонов оказался фрагментом гена 55 (сигма-фактор РНК-полимеразы Т4-подобных фагов) и показал 88%-ное совпадение нуклеотидной последовательности с аналогичным геном фага .1598 (аминокислотная последовательность транслированного клона совпала на 96%).

Рис 7. Электронная микрофотография бактериофага №98СЗ.

Последовательность второго клона, фрагмента гена 7 (одна из субъединиц базальной пластинки), имела гомологию в 87% (95% - в транслированном виде). Третий клон имел в транслированном виде 89% гомологию с предсказанной последовательностью большой субъединицы топоизомеразы II (пг 39) фага .1598. Нуклеотидные последовательности этих трех клонов депонированы в ОепВапк под номерами ЕР618561Л, ЕИб 18562.1 иЕР618563.1 соответственно.

Таким образом, полученные данные подтвердили генетическое сходство фага Д598СЗ с фагом .1598.

Физико-химические условия, с которыми сталкиваются бактериофаги и их хозяева в кишечнике лошади, имеют массу отличий от условий кишечника человека, из которого был изолирован фаг JS98. Мы сделали предположение, что в силу этих отличий, компоненты молекулярного сенсора фага JS98C3, ответственного за предотвращение инфекции в неблагоприятных условиях, должны нести соответствующие изменения.

IV.II. Последовательность гена wac

ПЦР-амплификация с использованием подобранных нами вырожденных олигонуклеотидных праймеров с последующим секвенированием ПЦР-фрагмента позволила нам определить полную последовательность гена wac фага JS98C3. Нуклеотидная последовательность этого гена депонирована в GenBank под номером EU2244220. Предсказанная аминокислотная последовательность N'-концевого участка пг wac (а.о. 1-48), имеющая значительную гомологию с последовательностью фибритина фага Т4, была практически идентичной в геномах фагов JS98C3 и JS98. Последующие 379 а.о. последовательности фибритинов фагов JS98C3 и JS98 также имеют высокую степень гомологии и сходны по своей гептадной coiled-coil периодичности с фибритином бактериофага Т4. Однако пг wac JS98 имеет дополнительный С-концевой домен, отсутствующий в пг wac фага Т4. Длина этого домена составляет 298 а.о. В фибритине фага JS98C3 также имеется «дополнительный» домен, однако его длина составляет только 54 а.о.

Последовательность С-концевой области пг wac фага JS98C3 почти идентична С-концевой последовательности пг wac фага JS98. Таким образом, по отношению к последнему пг wac фага JS98C3 имеет внутреннюю делецию 237 а.о. (Рис.2).

IV.HI. Последовательность гена 36

Продукт гена 36 является одним из компонентов молекулярного сенсора Т4-подобных бактериофагов, «Колено» ДХФ (пгЗб) принимает участие в первой стадии приведения фибрилл в состояние «ир» в неблагоприятных условиях путем взаимодействия с С-концевым доменом фибритина.

27 я о -►

Рис.8. Схема строения фибритинов бактериофагов Т4, №98 и №98СЗ. Овалами отмечены аминокислотные последовательности фолдонов.

Для того, чтобы выяснить, отразилась ли обнаруженная нами делеция в гене м?ас на последовательности гена 36, нами были подобраны вырожденные олигонуклеотидные ираймеры, фланкирующие данный ген. Полученный ПЦР-фрагмент по размерам и нуклеотидной последовательности оказался очень близким к гену 36 фага .1598 (номер в СепВапк Еи224421). Аминокислотная последовательность, кодируемая данными генами, оказалась практически идентичной. Это говорит о том, что связывание ДХФ с фибритином у фагов Д598СЗ и ^98 происходит за счет одинаковых белок-белковых взаимодействий.

262 а.о

IV.IV. Анализ последовательности генов wac бактериофагов JS98 и JS98C3

Для сравнения нуклеотидной последовательности генов wac фагов JS98 и JS98C3 мы использовали возможности программы Omiga 2.0 (Oxford Molecular LTD, США). Графические результаты анализа (рис. 9) подтверждают наше предположение о делеции в гене wac крупного фрагмента в регионе 1400-2100 о о -4 ю

1250

250

500 750 1000

J598C3 gene wac

1548

Рис. 9. Dot Plot диаграмма выравнивания нуклеотидных последовательностей генов wac фагов JS98 и JS98C3

Dot Plot выравнивание нуклеотидной последовательности гена wac фага JS98 саму на себя выявило в ее 3' - конце (регион 1800-2100) фрагмент, дважды содержащий прямой тандемный повтор (рис.10). Тандемные повторы в нуклеотидной последовательности бактериофагов, родственных Т4, а следовательно, имеющих сходный тип репликации ДНК (рекомбинационно-зависимый), несомненно говорят о том, что данный регион является горячей точкой рекомбинации и может устойчиво наследоваться только в случае, если дает бактериофагу несомненное селективное преимущество.

J S 9 8ge newac

Рис. 10. Dot plot диаграмма выравнивания нуклеотидной последовательности гена wac бактериофага JS98 на саму себя.

Графическое отображение выравнивания нуклеотидной последовательности гена \уас бактериофага ,Г898СЗ на саму себя драматически отличается от подобного выравнивания гена м?ас фага 1Б98 (рис.11). Обращает на себя внимание практически полное отсутствие нуклеотидных повторов, и в целом картина этого выравнивания выглядит намного более уравновешенной, чем предыдущая. Это говорит о том, что вероятность гомологичной рекомбинации внутри гена wac фага JS98C3 значительно ниже, а, следовательно, этот ген гораздо более стабилен, чем соответствующий ген бактериофага JS98.

JS98C3 gene wac

Рис. 11. Dot plot диаграмма выравнивания нуклеотидной последовательности гена wac бактериофага JS98C3 на саму себя.

Помимо поиска нуклеотидных повторов в последовательностях генов \уас фагов .189803 и 1898, мы провели поиск повторов аминокислотных последовательностей. Как показали результаты анализа обнаруженных аминокислотных повторов (Табл. 1), все выявленные нами ранее нуклеотидные тандемные повторы оказались в одной рамке считывания, а кодируемые ими аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомологии. Кроме того, в аминокислотной последовательности гена \¥ас фага 1898СЗ мы обнаружили короткий (17 а.о.) фрагмент, высоко гомологичный повторам из последовательности пг \уас бактериофага 1598.

Табл. 1.

Аминокислотные повторы в пг wac бактериофага JS98. Серым цветом выделена строка с гомологичной аминокислотной последовательностью из пг wac фага JS98C3.

Аминокислотная последовательность Положение Размер, а.о.

1 KIAPLTTRVTTAEGKITTLETGLAAVKVESD 601 31

2 KVAGINTRLGTAEGDIGTLKTGLAEVKGESD 632 31 з KVAAIDTRLGWEGEVGTLETGLAAVKVESD 663 31

4 1 KVADLGTRLTAAEGKITALETELS------- 694 24

--------LLEAEGKimLETEMAK------ 4S8 Г.17

IV.V. Экспрессия фибритина бактериофага JS98C3

Фрагмент генома фага 1S98C3 содержащий ген wac с естественным сайтом инициации трансляции был амплифицирован при помощи олигонуклеотидов, комплементарных 3'-концу гена 12 и 5'- концу гена 13, и клонирован в плазмидный вектор pGEM-T. ПЦР-амплификацией были отобраны клоны с ориентацией вставки, совпадающей с ориентацией промотора Т7 РНК-полимеразы.

Для нативной тримерной молекулы фибритина была показана способность к ренатурации после нагревания, а также свойства ограниченной устойчивости к ДСН (додецилсульфату натрия) и ограниченной устойчивости к действию протеаз [Boudko S. et al., 2002]. Экспрессия гена wac в клетках Е. coli BL21 (DE3) под контролем Т7 промотора привела к суперпродукции растворимого и ограниченно ДСН-устойчивого фибритина. Олигомерность белка анализировали путем электрофореза в 10% ДСН-ПААГ, на который наносили препараты белка в стандартном ДСН-буфере для образцов.

Образцы были нанесены в двух вариантах: в первом варианте перед нанесением их прогревали 3-5 мин на кипящей водяной бане, во втором варианте их наносили сразу же после смешивания белкового препарата с буфером для образцов (рис. 12).

Не прогретые образцы после окрашивания давали тонкую, высокоплотную полосу в верхней части геля, которая свидетельствует о том, что целевой белок находится в ДСН-устойчивом олигомерном состоянии.

166,0 66,2

45,0 35,0

18,4

Рис. 12. Анализ экспрессии пг м?ас фага №98СЗ и его трипсинолиза в 10% ПААГ-ДСН: 1 - маркеры молекулярного веса; 2 - осветленный лизат; 3 -не прогретый перед нанесением осветленный лизат в ДСН-буфере для образцов; 4 - высоленный препарат пг и>ас; 5 - тот же препарат, не прогретый перед нанесением; б — пг ц?ас после обработки трипсином в концентрации 0,01 мг/мл; 7 — он же, не прогретый перед нанесением; 8 — пг XVас после обработки трипсином в концентрации 0,05 мг/мл; 9 - тот же препарат, не прогретый перед нанесением.

IV.VI. Ограниченный протеолиз фибритина бактериофага Ш8СЗ

Для подтверждения того, что фибритин фага 1898СЗ образует компактную нативную структуру, мы подвергли его ограниченному протеолизу. К очищенному препарату фибритина в буфере для гидролиза мы добавляли трипсин в разных концентрациях." После 30 мин гидролиза при 37°С мы останавливали реакцию добавлением ФМСФ и анализировали продукты гидролиза электрофорезом в 10% ДСН-ПААГ (рис. 12).

Анализ геля показал, что молекулярная масса пг м?ас после гидролиза трипсином несколько уменьшается, однако, даже при внесении трипсина до концентрации 0.05 мг/мл данный белок не гидролизуется полностью и остается олигомерным. Это свидетельствует об эффективном сворачивании исследуемого белка в компактную нативную структуру. Следовательно, имеющаяся делеция в «дополнительном» С-концевом домене не препятствует нормальному фолдингу этого белка.

1У.УП. Экспрессия фибритина фага 1Б98СЗ с делецией части С-концевого домена

Для установления влияния С-концевого домена на фолдинг пг \vcic фибритина фага 1Б98СЗ, нами был получен его делеционный вариант, оканчивающийся на С-конце • стоп-кодоном в регионе, в котором происходит терминация трансляции гена м>ас бактериофага Т4 (сразу же за первым фолдоном). Для амплификации и секвенирования этого фрагмента гена мы использовали олигонуклеотидные праймеры 18Т12ир и ]зКс11о (рис. 13). Исходя из степени гомологии между фолдоном фибритина бактериофага Т4 и аминокислотным мотивом, фланкирующим проклонированнуюнами последовательность, мы ожидали получить в результате экспрессии растворимый олигомерный и ДСН-устойчивый продукт. Однако уровень экспрессии оказался крайне низким, на уровне мажорных клеточных белков. Исходя из полученных данных, мы предполагаем, что наличие аминокислотного мотива, гомологичного фолдону фибритина фага Т4 не обеспечивает быстрого принятия молекулой пг \vcic фага 1Б98СЗ нативной конформации. Белок, находящийся в состоянии «расплавленной глобулы» в течение продолжительного времени, становится уязвимым для клеточных протеаз, чем и объясняется наблюдаемое нами небольшое количество растворимого белкового продукта.

3 4 —►—►

12 wac

13

I < I I I I

Рис. 13. Схема расположения олигонуклеотидных праймеров, использованных в работе. 1 — ЗБТ12ир, 2 — JSglЗlo, 3 — ]зСс1ир, 4 — ]зСс12ир, 5 — ]$СсИо, 6 —/уТУ^/о. Серыми прямоугольниками отмечены последовательности, кодирующие аминокислотные мотивы, гомологичные фолдону бактериофага Т4. 1

1У.УШ. С-концевой домен фибритина фага JS98CЗ

Для того, чтобы выяснить, способен ли С-концевой домен фибритина фага 1898СЗ к самостоятельной тримеризации, мы проклонировали последовательность, кодирующую С-концевой домен в плазмидный вектор. Подобранные нами олигонуклеотидные праймеры ]зСс!ир ]зСс!2ир и jsCdlo (рис. 13) позволили нам амплифицировать и проклонировать последовательность С-концевого домена в двух вариантах: как с мотивом, гомологичным фолдону фибритина фага Т4 на N-конце, так и без него.

В силу того, что небольшие размеры С-концевого домена представляют препятствие для его экспрессии и осложняют манипуляции по очистке, мы проклонировали кодирующие его последовательности в плазмидный вектор рЕТ-32а, в одной рамке считывания с тиоредоксином Е. coli (рис. 14).

T-N и

2 Thioredoxin

C-domain

Рис. 14. Схема участка плазмидной конструкции с С-концевым доменом фибритина фага JS98C3. Цифрами обозначены: 1 — промотор Т7 РНК-полимеразы; 2 — 6xHis tag; 3 — сайт узнавания сайт-специфической протеиназы тромбин.

Экспрессия С-концевого домена пг wac с такой относительно крупной глобулярной структурой как тиоредоксин на N-конце также позволяет оценить его способность образовывать стабильные химерные тримеры.

Таким образом, нами были получены плазмидные конструкции pETCd (С-концевой домен обоими фолдонами) и pETCd2 (тот же домен без N-концевого фолдона). Соответствие нуклеотидной последовательности вставок расчетным последовательностям в обеих конструкциях было проверено секвенированием.

Белки, представляющие собой варианты С-концевого домена фибритина фага JS98C3, экспрессировались в Е. coli в количестве, превышающем 40% суммарного клеточного белка. Их электрофоретическая подвижность в 15% ДСН-ПААГ в прогретых образцах соответствовала предсказанной молекулярной массе (рис. 15). Не прогретые перед нанесением образцы дали на ПААГ полосы, характерные для олигомерных белков, в верхней части геля. Мы очистили белки из осветленного лизата путем аффинной хроматографии на Со-ЫТА, после чего отщепили тиоредоксин гидролизом их сайт-специфической протеиназой тромбин. Следующий цикл очистки на Со-ЫТА позволил нам очистить белки от тиоредоксина, который остался связанным со смолой. Целевые белки прошли через колонку в свободном объеме сорбента. После промывки промывочным буфером, мы элюировали тиоредоксин имидазолом, для того, чтобы убедиться в полноте гидролиза тромбином.

18,4 14,4

250,0 1150,0 -100,0 -75,0

-50,0 -37,0

-25,0

•<-20,0

4-15,0 м-10,0 1 8

10

Рис. 15. Анализ очистки вариантов С-концевого домена фибритина бактериофага №98СЗ в 17% ДСН-ПААГ. Порядок нанесения: 1,10-маркеры молекулярной массы; 2, б - тотальный препарат белков: с двумя фопдонами и без первого фолдона соответственно; 3, 7 — те же препараты, не прогретые перед нанесением; 4, 8 — второй этап очистки на Со-МТА (после гидролиза тромбином) с двумя фолдонами и без первого фолдона соответственно; 5, 9 - те же препараты, не прогретые перед нанесением.

Не прогретые перед нанесением на ПААГ образцы элюата не показали аномальной подвижности, характерной для олигомеров, в то время как образцы целевого белка из фракции «проскока» этим свойством обладали.

Это говорит о том, что гидролиз рекомбинантных вариантов С-концевого домена пг \vcic прошел полностью.

В процессе очистки варианта С-концевого домена пг \час.без 1Ч-концевого фолдона, нами было показано его уникальное свойство: частично сохранять условно нативную конформацию после прогревания образца с ДСН до 90°С в течении 5-6 минут. Полная утрата олигомерной конформации данным белком происходила только прогревания его препарата с ДСН-буфером в течении 10-12 минут.

Подобное свойство, ранее показанное только для фолдона пг 5 бактериофага Т4 [К.А. Мирошников, личное сообщение] говорит об очень высокой энергии, необходимой для плавления данного домена, либо о его способности к очень быстрой эффективной тримеризации, и может быть использовано для конструирования химерных тримерных белков.

1У.1Х. Спектроскопия кругового дихроизма

Нами были сняты спектры кругового дихроизма полноразмерного фибритина фага 1Б98СЗ и его делеционных вариантов. Математическая обработка полученных спектров показала высокое содержание альфа-спиральных вторичных структур во всех исследованных образцах. Эти данные подтверждают наши предположения о высоком сходстве между вторичными и третичными структурами фибритинов бактериофагов Т4 и 1598СЗ. Обращает на себя внимание резкое отличие в соотношениях альфа- и бета- структур между двумя делеционными вариантами С-концевого домена фибритина. Выявленное большее количество альфа-спиралей в варианте С-концевого домена фибритина с одним фолдоном говорит в пользу того, что отсутствующий в этом белке 1Ч-концевой фолдон действительно представляет собой бета-пропеллерную структуру (рис. 16, табл. 2).

Табл. 2.

Содержание элементов вторичных структур в целевых белках, рассчитанное по данным спектроскопии кругового дихроизма.

Содержание элементов вторичной;структуры,^ % альфа- бета- Бета-

Образец спираль лист поворот. непериодическая

Полноразмерный фибритин 38 16 18 28

С-концевой домен с двумя фолдонами 25 20 22 33

С-концевой домен с одним фолдоном 42 16 14 28 зоооо К

2 20000 м 10000 i о л ®

-10000

-20000

180

-г

190

Полноразмерный фибритан С-концееой домен с двумя фолдонами

---С-концееой домен с одним фолдоном

200

210 т

220

230 I

240

А, нм т

250

260

Рис. 16. Спектры кругового дихроизма в дальней УФ области фибритина фага №98СЗ и его делеционных вариантов.

IV.X. Поиск последовательностей, гомологичных фолдону фибритина фага Т4 в GenBank

Современные данные говорят о том, что фолдон фибритина бактериофага Т4 представляет собой энергетически выгодное и очень стабильное состояние белковой молекулы [Guthe S. et al., 2004]. Ранее эта структура считалась уникальной. Обнаруженные нами в фибритине фага JS98C3 аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомологии с фолдоном фибритина фага Т4, а показанные физическими методами их свойства говорят об их сходной функциональной нагрузке.

Факт того, что в фолдонах фаговых фибрилл возможны отклонения от «канонической» последовательности фолдона фибритина фага Т4, позволил нам сделать предположение о возможной широкой распространенности различных вариантов данного фолдона. В связи с этим, нами был произведен поиск гомологий в базе данных GenBank.

Для поиска нами была использована программа BLAST. В качестве матрицы для запроса мы использовали аминокислотные последовательности фолдонов пг wac фага Т4, а также изолированного нами фага JS98C3. Извлеченные таким образом из базы данных последовательности были выровнены при, помощи программы ClustalW 1.4. (рис. 17).

Данные гомологи были выявлены не только в последовательностях фибритинов бактериофагов, родственных Т4, но и в предполагаемых аминокислотных последовательностях белков некоторых бактериофагов, относящихся к семейству Siphoviridae. Обращает на себя тот факт, что в нескольких случаях, при больших размерах белка, фолдон-подобные последовательности встречались неоднократно, например, в белке хвостовой фибриллы бактериофага

ВсерЫаг^! или в фибритине родственного Т4 фага АеИ1. Кроме того, последовательность, гомологичная фолдону фибритина- Т4 была обнаружена в предсказанной аминокислотной последовательности гипотетического белка ОЬешОКАРТ3444 бактерии ОеоЬаМег Ьет1(1]1ет18 Вет.

Рис. 17. Выравнивание аминокислотных последовательностей выявленных нами гомологов фолдона фибритина фага Т4.

IV.XI. Моделирование вторичных и третичных структур фолдонов фибритина бактериофага JS98C3 in silico

Мы построили модели вторичных и третичных структур фолдонов фибритина фага JS98C3 при помощи программы Chimera. В качестве матрицы для построения структур нами была использована pdb-модель фолдона фибритина фага Т4 1RFO (рис. 18), депонированная в базе данных Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) под номером PF07921.

Моделирование in silico возможных вторичных и третичных

10

20

Т4

RB32 RB69 KVP40

Geobacter bemidjiensis Bern

BcepNazgull

BcepNazgul2

BcepNazgul3

BcepNazgul4

JS98-C31

JS98-C32

JS981

JS982

D3112

MP22

RB49

DMS3

Aehll

Aehl2

Aehl3

BcepFl

-GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL--GYIPEAPKDGQAYVRKDGEWVbLSTFL--GYIEDAPSDGKFYVRKDGANVELPTA—

- D GVLEAPAD GQE Y VRKD FQWVL P T Y PT --GAVGDAPKDGKLYVRQNGRWVELVTAA--GGIPDAPSDGVGYARKDGGWTPVATGS

- SGIPEAPADGKQYARKNSGWAEVQIPA-TAGIADAPSDGTKYMRQNGTWASFFTK—

- G GIPD APNN AN Q Y TRG QATRNVLGAFV

- TKLGDAPADSKLYGRKDAAWAEILDDT--RPPVAPTADGLPYVLVDNAVIVLLSDFV--GKLGDAPSD GKL Y &RRN AAWRE WWN S --RPPVAPAADGLPYVLVDNAWVLLSDFV--GGMADAPSDGSNYARNHGEWGKLGTAA--GGMSDAPSDGSHYARNNGAWGKLGTAA--NKVDDVPDDGFHYbRKRGEWVQVAYAA--GGMADAPSDGKRYARLNNAWAGLGTAA-HDGL-DAPKDDAMYARKNGVWT -AFNPGG HDGI-DAPSDGSYYARNNGTWQKVFN-GV -TSAFDVPTDDKRYSRRNGKWIQSYYYG--GGIQDAPDDGFPYVRDSKEWSRLQGLSструктур фолдонов фибритина бактериофага 1898СЗ показало высокую степень их сходства с вторичными и третичными структурами фолдона фибритина фага Т4.

Построенные нами модели с некоторой степенью достоверности объясняют результаты экспериментов с экспрессией делеционных вариантов пг м?ас фага 1898СЗ:

1) Недостаточная эффективность фолдинга, а, следовательно, и низкий уровень экспрессии варианта фибритина без части С-концевого домена можно объяснить более релаксированной по сравнению с фолдоном фибритина фага Т4 структурой К-концевого фолдона (рис.18,19).

2) Сохранение частично олигомерного состояния С-концевого домена после прогревания с ДСН возможно объяснить наличием в С-концевом фолдоне дополнительному альфа-спирального участка, не характерного для фолдона фибритина фага Т4. Этот участок предположительно стабилизирован относительно полипептидной цепи двумя водородными связями, и придает третичной структуре фолдона дополнительную жесткость, а также повышает температуру его плавления (рис. 20, 21, 22)

Рис. 18. Модель четвертичной структуры фолдона фибритина фага Т4.

Рис. 19. Модель четвертичной структуры первого фолдона фибритина фага №98СЗ.

Рис. 20. Модель четвертичной структуры второго (С-концевого) фолдона фибритина фага Ц898СЗ. Стрелкой показан дополнительный участок альфа-спирали.

Рис. 21. Предсказанная третичная структура С-концевого фолдона фибритина фага №98СЗ. Показаны водородные связи. ь 9

Рис. 22. Наложение третичной структуры фолдона фибритина фага Т4 и С-копцевого фолдона фибритина фага ^98СЗ. Светлосерым цветом обозначен фолдон фибритина фага Т4.

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

V.l. Изоляция бактериофага JS98C3, близкородственного фагу JS98

Изоляция нами бактериофага JS98C3, имеющего очень высокую гомологию нуклеотидной последовательности с бактериофагом JS98 не оставляет никаких сомнений в том, что бактериофаги Е. coli имеют очень большую географическую мобильность. Учитывая крайне высокие темпы эволюции геномов Т4-подобных фагов, основанную на механизме репликации их ДНК, можно с уверенностью сказать, что фаги JS98C3 и JS98 произошли от общего предка совсем недавно. Этот вывод подтверждается не только высокими гомологиями в их генах, находящихся в «коровых» по определинию Г. Криш регионах, но и почти полной идентичностью последовательностей генов wac (естественно, не принимая во внимание делецию), которые относятся к гиперпластичным областям геномов [Comeau A.M. et al., 2007].

Случай с обнаруженной нами парой близкородственных Т4-подобных бактериофагов предоставляет исследователям уникальную возможность выяснить, путем полного определения нуклуотидной последовательности фага JS98C3, в каких направлениях происходит дивергенция, и в каких локусах она происходит в первую очередь.

V.U. Анализ нуклеотидной последовательности гена wac фага JS98C3

Многообразие С-концевых модулей у бактериофагов, родственных Т4, представляет собой эволюционную загадку [Летаров А.В., 2004]. Существенно отличающиеся по размеру и предполагаемым вторичным структурам, эти домены либо замещают С-концевой домен (фолдон) фибритина фага Т4, являющегося наиболее просто устроенной структурой, либо следуют прямо за ним в виде «довеска» как у фагов 1898 и 1898СЗ. Подобное многообразие до сих пор не имеет адекватного объяснения: участки белка, инициирующие его фолдинг, обычно бывают эволюционно консервативны. Высокая частота модульных перестановок в этой области фибритина свидетельствует о том, что вирусы получают заметное селективное преимущество в результате части таких событий.

Мы предполагаем, что система, при которой фибритин связывается своим С-концевым доменом с пг 36 в составе длинной хвостовой фибриллы, может действовать не только по схеме, описанной для фага Т4, когда в неблагоприятных условиях при сравнительно коротком фибритине его взаимодействие с ДХФ приводит последнюю в поднятое состояние. Возможно, что данная система у других бактериофагов, родственных Т4, может действовать еще и в другом направлении, а именно, при благоприятных условиях удерживать ДХФ на расстоянии, наиболее способствующем взаимодействию фагового адгезина с молекулой-рецептором4 на поверхности бактериальной клетки. Подобное ограничение степени подвижности ДХФ может принести бактериофагу некоторые экологические преимущества, в частности, повышать скорость адсорбции в благоприятной для этого ситуации. Это предположение согласуется с наличием в последовательностях многих «новых» С-доменов аминокислотного мотива, соответствующего фолдону бактериофага Т4 - предполагаемому региону взаимодействия фибритина с пг 36.

Возможно также, что у некоторых фагов С-концевые домены фибритина играют роль дополнительных адгезинов, взаимодействующих с рецепторами на поверхности клеток бактерий, увеличивая, таким образом, вероятность адсорбции фага в условиях низкой плотности клеток-хозяев [Летаров A.B., 2004].

Отдельно стоит остановиться на тандемных повторах, обнаруженных нами в нуклеотидной последовательности гена wac бактериофага JS98. На данный момент представляется затруднительным с точностью найти объяснение наличию такого количества высоко гомологичных последовательностей в пределах одного гена. Однако, мы можем сделать несколько выводов-предположений :

1) Четырежды повторяющиеся аминокислотные мотивы могут нести какую-либо функциональную нагрузку, и давать бактериофагу соответствующее селективное преимущество. За счет этого ген с прямыми нуклеотидными повторами стабильно наследуется.

2) Возможно, это преимущество достигается только за счет вынесения С-концевого фолдона (который может являться областью связывания с ДХФ) на определенное расстояние от фаговой частицы. Структура несомненно, была собрана из тех модулей, которые были доступны для рекомбинации, и подошли по стерическим требованиям, а содержит повторы в силу недостатка материала.

3) Структура, содержащая эти повторы, возникла по эволюционным меркам совсем недавно, в результате дупликации, а потому еще не накопились синонимичные нуклеотидные замены, которые могли бы предотвратить рекомбинационное событие.

4) Наличие в фибритине фага JS98C3 фрагмента, высоко гомологичного аминокислотным повторам из пг wac фага JS98, может свидетельствовать о том, что некоторое время назад произошло вышеупомянутое рекомбинационное событие, которое и привело к делеции части гена в регионе 1400-2100.

У.Ш. Новые гомологи фолдона фибритина фага Т4

Для нас не стал неожиданностью тот факт, что аминокислотные мотивы, гомологичные фолдону фибритина фага Т4 были обнаружены в последовательностях белков других бактериофагов. Физико-химические свойства фолдона фибритина фага Т4 говорят о том, что этот белок — исключительно сбалансированный и эволюционно оптимизированный домен тримеризации. Вполне очевидно, что подобные структуры должны широко использоваться для сходных целей в сходных по структурной организации белках.

Гораздо больше нас удивило большое количество отличий этих мотивов от «канонической » последовательности фолдона. Причем, эти отличия, при явной функциональности белка (как в случае с вторым фолдоном фага 1898СЗ), затрагивают аминокислоты, считающиеся на данный мемент крайне важными при образовании внутримолекулярных связей в процессе тримеризации домена.

Исходя из последовательности второго фолдона фибритина бактериофага 1898СЗ, о котором мы, основываясь на экспериментальных данных, можем- с уверенностью говорить как о домене, эффективно тримеризующем большую тримерную молекулу фибритина, можно сделать вывод, что в нем не образуется солевого мостика Е5-Я15 «канонического» фолдона. При этом, аминокислотная последовательность, необходимая для формирования бета-шпильки, необходимой для тримеризации, в нем присустствует, что подтверждается т зШсо расчетами на основании большинства современных алгоритмов предсказания вторичных структур.

Подобное расхождение с экспериментально подтвержденной «идеальной» структурой можно объяснить:

1) тем, что структура второго фолдона фага JS98C3 более прочна за счет участка альфа-спирали между листами бета-шпильки;

2) молекулярный сенсор бактериофага JS98C3 рассчитан на ответ на иные физико-химические условия, чем сенсор фага Т4;

3) функция второго фолдона - только инициация тримеризации фибритина. 1

Стоит несколько более подробно остановиться на предпосылках ко второму из вышеперечисленных объяснений. По не вполне ясной причине, исследователи, занимающиеся структурными белками бактериофага Т4, до настоящего момента так и не провели параллелей между работами Майера [Meier S. et al., 2004] и более ранними работами Фоллансби и Конли [Conley М.Р. et al., 1975, Follansbee S.E. et al., 1974]. Обобщая результаты этих работ, можно сделать предположение, что компонентом молекулярного сенсора (или одним из этих компонентов), реагирующим на изменения внешней среды, такие как понижение рН, у фага Т4 является именно фолдон фибритина.

Диссоциация фолдона на мономеры вполне может экспонировать аминокислоты, участвующие во взаимодействии «фибритин-ДХФ». При этом экспонируемые аминокислоты, скорее всего, располагаются в прилежащей к бета-шпильке петле, гомологии в которой, несмотря на ее нерегулярную структуру, не имеющую, до определенных пределов, влияния на.тримеризацию домена, прослеживаются среди всех вновь обнаруженных последовательностей.

Плавление при низких значениях рН гомологов фолдона фибритина Т4 может также в какой-то мере объяснить и множественность некоторых из этих доменов в соотвествующих белках. Учитывая то, что ДХФ закреплены на базальной пластинке довольно пластично, вполне адекватно наличие на фибртине нескольких центров, способных их связать, особенно в тех случаях, когда сенсор должен отреагировать на изменение условий максимально быстро.

Также можно допустить, что некоторые из этих доменов могут диссоциировать на мономеры и экспонировать активные центры в ответ на иные факторы, нежели низкий рН. Подобное допущение вполне укладывается в нашу гипотезу о возможном действии молекулярного сенсора в ответ на факторы, располагающие к инфекции. Кроме того, разные разновидности фолдона, реагирующие на различные факторы внешней среды, и расположенные на одном фибритине, могли бы обеспечивать многофункциональность молекулярного сенсора.

VI. выводы

1. Изолирован новый Т4-подобный энтеробактериофаг 1898СЗ. В последовательности фибритина этого бактериофага обнаружены аминокислотные мотивы, имеющие высокую степень гомологии с фолдоном фибритина фага Т4.

2. Показано, что С-концевой домен фибритина бактериофага 1898СЗ способен к эффективной автономной тримеризации, что делает перспективным использование входящих в его состав фолдонов в белковой инженерии в качестве модулей, инициирующих фолдинг химерных белков.

3.\ В результате проведенного поиска в базе данных ОепВапк выявлено 16 новых аминокислотных мотивов, гомологичных фолдону фибритина фага Т4. Девять из вновь обнаруженных последовательностей находятся в последовательностях белков, не родственных фибритину, бактериофагов, относящихся к семейству Siphovirid.de, что говорит о широкой распространенности подобных структур.

4. 1п бШсо моделирование вторичных и третичных структур вновь обнаруженных нами в ОепВапк аминокислотных мотивов подтвердило предположение о сходстве их конформации с фолдоном фибритина бактериофага Т4, что может свидетельствовать об их сходной роли в фолдинге соответствующих белков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Куликов Е.Е Биоразнообразие и динамика бактериофагов фекалиях лошади. / Е.Е. Куликов, А.С. Исаева, А.С. Роткина, А.А. Маныкин, А.В. Летаров. // Микробиология. - 2007. - Т. 76. - С. 271278.

2. Летаров А.В. Эволюционная динамика, фолдинг и функция некоторых фибриллярных белков бактриофагов, родственных Т-чётным фагам энтеробактерий / А.В. Летаров // Труды ИНМИ им. С.Н. Виноградского. - 2004. - Вып. XII. - С. 269-284.

3. Abkevich V.I. Specific nucleus as the transition state for protein folding: evidence from the lattice model / V.I. Abkevich, A.M. Gutin, E.I. Shakhnovich // Biochemistry. - 1994. - V. 33. - P. 10026-10036

4. Akhter T. The neck of bacteriophage T4 is a ring-like structure formed by a hetero-oligomer of gpl3 and gpl4 / T. Akhter, L. Zhao, A. Kohda, K. Mio, S. Kanamaru, F. Arisaka // Biochim. Biophys. Acta. -2007. - V. 1774. - No. 8. - P. 1036-1043

5. Altschul S.F. Basic local aligment tool / S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, D. Lipman // J. Mol. Biol. - 1990. - V. 215. - P. 403-410

6. Anfinsen C.B. The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain / C.B. Anfinsen E. Harber, M. Jr. Sela, F.H. White // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1961. - V. 47. - P. 1309-1314

7. Bailey T. Score distributions for simultaneous matching to multiple motifs / T. Bailey and M. Gribskov // J. Comput. Biol. - 1997. -V. 4. - P. 45-59.

8. Baldi P., Hidden markov models of biological primary sequence information / P. Baldi, Y. Chauvin, T. Hunkapiller, M.A. McClure // Proc.

Natl Acad. Sci. USA, - 1994. - V. 91. - P. 1059-1063

9. Baiter M. Virology. Evolution on life's fringes / M. Baiter // Science. - 2000. - V. 289. - No. 5486. - P. 1866-1867

10. Boudko S. Domain organization, folding and stability of bacteriophage T4 fibritin, a segmented coiled-coil protein / S. Boudko, Y. Londer, A. Letarov, N. Sernova, J. Engel and V. Mesyanzhinov // Eur. J. Biochem. - 2002. - V. 269. - P. 833-841

11. Boudko S.P. Design and crystal structure of bacteriophage T4 mini-fibritin NCCF / S.P. Boudko , S.V. Strelkov, J. Engel, J. Stetefeld // J Mol Biol. - 2004. - V. 339. - P. 927-35

12. Bowie J. A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure / J. Bowie R. Liithy, D. Eisenberg // Science, -1991. - V. 253. - P. 164-170

13. Brussow H. Phage genomics: small is beautiful / H. Brussow, R.W. Hendrix // Cell. - 2002. - V. 108. - No. 1. - P. 13-16

14. Chibani-Chennoufi S. Isolation of Escherichia coli bacteriophages from the stool of pediatric patients in Bangladesh / S. Chibani-Chennoufi, J. Sidoti, A. Bruttin, M.-L. Dillmann, E. Kutter, F. Qadri, S.A. Sarker, H. Briissow. // J. Bacterid., 2004, V. 186, No 24. - P. 8287-8294.

15. Comeau A.M. Modular architecture of the T4 phage superfamily: a conserved core genome and a plastic periphery A.M. Comeau, C. Bertrand, A. Letarov, F. Tetart, H.M. Krisch // Virology. - 2007. - V. 362. - No. 2. - P. 384-96

16. Conley M.P. Bacteriophage T4 whiskers: a rudimentary environment-sensing device / M.P. Conley, W.B. Wood // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1975. - V. 72. - No 9. - P. 3701-3705

17. Coombs D.H. Studies on the structure, protein composition, and assembly of the neck of bacteriophage T4 / D.H. Coombs, F.A. Eiserling. // J. Mol. Biol. - 1977. - V. 116. - No 3. - P. 357-405

18. Demerec M. Bacteriophage-Resistant Mutants in Escherichia Coli M. Demerec and U. Fano // Genetics. - 1945. - No 30. - P. 119-136

19. Dickson R. Structural proteins of bacteriophage T4 / R. Dickson, S. Barnes, F. Eiserling // J Mol Biol. -1970. - V. 53. - P. 461-74

20. Doermann A.H., Genetic control of capsid length in bacteriophage T4: clustering ofptg mutations in gene 23 / A.H. Doermann, A. Pao, and P. Jackson // J. Virol. - 1987. - V. 61. - P. 2823-2827

21. Edgar R. COACH: profile-profile alignment of protein families using hidden markov models / R. Edgar and K. Sjolander // Bioinformatics

- 2004. - V. 20 - P. 1309-1318

22. Edgar R. Simultaneous sequence alignment and tree construction using hidden Markov models / R. Edgar and K. Sjolander // Bioinformatics. - 2003. - V. 19. - P. 1404-1411

23. Efimov V.P. Fibritin encoded by bacteriophage T4 gene wac has a parallel triple-stranded alphahelical coiled-coil structure / V.P. Efimov, I.V. Nepluev, B.N. Sobolev, T.G. Zurabishvili, T. Schulthess, A. Lustig, J. Engel, M. Haener, U. Aebi, S. Venyaminov // J. Mol. Biol. - 1994. - V. 242. - No 4. - P. 470^186

24. Espinosa J.F. Interplay between hydrophobic cluster and loop propensity in beta-hairpin formation / J.F. Espinosa, V. Munoz & S.H. Gellman // J. Mol. Biol. - 2001. - V. 306. - P. 397-^02

25. Fersht A.R. Nucleation mechanisms in protein folding / A.R. Fersht // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1997. - V. 7. - P. 3-9

26. Filée J. A selective barrier tohorizontal gene transfer in the T4-type bacteriophages that has preserved acore genome with the viral replication and structural genes / J. Filée, E. Bapteste, E. Susko, H.M. Krisch // Mol. Biol. Evol. - 2006. - V. 23. - P. 1688-1696

27. Fokine A. Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4 / A. Fokine, P.R. Chipman, P.G. Leiman, V.V Mesyanzhinov, V.B. Rao, M.G. Rossmann // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

- 2004. - V. 101. - No. 16. - P. 6003-6008

28. Follansbee S.E. A new set of adsorption mutants of bacteriophage T4D: Identification of a new gene / S.E. Follansbee, R.W. Vanderslice, L.G. Chavez, C.D. Yegian // Virology. - 1974. - V. 58. - P. 180-199

29. Frank S., Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering / S. Frank, R.A. Kammerer, D. Mechling, T. Schulthess, R.J.B. Landwehr, Y. Guo et al. // J. Mol. Biol. - 2001. - V. 308. - P. 1081-1089

30. Frydman J. Principles of chaperone-assisted protein folding: differences between in vitro and in vivo mechanisms / J. Frydman, F.U. Hartl // Science. - 1996. - V. 272. - P. 1497-1502

31. Fuhrman J.A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects / J.A. Fuhrman // Nature. - 1999. - V. 399. - No. 6736. - P. 541-548

32. Games D. Mice as models: transgenic approaches and Alzheimer's disease / D. Games, M. Buttini, D. Kobayashi, D. Schenk, P. Seubert // J. Alzheimers Dis. - 2006. - V. 9. - P. 133-149

33. Gough J. Assignment of homology to genome sequences using a library of hidden markov models that represent all proteins of known structure / J. Gough, K. Karplus, R. Hughey, C. Chothia // J. Mol. Biol., -2001. - V. 313. - P. 903-919

34. Guthe S. Very Fast Folding and Association of a Trimerization Domain from Bacteriophage T4 Fibritin / S. Guthe, L. Kapinos, A. Möglich, S. Meier, S. Grzesiek and T. Kiefhaber // J. Mol. Biol. - 2004. -V. 337. - P: 905-915

35. Halaby D.M. The immunoglobulin fold family: sequence analysis and 3D structure comparisons /D.M. Halaby, A. Poupon, and J. Mornon // Protein Eng. - 1999. - V. 12. - P. 563-571

36. Hambly E. A conserved genetic module that encodes the major virion components in both the coliphage T4 and the marine cyanophage S-PM2 / E. Hambly, F. Tetart, C. Desplats, W.H. Wilson, H.M. Krisch, N.H.

Mann // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2001. - V. 98. - No. 20. - P. 11411-11416

37. Harris D.A. A murine model of a familial prion disease / D.A. Harris, R. Chiesa, B. Drisaldi, E. Quaglio, A. Migheli, P. Piccardo, B. Ghetti // Clin. Lab. Med. - 2003. - V. 23. - P. 175-186

38. Helles G. A comparative study of the reported performance of ab initio protein structure prediction algorithms / G. Helles // J R Soc Interface. - 2007. - [Epub ahead of print].

39. Hendrix R.W. Bacteriophages with tails: chasing their origins and evolution / R.W. Hendrix, G.F. Hatfull, , M.C. Smith, // Res. Microbiol. -2003.-V. 154.-P. 253-257

40. Hensley K. On the relation of oxidative stress to neuroinflammation: lessons learned from the G93A-SOD1 mouse model of amyotrophic lateral sclerosis / K. Hensley, M. Mhatre, S. Mou, Q.N. Pye, C. Stewart, M. West, K.S. Williamson // Antioxid. Redox Signal. - 2006. -V. 8. - P. 2075-2087

41. Ivanitskii G.R. Does taxis exist in bacterial viruses? / G.R. Ivanitskii, A.B. Medvinskii, A.A. Deev, A.A. Khusainov, M.A. Tsyganov // Biofizika. - 1995. - V. 40. - No. 1. - P. 60-73

42. Jackson S.E. Folding of chy mo trypsin inhibitor Evidence for a two-state transition / S.E. Jackson, A.R. Fersht // Biochemistry. - 1991. -V. 30. - No. 43. - P. 10428-43

43. Karam J.D. DNA polymerase of the T4-related bacteriophages / J.D. Karam, W.H. Königsberg // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. -2000. - V. 64. - P. 65-96

44. Kim D. PROSPECT ii: protein structure prediction, method for genomescale applications / D. Kim, D. Xu, J.T. Guo, K. Ellrott, Y. Xu // Protein Eng. - 2003. - V. 16. - P. 641-650

45. Kostyuchenko V.A. The tail structure of bacteriophage T4 and its mechanism of contraction / V.A. Kostyuchenko, P.R. Chipman, P.G.

Leiman, F. Arisaka, V.V. Mesyanzhinov, M.G. Rossmann // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2005. - V. 9. - P. 810-813

46. Lawrence J.G. Imbroglios of viral taxonomy: genetic exchange and failings of phenetic approaches / J.G. Lawrence, G.F. Hatfull, R.W. Hendrix //J. Bacteriol. - 2002. - V. 184. - P. 4891-4905

47. Leckner J. The effect of the metal ion on the folding energetics of azurin: a comparison of the native, zinc and apoprotein / J. Leckner, N. Bonander, P. Wittung-Stafshede, B.G. Malmstrom, B.G. Karlsson // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - V. 1342. - P. 19-27

48. Leiman P.G. Structure and morphogenesis of bacteriophage T4 / P.G. Leiman, S. Kanamaru, V.V. Mesyanzhinov, F. Arisaka, M.G. Rossmann // Cell. Mol. Life. Sci. - 2003. - V. 60. - P. 2356-2370

49. Letarov A.V. gpwac of the T4-type bacteriophages: structure, function, and evolution of a segmented coiled-coil protein that controls viral infectivity / A. Letarov, X. Manival, C. Desplats, H.M. Krisch // J. Bacteriol., 2005, V.187 No 3,1055-66.

50. Letarov A. The function and evolution of fibritins in T4-related phages: C-end of the story / A. Letarov, O. Latypov. and H.M. Krisch. //1st Texas - Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting. -2006. Book of Abstracts, - P. 9

51. Letarov A.V. The carboxy-terminal domain initiates trimerization of bacteriophage T4 fibritin / A.V. Letarov, Y.Y. Londer, S.P. Boudko, V.V. Mesyanzhinov // Biochemistry. - 1999. - V. 64. - No 7 - P. 817-823

52. Levinthal C. Molecular model-building by computer / C. Levinthal // Sci Am. - 1966. - V. 214, - No. 6. - P. 42-52

53. Lifshits E.M. Physical Kinetics / E.M. Lifshits, L.P. Pitaevskii // Pergamon Press. Oxford. -1981

54. Lilie H. Advances in refolding of proteins produced in E. coli / H. Lilie, E. Schwarz, R. Rudolph // Curr Opin Biotechnol. - 1998 9 :497-501

55. Loayza D. Gene 32 transcription and mRNA processing in T4related bacteriophages / D. Loayza, A.J. Carpousis, and H.M. Krisch // Mol. Microbiol. -1991. - V. 5. - P. 715-725

56. Luby-Phelps K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area / K. Luby-Phelps // Int. Rev. Cytol. - 2000: - V. 192. - P. 189-221

57. Mann N.H. The genome of S-PM2, a "photosynthetic" T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains / N.H. Mann, M.R.J. Clokie, A. Millard, A. Cook, W.H. Wilson, P.J. Wheatley, A. Letarov, H.M. Krisch //J. Bacteriol. - 2005. - V. 187, - P. 3188-3200

58. Martin J. The effect of macromolecular crowding on chaperonin-mcdiated protein folding / J. Martin, F.U. Hartl // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1997. - V. 7. - P. 41-52

59. Matsuzaki S. Cloning and sequencing of major capsid protein (mcp) gene of a vibriophage, KVP20, possibly related to T-even coliphages / S. Matsuzaki, T. Inoue, M. Kuroda, S. Kimura, and S. Tanaka // Gene. -1998. - V. 222. - P. 25-30

60. McPheeters D. S. Nucleotide sequences of the bacteriophage T2 and T6 gene 32 mRNAs / D.S. McPheeters, G. Gosch, and L. Gold // Nucleic Acids Res. - 1988. - V. 16. - P. 9341

61. Meier S. Foldon, the natural trimerization domain of T4 fibritin, dissociates into a monomeric A-state form containing a stable b-hairpin: atomic details of trimer dissociation and local b-hairpin stability from residual dipolar couplings / S. Meier, S. Guthe, T. Kiefhaber and. S. Grzesiek // J. Mol. Biol. - 2004. - V. 334. - P. 1051-1069

62. Miller E.S., Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4- related bacteriophage / E.S. Miller, J.F. Heidelberg, J.A. Eisen, W.C. Nelson, A.S. Durkin, A. Ciecko, T.V. Feldblyum, O. White, I.T. Paulsen, W.C. Nierman, J. Lee, B. Szczypinski, C.M. Fraser // J. Bacteriol. - 2003. -V. 185, - P. 5220-5233

63. Miller E.S. Bacteriophage T4 genome / E.S. Miller, E. Kutter, G.

Mosig, F. Arisaka, T. Kunisawa and W. Ruger // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2003. - V. 67. - P. 86-156

64. Monod C. The genome of the pseudoT-even bacteriophages, a diverse group that resembles the T-even phages / C. Monod, F. Repoila, M. Kutateladze, F. Te'tart, and H. M. Krisch. // J. Mol. Biol. - 1997. - V. 267. - P. 237-249

65. Mosig G. Gene expression: A paradigm of integrated circuits / G. Mosig, D.H. Hall, in: J.D. Karam, J.W. Drake, K.N. Kreuzer, G. Mosig,

D.H. Hall, F.A. Eiserling, L. Black, E.K. Spicer, E.M. Kutter, K. Carlson,

E.S. Miller (Eds.) // Molecular Biology of Bacteriophage T4. - American Society for Microbiology. - Washington, DC. - 1994. - P. 127-131

66. Munoz V. A statistical mechanical model for beta-hairpin kinetics / V. Munoz, E.R. Henry, J. Hofrichter & W.A. Eaton // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1998. - V. 95. - P. 5872-5879

67. Murzin A. Distance homology recognition using structural classification of proteins / A. Murzin and A. Bateman // Proteins - 1997. -Suppl. l.-P. 105-112

68. Murzin A. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures / A. Murzin, S.E. Brenner, T. Hubbard, C. Chothia // J. Mol. Biol. - 1995. - V. 247. - P. 536-540

69. Nolan J. Genetic diversity among five T4-like bacteriophages / J. Nolan, V. Petrov, C. Bertrand, H.M. Krisch, J.D. Karam // Virol. J. - 2006. -V. 3. - P. 30

70. O'Sullivan O. 3DCoffee: combining protein sequences and structures within multiple sequence alignment / O. O'Sullivan, C. Notredame, K. Suhre, C. Abergel, D.G. Higgins // J. Mol. Biol. - 2004. -V. 340. - P. 385-395

71. Panchenko A. Combination of threading potentials and sequence profiles improves fold recognition / A. Panchenko, A. Marchler-Bauer, S.H Bryant // J. Mol. Biol. - 2000. - V. 296 - P. 1319-1331

72. Papanikolopoulou K. Adenovirus fibre shaft sequences fold into the native triple beta-spiral fold when N-terminally fused to the bacteriophage T4 fibritin foldon trimerisation motif / K. Papanikolopoulou, S. Teixeira, H. Belrhali, V.T. Forsyth, A. Mitraki and M. J. van Raaij // J. Mol. Biol. - 2004, - V.342. - P. 219-227

73. Park J. Sequence comparisons using multiple sequences detect three times as many remote homologues as pairwise methods / J. Park, K. Karplus, C. Barrett, R. Hughey, D: Haussler, T. Hubbard, C. Chothia // J. Mol. Biol. - 1998. - V. 284. - P. 1201-1210

74. Pedulla M.L. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes / M.L. Pedulla, M.E. Ford, J.M. Houtz, T. Karthikeyan, C. Wadsworth, J.A. Lewis, D. Jacobs-Sera, J. Falbo, J. Gross, N.R. Pannunzio, W. Brucker, V. Kumar, J. Kandasamy, L. Keenan, S. Bardarov, J. Kriakov, J.G. Lawrence, W.R. Jacobs, R.W. Hendrix, G.F. Hatfull // Cell. - 2003. - V. 113. - P. 171-182

75. Petrov V. Plasticity of the gene functions for DNA replication in the T4-like phages / V. Petrov, J. Nolan, C. Bertrand, D.Levy, C. Desplats, H.M. Krisch, J. Karam // J. Mol. Biol. - 2006. - V. 361 - P. 46-68

76. Prilipov A.G. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene wac / A.G. Prilipov, N.A. Selivanov, L.I. Nikolaeva, V.V. Mesyanzhinov // Nucleic Acids Res. - 1988. - V. 16. -No. 21.-P. 10361

77. Ravantti J.J. Comparative analysis of bacterial viruses Bam35, infecting a Gram-positive host, and PRD1, infecting Gram-negative hosts, demonstrates a viral lineage / J.J. Ravantti, A. Gaidelyte, D.H. Bamford, J.K.H. Bamford // Virology. - 2003. - V. 313. - P. 401^114

78. Rohwer F. The phage proteomic tree: a genome-based taxonomy for« phage / F. Rohwer, R. Edwards //J. Bacteriol. - 2002. - V. 184. - P. 4529-4535.

79. Ruska H. Die Sichtbarmachung der BakteriophagenLyse im

Ubermikroskop / H. Ruska // Naturwissenschaaften. - 1940.

80. Sambrook J. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edn. / J. Sambrook, E.F. Fritch, T. Maniatis // /New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1989

81. Saren A.M. A snapshot of viral evolution from genome analysis of the Tectiviridae family / A.M. Saren, J.J. Ravantti, S.D. Benson, R.M. Burnett, L. Paulin, D.H. Bamford, J.K.H. Bamford // J. Mol. Biol. - 2005.

- V. 350. - P. 427-440

82. Seckler R. Assembly of multi-subunit structures. In Mechanisms of Protein Folding (Pain, R., ed.) / R. Seckler // Oxford University Press, Oxford. - 2000. - P. 279-308

83. Selick H.E. Analysis of five presumptive protein-coding sequences clustered between the primosome genes, 41 and 61, of bacteriophages T4, T2, and T6 / H.E. Selick, G.D. Stormo, R.L. Dyson, and B.M. Alberts // J. Virol. - 1993. - V. 67. - P. 2305-2316

84. Shakhnovich E.I. Theoretical studies of protein-folding thermodynamics and kinetics / E.I. Shakhnovich // Curr. Opin. Struct. Biol.

- 1997. -V. 7.-P. 29-40

85. Shan Y. Fold recognition and accurate query-template alignment by a combination of PSI-BLAST and threading / Y. Shan, G. Wang, H.X. Zhou // Proteins, - 2001. - V. 42. - P. 23-37

86. Sobolev B.N. Fibritin and adhesin of bacteriophage T4 tell us how fibrous protein folds and assembles / B.N. Sobolev, M.M. Shneider, E.I: Marusich, V.V. Mesyanzhinov (Poglazov B.F., Kurganov B.I., Kritsky M.S., and Gladilin K.L. eds.). In: Evolutionary biochemistry and related' areas of physicochemical biology. // Moscow /Bach Institute of Biochemistry and ANKO. - 1995. - P. 351-374

87. Soding J. Protein homology detection by HMM-HMM comparison / J. Soding // Bioinformatics. - 2005. - V. 21. - P. 951-960

88. Slrelkov S.V. Preliminary crystallographic studies of bacteriophage T4 fibritin confirm a trimeric coiled-coil structure / S.V. Strelkov, Y. Tao, M.G. Rossmann, L.P. Kurochkina, M.M. Shneider, V.V. Mesyanzhinov // Virology. - 1996. - V. 219. - No.l. - P. 190-4

89. Strelkov S.V. Structure of bacteriophage T4 fibritin M: a troublesome packing arrangement / S.V. Strelkov, Y. Tao, M.M. Shneider, V.V. Mesyanzhinov, M.G.Rossmann // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. - 1998. - V. 54(Pt 5). - P. 805-16

90. Sullivan M.B. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations / M.B. Sullivan, M.L. Coleman, P. Weigele, F. Rohwer, S.W. Chisholm // PLoS Biol. - 2005. -V. 3. - P. 144

91. Suttle C.A. Viruses in the sea / C.A. Suttle // Nature. - 2006. - No. 437. - P. 356-361

92. Tang C. On the role of structural information in remote homology detection and sequence alignment: new methods using hybrid sequence profiles / C. Tang, L. Xie, I.Y. Koh, S. Posy, E. Alexov, B. Honig // J. Mol. Biol., - 2003. -V. 334. - P. 1043-1062

93. Tetart F. Phylogeny of the major head and tail genes of the wideranging T4-type bacteriophages / F Tetart, C. Desplats, M. Kutateladze, C. Monod, H1W. Ackermann, H.M. Krisch // J Bacteriol. - 2001. - V. 183. No. l.-P. 358-366

94. Theimer C.A. Non-nearest neighbor effects on the thermodynamics of unfolding of a model mRNA pseudoknot / C.A. Theimer, Y. Wang, D.W. Hoffman, H.M. Krisch and D.P. Giedroc // J. Mol. Biol. - 1998. - V. 279. - P. 545-564

95. Thompson J. CLUSTALW: improving the t sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice / J. Thompson, D.G Higgins, T.J. Gibson // Nucleic Acids Res., -1994. - V. 22. - P. 46734680

96. Vingron M. Sequence alignment and penalty choice. Review of concepts, case studies and implecations / M. Vingron and M. Waterman // J. Mol. Biol. - 1994. -V. 235. - P. 1-12

97. Wang G. Scoring profile-profile sequence alignments / G. Wang and R.J. Dunbrack // Protein Sci. - 2004. - V. 13. - P. 1612-1626

98. Wittung-Stafshede P. Role of cofactors in protein folding / P. Wittung-Stafshede // Acc. Chem. Res. - 2002. - V. 35. - P. 201-208

99. Wood W.B. "Long tail fibers: genes, proteins, structure, and assembly" - in Bacteriophage T4 (Karam J.D., ed.) / W.B. Wood, F.A. Eiserling, R.A. Crowther // American society for microbiology, Washington D.C., - 1994. - P. 282-290

100. Yanagida M. Determination of gene product positions in bacteriophage T4 by specific antibody association / M. Yanagida, C. Ahmad-Zadeh // J .Mol Biol. - ^1970. - V. 51. - P. 411-21

101. Yeh L.S., Divergence of a DNA replication gene cluster in the T4-related bacteriophage RB69 / L.S. Yeh, T. Hsu, and J.D. Karam // J. Bacteriol. -1998. - V. 180. - P. 2005-2013

102. Yoshida T., Isolation and characterization of a cyanophage infecting the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa / T. Yoshida, Y. Takashima, Y. Tomaru, Y. Shirai, Y. Takao, S. Hiroishi, K. Nagasaki // Appl. Env. Microbiol., 2006, V. 72, No 2, P. 1239-1247

103. Zhang Y. Automated structure prediction of weakly homologous proteins on a genomic scale / Y. Zhang & J. Skolnick // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - V. 101, - P. 7594-7599

104. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction / Y. Zhang // BMC Bioinformatics. - 2008. - V. 9. - No. 1. - P. 40 [Epub ahead of print]

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю, к.б.н. A.B. Летарову за помощь в постановке экспериментальных целей и задач. Также я очень признателен Ольге Воронцовой (ИБХ РАН) за помощь в получении спектров кругового дихроизма, Максиму Фильчикову (ИБХ РАН) за помощь в построении моделей вторичных и третичных структур, а также к.б.н. Артему Кононенко (ИМБ РАН) за ценные советы и помощь при решении экспериментальных задач.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Латыпов, Олег Рустамович

1. Изолирован новый Т4-подобный энтеробактериофаг JS98C3. В последовательности фибритина этого бактериофага обнаружены аминокислотные мотивы, имеющие высокую степень гомологии с фолдоном фибритина фага Т4.2. Показано, что С-концевой домен фибритина бактериофага JS98C3 способен к эффективной автономной тримеризации, что делает перспективным использование входящих в его состав фолдонов в белковой инженерии в качестве модулей, инициирующих фолдинг химерных белков.3.\ В результате проведенного поиска в базе данных GenBank выявлено 16 новых аминокислотных мотивов, гомологичных фолдону фибритина фага Т4. Девять из вновь обнаруженных последовательностей находятся в последовательностях белков, не родственных фибритину, бактериофагов, относящихся к семейству Siphoviridae, что говорит о широкой распространенности подобных структур.4. In silico моделирование вторичных и третичных структур вновь обнаруженных нами в GenBank аминокислотных мотивов подтвердило предположение о сходстве их конформации с фолдоном фибритина бактериофага Т4, что может свидетельствовать об их сходной роли в фолдинге соответствующих белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Латыпов, Олег Рустамович, Казань

1. Куликов Е.Е Биоразнообразие и динамика бактериофагов фекалиях лошади. Е.Е. Куликов, А.С. Исаева, А.С. Роткина, А.А. Маныкин, А.В. Летаров. Микробиология. 2007. Т. 76. 271278.

2. Летаров А.В. Эволюционная динамика, фолдинг и функция некоторых фибриллярных белков бактриофагов, родственных Тчётным фагам энтеробактерий А.В. Летаров Труды ИНМИ им. Н. Виноградского. 2004. Вып. XII. 269-284.

3. Abkevich V.I. Specific nucleus as the transition state for protein folding: evidence from the lattice model V.I. Abkevich, A.M. Gutin, E.I. Shakhnovich Biochemistry. 1994. V. 33. P. 10026-10036

4. Akhter T. The neck of bacteriophage T4 is a ring-like structure formed by a hetero-oligomer of gpl3 and gpl4 T. Akhter, L. Zhao, A. Kohda, K. Mio, S. Kanamaru, F. Arisaka Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1774. No. 8. P. 1036-1043

5. Altschul S.F. Basic local aligment tool S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, D. Lipman J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410

6. Anfinsen C.B. The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain C.B. Anfinsen E. Harber, M. Jr. Sela, F.H. White Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961. V. 47. P. 1309-1314

7. Bailey T. Score distributions for simultaneous matching to multiple motifs T. Bailey and M. Gribskov J. Comput. Biol. 1997. V. 4. P. 45-59.

8. Baldi P., Hidden markov models of biological primary sequence information P. Baldi, Y. Chauvin, T. Hunkapiller, M.A. McClure Proc. 72

9. Baiter M. Virology. Evolution on lifes fringes M. Baiter Science. 2000. V. 289. No. 5486. P. 1866-1867

10. Boudko S. Domain organization, folding and stability of bacteriophage T4 fibritin, a segmented coiled-coil protein S. Boudko, Y. bonder, A. Letarov, N. Sernova, J. Engel and V. Mesyanzhinov Eur. J. Biochem. 2002. V. 269. P. 833-841

11. Boudko S.P. Design and crystal structure of bacteriophage T4 mini-fibritin NCCF S.P. Boudko S.V. Strelkov, J. Engel, J. Stetefeld J Mol Biol. 2004. V. 339. P. 927-35

12. Bowie J. A method to identify protein sequences that fold into a known three-dimensional structure J. Bowie R. Liithy, D. Eisenberg Science, -1991. V. 253. P. 164-170

13. Brussow H. Phage genomics: small is beautiful H. Brussow, R.W. Hendrix Cell. 2002. V. 108. No. 1. P. 13-16

14. Chibani-Chennoufi S. Isolation of Escherichia coli bacteriophages from the stool of pediatric patients in Bangladesh S. Chibani-Chennoufi, J. Sidoti, A. Bruttin, M.-L. Dillmann, E. Kutter, F. Qadri, S.A. Sarker, H. Brussow.. J. Bacteriol., 2004, V. 186, No 24. P. 8287-8294.

15. Comeau A.M. Modular architecture of the T4 phage superfamily: a conserved core genome and a plastic periphery A.M. Comeau, C. Bertrand, A. Letarov, F. Tetart, H.M. Krisch Virology. 2007. V. 362. No. 2. P. 384-96

16. Conley M.P. Bacteriophage T4 whiskers: a rudimentary environment-sensing device M.P. Conley, W.B. Wood Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1975. V. 72. No 9. P. 3701-3705

17. Coombs D.H. Studies on the structure, protein composition, and assembly of the neck of bacteriophage T4 D.H. Coombs, F.A. Eiserling. J. Mol. Biol. 1977. V. 116. No 3. P. 357-405

18. Demerec M. Bacteriophage-Resistant Mutants in Escherichia Coli 73

19. Dickson R. Structural proteins of bacteriophage T4 R. Dickson, S. Barnes, F. Eiserling J Mol Biol. -1970. V. 53. P. 461-74

20. Doermann A.H., Genetic control of capsid length in bacteriophage T4: clustering of ptg mutations in gene 23 A.H. Doermann, A. Pao, and P. Jackson J. Virol. -1987. V. 61. P. 2823-2827

21. Edgar R. COACH: profile-profile alignment of protein families using hidden markov models R. Edgar and K. Sjolander Bioinformatics 2004. V. 20 P. 1309-1318

22. Edgar R. Simultaneous sequence alignment and tree construction using hidden Markov models R. Edgar and K. Sjolander Bioinformatics. 2003. V. 19. P. 1404-1411

23. Efimov V.P. Fibritin encoded by bacteriophage T4 gene wac has a parallel triple-stranded alphahelical coiled-coil structure V.P. Efimov, I.V. Nepluev, B.N. Sobolev, T.G. Zurabishvili, T. Schulthess, A. Lustig, J. Engel, M. Haener, U. Aebi, S. Venyaminov J. Mol. Biol. 1994. V. 242. No 4. P. 470186

24. Espinosa J.F. Interplay between hydrophobic cluster and loop propensity in beta-hairpin formation J.F. Espinosa, V. Munoz S.H. Gellman J. Mol. Biol. 2001. V. 306. P. 397-402

25. Fersht A.R. Nucleation mechanisms in protein folding A.R. Fersht Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. V. 7. P. 3-9

26. Filee J. A selective barrier tohorizontal gene transfer in the T4- type bacteriophages that has preserved acore genome with the viral replication and structural genes J. Filee, E. Bapteste, E. Susko, H.M. Krisch Mol. Biol. Evol. 2006. V. 23. P. 1688-1696

27. Fokine A. Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4 /A. Fokine, P.R. Chipman, P.G. Leiman, V.V Mesyanzhinov, V.B. Rao, M.G. Rossmann Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 2004. V. 101. No. 16. P. 6003-6008 74

28. Frank S., Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering S. Frank, R.A. Kammerer, D. Mechling, T. Schulthess, R.J.B. Landwehr, Y. Guo et al.. J. Mol. Biol. 2001. V. 308. P. 1081-1089

29. Frydman J. Principles of chaperone-assisted protein folding: differences between in vitro and in vivo mechanisms J. Frydman, F.U. Hartl Science. 1996. V. 272. P. 1497-1502

30. Fuhrman J.A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects J.A. Fuhrman Nature. 1999. V. 399. No. 6736. P. 541-548

31. Games D. Mice as models: transgenic approaches and Alzheimers disease D. Games, M. Buttini, D. Kobayashi, D. Schenk, P. Seubert J. Alzheimers Dis. 2006. V. 9. P. 133-149

32. Gough J. Assignment of homology to genome sequences using a library of hidden markov models that represent all proteins of known structure J. Gough, K. Karplus, R. Hughey, C. Chothia J. Mol. Biol., 2001.-V. 313.-P. 903-919

33. Guthe S. Very Fast Folding and Association of a Trimerization Domain from Bacteriophage T4 Fibritin S. Guthe, L. Kapinos, A. Moglich, S. Meier, S. Grzesiek and T. Kiefhaber J. Mol. Biol. 2004. V. 337. P: 905-915

34. Halaby D.M. The immunoglobulin fold family: sequence analysis and 3D structure comparisons D.M. Halaby, A. Poupon, and J. Mornon Protein Eng. -1999. V. 12. P. 563-571

35. Hambly E. A conserved genetic module that encodes the major virion components in both the coliphage T4 and the marine cyanophage SPM2 E. Hambly, F. Tetart, C. Desplats, W.H. Wilson, H.M. Krisch, N.H. 75

36. Harris D.A. A murine model of a familial prion disease D.A. Harris, R. Chiesa, B. Drisaldi, E. Quaglio, A. Migheli, P. Piccardo, B. Ghetti Clin. Lab. Med. 2003. V. 23. P. 175-186

37. Helles G. A comparative study of the reported performance of ab initio protein structure prediction algorithms G. Helles J R Soc Interface. 2007. [Epub ahead of print].

38. Hendrix R.W. Bacteriophages with tails: chasing their origins and evolution R.W. Hendrix, G.F. Hatfull, M.C. Smith, Res. Microbiol. 2003.-V. 154.-P. 253-257

39. Hensley K. On the relation of oxidative stress to neuroinflammation: lessons learned from the G93A-SOD1 mouse model of amyotrophic lateral sclerosis K. Hensley, M. Mhatre, S. Мои, Q.N. Pye, C. Stewart, M. West, K.S. Williamson Antioxid. Redox Signal. 2006. V. 8. P. 2075-2087

40. Ivanitskii G.R. Does taxis exist in bacterial viruses? G.R. Ivanitskii, A.B. Medvinskii, A.A. Deev, A.A. Khusainov, M.A. Tsyganov Biofizika. 1995. V. 40. No. 1. P. 60-73

41. Jackson S.E. Folding of chy mo trypsin inhibitor Evidence for a two-state transition S.E. Jackson, A.R. Fersht Biochemistry. 1991. V. 30. No. 43. P. 10428-43

42. Karam J.D. DNA polymerase of the T4-related bacteriophages J.D. Karam, W.H. Konigsberg Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2000. V. 64. P. 65-96 44. Kim D. PROSPECT ii: protein structure prediction, method for genomescale applications D. Kim, D. Xu, J.T. Guo, K. Ellrott, Y. Xu Protein Eng. 2003. V. 16. P. 641-650

43. Kostyuchenko V.A. The tail structure of bacteriophage T4 and its mechanism of contraction V.A. Kostyuchenko, P.R. Chipman, P.G. 76

44. Lawrence J.G. Imbroglios of viral taxonomy: genetic exchange and failings of phenetic approaches J.G. Lawrence, G.F. Hatfull, R.W. Hendrix J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 4891-4905

45. Leckner J. The effect of the metal ion on the folding energetics of azurin: a comparison of the native, zinc and apoprotein J. Leckner, N. Bonander, P. Wittung-Stafshede, B.G. Malmstrom, B.G. Karlsson Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1342. P. 19-27

46. Leiman P.G. Structure and morphogenesis of bacteriophage T4 P.G. Leiman, S. Kanamaru, V.V. Mesyanzhinov, F. Arisaka, M.G. Rossmann Cell. Mol. Life. Sci. 2003. V. 60. P. 2356-2370

47. Letarov A.V. gpwac of the T4-type bacteriophages: structure, function, and evolution of a segmented coiled-coil protein that controls viral infectivity A. Letarov, X. Manival, C. Desplats, H.M. Krisch J. Bacteriol, 2005, V.187 No 3,1055-66.

48. Letarov A. The function and evolution of fibritins in T4-related phages: C-end of the story A. Letarov, O. Latypov. and H.M. Krisch.. //1st Texas Evergreen Phage/Virus Genomics and Ecology Meeting. 2

50. Letarov A.V. The carboxy-terminal domain initiates trimerization of bacteriophage T4 fibritin A.V. Letarov, Y.Y. Londer, S.P. Boudko, V.V. Mesyanzhinov Biochemistry. 1999. V. 64. No 7 P. 817-823

51. Levinthal C. Molecular model-building by computer C. Levinthal Sci Am. 1966. V. 214, No. 6. P. 42-52

52. Lifshits E.M. Physical Kinetics E.M. Lifshits, L.P. Pitaevskii Pergamon Press. Oxford. -1981

53. Lilie H. Advances in refolding of proteins produced in E. coli IH. Lilie, E. Schwarz, R. Rudolph Curr Opin Biotechnol. 1998 9 :497-501

54. Loayza D. Gene 32 transcription and mRNA processing in T477

55. Luby-Phelps K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area K. Luby-Phelps Int. Rev. Cytol. 2000: V. 192. P. 189-221

56. Mann N.H. The genome of S-PM2, a "photosynthetic" T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains N.H. Mann, M.R.J. Clokie, A. Millard, A. Cook, W.H. Wilson, P.J. Wheatley, A. Letarov, H.M. Krisch //J. Bacteriol. 2005. V. 187, P. 3188-3200

57. Martin J. The effect of macromolecular crowding on chaperonin- mediated protein folding J. Martin, F.U. Hartl Curr. Opin. Struct. Biol. 1997. V. 7. P. 41-52

58. Matsuzaki S. Cloning and sequencing of major capsid protein (mcp) gene of a vibriophage, KVP20, possibly related to T-even coliphages S. Matsuzaki, T. Inoue, M. Kuroda, S. Kimura, and S. Tanaka Gene. -1998. V. 222. P. 25-30 60. McPheeters D. S. Nucleotide sequences of the bacteriophage T2 and T6 gene 32 mRNAs D.S. McPheeters, G. Gosch, and L. Gold Nucleic Acids Res. -1988. V. 16. P. 9341

59. Meier S. Foldon, the natural trimerization domain of T4 fibritin, dissociates into a monomeric A-state form containing a stable b-hairpin: atomic details of trimer dissociation and local b-hairpin stability from residual dipolar couplings S. Meier, S. Guthe, T. Kiefhaber and. S. Grzesiek J. Mol. Biol. 2004. V. 334. P. 1051-1069

60. Miller E.S., Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4- related bacteriophage E.S. Miller, J.F. Heidelberg, J.A. Eisen, W.C. Nelson, A.S. Durkin, A. Ciecko, T.V. Feldblyum, O. White, I.T. Paulsen, W.C. Nierman, J. Lee, B. Szczypinski, CM. Fraser// J. Bacteriol. 2003. -V. 185, P. 5220-5233

61. Miller E.S. Bacteriophage T4 genome E.S. Miller, E. Kutter, G. 78

62. Monod C. The genome of the pseudoT-even bacteriophages, a diverse group that resembles the T-even phages C. Monod, F. Repoila, M. Kutateladze, F. Теtart, and H. M. Krisch.. J. Mol. Biol. -1997. V. 267. P.237-249

63. Mosig G. Gene expression: A paradigm of integrated circuits G. Mosig, D.H. Hall, in: J.D. Karam, J.W. Drake, K.N. Kreuzer, G. Mosig, D.H. Hall, F.A. Eiserling, L. Black, E.K. Spicer, E.M. Kutter, K. Carlson, E.S. Miller (Eds.) Molecular Biology of Bacteriophage T

64. American Society for Microbiology. Washington, DC. 1994. P. 127-131

65. Munoz V. A statistical mechanical model for beta-hairpin kinetics V. Munoz, E.R. Henry, J. Hofrichter W.A. Eaton Proc. Natl Acad. Sci. USA. -1998. V. 95. P. 5872-5879

66. Murzin A. Distance homology recognition using structural classification of proteins A. Murzin and A. Bateman Proteins 1997. S u p p l l P 105-112

67. Murzin A. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures A. Murzin, S.E. Brenner, T. Hubbard, С Chothia J. Mol. Biol. -1995. V. 247. P. 536-540

68. Nolan J. Genetic diversity among five T4-like bacteriophages J. Nolan, V. Petrov, С Bertrand, H.M. Krisch, J.D. Karam Virol. J. 2006. -V. 3.-P.30 70. OSullivan O. 3DCoffee: combining protein sequences and C. structures within multiple sequence alignment O. OSullivan, Notredame, K. Suhre, С Abergel, D.G. Higgins J. Mol. Biol. 2004. V. 340. P. 385-395

69. Panchenko A. Combination of threading potentials and sequence profiles improves fold recognition A. Panchenko, A. Marchler-Bauer, S.H Bryant J. Mol. Biol. 2000. V. 296 P. 1319-1331 79

70. Park J. Sequence comparisons using multiple sequences detect three times as many remote homologues as pairwise methods J. Park, K. Karplus, С Barrett, R. Hughey, D: Haussler, T. Hubbard, С Chothia J. Mol. Biol. -1998. V. 284. P. 1201-1210

71. Pedulla M.L. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes M.L. Pedulla, M.E. Ford, J.M. Houtz, T. Karthikeyan, C. Wadsworth, J.A. Lewis, D. Jacobs-Sera, J. Falbo, J. Gross, N.R. Pannunzio, W. Brucker, V. Kumar, J. Kandasamy, L. Keenan, S. Bardarov, J. Kriakov, J.G. Lawrence, W.R. Jacobs, R.W. Hendrix, G.F. Hatfull Cell. 2003. V. 113. P. 171-182

72. Petrov V. Plasticity of the gene functions for DNA replication in the T4-like phages V. Petrov, J. Nolan, C. Bertrand, D.Levy, C. Desplats, H.M. Krisch, J. Karam J. Mol. Biol. 2006. V. 361 P. 46-68

73. Prilipov A.G. Nucleotide and deduced amino acid sequence of bacteriophage T4 gene wac A.G. Prilipov, N.A. Selivanov, L.I. Nikolaeva, V.V. Mesyanzhinov Nucleic Acids Res. -1988. V. 16. No. 2 1 P 10361

74. Ravantti J.J. Comparative analysis of bacterial viruses Bam35, infecting a Gram-positive host, and PRD1, infecting Gram-negative hosts, demonstrates a viral lineage J.J. Ravantti, A. Gaidelyte, D.H. Bamford, J.K.H. Bamford Virology. 2003. V. 313. P. 401-414

75. Rohwer F. The phage proteomic tree: a genome-based taxonomy forphage/F. Rohwer, R. Edwards// J. Bacteriol. 2002.- V. 184. P. 4529-4535.

76. Ruska H. Die Sichtbarmachung der BakteriophagenLyse im 80

77. Sambrook J. Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edn. J. Sambrook, E.F. Fritch, T. Maniatis /New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989

78. Saren A.M. A snapshot of viral evolution from genome analysis of the Tectiviridae family A.M. Saren, J.J. Ravantti, S.D. Benson, R.M. Burnett, L. Paulin, D.H. Bamford, J.K.H. Bamford J. Mol. Biol. 2005. V. 350. P. 427-440

79. Seckler R. Assembly of multi-subunit structures. In Mechanisms of Protein Folding (Pain, R., ed.) R. Seckler Oxford University Press, Oxford.. 2000. P. 279-308

80. Selick H.E. Analysis of five presumptive protein-coding sequences clustered between the primosome genes, 41 and 61, of bacteriophages T4, T2, and T6 H.E. Selick, G.D. Stormo, R.L. Dyson, and B.M. Alberts J. Virol. -1993. V. 67. P. 2305-2316

81. Shakhnovich E.I. Theoretical studies of protein-folding thermodynamics and kinetics E.I. Shakhnovich Curr. Opin. Struct. Biol. 1 9 9 7 V 7 P 29-40

82. Shan Y. Fold recognition and accurate query-template alignment by a combination of PSI-BLAST and threading Y. Shan, G. Wang, H.X. Zhou Proteins, 2001. V. 42. P. 23-37

83. Sobolev B.N. Fibritin and adhesin of bacteriophage T4 tell-us how fibrous protein folds and assembles B.N. Sobolev, M.M. Shneider, E.I: Marusich, V.V. Mesyanzhinov (Poglazov B.F., Kurganov B.I., Kritsky M.S., and Gladilin K.L. eds.). In: Evolutionary biochemistry and related areas of physicochemical biology. Moscow /Bach Institute of Biochemistry and ANKO. 1995. P. 351-374

84. Soding J. Protein homology detection by HMM-HMM comparison J. Soding Bioinformatics. 2005. V. 21. P. 951-960

85. Slrelkov S.V. Preliminary crystallographic studies of 81

86. Strelkov S.V. Structure of bacteriophage T4 fibritin M: a troublesome packing arrangement S.V. Strelkov, Y. Tao, M.M. Shneider, V.V. Mesyanzhinov, M.G.Rossmann Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1998. V. 54(Pt 5). P. 805-16

87. Sullivan M.B. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations M.B. Sullivan, M.L. Coleman, P. Weigele, F. Rohwer, S.W. Chisholm PLoS Biol. 2005. V. 3.- P. 144

88. Suttle C.A. Viruses in the sea C.A. Suttle Nature. 2006. No. 437. P. 356-361

89. Tang C. On the role of structural information in remote homology detection and sequence alignment: new methods using hybrid sequence profiles С Tang, L. Xie, I.Y. Koh, S. Posy, E. Alexov, B. Honig J. Mol. Biol., 2003. -V. 334. P. 1043-1062

90. Tetart F. Phylogeny of the major head and tail genes of the wide- ranging T4-type bacteriophages F Tetart, С Desplats, M. Kutateladze, C. Monod, H1W. Ackermann, H.M. Krisch J Bacteriol. 2001. V. 183. No. 1.-P. 358-366

91. Theimer C.A. Non-nearest neighbor effects on the thermodynamics of unfolding of a model mRNA pseudoknot C.A. Theimer, Y. Wang, D.W. Hoffman, H.M. Krisch and D.P. Giedroc J. Mol. Biol. -1998. V. 279. P. 545-564

92. Thompson J. CLUSTALW: improving the v sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice J. Thompson, D.G Higgins, T.J. Gibson Nucleic Acids Res., -1994. V. 22. P. 46734680 82

93. Vingron M. Sequence alignment and penalty choice. Review of concepts, case studies and implecations M. Vingron and M. Waterman J. Mol. Biol. -1994. -V. 235. P. 1-12

94. Wang G. Scoring profile-profile sequence alignments G. Wang and R.J. Dunbrack Protein Sci. 2004. V. 13. P. 1612-1626

95. Wittung-Stafshede P. Role of cofactors in protein folding P. Wittung-Stafshede Ace. Chem. Res. 2002. V. 35. P. 201-208

96. Wood W.B. "Long tail fibers: genes, proteins, structure, and assembly" in Bacteriophage T4 (Karam J.D., ed.) W.B. Wood, F.A. Eiserling, R.A. Crowther American society for microbiology, Washington D.C., -1994. P. 282-290

97. Yanagida M. Determination of gene product positions in bacteriophage T4 by specific antibody association M. Yanagida, C. Ahmad-Zadeh J Mol Biol. 1970. V. 51. P. 411-21 101. Yeh L.S., Divergence of a DNA replication gene cluster in the T4- related bacteriophage RB69 L.S. Yeh, T. Hsu, and J.D. Karam J. Bacteriol. -1998. V. 180. P. 2005-2013

98. Yoshida Т., Isolation and characterization of a cyanophage infecting the toxic cyanobacterium Microcystis aeruginosa T. Yoshida, Y. Takashima, Y. Tomaru, Y. Shirai, Y. Takao, S. Hiroishi, K. Nagasaki Appl. Env. Microbiol., 2006, V. 72, No 2, P. 1239-1247

99. Zhang Y. Automated structure prediction of weakly homologous proteins on a genomic scale Y. Zhang J. Skolnick Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101, P. 7594-7599

100. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction Y. Zhang BMC Biomformatics. 2008. V. 9. No. 1. P. 40 [Epub ahead of print] 83