Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия клонированных генов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 человека в клетках ESCHERICHIA СОLI и ASPERGILLUS IVIDULAMS

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия клонированных генов интерлейкина-6 и интерлейкина-8 человека в клетках ESCHERICHIA СОLI и ASPERGILLUS IVIDULAMS"

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

IУ

На правах рукописи

/ ЛОМАКИН ИВАН БОРИСОВИЧ

ЭКСПРЕССИЯ КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 И ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ЧЕЛОВЕКА В КЛЕТКАХ ESCHERICHIA СОИ И ASPERGILLUS МШ'ЬАХК

(03.00.03 — Молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в лаборатории структуры генов эукариот Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Винецкий Ю. П.; доктор биологических наук, профессор Машко С. В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Козлов Ю. И.; кандидат биологических наук Мочульский А. В.

Ведущее учреждение — Институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Московского государственного университета.

Защита диссертации состоится <2 1993 г. в У. на заседании Специализированного совета Д 098.12.01 при Всесоюзном научноисследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов но адресу: 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИГенетика.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

' ЩЕРБАКОВА В. Я.

ї, ошмі :іАРл:стт;сгіікд рйпош.

Актуальность теті. в ііослодшіп годи прог/одятся ілкрокоо ссподонаикя молокуллрных лвзсшцізнов регуляции икиущюм системи опошлсд. Особой шшнакио ксслпдоеііїолєИ пряЕяокаог* кзучеиао і-ог/лонодааторіп-л: і|-:ії<тсргіії( їштсрппіікипап, приясггивлешхп: дсіст&їочлп •голи;і&іі группок гл.мкопоіітїдов с иолекулиршл;* иастсг.ли от 10 до 50 :Дїі. ігре.ипріїїіятио апрокіїе лсслодоиаплл нлїср.и.'ііїліноіі ітзг.олЬ'ла іокйЗііТЬ оумгіС'Гії'овсіїпа: ц оргаїіїїио ііоіоіі сзіссеки рсгунсізаи іг«:іуі:и'.;х іі юсппшггольиих рсакд;:й, в ілітсрлй нлтдрлгьїГлни >:і ркїг риг.ь ііідаііторпв. і:і.;;ісі.лідось, что сацтси гчїсрпеі»!їїі;гіи происходит ліїйі, іі її г.сг на сілнуа и яшіяится ііич-ілоїс o-i-iii.Ti.o5 • родида

іппу пСК^Иніі КДСГОіі ( Ки с ПйІІСИл Іі С. і. и Д'р. , 1:1:42).

Одна из гллілих ноет ь регуляции нхнуиііого отвода закиПам ііптіїріїйііі.і.п-О ( п,-£). агргіі-'Ціьі Тйкжа цопграли;://> рокь я іизаплсгк-я іазличіод: *і<а«иі1 и органон. В посплліггйльіеіі; рг^лщиих оргдп^о»іг,

і.ТіИЧОІіуп ИГріїі.'Т !:1.1 ерДеЯНШі-а Гіто псрг.и.4 ДиТОКЇ.ЇІ, о

котором бмлс спс(ізд;л, что сп птивлгт ::іій(зтзкїг»с нйіітрофилоз. Зпокптяо кптсрлаіікйнл-Ч опосо5ст:іоізать ппспалиїслілпїн роак'Дцдн

оргаі;;<зка представляет болмлой иптяряо н>> голы:» длз іпуїного кзучшыс его хараягер/х-гкк, по И практического пранапслії:*, сиикиин;:* на сїго осново прппаратсп, •

& дтсїоцщску «іроцанн позтзішч. сознсй’сость аф}.актйпкиг,- прзкеазім і иііїсрдсїкиїіов для диагностика и лечения РЯД» апбслопаиЕй. Одкако наиболее расиростралсніїми і! с т (V .пізніше ппнучоїия атия псг;;г.атл іі препарат «шаі-к количествам, нпобчодіп'.!;;* дл:: ?>: прііїіонпїпіл і) >іпііі.г:5:і:я, ивппатея ксиусстпяипз ссзлаїи.'о {Ь'мпрзг-иъшв мгзгли'пролулсізї -і реііоіібкяантіЕіх і.нторлс/;ки:іоп. Кик гзт;~С'П1о, сй!ш.'а»г:яаа'.Кй!'.; ■■

бзитіфкальіа.):: скстоиіг рпкснбчіи'лтип о^П'їа кз гідглг'гімг.:

по своиа структурі ід: с, возидопо, біюлогйчсскйн єно Не- :гк г.ргрсз>я*и лзііілогп!;. їіалілдпа зцгчаїкю пр.-?о;ір"7К(:Т п сп.т.і:: (! еї::н рпп;-" ■' '.'.’і:і п і'.ії>;рнат5т,!а.:ї: гіукарнотіічесннх г^ствк і лспрас:'.‘Л гг:'г:'ри;і'зг<;-і':-:с г

голив. Соі'.;,с схаени э::с пр-ісс..£ гсно_' :■ ,г г;йг.ь-.с |..ч?<ч.г.г .•

культура;: і'.пйток ііі:е!:ог!Кіг.іа;їх псз«сйг.эт р:.::лг:ть рип '

зпглч, идяако, па е:і взгйчд. веська пррспа:«гско.15 являє іс,і ргсгі-Зогі'.'і систин зкспрксснк гогерологкчіг.!): гпі:оз в иііцзпнсі-'іьі^^”

грибіїх - і:ркродіь)2 продуцзнтгч егі'рптігру екпх (ізлкоп. Позлоанесті, попучоная суііергродуі<ци* роконбаїгаитног о эукариот'песиого балла, наксікалі ни чрабляя еішого по своем струнгурт.-к ссоЗІстваи к прзродиэиу щііпогу. дштст грибчип с я сто им гі'спрчгсї* очялі. Ириалсзкагплыима дли

досїижения биосинтеза іштврпейкиков, большянстБО пз которых явлЦит глїкопротоіїдани.

Постановка задачи. К началу лашлх работ вколись отдельт публикации по клонированию кДНК впторлойккна-В человека, а танхке бвоскнтезо роконбинантішх hlL-б в hIL-0 и бактериальных нлєткі (Schmid et al.r1907; Arcono et al.,1991; Lindley et al.,19B8). Крої того, сообщалось о получении продукций биологически активного hIL-6 Asparglllus hidulans (Carrez et ul.,1990). Эти работы созда. предпосылки для генно-инженерного конструирования штакиов-продуцент биологически активных lilL-C н liIL-O, пояучоннв которых из природ» ЙЬТО^НЯКОП нвляотея очень дорогоствлияк и неэффективный процессом. Сипая с этик кы определили основные задачи предстоящий работы.’

1. Создание бактериальный штаинов-продуцентов рекокбшшшых ЫЬ-О hlIi-8 ua основа В, сої і, способных обеспечить получашю достаточи КОЛеЧвСІВ ОТ ЕХ ПОШШОІ1ТИДОВ по только для научных целей, но возможно, практического использования в медицина.

2. Создание на осново ницеляалыюго гриба AspcrgiiJus nidult! системы для экспрессии гопов иптвряеіІкяшш^я секреции СИНТВЭИруоКС

. продукта. '«гь>

научная ковнзиа. Научная новизна работы ааклвчаотся о еле души 1. , Получен эффективный біосинтез рекомбинантных ML-6 и hlL-8 клетках E.coli. ■

а. Создана новая система экспрессии гетеро.югичных генов в клоп Aspergillus fridujans на основе использования промоторной области участка гена. нодіруюнего лидврный пептид, fl-Gol Penlcil. евпезеєпв.

3.',, Показан высокие уровень транскрипции рококОикантиого hlL-6

A.nidulans при использовании созданной оиспрассиопно! систв Тестированием биологическое активности обнаружена евкре рекомбинантного hIL-б. '

Практическая значимость. .

1. Получены пригодные мяв промышленного примене

генно-иіеиенарньїе птанкы-продуценты рекоябанацтгых hlL-б a hlL-B.

2. Показан высокоэффективны! биосинтез рекомбинантного hi

клетками E.coli. 1>аэреботан способ культивирования, при кото существенная часть синтезируемого реконбинантного полилепт находится во фракции растворктв белков клеїм*. .

3* Создана новая система, поэвьлямцая получать экспрессию rt цитокяновв иацеляаяьньп грибах.

Структура раДюггл> Диссертация излокона на ІІО стр. надвропяпцого ката, включая 20 рнсупков и 3 таблицы. Работа состоят кз рврдвнва, зора литератури, снспвркиоитальной части, содержащей условия озвденля экспсдрмоатоз, получошавс розультатоп и их обсуждения, ізодов в списка пспользовашгаЗ литератури l2.lt источников!.

Апробация рвЯот». Каторлапи дассертациз бил в далпгшт ка гллупзродио;! коифораїтцкн MMDS, canceC find human retroviruoao , 152, ST.-Peterburg и на ccitznapax отдг.яа биптеикопогвв ВНИИГеисткна 1302).

XI. ГЕЗУЛЬТАТІ! И йГСі’ШЇШИг.

Клонирование rf.na hTf.-B.

для кпошіроиаиап rencD Еіітерлціііптон чолаїгска пана ранва бпл алучси банк іШІїС, сиитозированясій на ро1у(Д)'*і:І,І,.;С 1:3 стякулироиангси опсцптов донорской крони чоловсмса. Кз дзтгггї библиотек:; били тпбраки роконб’лтіїтіїле фат, содержание полноразиеріЕДЯ ПДП1С ML-1а, ІЬ-10. hit-б (ІСотоїжо С.п. а др., IS3D, ICQIi. Иа осіюваикц дніїїйгс б зкспрассии гана hIL-fl в стияулг'ропашпс; коїшцктая чвпоиска ir.itaushima et el., 1980) Сип сделан сиі?рд о вєз»іоїї;тосїв

спош.зованкя гнвгуоііся у г.ас библиотеки нДї'ІС для поиска з Jiftii J«a::a, одпраацсго кДНК hl/.-fi.

Отбор іі башо !(ДП:С рвксшбпнаЕггшлс фагоп, сокаряспж: НГІ.-Я,

іроводилк с г;слользаааняем дну.” ол<ггсііуг:лсгот»дім:: зсшдоп.

іуклеотидтсе послэдопатольпоста зоидов соотвптстпопалл частя;: гада ilL-S, нодкруг.'уиі ll-иопцевуа а С-ісоїіцовую області; spanoro бв/ша п ібсаначої'и, соотпотстнаїша. ILCU її ILQC. Учкттпш дшпил о

:ридстаннтолыгост8 нРШС UIL-8 п пуг,а сутіирнаґ: на і!С7?і;тарі:ои кРІІК

1 iatauahir.ii ot al., 1300) иы использовали для первого сііра’івпга

п.'Сорку из 1з:Ю® рокпнбинаїшіш: ііагоз. В результата губрмдизйнм с «СЧСШіІ 0ЛИГ011у!!ЛеатКЛ!ЫН зондон IL0U било получено 3 5

гибрляззуггцогся son. ff-агя »з зтех зон объединяли я пмсеналц дня

юатерііого скринвнга олягонуклооти.ипам гоплои IL0C. В результата било получено 0 реконб«нантіаіх фагоа. Для дальнзкиего ашлїза был отобран luioii, сбоЗ!!ач"ш:„'Ч ILB-3 « содержа*.;! встрооаниЗ і!ргігатігі нанаолиавй Щ'.’ЛІЧІ (примерно Ї500 И. II. ).

Опроделвмаая паня нуклаотидна я последовательность кДНК hIL-S

приведена иа рзсунна І. Анализ этой послодопатель'.тстя показал, что она содорлит открытуп ракку считывания для поллпот ода. состояідзго хз П9 аминоккснотного остатка с раечктанней нолекулярпой кассоа, разной R кЯа Српрярянп с опг“ч“лв!«.чоИ И киачпвэй амшокгслоткоП

иослодоватолыгссть» hIL-8 IVoshLmura 1587) показало, что зрелый болі начинается с Ser‘a к е.*П:аг,ыалд псчшд' Єостщт_ из ?.7 ч. к. Но Сш oCiiupyii-.Giio иотонцкаиыьи сайтов и-глшшззнировйнг.я (Asp-X-Thr а; Пср-x-Ser). ироиодсішос сііадішц.пи ііуюіеотгдіїїіх нослидиааз ельписг; іШШС hXL-й, определены-:.': в различии» «айи;..чїОїідл:с, бы явило ркзлгчдл раз перах В** іштрапсіїїфуоїшх области)!. Крони toroi d дііпішй облас ПОСЛОДОПОТеЛЬНОСТК, (іпродилоішоі; ШІ'.Д ХМ'ЛГГСЯ - дзлецпд одна ву;шоот!!Д-і, в ііодожЬПїй -24. ПуіЧіеаткдйцх Звии:і іі у.одируыаа?. ойпііс обнаружена по Сило. І! задачу ііа'лвй рйбоїьі ііо входило кЄс;;идоиаііі«.и З нстраисл:руи>(о£ области клон.чровашіоії ішіл itJUiK JlIL-S, одаако, сиішвнкроьалг. 2CQ пуїспоогкдоа отоК области я обнаружит Da;tc;ty однії НуХЛСОТЕДіІ (С ->С) й нилоаонзя 333 (ряс. 1).

-1 gagacagcagacjcacacaaycttctagrjacaagiigccii ' Іі Т S К и Л V

ggaagaaaccaccggaacjaaccatctcactgtgtgtciaacatcjactfcccoiigctggccgt ЛЬ І. AAFLISAALCEGAVL. ИМ'

■ t!gctctct!.ggcagccttcct:gaUt;tctgcagc:tctgtgt.ga£ujgUj£:agttttgccaag ■i-SAKSLKCQC I KT YSKPFIIPK ga[jtgsuacagaacutagatrjfcoagtgcataaatj.acat.actccanaccttt(;ceiccccna F I ,K E L it V I E S G Г I! С Л W T E I 1

citltatcoaatjaactgagagtgaCtgagacttggaccacacLgcgcconcncagaciattat

v к ь в o g "її Ё ь с Е 5 г" -к ё ІГ w v q к

tgtaaagctttcLGatgJjaagagagctctgtctggaccccaaggaaaacLgtj <tgcagog VVE KFl,KIl AE tiS« .

QgLtgtggagaagtttttgaagagggctgagaattcataaaaaaattcotfxtcLgtggt .Qtccaagaatcagtcaagatgccogtgaaacttcaagcaaatctacttcaacacttce-j tottgtgtgggtctgttgtagggttgccagatgcaatacaagattcctggttanatttga . otttcagtoaacaatgaatngtttttcattgtaccatganntotccagaucatacttota' tgtaaogtattotttatttgaatctacnoanaecaacenataatttttaaatotaaggat tttcct.. . '

Ряс. X. Пуклоотмдная последовательность KCHK ML-3 г. продсиазан ап я во кк слот кая последовательность сайт отиепло

сигнального поптида. Откпчекы областг.. конплеконтпр

олигонукпоотидкым зондак 1L8H и II,ОС. • .

Пкосинтсз рекомбинантных hIL-6 к hIL-Я в кдвтках E.coii.

Для обеспечения биосинтеза rIL-б и rlL-О в клетках E.coii была использована высокоэффективная зкспроссаоннав система вектор -хозяин, основанная на способности РИК-полимеразы фага Т7 осуществлять транскрипции с проиотордв поздпнх фагопих генов. Птани-реципиент получои из природного штакка E.coii BL21 дефектного по протоазан Ion и oirpT, содориит а состава интогрировапного п геном бактериофага DE3 гон Т7 РШС-попиморазн пол контролен иидуцируоного ИПТГ промотора lac U75. Данная система окснрессив обаспачипает высокую транскрипцию готерояогичного гена в случае индукции синтеза PHiC-попииорази фага Т7. Наиопдеиио трапс!фиптов готеропогичного гена достигает уровня рнбосомной РНК за 1-3 ч. поело индукции. Особапиостн рогулпцип пронотора lac UV5 приводит и току, что а ноиндуцмровашолх клетках существует базалышЗ уровень Т7 РИК-пояниоразы. Это ножот приводить ц нежелательным последствиям, особенно п случаях, когда продукт экспрессии клонирогшшюго гена токсичен для клоткв. Для окспросс'ав таких гонов созданы птамии, отличаюэдиося от В1,21(Ш?3) иалкчаом плазмиды pLysS или pLysE, которыа содержат гон яазоцика бактериофага Т7 - природного внгабвтора Т7 Р1!К-полимеразы о отличаптсд уровнен ого экспрессии. Вторая часть РШС-полиноразы фага Т7 завясниой свстекы продстаалонна сконструиропаш&тн на базо ■ плазмиды pBR322 акспроссионными оокторани серне рВТ, содорзагшмн поздние промоторы в торкинаторы транскрипции фага Т7, пкоющани различные сайты для клонировании renoD и отличающиеся некоторыми конструктивными особенностями. Эта система ранее была разработана проф, ф. М. Студнорок (Brookhaven National Laboratory, U3W о любезно перодана ин профессору Нашко С. П. (ВНИИГенотика. Москва).

Стыковку фрагмента кДИК., кодирующего зрелый hIL-б, с промотороь,

узнаваемым РНК-полиноразой фага Т7, кы осуществляли методом ^ » tt конструирования гибридного оперона - TGATG-опарлапноиа , позволлкацин

осуществлять экспрессии гетерологиишх генов независимо от вторичной

структуры образующаяся кРНК. Дна создания целевого гибридного

TGATG- оворланчона с дкетально расположенный геном hll.-6 ил

использовали сконструированную ранее нлазмяду pET-3B-cat-2'T^ (Нлшко

1992). Схема сконструированной пназниаы pET-TGATC-hIL-б приведена нл

рисуико 2к.

Ляя конструирования нолевой зкспрессиониой ппазннди pET-hIL-0 ни нодифицкрг-ш.ли клонировании)* нямк фрагмент кДНК hI/>S. натодон

+ШеІ

Ряс.2. Схемы сконструированных эксирессиоиных плазмид.

олигонуклеотид-направленного мутагенеза Нр* этой кы : дополнительный АТО-иняцхкрующий кодон о состава сайта расщеплен*

1 перед первым кодоном зрелого hlL-B, кодирующего серві дополнительные нуклеотиды, кодирующие два С-концевых анинокнел остатка hIIr-8 и терминирующий кодон. В дальнейшем модифициров фрагмент кЛНК был интегрировпн в состав зкспрессиошіої понт ПЛАЗМИДЫ РЕТ-ЗВ-2Т0 (Кашко 1992, рис. 2Б). •

Для получения продукции рекомбинантного hIL-б тронсфармир штаммы Е.соИ BL21(DK3) и BL21(DE3)[pbysS) плазмидой pET-TGATG-l На рисунке 3 представлена картина электрофоретического разді препаратов суммарных белков клеток E.coli до и после индукции сі РНК-полимеразы фага Т7 добавлением в ростовую среду НПТГ. индукции наблкдаотся появление нового полипептида с молену, весом 21-23 к Да, что соответствует размеру природного Денситоиетрическое, сканирование геле! показало, что через 1,3-1 после кндукнии количество данного полипептида составляло около общей массы клеточных белков, данный полипептид локализовав фракции нерастворимых клеточных белков и составлял в это! <}

-:о

... I 1 [.-Г;

еткгэ — ;1.ь

ел-"Ч <1 -!■»

ййьк^2^Г

-- 14,3

Р„с. з. элвитрофорегранка белков, выделенных « «леток в»

- ‘ 1 -очвщош&Ш реионбииантныи ЫЬ б.

\ 2 3 4 5 б

.V • -5

§-Г-5 - к-

ЙМ*

1Л-' 14.и

}{ * -* ’ „1 1 * 1 ^

’ ‘ > 4 I! . » - *’

РИС 4 Улектрифоры-ранма банков, выделенных мз клаток 'а 1“ •’ соЧ Ы2Ии"з)1р1.уаЗИрЕЧ’-ЬГ1.-8| (1,2,4) ■ Б£.21<ПЕЗ ) Ц-Й-МШ,-в 1 : I

“• ,ш „....„к,,!,. 2 - чи,-.п:) ?. часа после индукции; 3 - ночнам куш. (У!»■> г

- ди иьдукиии, ^ ',м< о*-,1К1)в; ь - фг>,1Кц*н р.!Стиормиыл белый»; *• -

4 - франции 1и;рис10^1)иии< ' » *

ичи&онш.'й гм;иои'*<:л.п ’.и" 1.4.-м.

болео СОУ.. Из 0.8 г. биомассы индуцированной культуры было цолучопа 1,33 иг. Чистого hIL-б (гомогенность препарата болос 90S), обладающего биологической активностью, специфичном дли природного hIL-б.

Гокэибинантпои плазмидой рЕТ -hIL-О трансформировали кпеткя птиниои BL21(DE3) и DL21(DC3)[pLycS]. Как видно из рисунка 4 в спектра суммарных болкоп клеток штамма BL21(DE3)[pLyGS]{pET-hIL-Q], индуцированных добавленном КПТГ, появляется полипептид с молекулярної иасеоіі, соответствующей зрелому hIL-8 (около 8 КДа. ) и состаслліидяи примарно 30У. от исой массы клеточных белков. Этот полипептид находился во фракция нерастворимых клоточпых белков и составлял Солоо СБ% от их кассы. <

Интересный результат №і получили при анализе спектра суммарных болкоп-клоток штамма UL21(DE3)[pET-hXL-0]. Как оказалось, достаточно большие количества 8 кДа полвпоптвда на ка плі: и акт с и и клиткох культуры, культивируемой в ючопио 20 часов без вндукцеи синтеза . РНК-нолинеразы фага Т7 (ночная культура) - болео 13% от суммарных белкой клоткн (рис.4). При анализе фракции растворимых йолков

выделенных из отой культуры было об'.пруаоно, что содержание о ной рекомбинантного hlL-C составляет Солоо 20'/.. Из 10 г. биомассы штамма BL21(ПЕЗ)[pET-hIL-О] было'получено 9, 3 иг. очищенного рекомбинантного hIL-О. Препараты очищенного rhlL-О обладали биологической активностью природного белки. . ■

Наиболее неожиданным результатом при апалмзо продуктов бяосиитоза плазнидосодоржащих штамнов поилось значительное накопление рекомбинантного hIL-О в клетках ‘.ночной культуры E.coli

BL2I(DE3)fpET-hIL-О], культивированных о . отсутствии индуктора РНК-полимеразы фага Т7. При отои уровень биосинтеза hIL-8 отнмн

клетками бил лишь незначительно меньше уровня содержания рокомбинаптиого полипоптида *> клетках штанмов BL21(DE3){pET-hIL-0] я BL21(DE3)[pLyE5J[pET-hIL-BJ, выраценных в условиях индукции синтеза РНК-нолинеразы фага Т7. По-видамоиу, синтез рекомбинантного hIL-8

клетками E.coli BL21(DE3)(pET-hIL-8] происходи за счет относительно невысокого ' базального уровня функционально активной РНК-полимеразы фага Т7. Весьма вероятно, чте при остановке роста к деления клоток в стационарной фазо при условии продолжающегося накопления и/или стабильности РНК-нолинеразы фага 17 , а, следовательно, и накопления hIL-О, доля рекомбинантного полипептида оказывается значительно!. Е пользу этого предположения говорят тот факт, что в клетках ножной

культурц Е. coli BL21 (DE3) [pLyoS J (pET-hlL-f)}, содержащих белкавцї ингибитор Р11К-полимеразы фага Т7, накопление рекомбинантного hIL-Q нв происходит.

Пообходимо отметать, что . накопление значительных количоств белкового продукта клонерованиого гена в плазиидсодеряащях клетках Е. coll BL21{DS3) {pET-hlL-Q} D поиях экспериментах

регистрировалось талько в случаи hIL-Q * іш обнаруживалось, напрднєр, для hIL-б ним liIL-la (Кашко 1992). Причина этого эффекта в настоящее врвил не ясна. Но исключено. что она связана с образовании»?

нолекуламя hIL-G специфических агрегатов, устойчивых к действии протеаз E.coli, Функционирующих а стационарной фазо роста культура. Возможно такие, что на уровень биосинтеза влияет различная токсичность для 'клоток E.coli синтезируемых рекомбинантных

полипептидов, приводящая, в случае hIL-0 к существенному накоплению целевого продукта в клетках ночной культуры ттанна BL21(DB3)[рЕТ-hIL-Q] и, напротив, в случав hIL-б замедляющая рост Культуры DL21(DE3)[pET-TGATG-hIL-6].

Пяосмптез рекомбинантного ML-6 В A. niclulons. природные грибные штаммы-продуценты с личаются высоким уровнем экспрессии я секреции продуцируемых белков. Напрхкер, штамм Л. niger может секротировать глюкоамилазу до 20 г/л. Механизмы посттрансляционной модификации синтезируемых белков в мгцелаальных грибах аналогичны таким процесса» у высшчх эукариот, что, возноано, позволит получать различные рекомбинантные эукариотические белки, максимально приближенные по свг.'.н бнохвмическин характеристикам к продуктам, получаемый из природных источников.

Анализируя данные о клонировании и механизмах регуляции гопов няцелиальных грибов можно сказать, что число регулируемых грибных промоторов, удобных для создания систем экспрессии чужеродных генов, по велико. Наиболее часто используется промотор гена alcli [aicA(p)] A. nidulans a gJaA A. niger. D сплэя с этим представляют большой интерес данные об кспользопа.нии при экспрессии гетсрологнчных гонов в мицелиальных грибах новых промоторов. Нами сконструирована оригинальная система, позволяющая экспрессировать чужеродные гены и получать гетерологячный полипептид в виде секротируомого продукта на. осново впервые клонированного нами гона р-галактоз идазы Penlcillium canescens. Для палучо-.чя эффективной транскрипции гона h 1L-6, последующе* трансляции и секреции синтезируемого полипептида мы использовали промоторную область и участо' гена, кодирующие лидерныВ

X. Ksotiupooaiaiuii reiJ p-r?«»KT03Bflttaii p.caneacens.

6^-

npotiOTop

•fEco RI

up

0-Gal

.tyokpg

* •

fiipa r

2. OaMro:<yKncoTnn-Hanp«one«iinja MyTarsues.

Jin

Spoftuil hIL-6

...PrcAla

t»roValPro..,

ptz IB • fEco RI

• 1J13TG131

■J-.lpa I {c03flaHiiuH cuit\ fEco RI

3. PecTp»ii-'u«,i Jpa I - Eco RI K tiocnecytaiee JiiirKpooautie iparneaTo».

aei-£cs<u 3psAus htL-fi

Ala

«,. LyuJ.rg

PioValPro...

3/’-

Z2&%22Zr PtZ 16

t£co Rt . t^pa I |tx-0 RI

4- Pec-rpuKllxn Eco RI BfWSttun pKBV Z M ptz!8fJGal-IL6, «ttrjcpocauHO KOJiysemanc 4’parneUTos.

■ ^Eco HI ^Eco RI

rem Irp C* A.nidulans

...term

tT£C

pKUY 2

Co

»P

Tc*

| Eco F.I Jin-(3Ga.\

3pecuft hIL-6

Ik,

Eco RI

&

..,Ly3Arg Ala ProValPro... •••terBW

pBG-hIL-6

tpr

Tc*

fcco .It I

Pmc. 13. Cxeiiu KUriCTpyBpobaiiKH ima3M«AU pBG-liIL-6.

пептнд 0-галактоз идазы Реп1сИ11ит сапезсепз. Ген этого

сокретируемого фермента был ранее клонирован п лаб. Структуры Геков Эукариот. впиигенетяка (Москва), соквенирован я исследована чго регуляция (Николаев II. В. я др., 1939, 1092). Промотор р-Са 1

Р. сапевсепсз обеспечивает эффективную транскрипцию своего гоцэ, Ври этон уровень биосинтеза секрстяруекой (1-Са1 в Р. сапезсепЗ составляет до 0,5 г/л. Кроме того было показано, , что аффективными индукторами транскрипции гопа р-ба! являются араихнеза, поктин я некоторые другие полисахариды клеточной столки растений, при этой транскрипция с данного промотора полностью ингибируется наличном в ростовоЯ сродо Глюкозы. При клонировании гона р-галактоз'мдазы Я.еялезевлз в Л.пх<}и1ап5 уровень биосинтеза евкрвтируоного форнопта унонылался в 10 раз при аналогичном уменьшении уровня транскрипции, что позволяат предположить сохранение эффективности секроции при использования амперного пептида р-Са1. Кроне того, было показано, что вещества внгибнрующхо или индуцирующио синтез 0'Са1 в Р. сапегселз вызывает аналогичные эффекты в Л. п1<1и1апз.

Схема конструирования экспрсссиопнок кассеты продставлона на рисунко 5- Ли восстановили последовательность анинез/яслот, необходимых дня отщеплении лидорного иоптида (3-галактоз идазм -Ьув-Лгд-Л1а. но при этон ЫЬ~6 содоряит II- концевая Л1а, коюрого нет у природного болна. Для осуществлония эффективной тврнянация Транскрипции созданного гибридного гена рСа!-МЬ-6 исполъзопялп торнинатор транскрипции гена trp С Л. л1с1и1алз.

Для изучения экспрессии гена рекомбинантного 1111>6 ни трансформировали протопласты штамма Л,п1с1и1апз ИгрС ) плазмидами рвс-МЬ-б и рКВУ 2 в соотношения 20)1. Плазмида рКВТ 2 носет со лекгивный маркер (ген йгрС Л. п!<1и1апя). Использование во в качестве ко-трансформирующая плазмиды позволяет отбирать рекомбинантные клоны по фенотипу ЪгрС+, при этон средя рекомбинантных клоноо содеряотсл большая доля ко-интегрантов (Т1.тЬег1аке К.Е,, 1951). Из шест»

полученных трансформантов с фенотипом йгрС выделяли ДИК, которую исследовали методой блот-гибридизации но Соузорну на содержание о ной гена М1*-6. Было отобрано 3 клона, обозначенных АН11*5 я Получивших номера -2, -4, -6 (рис. 6) . как видно из рисунка, наблюдаются

различия в гибридизация этих клонов. Мы предполагаем, что сайты интеграции в геномную ЛИК различны для клонов 4 я Б я- не различаются для клонов 2 и <1. По-видимому, это связано с различием участков интеграции э геномную ДНК котрансформяруюп 1 плазмиды рКВТ 2. Однако,

FcoRI

4

Bam. HI

1

2 4 *5> 4t>

Hindi II

23130

6537

4361

- 2322

- 2027

Pkc. 6. Б«от-гибридизация ДИК, ридолвниой

трансформантов

A.rtldulens trpC

[ р] HOMQiJiOJH фрагментом кДИ1С hIL-6.

A I ; © Ф Ф ffi

г ;« • «I %

3 ■ & « %

4 © © 0 w

IQO GO 25 13 C 3 1,5

-+ % PISK

.4

fc-'

tft C'ii

Ж?-8*, ея^вв

V

28 S

»- 1C s

Pkc. 7. l - Дот-гибрвдизацкя poly(A) кРНК с [32P-dAT£*] кечзиии

(.лигонукдеоиджн Лондон BGLP. poly(А)+нР11К шдапэна S3 клеток: I -/\ canescens; 2 - a.nidujans с шиегрнрованныи гонок fl-Gal; 3 -

.l.niduians AMIL6-2; 4 - A.nidulans AH1L6-6. Количество РНК в первой проба: 1-2 нкг. ; 2-4 - 4 ииг. Б - Блот-га6р»дазацвн: 1 -

;о1у(А)+яНШС Л. nidulans AHIL6-2 (Змкг. ); 2 - AHIL6-6 (Ьнкг. ); 3 -

ро1у(А)',кГ'ПК Л. nidulans 4,5 - poly (А1 *к1Ш P. canescens (E *

0. !i мкг. соответственно).

недъэл исключить liepoHTiincv. нопосрадстпеннод интеграция зкскрвсссоиноЯ ппьаналн pCG-liIb-б н гонок, хотя олл должна быть сутеоктвшют Н‘;;ш вероятности гополапчноИ рекомбинация между twuaif.ufl'js pUG-UTIi-ft ч хнтсгриравлшюЯ в хромосому рКПУ ?громо тот, г.з рясукяа iikj'iio. что и случае клопа ,ЫШ.>6-(; интеграция акелриссионпой лассетм произошли « нескольких постах, ир/тя Ьолячество иитегр/роваиних копий сумвстяенно больпв чвч у Д'.ПL6-2 я .VULG-'i. •

W1 чсслодоланч транскр*пцкп рекокбг.шиггчого lilL-fi н A.nidulJиз в уии)вил>с г.ндукд*.” траискрлпцяя РНК с промотора гвна р-дя1 «отслои б.чо1-глбряднзоцлы !’)!>С <; рпд.чаактишш каченными эондакл. Как вяяпо г.з psayitHu 7 осукюстлллатся траксгрклцляг гона рокоибяна.чтиого с

промотора гена l\ czucscenn, !*азнер схитозмруепог» трпнекрзшто

составляет около 1S00 нуклеотлдо'; , что позволяет предислсяять э'(^сктяииуп тернишщкм ТрансиринЦяя в участи» term Ни сращшкя

j. CIJ7U ^

котодок лот-гибркдязацяя ро1у(Л ) ГПК я блот гябрхдхз&чяк poly (Л) F!I", уровень трппскряшс.г. геноэ (J-cai я /5-GaJ-lilZ.-C в Л. nidulans (psc. 7). При аток за юн» принимала уровень транскрипция гпна 0-Gal ь 1\ canescens. Оказалось, Что уровни траискряццпл в гетерслоггпюЗ системе обоих сраииилаймых го Пои Примерно рз&ш (около 5 У.). Тамга

практически но отлкчаюгел урошш транссрянцмн геноэ hIL-C о клапане ЛМ1Г.6-2 и лшьб-б. хотя они отличаются чкелок конкй этого гона п

гонинн. и литературе итнечаотсп тот <}акт, 'что игсутстяяв строгой

корреляции МКЧДУ К0111*ЙН0СТЬ*5 .4 ИрОДУКЦК'.’З, вероятно, BH3WIUW НйЛГЛЛСН различных сайтон интеграции экснрсссяонной кассеты.

1!а осноианяя опубляковишмя л£1!И"лх об вкткэностй л уровня секреции Р, canescens о A.nidtilans , нотор«г систуиллог спало

О, ОН г/л г япляятсл достаточно высоких дли продукция гогсроиигячит-сс бплков, нокно сделать вывод d ток; ‘но слииструг.ровпт'м с.гстела

*

позволяет Получать высокий ypououit транши'«шцг.ч' гзтехшлйгч'ммх генов п Л. nidulntrj. однако, эффокт^ипал . трапс!'р*.:;ц"я гвтерологячмогв ! гшя из полнотел гарантией нолучоня." высокого урооня бкоечнтоза продукта этого гона. Надо яэсостдо о нехапязнах яняикацк* трписляцчч у эуяарчот. Крама того, уропень блос.ч.чтуза гЬтерояогячных uerpn'tiiik балкон а гркбнше скстсиох значительна ичха, чпч гоюропогг.чюк грчб!1й балиси (Van Исп Jltsndsl 1$ЭИ. Ллк оНрЗдчлолч* уровня спкрпик* lilb'6 attanr-SxposaiiM болкн нульгурвлЬпой кйякоетя.. ЭлагТроф^ротглссхяЯ щгяйяз cetipatypyftm-tx бйЛЯОО Д. nicMJoПЗ в ftMXLG-в !’ч иозвол.-:)!

наи Knni!t*iJ'iiiUfpobaTb ерндй пййвяягппЗс.ч. j46noJiH*Tiin!,ruz по отног.ппг*)

if ((ритроли, болкоэ с кплекуляриыия г.йссйііи » облвртд Е'З лолипоптнда, соответствующего hIL-б. Однако. рсоля^рвсцив уупьтуралытм жидкости птакиов A11IL6-2 в ДіЦЬб-б D rjII'H ОЧБ (CujiuT-Петорбург) показало паявчво а ной едстквиости, спецкі»ішрй дла J1IV6. ■

Низкий уроьснь продукции роконбянаптиого lUJ*-6 По срааизпкв о ррвіїпсн продукции /і-Gal и той so гетсрологкчкоЗ свстоко, па-ввдакоііу, Сііязбк с протоолхтьчнскші расщсплаїшон схитьзкруониго продукта ела с дураки ч'актараиЕ, влияюцкпк на трансляцию к секроцво белка.- Но, нгснотря іій ннокаї уровень бкосэситоэа hIL-С в данцлї оиспроссиошюД сх'стсип, роконбытш .алй балок вероятно г^-лоягтсл с ка!:|;оргкцвз болоэ і^ргіблї.їіппііоіі к природной, чон ого бпктпра;і;!Ьіі?-!ї аналог. Об Стон cgxgtffL ньстяуют даишо по сраенэита б:;слогіческай акткакосг? очкц.?)шого рококбанактіїого hIL-6 из отанка В. сої і Ііь21 (0S3 ) [pLyeS ] IpET-TG7iTG-llIL-6 J a iryRbTJ'PQKbKSlj ИЭДКОСТИ ЕЇЄ1ШОВ Л. (/Sdnlans AtlIL-2, AHIL-4, MIIL-C. It тесто С єспользобізіііісі! кіШ'ьрле2і:ин-В-завк:сикоа пинги ВО гхбркдшеи ііилк удовиная бксіїйгичоскаа активность болкоо грибного щпзпарзта Сі.ціа сукзствоішо види, че* у роконбмігантного Сопка, кидалпмиого і:л Е.соїі. Возкоиио, что па СиологичесноЗ актквлоста бактеріального препарата с;<азцпаогсн вяішішо неэффективной рспатурацЕЯ при ото Ьчкстко, т. к. по оцопкап, сдшкишик при бжологичоскок тосткропаїгаїг о ПІНИ ОЧС (Сашп—Петербург), доли активного hIL-C о бактеркалыюк препарата но преиишаот ги%.. '

Таїшн образен, ки показали високую Q ІЛоктц'ЕпаїЗїі, транскрі-'пцкв готорологичиого гена и скоіштрухроваїшоіі і:аи« зкспроссхоннсК снстеко и Л./tidirians на dchobq использования промотора и областн гопа, кодирующий дкдерчиіі пвптал (3-Gal P. canescens. СиіпозЕрованшЗ с сокретируемміі 1 данной системой рококбкнаптлян hll.-б ойпаьаг. активность» природного ЫЪ-б и препоскод;!ї по этой ігпрг.іЕТБристїкс гїіоого бактериального аналога. .

1. Из батт кдшс. послвдоиатэльностой, сянтезгровашплх т ро1у(Д) РНК яз стинулкрОвашых моноцитов донорской крЬвя чоловоКа отобран клан, содержащий. КДНК витсрлсйкяпи-З. Опрздслона первичная сгуктура клшс мнторлейняна-О я мроводэн анал« нуклэотядиоЗ нослодопатольпостя.

’ 2. Скопстругроваш плазмида для оиспроссяк в платках. Е. coli

роконбинантных ннторЛвклина-G я ннторлойкина-В чоловпка на основе экспросекониой сястЕми, ясиольэуюцэй ГПК-нолмкоразу бактпрпофага Т7.

3. Получена продукция рокохбинантных антсрлвВкяна-О И интсрлойкнна-В человека и клотка:: Е. coli . Доля рокоибинаптйого hIL-G еостапяла около 5'/., а рокбмбинантного hIL-8 болоо ЗОХ Ьт суммарных банков бактериальном плотин.

4. Создана новая сйстона зксироссяи готерологнчних гонов в клотнах мкцайиаяьного гриба Aspergillus nidulans на основе использования промоторной области н последовательности Гопа р-aal Pcniciliun canescens . кодирующего яядерныЯ пептид, . П этой евствн была иселодована экспрессия rnGpilfliioro гона fi-Gal -hIL-б. Показан высокий ‘уровень трпнскригщМ гона. ОСиаруяопо наличие споцнфическо* для природного hIL-в активности в »ультуралы:о8 яидкостп йтаинов Л. nidtiians(pBC5-hIL-6, trpC+).

-Ю-

IV. СПИСОК 1‘iEGT, ОПУЕЛЖГШШИК ПО ТЕПЛ ДИССЕРТАЦИИ.

1. котошсо C.D., Еулоикои К. Т., Пойко П.П., Спишеи С. М., Jlmjawia

И. К., Енепьикоо А. Б., Козлов А. II. , Конусопи FJ. Г.. Коюв А. И..

Кур&тока Т. к., Ркигнпшков В. л., Сннб.фцея Л. С., Котлянслай С. А.,

В'.лйциил U>. I,. Кион/рорашгь v етруктуpraja епалвз к,ПИК, кодЕрукща*

npoaii-/t>p.te*SKi»H-la и прок иi«фпоЯкин* 1U чеподека. ~ Hoiifcuyu. гопагсна,

нхарпйлопм'чи к рг^усплогмн, 1£Н!Э, v. 1й, с. 13*IV.

"'г. К о to ни о С.!;., liyneiiKOH И. Т., tuiuco в. Н. < Виыэкн С. И., Лсиикш.

, Емедн.кио» Л. В, , Ксйнйс А. Н. , Копусопа 11. Г., Котоз A.U). ,

Ч. И., 1ч>шат1>К!<ов В. И. , Cy.KGi'y»:i<iH А. С., /итимквучи ’ С. А. ,

I>L(iuiiKM4 Ч.И. Клоиизараика и счрукгуи'мк iw.aius яЛН/С, >|Пдм'Уг-“!-‘'

r>i>o«Kieprioiiuvk' i« ji ирОиптеринйкк»- ?p Чслопека. “ ЛАН СССР, ItfcQ, 1.

ЗОЯ. -с. юой-хОоб.

■ 3. Kottnkd i;. V., Epiehin К.Я., Lomakin I j Ki., SicJ>.irtu«v ;\,S.

i<otli nr.ky S.»,, VinatsKi Yu.P. iblemllar tOHA cloning t>£ Uuu-..

(icoinUerleukinc, - Ньмдунпродиан uciil>ep?HU(*;| -Льдицали.-й . - <r ■ ' '

Йаотохиопогйп,' Кйчушш&цзгя * СВйЯ . Тоаиси, лииь .1901 г., Й7-13

Леиимгрлд- Ihburutitibiieil Confcrenc;; on nodical biotechnoioQy

Inw.tiiuBfjfciaii tun) T\Xb3t Junti S?-J.3, Leningrad) UUSR.

*. Loir,akin I.B,# kiufchin S.li., Ikishv.o £J.V,, KeClineliy S.A.

Konusove Viiittcki llolocular cloning and uxpructsion of ti:

hunau intbjfloukin-8 qtinb in KiicJiei-i cliia coli, - Intematicsnr

conference ■ on DC, cauctir fend !«usan rcUroviruBec, t!0V6mber, 1007

C-L.- Tetetburg, p. 35.

5. Zakharova E.S., Alexcnko A.Y., Lcnakin I .B., Hitolftav I.V,

S'fishLn ii . • I <, V'inufcfilci Yu.P. Irahb'kriptioilal expression ot Iiuc;

-ustorlenkiis-'j 5ИЮ in Aspvrgilluz nidulans'. - Internationi

couIoL'iiiicj on AIDS, cancer and hurnan retrovirur.es, llovember, 1SD:

St.- i’etorburgi p. 3G.

G. Ло.ча(;ии Я. G. , Hawo C. S. . Сшташг C.H. , Кот»1».::с:«и С. I.

?n>«ycoBii U. Г. , Hi; НЕЦ^и;: П.П., Лйбгбпс Г. БгосЖсз рзкоибпаагис

м:т ejam ? - ti чояорска n uji^tkhx Frchcrlchi a calx. - ЛАг! Г'оссг

тэг.