Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия протеолитического и АТР-азного центров нативной Lon-протеиназы Escherichia coli и её мутантных форм

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Цирульников, Кирилл Борисович

ВВЕДЕНИЕ

СУБСТРАТЫ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Е. coli (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1. Функции внутриклеточного протеолиза. Протеолитические ферменты.

2. Краткая характеристика Ьоп-протеиназы.

3. Внутриклеточные функции Ьоп-протеиназы

3.1. Участие Ьоп-протеиназы в регуляции ответа на тепловой шок и в деградации аномальных белков.

Деградация о32-фактора.

3.2. Роль Ьоп-протеиназы в регуляции SOS-ответа

Деградация LexА41, SulA, UmuD, UmuC

3.3. Регуляция капсульного синтеза.

Деградация RcsA

3.4. Участие Ьоп-протеиназы в индукции профагов.

Деградация N- и Xis-белков фага лямбда/

3.5. Участие Ьоп-протеиназы в стабилизации плазмид.

Деградация CcdA, RelB, PasA

3.6. Другие мишени Ьоп-протеиназы Е. coli.

Деградация MinC*, транспозазы IS903, StpA, HemA, LuxR

4. Участие шаперонов в функционировании Ьоп-протеиназы.

5. Функции Ьоп-протеиназ эукариот.

6. Субстраты Ьоп-протеиназы in vitro.

7. Принципы узнавания субстратов Ьоп-протеиназой

8. Локализация субстрат-узнающих участков в Ьоп-протеиназе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование взаимодействия протеолитического и АТР-азного центров нативной Lon-протеиназы Escherichia coli и её мутантных форм"

Селективный протеолиз - важнейший механизм поддержания внутриклеточного гомеостаза - осуществляется ААА-протеиназами, относящимися к сообществу ААА-белков (ЛТР-аз, ассоциированных с различными клеточными активностями). Внутриклеточные ААА-протеиназы выполняют две основные функции: (1) регуляция клеточного метаболизма за счет расщепления короткоживущих регуляторных белков, (2) деградация дефектных полипептидов, образующихся в результате ошибок транскрипции или трансляции, химического повреждения, неправильного сворачивания или действия стрессогенных факторов.

АТР-зависимая Lon-протеиназа Escherichia coli - первая обнаруженная ААА-протеиназа - цитоплазматический гомоолигомерный фермент, субъединица которого (784 а.о.) содержит три функциональных домена: N-концевой (функция неизвестна), центральный - АТР-азный и С-концевой - протеолитический. Каталитически активный остаток протеолитического центра - Ser679; однако, наличие в Lon-протеиназе классической триады (Ser, His, Asp) до начала данной работы подвергалось сомнению; было высказано предположение, что в активном центре фермента функционирует каталитическая диада Ser-Lys.

К настоящему времени сформировалась группа АТР-зависимых протеиназ Е. coli (Lon, ClpAP, ClpXP, FtsH и HslUV), обладающая следующими уникальными характеристиками: (1) протеолитическая активность ферментов сопряжена с гидролизом АТР; (2) ферменты обнаруживают высокую селективность при отборе субстратов-мишеней, не проявляя выраженной первичной специфичности при их гидролизе; (3) деградация белковых субстратов происходит по процессивному механизму (без высвобождения высокомолекулярных промежуточных продуктов). Хотя накоплена значительная информация о структуре и функционировании гетероолигомерных АТР-зависимых протеиназ (ClpAP, ClpXP и HslUV), такие данные для гомоолигомерных протеиназ (Lon и FtsH) весьма ограничены.

Актуальные проблемы АТР-зависимого протеолиза - роль гидролиза АТР в протеолизе и механизм сопряжения протеолиза и гидролиза АТР, а также принципы селективного узнавания ферментами субстратов-мишеней остаются пока нерешенными. Одним из перспективных подходов при решении этих проблем является исследование взаимодействия протеолитических и АТР-азных центров нативных и модифицированных ферментов. В представляемой работе такое исследование проведено на примере функционирования ш vitro Lon-протеиназы Е. coli.

Обзор литературы посвящен рассмотрению субстратов Ьоп-протеиназы Escherichia coli и ее внутриклеточных функций. Приведены данные о модельных субстратах, используемых для исследования фермента in vitro. Рассмотрены основные принципы узнавания субстратов Ьоп-протеиназой и локализация субстрат-распознающих участков в ферменте.

СУБСТРАТЫ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Е. coli (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Цирульников, Кирилл Борисович

выводы

1. Для исследования и количественной характеристики эффективности функционирования пептидгидролазных центров АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Е. coli предложен высокочувствительный субстрат - Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl.

2. Нативная Ьоп-протеиназа и ее мутант Lon-K362Q представляют смесь олигомерных и агрегированных форм, на относительное содержание которых влияют наличие и природа нуклеотид-магниевых комплексов. Ионы магния являются фактором агрегации Ьоп-протеиназы.

3. Олигомерная структура фермента не является необходимой для гидролиза Suc-Phe-Leu-Phe-SBzl и мелиттина, но формирует участок узнавания белкового субстрата. В условиях гидролиза АТР нативная Ьоп-протеиназа функционирует как тетрамер, а мутант Lon-K362Q функционирует как мономер, то есть представляет модель активной субъединицы Ьоп-протеиназы.

4. Нуклеотид-магниевые комплексы, свободные нуклеотиды и ионы магния оказывают регуляторное действие на активность Ьоп-протеиназы. АТР проявляет свойства модифицируемого аллостерического эффектора пептидгидролазных центров нативного фермента.

5. Пептидгидролазный центр мутанта Lon-K362Q активируется связыванием как ATP-Mg, так и ADP-Mg. Комплементацией мутаций (Lon-K362Q и Lon-S679A) подтверждено наличие в нативной Ьоп-протеиназе двух путей передачи сигнала от АТР-азных центров к протеолитическим (внутрисубъединичного и межсубъединичного).

6. Установлено, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза являются процесс гидролиза АТР и олигомерность нативной Ьоп-протеиназы. Выявлен комплекс межцентровых взаимодействий, регулирующих функционирование фермента.

7. Функционирование каталитической диады Ser679-Lys722 в активном центре Ьоп-протеиназы доказано с помощью сайт-направленного мутагенеза

9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ьоп-протеиназа Escherichia coli принимает участие в деградации аномальных полипептидов и специфических белков, участвующих в регуляции генной экспрессии. Тем не менее, фермент не является ключевым при нормальных условиях роста клеток, его критическая роль проявляется лишь в экстремальных условиях. В этих условиях регуляторная функция Lon-протеиназы обеспечивает жизнеспособность клетки и способствует ее возвращению в нормальное состояние. В ряде случае Ьоп-протеиназа функционирует кооперативно с системой шаперонов Hsp70, однако в некоторых ситуациях и сама выступает в качестве шаперона, участвуя, например, в сборке белковых комплексов.

Энергозависимость протеолиза, необходимая, по-видимому, для обеспечения селективного отбора субстратов и их процессивной деградации, сопряжена с олигомерным строением АТР-зависимых протеолитических ферментов. В этом плане исследование четвертичной структуры Ьоп-протеиназы в различных условиях, реализующихся при ее функционировании, безусловно, позволит приблизиться к пониманию молекулярных основ структурно-функциональной организации внутриклеточных протеолитических комплексов, не входящих в какие-либо компартменты. Необходимым этапом изучения механизма сопряжения протеолиза с гидролизом АТР является установление функциональной роли олигомерной структуры фермента.

Важным этапом изучения Ьоп-протеиназы является характеристика протеолитических центров и их взаимодействий с АТР-азными центрами. Изучение активности Ьоп-протеиназы in vitro с использованием стандартных белковых и олигопептидных, а также низкомолекулярных флюорогенных субстратов затруднено, главным образом, ввиду сложности метода детектирования. Для решения поставленной задачи необходимо использовать высокочувствительный субстрат.

Одной из ключевых задач исследования является установление природы каталитических групп протеолитического центра Ьоп-протеиназы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Цирульников, Кирилл Борисович, Москва

1. Gottesman S., Maurizi M.R. (1992). Regulation by proteolysis: energy-dependent proteases and their targets. Microbiol. Rev. 56, 592-621.

2. Gottesman S. (1996). Proteases and their targets in Escherichia coli. Anmt. Rev. Genet. 30, 465-506.

3. Maurizi M.R. (1992). Proteases and protein degradation in Escherichia coli. Experiential, 178-201.

4. Gottesman S. (1989). Genetics of proteolysis in Escherichia coli. Annu. Rev. Genet. 23, 163-198.

5. Lupas A., Flanagan J.M., Tamura T. (1997). Self-compartmentalizing proteases. Trends Biochem. Sei. 22, 399-404.

6. Gottesman S., Roche E., Zhou Y., Sauer R.T. (1998). The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev. 12, 1338-1347.

7. Baumeister W., Walz J., Zuhl F., Seemuller E. (1998). The proteasome: paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell 92, 367-380.

8. Ebel W., Skinner M.M., Dierksen K.P., Scott J.M., Trempy J.E. (1999). A conserved domain in Escherichia coli Lon protease is involved in substrate discriminator activity. J. Bacteriol. 181,2236-2243.

9. Roudiak S.G., Shrader Т.Е. (1998). Functional role of the N-terminal region of the Lon protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry 37, 11255-11263.

10. Saraste M., Sibbald P.R., Wittinghofer A. (1990). The P-loop a common motif in ATP- and GTP-binding proteins. Trends Biochem. Sei. 15, 430-434

11. Yoshida M., Amano T. (1995). A common topology of proteins catalyzing ATP-triggered reactions. FEBSLett. 359, 1-5.

12. Amerik A.Yu., Antonov V.K., Gorbalenya A.E., Kotova S.A., Rotanova T.V., Shimbarevich E.V. (1991). Site-directed mutagenesis of La protease. A catalytically active serine residue. FEBS Lett. 287, 211-214.

13. Fischer H., Glockshuber R. (1993). ATP hydrolysis is not stoichiometrically linked with proteolysis in the ATP-dependent protease La from E. coli. J. Biol. Chem. 268, 22502-22507.

14. Birghan C., Mündt E., Gorbalenya A.E. (2000). A non-canonical Lon proteinase lacking ATPase domain employs the Ser-Lys catalytic dyad to exercise broad controlover the life cycle of a double-stranded RNA virus. EMBO J. 19, 114-123.

15. Paetzel M., Dalbey R.E. (1997). Catalytic hydroxyl/amine dyads within serine proteases. Trends Biochem. Sei. 22, 28-31.

16. Grossman A.D., Erickson J.W., Gross C.A. (1984). The htpR gene product of Escherichia coli is a sigma factor for heat shock promoters. Cell 38, 383-390.

17. Kanemori M., Yanagi H., Yura T. (1999). Marked instability of the a32 heat shock transcription factor at high temperature. J. Biol. Chem. 274, 22002-22007.

18. Baker T.A., Grossman A.D., Gross C.A. (1984). A gene regulating the heat shock response in Escherichia coli also affects proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6779-6783.

19. Goff S.A., Casson L.P., Goldberg A.L. (1984J. Heat shock regulatory gene htpR influences rates of protein degradation and expression of the Ion gene in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81, 6647-6651.

20. Chung C.H., Goldberg A.L. (1981). The product of the Ion (capR) gene in Escherichia coli is the ATP-dependent protease, protease La. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 4931-4935.

21. Phillips T.A., Van Bogelen R.A., Neidhardt F.C. (1984). Ion gene product of Escherichia coli is a heat-shock protein. J. Bacteriol. 159, 283-287.

22. Chin D.T., Goff S.A., Webster T„ Smith T„ Goldberg A.L. (1988) Sequence of the Ion gene in E. coli, a heat-shock gene which encodes the ATP-dependent protease La. J. Biol. Chem. 263, 11718-11728.

23. Goff S.A., Goldberg A.L. (1985). Production of abnormal proteins in Escherichia coli stimulates transcription of Ion and other heat shock genes. Cell 41, 587-595.

24. Kanemori M., Nishihara K., Yanagi H., Yura T. (1997). Synergistic roles of HslUV and other ATP-dependent proteases in controlling in vivo turnover of c and abnormal proteins in Escherichia coli. J. Bacteriol. 179, 7219-7225.

25. Tatsuta T., Joo D.M., Calendar R., Akiyama Y., Ogura T. (2000). Evidence for an active role of the DnaK chaperone system in the degradation of o . FEBS Lett. 478, 271-275.

26. Liu J., Cosby W.M., Zuber P. (1999). Role of Lon and ClpX in the post-translational regulation of a sigma subunit of RNA polymerase required for cellular differentiationin Bacillus subtillis. Mol. Microbiol. 33, 415-428.

27. Gottesman S., Zipser D. (1978). Deg phenotype of Escherichia coli Ion mutants. J. Bacteriol. 133, 844-851.

28. Peterson K.R., Mount D.W. (1987). Differential repression of SOS genes by unstable LexA41 (Tsl-1) protein causes a "split-phenotype" in Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 193,27-40.

29. Schoemaker J.M., Gayda R.C., Markovitz A. (1984). Regulation of cell division in Escherichia coli: SOS induction and cellular location of the SulA protein, a key to Ion-associated filamentation and death. J. Bacteriol. 158, 551-561.

30. Mizusawa S., Gottesman S. (1983). Protein degradation in Escherichia coli: the Ion gene controls the stability of SulA protein. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 358-362.

31. Canceill D., Dervyn E., Huisman O. (1990). Proteolysis and modulation of the activity of the cell division inhibitor SulA in Escherichia coli Ion mutants. J. Bacteriol. 172,7297-7300.

32. Lutkenhaus J., Sanjanwala B., Lowe, M. (1986). Overproduction of FtsZ suppresses sensitivity of Ion mutants to division inhibition. J. Bacteriol. 166, 756-762.

33. Bi E., Lutkenhaus J. (1990). Analysis of ftsZ mutation that confer resistance to the cell division inhibitor SulA. J. Bacteriol. 172, 5602-5609.

34. Sonezaki S., Ishii Y., Okita K., Sugino T., Kondo A., Kato Y. (1995). Overproduction and purification of SulA fusion protein in Escherichia coli and its degradation by Lon protease in vitro. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 304-309.

35. Frank E.G., Ennis D.G., Gonzalez M., Levine A.S., Woodgate R. (1996). Regulation of SOS mutagenesis by proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 10291-10296.

36. Gonzalez M., Frank E.G., Levine A.S., Woodgate R. (1998). Lon-mediated proteolysis of the Escherichia coli UmuD mutagenesis protein: in vitro degradation and identification of residues required for proteolysis. Genes Dev. 12, 3889-3899.

37. Gonzalez M., Frank E.G., McDonald J.P., Levine A.S., Woodgate R. (1998). Structural insights into the regulation of SOS mutagenesis. Acta Biochim. Pol. 45, 163-172.

38. Gonzalez M., Rasulova F., Maurizi M.R., Woodgate R. (2000). Subunit-specific degradation of the UmuD/D' heterodimer by the ClpXP protease: the role of trans recognition in UmuD' stability. EMBO J. 19, 5251-5258.

39. Tang M., Shen X., Frank E.G., O'Donnell M., Woodgate R., Goodman M.F. (1999). UmuD2'C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli polV. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 8919-8924.

40. Trisler P., Gottesman S. (1984). Ion transcriptional regulation of genes necessary for capsular polysaccharide synthesis in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 160, 184191.

41. Torres-Cabassa A.S., Gottesman S. (1987). Capsule synthesis in Escherichia coli K-12 is regulated by proteolysis. J. Bacteriol. 169, 981-989.

42. Gottesman S., Stout V. (1991). Regulation of capsular polysaccharide synthesis in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 5, 1599-1601.

43. Stout V., Torres-Cabassa A.S., Maurizi M.R., Gutnick D., Gottesman S. (1991). RcsA, an unstable positive regulator of capsular polysaccharide synthesis. J. Bacteriol. 173, 1738-1747.

44. Dierksen K.P., Marks J., Chen D.D., Trempy J.E. (1994). Evidence for structural conservation of Lon and RcsA. J. Bacteriol. 176, 5126-5130.

45. Zuber M., Hoover T.A., Curt D.L. (1995). Analysis of Coxiella birnetti gene product that activates capsule synthesis in Escherichia coli: requirement for the heat shock chaperone DnaK and two-component regulator RcsC. J. Bacteriol. 177, 4238-4244.

46. Virlogeux I., Waxin H., Ecobichon C., Lee J.O., Popoff M.Y. (1996). Characterization of the rcsA and rcsB genes from Salmonella typhi: rcsB through tviA is involved in regulation of Vi antigen synthesis. J. Bacteriol. 178, 1691-1698.

47. Summers M.L., Botero L.M., Busse S.C., McDermott T.R. (2000). The ++Sinorhizobium melioti lon protease is involved in regulating exopolysaccharide synthesis and is required for nodulation of alfalfa. J. Bacteriol. 182, 2551-2558.

48. Gottesman, S., Gottesman M., Shaw J.E., Pearson M.L. (1981). Protein degradation in Escherichia coli: the lon mutation and bacteriophage lambda N and ell protein stability. Cell 24, 225-233.

49. Maurizi M.R. (1987). Degradation in vitro of bacteriophage X N protein by Lon protease from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 262, 2696-2703.

50. Leffers G.G.Jr., Gottesman S. (1998). Lambda Xis degradation in vivo by Lon and FtsH. J. Bacteriol. 180, 1573-1577.

51. Lamrani S., Ranquet C., Gama M.J., Nakai H., Shapiro J.A., Toussaint A., Maenhaut-Michel, G. (1999). Starvation-induced Mucts62-mediated coding sequence fusion: a role for ClpXP, Lon, RpoS and Crp. Mol. Microbiol. 32, 327-343.

52. Van Melderen L., Bernard P., Couturier M. (1994). Lon-dependent proteolysis of CcdA is the key control for activation of CcdB in plasmid-free segregant bacteria. Mol. Microbiol. 11, 1151-1157.

53. Van Melderen L.,Thi M.H.D., Lecchi P., Gottesman S., Couturier M., Maurizi M.R.1996). ATP-dependent degradation of CcdA by Lon protease. J. Biol. Chem. 271, 27730-27738.

54. Gronlund H., Gerdes K. (1999). Toxin-antitoxin systems homologues with relBE of Escherichia coli plasmid P307 are ubiquitous in prokaryotes. J. Mol. Biol. 285, 14011415.

55. Smith A.S.G., Rawlings D.E. (1998). Efficiency of the pTF-FC2 pas poison-antidote stability system in Escherichia coli is affected by the host strain, and antidote degradation requires the Lon protease. J. Bacteriol. 180, 5458-5462.

56. Sen M., Rothfield L.I. (1998). Stability of the Escherichia coli division inhibitor protein MinC requires determinants in the carboxy-terminal region of the protein. J. Bacteriol. 180, 175-177.

57. Derbyshire K.M., Kramer M., Grindley N.D.F. (1990). Role of instability in the cis action of the insertion sequence IS903 transposase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4048-4052.

58. Johansson J., Uhlin B.E. (1999). Differential protease-mediated turnover of H-NS and StpA revealed by a mutation altering protein stability and stationary-phase survival of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 10776-10781.

59. Zhang A., Rimsky S., Reaban M.E., Buc H., Belfort M. (1996). Escherichia coli protein analogs StpA and H-NS: regulatory loops, similar and disparate effects on nucleic acid dynamics. EMBO J. 15, 1340-1349.

60. Wang L., Elliott M., Elliott T. (1999). Conditional stability of the HemA protein (glutamyl-tRNA reductase) regulates heme biosynthesis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 184, 1211-1219.

61. Wang L., Wilson S., Elliott T. (1999). A mutant HemA protein with positive charge close to the N terminus is stabilized against heme-regulated proteolysis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 181, 6033-6041.

62. Завильгельский Г.Б., Манухов И.В., Расторгуев С.М. (1996). Lux-регулон Vibrio fischeri ослабляет рестрикцию 1-го типа в клетках Escherichia coli К-12. Генетика 32, 1148-1152.

63. England Е.А., Greenberg Е.Р. (1999). Quorum sensing in Vibrio fischeri: elements ofthe luxl promoter. Mol. Microbiol. 31, 1197-1204.

64. Ulitzur S. (1998). H-NS controls the transcription of three promoters of Vibrio fischeri lux cloned in Escherichia coli. J. Biolumin. Chemilumin. 13, 185-188.

65. Sherman M.Y., Goldberg A.L. (1992). Involvement of the chaperonin dnaK in the rapid degradation of a mutant protein in Escherichia coli. EMBO J. 11, 71-72.

66. Jubete Y., Maurizi M.R., Gottesman S. (1996). Role of the heat shock protein DnaJ in the Lon-dependent degradation of naturally unstable proteins. J. Biol. Chem. 271, 30798-30803.

67. Huang H., Sherman M.Y., Kandror O., Goldberg A.L. (2001). The molecular chaperone DnaJ is required for the degradation of a soluble abnormal protein in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 276, 3920-3928.

68. Wickner S., Gottesman S., Skowyra D., Hoskins J. (1994). A molecular chaperone, ClpA, functions like DnaK and DnaJ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 12218-12222.

69. Weber-Ban E.U., Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. (1999). Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. Nature 401, 90-93.

70. Van Melderen L., Gottesman S. (1999). Substrate sequestration by a proteolytically inactive Lon mutant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6064-6071.

71. Van Dijl J.M., Kutejova E., Suda K., Perecko D., Schatz G., Suzuki C.K. (1998). The ATPase and protease domains of yeast mitochondrial Lon: roles in proteolysis and respiration-dependent growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10584-10589.

72. Teichmann U., van Dyck L., Guiard B., Fischer H., Glockshuber R., Neupert W., Langer T. (1996). Substitution of PimI protease in mitochondria by Escherichia coli Lon protease. J. Biol. Chem. 271, 10137-10142.

73. Luciakova K., Sokolikova B., Chloupkova M., Nelson B.D. (1999). Enhanced mitochondrial biogenesis is associated with increased expression of the mitochondrial ATP-dependent Lon protease. FEBS Lett. 444, 186-188.

74. Van Dyck L., Neupert W., Langer T. (1998). The ATP-dependent PimI protease isrequired for the expression of intron-containing genes in mitochondria. Genes Dev. 12,1515-1524.

75. Suzuki C.K., Rep M„ van Dijl J.M., Suda K., Grivell L.A., Schatz G. (1997). ATP-dependent proteases that also chaperone protein biogenesis. Trends Biochem. Sei. 22, 118-123.

76. Rep M„ van Dij J.M., Suda K„ Schatz G„ Grivell L.A, Suzuki C.K. (1996). Promotion of mitochondrial membrane complex assembly by a proteolytically inactive yeast Lon. Science 274, 103-106.

77. Stahlberg H., Kutejova E., Suda K., Wolpensinger В., Lustig A., Schatz G., Engel A., Suzuki C.K. (1999). Mitochondrial Lon of Saccharomyces cerevisiae is a ring-shaped protease with seven flexible subunits. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 67876790.

78. Swamy K.S., Goldberg A.L. (1981). E. coli contains eight soluble proteolytic activities, one being ATP-dependent. Nature 292, 652-654.

79. Waxman L., Goldberg A.L. (1982). Protease La from Escherichia coli hydrolyzes ATP and proteins in a linked fashion. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 4883-4887.

80. Ротанова T.B., Котова C.A., Америк А.Ю., Лыков И.П., Гинодман Л.М., Антонов В.К. (1994). АТР-зависимая протеиназа La из Е. coli. Биоорг. Химия 20, 114-125.

81. Расулова Ф.С. Структурно-функциональное исследование АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук, Ин-т биоорган, химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, М„ 1998.

82. Waxman L., Goldberg A.L. (1985). Protease La, the lon gene product, cleaves specific fluorogenic peptides in an ATP-dependent reaction. J. Biol. Chem. 260, 12022-12028.

83. Fu G.K., Smith M.J., Markovitz D.M. (1997). Bacterial protease Lon is a site-specific DNA-binding protein. J. Biol. Chem. 272, 534-538.

84. Fu G.K., Markovitz D.M. (1998). The human Lon protease binds to mitochondrial promoters in a single-stranded, site-specific, strand-specific manner. Biochemistry 37, 1905-1909.

85. Smith C.K., Baker T.A., Sauer R.T. (1999). Lon and Clp family proteases and chaperones share homologous substrate-recognition domains. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 6678-6682.

86. Freudl R., Braun G., Honore N., Cole S.T. (1987). Evolution of the enterobacterialsulA gene: a component of the SOS system encoding an inhibitor of cell division. Gene 52,31-40.

87. Higashitani A., Ishii Y., Kato Y., Korinchi K. (1997). Functional dissection of a celldivision inhibitor, SulA, of Escherichia coli and its negative regulation by Lon. Mol. Gen. Genet. 254,351-357.

88. Ishii Y., Sonezaki S., Iwasaki Y., Miyata Y., Akita K., Kato Y., Amano F. (2000). Regulatory role of C-terminal residues of SulA in its degradation by Lon protease in Escherichia coli. J. Biochem. 127, 837-844.

89. Rudyak S.G., Shrader Т.Е. (2000). Polypeptide stimulators of the Ms-Lon protease. Protein Sci. 9, 1810-1817.

90. Dao-Thi M.H., Messens J., Wyns I., Backmann J. (2000). The thermodynamic stability of the proteins of the ccd plasmid addiction system. J. Mol. Biol. 299, 13731386.

91. Seong I.S., Oh J.Y., Yoo S.J., Seol J.H., Chung C.H. (1999). ATP-dependent degradation of SulA, a cell division inhibitor, by the HslVU protease in Escherichia coli. FEBS Lett. 456, 211-214.

92. Wu W.F., Zhou Y., Gottesman S. (1999). Redundant in vivo proteolytic activities of Escherichia coli Lon and the ClpYQ (HslUV) protease. J. Bacteriol. 181, 3681-3687.

93. Roudiak S.G., Seth A., Knipfer N., Shrader Т.Е. (1998). The Lon protease from Mycobacterium smegmatis: molecular cloning, sequence analysis, functional expression, and ensymatic characterization. Biochemistry 37, 377-386.

94. Robertson G.T., Kovach M.E., Allen C.A., Ficht T.A., Roop R.M. 2nd. (2000). The Brucella abortus Lon functions as a generalized stress response protease and is required for wild-type virulence in BALB/c mice. Mol. Microbiol. 35, 577-588.

95. Darvyn E., Canceill D., Huisman O. (1990). Saturation and specificity of the Lon protease of Escherichia coli. J. Bacteriol. 172, 7098-7103.

96. Hilliard J. J., Maurizi M.R., Simon L.D. (1998). Isolation and characterization of the phage T4 PinA protein, an inhibitor of the ATP-dependent Lon protease of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 273, 518-523.

97. Hilliard J.J., Simon L.D., van Melderen L., Maurizi M.R. (1998). PinA inhibits ATP hydrolysis and energy dependent protein degradation by Lon protease. J. Biol. Chem. 273, 524-527.

98. Мельников Э.Э., Цирульников К.Б., Ротанова Т.В. (2000). Сопряжение протеолиза и гидролиза АТР при функционировании Lon-протеиназы Escherichia coli. I. Кинетические аспекты гидролиза АТР. Биоорг. Химия 26,530.538.

99. ЮЗ.Ротанова Т.В. (2001). Энергозависимый селективный внутриклеточный протеолиз. Вопросы Мед. Химии. 47, 1-19.

100. Мельников Э.Э., Цирульников К.Б., Гинодман JI.M., Ротанова Т.В. (1998). Сопряжение гидролиза АТР и протеолиза при функционировании in vitro мутантных по АТР-азному центру форм Ьоп-протеиназы Е. coli. Биоорг. Химия 24, 293-299

101. Mirgorodskaya О.А., Kazanina G.A., Mirgorodskaya Е.Р., Vorotyntseva T.I., Zamolodchikova T.S., Alexandrov S.L. (1996). A comparative study of specificity of melittin hydrolysis by duodenase, trypsin, and plasmin. Prot. Pept. Lett. 3, 315-320.

102. Юб.Дарбре А. Практическая химия белка. M., Мир, 1989.

103. Антонов B.K. Химия протеолиза. M., Наука, 1991.

104. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М., Наука, 1977.

105. Waxman L, Goldberg AL. (1986). Selectivity of intracellular proteolysis: protein substrates activate the ATP-dependent protease (La). Science 232, 500-503.

106. Ш.Ротанова Т.В. (1999). Структурно-функциональные особенности АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорг. Хим., 25, 883-891.

107. Maurizi М. (1999). Here's the hook: similar binding sites in the chaperone domains of Clp and Lon. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 8318-8320.

108. Боуэн Т. Введение в ультрацентрифугирование. М., Мир, 1973.

109. Halsall Н.В. (1967). Atassi-Gandhi sedimentation coefficient and molecular weight relationships. Nature 215, 880-881.

110. Hesterberg L.K., Lee J.C. (1985). Measurement of hydrodynamic properties of active enzyme by sedimentation. Meth. Enzymol. 117, 97-115.

111. Мельников Э.Э. Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы Е. coli и ее мутантных форм. Диссертация на соискание ученой степени канд. биол. наук, Ин-т биоорган, химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, М., 1999.

112. Dayhoff M.O. Atlas of Protein Sequence and Structure. Washington DC: Natl. Biom. Res. Foundation, 1972.

113. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., Pease L.R. (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77, 6168.

114. Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

115. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 221, 680-685.

116. Bencini D.A., Wild J.R., O'Donovan G.A. (1983). Linear one-step assay for the determination of ortophosphate. Anal Biochem. 132,254-258.

117. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, NY, 1989.

118. РОС С Vi V> CK A S» roCYßÄ^-esHK-^a4s/híoís¡>£I— ^ —