Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная характеристика фибритина бактериофага Т4 и его использование в белковой инженерии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурная характеристика фибритина бактериофага Т4 и его использование в белковой инженерии"



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ. А. Н. БАХА

На правах рукописи

{

УДК 577.112-1577.322:578.811 ЕФИМОВ Владимир Парфирьевич

СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЕРИТИНА БАКТЕРИОФАГА Т4 И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В БЕЛКОВОЙ ИНЖЕНЕРИИ

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института

I | '

вирусологии им. Д. И. Ивановского РАЫН и ка кафедре молекулярной биофизики- Московского физико-технического института

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор В.В. Месянжинов, кандидат биологических наук ' И.В. Неплюев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук (

Д. И. Левицкий, доктор химических наук А.И. Ыирошников Ведущая организация: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МРУ

Защита диссертации состоится " 3 ".. 1ддз г> в " " час. на заседании Специализированного Совета

СК 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха (117071, Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 1).

Автореферат разослан " " .. 1ддз г

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук

Ы.И. Молчанов

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из ключевых проблем современной биологии является проблема пространственной организации белковых молекул. Структурное многообразие белков, образующих частицу бактериофага Т4, позволяет надеяться, что некоторые из них могут оказаться удобными моделями для изучения механизмов свертывания белков и развития методов белковой инженерии.

Фибриллярный белок фибритин бактериофага Т4 (продукт гена vac - whisker antigen control) образует комплекс воротничок/бакенбарды, расположенный в месте объединения головки и хвоста фага (Coombs, Eiserling, 1977; Николаева и соавт., 1987). Комплекс воротничок/бакенбарды необходим для эффективной сборки длинных хвостовых фибрилл на частице фага (Terzaghl et al., 1979; Wood, Conley, 1979). Нуклеотидная последовательность гена Iчас определена (Prilipov et al., 1988). В аминокислотной последовательности продукта гена vac была обнаружена периодичность в распределении остатков, характерная для суперспиральных фибриллярных белков (Scbolev, Mesyanzhinov, 1991). Суперспирали из нескольких ct-спиралей содержатся в миозине, тропомиозине, промежуточных филаментах, ламининах, фибриногене и многих других белках (Cohen, Parry, 1990). Экспериментальное исследование а-спиральных фибриллярных белков осложняется их плохой растворимостью, трудностью очистки, большими размерами и сложной организацией. В результате, несмотря на длительную историю изучения, сведения об их строении и механизмах сборки далеко не полны.

Изучение механизмов пространственной самоорганизации белков тесно связано с развитием белковой инженерии. В последние годы было опубликовано большое количество работ, посвященных использованию в белковой инженерии химерных вирусных частиц, получивших название векторов экспонирования. Векторы экспонирования отличаются от обычных клонирующих векторов на основе вирусов тем, что клонированные гены при размножении вируса зкспрессируются в виде гибрида с каким-либо структурным белком, и гибридный белок встраивается в частицы вируса. Единичные вирусные частицы, специфически связывающиеся с исследуемым белком, могут быть выделены из смеси, содержащей около 107 вариантов химерных вирусов, с помощью аффинной селекции (Parmley, Smith, 1988). Таким образом, векторы экспонирования

могут быть йслользозаны для изучения белковых взаимодействий и получения полипептидов с заданными свойствами (Cwirla et al., 1990; Marks et al., 1991; Gram, et al., 1992; Swimmer et al., 1992). Одно из трудно выполнимых условий, связанных с развитием этого направление, состоит в том, что встраивание в белок-носитель . чужеродных последовательностей не должно нарушать его связывание с вирусом и биологические функции. В настоящее время подавляющая часть работ по экспонированию клонированных антигенов выполнена на белках III и VIII-нитевидных бактериофагов Е. coll. Разработка аналогичных систем на основе других белков-носителей и других вирусов может увеличить возможности и гибкость метода.

Цель и задачи работы. Данная работа направлена в первую очередь на изучение структурно-функциональной организации фиб-ритина бактериофага Т4. Конечной целью является создание системы экспонирования антигенов на поверхности бактериофага Т4, используя фибритин в качестве белка-носителя. Для характеристики белка и проведения белковой инженерии необходимо бьшо создать эффективную систему его экспрессии. Основная часть работы посвящена решению следующих задач:

1). Конструирование векторов экспрессии, позволяющих получать белок фибритин в нативной и мутантных формах.

2). Проверка гипотезы о суперспиральной организации фибри-тина и выяснение роли различных участков белка в сборке з оли-гомер и проявлении биологической активности.

3). Поиск способов встраивания в фибритин чужеродных последовательностей с сохранением его структуры и биологической активности.

4). Создание системы клонирования генов в геноме бактериофага Т4 в виде гибрида с геном »гас. Доказательство того, что клонированные гены зкспресеируются при размножении фага Т4, и образующийся-химерный фибритин встраивается в фаговые частицы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые подучены экспериментальные данные, свидетельствующие, что фибритин бактериофага Т4 является тримером, образованным тремя параллельными а-спиралями. Показано, что воротничок фага образован N-концевьми участками фибритина, а С-концы локализованы в дистальных участках бакенбард комплекса воротничок/бакенбарды. Сделан вывод о том, что тримеризация фибри-

тина при сборке в клетке инициируется С-концевым участком полипе птадной цепи. Полученные данные важны для понимания принципов организации обширного класса фибриллярных белков, имеющих в своем составе суперспиральные участки.

.Продемонстрировано, что фибритин может быть использован для экспонирования разнообразных антигенов на поверхности бактериофага Т4. Найден способ встраивания чужеродных последовательностей в фибритин, без нарушения его сборки и биологической активности. Создана система клонирования генов в геноме бактериофага Т4, позволяющая получать химерные частицы фагов, несущие на дистальных концах воротничковых нитей разнообразные чужеродные антигены. Бактериофаги, экспонирующие соответствующие лиганды, могут быть использованы для эффективного обнаружения определенных антител или других молекул по снижению титра инфекционных частиц в смеси химерных фагов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Фибритин бактериофага Т4 в растворе является тримерным суперспиральным белком.

2. С-концы полипептидных цепей фибритина в комплексе воротничок/бакенбарды расположены в дистальной части бакенбард. Последовательность на И-конце необходима для связывания с частицами фага при образовании комплекса воротничок/бакенбарды. С-концевые аминокислотные остатки существенны для эффективной сборки фибритина в клетке.

3. Фибритин может быть использован в качестве белка-носителя для экспонирования различных антигенов на поверхности фага Т4.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из" введения, обзора литературы по <*-спиральным фибриллярным белкам, экспериментальной части, результатов исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (156 наименований). Диссертация излажена на 164 страницах машинописного,^екста и содержит 26 рисунков.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990), 8 международном конгрессе по вирусологии {Берлин, .1990) и на международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (С.-Петербуг, 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

- 4 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Штаммы бактерий и бактериофагов. В качестве пермисеивного и непермиссивного хозяев для анбер-ыутантов бактериофага Т4 использовали соответственно штаммы Escherichia coll Ве/1 и CR63. Двойные амбер-мутанты бактериофага Т4 amE17-E727J (9~-icac-) и amNG75-E609 (12~-13~) были получены скрещиванием соответствующих одиночных мутантов.

Конструирование плазмидных векторов проводили по стандартным методикам (Sambrook et al., 1S89). Плазмиды с генами фага Т4 были получены клонированием в коммерческих векторах по сайтам Xbal, EcoRI, EcoRV фрагментов ^модифицированной ДНК фага. Экспрессиошше плазмиды создавались на основе векторов PGEM-3Z (Promega), Blueskript (Stratagene), pET-3b (Studier et al., 1990), содержащих промотор фага T7.

Экспрессию генов фага Т4, клонированных в плазмидах под промотором фага Т7, проводили в штамме Е. coll BL21(DE3) (Studier et al., 1990), в хромосоме которых содержится ген РНК-полимеразы фага Т7 по контролем индуцируемого ЙПТГ Lac UV5 промотора.

Электрофорез белков в полиакркламидном геле в присутствии ДСН проводили по методу Лэммли (Laemmll, 1970). Электрофорети-ческий анализ белков в неденатурирующих условиях проводили при отсутствии ДСН и 2-меркапозтанола.

Рекомбинацию 12~-15~-амбер-мутанта с плазмидами in vivo использовали для переноса видоизмененного гена фибритина из плазмиды в геном фага Т4 (Mattson et al., 1977; Volker et al., 1982). Клетки CR63, содержаще плазмиду с видоизмененным геном, инфицировали двойным амбер-мутантом и потомство высевали на газон Ве/1 для выявления рекомбинантов.

Концентрированные препараты бактериофагов получали по методу Келленбергера (Kellenberger, 1968). Очистку вирусных частиц осуществляли с помощью дифференциального центрифугирования и седиментации в градиенте концентрации сахарозы.

Равновесное центрифугирование и скоростную седиментацию* проводили на аналитической ультрацентрифуге Splnco Model Е (Beckman Instruments), снабженной абсорбционной оптикой и фо-

* Работа выполнена в департаменте биофизической химии Биоцентра при Университете г. Базеля совместно с проф. Й. Энгелем.

тоэлектрической сканирующей системой.

Электронно-микроскопические исследования* прозодили на приборе Philips 300 при увеличении 30 ООО. Образцы готовили методом кругового оттенения платиной Еысушенных растворов белка (Engel, Furthmayr,1987).

Спектры кругового дихроизма* регистрировали на спектропо-ляриметре Carry Model 60 в термостатируемых кварцевых кюветах. Для получения кривых тепловой денатурации образцы в кювете нагревали или охлаждали со скоростью 8 - 24°С/час. За степенью денатурации белка следили по эллиптичности при 220 нм.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Выбор фибритина бактериофага Т4 в качестве объекта структурно-функционального исследования и белковой инженерии.

На предварительном этапе работы были сконструированы плазмидные векторы для экспрессии генов 6, 7, 8, 9, 10, 11, wac, 13 и 14 бактериофага Т4. При конструировании векторов экспрессии фрагменты ДНК, содержащие какой-либо из этих генов фага вместе с участком инициации трансляции, субклонировались так, чтобы сделать возможной транскрипцию гена с промотора фага Т7 в составе вектора. Выяснилось, что продукты генов 8, 9, 10, 11, wac нарабатываются в больших количествах (более 30% от суммарного белка) и в растворимой форме. Использование стандартного метода комплементации (Edgar, Wood, 1966, Klkuchi, King, 1975) показало, что продукты генов 8, 9, 11 синтезируются в биологически активной форме. Аналогичный вывод был сделан в отношении продукта гена wac с помощью описанной ниже методики проверки его биологической актизности.

К моменту заверпения этого этапа работы для продукта гена wac (фибритина) была предложена модель трехмерной укладки в виде суперспирали из нескольких параллельных а-спиралей (Sobolev, Mesyanzhinov, 1991). Такая структура, в принципе, значительно проще структуры глобулярных белков, какими являются продукты генов 8, 9,. 11. Функция фибритина и морфология образуемого им комплекса воротничок/бакенбарды изучены довольно подробно (Coombs, Elserline, 1977; .Wood, Conley, 1979). По этим причинам для дальнейшей детальной структурной характеристики нами был выбран фибритин.

II. Экспрессия фибритина в 'нативной и деде тированных формах.

Первой была создана плазмида pG-waclZ (рис.1), позволяющая нарабатывать фибритин бактериофага Т4 в клетках Е. coli BL21(DE3) в препаративных количествах и в растворимой форме. После того как мы убедились, что рекомбинантный белок биологически активен, бшш сконструированы плаз мзды для экспрессии мутантных фибритинов с делециями в амин о- и карбоксиконцевых участках. Исходя из гипотезы суперспиральной организации фиб-ритина, мы предполагали, что укороченные белки будут собираться в суперспиральные олигомеры, но при этом их связывание с фаговыми частицами (образование воротничка) и/или взаимодействие с длинными фибриллами будет нарушено.

1). Конструирование плаамидных векторов.

Плазмида pG-wacl2 (рис.1) содержит полностью ген \гас фага Т4 вместе с участком связывания с рибосомой. Плазмида использовалась для экспрессии фибритина в полноразмерной-нативной форме (WAC). Плазмида представляет собой вектор pGEM-3Z со вставкой Ncol-Hpal (1621 н.п.) ДНК фага Т4 по сайту Smal вектора. Делеции в 5'- и 3'-участках последовательности гена vac. были сделаны с помощью рестригсгаз HlncII и HindiII. Кодируемые зкспрессионными шаамидами белки показаны на рис.2.

Никаких чужеродных последовательностей к фибритину не добавилось в случае белков WAC-C1 и WAC-H. Делеция С-конца фибритина возникла вследствие появления терминирующего кодона сразу после аланина 469. В двух случаях использован фрагмент гена 9 фага Т4, кодирующий первые 22 аминокислоты, вместе с его участком связывания с рибосомой.

Hindi II (272)

Т7 promoter HlncII (36)1 HincII (372)

-► ' 1 I M

■ ____taattaaggtaaaagaATBACA..............................

HindiII (1403) BmXbSlPsSpHd

4 ' 1461 МММ

.................-.........CCAGCAteacatgggg.......

Рис. 1. Схема плазмида pG-wacl2, использованной для экспрессии фибритина в нативвой форме и получения делетированных вариантов. Вставка ДНК фага Т4 показана точками. Участок связывания с рибосомой, инициирующий и терминирующий кодоны гена vac подчеркнуты.

2). Экспрессия рекомбинантных фибритинов.

Клетки ВЬ21 (БЕЗ) трансформировались шгазыидами, кодирующими показанные на рис.2 варианты фибритина, и экспрессия индуцировалась добавлением ИПТТ. На рис.3 представлены результаты злектрофоретического анализа лизатов индуцированных клеток в ПААГ с ДСН. Клетки лизировали замораживанием/оттаиванием и

WAC

(487)

ИАС-С1 (469)

470-48/

13-124

WAC-H (375)

;VY

- 124

WAC-N3 (385)

1

WAC-N2 (497)

1-12

\/\/ш =3

Рис. 2. Схема рекомбинантных вариантов фибритина бактериофага Т4. Закрашенные прямоугольники - делеции в аминокислотной последовательности с указанием номеров первых и последних делети-рованных остатков. \/\/ - аминокислотные остатки 1-22 продукта гена 9. В скобках указан общий размер белков.

WAC

Н

$ Р

2 9

тщ-

'^BcsttBiBeSeB

Рис. 3. Экспрессия рекомбинантных вариантов фибритина, показанных на рис.2, в клетках Е. coli BL21(DE3) и анализ их растворимости. Белки растворимой ("s") и нерастворимой ("р") фракций клеточных лизатов разделялись в 10% ПААГ с ДСН. kD - маркеры молекулярной массы.

N3

нерастворимые агрегаты осаждали кратковременным центрифугированием. Во всех случаях уровень экспрессии высок, и продуцируемые белки хорошо видны после окрашивания геля кумасси. Молекулярные массы рекомбинантных белков соответствуют сделанным в гене угас заменам. Полноразмерный фибритин имеет кажущуюся молекулярную массу 52 кДа и по подвижности не отличается от IHVac в составе фаговых частиц.

Все белки кроме делегированного в С-концевой части (WAC-C1) продуцируются в растворимой форме. Хотя подавляющая часть WAC-C1 находится в нерастворимой форме, незначительная часть белка обнаруживается и в растворимой фракции.

3). Анализ биологической активности рекоибинантных фибри-тинов.

Прямая проверка биологической активности рекомбинантного фибритина в реакции комплементации экстракта бактериофага Т4, дефектного по ПГкас, затруднена, поскольку Ш>ас не является существенным для размножения фага Т4 (Dewey et al., 1974; Wood, Conley, 1979). При создании методики проверки биологической активности рекомбинантного фибритина мы использовали свойство ПГгзс ускорять сборку длинных хвостовых фибрилл (Wood, Conley, 1979; Terzaghi et al., 1979; Селиванов и co-авт., 1981).

Как отмечено выше, пг9 фага Т4 может быть наработан в клетках Е. coll BL21(DE3) в форме, активной в реакции комплементации 9~-экстрактов. Известно, что пг9 и пгЮ являются тем компонентами базальной пластинки, с которыми взаимодействуют длинные хвостовые фибриллы, и в 9~ экстрактах фага длинные фибриллы и фаговые частицы не связаны друг с другом (Urlg et al., 1983; Тургаш и соавт., 1985). Таким образом, в экстракте фага, дефектной по ПГ9, после добавления ПГ9 начинается реакция присоединения длинныг хвостовых фибрилл. Удаление из 9"-экстракта фибритина должно замедлить эту реакцию.

Экстракт фага 14, дефектный по продуктам генов vac и 9, был получен наращиванием гас~-9~ двойного амбер-мутанта в не-пермиссивном шташе ВР/1. Результаты опытов по комплементации гас~-9~-экстракта фага смесью рекомбинантного пг9 с разными вариантами фибритина представлены на рис.4. Титр смеси практически постоянен, если добавлен лизат клеток

BL21 (DE3) [pGEM-3Z3, не содержащий фаговых белков. В том случае, когда добавлен лизат, содержащий только рекомбинантный ЛГ9 (gp9), титр медленно возрастает в течение всего времени комплементации. Если же в экстракте присутствуют как ПГ9, так и рекомбинантный фибригия (WAC), то реакция ускоряется не менее чем в 50 раз.

Ни один из вариантов фибритина с делецией в Н-концевой части (WAC-N2, WAC-N3, WAC-H) не проявляет биологической активности. В случае фибритина, делегированного в С-концевой части (WAC-C1), опыт достоверно выявляет каталитическую активность в растворимой фракции клеточного лизата.

Отсутствии каталитической активности у делетированяых в N-концевой части вариантов фибритина можно объяснить. нарушением образования воротничка или взаимодействия с длинными фибриллами. Если бы эти варианты связывались с фагом, образуя

Рис. 4. Ускорение реакции присоединения длинных хвостовых фибрилл бактериофага Т4 в присутствии рекомбинантных фкбритинов. 100Z активации соответствуют максимальному титру фаговых частиц (1,9-Ю11 б.o.e./мл) в смеси, где-присутствовали ПГ9 и WAG. 0% процентов активации соответствуют титру в смесях в нулевой момент времени (8.6-107 б.o.e./мл). В тех случаях, когда добавлялась смесь фибритина и ПГ9, указано только название варианта фибритина.

комплекс воротничок/бакенбарды, то образующиеся фаговые частицы можно было бы инактивировать антителами к ПГwac (Wood, Conley, 1979). Для проверки этой возможности ш инкубировали wac--экстракты фага Т4 с различными вариантами фибритина и затем ставили реакцию нейтрализации фага антителами к mvac. Нейтрализация наблюдалась только в случае белков WAC и WAC-C1. 4). Вывода-

Из того что фибритин синтезируется при экспрессии плаз-миды в растворимой и. биологически активной форме, можно заключить, что для сборки фибритина не требуется дополнительных фаговых белков. Остальные фибриллярные компоненты фага Т4, продукты генов 12, 34, 37, нуждаются в белках-помощниках сворачивания - продуктах генов 57 и 38 (Wood, Crowther, 1983; Berget, King, 1983).

Последние 18 остатков не важны ни для связывания с фагом (образования воротничка), ни для взаимодействия q длинными фибриллами. Отсюда напрашивается вывод, что С-концевые части фибритина экспонированы в растворитель, a N-концевые части образуют воротничок. Подтверждением служит то, что ни один из вариантов фибритина с делецией в N-концевой части не проявляет биологической активности и не связывается с фагом. При этом результаты физико-химической характеристики (см. далее) однозначно свидетельствуют, что структуры укороченных на' аминоконце фибритинов в целом идентичны структуре интактного полноразмерного фибритина.

В пределах последних 18 остатков фибритина находится последовательность, необходимая для правильного сворачивания фибритина в нативную структуру при сборке в клетке. Снижение скорости сворачивания фибритина вследствие дедеции этой последовательности, вероятно, увеличило долю синтезированных цепей, необратимо агрегировавших друг с другом (Mltrakl, King, 1989).

III. Изучение рекомбинантных фибритинов физико-химическими

методами.

1). Очистка белков.

Очистка рекомбинантных белков облегчается их высокой долей в исходных клеточных лизатах (рис.3). Существенная степень очистки достигается с помощью осаждения сульфатом аммония. При 25-302 концентрации сульфата аммония осаждается почти исключительно фибритин. Оставшиеся примеси легко удаляются хроматог-

рафией на гидроксилапатите в 10 тМ фосфате натрия, рН7,5. Фиб-ритин злюируется в свободном объеме, в то время как подавляющее большинство белков сорбируются на ГАП при такой концентрации фосфата (Голицина и соавт., 1983). Очищенный полноразмерный фибритин активен в реакции комплементации 9~-\гас~-дефектного экстракта. Процедура очистки проста, хорошо воспроизводима и позволяет получать около 10 мг белка с 200 мл культуры клеток. Таким образом были получены в чистом виде белки V7 АС, WAC-H, WAC-N2 (рис.2) и химерный фибритин WAC-RR (рис.9).

2). Аналитическое улъ трацентрифугирование.

Белки WAC и WAC-H были охарактеризованы методами скоростной седиментации и равновесного центрифугирования. Измеренные константы седиментации составили 4,3 ± 0,1 S для WAC и 4,0 ± 0,1 S для WAC-H. Получены значения молекулярной массы 160 ± 8" КЦа для WAC, 144 ± 7 кДа для WAC-H. Величина молекулярной массы, полученная для интактного фибритина, соответствует тримеру (52 кДа х 3 - 156 кДа). В случае делегированного варианта WAC-H ситуация менее ясна. Измеренная молекулярная масса больше, чем была бы у тримера (40 кДа х 3 - 120 кДа), но меньше, чем для тетрамера (40 кЦа х 4 - 160 КДа). Отметим также, что измеренные массы и коэффициенты седиментации характерны для в высокой степени асимметричных молекул.

3). Электронная микроскопия.

Образцы белков WAC, WAC-H и WAC-N2 для электронной микроскопии готовили методом кругового оттенения платиной высушенных растворов белков. WAC и WAC-N2 очень похожи по своей форме и размерам (рис.5). Они выглядят преимущественно как однородные прямые палочки. На концах можно видеть небольшие гло-

ч- У- еъу&ж-?

Рис. 5. Электронные

микрофотографии от- 5

дельных молекул ПОЛНО- •••.•.•»..?^•••.•.....-е.л-г..-.* ••

размерного фибритина

WAC (А) и делегирован- ^P^Ägl В ных вариантов WAC-N2 а^&Юкьж**"*-'

(Б). WAC-H (В). ,100

булы. Молекулы иногда искривлены вблизи центра и ближе к одному из концов. Контурная длина молекул WAC и WAC-N2 равна 53 ± 3 нм. На электронных микрофотографиях WAC-H видны похожие палочковидные молекулы, но со средней длиной 43 ± 3,5 нм.

Результаты электронной микроскопии подтверждают модель суперспиральной организации фибритина (Sobolev, Mesyanzhlnov, 1991). По данным Соболева и Месянжинова 352 амшюкислотных остатка фибритина находятся в составе участков с гептадной периодичностью. Следовательно, длина суперспирали фибритина должна составить 0,15 нм х 352 - 52,8 нм, что совпадает с экспериментальной величиной 53 ± 3 нм. Делеция остатков 13 - 124 з фиб-ригине WAC-H привела к уменьшению длины молекул с 53 ± 3 нм до 43 ± 3,5 нм. По данным тех же авторов в делегированном участке белка WAC-H в составе гептад находятся 85 остатков, что соответствует й-спирали длиной 12,8 нм в хорошем, согласии с экспериментом.

4). Спектры кругового дихроизма и тепловая денатурация.

Спектры кругового дихроизма вариантов фибритина WAC, WAC-H и WAC-N2 представлены на рис.6. Все три варианта фибритина демонстрируют спектры кругового дихроизма, характерные для а-спиральной конфорыации (Yang et al.f 1986). Расчет содержания вторичных структур для фибритина по методу Провенчера и Глокнера (Provencher, Gloeckner, 1981) дает значения 90X для

Рис. 6. Спектры кругового дихроизма фибритинов ШС, \«?АС-Н И WAC-N2 (20 иМ трис, рН 7,5) при 20°С (сплошная кривая) и при 65°С (пунктир).

а-спиральной структуры, 07. для {¡-структуры и 10% для неупорядоченной структуры.

На рис.7 показаны кривые зависимости эллиптичности при 220 нм от температуры. Величина f83220 приблизительно пропорциональна «-спиральному содержанию белка (Yang et al., 1986). Наблюдаются два перехода в районах 42°С (малый переход) и 56°С (основной переход). Кривые совершенно различны для прямого и обратного процессов. Несмотря на отличия, связанные е малым переходом, общая форма кривых одинакова для всех трех типов фибритина, что свидетельствует о схожести их структур.

Первый переход отсутствует у варианта WAC-N2. Учитывая, что при создании этого варианта была сделана замена первых 12 остатков на N-конце, можно объяснить переход в районе 42°С в полноразмерном фибритине плавлением N-нонцевого сегмента. Хотя у фибритина WAC-H с делёцией остатков 13-124 имеется малый переход, его параметры отличаются от параметров аналогичного перехода в интактном фибритине. Можно предположить, что тепловая денатурация WAC-H начинается также с плавления N-концевого

WAC-H г

WAC-N2

2» -30 » 40 <9 W TlHUiFAT»**

S9 N

( °С >

Рис. 7. Тепловая денатурация и ренатура-цин фибритияов WAC, WAC-H и WAC-H2, наблюдаемая по эллиптичности при 220 нм. Кривые получены при нагревании (сплошная линия) и последующем охлаждении (пунктир) белковых растворов (0,14 мг/мл, 20 гаМ трис, рН7,5) со скоростью 24°С в час.

»-

участка, но другого чем у полноразмерного фибритина.

Перечисленные ниже экспериментальные данные свидетельствуют об одинаковости структур исходных и ренатуированных белков. Спектры кругового дихроизма реналуированных белков не отличается по форме от исходных. Повторение процесса нагревание/охлаждение дает кривые, аналогичные исходным. Ренатуиро-ванньш фибритин WAC биологически активен. Электронная микроскопия оттененных платиной ренатуированных образцов выявляет палочковидные молекулы неотличимые от исходных. Злектрофорети-ческие свойства ренатуированных фибритинов аналогичны таковым у исходных препаратов.

Причиной несовпадения кривых денатурации и ренатурации фибритина могла бы быть агрегация полипептидных цепей, часто наблюдаемая при тепловой денатурации белков (Jaenlcke, Rudolph, 1986). Ряд фактов заставляет отказаться от такого объяснения. Во-первых, агрегация денатурированных белков обычно необратима. Во-вторых, процесс тепловой денатурации фибритина не зависит от концентрации белка в интервале 0,5-0,005 иг/т. Реассоциацию олигомерных белков обычно проводят при концентрациях 1-10 мкг/мл для подавления процессов агрегации. Фибритин же успешно ренатуирует при концентрациях 0,5 мг/мл в простом буфере состава 20 шМ трис, рН7,5. Причиной неравновесности процессов тепловой денатурации и ренатурации фибритина является, вероятно, низкая скорость обоих процессов по сравнению с использованными скоростями изменения температуры.

Скорость восстановления эллиптичности в ходе ренатурации фибритина сильно зависит от концентрации белка. Это было продемонстрировано в опытах со скачком температуры. Отсюда можно заключить, что образование вторичной структуры сопряжено с ассоциацией цепей.

5). Доказательство трииерной организации фибритина гибридизацией двух вариантов белка.

Для получения дополнительных доказательств в пользу три-мерной организаций фибритина мы поставили эксперимент по гибридизации полноразмерного и делегированного вариантов фибритина в процессе реассоциации смеси' денатурированных молекул (рис.8). В эксперименте использована описанная выше способность фибритинов к ренатурации после денатурации нагреванием.

В смеси белков WAC и WAC-H, подвергшейся циклу денатура-

Рис. 8. Электрофоретический анализ продуктов гибридизации полноразмерного фибритина WAC и его делегированного варианта WAC-H в 7% нативном ПААГ. Растворы белков WAC (дорожки обозначены "W"), WAC-H ("Н") и их смесь ("W+H") ингсубнровались при 25°С (контрольный опыт) или при 65°С (для денатурации) в течение 30 минут. Далее растворы инкубировались один час при 25°С для ре-натурацки. Образцы разделялись в 7% ПААГ в нативных условиях.

ция/ренатурация, обнаруживаются два новых типа белков, отличающихся по подвижности от исходных препаратов. Анализ четырех белковых полос в денатурирующем ПААГ с ДСН показывает, что полосы а и Ь, в отличии от полос с и d, содержат как полипептидные цепи WAC, так и полипептидные цепи WAC-H. При этом соотношение между длинными и короткими полипептидными цепями в гибридах различно. Можно предположить, что полоса а (с наименьшей подвижностью) состоит из 2 "длинных" молекул WAC и одной "короткой" WAC-H, а полоса b - наоборот.

Опыт по гибридизации стал возможен благодаря тому, что оба варианта фибритина имеют в целом одинаковую структуру, возможна ренатурация к исходной структуре после диссоциации полипептидных цепей и возможно образование стабильных гетеро-олигомеров. Выполнение этих условий следует из параллельности полипептидных цепей в олигомере, подразумеваемой суперспиральной моделью, и несущественности N-концевых остатков для сборки фибритина в олигомер.

6). Трехмерная организация фибритина - суперспираль из трех а-спиралей.

Б.Н. Соболев и В. В. Месянжинов обнаружили в аминокислот-

25'С S5 °С

---* > ч

W Н W Н

te« —— а

нал «яздам Ä m £

ШШ> ьвё>>---—d

ной последовательности фибритина периодическое распределение остатков, характерное для переплетенных й-спиралей (Soboley, Mesyanzhinov, 1991). Результаты физико-химической характеристики фибритина и его вариантов находятся в согласии с суперспиральной моделью. Данные равновесного центрифугирования и гибридизации однозначно свидетельствуют в пользу тримерной организации фибритина. Таким образом, фибритин по своей структуре оказывается отнесенным к классу фибриллярных белков, содержащих суперспираль из трех ct-спиралей. К атому классу принадлежат фибриноген, ламинин, хвостовые фибриллы фагов Т7 и ТЗ, гемагглютинин вируса гриппа, • рецептор макрофагов. Во всех случаях это внеклеточные белки (Cohen, Parry, 1990).

Суперспираль из параллельных «-спиралей подразумевает коллинеарность аминокислотной последовательности и третичной (супервторичной) структуры. Именно поэтому делеции вплоть до 100 остатков на N-конце фибритина не влияют на общие физико-химические характеристики фибритина - спектр КД, асимметричную форму молекул, кривые теплового разворачивания - сворачивания.

Требуются дополнительные исследования для выяснения стадии сворачивания фибритина, блокируемой делецией С-концевых остатков (рис.3). Наиболее вероятно, что С-концевой участок инициирует тримеризацию полипептидных цепей, обеспечивая, например, их правильное выравнивание. Аналогичный результат был недавно получен при исследовании сборки фибрилл аденовирусов (Novelli, Boulanger, 1991). Поскольку фибритин успешно ренату-ирует 1л vitro, то, вероятно, при сборке in vivo не требуется участие клеточных помощников сворачивания (Gethlng, Sambrook, 1992). Сборка тройной суперспирали ламинина также легко происходит In vitro (Hunter et al., 1992).

IV. Использование фибритина для экспонирования антигенов на поверхности бактериофага Т4.

Из приведенных выше данных, а также из модели суперспирального строения фибритина, можно заключить, что карбоксикон-цевые участки полипептидных цепей фибритина экспонированы в растворитель и образуют дистальную часть бакенбард. Этот факт указывает на способ встраивания чужеродных последовательностей в фибритин без нарушения его сборки и биологической функции. Способ заключается в удлинении последовательности фибритина на

- 17------------------------------

О-конце, за счет взмены терминирующего ко дона гена wac на ка~ кой-либо значащий. При этом сохраняется первичная структура С-концевого участка, важная для правильной сборки белка. На рис.9 поясняется строение плазмкды pRR2, при создании которой был применен этот подход.

В качестве модельного полипептида мы использовали фрагмент preS2 области вируса гепатита 8 человека. Гибридный белок WAC-RR, состоящий из полной последовательности фибритина и дополнительного полипептида из 53 остатков на С-конце, экепрес-сируется в растворимой форме и ускоряет реакцию присоединения длинных хвостовых фибрилл фага Т4 1л vitro. Из 53 добавленных

Структура ДИК бактериофага Т4 в области гена vac:

ген12 М ген vac А Тег ген13 -—¡¡.at —--gcataa-5-

NG75 " Е609 л

Структура вставки в плазшде. pRR2:

ген12 U гэн vac АС А Тег гек!3 —--Jatg—-—-————--gcatgcAAAgcatsa-J--

Структура С-концевого участка гена wac в плгзмиде pRR2:

р г е S 2 (45 остатков) N S ... F S R SPA CHS5TYS A Z

—tcaccagca tgccatggatcgacggtatcgaattec......itcteecgagca taac

tt • t t Sphl Ncol EcoRI NruI

ген13 M S

a t ggggccgcaaggccccaaaggat 11 taaat gt ca— Рис. 9. Схемы, поясняющие строение плазмиды pRR2, кодирующей удлиненный фибритин WAC-RR. Нуклеотиды, отсутствующие в ДНК фага Т4 дикого типа, и кодируемые ими аминокислоты ввделены жирным шрифтом. Значком л отмечено положение амбер-мутаций в генах ,12 и 13. Нуклеотиды и аминокислотные остатки области preS2 вируса гепатита В выделены дополнительно курсивом.

остатков 45 являются остатками 112-156 области ргеБ2 гепатита В человека (субтип ауу/) (баНЬеЛ еЬ а1., 1979).

В ходе создания плазмиды рКК2, кодирующей удлиненный белок ШС-ЯН, были получены 3 других удлиненных варианта фибритина, содержащих на С-конце разные случайные последовательности размером 15, 19 и 20 остатков. Все они продуцируются в растворимой форме и биологически активны. Это говорит о том, что встраиваемые последовательности могут быть самыми разными.

Обычные генно-инженерные методы не пригодны для работы с ДНК фага Т4. Для переноса измененного гена час из плазмиды в геном бактериофага Т4 мы использовали рекомбинацию двойного амбер-мутанта с плазмидой рИ?2.' Из 8 проанализированных вестерн- блот-анализом рекомбинантов 6 зкспремировали ПГ^ас с увеличенной молекулярной массой. Рекомбинантные фаги не отличались значительно от дикого типа по морфологии образуемых бляшек или по титрам получаемых суспензий. Это свидетельствует о том, что изменение генома бактериофага Т4 в районе гена нас не повлияло существенно на жизнеспособность фага. Вероятно,

Рис. 10. Анализ белков бактериофага Т4Е>-И?, . полученного рекомбинацией двойного амбер-мутанта с плазмидой рИ?2. Слева показан ПААГ с ДСН (8%), окрашенный ку-масси. Справа представлены результаты вестерн-блот-анализов этого геля с использованием кроличьих антител к ПТи-ас (апЫтИАС) и монокло-нальных антител к ргеЭ2 области вируса гепатита В человека -(апЫ-Бг). 1 - белок УАС-К? (получен экспрессией с плазмиды рНН2); 2 - белок МАС; 3 - рексмбинантный бактериофаг Т40-Ю? (получен рекомбинацией двойного амбер-мутанта с плазмидой рй?2); 4 - бактериофаг Т4Б.

«пИ-ШАС ап«1-82

1234 1234 1234

- 19 " -------------------

размер экспонируемой аминокислотной последовательности может Оыт!- значительно увеличен.

Очищенные частицы рекомбинанткого фага содержат в своем составе продукт гена vac увеличенного размера, совпадающий по своим свойства/! с белком WAC-RR, экспреесируемым с пдазмады (рис.10). Данный белок реагирует с моноклональными антителами к preS2 области вируса гепатита В.

Сис^ма депонирования антигенов на поверхности бактериофага Т4 может быть использована для создания библиотек рексм-бинантных фагов. Т4 со случайными аминокислотными последовательностями и последующей селекции фагов на наличие.пептидов с требуемыми свойствами, как это было описано для нитевидных фагов Е. coli (Cwirla et al., 1990; Marks et al., 1991; Gram et al.,1992; Swimmer et al., 1992). Другое возможное применение -детекция антител или иных белковых молекул по снижению титра инфекционных частиц.

ВЫВОДЫ.

1), Созданы векторы экспрессии, позволяющие нарабатывать б препаративных количествах фибритин бактериофага Т4 в клетках Е. ccll BL21 (DE3) как в биологически активной нолнораамерной ферме, так и s виде мугантных балков с делениями в амино- и карбоксиконцевкх участках. Разработана методика очистки реком-бинантных фибритинов, позволяющая получать около 10 мг белка с 200 мл культуры ¡меток.

2). Установлено, что фибритин бактериофага Т4 в растворе является тримернкм а-спиратгьньгм белком с параллельной укладкой трех а-спиралей. Учитывая данные анализа аминокислотной последовательности (Sobolev, Mesyanzhinov, 1991) фибритин следует отнести к классу трехцепочечных суперспиральных белков.

3). В пределах последних 18 С-концевых аминокислотных остатков фибритина находится последовательность, необходимая для эффективной сборки фибритина в тример при экспрессии в клетке.

4). С-кокцевые участки фибритина в комплексе воротничок/бакенбарды расположены в дистальной части бакенбард. Последовательность на N-конце необходима для связывания с частицами фага при образовании комплекса воротничок/бакенбарды.

5). Сконструированы плазмидные векторы, позволяющие клонировать чужеродные гены в 3'-концевой области гена фибритина

и продуцировать гибридные белки в Е. coll. Гибридные белки синтезируются в растворимой форме и обладают биологической активностью природного фибритина бактериофага Т4.

6).' Модифицированный ген фибритина может быть с высокой эффективностью перенесен из плазмиды в геном бактериофага Т4 с помощью рекомбинации с двойным амбер-мутантом фага.

7). Показано, что фибритин может быть использован в качестве белка-носителя для экспонирования различных антигенов на поверхности бактериофага Т4. Получен .стабильный рекомби-нантный штамм бактериофага Т4, частицы которого несут в составе фибритина чужеродную аминокислотную последовательность длиной 53 остатка, из которых 45 являются остатками preS2 области вируса гепатита В человека.

По материалам диссертации опубликованы работы:

1. Selivanov N.A., Prilipov A.G., Efimov V.P., Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V. "Cascade of late overlapping genes In bacteriophage T4", Biomedical Sciences, 1990, v.i, p.55-62.

2. Nepluev I.Y., Efimov V.P., Sobolev B.N., Zurabishvili T.G., Strelkov S.G, Rassulin Y.Y., Sadykova G.K., Pakhomova A.V., Marusich E. I., Mesyanzhinov V.V. "Bacteriophage T4 as a model for protein engineering", Abstracts of International Symposium "100 years of virology", St.-Petersburg, 1992, p. 75.

3. Селиванов H.A., Прилипов А.Г., Зурабишвшш Т.Г., Соболев Б.H., Ефимов В.П., Ыесянжинов В.В. "Структурная организация и сборка белков бактериофага Т4, кодируемых поздними генами 9-12, wac, 13-15", Всесоюзный симпозиум по химии белков. Тезисы докладов. Тбилиси, 1990, С. 19.

4. Prilipov A.G., Selivanov N.A., Efimov V.P., Mesyanzhinov V.V. "The structure of late transcription unit of bacteriophage T4", Abstracts of VIHth International Congress of Virology, Berlin, 1990, p.116.

5. Efimov V.P., Prilipov A.6., Mesyanzhinov V.V. "Nucleotide sequence of bacteriophage T4 genes 6, 7 and 8", Nucl. Acids Res., 1990, v. 18, p. 5313.

5. Prilipov A.G., Selivanov N.A., Efimov V.P., Marusich E. I., Mesyanzhinov V.V. "Nucleotide sequences of bacteriophage T4 genes 9, 10 and 11", Nucl. Acids Res.,1989, v.17, p.3303.