Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение структурного гена интерлейкина -1бета и экспрессия ряда генов-иммуномодуляторов человека и быка в клетках E. coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Получение структурного гена интерлейкина -1бета и экспрессия ряда генов-иммуномодуляторов человека и быка в клетках E. coli"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ЧИСТЯКОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ СТРУКТУРНОГО ГЕНА ИНГЕРЛЕЙКИНА-ip И ЭКСПРЕССИЯ РЯДА ГЕНОВ-ИММУНОМОДУЛЯГГОРОВ ЧЕЛОВЕКА И БЫКА В КЛЕТКАХ Е. COL I.

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Мэсква - 1992

Работа выполнена во ВНИИ генетики и селекции " промышленных микроорганизмов

Научный руководитель:

кандидат химических наук ЕЕ Носиков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ЕК. Янковский кандидат биологических наук С. К. Артюшин

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится о^з/ио. 1992 г. в >н "часов на заседании Специализированного совета Д 0S8.12.01. при ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дородный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Автореферат разослан 19S2 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук Е И. Щербакова

с-.- -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблему.

Исследователи, занимаются проблемами экспрессионного клонирования в бактериях, встречаются в ходе решения поставленных вадач с рядом трудностей, мешающих успешному достижению конечной цели -получению в клетках бактерий препаративных количеств полноценных и биологически активных белковых продуктов чужеродных генов. К числу подобных проблем относится отсутствие в прокаркоткческих клетках системы посттрансляциониого процесскнга мРНК, что делает невозможным получение полноценного белка - продукта эукариотического гена, ккектего мозаичную структуру, при непосредственном введении последнего в клетки бактерий. В настоящее эреыя существует ряд методических подходов, способствующих преодолению данной проблемы -это: 1) методы непоерэдетвекного удаления нитронов из геномных генов (путем искусственного мутагенеза или через введение геномного гена в состав ретровируского челночного вектора); 2) химико-ферментативный синтез генов с запланированным строением, максимально приспособленным для последующей экспрессии в бактериях; 3) получение кДНК-копии гена с помощью обратной транскрипции его мРНК. Эднагео вызеупомянутые методические подходы обладают рядом недостатков: трудоемкостью и дороговизной экспериментального процесса, необходимостью получения количеств ДНК гена, достаточных для последующего клонирования в составе экспрессионного вектора, а также зевозмохностью удаления очень протяженных интронных последователь-иостей (при использовании методов непосредственного деинтронирова--гия). Разработанный в середине 80-х годов метод амплификации ДНК ^средством полимераэной цепной реакции (ПНР) в его приложении к задачам экспрессионного клонирования лишен недостатков, присущих вышеупомянутым методикам, и обладает рядом несомненных достоинств, к числу которых преаде всего относятся быстрота проведения • эксперимента, простота метода, наличие крайне малых количеств ис-содной матричной ДНК, на основе которой путем амплификации можно » 5ыстро получить достаточные для последующей работы количества тутаого фрагмента ДНК, а также независимость метода от разме-

- А. -

ров интронных последовательностей и возможность введения е состав амплифицируеыого гена необходимых регуляторных элементов для обеспечения его эффективной экспрессии в прокариотических клетках.

Среда проблем, затрудняющих экспрессии чужеродных генов в бактериальных клетках существует одна, которая заключается в образовании неопгишльной вторичной структуры Б'-концевой области мРНК, транскрибируемой с чукеродного гена. При атом в формирование "шпилечных" структур вовлекаются последовательности регуляторных элементов инициации трансляции, что затрудняет инициацию синтеза белка рибосомами. Данная проблема успешно решается с использованием полицистронных экепрессионных векторов, в составе которых эффективность экспрессии дистального По отиовени» к промотору цист-рона, образованного клонированным геном, достигается в результате реализации принципа "трансляционного сопряжения" и не зависит от характера вторичной структуры мРНК. Созданная недавно векторная пдазмвда рРК-Т(ЗАТ&-1 обеспечивает высокие уровни экспрессии целевых генов за счет эффективной реинициации рибосомами трансляции дистального по отношению к промотору цистрона, образуемого геном-вставкой в результате частичного перекрывания стоп-кодона США) проксимального и стартового колона (АТв) дистального цистро-нов.

Цель работы.

Целью данной работы являлась разработка простого и надежного метода удаления интроков посредством ПЦР на примере сборки структурного гена ингерлейкина-1£человека (МЫр ) и конструирование экспрессионного вектора рРИ14, основанного на принципе " трансляционного сопряжения", с получением в клетках Е. соИ биологически активных белковых продуктов генов МИр, интерлейккна-3 человека (ЫЬ-З) и гамма-интерферона быка (ЬШТ-у) с использованием данного вектора.

Научная новизна и дрзктическзя ценность работы.

Настоящая работа является частью комплексных исследований по клонированию и экспрессии различных лимфокинов, проводимых во ВНИИ генетика совместно с Институтом, биоорганической химии им. ИМ. Шемякина РАН. 11.-1 - белковый фактор, необходимый для стиму-

кирования ранних этапов организации иммунного ответа. IL-3 - муль-гиколониестимулируший фактор, возлействукщий на полипотентные :тволовые клетки костного мозга на различных стадиях их роста и цифференцировки. INF-у - иммуномодулятор, играющий важную роль в троцессах супрессии и активации иммунного ответа, а тага® являющийся противоопухолевым, антивирусным, антимикробным, противопара-зитарным и антипролиферагивньм агентом. Вышеперечисленные свойства данных цитокинов делают крайне перспективным их использование при печении широкого круга раковых, инфекционных, аллергических и цтоиммунных заболеваний, иммунодефицита организма, нарушений функций кроветворения и патологических изменений состава крови. )чистка данных белков из природных источников - трудоемкая и неэкономичная процедура ввиду низкого содержания цитокинов а живог-шх тканях. Поэтому для получения массовых количеств этих факто-хзв, достаточных для широкого клинического использования, очень 'добно применение генно-инженерных подходов, направленных на полу-шние бактериальных, штаммов-продуцентов важных в клиническом от-юшении лимфокинов. Кроме того, конструирование штаммов-продуцентов данных белков имеет большое значение для изучения молекуляр-ю-биологических основ их роли в живом организме.

Объем работы.

Диссертационная работа изложена на 146 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой ;итературы, состоящего из 240 ссылок.

СОДЕРЖАЩЕ РАБОТЫ

I, Удаление интрона 5 из геномного гена hIL-lf> методами искусственного мутагенеза и ПНР.

1. Умаление нитрона 5 из геномного гена hll-if, методом не- • кусственного мутагенеза.

о

Геномный ген hIL-ip содержит 7 экзонов (Auron et al, 1984). В езультате транскрипции геномного гена образуется мРНК, кодирующая

последовательность предшественника hIL-lp . Данный дредшествент» имеет молекулярную массу ( и. и. ) 33 kDa и не обладает биологической активностью (Ihrie and Wood, 1985). В ходе процессинга предшественник превращается в зрелый IL-lß с м. м. 17 кДа» обладающий биологической активностью (Kronheim et al, 1985). Последовательность зрелого белка, представляющего собой С-концевую часть неактивного предшественника, кодирует три последние зкзона (5, 6, и 7) геномного гена h IL-1/5 (Clark et al, 1986).

Для получения экспрессии гена hIL-l£ в бактериях Е. coli тре бовалось сначала удалить нитроны из исходного геномного гена. ï качестве исходной ДНК-матрицы для удаления интронов использовали геномный ген 11-ip, отобранный ранее с помощью олигонуклеотидных зондов из геномного банка генов мозга человека и клонированный в фаг Ml3tgl30 (Носиков и соавт., 1989). Данный геномный ген содержал только экзоны 5, 6 и 7 с фланкирующими последовательностями, не несущими генетической информации, что позволяло в результате удаления интронов подучить структурный ген, непосредственно кодирующий зрелый hIL-lß.

Вырезание ингрона 5 из геномного гена hIL-lpc помощью искусственного мутагенеза (Eghtordarzaden and Henikoff, 1986) схематично изображено на рис. 1. Для удаления интрона 5 из геномного гена hIL-lp использовали 50-членный синтетический олигонуклеотид, имею-вдй следующую последовательность:

6' -CAGGGACASGATAT6SAGCAACAAQTSSTCTTCTœATGTCCTTT6TACA-3'. У данного олигонуклеотида 25 нуклеотидов с 5*-конца комплементар-. ны 3' -концу зкзона 5, а другие 25 нуклеотидов - 5' -концу экзона 6. В результате отяига олигонуклеотида, предварительно обработанного полинуклеотидкиназой, с одноцепочечной ДНК-матрицей (M13tgl30), содержащей встроенный геномный ген hlL-ip, происходило "выпетливание" интрона 5. Затем с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е.coli синтезировали втору» цепь, используя в качестве затравки 3'-конец отожженного олигонуклеотида, и циклизовали ее с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Одноцепочечшй интрон удаляли с помощью нуклеа-зы S1, после чего деинтронированной фаговой ДНК трансформировали клетки Е.coli. У фаговой ДНК, выделенной из 10 клонов, определили

о

ЭКЗОН 5

ИНТРОН 5

СИНТЕТИЧЕСКИМ

ОЛИГОНУКЛЕОТИД

экзон в

11|||1Ш111111111Ш!ШШ11111

И15 ^130-И1ЫЭ

ОТЖИГ

I

^ИНТРОН 5)

л

I

ФРАГМЕНТ КЛЕНОВА

пшппшпшшшш

^щшшшпшшпш

интронв

ЛИГАЗА т^

I

НУКЛЕАЗА

ЭКЗОН 5 £ ЗК ВОН 6

Л

шииштшншу

шшшшшпшшпшн^

I

ТРАНСФОРМАЦИЯ Е.СОЫ

I

Рис.1. Схема удаления интрона 5 из геномного гена методом искусственного мутагенеза.

нуклеотидную последовательность к обнаружили в 2 случаях отсутствие интрона 5 в гене hIL-lp. Размер удаленного интрона составил 1236 нуклеетидных пар (н. п.).

2. Удаление нитронов из геномного гена hIL~ip посредством по-шме разной шпюй реакции.

Удаление интрона 5 с помощью искусственного мутагенеза мы проводили для того, чтобы сравнить эффективность данного метода с де-интронированием посредством ПЦР. Основным же способом деинтрониро-вания геномного гена hIL-ip, использованным в настояний работе, был метод ПЦР. Сущность данного способа деинтронирования состояла в амплификации ДНК отдельных экзонов геномного гена hIL-lj3 и последующего их соединения в правильном порядке с использованием синтетических олигонуклеотидов, комплементарных концевым последовательностям экзонов.

Для синтеза и соединения экзонов геномного гена hIL-ip с помощью ПЦР использовали олигонуклеотидные праймеры (табл.1), синте-Бированные на основе известной нуклеотидной последовательности (Clark et al, 1986). Использованные праймеры представляют собой олигонуклеотиды, содержащие 12- и 18-членные фрагменты, комплементарные, соответственно, 5'- и 3'-концам экзонов и необходимые для соединения последних. Праймеры, комплементарные 5'-концу эквона 5 (5L) и 3'-концу экзона 7 (7R), включали дополнительные последовательности, содержащие участки узнавания рестриктаз Xbal и PstI и предназначенные для включения гена hIL-1^ после сборки из отдельных экзонов в экспрессионный вектор, а также инициирующий ко-дон ATQ (табл. 1). В качестве матрицы использовали геномный ген hIL-lp, клонированный в фаг Ifi3tgl30.

В результате амплификации были получены отдельные экзоны: эк-аон 5 длиной 117 н. п., экзон 6 - 132 н. п. и экзон 7 - 204 н. п. (рис.2). Сборку полного структурного гена hIL-l£ проводили путем последовательного соединения экзонов, по схеме, представленной на рис. 3. На первом этапе экзоны 5 и 6 отжигали друг с другом при 65° С за счет взаимнокомплементарных концевых последовательностей и

Табл. 1. Олигонуклеотидь, синтезированные для амплификации SK30H0B и сборки структурного гена hlL-lß.

Олигонуклеотид

Последовательность

5L

Xbal экзон 5-—> 5" -TGTCTAGATG--6CACCTGTACGATCACTGAA-3' 5919 5938

5R

<—зкзон 6

5'-TSGAGAACACCA-7284 7273

зкзон 5—> ■CTTGTTGCTCCATATCCT-3' 603G 6019

GL

<—SK30H 5 экзон 8—> 5"-TGGAGCAACAAG—rGGTGTTCTCCATGTCCT-3' 6025 6036 7273 7290

6R

<—зкзон 7 б'-GGGATCTACACT-8136 8125

зкзон 6—>

-CTCCAGCTGTAGAGTGGG-3' 7403 7386

7L

<—зкзон б экзон 7—> б'-CTACAGCTGGAG—AGTGTAGATCCCAAAAAT-3' 7392 7403 8125 8142

7R

Pstl 5'-AGCTGCAG-

3K30H 7- —>

■TTAGGAAGACACAAATTGCAT-3' 8337 8317

Пунктиром внутри последовательностей выделены границы зкэо-нов. Подчеркнуты участки узнавания рестриктаз Xbal и Pstl. Цифрами обозначены порядгеовыз помора нуклеотидов в последовательности геношюго гена hIL-1/s.

12 3

V"

4 Б б '

О

г Г'

Gm

Рис.2. Электрофоретическое разделение в ПААГ продуктов амплификации и соединения зкзоиов гена после проведения ЩР. 1 - ген собранный из

экзоноз 5, б и ?; 2 - сшитые вместе зкзоны 5 и 6; 3 - фрагменты ДНК фага А, расщепленные рестриктазой И1 п<1 Ш (показаны фрагменты длиной 125 и 564 Н. П. ); 4 - зкзон 7; 5 И 6 - ЭКЗОН 5 после 10 и 20 циклов амплификации, соответственно; 7 -зкзон 6.

51_

5'—С

зч:

экзон 5

5'Ш З'И

5'

интрон

61.

с экзон б

5-ЕШПШЗШПШЕШШ

пт

5Р?

ни

ак

5'

51

ни

экзон 5

6Я

эк зон 6

Щ|||1|||||Ц||||||||Ц|Ц||Щ|||тш

иштшшштттш

Рис. а Схема соединения двух экзонов (5 и 6) геномного гена ЫЫр посредством ПЦР.

проводили синтез-второй цепи полученного продукта с помощью ДНК-по-лимеразы Tth. Данную операцию повторяли пятикратно, чтобы повысить вероятность получения правильного продукта отжига, позволяющего провести полимеразную реакцию. IIa втором этапе в реакционную смесь добавляли соответствующие праймеры и проводили амплификацию продукта Соединения двух зкзонов. Аналогичным образом поступали при присоединении к продукту (5+6) экзона 7. В результате был получен структурный ген hIL-lp длиной 469 н. п., содержащий на концах участки узнавания рестриктаэ Xbal и Pstl (рис.2).

Удаление интронов посредством ВДР обладает рядом неоспоримых преимуществ по сравнению с методами непосредственного деинтрониро-вания. Данный метод более быстр, эффективен и дешев и менее трудоемок. Кроме того, он требует наличия крайне малых количеств исходной ДНК; что делает его более предпочтительным по сравнению с вышеупомянутыми методами деинтронироваяия, а такие со способом получения структурного гена (кЛНК) через обратную транскрипцию его мРШ в тех случаях, когда источники данного гена ограничены или затруднен процесс очистки мРНК гена. Следует также отметить, что метод деинт-ронирования посредством ПЦР ке ограничен размерами удаляемых интронов.

Использование данного метода позволяет также избежать трудо-змккй процесс отбора нужного гена из клонотеки или геномного банка генов с помощью олигонуклеотидных зондов. Более того, если известна нуклеотидная последовательность гена, то его можно амплифицировать непосредственно из препарата тотальной хромосомной ДНК (например, из ДНК крови).

II. Экспрессия генов hll-Ц, hIL-З и blNF-j в клетках Е. coli.

1. Экспрессия в-системе pINF 4/3

Для термостабильньи ДНК-полимераэ показано, что они в ходе ТЦР могут допускать ошибки при синтезе второй цепи с вероятностью эт 1,2 х 10~5до 5 х 10~б после 25-30 циклов амплификации, что соот-

ответствует замене одной нуклеотидной пары в рассчете на 15-200 т.н. п. (Fucharoen et al. 1989; Gelfand and White, 1990). Ген hIL-lß был синтезирован с пошщыо ДНК-полимераэы Tth приблизительно за 70 циклов амплификации, поэтому не исключалось наличие 1-2 точковых мутаций п йуклеотидной последовательности гена. Кы определили последовательность синтетического гена и обнаружили ее полное сходство с последовательностью природного гена (рис.4). Отсутствие мутаций позволяло надеяться на успешную экспрессию гена hIL-lyä в бактериях.

Xbal экзон 5---->

TGTCTAGATGGCACCTSTAC^TCACTSAACrrGCACGCTCiCGGGACTCACASCAAAAAA 60 5919

GCTTGGIGATGTCTGSTCCAT ATGAACTGAAGCTCTCCAiX'TCCAGGQACAGGATATGQ 120 экзон 6---->

AGCAACAAGTGQTQTTCTCCATGTCCTTTSTACAAG6AQAASAMGTAATGACAAMTA 180 6036—>7273

CCTGTGGCX3TTGGGCX;rCMGGAAMGMTCTGTACCT6TCCTQC^CTTGAAASAT(^ 240 экзон 7---->

TAAGCCCACTCTACASCTSQAGAOTerAGATCCCAAAAATTACCCAAAQAAaAAQATta 300 7403-->8125

AAMGC^TTTGTCTTCAACAAGATAGAAATCMTAACAAGCTi^AATTTGAQTCTGCC 360

CAQTTOXXIAACTGGTACATCAGGAOTCTC^GCA^MCATeCCCQTGTTCCn'tKQ 420

AGC33ACCAM3XG3(X;AG(MTATMCT6ACrrTCAa:ATGCAATTTGTQTCrrTCXrrAA3 480

8337—>~

Pst I

ACOTCSA 487

Рис. 4. Нукдеотвдная последовательность гена hlL-lß, собранного из экзонов 5, 6 и 7. Цифрами под последовательностью обозначены порядковые номера нуклеотидов в геномном гене hIL-ip. Подчеркнуты участки узнавания рестриктаэ Xbal и Pstl.

Гены 11-3 человека и гамма-интерфорона быка были ранее полутени путем химкко-фермеитативного синтеза Т. Л Ажикикой и Е М. Ростапшовым, соответственно, в Институте биооргаякческой химии им. 1 IL Шгмякияа РАН (г. Москва) и клонированы в фаг Ш3tgl31 по участкам узнавший рестриктаз Xbal и Pstl.

Сначала планировали провести экспрессию генов hIL-1/з, hIL-3 i bINF-j в клетках Е.coli под контролем сильного промотора трипто-Еанового оперона Е.coli в составе экспрессионного вектора pINF 4/3. Цанная векторная плазмида состоит из следующих фрагментов ДНК: фрагмент плазмиды pBR322 от участка EcoRI до участка Pstl, промотор триптофанового оперона Е. cali, последовательность SD, ген IHF-J кдовека (hIMF-y) (Крыкбаев, 1988).

ДНК генов лигировали с векторным (Xbal-Pstl)-фрагментом плаз-эды и лигазной смесью трансформировали клетки Е. coli. Было отоб-зано 3 рекомбинантных клона, содержащих.плазмиду ptrp-hIL-ip , а ?ага» примерно по 50 клонов, содеркащих плазмиды ptrp-hIL-З и jtrp-blNF-tf. Тотальные лизаты клеток, содержащих рекомбинантные шшкнды, были проверены на синтез реконбинантных белков методой »лектрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додо-щдсульфата натрия (ДСН). Синтез белков выявлен не был. Однако Сына обнаружена суперэкспрессия гена hINF-jf (до 40Z тотального кле-шеточного белка) в бактериях Е.coli, несущих исходную плазмиду >INF 4/3 и использовавшихся в качестве тест-культуры для контроля Акционирования trp-промотора.

2. Анализ втортной структуры uPHK.

Известно, что одним из факторов, определяющих эффективность ¡елкового синтеза, является вторичная структура мРНК, особенно в >бласти инициации трансляции. Чтобы объяснить различие в экспрессии ■енов hlFN-j, blNF-J, hIL-З и hlL-1/з. был проведен компьютерный шалиэ вторичной структуры мРНК данных генов, транскрибируемых в >езультате активации trp-промотора (Zuker and»Stiegler, 1981).

б'-А 3' UCtái

uiw

A-A А' 43 A G A 'A G' "ÇGU UAU

cU-Ax

С G

«n ü Й

SD, С, yu

^â-C-^ A ÍJ G' CQ-GAAU GAÇÇ-" UUA-CÙGQ

'AC

U

À te .CAS,

CAU UAAAA-AAG A GOA-ÁUUÚÜ ШС A

A A TIAA' U'

A G •A-A'

E.

б'-a

3' -A'

лß - -27,6 ккал/моль

A*A CAA

UUCA^GU ШЗи-AU-CQ-Cß-GA—Al кШУСК-ШкМ ßCvGÖ CO

С С A A U G Q A U A A' ЧА G A 'A' a A 4UC' "UAC

U A , С 6

SD ЧС ¡STwet .CCGAv

rÇU U JïÀ G

U

A VCCCA'

a

л G - -22,0 ккал/иоль

GGGU G' 'A

A'

A-G U С

3'5'

'A 'A ОТ A

-U "U С' G' С

GGAC G' 'A

A 'GGA GAÇC AAGUUÇA' ЧГ GGA--AUU' , С ACCÙ-CÛCG ÛCAAGU A--CCÛG OÂ ßUCCA-•CUCC M 4 AU' G'С'G U

.UCU-A 'CA' AAA

G С A' VA CACUC. *U~A'UGAA-CA' С6Л' A G-U-OO-GU GCÛ G С 'G С VCC-GG' •C-A'

ûG - -26,9 ккал/иоль

Г.

,ААШ. 6 С

САС А-и в

,СК

С А

(ЗА.

5'-мбиу еидлАА сулегас-А(^д ушуим а

3* -ОйШсСААШи--А-ШЙ ШСС--ААМаАО А

ОАА

дб - -21,9 гасад/моль

Рис. 5. Вторичная структура б'-концевой части мРНК, транскрибируемой с генов МИГ-* (А), (Б), МЬ-1/з(В),

и ЫНГ-К (Г) в рекомбинантных плазмидах р1грВ 4/3. Кошле-ментарные основания помечены точками. Последовательности ЯМна-Дальгарно и инициирующего кодона выделены в рамку.

мРНК, транскрибируемая с гена ЫИГ-у в плазмиде рШР 4/3, шеет устойчивую вторичную структуру (свободная энергия -27.6 ¡скал/моль) (рис.5А). 5*-конец ыРНК образует устойчивую вторичную структуру с областью гена +140 - +150 нуклеотидов от 5'-конца гена, что обеспечивает, по-видимому, стабильность мРНК. Район последовательности БО не входит в состав шпильки, а в кодоне инициации трансляции АШ лишь последний нуклеотид участвует в комплементарных взаимодействиях. Рибосома легко связывается с 5'-концом мРНК и по мере продвижения "расплетает" структурированные участки мРНК, что приводит к эффективному синтезу белка.

Для «РНК, транскрибируемой с гена М1.-3 в плазмиде pt.rp-hIL.-3, характерно наличие очень устойчивой девятизвенной ипидькм в области последовательности БЮ (рис.5Б), что крайне затрудняет инициацию трансляции рибосомами. В мРНК генов ЫЬ-1р и ЫЫГ-у последовательность вовлечена в формирование б-членных шпилек (рис. 5В, Г). Таким образом, наличие стабильных шпилечных структур на 5'-конце мРНК генов МЬ-З, и ЫМИ-д', особенно на участке связывания рибосомы, по-видимому, ведет -к сильному затруднению, если не к полному подавлению синтеза белка

а Конструирование зкспргссионного вектора pPR114.

Для того, чтобы исключить вероятность Формирования неоптимальной вторичной структуры мРНК зкспреесируемого гена в результате комплементарных взаимодействий регуляторныхЗ в том числе и последовательности Шайна-Дальгарно) и кодирующих участков, мы переклонировали гены hIL-ip, hIL-З и bINF-£ в сконструированный нами экспрес-сионный вектор pPR114.

В основу конструирования данного вектора был положен принцип "трансляционного сопряжения", заключавшийся в эффективной реинициации трансляции дистального цистрона при условии частичного перекрывания генов или их непосредственного расположения друг за другом (Mashko et al, 1990).

Для создания экспрессионного вектора pPR114 мы использовал! ДНК плазмиды pPR53S (Mashko et al, 1990). В данной плазмвде уничтожили участок узнавания рестриктазы Xbal путем последовательной обработки ее ДНК рестриктазой Xbal, фрагментом Кленова и ДНК-лига-зой фага 74. Полученную плазмвду обозначили pPR113, ДНК которой затем расщепили рестриктазами EcoRI и ВзгШ и лигировали с фрагментов ДНК, полученным в результате отжига двух синтетических олигонукле-отидов (рис.6). Лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli. Было отобрано 11 клонов, содержащих новую векторную плазмиды PPR114.

Новый экспроссионный вектор содержал последовательность SD гена trpE Е.coli и расположенные друг за другом триплеты терминацил (TAG) и инициации (ATG) трансляции непосредственно перед полилин-керным участком, содержащим участки уьаавания рестриктаз Xbal, Sac] и Ват,Н1 и предназначенным для встраивания в вектор подходящих генов. Сконструированный нами вектор pPR114 является универсальным, так как позволяет проводить встраивание любого гена, имеющего us 5"-конце участок Xbal и. кодон ATG. Каскад терминаторов фага fc обеспечивает эффективную терминации транскрипции. Встраиваемый ret попадает под контроль териоиндуцибельного промотора PR фага Л, экспрессия которого при 30° С блокирована термочувствительным реп-ресссрсм с! фага i*. и индуцируется при повышении температуры дс

aattccaattcqaqc ат^тстаслсл^стсс; 4-

Cqttaacctcctacac;atctctcta£;ccta<;

EcoRI

ОТЖИГ SD ♦

Xbel SocI

AATTCCAATTKqÄCC AT С ТС ТА С A QAQC ТСС

С CT ТА AjCCTCcjr А С AQ АТС ТСТС ТА CCCTAß

баШ/Ват 41

Bam HI

ßomHl AccI

Г Po

EcoRI+ВатНГ K

лига за T4

сл. -*bajr

Ж

Рыа

V

Ыа

Р«с. 6. Конструирование экспрзс-сионного вектора PPR114. Условнью обозначения: Аярй н РЬ1а - ген р- лш стана- . зы и его промотор; clts857 - ген термочувствительного реп-рессора cl фага X; его'-cat - гибридный ген £елка его фага А и. глорамфештколаца-

илтрансферазы Е. coli; Pr и fRpi" промоторы фага X; tfd" каскад ерминаторов транскрипции фага fd; SO- последовательность Шайна-альгарно (выделена в рамку).

*-Ь<а И*« XfecJj^ Psy

"Poll \f , _ Poel

Ml3mp19-hlb1ß j(J4l3™P19-hIL-5

« ь

ХЬоЛ>Рае1

XboI+ Hind I

HiMHll xboi Xbol+Hind JE

V_

ХЫх I ) jPoal XboItPüoI

V_

ЛИГА5А T4

ЛИГАЭА Ш f

ЛИГА'S А T^

4-

(Ш

ч!

ЬйпЦГЙДыи^в^Ьо! ХЬдДкщЗ РЩ EcoRg PglX ЫЫРх XboJ

6omHl|pgN-

Peel

Nl5t9131-hIL-1ß

Xbal+BamHI

.J

Eemsifsgojl

Xbal+Ecl 136Д J

h15t9l31-bIMFyj i

Xbal+ßamHI J

Рис. 7. Схема переклонирования генов hlL-iß(A), hIL-3 (Б) и ЫНГ-г (В) из плззмвды ptrpB 4/3 в экспрессионный вектор pFRU4. Услсенме обозначения те ж?, что и ка рис. б.

42° С. Ген репрессора clts857 кодируется созданной векторной плаз-мидой (рис.6).

В ходе конструирования рекомОинантной молекулы встраиваемый ген оказывается по отношению к промотору PR фага Я дистальныа цист-эоном нового гибридного оперона PR -> (его'-cat) - (встраиваемый ген). При этом межцистронная область оперона с близко расположенными инициирующим и терминирующим триплетами дистального и проксимального цистронов, соответственно, позволяла рассчитывать ча эффективный биосинтез целевого продукта в ревультате реализации эф-[ккта "трансляционного сопряжения".

4. Экспрессия генов в с ос г am вектора pPR114.

Схема конструирования рекомбинантных плазмид pPRll4-hlL-lp, >PR114-hIL-3 и pPR114-bINF-f приведена на рис.7. Было получено 9, .3 и 14 клонов, содержащих, сответственно, плазмиды pPR114-b]NF-/, и pPR114-hIL-3. В результате встраивания гена в зкеп->ессионный вектор pPR114 формируется новый гибридный оперон, состоящий из двух расположенных непосредственно друг за другом цистро-юв (рис.8).

Pr SD,

ИЗ

net_SPjrpE Тег, Met Тег* Tfd

АТсГ WA« \TCTC|Tftq| АТС]

ЦИСТР0Н1 (cro'-cat) цметрон 2

(ПЕН-ВСТАВКА)

V СI &5?tS ^ Рьla AmpR

>-R===

or«

Рис.8. Схема строения рекомбинантного вектора pPRl 14.

кДа

94,0 — 67,0 -

43.0 —

30.0 -

20.1 — 14,4 —

1 2 3 4 5 6 7 6

ras ^ * « |» яяшщ

hll-1s blNF-jf

hIL-3

Рис. 9. Электрофоретическое разделение в ПААГ в присутствии ДСН тотальных клеточных белков клеток Е. coli, содержащих плазмиды: 1 -. pPRil4-hIL-l£ (до термоиндукции); 2 - то же после термоиндукции; 3 -стандарты молекулярной массы; 4 - pPR114-blNF-i (до термоиндукции); 5 -. то же после термоиндукции; 6 -pPR114-hIL-3 (до термоиндукции); 7 - то же после термоиндукции.

Эффективность инициации трансляции дистального цистрона, в со-тав которого входит ген-вставка, не зависит от 5*-концевой посде-овательности данного гена, поскольку инициация трансляции гибрид-ого опероиа будет происходить на регуляторных элементах первого истрона (его*-cat) и рибосомы, транслируйте проксимальную к про-отору часть полицистронной мРНК, будут расплетать даже неоптималь-ую вторичную структуру мРНК второго цистрона. фи этом очень об-егчается возможность реинициации трансляции рибосомами дкетальной зсти мРНК на регуляторных элементах второго цистрона, что должно ривести к зффетаивному синтезу белкового продукта гена, входящего состав дистального цистрона

Лизаты клеток Е. coli, содержащих плазмиды и выращенных в усло-иях термокндугадаи промотора Pr , разделяли с помощью электрофореза ПААГ в присутствии ДСП В лизатах бактерий после индукции было Энарушю появление новых полос бедка с и. м. около 17 кДа, соот-зтетвуюких м.м. зрелых hlL-ipn blNF-j , и 15 кЛа, соответствующей IL-3 (рис. 9). Уровень синтеза рекомбинантных белков в EL col i был зимерно одинаков и составил 3-5Х от суммарного клеточного белка.

5. Onps меле пае бюхгтескай активности рекомбинантных белков. Очистка рэкомбмантного hIL-3.

Определение биологической активности синтезированных в Е.coli IL-lßn hIL-З проводили в Институте особо чистых биопрепаратов (г. шгег-Петербург). Биологическую активность интерлейкииа-1роценива-I с помощью LAF-теста (Mizel, 1979) по способности оказывать сти-глкрующее влияние на пролиферацию Т-лимфоцитов мышей линии СБА, стивированных субоптимальными дозами мэтогенных лектинов. Биоло-1ческую активность интерлейюта-З определяли с помощью лимфоцито-жеического теста, основанного на способности IL-3 вызывать син-;з антигена Thyl в протимоцитах мышей линии СБА. Противовирусную ггивность рекомбинантного гамма-интерферона быка определяли в Ин-■итуте экспериментальной медицины им. ф. М. Гамалеи РАШ (г. Моск-t) по способности интерферона оказывать защитный эффект на клет-

- 2Z

кн трахеи быка линии ЕВТг, инфицированных вирусом везикулярного стоматита (штама Индиана). Наличие биологической активности было показано для всех ревомбинантных белков. «

Очистка рекомбинаитного hIL-З была проведена в Институте особ чистых биопрепаратов (г.Санкт-Петербург). Рекомбинантный белок выделяли из мембранной фракции клеток Е. colt методом последовательно денатурации-ренатурации с использованием гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Выход IL-3 составил 0.2 иг/г сырого веса клеток; степень чистоты полученного белкового препарата составила 85-97Х.

вьшоды

1. Разработан эффективный метод удаления интронов из геномных генов п получения структурных генов путем сборки из отдельных экзонов посредством ПОР. С помощью данного ыетода был собран ген hIL-lß, кодирующий зрелый белок.

2. Определена иуклеотидная последовательность синтезированного посредством ВДР гена hlL-lß; анализ ее показал полное соответствие с последовательностью природного гена.

3. Сконструирован новьй экспрессионный вектор pPR114, функционирующий по принципу "трансляционного сопряжения".

4. Получена экспрессия генов hIL-3,. hlL-l^H blNF-i в Е.coli в составе данного вектора на уровне 3-5Z от суммарного клеточного белка.

5. Показано наличие биологической активности у синтезированных в бактериях hIL-3, hIL-lß и bINF-|. Проведена очистка до гомогенного состояния рекомбинантного hIL-3.

Основные результаты диссертации изложены в следующих печатных работах:

1. Чистяков ДА., Арсенян С. Г., Брага Э. А., Лапидус А. Л., ¡оэлов П И., Нашко С. В., Носиков В. Е , Свердлов Е. Д., Дебабов R Г. 'даленне интроноэ методой амплификации ДНК из геномного гена кн-ерлейкина-lb и экспрессия гена интерлейкина-lb в Е.coll, Молеку-ярная биология, 1991, т. 25, вып. 5, с. 1273-1284.

2. Chystyakov D. А., Nosikov V. V. Using oligonucleotide rimers for intron excision from human genomic interleukin-lb gene >y means of PCR technique. Nucl. Acids Res. Symp. Series, 1991, 0.24, p. 259.

3. Chystyakov D. A., Nosikov V. V. Using oligonucleotide rirors for intron excision from human genomic interleukin-lb gene у rreans of PCR technique. Materials of Internet. Symp. "Synthetic 1igonucleotides: problems and frontiers of practical application", oscow, 1991, p. 286.

чистяков дапий Александрович

ПОЛУЧЕНИЕ! СТРУКТУРНОГО 1ША ШТЕРЛЕЙКИНА-1£ И ЭКСПРЕССИЯ РЯДА ШОВ-ШУНШОДШГОРОВ ЧЕЛОВЕКА И ЕЫКА В HiETKAX E.COLI.

(Автореферат)

Подписано к печати 05.QE.S2 Формат 60x90 I/I6 1,5 п.л. Уч. изд. л. 1,3 Тирая 100 Заказ 60

Ротапринт МАСИ (BT>'3-3ILI) ,10260, Москва,Автозаводская,16