Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli

Андрианова, Анна Говардовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli"

ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков М М ШЕМЯКИНА и Ю А ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

АНДРИАНОВА Анна Говардоена

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ИЗОЛИРОВАННЫХ ДОМЕНОВ АТР-ЗАВИСИМОЙ Lon-ПРОТЕИНАЗЫ Escherichia coli

03 00 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - I

003170003

Работа выполнена в лаборатории химии протеочитических ферментов Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель:

доктор химических наук Ротанова Татьяна Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Филиппова Ирина Юрьевна

доктор биологических наук,

профессор Соловьева Нина Ивановна

Ведущая организация

Институт биохимии им АН Баха РАН

Защита состоится «21» мая 2008 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и ЮА Овчинникова РАН по адресу 117997 ГСП-7, Москва В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан «18» апреля 2008 г

Ученый секретарь -

специализированного совета -----

доктор физико-математических наук В А Олейников

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Основная роль в обеспечении качества и поддержании баланса клеточного белка принадлежит АТР-зависимым протеиназам и мультиферментным комплексам (протеасомам) -представителям сообщества ААА+-белков (/1ТР-аз с альтернативными активностями), широко представленного в клетках различных организмов бактерий, архей и эукариот Деградации ААА+-протеиназами подвергаются короткоживущие регуляторные белки, дефектные пошпептиды, образовавшиеся в результате ошибок биосинтеза, а также белки, лишенные "партнеров" - отдельные субъединицы олигомерных комплексов, образующиеся вследствие недостаточного или избыточного биосинтеза

В отличие от "классических" протеолитических ферментов ААА+-протеиназы проявляют высокую селективность по отношению к своим белковым мишеням, не обладая при этом выраженной первичной специфичностью Гидролиз белков-субстратов, сопряженный с гидролизом АТР, осуществляется по процессивному механизму, без высвобождения высокомолекулярных продуктов Все ААА+-протеиназы имеют мультисубъединичную организацию Принципиальные проблемы энергозависимой деградации белков - высокая селективность ферментов и механизм сопряжения гидролиза АТР и процессивного протеолиза - до последнего времени во многом остаются нерешенными

Объектом исследования в настоящей работе является Lon-протеиназа Escherichia coli - исторически первая обнаруженная АТР-зависимая протеиназа Ферменты семейства Lon представлены двумя подсемействами (А и В) и относятся к редким представителям ААА+-белков, АТР-азный и функциональный компоненты которых локализованы в единой полипептидной цепи Lon-протеиназа Е coli (далее - Lon) служит типичным представителем подсемейства LonA Данные о пространственных структурах полноразмерных Lon-протеиназ отсутствуют Актуальным остается изучение струкгурно-функциональных взаимодействий между различными доменами в сложноустроенных олигомерах ферментов семейства Lon, а также выяснение вклада отдельных доменов в образование четвертичной структуры функционально активного фермента

Цель и задачи исследования Цель работы состояла в детализации доменной организации АТР-зависимой Lon-протеиназы Е coli с помощью ограниченного протеолиза и в структурно-функциональном исследовании изолированных доменов фермента и их комбинаций При этом решались следующие задачи (1) изучение условий проведения ограниченного протеолиза полноразмерной Lon-протеиназы, (2) разработка методик препаративного разделения стабильных фрагментов фермента, (3) характеристика энзиматических свойств и олигомерного состояния изолированных фрагментов, (4) использование полученных фрагментов Lon-протеиназы для определения их пространственной структуры

Научная новизна и практическая значимость работы Методом ограниченного протеолиза химотрипсином детализировано доменное строение субъединицы Ьоп-протеиназы Показано, что характер химотрипсинолиза зависит от наличия эффекторов (нуклеотидов и ионов магния) в отсутствие эффекторов продуктами ограниченного протеолиза являются N-концевой фрагмент фермента и два домена - протеолитический (Р) и а-спирализованный (а, представляющий С-концевую часть АТР-азного (А) домена), наличие нуклеотида способствует стабилизации А-домена, а нуклеотид-магниевые комплексы стабилизируют AP-фрагмент Ьоп-протеиназы Оптимизированы условия проведения ограниченного протеолиза и разработаны эффективные методики препаративного разделения и очистки химотриптических фрагментов Ьоп-протеиназы

В совместной работе с лабораторией кристаллографии макромолекул Национального института рака (США) впервые установлены приирашл венные структуры а- и Р-доменов Ьоп-протеиназы Обнаружено, что a-домен обладает характерной для а-доменов ААА+-белков топологией, в то время как Р-домен имеет уникальную пространственную укладку Выявлена высокая степень подобия активных центров Р-домена Ьоп-протеиназы Е coli и ряда серин-лизиновых пептидгидролаз

Охарактеризованы олигомерное состояние и энзиматические свойства полученных фрагментов Ьоп-протеиназы Выявлено взаимовлияние функциональных доменов Способность к формированию четвертичной структуры обнаружена только у AP-фрагмента, представленного в растворе тетрамерной формой В противоположность мономерным неактивным составляющим (А и Р) AP-фрагмент проявляет и АТР-азную и протеолитическую активности, однако в отличие от интактного фермента функционирует как непроцессивная протеиназа

Выявлен ключевой вклад некаталитического N-концевого фрагмента Ьоп-протеиназы, включающего coiled-coil область, в формирование четвертичной структуры полноразмерного фермента, способного к процессивному протеолизу Выдвинуто предположение о необходимости прямого структурного контакта протеолитического и АТР-азного доменов для олигомеризации фермента Постулировано, что непроцессивная протеолитическая активность нативной Ьоп-протеиназы реализуется формами фермента с пониженной степенью олигомеризации, не содержащими связанных нуклеотидов

Полученные в рамках настоящей работы результаты способствуют расширению представлений о структуре и особенностях функционирования Ьоп-протеиназы и могут быть использованы при дальнейшем исследовании ферментов семейства Ьоп и других АТР-зависимых протеиназ

Апробация работы Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах XIV и XVIII зимние международные молодежные научные школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2002, 2006), V и VI симпозиумы "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 2002, 2007), XXI Европейская

конференция по кристаллографии (Дурбан, 2003), III конгресс Международного общества по исследованию протеолиза (Нагойя, 2003), Международная конференция "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов" (Петрозаводск, 2004), VII Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова (Москва, 2004), VII Международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (Суздаль, 2004), V - VII Международные конференции по ААА-белкам (Варрентон, 2003, Сеггау, 2005, Селенчестер, 2007), VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва - Пущино, 2006), III Российский симпозиум "Белки и пептиды" (Пущино, 2007)

По материалам диссертации опубликовано 18 работ

Объем и структура работы Диссертация изложена на/^Атраницах печатного текста, содержит££рисунков и //таблиц, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 'Наименований

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ьоп-протеиназа Е coli - цитозольный гомоолигомерный фермент Анализ литературных данных с учетом результатов по фрагментации Lon, полученных в настоящей работе, показывает, что обобщенное строение субъединицы фермента (784 аминокислотных остатка, а о) может быть представлено последовательно соединенными N-концевым, АТР-азным (А) и протеолитическим (Р) доменами (рис 1А-Б) А-домен фермента включает характерные для ААА+-белков ААА+-модуль, состоящий из нуклеотид-связывающего (a/ß-) и a-спирализованного доменов, и так называемый, экстрадомен (ED), который, как полагают, может участвовать во взаимодействии с белковыми субстратами А- и Р-домены содержат набор консенсусных для Ьоп-протеиназ фрагментов - типичные для ААА+-белков мотивы Уолкера А и В (G356-T363 и L4I9-E424), остатки "sensor-1" (N473), "Arg finger" (R484) и "sensor-2" (R342), а также каталитические остатки протеолитического центра S679 и К722, локализованные в консервативных фрагментах последовательности (K675-G681 и K720-L724) (рис 1А и 2) При анализе вторичной структуры Ьоп-протеиназы выявлен фрагмент, представляющий структуру "coiled-coil" (а о ~180-280, условно - СС-домен, рис 1А и 2) Вопрос о том, является ли высокоспирализованный СС-домен частью N-домена фермента или представляет линкерную область между N- и А-доменами остается открытым

Мотивы Уолкера

N + P + a

207

N + P + A

N +АР

«Да

В П

■к -<С«»

45— « 35— m

25—Ч<*

18-Ш

14—щк.

491 584

V Р-домен J

123456789

Рис. 1. Обобщенное строение субъединицы Lon-протеиназы Е. coli (А), химотриптические фрагменты фермента (Б) и влияние эффекторов на фрагментацию Lon-протеиназы (здесь и далее 12% ПААГ в присутствии SDS) (В). Показана локализация консервативных для Lon-протеиназ мотивов (см. текст) и каталитически активных остатков Ser679 и Lys722. Nu - нуклеотид (ATP, ADP, AMPPNP). Условия химотрипсинолиза: рН 8.0, 0.3 M NaC!, 30 °С, 2ч;/- исходный препарат Lon-протеиназы, эффекторы'. 2 - отсутствуют, 3 - Mg2+, 4 - ATP, 5 - ADP. 6 - AMPPNP, 7- ATP + Mg24", 8 - ADP + Mg2+, 9 - AMPPNP + Mg2+. Концентрации: Lon - 10 мкМ, химотрипсин -0.2 мкМ, нуклеотиды - 5 мМ, MgCfe - 20 мМ.

mnperserieipvlplrdvwyphmviplfvgreksircleaamdhdkkimlvaqkeast 60

depgvndlftvgtvasilqmlklpdgtvkvlveglqrarisalsdngehfsakaeylesp 120

QSVLEMSDVNERLEYLMAMMESEipLLQV

¡KRIRNRVKKQMEKSQREYYLNE

lgemddapdenealkrkidaakmpkeakekaeaelqklkmmspmsaeatwrgyidwmvq

vpwnarskvkkdlrqaqeildtdhyglervkdrileylavqsrvnkikgpxlclvgppgv gktslgqsiakatgrkyvrmalggvrdeaeirghrrtyigsmpgkliqkmakvgvknplf

lldeidkmssdmrgdpasallevldpeqnvafsdhylevdydlsdvmfvatsnsmnipap

LLD

VRGLEREISKLCRKAVKQLLLDKSLKHIEINGD1ILHDYLGV IV 2RFDYGRAD ÍENRVGQVTG

t 1-

360 420

480

rredeklniakrhllpkqiermalkkgeltvddsaiigiiryytreag 540

600

660 720 780 784

lawtevggdlltietacvpgkgkltytgslgevmqesiqaaltvvraraeklginpdfye krdihvhvpegatpkdgpsagiamctalvscltgnpvradvamtgeitlrgqvlpigglk ekllaahrggiktvlipfehkrdleeipdnviadldihpvkrieevltlalqnepsgmqv vtak

Рис. 2 Первичная и вторичная структура Lon-протеиназы Е coli

Элементы вторичной структуры приведены согласно данным рентгеноструктурного анализа (подчеркнутые фрагменты) или предсказаны теоретически (http //distill ucd ie/porter) Красным цветом показаны аминокислотные остатки, участвующие в образовании а-спиралей, роювым - Зю-спирали, чшим - ß-тяжей, черным - неструктурированных регионов Предполагаемый СС-домен выделен желтым Показаны сайты ограниченного протеолиза синие стрелки соответствуют действию химотрипсина (настоящая работа), красные - трипсина (Patterson et al, 2004), зеленые - глугамилэндопептидазы (Vasilyeva et al, 2002) Черные стрелки показывают сайты автолиза Lon-протеиназы, а серые - АР-фрагмента в отсутствие эффекторов, розовая стрелка - сайт автолиза AP-фрагмента в присутствии ATP-Mg

1. Ограниченный протеолиз Ьоп-протеиназы и выделение фрагментов фермента

В целях получения Ьоп-протеиназы в достаточных количествах в работе был использован продуцент, построенный на основе /о/7-дефицитного штамма Е coli BL21 и рекомбинантного плазмидного вектора pBR327/ow, несущего полноразмерный ген Ion с собственными регуляторными элементами Схема выделения фермента включает этапы наработки биомассы и получения бесклеточного экстракта, а также ряд последовательных хроматографических стадий с использованием фосфоцеллюлозы, Q-сефарозы, гепарин-сефарозы и

сефакрила Б-ЗОО Выход фермента составил около 5 мг/г клеток, чистота препарата не менее 90% (по данным гель-электрофореза)

Ограниченный протеолиз химотрипснном проводили в отсутствие и при наличии эффекторов Ьоп-протеиназы (нуклеотидов и ионов магния) Показано, что в отсутствие эффекторов продуктами реакции являются М-концевой фрагмент, включающий часть СС-домена (условно именуемый далее Ы-доменом), а также Р- и а-домены фермента (рис 1Б и В, дорожка 2) Ионы магния не оказывают влияния на характер ограниченного протеолиза (рис 1В, 5) Связывание нуклеотидов с Ьоп-протеиназой приводит к стабилизации центральной АТР-азной части субъединицы фермента и появлению А-фрагмента (далее - АТР-азный или А-домен) среди продуктов реакции (рис 1Б и В, 4-6) Влияние ас куклсстид ;.:аг::::е2ых комплексов выраж?ется в образовании АР-фрагмента, включающего АТР-азный и протеолитический домены фермента (рис 1Б и В, 7-9) Из рис 1В видно, что тип нуклеотида не влияет на характер химотрисинолиза

Границы фрагментов были установлены с помощью аминоконцевого секвенирования и масс-спектрометрии (табл 1) Расчетные значения изоэлектрических точек фрагментов были использованы при разработке схемы их хроматографического разделения, а коэффициентов экстинкции - для определения концентрации белка Оказалось, что при любых условиях ограниченного протеолиза происходит выщепление фрагмента <320-М234, а образующиеся А- и АР-фрагменты Ьоп-протеиназы включают часть СС-домена исходного белка (рис 1 Б), которая не подвергается гидролизу химотрипсином, однако отщепляется при автолизе АР-фрагмента (см стр 21-22)

Таблица 1. Характеристика Ьоп-протеиназы и ее химотриптических фрагментов

Белок/фрагмент Границы Мм, Да* pl* £,M 'cm"'*

Ьоп-протеиназа Met'-Lys'54 87 437 60 46 675

АР-фрагмент LysiJS-Lys'M 60 777 73 37 610

А-домен Lys^-Phe584 39 438 89 27 515

N-домен Met'-Mef"" 23 183 46 5 960

Р-домен Asp^-Lys'84 21 358 53 10 095

а-домен Ser™-Phe584 10818 97 5 960

* - рассчитаны с помощью программного обеспечения http //cn expasv org/tools/protparam html

Полученные данные позволили детализировать доменное строение Ьоп-протеиназы, выявить границы а-спирализованного и протеолитического доменов и доказать, что связывание нуклеотида и нуклеотид-магниевого комплекса приводит к различным состояниям структуры фермента в области контакта а- и Р-доменов, но не влияет на область контакта N- и А-доменов Совокупность представленных результатов и литературных данных по действию трипсина и глутамилэндопептидазы на Ьоп-протеиназу

свидетельствует о наличии в структуре фермента ограниченного числа областей, чувствительных к протеоличу {¡-IV на рис 2)

Для получения изолированных фрагментов Ьоп-протеиназы в препаративных количествах проведена оптимизация условий ограниченного протеолиза по следующим параметрам рН, температура, соотношение концентраций фермента и субстрата, продолжительность реакции, содержание соли, нуклеотидов и ионов магния

Обнаружено, что при концентрациях химотрипсина 5 мкг/мл (~0 2 мкМ) и Ьоп-протеиназы 1 мг/мл (~10 мкМ) в течение 2 ч около 95% исходной полноразмерной Ьоп претерпевает превращение Поскольку изменение рН от 7 0 до 9 0 и концентрации хлорида натрия от 0 1 до 1 О М практически не приводит к изменению состава химотриптических фрагментов (свидетельство структурной стабильности Ьоп-протеиназы при исследованных условиях), для ограниченного протеолиза были использованы умеренное содержание соли и условия рН и температуры, оптимальные для функционирования химотрипсина Таким образом, стандартизованными условиями для получения большинства фрагментов Ьоп-протеиназы явились рН 8 0-8 2, 0 1 М >1аС1 и 37°С При этом, однако, выяснилось, что А-домен недостаточно стабилен при 37°С и склонен к агрегации при низком содержании соли Поэтому для наработки А-домена химотрипсинолиз Ьоп-протеиназы проводили при 30°С и в присутствии 0 3 М ИаС1

Оценка влияния концентрации нуклеотида на образование АТР-азного домена показала (рис ЗА), что достаточным для полной стабилизации А-домена является 10-кратный избыток нуклеотида по отношению к содержанию Ьоп-протеиназы

В отсутствие нуклеотида изменение концентрации ионов магния в широком диапазоне не влияет на состав и соотношение продуктов гидролиза Ьоп-протеиназы (рис ЗБ) При совместном присутствии нуклеотида и ионов магния образуются фрагменты, включающие А-домен, стабильность и относительное содержание которых зависят от концентрации Х^-ионов

Следует отметить, что использование ограниченного протеолиза позволяет характеризовать состояние нуклеотид-связывающих центров Ьоп-протеиназы в процессе ее выделения Об этом свидетельствуют результаты химотрипсинолиза препаратов фермента, прошедших завершающую стадию очистки - гель-фильтрацию - с предварительным концентрированием белка в различных условиях (рис ЗВ) Идентичность продуктов гидролиза (Ы-, Р- и а-домены) препаратов фермента, полученных на двух последних стадиях очистки (рис ЗВ, дорожки 2 и 3), показывает, что собственно гель-фильтрация не приводит к выраженным конформационным изменениям Ьоп-протеиназы Предварительное концентрирование белка в присутствии только хлорида магния также не меняет характер химотрипсинолиза (рис ЗВ, 4) Однако, в случае препаратов "5" и "б", концентрированных в присутствии АБР или комплекса АЭР-!^ и освобожденных от избытка эффекторов гель-фильтрацией, наблюдается образование А-домена, что указывает на способность нуклеотида оставаться в связанном с белком состоянии даже после эксклюзионной хроматографии При этом среди продуктов

Lon

1 - препарат Ьоп-протеиназы;

2-6: продукты химотрипсинолиза Ьоп-протеиназы после стадий хроматографической очистки на гепарин-сефарозе (2) и БерЬасгу! 8-300 (3 - 6); предварительное концентрирование препарата белка проводили в отсутствие эффекторов {3) или в присутствии 20 мМ \fgCl2 (4); 0.1 мМ АБР (5); 0.1 мМ АОР и 20 мМ М§С12 ОД.

Условия гель-фипьтрации\ 50 мМ Тпз-НС1-буфер, рН 8.5; 0.15 М№С1; 4°С.

Рис. 3. Влияние на химотрипсинолиз Ьоп-протеиназы концентраций нуклеотидов (А), концентрации ионов магния (Б) и условий концентрирования Ьоп-протеиназы перед заключительной стадией хроматографии (В). Экспериментальные условия см. в подписи к рис. 1 и в тексте. Концентрации: Ьоп - 10 мкМ, химотрипсин - 0.2 мкМ.

химотрипсинолиза препарата "б" отсутствует ожидаемый АР-фрагмент, что свидетельствует об удалении из исходного препарата Ьоп-протеиназы ионов магния. Эти данные означают, что магний не способен удерживаться в тройном комплексе "фермент-нухлеотид-магний" и подвергается быстрому обмену с ионами внешней среды. Совокупность результатов, представленных на рис. ЗВ, демонстрирует также, что стадия хроматографии на гепарин-сефарозе приводит к полному удалению эндогенных нуклеотидов из препаратов Ьоп-протеиназы.

Таким образом, ограниченный протеолиз химотрипсином позволил не только получить детальную информацию о доменной организации Ьоп-протеиназы, но и оказался удобным вспомогательным инструментом для характеристики состояния нуклеотид-связывшощих центров, перспективным для использования его при изучении in vitro ряда аспектов нуклеотид- и магний-зависимого функционирования как нативного фермента, так и его модифицированных форм.

Для препаративного получения индивидуальных фрагментов Ьоп-протеиназы была разработана схема, представленная на рис. 4. Степень чистоты полученных препаратов составила не менее 90%. Отсутствие следовых количеств химотрипсина в целевых препаратах было показано с использованием его специфического хромогенного субстрата, 8ис-А1а-А1а-РЬе-рЫА.

' ,: улрвёуфк. "'.

. •■', ЫЦ/щттШнрпизе Хоп ■ ■.

Гепарин-сефароза Связавшиеся белки ар. а.«

ЁШ

Ря .

ал ' -

Рис. 4. Общая схема разделения продуктов ограниченного протеолиза Ьоп-протеиназы химотрипсином.

2. Структурная характеристика Ьоп-протеиназы и ее фрагментов

Микрокалориметрическое исследование Ьоп-протеиназы и ее фрагментов, полученных ограниченным протеолизом химотрипсином, было проведено совместно с лабораторией физической химии полимеров Института элементоорганических соединений РАН. Из рис. 5А (кривая а) следует, что тепловая денатурация нативной Ьоп-протеиназы в отсутствие эффекторов происходит в три этапа, соответствующих плавлению трех структурных доменов фермента. Данные по денатурации изолированных Ы-, А- и Р-доменов (рис. 5Б-Г, кривые а) позволяют полагать, что первый пик на рис. 5А с температурой перехода (Та) 47.6°С отражает плавление А-домена, второй пик (57.4°С) соответствует протеолитическому домену, а третий (68.2°С) - Ы-домену (табл. 2). Значительное различие в Т^ для изолированного и включенного в полноразмерный белок Р-домена (8-10°С) может

• А-домен

/ Iе а/ у ]

т, °с

140

130

I20 -а10 о

Р-домен Л

I I 1 л 1 , ■

30 40 50 60 70 80 90 ЮС

Т,°с

50 1Ч-домен

* 40 \\

л // 6

§ 30 //

| 20 7

ю / V

а у V

О 0

Т,°с

Рис. 5 Температурная зависимость парциальной теплоемкости нативной Ьоп-протеиназы (А) и ее АТР-азного (Б), протеолитического (В) и Ы-концевого (Г) доменов в отсутствие эффекторов (а) и при наличии (Ь) или АБР (с)

Условия 20 мМ имидазол-НС1-буфер, рН 7 5, 01 М и 03 М (для А-домена) №С1 Концентрации белок — 2 мг/мл, АБР - 0 5 мМ, MgCl2 - 20 мМ

Таблица 2. Температуры плавления (Т^ °С) Ьоп-протеиназы и ее фрагментов

Белок Эффектор

- Мй АЮР

Ьоп-протеиназа 47 6 49 5 57 5

57 4 57 2

68 2 70 1

А-домен 44 9 - 52 1

Р-домен 65 8 67 3 -

Ы-домен 70 4 71 2 -

свидетельствовать о влиянии междоменных взаимодействий на структуру Р-домена Наличие ионов магния приводит к незначительному сдвигу Тй (на 110

2°С) как для изолированных Р- и N-доменов, так и для А- и N-доменов в составе полноразмерной Ьоп-протеиназы (рис 5А, В и Г, Ь)

Асимметричная форма пиков (наиболее выраженная для А-домена, рис 5Б, а), по-видимому, отражает субдоменную организацию фрагментов Связывание ADP А-доменом приводит к сдвигу его Td более чем на 7°С в высокотемпературную область и выраженному изменению формы пика на более острую и симметричную (ср кривые а и с на рис 5Б), что может свидетельствовать о формировании структуры домена с повышенной устойчивостью к термоденатурации

Для полноразмерной Ьоп-протеиназы в присутствии ADP детектируются еще более заметные структурные изменения и обусловленный ими характер плавления (рис 5А, кривая с) плавление комплекса нуклеотид-белок происходит как одноэтапный процесс с температурой денатурации, практически совпадающей с Td включенного в белок Р-домена При этом пик характеризуется высокой степенью симметрии, что указывает на образование структуры, в которой все домены находятся, по-видимому, в тесной взаимосвязи Интересно отметить близость температур плавления комплексов Ьоп-протеиназы и ее А-домена с ADP (табл 2) Можно полагать, что именно взаимодействие с нуклеотидом АТР-азного домена, выполняющего роль структурного ядра всех известных ААА+-белков, обеспечивает высококомпактную сборку субъединицы Ьоп-протеиназы

Совокупность микрокалориметрических данных дополнительно подтверждает доменную организацию Ьоп-протеиназы и реализацию конформационных изменений при связывании ферментом нуклеотида, а также демонстрирует способность изолированного А-домена к связыванию ADP

Третичная структура индивидуальных доменов Lon-протеипазы Поскольку до последнего времени попытки кристаллизации полноразмерной Ьоп-протеиназы не привели к успеху, все химотриптические фрагменты фермента были подвергнуты кристаллизации с целью последующего определения их пространственной структуры При этом были получены кристаллы а- и Р-доменов, a также N-концевого фрагмента (последние оказались непригодными для рентгеноструктурного анализа)

Кристаллическая структура а-спирализованного домена Ьоп-протеиназы Е coli (а о 491-584) определена с разрешением 19 Á (рис 6) Фрагмент обладает характерной для а-доменов ААА+-белков топологией (чередование а-спиралей и ß-тяжей aßaaßa, рис 2) Сопоставление структур a-доменов Ьоп-протеиназы и других представителей ААА+-семейства позволило выявить ряд остатков a-домена Ьоп, потенциально принимающих участие в функционировании АТР-азного центра и локализованных в пределах a-спирали 1 (Y493, 150', Н505 и К506) и a-спирали 3 (V541, R542 (sensor-2) и Е545)

Пространственная структура протеопитического домена Ьоп-протеиназы Е coli (а о 585-784) определена с разрешением 1 75 Á (рис 7А) Р-домен обладает уникальной укладкой, не обнаруженной ранее в известных белках Наряду с этим выявлено хорошее совпадение кристаллических структур

Рис. 6. Кристаллическая структура а-спирализованного домена Ьоп-протеиназы. Локализация остатка 5епзог-2 (Я34 ) показана красным цветом.

г* ь

Ч.

чад

Ы- жгт

РФ;

V '

Рис. 7. Структура протеолитического домена Ьоп-протеиназы со/г. А - ленточная модель с указанием локализации каталитически активных остатков S679 и К722; Б - топология Р-домена (красным цветом обозначены ß-тяжи, синим - ос-спирали, розовым -Зщ-спираль, показана локализация дисульфидной связи и остатков S67'' и К ); В - гексамер Р-домена; Г - поверхность гексамера Р-домена (вид "сбоку" и "снизу"), окружностями отмечены места локализации активных центров.

Р-домена и ряда известных серин-лизиновых пептидгидролаз в области их активных центров, что послужило дополнительным подтверждением функционирования каталитической диады в протеолитическом центре Ьоп-протеиназы Полученные результаты явились основанием для выделения Ьоп-протеиназ в самостоятельное структурное семейство, представляющее индивидуальный клан в классификации пептидгидролаз МЕЛОРБ

Структура Р-домена включает пять а-спирапей, одну спираль Зю и десять Р-тяжей (рис 2 и 7Б) 0-Тяжи 1 и 2, образующие длинную р-шпильку, совместно с РЗ и р4, разделенными спиралью а1, формируют первый р-слой, который взаимодействует со спиралями а1 и а2, образуя компактный субдомен Второй р-слой локализован вокруг тяжа р5 Каталитически активный остаток Б679 расположен в петле, соединяющей Р5 и а2 Стабилизирует субдомен дисульфидная связь, образованная остатками С617 и С691 и связывающая таким образом С-концевые участки спирали а2 и тяжа Р2 (рис 7Б) Другой субдомен включает тяжи Р6-Р10 и спирали аЗ-аб Р-Тяжи 6, 9 и 10 образуют третий р-слой, который располагается между спиралями аЗ и аб Второй каталитический остаток, К722, локализован в спирали оЗ (рис 7Б)

Шесть молекул протеолитического домена (А-Р) образуют в кристалле кольцеобразный гексамер, который имеет колоколообразное строение (рис 7В и Г) Доступное растворителям центральное отверстие диаметром около 18 А в вершине колокола и длиной около 32 А слегка расширяется к основанию, на поверхности которого расположены активные центры Р-доменов (рис 7Г) Такая локализация протеолитических центров оказалась крайне неожиданной, поскольку активные центры всех АТР-зависимых протеиназ, для которых известна кристаллическая структура, обычно секвестрированы во внутренней полости бочкообразных гекса- или гептамеров их протеолитических составляющих и тем самым изолированы от окружающей среды Атипичная локализация активных центров в гексамере Р-домена Ьоп-протеиназы может либо служить характерной особенностью фермента, либо быть следствием неспецифической гексамеризации Р-домена в кристалле в результате утраты специфических взаимодействий с другими доменами Выбор между этими возможностями требует дополнительных рентгеноструктурных исследований с использованием других фрагментов Ьоп-протеиназы

Олигомерное состояние Ъоп-протеиназы и ее фрагментов в растворе определяли гель-фильтрацией и аналитическим ультрацентрифугированием

Имеющиеся данные не позволяют сделать окончательное заключение об олигомерном состоянии полноразмерной Ьоп-протеиназы По результатам гель-фильтрации (табл 3) Ьоп-протеиназу можно характеризовать как высокомолекулярный ассоциат (не менее чем додекамер или неглобулярный октамер с повышенной подвижностью) При значительном разбавлении заметной диссоциации высокомолекулярного комплекса не происходит Скоростная седиментация фермента, проведенная после гель-фильтрации, выявляет сложную картину состояния белка в растворе при комнатной температуре наряду с нерегулярными ассоциатами обнаружены различные олигомерные формы вплоть до димеров и мономеров (табл 3) Результаты

Таблица 3. Олигомерное состояние Lon-протеиназы и ее фрагментов

Мол Эксклюзионная Скоростная седиментация"

масса хроматография , коэфф

Белок/фрагмент моно- мол масса, кДа (п) седимен- мол масса, ОС, РСА,

мера, Superdex 75 Sephacryl тации, кДа (п) % (п)

кДа 16/60 S-300 26/60 S

Lon-протеиназа 87 4 - -1000 (?) -100-240 ~8-30 000 48 -

(асс)

18 613 (7) 10

13 350 (4) 13

76 190 (2) 7

47 105 (/) 22

АР-фрагмент 60 8 - 762 (/)"• 3 75 64 0 (/) 50 -

125 0 (2)" 8 80 230 0 (4) 20

220 0 (4)m 21 5 880 0 (асс) 30

А-домен 39 4 42 3 (lfm 45 0 (if* ND - - -

N-домен 23 2 27 5 (/) - 1 93 23 6 (/) 100 -

Р-домен 21 4 23 8 (/) - 1 75 20 4 (1) 100 (б)

а-домен 10 8 10 0 (/) - ND - - (Л

ND - не определяли, (и) - количество субъединиц, ОС - относительное содержание, РСА -данные рентгеноструктурного анализа, (асс) - ассоциаты, - условия хроматографии 50 мМ Трис-НС1-буфер, рН 7 5, 0 2 М NaCl, 4°С, - данные получены при 25°С и в отсутствие нуклеотидов, — хроматография в присутствии 1 М NaCl, - концентрирование образца в отсутствие эффекторов, м - концентрирование образца в присутствии 1 мМ нуклеотида (ATP, ADP или AMPPNP), т - хроматография в присутствии 0 3 М NaCl (аналогичные результаты получены при использовании нуклеотидов как при конце1ггрировании образца, так и при их содержании в составе буфера)

ультрацентрифугирования выявляют также чувствительность нативной Lon-протеиназы к гидродинамическим силам в условиях эксперимента Можно полагать, что трудности, возникающие при кристаллизации полноразмерного фермента, в большой степени обусловлены его предрасположенностью к образованию гетероагрегатов Однако следует отметить, что такая агрегация может и не реализовываться при обычных условиях изучения фермента -низкие концентрации, физиологическая температура, присутствие эффекторов, субстрата, гидролиз АТР и пр При этом изучение четвертичной структуры Lon Е coli в ее функциональной форме сопряжено с очевидными трудностями, поскольку используемые физические методы не вполне соответствуют динамической природе ферментативных процессов Представленные данные показывают, что углубленное исследование олигомерного состояния Lon-протеиназы в растворе остается актуальной проблемой

В отличие от полноразмерного фермента олигомерное состояние фрагментов Ьоп-протеиназы, полученных ограниченным протеолизом, можно охарактеризовать однозначно Изолированные домены фермента (A, N, Р и а) являются стабильными образованиями и существуют в растворе в качестве мономеров (табл 3) Следует подчеркнуть, однако, что мономерный в растворе

Р-домен в кристалле образует циклические гексамерные структуры (см стр 12 итабл 3)

Неспособность А-домена к формированию олигомеров оказалась неожиданной, поскольку этот домен содержит все характеристические элементы обычно кольцеобразных гексамеров ААА+-белков (консенсусные мотивы (см стр 3), типично организованный а-домен (см стр 12) и протяженную (около 100 а о) [Ч-концевую последовательность предполагаемого экстрадомена) Необычное мономерное состояние А-домена сохраняется также в присутствии нуклеотидов (табл 3) Можно полагать, что область, ответственная за олигомеризацию Ьоп-протеиназы, локализована вне ее А-домена (а о 235-584)

Единственным химотриптическим фрагментом Ьоп-протеиназы, сохраняющим способность к олигомеризации в растворе, является АР-фрагмент, преимущественно димерный в свободном состоянии или тетрамерный в комплексе с нуклеотидом (табл 3) Полученные данные можно рассматривать как свидетельство непосредственного участия Р-домена в формировании четвертичной структуры путем взаимодействия с А-доменом соседней субъединицы в олигомере Кроме того, можно предположить, что олигомеризация полноразмерного фермента происходит путем сборки димеров Вместе с тем, различие олигомерного состояния АР-фрагмента и нативной Ьоп-протеиназы выявляет несомненное участие К-концевой части фермента в олигомеризации Диссоциация АР-фрагмента до отдельных субъединиц (табл 3), наблюдаемая в высокосолевом буфере, свидетельствует о том, что стабилизация димеров происходит, в основном, за счет ионных межсубъединичных взаимодействий

3. Сравнительная характеристика ферментативных свойств Ьоп-протеиназы и ее фрагментов

Тестирование АТР-азной активности в интервале рН от 7 0 до 9 0 и в температурном диапазоне от 25 до 60°С выявило отсутствие у изолированного А-домена способности к гидролизу АТР Неактивное состояние А-домена вполне соотоносится с его мономерным состоянием в растворе, поскольку у известных и обычно гексамерных ААА+-белков в образование АТР-азного активного центра вовлечены остатки, принадлежащие разным субъединицам При этом мономерная форма А-домена достаточна для сохранения способности к связыванию нуклеотида, что показано микрокалориметрией (рис 5Б) и подтверждено повышением устойчивости домена к гидролизу химотрипсином в присутствии АТР (рис 8)

В отличие от А-домена АР-фрагмент обладает АТР-азной активностью, рН-и температурный оптимумы которой (около 84 и 50°С, соответственно) практически совпадают с показателями полноразмерной Ьоп-протеиназы Однако, АТР-азная активность АР-фрагмента заметно ниже и не подвержена ингибирующему влиянию свободных ионов магния В условиях максимальной АТР-азной активности (при эквимолярных концентрациях АТР и ионов магния)

время, мин 0 15 30 60 120 15 30 60 120 -ATP +АТР

Рис. 8. Влияние АТР на гидролиз А-домена Lon-протеиназы химотрипсином. Условия: 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.0, 0.3 М NaCl, 30 °С. Концентрации: А-домен - 10 мкМ, химотрипсин - 0.2 мкМ, АТР - 5 мМ.

субстраты протеолигического центра - (3-казеин и 26-членный олигопептид мелиттин - активируют гидролиз АТР АР-фрагментом, тогда как на нативный фермент мелиттин оказывает ингибирующее действие (табл. 4). Эти результаты свидетельствуют о различии кооперативных эффектов при функционировании нативного фермента и его АР-фрагмента, для их интерпретации требуется проведение дальнейших углубленных кинетических исследований.

Таблица 4. Влияние белкового и пептидного субстратов на удельную АТР-азную активность (мкМ/мкМ*мин) Ьоп-протеиназы и АР-фрагмента

Фермент Субстрат

- /?-казеин мелиттин

Ьоп-протеиназа 141.1 141.9 27.8

АР-фрагмент 19.0 21А 50.6

Условия: 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.1, 0.15 М NaCl, 37 °С.

Концентрации-. Lon-протеиназа - 0.4 мкМ, АР-фрагмент - 0.25 мкМ, р-казеин - 0.1 мМ, мелиттин - 0.25 мМ, АТР - 2.5 мМ, MgCl2 - 2.5 мМ.

Определение кинетических параметров гидролиза АТР показало, что при близких константах Михаэлиса (Кт 0.22 и 0.31 мМ для Lon и АР, соответственно) каталитическая константа Ьоп-протеиназы (Acat 2.09 с"1) почти в 4 раза превышает таковую для АР-фрагмента (0.56 с"1). Таким образом, основной вклад в различие эффективности гидролиза АТР двумя формами фермента вносит именно каталитическая составляющая.

Пептидазную активность Lon-протеиназы и ее химотриптических фрагментов Р и АР определяли по гидролизу олигопептидного субстрата мелиттина, а также тиоэфирного производного трипептида, Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl (РерТВЕ), чувствительного субстрата ряда сериновых протеиназ

Оптимальные значения рН гидролиза РерТВЕ АР-фрагментом (8 2-8 5) и Р-доменом (8 4-8 6) несколько отличаются от рН-оптимума пептядазной активности нативной Ьоп-протеиназы (около 9 0) Однако для всех форм фермента они превышают соответствующие значения, определенные для классических сериновых протеиназ (7 5-8 0), и приближаются к рН-оптимумам серин-лизиновых пептидгидролаз (9 0-10 0) Температурный оптимум гидролиза РерТВЕ АР-фрагментом и Р-доменом одинаков и практически не отличается от температурного оптимума пептидазной активности полноразмерного фермента (около 50°С)

Соотношение удельных активностей Ьоп-протеиназы, АР-фрагмента и Р-домена в отсутствие эффекторов составляет -100 20 1 (рис 9, }), при этом ионы магния активируют пептидгидролазные центры полноразмерного фермента и АР-фрагмента, но не оказывают влияния на Р-домен (рис 9, 2)

Свободный АТР также в незначительной степени активирует гидролиз РерТВЕ Ьоп-протеиназой, a ADP и негидролизуемый нуклеотид, AMPPNP, напротив, проявляют слабое ингибирующее действие, в то время как по отношению к АР-фрагменту нуклеотиды любого типа являются ингибиторами (рис 9, 3-5) В отсутствие избытка ионов магния все три нуклеотид-магниевых комплекса активируют нативный фермент, хотя и в разной степени, однако, только два комплекса - ATP-Mg и AMPPNP-Mg - служат активаторами для АР, а комплекс ADP-Mg игибирует активность фрагмента (рис 9, 6-8) Вблизи физиологических концентраций ионов магния нуклеотид-магниевые комплексы активируют обе формы фермента, причем, максимальная тиоэстеразная активность наблюдается в условиях сопряжения с гидролизом АТР, те в присутствии ATP-Mg (рис 9,9-11)

Можно полагать, что обнаруженные различия в действии нуклеотидов и их комплексов с магнием на активность пептидгидролазных центров нативной Ьоп-протеиназы и ее АР-фрагмента обусловлены разной степенью олигомеризации последних (как и рассмотренные выше различия АТР-азной активности) и, как следствие, различием кооперативных эффектов, сопровождающих функционирование фермента

Определение кинетических параметров гидролиза РерТВЕ показало, что повышение эффективности функционирования пептидгидролазных центров нативной Ьоп-протеиназы и ее АР-фрагмента в присутствии ATP-Mg обусловлено исключительно увеличением каталитической константы (табл 5) При этом гидролиз РерТВЕ обеими укороченными формами (АР и Р) характеризуется пониженными значениями кинетических констант (kca, и Кт) по сравнению с данными для полноразмерного фермента

Гидролиз мелиттина Ьоп-протеиназой, АР-фрагментом и Р-доменом происходит, главным образом, по связям Vs-L9, Ь9-Т10, т10-Тп и G,2-Lb (рис 10А, показано масс-спектрометр ическим анализом продуктов и

1 2 3

4 5 6

7 8

9 10

■ Р

ВАР □ Lon

Рис. 9. Влияние эффекторов на тиоэстеразную активность Ьоп-протеиназы и ее укороченных форм.

Условия: 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.1, 0.15 М NaCl, 10% DMSO; 37 'С. Эффекторы: 1 -отсутствуют, (2, 9-11) - 20 мМ MgCfe, (6-8) - 2.5 мМ MgCl2, (3, 6, 9) - 2.5 мМ АТР, (4, 7,10) - 2.5 мМ ADP, (5, 8,11) - 2.5 мМ AMPPNP. Концентрации: Ьоп-протеиназа и АР-фрагмент -0.1 мкМ, Р-домен - 1 мкМ; РерТВЕ - 0.1 мМ, дитиодипиридин - 0.2 мМ. Значения активности рассчитаны с учетом концентраций ферментов; за 100 % принята активность Ьоп-протеиназы при гидролизе АТР (9).

Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzi нативной Lon-протеиназой и ее укороченными формами

Фермент - ATP-Mg + ATP-Mg

Km, мМ ксаь с ^cat /Кт мМ"' * с"1 Кт мМ ^cai, С ^cat /Кт мМ'1 * с 1

Ьоп-протеиназа 4.4 4.7 1.1 3.8 49 13

АР-фрагмент 0.4 0.7 2.1 0.4 12.9 30.7

Р-домен 0.3 0.04 0.13 ND

ND - не определяли.

Условия: 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.1, 0.15 М NaCl, 10 % DMSO; 37 "С.

Концентрации: Ьоп-протеиназа и АР-фрагмент - 0.1 мкМ, Р-домен - 1 мкМ, АТР - 2.5 мМ,

Mg2+- 20 мМ, РерТВЕ - 0.03-0.20 мМ, дитиодипиридин - 0.2 мМ.

подтверждено аминоконцевым секвенированием). Можно отметить, что локализация сайтов расщепления мелиттина, в целом, соответствует специфичности серин-лизиновых пептидгидролаз. Нативный фермент и его укороченные формы различаются только степенью эффективности превращения субстрата (рис. 10Б), при этом активность Р-домена становится сопоставимой с базовой активностью форм, содержащих АТР-азный домен

•i i- J-

GIGAVLKV-L-T-TG-LPALISWIKRKRQQ-NHj

S §

ч:

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

□L

□ Lon

□ AP ■ P

Рис. 10. Сайты гидролиза (А) и эффективность расщепления мелиттина Ьоп-

протеиназой и ее укороченными формами (Б).

Условия: 50 мМ Тпв-НСЛ-буфер, рН 8.1, 0.15 М №С1, 37 2 ч.

Эффекторы: 1 - отсутствуют, 2 - , 3 - АТР-М§, 4 - АЭР-К/^, 5 - AMPPNP-Mg. Концентрации: Ьоп - 0.4 мкМ. АР-фрагмент и Р-домен - 1 мкМ, мелиттин - 0.25 мМ, нуклеотиды - 5 мМ, М§СЬ - 20 мМ.

(Lon и АР). Можно полагать, что связывание олигопептидного субстрата способно активировать пептидазный центр мономерного Р-домена (активация субстратом), однако эта проблема требует дополнительного исследования.

В противоположность действию на гидролиз РерТВЕ ионы магния не активируют расщепление мелиттина (рис. 10Б, 1 и 2). Гидролиз мелиттина Lon-протеиназой и АР-фрагментом, подобно гидролизу РерТВЕ, ускоряется в присутствии нуклеотид-магниевых комплексов (рис. 10Б, 3 - 5), причем, максимальный эффект оказывает комплекс AMPPNP-Mg.

Совокупность результатов изучения гидролиза пептидных субстратов Ьоп-протеиназой и ее укороченными формами позволяет сделать заключение о том, что (1) удаление N-концевого домена не приводит к изменению основных принципов нуклеотид-зависимой аллостерической регуляции

пептидгидролазных центров в АР-фрагменте; (2) Р-домен является низкоэффективной пептидгидролазой, содержащей, в отличие от А-домена, сформированный каталитический центр, высокая эффективность функционирования которого в полноразмерном ферменте определяется взаимодействием с другими доменами.

Протеолитическую активность, тестируемую по гидролизу модельного субстрата (3-казеина, обнаруживают только нативная Ьоп-протеиназа и АР-фрагмент, Р-домен не способен гидролизовать белковые субстраты. Характерный для ААА+-протеиназ проиессивный механизм протеолиза, сопряженный с гидролизом АТР, реализуется исключительно полноразмерным

ферментом (рис. 11 А, б). В отсутствие нуклеотидов Lori и АР гидролизуют белковый субстрат по непроцессивному механизму (с высвобождением высокомолекулярных продуктов реакции, рис. 11А-Б, / и 5). Принимая во внимание, что свойства Ьоп-протеиназы in vitro в большой степени зависят от полноты освобождения ее препаратов от эндогенных нуклеотидов, можно полагать, что проявление АТР-независимого гидролиза (3-казеина обусловлено понижением степени олигомеризации свободного от нуклеотидов фермента в разбавленных растворах. Протеолитические центры в низкомолекулярных олигомерах фермента становятся доступными для белкового субстрата, и Ьоп-протеиназа функционирует как "обычная" пептидгидролаза. Отсутствие детектируемой протеолитической активности у Р-домена, вероятно, определяется преимущественно неактивным состоянием его каталитического центра. В то же время вопрос о принципиальной способности протеолитического домена к взаимодействию с белковыми мишенями остается открытым.

-АР

1-р-качеин

Рис. 11. Влияние эффекторов на гидролиз р-казеина нагивной Ьоп-протеиназой (А) и АР-фрагментом (Б).

Условия: 50 мМ Тпв-НО-буфер, рН 8.1, 0.15 М ЫаС1, 37 'С, время реакции -2ч (А) и 24 ч (Б). О — образцы реакционной смеси в момент инициации реакции; К/ и к2 - образцы (3-казсина в моменты начала и окончания реакции, соответственно. Эффекторы'. 1 -отсутствуют, (2, 6) - 5 мМ АТР, {3,7)- 5 мМ АЭР, (4. 8) - 5 мМ АМРР№, (5-8) - 20 мМ (У^СЬ. Концентрации: Ьоп-протеиназа и АР-фрагмент - 1 мкМ, р-казеин - 43 мкМ.

Из рис. 11А-Б видно, что АР-фрагмент обладает значительно пониженной относительно Ьоп-протеиназы протеолитической активностью (близкая степень деградации субстрата детектируется за 24 и 2 часа, соответственно). При этом на фоне гидролиза р-казеина наблюдается автолитический распад самого АР-фрагмента (рис. 11Б, /, 5, б). Свободные нуклеотиды ингибируют протеолитическую активность и Ьоп-протеиназы и АР-фрагмента (рис. 11А-Б, 2-4) и одновременно стабилизируют их, предотвращая автолиз. Комплексы АОР-М§ и АМРР№-М§ также являются стабилизаторами, при этом АОР-1У^ ингибирует гидролиз белка (рис. 11А-Б, 7), но в присутствии АМРРЫР-!^

выявляется непроцессивная протеолитическая активность Lon (не проиллюстрировано) и АР (рис. 11Б, 8), развивающаяся с выраженным лаг-периодом.

Наиболее примечательные различия свойств полноразмерного фермента и его укороченной формы были выявлены при гидролизе АТР. АТР-зависимый гидролиз (3-казеина Ьоп-протеиназой соответствует классическими представлениям и происходит процессивно (рис. 11 А, 6, подтверждено масс-спектрометрией). В отличие от полноразмерной Lon АР-фрагмент гидролизует р-казеин с образованием высокомолекулярных интермедиатов. При этом на начальной стадии реакции АР подвергается необычному автолизу (рис. 12А), иницируемому гидролизом АТР. Наряду с тем, что собственно АР является непроцессивной протеиназой (рис. 11 Б, 8), протеолитическую активность продуктов его автолиза, наблюдаемого при гидролизе АТР, также нельзя исключить.

кДа

116 -г*й 66—i- :

45- •

25-ч* ■

14-ч

время, О мин

20 40 60 120 20 40 60 120

- ATP-Mg

+ ATP-Mg

кДа 1166645- ,.

35- . 25" **

14-%

время, сутки

-JL-

ГГ-

О 1

6 7

Рис. 12. Автолиз АР-фрагмента (А) и Ьоп-протеиназы (Б).

Условия: 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 8.1, 0.15 М NaCl, 37 'С.

Концентрации: Ьоп-протеиназа и АР-фрагмент - 1 мкМ, 5 мМ АТР, 20 мМ MgCb.

Автолитическая деградация АР-фрагмента в отсутствие нуклеотидов и при гидролизе АТР носит различный характер (рис. 12А). В первом случае за 2 часа АР-фрагмент автолизуется примерно на 50% и преимущественно по связям Ala4n-Lys412 и Phe468-Val46 , локализованным в а/(3-домене (рис. 2). Образующиеся фрагменты Lys412-Lys784 и Val469-Lys784 имеют молекулярные массы ~41 и 35 кДа (рис. 12А). При гидролизе АТР близкая степень превращения обнаруживается уже за 20 мин, причем, наблюдается стабилизация а/(3-домена, так как расщеплению практически исключительно подвергается связь Ala286-Glu287, расположенная вблизи С-концевой области предполагаемого СС-домена (рис. 2), и главным продуктом реакции становится фрагмент Glu287-Lys784 (-55 кДа, рис. 12А). Недоступность рассматриваемой области полноразмерного белка действию химотрипсина независимо от

условий может означать, что эта область Lon-протеиназы "спрятана" в олигомере фермента и, возможно, вовлечена в непосредственное взаимодействие с протеолитическим доменом

Нативная Ьоп-протеиназа автолизуется значительно медленнее, чем АР-фрагмент и только в отсутствие нуклеотидов (рис 12Б), что может служить свидетельством в пользу стабилизирующей роли N-концевого домена в структуре фермента Автолизу, в первую очередь, подвергаются связи Met410-Ala411 и lie 88-Arg489, локализованные соответственно вблизи одного из сайтов автолиза АР-фрагмента и сайта ограниченного протеолиза Lon химотрипсином (рис 2) Окончательным итогом процесса служит накопление N-концевого фрагмента с мол массой 27-28 кДа (около 250 а о) и фрагмента Arg489-Lys784, включающего а-спирализованный и протеолитический домены (аР-фрагмент, 32 кДа) (рис 12Б)

Совокупность представленных данных свидетельствует о том, что в отсутствие стабилизирующего действия нуклеотидов АТР-азный модуль Lon-протеиназы лабилен и подвергается автолизу на участке между мотивами Уолкера А и В, а также в междоменной области на границе а/р- и а-спирализованного доменов При этом автолиз Lon и АР-фрагмента, по-видимому, обусловлен активностью их низкомолекулярных форм, предположительно - димеров (табл 3) Нестабильность АР-фрагмента при гидролизе АТР является следствием динамического процесса, который может протекать внутримолекулярно в олигомере АР, однако, это предположение требует дальнейшего изучения с определением кинетического порядка реакции автолиза

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика фрагментации Lon-протеиназы Е coh путем ограниченного протеолиза химотрипсином Препаративно выделены пять фрагментов фермента, соответствующих его индивидуальным структурным доменам или их комбинациям (а-спирализованный (а) и протеолитический (Р) домены, N-концевой (N), АТР-азный (А) и АР-фрагменты) Выявлены четыре участка структуры фермента, чувствительные к действию протеиназ

2. На основании рентгеноструктурных данных установлено, что структура а-домена типична для ААА+-белков, а Р-домен имеет уникальную для протеолитических ферментов пространственную укладку

3. Изучено олигомерное состояние полученных фрагментов Ьоп-протеипазы Выявлено, что способностью к олигомеризации обладает исключительно АР-фрагмент Выдвинуто предположение о необходимости для олигомеризации прямого структурного контакта протеолитического и АТР-азного доменов фермента

4. Охарактеризованы ферментативные свойства фрагментов, содержащих каталитические центры Показано отсутствие АТР-азной активности у А-домена и протеолитической у Р-домена Установлено, что в отличие от неактивных составляющих, АР-фрагмент является активной АТР-азой и непроцессивной протеиназой, склонной к АТР-зависимому автолизу в области С-концевой границы coiled-coil области структуры фермента

5. Показана ключевая роль N-концевой части Ьоп-протеиназы, содержащей coiled-coil область, в формировании формы фермента, способной к процессивному протеолизу при реализации гидролиза АТР

6. Выявлено новое свойство Ьоп-протеиназы - способность к непроцессивному протеолизу в отсутствие нуклеотидов Выдвинуто предположение о том, что это свойство реализуется формами фермента с пониженной степенью олигомеризации

Список публикации

1 Botos I, Melnikov ЕЕ, Cherry S, Khalalova A G. Rasulova FS, Tropea J, Maurizi MR, Rotanova T V, Gustchina A , Wlodawer A (2004) Crystal structure of the AAA+ a domain of£ coll Lon protease at 1 9Aresolution J Struct Biol, 146(1-2), 113-122

2 Botos I, Melnikov E E, Cherry S, Tropea J, Khalatova A G. Rasulova FS, DauterZ, Maurizi MR, Rotanova T V, Wlodawer A , Gustchina A (2004) The catalytic domain of E coll Lon protease has a unique fold and a Ser-Lys dyad in the active site J Biol Chem , 279 (9), 81408148

3 Rotanova TV, Melnikov EE, Khalatova A G. Makhovskaya О V, Botos I, Wlodawer A , Gustchina A (2004) Classification of ATP-dependent proteases Lon and comparison of the active sites of their proteolytic domains Eur J Biochem,271 (23-24), 4865-4871

4 Маховская О В, Козлов С, Ботос И, Степнов А А, Андрианова А Г. Гущина А Е, Вюдавер А, Мельников Э Э, Ротанова ТВ (2007) Формы ЬопВ-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus, лишенные трансмембранного домена Вклад четвертичной структуры в регуляцию протеолитической активности фермента Биоорган химия, 33 (6), 657-660

5 Цирульников К Б, Халатова А Г. Маховская О В (2002) Каталитическая диада Ser-Lys в протеолитическоч центре АТР-зависимой Lon-протеиназы Ecoh XIV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва Тез стенд сообщ, с 42

6 Мельников ЭЭ, Халатова А Г, Серова ОВ, Цирульников КБ, Ротаноза ТВ (2002) Сравнительное исследование функциональной активности АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia toll и ее фрагментов, полученных ограниченным протеолизом" V Симпозиум "Химия протеочитических ферментов", Москва Тез стенд сообщ , с 68

7 Botos I, Melnikov ЕЕ, Cherry S, Khalatova A G. RasulovaFS, Tropea J, Maurizi MR, Rotanova T V, Gustchina A, Wlodawer A (2003) Crystal structure of the SSD domain of E coli Lon protease at 1 9 A resolution The 21st European Crystallographic Meeting, Durban Abstr, p 10

8 Botos I, Melnikov E E, Cherry S, Tropea J, Khalatova A G. Rasulova FS, Dautei Z, Maurizi MR., Rotanova TV, Wlodawer A, Gustchina A (2003) Slicing a protease crystallographic investigations of individual domains of the E coli ATP-dependent protease Lon reveals a novel fold 3rd General Meeting of the International Proteolysis Society, Nagoya, Japan Abstr,p 340

9 Botos I, Melmkov EE, Cherry S, Khalalova A G. Rasulova FS, Tropea J, Maurizi MR, Rotanova T V, Gustchma A, Wlodawer A (2003) Crystal structure of the SSD domain of E colt Lon protease at 1 9 A resolution V International conference on AAA Proteins, Warrenton Abstr, A-69

10 Махоеская OB, Халатова А Г. Мельников ЭЭ, Ротаноеа ТВ (2004) Структурная организация и функционирование in vitro АТР-зависимой ЬопВ-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus Международная конференция "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов", Петрозаводск Материалы, с 88-89

11 Халатова А Г. Мельников Э Э, Ротаноеа ТВ (2004) Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Lon-протеиназы Е coli, полученных методом ограниченного протеолиза химотрипсином Международная конференция по физико-химической биологии, поев 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова (VII чтения), Москва Тез докл и стенд сообщ, с 74

12 Botos I, Ziolkowska N, Melmkov EE, Cherry S, Kozlov S, Khalatova A G. Makhovskaya О V, Tropea J, Gustchma A , Maurizi MR, Rotanova T V, Wlodawer A (2005) Conservation of the overall fold and variability of the active sites of isolated proteolytic domains of Lon proteases 6th International Conference on AAA Proteins, Schloss Seggau, Austria Abstr, p 65

13 Khalatova A G. Melmkov EE, Rotanova TV (2005) The role of the individual domains of the Escherichia coli ATP-dependent protease LonA in oligomerization and function б"1 International Conference on AAA Proteins, Schloss Seggau, Austria Abstr, p 104

14 Махоеская OB, Степнов AA, Халатова А Г. Мечьников ЭЭ, Ротаноеа ТВ (2006) АТР-зависимые Lon-протеиназы В-типа Термостабильная мембраносвязанная протеиназа LonB из A fulgidus экспрессия в Е coh, свойства полноразмерно го фермента и его форм, лишенных трансмембранного домена VIII чтения, поев памяти академика Ю А Овчинникова, Москва-Пущино Тез докл и стенд сообщ, с 83

15 Степнов А А, Строкова ОВ, Халатова А Г. Мельников ЭЭ, Ротаноеа ТВ (2006) Ключевая роль остатка Arg542 в регуляции активности АТР-зависимой Lon-протеиназы Е coh XVIII зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва Тез стенд сообщ, с 51

16 Андрианова АГ. Строкова ОВ, Степнов АА, Морозкин АД, Мельников ЭЭ, Ротаноеа ТВ (2007) Ограниченный протеочиз АТР-зависимой Lon-протеиназы Е coli и роль индивидуальных доменов в олигомеризации и функционировании фермента VI Симп "Химия протеолитических ферментов", Москва Тез докл и стенд сообщ, с 95-96

17 Stepnov А А , Andrianova A G . Gustchma А , Wlodawer А , Melmkov ЕЕ, Rotanova Т V (2007) Modified forms of Е coli Lon protease and the functional role of the non-catalytic domains of the enzyme 7th International Conference on AAA proteins, Cirencester, England Abstr, p 26

18 Мельников Э Э, Ротаноеа T В, Махоеская О В, Андрианова А Г. Степнов А А, Румш ЛД (2007) Модифицированные формы АТР-зависимых Lon-протеаз в исследовании структурной организации и функционирования интактных ферментов III Российский симпозиум "Белки и пептиды", Пущино Тез докл , с 43

Сокращения Sue - сукцинил, pNA - п-нитроанилид, S-Bzl - тиобензил

Подписано в печать 16 04 2008 г Печать трафаретная

Заказ №281 Тираж 100экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Андрианова, Анна Говардовна

Введение.

1. Активные центры АТР-зависимых протеиназ и протеолитических комплексов, осуществляющих селективную внутриклеточную деградацию белков (Обзор литературы).

1.1. Семейство ААА+-белков.

1.1.1 .Структурные особенности ААА+-белков.

1.1.2. Классификация ААА+-белков.

1.1.3. Функции ААА+-белков.

1.1.3.1. Классификация, структура и функции шаперонов.

1.1.3.2. Регуляция межбелковых взаимодействий.

1.1.3.3. ДНК-связывающие представители ААА+-семейства.

1.1.3.4. Молекулярные моторы.

1.1.4. Биологическая роль ААА+-белков.

1.2. Типы активных центров АТР-зависимых протеиназ и протеолитических комплексов.

1.2.1. Металлопротеиназа FtsH.

1.2.2. Классическая каталитическая триада. Протеиназы ClpAP и С1рХР.ЗО

1.2.3. Треониновые протеиназы: IIslUV и протеасомы.

1.2.4. Каталитическая диада Ser-Lys.

1.2.4.1. Ьоп-протеиназа.

1.2.4.2. Репрессор LexA.

1.2.4.3. Сигнальная пептидаза типа 1.

1.2.4.4. Протеиназа Tsp.

1.2.4.5. Пептидаза CtpA.

1.2.4.6. Неканонические Ьоп-протеиназы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli"

Процессы жизнеобеспечения клетки имеют многоуровневую регуляцию и таким образом строго контролируются. В поддержании гомеостаза важную роль играет адекватное функционирование клеточных белков. Наряду с ковалентной модификацией, изменением субклеточной локализации, взаимодействием с лигандами, особое место в регуляции активности белков отведено их протеолитической деградации.

Известно, что одни белки существуют in vivo довольно длительное время, другие живут от нескольких минут до 2-3 часов. Короткоживущие белки обычно синтезируются в определенный момент жизни клетки, в ответ на некоторые внутренние и внешние импульсы [']. Когда потребность в таком белке отпадает, специальные факторы сигнализируют о том, что его синтез должен быть остановлен, либо на этапе считывания матричных РНК (мРНК) с ДНК (факторы транскрипции), либо на стадии синтеза белка с РНК-матриц. Однако если белок уже существует, должен быть и механизм, обеспечивающий регуляцию его работы. Такой механизм давно и достаточно детально исследован для ферментов, активность которых обратимо подавляется ингибиторами белковой или небелковой природы. Однако клетка на протяжении своей жизни синтезирует и множество белков неферментативной природы, выполняющих разнообразные функции. К ним относятся, в частности, короткоживущие регуляторные белки, необходимые лишь на определенных стадиях клеточного метаболизма или развития, например, белки, функционирующие в условиях стресса, регулирующие стадии клеточного деления или инициирующие регуляторные каскады [']. Избыточное содержание таких белков удаляется посредством внутриклеточного протеолиза. Другой важной функцией внутриклеточного протеолиза является быстрое устранение дефектных полипептидов, образовавшихся в результате ошибок транскрипции или трансляции или в результате временного пребывания организма под влиянием факторов стресса (химического повреждения, тепловой денатурации, биохимического голодания, повреждающего излучения) [ ]. Деструктивный протеолиз носит "защитный" характер. Кроме того, быстрой деградации подвергаются белки, "лишенные партнеров", стабильные в составе олигомерных комплексов. Отдельные субъединицы таких белков, образующиеся в результате недостаточного или избыточного биосинтеза, считаются "условными субстратами".

Основная возможность обеспечить качество и поддерживать баланс клеточного белка предоставляется клетке АТР-зависимыми протеиназами, способными производить высокоселективный отбор субстратов с последующим их рефолдингом или деградацией.

1. Активные центры АТР-зависимых протеиназ и протеолитических комплексов, осуществляющих селективную внутриклеточную деградацию белков (Обзор литературы)

АТР-зависимые протеиназы и мультиферментные комплексы относятся к сообществу ААА+-белков (ЛТР-аз, Ассоциированных с различными клеточными активностями) [3]. В отличие от "классических" протеолитических ферментов ААА+-протеиназы проявляют высокую селективность по отношению к своим белковым мишеням, не обладая при этом выраженной первичной специфичностью. АТР-зависимый гидролиз субстратов осуществляется процессивно, без высвобождения высокомолекулярных продуктов реакции, при этом энергия гидролиза АТР расходуется ферментами на связывание мишени, разворачивание и проталкивание белка-субстрата в центральную каталитическую полость цилиндрического олигомера - структуры, характерной для ААА+-протеипаз. Семейство АТР-зависимых ферментов широко представлено в клетках самых разнообразных организмов, как в прокариотах и археях, так и в эукариотах (табл. 1). Исторически первыми обнаруженными представителями энергозависимых протеиназ оказались протеасомы и Ьоп-протеиназа, которая является объектом исследования в представленной работе.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Андрианова, Анна Говардовна

4. Выводы

1. Разработана методика фрагментации Ьоп-протеиназы Е. coli путем ограниченного протеолиза химотрипсином. Препаративно выделены пять фрагментов фермента, соответствующих его индивидуальным структурным доменам или их комбинациям (а-спирализованный (а) и протеолитический (Р) домены; N-концевой (N), АТР-азный (А) и АР-фрагменты). Выявлены четыре участка структуры фермента, чувствительные к действию протеиназ.

3. Изучено олигомерное состояние полученных фрагментов Ьоп-протеиназы. Выявлено, что способностью к олигомеризации обладает исключительно АР-фрагмент. Выдвинуто предположение о необходимости для олигомеризации прямого структурного контакта протеолитического и АТР-азного доменов фермента.

4. Охарактеризованы ферментативные свойства фрагментов, содержащих каталитические центры. Показано отсутствие АТР-азной активности у А-домена и протеолитической у Р-домена. Установлено, что в отличие от неактивных составляющих, АР-фрагмент является активной АТР-азой и непроцессивной протеиназой, склонной к АТР-зависимому автолизу в области С-концевой границы coiled-coil области структуры фермента.

6. Выявлено новое свойство Ьоп-протеиназы — способность к непроцессивному протеолизу в отсутствие нуклеотидов. Выдвинуто предположение о том, что это свойство реализуется формами фермента с пониженной степенью олигомеризации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Андрианова, Анна Говардовна, Москва

1.Б., Карпов B.J1. (2003) Протеасома: разрушение во имя созидания. Природа, 7.

2. Gottesman S., Maurizi М. (2001) Surviving starvation. Science, 293, 614-615.

3. Beyer A. (1997) Sequence analysis of the AAA protein family. Protein Sci., 6, 2043-2058.

4. Erdraann R., Wiebel F.F., Flessau A., Rytka J., Beyer A., Frohlich K.U., Kunau W.H. (1991) PAS1 a yeast gene required for peroxisome biogenesis, encodes a member of a novel family of putative ATPases. Cell, 64 (3), 499-510.

5. Lupas A.N., Martin J. (2002) AAA proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 12 (6), 746-753.

6. Dougan D.A., Mogk A., Zeth K., Turgay K., Bukau B. (2002) AAA+ proteins and substrate recognition, it all depends on their partner in crime. FEBS Lett., 529, 6-10.

7. Iyer L.M., Leipe D.D., Koonin E.V., Aravind L. (2004) Evolutionary history and higher order classification of AAA+ ATPases. J. Struct. Biol., 146 (1-2), 11-31.

8. Neuwald A.F., Aravind L., Spouge J.L., Koonin E.V. (1999) AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res., 9 (1), 2743.n

9. Hattendorf D.A., Lindquist S.L. (2002) Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hspl04 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99 (5), 2732-2737.

10. Johnson A., O'Donnell M. (2003) Ordered ATP hydrolysis in the gamma complex clamp loader AAA+ machine. J Biol Chem., 278 (16), 14406-13.

11. Vale R.D. (2000) AAA proteins: lords of ring. J. Struct. Biol., 150 (1), 13-20.

12. Schumacher J., Zhang X., Jones S., Bordes P., Buck M. (2004) ATP-dependent transcriptional activation by bacterial PspF AAA+ protein. J. Mol. Biol., 338 (5), 863-875.

13. Seybert A., Scott D.J., Scaife S., Singleton M.R., Wigley D.B. (2002) Biochemical characterization of the clamp/clamp loader proteins from the euryarchaeon Archaeoglobus fulgidus. Nucl. Ac. Res., 30 (20), 4329-4338:

14. Gottesman S., Maurizi M.R., Wickner S. (1997) Regulatory subunits of energy-dependent proteases. Cell, 91, 435-438.

15. Hersch G.L., Burton R.E., Bolon D.N., Baker T.A., Sauer R.T. (2005) Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase: allosteric control of a protein machine. Cell, 121, 1017-1027.

16. Rouiller I., DeLaBarre В., May A.P., Weis W.I., Brunger A.T., Milligan R.A., Wilson-Kubalek E.M. (2002) Conformational changes of the multifunction p97 AAA ATPase during its ATPase cicle. Nat. Struc. Biol., 9 (12), 950-956.

17. Weibezahn J., Bukau В., Mogk A. (2004) Unscrambling an egg: protein disaggregation by AAA+ proteins. Microbial Cell Fact., 3 (1), 1-12.

18. Wong P., Houry W.A. (2004) Chaperone networks in bacteria: analysis of protein homeostasis in minimal cells. J. Struct. Biol., 146 (1-2), 79-89.

19. Rotanova T.V., Starkova N.N. (2003) ATP-dependent protease Lon Escherichia coli. Structure, active site, coupling of proteolysis to ATP hydrolysis. Protein Structure, 579-592.

20. Weibezahn J., Schlieker C., Bukau В., Mogk A. (2003) Characterisation of trap mutant of the AAA+ chaperone ClpB. J. Biol. Chem., 278 (35), 32608-32617.

21. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. (1996) HsplOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem. Sci., 21 (8), 289-296.

22. Mogk A., Dougan D., Weibezahn J., Schlieker C., Turgay K., Bukau B. (2004) Broad yet high.substrate specificity: the challenge of AAA+ proteins. J. Struct. Biol., 146 (1-2), 90-98.

23. Mogk A., Bukau B. (2004) Molecular chaperones: structure of a protein disaggregase. Carr. Biol., 14 (2), 78-80. f

24. Lee S., Sowa M.E., Choi J.M., Tsai F.T. (2004) The ClpB/Hspl04 molecular chaperone a protein disaggregating machine./. Struct. Biol., 146 (1-2), 99-105.

25. Martin J., Gruber M., Lupas A.N. (2004) Coiled coils meet the chaperone world. Trends Biochem. Sci.,29 (9), 455-458.

26. Smith G.R., Contreras-Moreira В., Zhang X., Bates P.A. (2004) A link between sequence conservation and domain motion within the AAA+ family. J. Struct. Biol., 146 (1-2), 189-204.

27. Keiler K.C., Waller P.R., Sauer R.T. (1996) Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science, 271, 990-993.

28. Gottesman S., Roche E., Zhou Y., Sauer.R.T. (1998) The ClpXP and ClpAP proteases degrade proteins with carboxy-terminal peptide tails added by the SsrA-tagging system. Genes Dev., 12 (9), 1338-1347.

29. Flynn J.M., Levchenko I., Seidel M., Wickner S.H., Sauer R.T., Baker T.A. (2001) Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (19), 10584-10589.

30. Varshavsky A. (1992) The N-end rule. Cell, 69 (5), 725-735.

31. Flynn J.M., Neher S.B., Kim Y.I., Sauer R.T., Baker T.A. (2003) Proteomic discovery of cellular substrates of the ClpXP protease reveals five classes of CIpX-recognition signals. Mol. Cell, 11 (3), 671683.

32. Kudora A. (2006) A polyphosphate-Lon protease complex in the adaptation of Escherichia coli to amino acid starvation. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70 (2), 325-331.

33. Quarmby L. (2005) Cellular samurai: katanin and the severing of microtubules. J. Cell. Science, 113, 2821-2827.

34. Wang Q., Song C., Li C.H. (2004) Molecular perspectives on p97-VCP: progress in understanding its structure and diverse biological functions. J. Struct. Biol., 146 (1-2), 44-57.

35. Uchiyama K., Kondo H. (2005) p97/p47-mediated biogenesis of Golgi and ER. J. Biochem., 37, 115119.

36. Whiteheart S.W., Matveeva E.A. (2004) Multiple binding proteins suggest diverse functions for the N-ethylmaleimide sensitive factor. J. Struct. Biol., 146, 32-43.

37. Hickman A.B., Dyda F. (2005) Binding and unwinding: SF3 viral helicases. Curr. Opin. Struct. Biol., 15, 77-85.

38. Yamada K., Morikawa A., Morikawa K. (2004) Three-dimensional structural views of branch migration and resolution in DNA homologous recombination. Curr. Opin. Struct. Biol., 14, 130-137.

39. Wang J. (2004) Nucleotide-dependent domain motions within rings of the RecA/AAA+ superfamily. J. Struct. Biol., 148, 259-267.

40. Komori K., Miyata Т., Daiyasu H., TobH., Shinagawa H., Ishino Y. (2000) Domain analysis of an archaeal RadA protein for the strand exchange activity. J. Biol. Chem., 275 (43), 33791-33797.»

41. Seitz E.M., Kowalczykowski S.C. (2000) The DNA binding and pairing preferences of the archaeal RadA protein demonstrate a universal characteristic of DNA strand exchange proteins. Mol. Microbiol., 37 (3), 555-560.

42. Beam C.E., Saveson C.J., Lovett S.T. (2002) Role for radA/sms in recombination intermediate processing in Escherichia coli. J. Bacteriol., 184 (24), 6836-6844.

43. Bordes P., Wigneshweraraj S.R., Zhang X., Buck M. (2004) c54-dependent transcription* activator phage shock protein F of Escherichia coli: a fragmentation approach to identify sequences that contribute to self-association. Biochem. J., 378, 735-744.

44. Leonard A.C., Grimwade J.E. (2005) Building a bacterial orisome: emergence of new regulatory features for replication origin unwinding. Mol. Microbiol., 55 (4), 978-985.

45. Burgess S.A., Knight PJ. (2004) Is the dynein motor a winch? Curr. Opin. Struct. Biol., 14, 138-146.

46. King S.M. (2000) AAA domains and organization of the dynein motor unit. J. Cell. Science, 113, 25212526.

47. Sakato M., King S.M. (2004) Design and regulation of the AAA+ microtubule motor dynein. J. Struct. Biol., 146, 58-71.

48. Muchowski P J., Wacker J.L. (2005) Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nat. Rev. Neuroscience, 6, 11-22.

49. Petrof E.O., Ciancio M.J., Chang E.B. (2004) Role and regulation of intestinal epithelial heat shock proteins in health and disease. Chin. J. Dig. Dis., 5 (2), 45-50.

50. Beere H.M. (2004) The stress of dying: the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J. Cell Science., 117, 2641-2651.

51. Di Felice V., David S., Cappello F., Zummo G. (2005) Is chlamydial heat shock protein 60 a risk factor for oncogenesis? Cell Mol. Life, 62 (1), 4-9.

52. Gupta S., Knowlton A.A. (2005) Hsp60, bax, apoptosis and the heart. J. Cell Mol. Med., 9(1), 51-58.

53. Qamra R., Mande S.C. (2004) Crystal structure of the 65-kilodalton heat shock protein, chaperonin 60.2, of Mycobacterium tuberculosis. J. Bacteriol., 186 (23), 105-113.

54. Zellmeier S., Zuber U., Schumann W., Wiegert T. (2003) The absence of FtsH metalloprotease activity causes overexpression of the ©"-controlled pbpE gene, resulting in filamentous growth of Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 185 (3), 973-982.

55. Ito K., Akiyama Y. (2005) Cellular functions, mechanism of action and regulation of FtsH protease. Annu. Rev. Microbiol., 59, 211-231.

56. Nixon P.J., Barker M., Boehm M., Vries R., Komenda J. (2004) FtsH-mediated repair of the photosystem II complex in response to light stress. J. Exp. Bot., 56 (411), 357-363.

57. Anilkumar G., Srinivasan R., Anand S.P., Ajitkumar P. (2001) Bacterial cell division protein FtsZ is a specific substrate for the AAA family protease FtsH. Microbiology, 147, 516-517.

58. Adam Z., Ostersetzer O. (2001) Degradation of unassembled and damaged thylakoid proteins. Biochem. Soc. Transact., 29 (4), 427-430. {•

59. Yu F., Park S., Rodermel S.R. (2005) Functional redundancy of ^FtsH metalloproteases in thylakoid membrane complexes. Plant Physiol., (138),* 1957-1966.

60. Akiyama Y., Ito K. (2000) Roles of multimerization and membrane association in the Jproteolytic functions of FtsH (HflB). EMBO J., 19 (15), 3888-3895.

61. Krzywda S., Brzozowski A.M., Verma C., Karata K., Ogura Т., Wilkinson A.J. (2002) The crystal structure of the AAA domain of the ATP-dependent protease FtsH of Escherichia coli at 1.5 A4resolution. Structure, 10(8), 1073-1083.

62. Niwa H., Tsuchiya D., Makyio H., Yoshida M., Morikawa K. (2002) Hexameric ring structure of the ATPase domain of the membrane-integrated metalloprotease FtsH from Thermus thermophilus HB8. Structure, 10(10), 1415-1423.

63. Bieniossek C., Schalch Т., Bumann M., Meister M., Meier R., Baumann^ U. (2006) The molecular architecture of the metalloprotease FtsH. PNAS; 103 (9), 3066-3071.

64. Yamada-Inagawa Т., Okuno Т., Karata K., Yamanaka K., Ogura T. (2003) Conserved pore residues in the AAA protease FtsH are important for proteolysis and its coupling to ATP hydrolysis. J. Biol. Chem., 278(50), 50182-50187.

65. Shotland Y., Shifrin A., Ziv Т., Teff D., Koby S., Kobiler O., Oppenheim-A.B. (2000) Proteolysis of bacteriophage X CII by Escherichia coli FtsH (HflB). J. Bacteriol., 182 (11), 3111-3116.

66. Chiba S., Akiyama Y., Ito K. (2002) Membrane protein degradation by FtsH can be initiated from either end. J. Bacteriol., 184 (17), 4775-4782.

67. Tomoyasu Т., Arsene F., Ogura Т., Bukau B. (2001) The С terminus of a32 is not essential for degradation by FtsH. J. Bacteriol., 183 (20), 5911-5917.

68. Chiba S., Akiyama Y., Mori H., Matsuo E., Ito K. (2000) Length recognition at the N-terminal tail for the initiation of the FtsH-mediated proteolysis. EMBO, 1 (1), 47-52.

69. Wang J., Song J.J., Franklin, M.C., Kamtekar S., Im Y.J. (2001) Crystal structures of the HslVU peptidase-ATPase complex, reveal an ATP-dependent proteolysis mechanism. Structure, 9, 177-84.

70. Akiyama Y., Ito K. (2003) Reconstruction of membrane proteolysis by FtsH. J. Biol. Chem., 278 (20), 18146-18153.

71. Blaszczak A., Georgopoulos C., Liberek K. (1999) On the mechanism of FtsH-dependent degradation of the a32 transcriptional regulator of Escherichia coli and the role of the DnaK chaperone machine. Mol. Microbiol., 31 (1), 157-166.

72. Urech C., Koby S., OppenheimA.B., Muenchbach M., Hennecke H., Narberhaus F. (2000) Differential degradation of Escherichia coli o32 and Bradyrhizobium japonicum RpoH factors by the FtsH protease. Eur. J. Biochem., 267, 4831-4839.

73. Hinnerwisch J., Reid B.G., Fenton W.A., Horwich A.L. (2005) Roles of the N-domains of the ClpA unfoldase in binding substrate proteins and in stable complex formation with the CIpP protease. J. Biol. Chem., 280 (49), 40838-40844.

74. Guo F., Maurizi M.R., Esser L., Xia D. (2002) Crystal structure of ClpA, an HsplOO chaperone and regulator of ClpAP protease. J. Biol. Chem., 277 (48), 46743-46752.

75. Kim D.Y., Kim K.K. (2003) Crystal structure of ClpX molecular chaperone from Helicobacter pylori. J. Biol. Chem., 278 (50), 50664-50670.

76. Wang J., Hartling J.A., Flanagan J.M. (1998) Crystal structure determination of Escherichia coli CIpP starting from an EM-derived mask. J. Struct. Biol., 124 (2-3), 151-163.

77. Singh S.K., Rozycki J., Ortega J., Ishikawa Т., Lo J., Steven A.C., Maurizi M.R. (2001) Functional domains of the ClpA and ClpX molecular chaperones identified by limited proteolysis and deletion analysis. J. Biol. Chem., 276 (31), 29420-29429.

78. Burton BM, Baker ТА. (2005) Remodeling protein complexes: insights from the AAA+ unfoldase ClpX and Mu transposase. Prot. Sci., 14 (8), 1945-1954.

79. Joshi S.A., Hersch G.L., Baker T.A., Sauer R.T. (2004) Communication between ClpX and CIpP during substrate processing and degradation. Nat. Struct. Mol. Biol., 11 (5), 404-411.

80. Hoskins J.R., Wickner S. (2006) Two peptide sequences can function cooperatively to facilitate binding and unfolding by ClpA and degradation by ClpAP. PNAS, 103 (4), 909-914.

81. Burton R.E., Baker T.A., Sauer R.T. (2003) Energy-dependent degradation: linkage between ClpX-catalysed nucleotide hydrolysis and protein substrate processing. Prot. Sci., 12, 893-902.

82. Flynn J.M., Levchenko I., Seidel M., Wickner S.H., Sauer R.T., Baker T.A. (2001) Overlapping recognition determinants within the ssrA degradation tag allow modulation of proteolysis. PNAS, 98 (19), 10584-10589.

83. Bolon D.N., Grant R.A., Baker T.A., Sauer R.T. (2004) Nucleotide-dependent substrate handoff from the SspB adaptor to the AAA+ ClpXP protease. Mol. Cell, 16 (3), 343-350.

84. Flynn J.M., Levchenko I., Sauer R.T., Baker T.A. (2004) Modulating substrate choice: the SspB adaptor delivers a regulator of the extracytoplasmic-stress response to the AAA+ protease ClpXP for degradation. Genes Dev., 18 (18), 2292-2301.

85. Singh S.K., Grimaud R., Hoskins J.R., Wickner S., Maurizi M.R. (2000) Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases ClpXP and ClpA. PNAS, 97 (16), 8898-8903.

86. Seong I.S., Kang M.S., Choi M.K., Lee J.W., Koh O.J., Wang J., Eom S.H., Chung C.H. (2002) The C-terminal tails of HslU ATPase act as a molecular switch for activation of HslV peptidase. J. Biol. Chem., 277 (29), 25976-25982.

87. Yoo S.J., Shim Y.K., Seong I.S., Seol J.H., Kang M.S., Chung С H. (1997) Mutagenesis of two N-terminal Thr and five Ser residues in HslV, the proteolytic component of the ATP-dependent HslVU protease. FEBSLett., 412 (1), 57-60.

88. Seong I.S., Oh J.Y., Yoo S.J., Seol J.H., Chung C.H. (1999) ATP-dependent degradation of SulA, a cellгdivision inhibitor, by the HslVU protease in Escherichia coli. FEBS Lett., 456, 211-214.

89. Kuo M.S., Chen K.P., Wu W.F. (2004) Regulation of RcsA by the ClpYQ (HslUV) protease in Escherichia coli. Microbiology, 150, 437-446.

90. Kang M.S., Lim B.K., Seong I.S., Seol J.H., Tanahashi N., Tanaka K., Chung C.H. (2001) The ATP-dependent CodWX (HslVU) protease in Bacillus subtilis is an N-terminal serine protease. EMBO J., 20 (4), 734-742.

91. Baumaister W., Walz J., Zuhl F., Seemuller E. (1998) The Proteasome: paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell, 92, 367-380.

92. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H.D., Huber R. (1997) Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature, 386 (6624), 463-471.

93. Unno M., Mizushima Т., Morimoto Y., Tomisugi Y., Tanaka K., Yasuoka N., Tsukihara T. (2002) The structure of the mammalian 20S proteasome at 2.75 A resolution. Structure, 10 (5), 609-618.

94. Orlowski M. (1990) The multicatalytic proteinase complex, a major extralysosomal proteolytic system. Biochemistry, 29 (45), 10289-10297.

95. Heinemeyer W., Fischer M., Krimmer Т., Stachon U., Wolf D.H. (1997) The active sites of the eukaryotic 20S proteasome and their involvement in subunit precursor processing. J. Biol. Chem., 272 (40), 25200-25209.

96. Arendt C.S., Hochstrasser M. (1997) Identification of the yeast 20S proteasome catalytic centers and subunit interactions required for active-site formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (14), 7156-7161.

97. Seemuller E., Lupas A., Stock D., Lowe J., Huber R., Baumeister W. (1995) Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science, 268 (5210), 579-582.

98. Kisselev A.F., Akopian T.N., Castillo V., Goldberg A.L. (1999) Proteasome active sites allosterically regulate each other, suggesting a cyclical bite-chew mechanism for protein breakdown. Mol. Cell, 4 (3), 395-402.

99. Kanemori M., Yanagi H., Yura T. (1999) The ATP-dependent HslVU/ClpQY protease participates in turnover of cell division inhibitor SulA in Escherichia coli. J. Bacterial., 181(12), 3674-3680. Г

100. Wilkinson K.D., Ventii K.H., Friedrich K.L., Mullally J.E. (2005) The ubiquitin signal: assembly, recognition and termination. EMBO rep., 6 (9), 815-820.

101. Hershko A., Ciechanover A., Rose I.A. (1981) Identification of the active amino acid residue of the polypeptide of ATP-dependent protein breakdown. J. Biol. Chem., 256 (4), 1525-1528.

102. Chau V., Tobias J.W., Bachmair A., Marriott D., Ecker D.J., Gonda D.K., Varshavsky A. (1989) Ubiquitin chain is confined to specific lysine in a targeted short-lived protein. Science, 243 (4898), 15761583.

103. Hershko A. (1996) Lessons from the discovery of the ubiquitin system. Trends Biochem. Sci., 21 (II), 445-449.

104. Hershko A., Ciechanover A. (1992) The ubiquitin system for protein degradation. Ann. Rev. Biochem., 61, 761-807.

105. Rogers S., Wells R., Rechsteiner M. (1986) Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science, 234 (4774), 364-368.

106. Rechsteiner M., Rogers S.W. (1996) PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem. Sci., 21 (7), 267-271.

107. Glotzer M., Murray A.W., Kirschner M.W. (1991) Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature, 349 (6305), 132-138.

108. Tu G.F., Reid G.E., Zhang J.G., Moritz R.L., Simpson R.J. (1995) C-terminal extension of truncated recombinant proteins in Escherichia coli with a lOSa RNA decapeptide. J. Biol. Chem., 270 (16), 93229326.

109. Keiler K.C., Silber K.R., Downard K.M., Papayannopoulos I.A., Biemann K., Sauer R.T. (1995) C-terminal specific protein degradation: activity and substrate specificity of the Tsp protease. Prot. Sci., 4 (8), 1507-1515.

110. Hershko A., Ciechanover A. (1998) The ubiquitin system. Ann. Rev. Biochem , 67, 425-479.

111. Lee A.Y., Hsu C.H., Wu S.H. (2004) Functional domains of Brevibacillus thermoruber Lon protease for oligomerization and DNA binding. J. Biol. Chem., 279 (33), 34903-34912.

112. Chung, C.H., Goldberg, A.L. (1981) The product of the lon (capR) gene in Escherichia coli is the ATP-dependent protease, protease La. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 4931-4935.

113. Goldberg, A.L., Moerschell, R.P., Chung, C.H., Maurizi, M.R. (1994) ATP-dependent protease La (lon) from Escherichia coli. Methods Enzymol., 244, 350-375. V

114. Rivett, A.J. (1989) High molecular mass intracellular proteases. Biochem. J., 263, 625-633.

115. Besche H., Zwickl P. (2004) The Thermoplazma acidophilum Lon protease has a Ser-Lys dyad active site. Eur. J. Biochem., 271 (22), 4361-4365. \

116. Park S.C., Jia В., Yang J.K., Van D.L., Shao Y.G., Han S.W., Jeon Y.J., Chung C.H., Cheong G.W. (2006) Oligomeric structure of the ATP-dependent protease La (Lon) of Escherichia coli. Mol. Cells, 21 (1), 129-134. i

117. Gottesman S. (1996) Proteases and their targets in Escherichia coli. Ann. Rev. Genet., 30,465-506.

118. Ротанова T.B. (2001) Энергозависимый селективный внутриклеточный протеолиз. Строение, активные центры и специфичность АТР-зависимых протеиназ. Вопросы Мед. Химии, 44 (I), 3-19.

119. Tsilibaris V., Maenhaut-Michel G., Melderen L. (2006) Biological roles of the Lon ATP-dependent protease. Res. Microbiol., 157, 701-713.

120. NishiiW., Suzuki Т., Nakada M,, Kim Y.T., Muramatsu Т., Takahashi K. (2005) Cleavage mechanism of ATP-dependent Lon protease toward ribosomal S2 protein. FEBS Lett., 579, 6846-6850.

121. Vineyard D., Patterson J., Berdis A.J., Lee I. (2005) Monitoring the timing of ATP hydrolysis with activation of peptide cleavage in Escherichia coli Lon by transient kinetics. Biochemistry, 44, 1671-1682'.

122. Vineyard D., Patterson J., Lee I. (2006) Single-turnover kinetic experiments confirmthe existence of high- and low-affinity ATPase sites in Escherichia coli Lon protease. Biochemistry, 45, 4602-4610.

123. Fu G.K., Smith M.J., Markovitz D.M. (1997) Bacterial protease Lon is site-specific DNA-binding protein./. Biol. Chem., 272 (1), 534-538.

124. Liu Т., Lee I., Ondrovicova G., Kutejova E., Suzuki C. (2004) DNA and RNA binding by the mitochondrial Lon protease is regulated by nucleotide and protein substrate. J. Biol. Chem., 279 (14), 13902-13910.

125. Nomura K., Kato J:, Takiguchi N., Ohtake H., Kuroda A. (2004) Effect of inorganic polyphosphate on the proteolytic and DNA-binding activities of Lon in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 279 (33), 3440634410.

126. Kuroda A., Nomura K., Ohtomo R., Kato J., Ikeda Т., Takiguchi N., Ohtake H., KornbergrA. (2001) Role of inorganic polyphosphate in promoting ribosomal protein degradation by the Lon protease in E. coli. Science, 293, 705-708.

127. Bota D.A., Davies KJ. (2002) Lon protease preferentially degrades oxidized mitochondrial:aconitase by an ATP-stimulated mechanism. Nat. Cell Biol., 4, 674-680.

128. Bota D.A., Van Remmen H., Davies K.J. (2002) Modulation of Lon protease activity and aconitase turnover during aging and oxidative stress. FEBS Lett., 532, 103-106.

129. Waxman L., Goldberg A.L. (1985) Protease La, the lon gene product, cleaves specific fluorogenic peptides in an ATP-dependent reaction. / Biol. Chem., 260, 12022-12028.

130. Amerik A.Yu., Antonov V.K., Gorbalenya A.E., Kotova S.A., Rotanova T.V., Shimbarevich E.V. (1991) Site-directed mutagenesis of La protease. A catalytically active serine residue. FEBS Lett., 287, 211-214.

131. Starkova N.N., Koroleva E.P., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova T.V. (1998) Mutations in the proteolitic domain of Escherichia coli protease Lon impair the ATPase activity of the enzyme. FEBS Lett., 422 (2), 218-220.

132. Paetzel M., Dalbey R.E. (1997) Catalytic hydroxyl/amine dyads within serine proteases. Trends. Biochem. Sci., 22,28-31.

133. Corey D.R:, Craik C.S. (1992) An investigation into the minimum requirements for peptide hydrolysis by mutation ofthe catalytic triad of trypsin. J. Am. Chem. Soc., 114,1784-1790.

134. Liao D., Breddam K., Sweet R.M., Bullock Т., Remington S.J. (1992) Refined atomic model of wheat serine carboxypeptidase II at 2.2-A resolution. Biochemistry, 31, 9796-9812.

135. Ротанова T.B., Цирульников К.Б., Мельников Э.Э. (2003) Каталитическая диада Ser Lys в активном центре АТР-зависимой Ьоп-протеиназы Escherichia coli. Биоорган. Химия-, 29 (1), 97-99.

136. Maurizi M.R. (1987) Degradation in vitro of bacteriophage A. N protein by Lon protease from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 262 (6), 2696-2703.

137. Lee I., Berdis A.J. (2001) Adenosine triphosphate-dependent degradation of a fluorescent X N substrate mimic by Lon protease. Anal. Biochem., 291, 74-83.

138. Kuehner F„ Costa L.T., Bisch P.M., Thalhammer S., Heckl W.M., Gaub H.E. (2004) LexA-DNA bond strength by single molecule forces. Biophys. J., 87, 2683-2690.

139. Barret A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. (1998) Handbook of proteolytic enzymes. Acad. Press.

140. Neher S.B., Flynn J.M., Sauer R.T., Baker T.A. (2003) Latent ClpX-recognition signals ensure LexA destruction after DNA damage. Genes Dev., 17, 1084-1089.

141. Luo Y., Pfuetzner R.A., Mosimann S., Paetzel M., Frey E.A., Cherney M., Kim В., Little J.W., Strynadka N.C.J. (2001) Crystal structure of LexA: a conformational switch for regulation of self-cleavage. Cell, 106, 585-594.j

142. Ghosh K., Pal A., Chattopadhyaya R. (2004) pH-dependent autocleavage of Я repressor occurs in the operator-bound form: characterization of Я repressor autocleavage. Biochem. J., 379, 325-330.

143. McCabe B.C., Pawlowski D.R., Koudelka G.B. (2005) The bacteriophage 434 repressor dimer preferentially undergoes autoproteolysis by an intramolecular mechanism. J. Bacteriol., 187 (16), 56245630.

144. Dev I.K., Ray P.H., Novak P. (1990) Minimum substrate sequence for signal peptidase I of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 265 (33), 20069-20072.

145. Dalbey R.E., Lively M.O., Bron S., van Dijl J.M. (1997) The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases. Protein Sci., 6, 1129-1138.

146. Von Heijne G. (1986) A new method for predicting signal sequence cleavage sites. Nucleic Acids Res., 14, 4683-4690.

147. Fikes J.D., Barkocy-Gallagher G.A., Klapper D.G., Bassford P.G. (1990) Maturation of Escherichia coli maltose-binding protein by signal peptidase I in vivo. J. Biol. Chem., 265 (6), 34173423.

148. Paetzel M., Dalbey R.E., Strynadka N.C. (1998) Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a p-lactam inhibitor. Nature, 396, 186-190.

149. Paetzel M., Karla A., Strynadka N.C.J., Dalbey R.E. Signal peptidases. (2002) Chem. Rev., 102, 45494579.

150. Paetzel M., Goodall J.J., Kania M., Dalbey R.E., Page M.G. (2004) Ciystallographic and biophysical analysis of a bacterial signal peptidase in complex with a lipopeptide-based inhibitor. J. Biol.Chem., 279' (29), 30781-30790.

151. Carlos J.L., Klenotic P.A., Paetzel M., Stiynadka N.C., Dalbey R.E. (2000) Mutational evidence of transition state stabilization by serine 88 in Escherichia coli type I signal peptidase. Biochemistry, 39, 7276-7283.

152. Bilgin N., Lee J.I., Zhu H., Dalbey R.E., von Heijne G. (1990) Mapping of catalytically important domains in Escherichia coli leader peptidase. EMBO J., 9 (9), 2717-2722.

153. Black M.T., Bruton G. (1998) Inhibitors of bacterial signal peptidases. Curr. Pharm. Design., 4, 133154. f

154. Keiler K.C., Sauer R.T. Identification of active site residues of the Tsp protease. (1995) J. Biol. Chem., 270 (48), 28864-28868.

155. Inagaki N., Maitra R., Satoh K., Pakrasi H.B. (2001) Amino acid residues that are critical; for in vivo catalytic activity of CtpA, the carboxyl-terminal processing protease for the D1 protein of photosystem II. J. Biol. Chem., 276 (32), 30099-30105.

156. Yamamoto Y., Inagaki N., Satoh K. (2001) Overexpression and characterization of carboxyl-terminal processing protease for precursor D1 protein. J. Biol. Chem., 276 (10), 7518-7525.

157. Birghan C., Mundt E., Gorbalenya A.E. (2000) A non-canonical Lon proteinase lacking the ATPase domain employs the Ser-Lys catalytic dyad to exercise broad control over the life cycle of a double-stranded RNA virus. EMBO J., 19 (1), 114-123.

158. Lejal N., da Costa В., Huet J., Delmas B. (2000) Role of Ser-652 and Lys-692 in the protease activity of infectious bursal disease virus VP4 and identification of its substrate cleavage sites. J. Gen. Virol., 81 (4), 983-992.

159. Ротанова T.B. (1999) Структурно-функциональные особенности АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорган. Химия, 25 (12), 883-891.

160. Goldberg A.L. (1992) The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells. Eur. J. Biochem., 203, 9-23.

161. Petit S., Lejal N., Huet J., Delmas B. (2000) Active residues and viral substrate cleavage sites of the protease of the birnavirus infectious pancreatic necrosis virus. J. Virol., 74 (5), 2057-2066.

162. Америк А.Ю., Антонов B.K., Остроумова Н.И., Ротанова Т.В., Чистякова Л.Г. (1990) Клонирование, структура и экспрессия полноразмерного гена lon Escherichia coli, кодирующего АТР-зависимую La-протеинэзу. Биоорган. Химия, 16 (7), 869-880.

163. Ротанова Т.В., Котова С.А., Америк А.Ю., Лыков, И.П., Гинодман Л.М.', Антонов В.К. (1994) АТР-зависимая протеиназа La из Escherichia coli. Биоорг. Химия, 20 (2), 114-125.

164. Patterson J., Vineyard D., Thomas-Wohlever J., Behshad R., Burke M., Lee I. (2004) Correlation of an adenine-specific conformational change with the ATP-dependent peptidase activity of Escherichia coli Lon: Biochemistry, 43, 7432-7442.

165. Васильева O.B., Мартынова Н.Ю., Потапенко H.A., Овчинникова Т.В. (2004) Выделение и характеристика фрагментов АТР-зависимой Lon-протеиназы Е. coli, полученных ограниченным протеолизом. Биоорг. Химия, 30 (4), 341-349.

166. Биохимическая термодинамика под ред. Блюменфельда Л.А. (1982) "Мир", М., 95-104.

167. Li М., Rasulova F., Melnikov Е.Е., Rotanova T.V., Gustchina A., Maurizi M.R., Wlodawer A. (2005) Crystal structure of the N-terminal domain of E. coli Lon protease. Protein Sci., 14 (11), 2895-^900.

168. JeruzalmiD., O'Donnell M., KuriyanJ. (2001) Crystal structure of the processivity clamp loader gamma (y) complex of E. coli DNA polymerase III. Cell, 106, 429-441.

169. Rudyak S.G., Brenowitz M., Shrader Т.Е. (2001) Mg2+-linked oligomerization modulates the catalytic activity of the Lon (La) protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry, 40, 9317-9323.

170. Stahlberg H., Kutejova E., Suda K., Wolpensinger В., Lustig A., Schatz G., Engel A., Suzuki C.K. (1999) Mitochondrial Lon of Saccharomyces cerevisiae is a ring-shaped protease with.seven flexible subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 6787-6790.

171. Мельников Э.Э., Цирульников-К.Б., Ротанова Т.В. (2000) Сопряжение протеолиза и гидролиза АТР при функционировании Lon-протеиназы. I. Кинетические аспекты гидролиза АТР. Биоорган. Химия, 26 (7), 530-538.

172. Bradford М.М. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 272, 248-254.

173. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature, 227, 680-685.

174. Bencini D.A., Wild J.R., O'Donovan G.A. (1983) Linear one-step assay for the determination of ortophosphate. Anal. Biochem., 132,254-258.

Информация о работе

Андрианова, Анна Говардовна
кандидата химических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурно-функциональное исследование изолированных доменов АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы