Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственная структура фибритина бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Пространственная структура фибритина бактериофага Т4"

Московский ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

р г в ад

> В «сК 1397

На правах рукописи

Стрелков Сергей Вячеславович Пространственная структура фибритина бактериофага Т4 Специальность 03.00.02 "Биофизика"

Автореферат

дессерашк па соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва, 1997 г.

Работа выполнена в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН, Институте кристаллографии им. А. В. Шубникова РАН, Purdue University, штат Индиана, США, и на Кафедре молекулярной биофизики Московского физико-технического института.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В. Б;. МешакмоЕ, доктор химических наук, прсфессор Э. Г. Ар; тюкян, Prof. Dr. Michas! G. Rossmann

Официальные доктор физико-математических ньук, профессор В. И. ИвьйОв

оппоненты: (Институт молекулярной биологии РАН),

доктор физнко-матеиатических наук В. Р. Мелик-Адашя (Институт кристаллографии РАН)

Ведущая организация: Инсгитут биоорганичгскол химии

им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Защита диссертации состоится "23" ДЕКАБРЯ 19»7г. в 15 на заседании Дисссртациожиго Совета КЗ&.91.10 при Мосшюк фкзняс-техническом институте (541700, г. Долгопрудный Московской обл.» Институтский пер., 9).

С диссертацией к ожно озна! смчться в Диссертационном Совете K063.9l.ii> при Московском физико-техническом институте.

Адрес автора: strelkov@glasnet.ru; http://bilbo.bio.purdue.edu/~sergeis

Автореферат разослан " " НО*? 15S / г-

Ученый секретарь Дисссртйчяоиного Совета кандидат физяко-математичг лсих наук

В. Б. 1Сиреев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Изучение пространственной структуры белков является принципиально важным направлением современной биологии. К настоящему моменту статический аспект пространственной организации белка (иерархия пространственной структуры, основные определяющие ее взаимодействия) изучен сравнительно полно. Динамический аспект структуры белков, непосредственно связанный с их функционированием, охарактеризован пока недостаточно. Это в наибольшей степени относится к процессу укладки полипептидной цепи в нативную структуру (фолдингу белка). Понимание процесса белкового фолдинга имеет не только общебиологическое, но и большое практическое значение. Нарушения процесса фолдинга вследствие мутаций, приводящие к образованию нефункциональных и/или нерастворимых белков, являются причиной ряда заболеваний человека.

Таким образом, в настоящий момент весьма- актуально экспериментальное изучение процесса фолдинга на примере модельных белков. В лаборатории проф. В. В. Месянжинова в качестве такого белка всесторонне исследуется фибритин бактериофага Т4, принадлежащий к классу суперспиральных фибриллярных (coiled coil) белков. Предлагаемая работа является частью этих исследований.

Задачи работы.

Главная задача данной работы состояла в определении пространственной структуры фибритина бактериофага Т4 методом рентгеновской кристаллографии. Наиболее существенно было установить строение-уникального сегментированного coiled coil фибритина, а также структуру его С-концевого глобулярного домена.

Во-вторых, было необходимо объяснить исходя из пространственной структуры свойства ряда генноинженерных мутантов фибритина.

В-третьих, представлялось важным проанализировать кристаллическую структуру в свете полученных ранее биохимических результатов с тем, чтобы построить качественную модель фолдинга фибритина, которая описывала бы последовательность событий в ходе этого процесса.

Кроме решения указанных задач, предлагаемая работа включила в себя предварительные кристаллографические исследования еще двух белков бактериофага Т4 — продуктов генов 9 и 11.

Научная ценность работы.

Фибритин является первым структурным белком фага Т4, для которого определена пространственная структура с атомным разрешением. Информация о структуре

играет ключевую роль в интерпретации результатов изучения процесса фолдинга фиб-рнтина методом сайт-направленного мутагенеза и другими методами. Знание структуры фибритина существенно также для понимания его функционирования в качестве белка-помощника (helper, chaperone) при сборке фаговой частицы.

Фибриллярные белки более сложны для рентгеноструктурных исследований, чем типичные глобулярные белки. Опыт, приобретенный в ходе определения пространственной структуры фибритина, представляет интерес для кристаллографии фибриллярных белков.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Она изложена на 105 страницах и содержит 41 рисунок и 13 таблиц.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Международном Симпозиуме "100 лет вирусологии" (Санкт-Петербург, 1992), Xth and Xlth International Evergreen Bacteriophage T4 Meetings (Olympia, USA, 1993 and 1996), Howard Hughes Medical Institute Meetings of International Research Scholars (Prague, 1996, and Warsaw, 1997), Xth International Congress of Virology (Jerusalem, 1996), American Crystallographic Association Annual Meeting (St. Louis, USA, 1997) и Ежегодных конференциях НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН и Института биохимии им. А. Н. Баха РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, список которых приведен в конце автореферата. Атомные координаты построенных моделей фибритинов M и Е занесены в Brookhaven Protein Data Bank под кодами lavy и laaO соответственно.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования

Бактериофаг Т4, инфицирующий клетки Е. coli, является одним из наиболее сложно устроенных вирусов [1]. Его двумя главными компонентами являются капсид и сократимый хвост. К основанию хвоста присоединяются шесть т. н. длинных и шесть коротких хвостовых фибрилл, ответственных за прикрепление к поверхности клетки-хозяина. Еще один набор из шести фибрилл, называемых бакенбардами или воротнич-ковыми нитями, присоединяется к верхней части хвоста. Бакенбарды образованы продуктом гена wac (whiskers' antigen control) фибритином, масса одной цепи которого равна 52kDa. Установлено, что бакенбарды выполняют роль молекулярного шаперо-

на, обеспечивая эффективную сборку и присоединение длинных хвостовых фибрилл на заключительной стадии формирования фаговой частицы.

В. П. Ефимов и др. [2] создали систему экспрессии гена пае в Е. coli и разработали метод выделения биологически активного белка в препаративных количествах. Реком-бинантный фибритин собирается в фибрнллярные частицы длиной около 530Â, каждая из которых образована тремя идентичными цепями.

В преобладающей части аминокислотной последовательности фибритина (486 остатков) присутствует гептадная периодичность, соответствующая схеме (abcdefg)n, где позиции and заняты небольшими гидрофобными остатками [3]. Эта периодичность является характерным признаком структуры типа coiled coil - суперспирали из двух или более a-спиралей. Образование такой суперспирали обеспечивает упаковку остатков в позициях andü единое гидрофобное ядро вдоль ее оси. Coiled coil представляет собой мотив укладки белков (фолд), широко распространенный в природе [4]. Однако, отличительной особенностью фибритина является наличие тринадцати отдельных сегментов с гептадной периодичностью (длиной от двух до шести гептад), имеющих структуру тройного параллельного coiled coil и соединенных небольшими петлями (см. Рис. 5). N-концевой и С-концевой участки цепи фибритина (47 и 29 остатков соответственно) не содержат гептадных повторов и, вероятно, образуют глобулярные домены.

Продукты генов (gene product, gp) 9 и 11 являются структурными компонентами базальной пластинки хвоста, которая состоит из примерно 15 различных белков.

■ Материалы и методы

Получение рекомбинантных белков проводили путем экспрессии плазмид [5, II], содержащих ген wac и его различные делеционные мутанты, а также гены 9 и 11, в клетках Е. coli BL21(DE3). Очистку белков осуществляли с помощью хроматографии на колонке с гидроксилапатитом, как описано в [2] и [6]. Чистота полученных белков была, не менее 95%. Присутствие в некоторых случаях минорных примесей не влияло на воспроизводимость кристаллизации и качество кристаллов.

Для кристаллизации использовали метод висячей капли [7] на культуральных 24-ячеечных пластиковых плашках Linbro Plate.

Регистрацию дифракционной картины осуществляли по методу вращения кристалла. Использовалось излучение серии К„ меди (X=1.54Ä), получаемое от источника с вращающимся анодом (Rigaku, Япония), и детектор типа image plate R-axis Ile (Molecular Structure Соф., США). Для охлаждения кристаллов до 100 - 110К использовали криостат на жидком азоте (Oxford Cryosystems), смонтированный на рентгенов-

- ской установке. Полученные дифракционные картины обрабатывали программами

- DENZO и SCA LEPA С К [9].

Расчеты проводили на рабочей станции "AIpha2000 (Digital) под операционной системой UNIX. Большинство использованных кристаллографических программ являются частью комплекса ССР4 [10]. Для обработки данных, собранных с двойниковых кристаллов фибритина М, мы создали программу DETWIN. Эту программу можно получить у автора.

Определение кристаллической структуры фибритина М

Поиск условий кристаллизации полноразмерного фибритина и его фрагментов. На

начальном этапе мы предприняли попытку кристаллизации полноразмерного фибритина. Однако во всех опробованных условиях при определенной концентрации осадителя происходила неспецифическая агрегация белка, которой, по-видимому, способствовала удлиненная форма тримера фибритина.

Последующие кристаллизационные эксперименты проводились с двумя фрагментами фибритина, называемыми фибритинами М и Е. Плазмиды, экспрессирующие эти белки, созданы В. В. Месянжиновым и М. М. Шнейдером [11]. Полипептидная цепь фибритина М содержит 74 аминокислотных остатка, которые соответствуют последнему сегменту coiled coil и С-концевому домену, а фибритин Е (119 остатков) включает три последних сегмента coiled coil (первый из них не полностью) и С-концевой домен (Рис. 1). В последовательность coiled coil фибритина М дополнительно внесены пять аминокислотных замен (Рис. 2). После экспрессии фибритины М и Е были хорошо растворимы. Было логично предполагать, что оба белка собираются в тримеры, структура которых близка к структуре соответствующих частей полноразмерного фибритина. Для поиска условий кристаллизации мы испытали 50 растворов осадителей из набора Crystal Screen Kit 1 (Hampton Research, США). Образование кристаллов фибритина М наблюдалось при использовании 15 из этих растворов. Это необычно хороший результат для первоначального скрининга. Кристаллы фибритина Е были получены с использованием лишь одного раствора (0.2М СаСЬ, 28% полиэтиленгликоля 400 в 0.1М HEPES/Na буфере, рН7.5).

Дальнейшая работа по определению кристаллической структуры фибритина М изложена в предлагаемой диссертации. Параллельно мы продолжили работу с кристаллами фибритина Е, которые давали дифракцию рентгеновских лучей до разрешения 2.2Á. Были получены три изоморфные производные, после чего структура была определена классическим методом полиизоморфных замещений. Модель фибритина Е была уточнена до свободного R-фактора 0.267 и традиционного R-фактора 0.217 (в ин-

тервале по разрешению 30 - 2.2А). В независимой части кристаллической ячейки содержится одна цепь тримера. Процесс определения структуры фибритина Е подробно описан нами в статье (Tao, Strelkov, Mesyanzhinov & Rossmann, 1997].

Рис. 1. Схема строения полноразмерного фибритина и фибритинов Е и М. Отдельные сегменты coiled coil обозначены прямоугольниками. N- и С-концевые домены изображены в виде овалов.

n с

ja I mm ........ми тиши nnmmimQ WT

вшшшЦ Е

вввф М

413

421

431

441

451

veesgltnkikaietdiasvrqevntakgnisslqgdvqalqea r s м n т

Рис. 2. Аминокислотная последовательность фибритина М. Нумерация остатков полноразмерного фибритина сохранена. Непосредственно под последовательностью фибритина М указаны пять остатков полноразмерного фибритина, которые были ^заменены. Показаны элементы вторичной структуры, определенные исходя из кристаллографических координат.

Кристаллизация фибритина М. В результате оптимизации условий кристаллизации были получены пригодные для рентгеноструктурного анализа кристаллы фибритина М трех типов. Кристаллизационные капли получали смешиванием 6ц! раствора белка с концентрацией 20т^ш1 в ЮтМ Тлв/НО буфере, рН7.5, содержащем 2тМ ЕОТАЛ^а, 0.5шМ ВТТ и 0.02% №№, и равного объема раствора осадителя, который помещали также в ячейку кристаллизационной плашки. Кристаллизация проводилась при 20°С. Кристаллы первого типа были выращены с использованием в качестве осадителя 1.75М сульфата и в 0.1М Тш-НС!, рН7.5. Эти кристаллы имели пластинчатый

Ч crabcdefqitbcdefcrabedefqabcdefcrabcdefql а

- coiled-coil domain-

461 471 481

gyipeaprdgqayvrkdgewvllstflspa

PI 02

^-earboxyterminal domain-

габитус (Рис. Г) и достигали размера 0.35х0.35х0.07тт5 через 3 - 5 дней. Кристаллы второго типа, имеющие форму двояковыпуклых линз без огранки (Рис. II), были получены с использованием раствора осадителя, содержащего 22% (объемн.) полиэтилен-гликоля со средней молекулярной массой 400 и 0.05М ацетата 2.п в 0.1М МЕЭЛ^а буфере, рН 6.0. Третий тип кристаллов был получен с 0.55М раствором тартрата Иа/К в 0.07М НЕРЕБЛЧа буфере, рН 7.5, в качестве осадителя.

Таблица 1. Сравнение нативных наборов данных для трех типов кристаллов фибритина М

Тип кристаллов (осадитель) Сульфат лития Полиэтилен-гликоль 400 Тартрат NaTK

Температура сбора данных комн. ЮОК ЮОК комн.

Пределы разрешения (А) Размеры кристаллической ячейки (А): а Ь 46 - 2.1 44.26 91.23 23-1.85 43.68 90.61 50 - 2.2 43.12 90.39 50-2.1 44.38 91.26

Я 1 в Лауэ-классе 3 тегче * 0.067 0.036 0.048 0.065

К а в Лауэ-классе 3 1 т тггяе * 0.456 0.454 0.061 0.158

ь а 0 0 0.49 0.41

5?

h I ■ _

ъ Отношение двойникования, определяемое в простейшем случае наличия двух двойниковых доменов как отношение объема меньшего из доменов к общему объему кристалла.

Сбор дифракционных данных. Первоначальный набор данных для кристаллов фибритина М первого типа (Табл. I) был собран при комнатной температуре, однако при этом наблюдалось значительное радиационное разрушение кристаллов. Качество и максимальное разрешение наборов данных удалось существенно повысить после того, как перешли к съемке при ЮОК (Табл. 2). Для этого кристалл предварительно переводили в криопротекторный раствор, содержащий 25% (объемн.) глицерина и 1.45М сульфата Li в 0.06М Tris/HCl буфере, рН 7.5, а затем помещали в петлю из нейлонового волокна и подвергали быстрому охлаждению (flash cooling) [8] в струе азота из кри-остата. Съемку картины дифракции с кристаллов, выращенных в присутствии поли-

L ~(Л)

* Рисунки, обозначенные римскими цифрами, расположены на цветной вкладке между стр. 12 и 13.

эгиленгликоля, проводили при ЮОК, причем непосредственно маточный раствор оказался хорошим криопротектором. Набор данных для кристаллов третьего типа был собран при комнатной температуре. Полученные наборы включали все рефлексы без отбраковки по На(I). Все три типа кристаллов имеют тригональную ячейку с очень близкими параметрами (Табл. 1). Однако, кристаллы второго и третьего типа проявляли склонность к двойникованию (см. ниже), поэтому на последующих этапах определения структуры использовались лишь данные, собранные с кристаллов первого типа.

Таблица 2. Характеристики наборов данных, собранных с кристаллов первого типа

Набор данных - Нативный Ксеноновая производная Уранильная производная

Температура сбора данных ШОК комнатная ЮОК

0.95 1.7 1.5

Число изображений Размеры кристаллической ячейки (А): а с 103 43.68 90.61 101 44.33 91.25 125 43.27 90.54

Пределы разрешения (А) 23 - 1.85 38-2.1 24 - 2.3

Число измеренных рефлексов 39783 39649 45405

Число независимых рефлексов 14861 11494 8423

Полнота <%)ь 89.8* (53.6) 98.4 (89.3) 99.7 (100.0)

Мозаичность (°) 0.53 0.28 0.91

0.036 (0.182) 0.077 • (0.373) 0.081 (0.235)

- 0.111 0.256

а Интервал по углу вращения при регистрации одного изображения. ь В скобках приведены данные для последнего (т. е. имеющего наибольшее значение <2sin9^.>) из 10 интервалов по разрешению, каждый нз которых содержит 10% всех рефлексов.

с-

I F„

h

' Полнота в интервале разрешений от 23 до 2.3А равна 99.5% .

Получение тяжелоатомных производных. Несмотря на отсутствие в аминокислотной последовательности фибритина М остатков Cys, Met и His, мы получили около десяти производных кристаллов первого типа, наборы данных для которых обладали

значениями RJ:^относительно нативного набора в интервале от 0.1 до 0.25. Для получения одной из производных кристалл помещали в атмосферу ксенона под давлением Юатм., которое поддерживалось в течение двух часов до начала и в ходе дифракционного эксперимента. Используемое для этого приспособление (предоставленное д-ром D. Moras, Университет г. Страсбурга, Франция) позволяло проводить сбор данных только при комнатной температуре (Табл. 2). Другая тяжелоатомная производная была получена вымачиванием кристаллов в 4 ш\1 растворе уранилацетата в течение четырех дней. Карты изоморфного и аномального разностного синтеза Паттерсона не могли быть уверенно интерпретированы ни для одной из производных, однако после решения задачи молекулярного замещения ксеноновая и урановая производные были расшифрованы путем анализа карт разностных синтезов Фурье.

Таблица 3. Максимумы перекрестной функции вращения (разрешение 10 - ЗА)

№ пика Коэфициент корреляцииа Обозначение молекулы а Ориентация (°) Р Y

1 19.8 А 3.5 0. 0.

2 17.5 В 0. 180. 9.1

3 10.8 С 0. 180. 114.8

t 7.4 - 93.9 0. 0.

§ 6.5 - 84.2 123.1 96.9

» Corr = , * —— ,-- . , . ... х 100.

JZ ( f,,-ЮГ pli^ - (О

I Первый ложный пик для ориентации тримера параллельно оси 1. § Первый ложный пик для произвольной ориентации.

Таблица 4. Решения задачи трансляции (разрешение 10 - 3 А)

Молекула R-фактор а Кос X )рдинаты в д :торон ячейк V ОЛЯХ и

А В С 52.6 49.3' 48.8 " 0. 1/3 2/3 0. 2/3 1/3 0. 0.4811 0.1214

" R - Xl^* ~ ^J/X F.4«■

h i к

' С учетом вклада молекулы А, зафиксированной в указанном выше положении, в Рсак. " С учетом вклада молекул А и В.

Молекулярное замещение. В качестве модели был использован гример, содержащий остатки 418 - 483 ранее определенной структуры фибритина Е, причем мутированные остатки были заменены остатками аланина. Ориентация оси тримера вдоль кристаллографической оси : была принята за нулевую. Два наиболее сильных пика перекрестной функции вращения, вычисленные с помощью программы AMoRe, отвечали ориентациям тримера соответственно параллельно и антипараллельно оси ; (Табл. 3). Трансформация, связывающая эти ориентации (А и В), соответствовала также максимуму собственной функции вращения при к=180°. Третий пик перекрестной функции вращения был значительно ниже первых двух и мог указывать на наличие третьего тримера С. Максимум функции трансляции для тримера А соответствовал тройной кристаллографической оси. Затем были последовательно определены положения три-меров А и В (Табл. 4). Ориентации и положения трех тримеров были совместно уточнены методом rigid body.

Расшифровка тяжелоатомных производных. Полученные данные для ксеноновой производной были изначально нормированы к нативному набору, собранному при комнатной температуре, и использованы для вычисления карт синтезов Фурье с коэффициентами FPH- FP (изоморфный синтез) и Ffu* - FeH~ (аномальный синтез) и фазами модели. Эти карты имели значительное сходство в расположении всех основных пиков. В каждой из молекул А, В и С присутствуют два основных места связывания ксенона, которые располагаются в coiled coil - домене на тройных кристаллографических осях в промежутках между соседними триплетами гидрофобных боковых цепей, принадлежащих остаткам в позициях a vi.d (Рис. VIII). Изоморфная и аномальная разностные карты для урановой производной находились в хорошем согласии и указывали на наличие пяти мест связывания, которые образуют кажущийся "кластер" с расстояниями 3.2 -4.0Á между атомами урана, расположенный в канате между молекулами А и В.

Расчет и комбинации фаз, полученных, методами изоморфного и молекулярного замещений. Заселенности и положения мест связывания Хе и уракила уточнялись с помощью программы MLPHARE. Затем были рассчитаны фазы белка, причем учитывалась как изоморфная информация, так и эффект аномального рассеяния. Было показано, что данные для ксеноновой производной можно использовать для расчета фаз белка в сочетании с нативным набором, собранным при 100К (несмотря на изменение параметров кристаллической ячейки при охлаждении — см. Табл. 1), но лишь до разрешения 3Á. Средний фактор достоверности изоморфных фаз составил 0.41. Полученные фазы были скомбинированы с фазами модели, полученной методом молекулярного замещения, с помощью программы SIGMAA. Вклад изоморфных фаз в комбинирован-

ные фазы преобладал при разрешении ниже 5Â, а при высоком разрешении вклад фаз модели был решающим. Комбинированные фазы могли быть затем лишь незначительно улучшены с помощью метода Ванга (solvent flattening) и модификации функции распределения электронных плотностей (histogram matching) с использованием программы DM.

Уточнение модели. Модель, полученная методом молекулярного замещения, была совмещена с 2F<>\» - Fojc и Fobs - Fciw - картами электронной плотности, вычисленными с улучшенными комбинированными фазами. Использовалась графическая программа О [12]. Большей части цепи каждой из молекул А, В и С соответствовала хорошо разрешенная электронная плотность, и требовались лишь незначительные поправки. Были встроены боковые цепи для некоторых мутированных остатков, напр., Arg433. Однако, качество карт электронной плотности для остатков А418 - 423, B4I8 - 437 и С418 -428 было неудовлетворительным. Эти остатки были временно удалены из модели, чтобы избежать ошибки, вызванной преобладающим влиянием фаз модели на рассчитываемую карту. Затем в ходе уточнения каждая из трех цепей постепенно "наращивалась" с N-коица по мере улучшения карт электронной плотности.

Автоматическое уточнение модели проводили с помощью комплекса программ X-PLOR версии 3.851 [13] с использованием всех рефлексов без срезки по сг(1). Для уточнения положений атомов применялась процедура минимизации функции псевдоэнергии ¿total по градиентному методу. Использование метода отжига (simulated annealing) не приводило к дополнительному улучшению модели. Затем уточнялись изотропные температурные факторы для каждого атома. На всех стадиях уточнения в качестве критерия улучшения модели руководствовались свободным R-фактором [14], вычисляемым по "тестовому" набору из 740 отражений (5% от полного набора). Было осуществлено моделирование "объемного" неупорядоченного растворителя (bulk solvent correction) с помощью стандартной процедуры X-PLOR, что позволило использовать данные в интервале разрешения 23 - 1.85А. Попытка уточнения с использованием ограничений по некристаллографической симметрии привела к ухудшению согласия модели с экспери--ментальными данными, что, очевидно, являлось отражением заметного различия кон-формаций молекул А, В и С.

После того, как процесс уточнения модели, содержащей только атомы белка, практически сошелся, за три последовательных "прохода" были добавлены молекулы воды. Эти молекулы помещались в положения, которые соответствовали пикам в 2F,ь^-Ftaic и Fobs - Fcaic - картах электронной плотности, расположенным вблизи потенциальных доноров и акцепторов водородных связей. Благодаря этому улучшилось качество карг электронной плотности, что позволило локализовать несколько дополнительных

Il

остатков на N-конпах трнмеров. На завершающей стадии правильность модели была проверена с использованием т. н. annealed omit - карты. Для этого небольшой участок белковой цепи или часть молекул воды временно удалялись, модель подвергали уточнению по методу отжига и затем вычисляли карту с коэффициентами - Лак.

анализ структуры фнбритина ii ее приложение к проблеме фолдинга

Особенности кристаллической структуры фибритина M

Кристаллическая решетка. Кристаллы фибритина М, выращенные в присутствие сульфата Li, принадлежат к редкой для белков пространственной группе РУ. к августу .1997 года Брукхейвеиский Банк [15] содержал лишь две белковые структуры, имеющие эту группу. Элементарная ячейка кристалла содержит тримеры А, В и-С, расположенные соответственно вокруг трех симметрически независимых осей третьего порядка. Ориентация тримера А антипараллельна ориентации тримеров В и С (Рис. VI). Доля объема кристаллов, занимаемая белком, составляет 55%. Приходящийся на единицу массы белка объем кристалла ( Vm) равен 2.15Â3/Da.

Решение задачи молекулярного замещения для молекулы С было значительно менее надежным, чем решения для молекул А и В, но его удалось подтвердить после рас-.шифровки ксеноновой производной. Сначала были простроены разностные карты Фурье для этой производной, вычисленные с фазами от модели, из которой была изъята молекула С. Оказалось, что такие карты все равно содержат пики, соответствующие местам связывания Хе в этой молекуле. Кроме гого, фазы модели, содержащей только .молекулы А и В, были скомбинированы с изоморфными фазами ксеноновой производной и использованы для построения карты с коэффициентами 2Fohs - которая подтвердила найденную ориентацию и положение молекулы С. Низкая контрастность решения задачи молекулярного замещения, вероятно, объяснялась тем, что эта молекула более отлична по конформации от исходной модели, чем молекулы А и В (см. ниже).

Характеристика построенной модели фибритина ¡VI. Основные показатели построенной модели приведены в Табл. 5. Распределение углов основной цепи <р и \\) таково, что 91.4% всех аминокислотных остатков (за исключением глицинов я пролинов) располагаются в наиболее благоприятных областях карты Рамачандрана, и ни один остаток не попадает в запрещенные или условно разрешенные области. Asp473 присутствует в необычной конформации с <р=45°, что связано с нахождением этого остатка в петле типа "(5-поворот". Три цепи А, В и С были сравнены между собой, а также с фибритином Е, после попарного наложения друг на друга с помощью программы LSQKAB (Табл. 6). Отличие каждой из молекул А. В и С от фибритина Е лишь ненамного больше, чем различия между самими этими молекулами.

Таблица 5. Параметры конечной модели

Упорядоченные остатки:

молекула А 419-486

молекула В 432 - 485

молекула С 418-485

Общее число неводородных атомов белка 1441

Число молекул воды:

первая координационная оболочка белка 183

последующие оболочки 94

Свободный Я-фактора 0.253 (0.416)

Рабочий К-фактора 0.220 (0.317)

Среднеквадратичные отклоненияь:

длин связей (А) 0.006

валентных углов (°) 1.3

торсионных углов (°) 24.9

Средние температурные факторы (А2):

молекула А 24.8

молекула В 30.2

молекула С 38.0

молекулы воды 42.1

/,..■/ л 4

для всего интервала по разрешению, 23 - 1.85А(в скобках для 1.93 - 1.85А). ь По отношению к "идеальным" значениям по Engh и НиЬег [16].

Таблица 6. Сравнение молекул А, В и С фибритина М и молекулы фибритина Е

А В С Фибритин Е

А 0.56 0.62 0.75

В 1.40 0.62 0.67

С 1.13 1.45 1.07

Фибритин Е 1.50 1.39 1.88

Среднеквадратичные отклонения (в А) для атомов основной цепи и атомов боковых групп приведены соответственно над и под диагональю.

Подписи к рисункам на цветной вкладке

Рис. I. Кристаллы фибритина М, выращенные с использованием сульфата лития. Увеличение 20х.

Рис. II. Кристаллы фибритина М, выращенные с использованием PEG. Ув. 20х. Рис. Ш. Первая кристаллическая форма gp9. Ув. 40х. Рис. IV. Вторая кристаллическая форма gp9. Ув. 20х.

Рис. V. Стереоизображение 2F„hj-Fl„lc карты электронной плотности для цепи В в области остатков с 432-го (вверху рисунка) по 463-ий (внизу). Цвет полипептидной цепи изменяется в соответствии с атомными температурными факторами от темносинего (при В=5к1) до красного (80Á;) в последовательности цветов радуги. Связанные молекулы воды показаны в виде сфер голубого цвета. Карта электронной плотности изображена при двух срезках: 0.65а — в виде "сетки" желтого цвета, и 1.5а - в виде полупрозрачной поверхности оранжевого цвета.

Рис. VI. Упаковка тримеров фибритина М в кристаллах, а. Проекция вдоль оси ;. Ь. Вид в плоскости (110). Показаны Са-остовы молекул, цвет которых обозначает средний по остатку температурный фактор аналогично Рис. V. Фиолетовым цветом показано ожидаемое положение разупорядоченных остатков 418 - 431 молекулы В. Рис. VII. Ленточная диаграмма фибритина М.

Рис. VIII. Два основных места связывания ксенона в домене coiled coil молекулы А. Изоморфная и аномальная разностные карты Фурье с фазами конечной модели изображены соответственно оранжевым и голубым цветами. Показаны две из трех цепей молекулы. .Желтым цветом выделены остатки, формирующие гидрофобное ядро. Рис. IX. Вид С-ксшцевого домена вдоль оси тримера. Рис. X. Кристаллы gp 11. Увеличение 40х.

Частичная разупорядоченность белковых цепей и кристаллические контакты. Качество 2F„h, - Fcak карт электронной плотности для N-концеимх частей дсмепоз coiled coil всех трех молекул оставалось низким даже в окончательной модели. Это может быть связано с повышенной конформационной подвижностью или же с частичной раз-упорядоченностью указанных участков. Степень разупорядоченности увеличивается к N-концу в каждом из тримеров, о чем свидетельствует также монотонное возрастание атомных температурных факторов (Рис. 3). Наиболее сильно разупорядочен тример В (Рис. V). Температурные факторы в С-концевом домене молекулы С выше, чем в большей части ее домена coiled coil.

Описанные явления можно объяснить, если принять в рассмотрение расположение межмолекулярных контактов (Рис. 3 и VI). Наиболее важными для формирования кристаллической решетки являются контакты между С-концевыми доменами тримеров А и

420 430

440 450 460 Негйие питЬег

470 480

Рис. 3. Зависимость средних на остаток температурных факторов атомов основной цепи молекул А, В и С от номера остатка. Кроме того, над каждым графиком отмечены участки соответствующей молекулы, вовлеченные в кристаллические контакты. Вертикальные отрезки обозначают количество атомов, участвующих в таких контактах, для каждого остатка. Считалось, что атом участвует в кристаллическом контакте, если он расположен на расстоянии менее 5.0А. к какому-либо из атомов соседнего тримера.

В, а также контакты N- и С-концевых частей одноименных гримеров в соседних ячейках, связанных единичной трансляцией по оси z. Эти контакты, в принципе, достаточны для формирования наблюдаемой кристаллической решетки только лишь молекулами А и В при отсутствии молекул С. Домены coiled coil различных молекул, имеющие меньший диаметр, чем С-концевые домены, практически нигде не взаимодействуют друг с другом.

Очевидно, что чем дальше от N-конца молекулы находится ее первый контакт с С-концевым доменом соседней молекулы, тем сильнее проявляется разупорядоченность N-концевого участка coiled coil (Рис. 3). Относительно высокую подвижность С-концевого домена молекулы С также легко объяснить: в то время как С-концевые домены молекул А и В образуют достаточно интенсивный контакт, С-концевой домен молекулы С контактирует только с coiled coil молекулы А. Роль кристаллических контактов подтверждается и четкой корреляцией между температурными факторами частей тримеров, соседствующих в латеральном направлении (Рис. VI, Ь),

Структурированный растворитель. Тример фибритина М, обладающий вытянутой формой и небольшим молекулярным весом, имеет высокое отношение поверхности к объему и сильно гидратирован. Мы провели сравнение характеристик структурированного растворителя в кристаллах фибритина М и нескольких других фибриллярных и глобулярных белков. На один остаток фибритина в кристаллической структуре приходится в среднем 1.46 упорядоченных молекул воды, что выше, чем для типичных белков. В кристаллах фибритина М упорядочены около 1/3 от полного числа молекул воды, что также необычно много. Как и следовало ожидать, хорошее согласие модели с экспериментальными данными в ходе уточнения было достигнуто только после добавления молекул воды (Табл. 7).

Таблица 7. Значения Л-факторов модели на различных этапах уточнения

¿Модель после молекулярного замещения ' ■ До добавления молекул воды ь Конечная модель, включая молекулы воды Конечная модель без молекул воды с

free 0.375 0.332 0.253 0.321

^IWI г к 0.370 0.276 0.220 0.286

-1 Модель, полученная в результате молекулярного замещения, после предварительного уточнения температурных факторов всех атомов.

ь Наилучшая уточненная модель, содержащая только атомы белка, перед началом встраивания молекул воды.

1 Окончательная модель, из которой были изъяты молекулы воды, после перенормировки /■"„/,, к новым н вычисления заново поправки на объемный растворитель.

Гемиэдрическое двойникование в кристаллах фибритииа М. Наблюдаемая симметрия дифракционной картины для кристаллов второго типа была выше, чем для первого типа, и соответствовала Лауэ-группе 3 \т (т. е. кажущейся пространственной группе Р312) (Табл. 1). Эта симметрия дифракционной картины могла быть объяснена только присутствием почти идеального гемиэдрического двойникования по плоскости базы [17], в то время как истинной пространственной группой симметрии была Р3. При таком двойниковании кристалл состоит из нескольких доменов, принимающих одну из двух ориентации, а дифракционные картины от этих ориентации полностью накладываются. Для кристаллов второго типа было найдено 6 решений задачи молекулярного замещения, три из которых соответствовали одной из доменных ориентации и три -другой. Кристаллическая упаковка каждого домена близка к упаковке первого типа кристаллов. В кристаллах третьего типа имелось аналогичное двойникование, но оно не было идеальным (Табл. 1).

Пространственная структура фибритииа

Сравнение структур фибритинов M и Е. Фибритины M (Рис. VII) и Е (Ряс. 4) имеют очень близкую пространственную структуру как в подавляющей части общего сегмента coiled coil, так и в С-концевом домене (см. Табл. 6). Единственное небольшое отличие состоит в конформации N-концевой части coiled coil (остатки 418 - 428): расстояние между а-спиралями постепенно увеличивается в фибритине M в сторону N-конца, а вся суперспираль немного раскручивается. В результате первым остатком, участвующим в формировании гидрофобного ядра coiled coil оказывается 11е422, в то время как в фибритине Е таким остатком является Leu418. Расстояние между Си-атомами остатков 422 в двух структурах после совмещения равно I.4Â. Мы считаем, что описанные конформационные отличия не связаны с аминокислотными заменами в последовательности фибритииа М, но объясняются отсутствием предшествующих сегментов coiled coil, а также, возможно, взаимодействиями в кристаллическом контакте между одноименными тримерами фибритина М.

Структура coiled coil. В результате кристаллографических исследований фибритинов Е и M получена структура трех последних сегментов coiled coil полноразмерного фибритина, обозначаемых а 10, all и а 12. Для каждого сегмента были рассчитаны параметры [18] coiled coil (Табл. 8). Параметры сегмента а12 в фибритинах Е и M практически идентичны.

Таблица 8. Параметры coiled coil - сегментов alO, al 1 и al2 в фибритине Е

Сегмент alO (неполный) all al2

Число гептадных повторов 2.5 2 5.5

Радиус суперспирали (А) 6.4 - ' 6.6 6.2

Шаг суперспирали (А) 165.2 109.7 138.6

Угол между осями а-спиралей (°) 27.2 41.3 31.5

Радиус изгиба оси а-спирали (А) 114.9 53.0 84.4

Радиус а-спирали (А) 2.27 2.24 2.30

Шаг а-спирали (А) 5.50 5.60 5.48

Число остатков на оборот а-спирали 3.64 3.66 3.63

Среднеквадратичное отклонениеа (А) 0.32 0.49 0.33

1 Среднеквадратичные отклонения наблюдаемых положений Са-атомов от их положений в соответствующей идеальной суперспирали

В структуре фибритина Е присутствуют две петли, L10 и LI 1, соединяющие соответственно сегмент alO с al 1 и сегмент all с a 12, причем "устройство" обоих мест сочленения очень похоже. Каждый последующий сегмент является почти точным продолжением суперспирали предыдущего (Рис. 4). По сравнению с непрерывной а-

спиралью в месте вставки петли отсутствуют два остатка, однако два последних остатка сс-спирали одного сегмента соединены с двумя первыми остатками а-спирали следующего сегмента каноническими водородными связями (связи между остатками "1" и "5" спирали). Каждая из петель начинается и заканчивается остатками глицина.

Описанные наблюдения позволяют улучшить предложенную ранее схему строения домена coiled coil полноразмерного фибритина [2]. Количество и примерное положение

Ь с d е £ я а

51 v"1 L R N ~

56 Е V L D К N I

63 G I L К Т S L

'ТО Е т А N S D I

77 К т I Q G I L

97 I N К К D I

103 S D Ь к т L Т

110 S Е Н т Е I L

117 N G Т N N Т V

124 D S X L А D X

144 I R N D L

149 Ь W I К R Е L

176 м К Н R I

181 I N N Т D V I

188 Т S Q G I R L

208 S L Т I Е V

214 G N L R Е Е L

231 V Y S R L

236 N Е I D Т К Q

243 Т Т V Е S D I

250 S А I К т S 1

(а1)

DVSGDIE ALAQIG

(о2)

GPFNAEA NSVYRT

(иЗ)

GQYTGQD INGLPW GNPSSG

(а4а)

SELETKF IESDVG

(а4Ь)

GPKPPSF SQN

(CC5) GYPGNN

(L1)

(L2)

(L3)

(L4a)

(L4b)

(L5)

Ь с d е £ д а

263 S т 1 Т s \Г

269 N т N Т D N I

276 А S X N L Е L

288 X К Q R L

293 -т V I Е т S I

308 I К G Q I

313 К D N Т Т S I

320 Е S L N G I V

334 L R А N V

339 S W L N Q I V

359 S L L N R V

365 S т I Е Т S V

372 S G L N N А V

379 Q N L 0 V Е X

392 I К a Q V

397 V Л L N т L V

418 L Т и S I

423 к А Я г т N X

430 А S V т Q Е V

437 N т А к в N I

444 S S L Q в D V

451 Q А L Q Е А

(аб)

(а7)

(а8)

GENTSSG (L8) (а9)

GTDSSGG QPSPPG 1 '

(«10)

GNNSAG

(0С11) .

NGTNPUG STVEERG

(«12)

GSTP____

Рис. 5. Схема предполагаемого строения домена coiled coil полноразмерного фибритина. Участки аминокислотной последовательности, содержащие гелтадные повторы и образующие вероятные сегменты coiled coil, представлены в виде двух вертикальных колонок. Справа от каждой колонки вынесены остатки, которые, скорее всего, образуют петли. Остатки в позициях гидрофобного ядра обведены в рамки. Последовательность фибритина Е с известной структурой выделена жирным шрифтом.

S

сегментов coiled coil остается без изменений, но уточняются остатки, образующие петли. В новой схеме каждый сегмент начинается в позиции с или d и заканчивается в позиции а, а первые и последние остатки петель являются глицинами или небольшими полярными остатками (Рис. 5). Кроме того, в старой схеме остатки Tyrl41 и Phe201 находились внутри (двух различных) сегментов coiled coil в гептадной позиции а. В новой схеме примыкающие к этим сегментам петли расширены так, чтобы включить указанные остатки, поскольку присутствие ароматических остатков в позиции а маловероятно по причине стереохимических ограничений.

Эффект аминокислотных замен в домене coiled coll фибритнна ¡VI. Мутация Ser421->Lys приводит к образованию солевого мостика между боковыми группами Lys421 и Glu426, занимающими гептадные позиции g не соответственно, причем солевой мостик формируется остатками, находящимися в разных цепях одного тримера. Вероятно, что такой мостик стабилизирует coiled coil. Замены остатков 428 на Asp и 433 на Arg были задуманы для создания еще одного межцепочечного солевого мостика, однако, судя по картам электронной плотности, такой мостик отсутствует. Asn425 заменен в фибритине М на остаток изолейцина, относящийся к числу наиболее часто встречающихся в позициях а и d суперспиральных белков, поэтому эта замена не создает каких-либо осложнений.

Структура С-концевого домена. Остатки 457 - 486 трех цепей фибритина формируют единый глобулярный домен. В каждой цепи присутствуют два коротких ß-тяжа (Рис. 2), соединенных петлей с конформацней " ß-поворот", так что образуется структура типа шпильки, стабилизированная пятью водородными связями..Три симметрично расположенные шпильки образуют;структуру, напоминающую пропеллер, в плоскости, перпендикулярной тройной оси (Рис. IX). Начало первого ß-тяжа соединено с концом а-спирали петлей из 12 остатков. Основу С-концевого домена составляет плотное гидрофобное ядро (Рис.5). Остаток Тгр476 и алифатическая часть боковой цепи А г "471 расположены так, что вокруг оси тримера формируется замкнутое гидрофобное кольцо Trp-Arg-Trp-... .

Модель фолдинга фибритииа

Ранее было показано, что мутант фибритина, в котором удалены последние 18 остатков (начиная с Туг469), при экспрессии агрегирует неспецифическим образом [2]. Это наблюдение можно объяснить исходя из трехмерной структуры. Скорее всего, компактная структура, аналогичная интактному С-концевому домену, в этом случае не образуется, что является причиной последующего неправильного фолдинга всей моле-

кулы (см. далее). Мутанты с единичными заменами Тгр476-»Ьеи и Тгр476-»5ег также нерастворимы [11]. Вероятно, что эти замены нарушают стабильность гидрофобного ядра С-концевого домена.

Рис. 6. Стереоизображение С-концевого домена. Показана только одна цепь тримера. Обозначены остатки, участвующие в формировании гидрофобного ядра.

Мы предполагаем, что фолдинг фибритина начинается с образования р-шпилек на С-концах цепей, а затем взаимодействие С-концевых участков трех цепей приводит к формированию глобулярного домена, который выполняет роль зародыша фолдинга (фолдона). После этого образуются а-спирали, формирующие coiled coil. Судя по последовательности, центршгьная часть цепи фибритина одинаково способна к образованию суперспирали из двух или трех цепей, однако именно присутствие С-концевого домена определяет тримерность образующегося coiled coil. Кроме того, С-концевой домен обеспечивает правильное выравнивание белковых цепей в направлении вдоль оси тримера.

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ И РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫП АНАЛИЗ БЕЛКОВ GP9 И GPll

Получение и рентгеноструктурный анализ первой кристаллической формы gp9.

Кристаллизацю проводил» при 20"С в висячих каплях, полученных смешиванием раствора белка с концентрацией 6mg/ml в ЮшМ Tris/HCl буфере, рН7.5, с равным объемом противораствора, содержащего 0.5М сульфата аммония в 0.1М Na-ацетатном буфере, рН4.0. Полученные кристаллы, обладающие ромбоэдрической огранкой (Рис. III), принадлежат к пространственной группе R32 с параметрами ячейки a=b=86.5A, с=156.2А. а=р=90°, у= 120° и дают рентгеновскую дифракцию до разрешения 2.7А. В независимой части кристаллической ячейки содержится одна цепь gp9. Удалось получить и затем расшифровать одну тяжелоатомную производную, однако впоследствии перешли к изучению второй формы кристаллов, дающей дифракцию до более высокого разрешения.

Получение второй кристаллической формы н начальный этап определения структуры gp9. Первоначально единственный кристалл новой формы был получен в висячих каплях, аналогичных применявшимся для кристаллизации первой формы, но с проти-вораствором, содержащим 28% (объемн.) полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400Da и 0.2М СаСЬ в 0.1М HEPES/Na буфере, рН 7.5. При попытках воспроизведения этого опыта спонтанная нуклеация кристаллов происходила только в 10 - 15% от числа идентичных висячих капель, часто лишь по прошествии более одного месяца. Получение необходимого количества.кристаллов было осуществлено по методу streak seeding [7]. Кристаллы, изоморфные исходным самозарожденным кристаллам, были различимы уже через 12 часов после "высева" затравочных микрокристаллов и достигали размера до I .Omm менее чем через одну неделю (Рис. IV).

Нативный набор данных для этой кристаллической формы был собран при 110K до разрешения 2.0А. Интересно, что вторая кристаллическая форма, как и первая, относится к пространственной группе R32, но размеры ячейки составляют а=Ь=96.0А, с=445.2А. Максимально допустимое количество цепей gp9 в независимой части такой ячейки равно четырем. Набор данных для тяжелоатомной производной, приготовленной вымачиванием в растворе EtHgPCh, имел разрешение 2.5А и Я,ед=0.32 относительно нативного набора. Найдены два основных места связывания тяжелых атомов. Расчет изоморфных фаз дал значение среднего фактора достоверности фаз, равное 0.42. Определение структуры продолжает В. Костюченко.

Кристаллизация gpll. Кристаллы продукта гена 11 были получены в висячих каплях с использованием раствора белка с концентрацией 0.7mg/ml и противораствора, содержащего 0.5М сульфата аммония в 0.1М буфере, при всех значениях рН от 4.0 до 9.0.

Кристаллы имели вид правильных шестиугольных призм (Рис. X), причем добавление

0.6. мягкого детергента Р-октилглюкозида способствовало росту призм с большим отношением высоты к размеру основания. Кроме того, при смешивании в пробирке равных объемов растворов белка и 2М сульфата аммония удалось получить двумерные микрокристаллы, пригодные для электронной микроскопии высокого разрешения.

Основные результаты и выводы

1. С помощью рентгеновской кристаллографии решена структура фрагментов Ми Е фибритина бактериофага Т4 с разрешением 1.85А и 2.2А соответственно. Определение структуры фибритина Е было выполнено по методу полиизоморфного замещения, а в случае фибритина М использовалась комбинация методов молекулярного и полиизоморфного замещения. Каждый из фрагментов представляет собой фибриллярный гомотример, состоящий из параллельного а-спирального coiled coil и С-концевого глобулярного домена.

2. Рассчитаны параметры coiled coil в фибритинах М и Е. На основании анализа структуры петель в домене coiled coil фибритина Е уточнена схема сегментации coiled coil фибритина дикого типа.

3. С-концевой домен тримера, формируемый 29 остатками каждой цепи, содержит структуру типа пропеллера из трех симметрично расположенных Р-шпилек и стабилизируется плотным гидрофобным ядром.

4. Полученные структурные данные в сочетании с результатами направленного мутагенеза позволяют предположить, что процесс фолдинга фибритина начинается с взаимодействия коротких С-концевых участков трех цепей и формирования глобулярного домена, который выполняет роль зародыша фолдинга (фолдона). Это (i) определяет тримерность образующегося затем coiled coil и (it) обеспечивает правильное выравнивание белковых цепей в направлении вдоль его оси.

5. Изучены 3 различных типа кристаллов фибритина М, полученные с использованием в качестве осадителей Li2S04, полиэтиленгликоля 400 и тартрата Na/K соответственно. Все кристаллы принадлежат к редкой пространственной группе РЗ и имеют практически идентичные параметры элементарной ячейки и упаковку белковых.мо- • лекул. Однако, в условиях с полиэтиленгликолем и тартратом происходит к образованию кристаллов с гемиэдрическим двойникованием.

i. Для получения одной из тяжелоатомных производных кристаллов фибритина М использован газообразный ксенон, который связывается на оси coiled coil в гидрофобных полостях. Указанный метод может быть эффективно применен для других суперспиральных белков.

1. Установлено, что отличительными особенностями кристаллов фибритина М являются (0 повышенная подвижность значительных участков белковой цепи, которая возникает вследствие малого количества межмолекулярных контактов, а также (//) высокое содержание упорядоченных молекул растворителя.

I. Получены и исследованы две кристаллические формы продукта гена 9 бактериофага Т4. Вторая форма в настоящий момент используется для определения пространственной структуры. Кроме того, получены кристаллы продукта гена 11 фага Т4, пригодные для структурного анализа.

Публикации по материалам диссертации

Журнальные статьи

1. Strelkov, S. V., Zurabishvili, Т. G„ Nepluev, I. V., Efimov, V. P., Isupov M. N„ Harutyunyan E. H., & Mesyanzhinov, V. V. (1993) Crystallization and preliminary crystallographic characterization of bacteriophage T4 baseplate protein encoded by gene 9. J. Mol. Biol., 234,493-495.

I. Strelkov, S. V., Tao, Y., Rossmann, M. G., Kurochkina, L. P., Shneider, M. M. & Mesyanzhinov, V. V. (1996). Preliminary crystallographic studies of bacteriophage T4 fibritin confirm a trimeric coiled-coil structure. Virology 219, 190-194.

i. Tao, Y., Strelkov, S. V., Mesyanzhinov, V. V., & Rossmann, M. G. (1997) Structure of bacteriophage T4 fibritin: a segmented coiled coil and the role of the C-terminal domain. Structure 5, 789-798.

i. Strelkov, S. V., Tao, Y„ Shneider, M. M„ Mesyanzhinov, V. V., & Rossmann, M. G. Crystal structure of bacteriophage T4 fibritin M: a troublesome packing arrangement. Принята к печати в Acta Crystallographica D.

Гезисы докладов

I. Nepluev, I. V., Efimov, V. P., Sobolev, B. N.. Zurabishvili, T. G., Strelkov, S. V., Rassulin, Y. Y,, Sadvkova, G. K., Pakhomova, A. V., Marusich, E. I., & Mesyanzhinov, V. V. Bacteriophage T4 as a model for protein folding. Abstracts of International Symposium "100 Years of Virology", St. Petersburg, September 21-25, 1992, p. 75.

I. Mesyanzhinov, V. V., Strelkov, S. V., et al. Crystallization and preliminary crystallographic characterization of bacteriophage T4 baseplate protein encoded by gene

9. Abstracts of Xth International Evergreen Bacteriophage T4 meeting, July 29 - August 3,1993, Olympia, WA, USA, p. 17.

3. Mesyanzhinov V.V., Tao Y., Strelkov S. V., & Rossmann M. G. Structure, folding and assembly of bacteriophage T4 fibritin. Abstracts of Howard Hughes Medical Institute Meeting of International Research Scholars, Prague, June 23-26, 1996, p. 343.

4. Mesyanzhinov V. V., Tao Y., Strelkov S. V., Kurochkina L. P., & Rossmann M. G. 3D structure of bacteriophage T4 fibritin. Abstracts of Xth International Congress of Virology, Jerusalem, August 11-16, 1996, p. 81.

5. Strelkov, S. V., Tao Y., Rossmann, M. G., & Mesyanzhinov, V. V. Crystallographic studies of bacteriophage T4 fibritin. Abstracts of Evergreen International Bacteriophage T4 Meeting, Olympia, WA, USA, August 8-12, 1996, p.30.

6. Strelkov, S. V., Tao Y., Mesyanzhinov, V. V., & Rossmann, M. G. Crystal structure of bacteriophage T4 fibritin M: a troublesome packing arrangement. Abstracts of American Ciystallographic Association Annual Meeting, St. Louis, MO, USA, July 21-25, 1997.

7. Miroshnikov, K. A., Marusich, E. I., bonder, Y. Y., Shneider M. M., Pronina, M. A., Mesyanzhinov, V. V., Strelkov, S. V., Tao Y., & Rossmann, M. G. Protein engineering based on a novel class of trimeric fibrous proteins. Abstracts of Howard Hughes Medical Institute Meeting of International Research Scholars, Warsaw, June 24-27, 1997, p. 31.

Представление атомных координат в Brookhaven Protein Data Bank

1. Strelkov, S. V., Tao, Y., Mesyanzhinov, V. V., & Rossmann, M. G. (1997) Atomic coordinates of bacteriophage T4 fibritin fragment M. PDB accession number lavy.

2. Tao, Y., Strelkov, S. V., Mesyanzhinov, V. V., & Rossmann, M, G. (1997) Atomic coordinates of bacteriophage T4 fibritin fragment E. PDB accession number laaO.

Цитируемая литература

5. Eis-irlmg, F. A. &. Black, L. W. (1994) In Molecular Biology of Bacteriophage T4 (Karam, E., :d.) pp. 209-212. American Soc. Microbiol., Washington, DC.

2. Fit nov, V. P., et al. (1994)/ Mol. Biol. 242,470-486.

Sobolsv, B. N.. & Mesyaaihinov, V. V. (1991) J. Biomol. Struct. Dynam. 8, 953-965.

4. Lupss, Л. ft №5} Ticnds Biochem. Sci. 21, 375-382.

1 1?4.>лкгЕ. О. П. ;i'V93) Автореферат кандидатской диссертации. Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, Москва.

6. Зурабишвкли Т. Г. (1993) Автореферат кандидатской диссертации. НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Москва.

7. Ducruix, А., & Giege, R, eds. (1992) Crystallization of nucleic acids and proteins. A practical approach. Oxford University Press.

8. Garman, E. F., & Schneider,T. R. (1997) J. Appl. Cryst. 30, 211-237.

9. Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997) Meth. Emymol. 276,307-326.

1С. Collaborative Computational Project Number 4. (1994) Acta Crystallogr. D50,760-763. ! I. Шнейдер, M. M. (1997) Автореферат кандидатской диссертации. НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Москва.

12. Jones, Т. A., et al. (1991) Acta Crystallogr. A47, 110-119.

13. http://xplor.csb.yale.edu/xplor-info/xploronline.html.

14. Brunger, A. T. (1992) Nature 355,472-475. ! S. http://w4vw.pdb.bnl.gov/cgi-bin/pdbmain.

16. Engh, R. A. & Huber, R. (1991) Acta Crystallogr. A47,392-400.

17. Yeat«, Т. O. (1997) Metk. Emymol. 276, 344-358.

18. Crick F. H. C. (1953) AC:, Crystallogr. 6,689-697.