Структурная организация и функционирование АТР-зависимой Lon-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus

Маховская, Оксана Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная организация и функционирование АТР-зависимой Lon-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация и функционирование АТР-зависимой Lon-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков ММ ШЕМЯКИНА И ЮА ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

МАХОВСКАЯ ОКСАНА ВЛАДИМИРОВНА

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АТР-ЗАВИСИМОЙ Ьоп-ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ АгсИаеофЬш /и^Миэ

03 00 04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ООЗ175ЭЬо

МОСКВА -

2007

003175968

Работа выполнена в лаборатории химии протеолитических ферментов Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Научный руководитель доктор химических наук

Ротанова Татьяна Васильевна

Официальные оппоненты доктор химических наук

Руденская Галина Николаевна

кандидат химических наук Зинченко Алексей Алексеевич

Ведущая организация ГУ НИИ биомедицинской химии им В Н Ореховича РАМН

Защита состоится «14» ноября 2007 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 002 019 01 при Институте биоорганической химии им академиков ММ ШемякинаиЮА Овчинникова РАН по адресу 117997 ГСП-7,МоскваВ-437, ул Миклухо-Маклая 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН

Автореферат разослан «13» октября 2007 г

Заместитель председателя диссертационного совета член-корреспондент РАН, доктор химических наук

В М Липкин

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Эукариоты, бактерии и археи представляют три высших таксономических группы (домена), которые охватывают все известные формы жизни на Земле Архебактерии были признаны в качестве отдельной филогенетической группы менее, чем 30 лет назад По мере накопления сведений о молекулярной структуре и организации геномов архей стало очевидно, что эта группа организмов обладает структурными, физиологическими, биохимическими и генетическими характеристиками, которые значительно отличают ее от бактерий и эукариот Уникальные особенности архей вызвали направленный интерес к изучению биохимических процессов, протекающих в клетках данных микроорганизмов При этом исследование механизмов протеолитической деградации не является исключением.

Механизмы деструкции белков играют ключевую роль в поддержании сохранности клеточного протеома, обеспечивая удаление нежелательных или опасных белков, а также быструю и адекватную регуляцию биологического ответа на изменяющиеся условия Деградацию белков в клетках бактерий, эукариот и архебактерий осуществляют АТР-зависимые протеиназы, относящиеся к суперсемейству ААА+-белков (АТР-азы с альтернативными активностями)

В последнее время был достигнут значительный прогресс в понимании того, каким образом ААА+-протеиназы узнают свои специфические мишени, осуществляют деградацию белков и разрушение макромолекулярных комплексов Полнее всего механизмы и регуляция АТР-зависимой деградации белков исследованы на примере бактерий и эукариот

В клетках архебактерий к настоящему времени обнаружено две АТР-зависимые протеолитические структуры - цитозольная протеасома и мембраносвязанная Ьоп-протеиназа К настоящему времени информация о структуре и свойствах этих «протеолитических машин» весьма ограничена Решение проблемы механизма утилизации метаболической энергии на основных этапах АТР-зависимого протеолиза, а также выявление принципов селективного узнавания ферментами из архей субстратов-мишеней и их направленной доставки к протеолитическим центрам представляет актуальную научную задачу

Цели и задачи работы Целью работы явилось структурно-функциональное исследование АТР-зависимой Ьоп-протеиназы из термофильной архебактерии Archaeoglobus fiilgidus (A/Lon). При этом были сформулированы следующие задачи

1 Разработать методику выделения рекомбинантной АДюп-протеиназы и исследовать общие энзиматические свойства фермента

2 Идентифицировать каталитические остатки протеолитического центра Д/Ьоп-нротсиназы и выявить групповую принадлежность фермента в классификации пептидгидролаз MEROPS.

3 Получить и охарактеризовать мутантные, модифицированные и укороченные формы A/Lon-протеиназы с целью выявления особенностей функционирования протеолитических и пептидгидролазных центров, а также для выяснения условий реализации процессивной деградации субстратов

4 Определить пространственную структуру A/Lon и/или изолированных доменов фермента

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые выделена рекомбинантная форма термостабильной Д/Ьоп-протеиназы, принадлежащая к неизученной и малочисленной группе LonB-протеиназ архебактерий Показано, что Lon-протеиназы архей представляют отдельное подсемейство (В) в семействе Ьоп-протеиназ и отличаются от классических LonA-протеиназ бактерий и эукариот особенностями окружения каталитических остатков пептидгидролазного центра и общей архитектурой молекулы Дана энзиматическая характеристика A/Lon, получены и частично охарактеризованы четыре мутантные формы фермента с заменами аминокислот в области пептидгидролазного активного центра Доказано, что в активном центре ЬопВ-протеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys Разработаны условия ограниченного протеолиза A/Lon а-химотрипсином, приводящие к образованию индивидуального протеолитического домена фермента (Р-домен) В совместной работе с лабораторией кристаллографии макромолекул (Национальный институт рака, Фредерик, США) установлена пространственная структура Р-домена А/Lou Показано, что в изолированном виде этот домен находится в неактивной конформации как в растворе, так и в кристалле

Обнаружено, что делеция трансмембранного домена A/Lon-протеиназьт приводит к активации протеолитической функции, сопровождающейся автолизом модифицированного фермента в процессе экспрессии in vivo с образованием, аР-фрагмента, включающего а-спирализованный и протеолитический домены A/Lon Образование полноразмерных форм A/Lon, лишенных трансмембранного домена, возможно только при одновременной инактивации протеолитического центра. Сделано заключение о том, что термофильность A/Lon определяется регуляцией активности Р-домена фермента, опосредованной структурой его ААА+-модуля

Показано, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза служат гидролиз АТР и олигомерность фермента

В целом, представленная работа является первым широкомасштабным исследованием свойств Lon-протеиназы подсемейства LonB Полученные результаты могут быть использованы при дальнейшем изучении закономерностей функционирования АТР-зависимых Ьоп-протеиназ

Апробация работы и публикации Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях. XIV зимняя международная молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), V и VI Симпозиумы «Химия

протеолитических ферментов» (Москва, 2002, 2007), I и П Международные конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004, 2007), VII Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова, (Москва, 2004), VII Международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (Москва — Суздаль, 2004), VI и VII Международные конференции по ААА-белкам (Сеггау, 2005, Селенчестер, 2007), VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва - Пущино, 2006), Ш Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Пущино, 2007)

По материалам диссертации опубликовано 16 работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 страницах, содержит 41 рисунок и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 242 наименования, и приложения, содержащего 7 таблиц и 3 рисунка

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Особенности строения и классификация Ьоп-протеиназ

Семейство АТР-зависимых Lon-протеиназ, как было установлено ранее в нашей лаборатории, относится к серин-лизиновым пептидгидролазам и составляет самостоятельный клан SJ (П> S16) в классификации пептидаз MEROPS Эволюционно-генетический анализ Lon-щютеиназ приводит к разделению этих ферментов на подсемейства Вместе с тем, такое разделение с необходимостью следует и из детального анализа первичных структур известных Ьоп-протеиназ, представляемого в настоящей работе

Сопоставление последовательностей в окружении активных остатков Ser и Lys в протеолитических доменах АТР-зависимых Ьоп-протеиназ из различных источников позволяет заключить, что семейство bon образовано двумя подсемействами, большим ЬопА (около 80 % Ьоп-протеиназ) и меньшим ЬопВ Основанием для такого вывода служит значительное различие между консенсусными фрагментами последовательностей ЬопА и ЬопВ протеиназ, включающими каталитические остатки пептидгидролазного центра (рис. 1)

Представленные фрагменты ЬопА-протеиназ содержат 20 строго консервативных остатков (а о ), а ЬопВ - 15. Строго консервативными для всего пула ферментов остаются только 10 а о кроме активных Ser и Lys в обоих подсемействах консервативны остатки Gly и Ala из ближайшего окружения каталитического Ser (положения -2 и +1, соответственно), а также остатки Ser (+11), Thr (+25) и Gly (+26, +32, +38 и +39) (рис 1)

ь'фклрхс.адркобр з абх ххх га фф зхфххххх

x 4>хфх 1гххф есьзазх 5лхххффзафххфр {)

+20 +30 т4С

ХХХФЛМТОЕФХЬХеХОХХФеОФКЕКХФААХЖХ хйхфафтозфхххсхфххфовфхххфеафххф с

Рис. 1. Консепсусные фрагменты последовательностей ТлпА- и ЬопВ-протеинам, включающие каталитически активные остатки серина и лизина (отмечены *) Ф - остатки гидрофобных аминокислот; X - остатки любых аминокислот; жирным шрифтом выделены абсолютно консервативные остатки, курсивом — остатки, консервативность которых превышает 90%.

LonA LonB

Сравнительный анализ полных аминокислотных последовательностей общего пула Lon-протеиназ приводит к заключению о том, что разделение семейства З.оп на два подсемейства отражает не только различие протеолитических центров ферментов, но также и различие их АТР-азных (А-) доменов и общей архитектуры молекул (рис. 2).

В отличие от Lon-протсиназ А-типа (классический объект исследования - фермент из Е. coli) LonB - пр отеиназы не имеют пролонгированно[О (более 250 а.о.) иекаталитического N-концевого домена, но содержат трансм.ембранный домен (ТМ, около 100 а.о,), являющийся инсерцией в АТР-азном домене фермента. Протеолитические домены LonB-

Мотины Уолкера: А

GPPGVGKT

LFLLOE KDGPS'AG

lon А

(ЮП)ХК'ХФ

^ N-домен

ААА' - модуль А-дом ем

Р-до^ен

GXPG VGKS VLFJDB Ф{Е/Р)вР S*A{£/T) (ТЩХК'ФЕ

lons

tT-

Wlv

SjNüWij

ушШ

AAJC - модуль А-домсн

Р-домсн

Рис- 2, Схема строения LonA и LonB-протеиназ. 4

протеиназ несколько превышают по размеру Р-домены Lon-протеиназ подсемейства А Нуклеотид-связывающие (oc/ß) домены у LonA-протеиназ, в целом, больше, чем у LonB (за счет их протяженных N-концевых областей) a-Домены большинства LonB-протеиназ (за исключением ферментов из sp Methanococcus) содержат 118 а о , в то время как а-домены LonA-протеиназ имеют значительно различающиеся размеры (от 88 до 175 а о )

Наряду с тем, что LonA-протеиназы являются классическим объектом энзимологии АТР-зависимых протеиназ, начало исследования которых было положено в 1970 гг в работах по изучению фермента из Е coli, LonB из архебактерий - новый тип Lon-протеиназ необычного строения, представление о которых появилось лишь несколько лет назад, незадолго до начала наших исследований фермента из Archaeoglobus fiilgidus В связи с этим исследование свойств и функций LonB-протеиназ представляет актуальную задачу

2. Общая энзимологическая характеристика A/Lon-протеиназы

2.1. Экспрессия гена Ion Archaeoglobus fulgidus (DSM4304) в Escherichia coli и выделение AfLon-протеиназы

Клонирование гена lonAf было осуществлено в Национальном институте рака и привело к получению двух IPTG-индуцибельных конструкций, рЕТ24а-/онА/ и pET28b(+>-/onA/-NHis. предназначенных для экпрессии в (ОЕЗ)-штаммах Е coli Структурная часть гена lonAf кодирует белок, состоящий из 621 а о с молекулярной массой 68 2 кДа. В конструкции ген содержит последовательность, приводящую к модификации N-концевой части белка 20-членным олигопептидом, включающим шесть остатков His и специфический сайт расщепления тромбином.

На начальном этапе исследования были изучены условия ферментации .A/Lon-протеиназы и показано, что экспрессия генов возможна лишь в специальных штаммах Е coli, лишенных дефицита редких тРНК

В ходе выделения A/Lon было установлено, что в отсутствие NHls-модификации белок образуется в растворимой форме, однако его получение в гомогенном виде, несмотря на попытки использования разнообразных сорбентов и многочисленных процедур, включающих проведение хроматографии в присутствии детергентов и денатурирующих агентов (мочевина, гуанидин-гидрохлорид), а также термопреципитацию, оказалось проблематичным Наилучшие результаты были получены при проведении хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11 (рис 3, 1), дальнейшие стадии очистки не оказались столь эффективными По результатам гель-фильтрации на Sephacryl S300, белок представлял собой ассоциат с молекулярной массой не менее 1000 кДа

Результат экспрессии pET28b(+)-/onA/-NH,s оказался неожиданным, поскольку Nms-модифицированная A/Lon-протеиназа практически полностью была представлена нерастворимой формой (NHls-4/Lon-ins, insoluble)

кДа Г16 66

25 ■

Рис. 3. Препараты А/1 „он-проте иназ ы (кйь-электрофорез в 12® ПААГ-Я05): 1 - /\Д,он, 2 - Нн^-Л^оп-ло! (растворимая форма Кив-ЛД-ои), 3 — N»-4/11011-1™ (нерастворимая форма Кнв-ЛД.оп).

!К 14

Ж;

Содержание цепе кого белка в бесисточнОм экстракте (Кн^ -А/Ьоп-ко1. 5о1и Ые) было н езначител ьжым и не увеличивалось при понижении температуры индукции. Тем не менее, обе формы Мн^-Д/Ьо]! удалось .выделить при использовании мс-талл-х ел ахи ой хроматографии, позволившей в итоге повысить качество конечного препарата белка (рис. 3, 2 и 3).

Согласно результатам гель-фильтрация на 5ер1шсгу1 в300 Г^-АД-ои-пр 01 ей и аза. была значительно менее ассоциирована но сравнению с ферментом, содержащим кем о дкфнциро»анкук> 1чт-хотщевую часть, однако представлена различными олигомерамк. Белок растворимой фракции лизата клеток (МК1.-Д/Ъо11-5о1) оказался тетрамером, но полученный из нерастворимой формы и прошедший стадии солюбилизации и рефолдинга -октамером

Выход немодифицированной формы А/Ьоп составил - 40 мг, Г^ньг Д/Ьсш-йо! — 1 мг, а Ыни-А/Ьоп-тз — 20 мг из 10 г клеточкой биомассы. Существенные потери белка в ходе выделения били вызваны нестабильностью его растворов и значительной преципитацией как при хранении, так и при концентрировании. Полученные препараты А]Ъоп-протеиназы были частично охарактеризованы в сравнительном варианте энзиматических тестов. Наиболее гомогенная форма фермента МНи-Л/Ьол-ть (далее - Нщя-Д/1.оп) была исследована преимущественно.

2.2. Протеолитическая активность Л/1мп

Выделенные препараты Л/Ьол-протеиказы способны к гидролизу белкового субстрата ((3-казеин) при повышенной температуре. Сравнительное исследование действия эффекторов (нуклеотидов и ионов магния), проведенное на примере Ы-немодкфицированной А/Ьоп (рис. 4), показало, что реализация иротеолитической активности возможна только при одновременном присутствии ЛТР и ионов магния. Особенностью протекания реакции оказалось отсутствие высокомолекулярных продуктов гидролиза

1, 2.......3 4 5 в 7 S

ДЯ.ОП > • ^г^ШЩЕС^Й^".-^®^1^"

Рис. 4. Тестирование црогеолитаческой активности АД. о л по гидролизу р-казеина. Условия: 0.1 М трис-НС1-буфер, рН 9.5; AfLon -0.1 мг/мп; |3-казеин - 1 мг/мл; время реакции 2 часа, температура 60 °С. Эффекторы. 1,2 - отсутствуют, (3, 6, 8) - 20 мМ MgCl-i (4, б, 8) - 5 мМ АТР, (5, 7)-5 мМ ADP.

субстрата, свидетельствуют ее о процессивном характере деградации казеина, характерном для всех АТР-зависимых протеин аз.

Тестирование i ip от ео лиги ческой активности форм Nj^-A/Lon, выделенных из растворимой и нерастворимой фракций лизата клеток, показало их идентичность как термостабильных АТР-завнсимых протеиказ и привело к заключению о том, что модификация N-концсвой части A/Lon-протеиназы не сказывается на протеолитиясскоЙ функции фермента,

2.3. Пепмидазнан и АТР-азная активности AfLun

Для тестирования активности пептидгидр о ладных центров Л/LonB использовали мелиттин, который ранее был предложен в качестве субстрата при изучении £VLon А - протеи к аз ы. Исследование гидролиза мелиттин а Л/Lon -протеиназоЙ с применением ВЭЖХ позволило выявить АТР-зависимость деградации этого олигопептида, установить температурный оптимум функционирования фермента и сайты преимущественного расщепления в субстрате, количественно охарактеризовать активность A/Lon и провести дополнительное сопоставление свойств разных форм фермента.

Как показано на. рис. 5A, A/Lo 1\-протеипаза обладает низким уровнем базовой ахтлвносга, причем практически не ингибирусмой в присутствии ионов магния аденозиндифосфатом. Установлено, что в отсутствие АТР накопление пептидов происходит пропорционально содержанию фермента в реакционной среде. Поскольку условия проведения реакций были высокотемпературными (60 °С), маловероятно, что наблюдаемая активность является примесной. В присутствии АТР и ионов магния пептид азная активность фермента значительно увеличивается. Максимум A TP -з ави с им ой нептидазной активности AfLon наблюдается при 70 "С.

А Г,

ипргпж a1t-sfe2- adp-m*- i 2 3 * 6

KTOf-H ''.i-'i'lJ» КмфМ

ЩШЗ -Vhon. ИЩ23 Eil.aj*

Рис, S. Пептидазная активность no гидролизу метитгина: (Л) - для Nu^-A/Lon и Д/Lon, (Б) - для NW/l/I-on и El'Loi:

Условия: 0.1 М трис-ПС1-буфер. plí 9,5, 60 °С (для Nh^-A/Lou и Л/Lon) и рН 8.0, 37 °С (для ЕсЬЩ), время реакции 2 часа.

А, Концентрации: N'isj-.l/Um и Д/Loa - 0.03 мг/мл, мглиптип - I мг/мл, нуклеотнд (АТТ1 или A DP) - 5 мМ, MgCb- 20 мМ.

Б. Концентрации: 'NHis-A/Lon. - Ü.03 мг/мл, £<-1.011 - 0.1 мг/мл, мблиттин - 1 мг/мл. нуклеотид (А1Р, ADP или AMPPNP) - 5 мМ, MgCl2 - 20 мМ. Эффекторы: 1 -отсутствуют. 2 - ноны магния, 3 - ATP-Mg2', 4 - ADP-Mg", 5 - AMPPNP-Mg

Сопоставление активности немоли фи г дарованной и .\¡v-модифицированной форм A/Lon-протеин азы показывает, что свойства этих форм одинаковы (рис. 5А). Сравнительное исследование влияния эффекторов на гидроякз мклкттина Д/LoüB- и EcLoflA-протеиназами (рте. 5Б) привело к выявлению различия н действии нсгидро лизуемого аналога ATP - AMPPNP, не проявившего себя активатором A/Lon-протеин азы, что предварительно позволяет постулировать возможное различие систем регуляции активности протеолитичсских центров в Lou-протеин азах, относящихся к разным подсемействам. Не исключено, что именно динамическое функционирование AfLan в процессе гидролиза A TP, сопровождающееся структурной реорганизацией протеолнтических доменов в олигомере, может быть выраженной особенностью системы активации этого фермента.

Анализ продуктов АТР-зависимого гидролиза мелиттина A/LcmB- и Яс1лпА-протсиназами (рис. 6) приводит к заключению о том, что эти ферменты, принадлежащие к разным подсемействам, имеют схожую специфичность и предпочитают расщепление связей, образованных карбоксильными группами аминокислотных остатков, содержащих небольшие боковые радикалы (Val, Thr).

NK!i-4/L0n jjj j

QIOAVLKVIiTTeLPALI SWIKRLRQQ ~HH2

EcLon J I

-*■ преимущественные места расщепления

— дополнительные места расщепления

Рис. 6. Caihu расщепления мелиттина протеиназами Nms-A/Lon и Echem (данные масс-спектр омсгрии).

Обнаруженное вторичное расщепление субстрата A/LonB-протеиназой происходит по остаткам гидрофобных аминокислот. Наличие дополнительных мест расщепления мслиттина, очевидно, вызвано отличающимися температурными условиями функционирования ферментов, ~во многом определяющими эффективность гидролиза тех ш иных пептидных связей.

Исследование ЛТР-азной функции A/Lon выявило ее низкую чувствительность как к избыточному содержанию ионов магния, так и к присутствию в реакционной среде белкового субстрата. Характерная особенность функционирования фермента как АТР-азы — наличие весьма пролонгированного (около 20 мин) лаг-периода в развитии процесса гидролиза АТР. Факторы, определяющие продолжительность лаг-периода (температурные условия, влияние компонентов и их концентрации), в настоящей работе не установлены. Тем не менее, одна из допустимых версий может состоять в том, что реализации АТР-азноЙ активности предшествует медленная изомеризация АТР-азного центра фермента, вызываемая связыванием субстратного комплекса ATP-Mg.

Таким образом, совокупность представленных результатов позволяет заключить, что экспрессия в Е. coli гена Ion из эволюцжшно отдаленного организма A. fulgidил приводит к образованию функционально активного термо стабильного фермента, характеризующегося всеми основными свойствами АТР-зависимых, цротеиназ. Ряд выявленных особенностей АТР-азной функции и регуляции активности протеолитическнх центров A/Lo л-протеиназы требует углубленного изучения в рамках отдельного исследования.

3. Протеолитический домен A/Lon и активный центр фермента

3.1. Ограниченный протеолиз Afilón химотрипсипом, выделение и характеристика протеолитического домена фермента

По сравнению с гечероолигомерными АТР-зависимым и протеинаэами прел стали гели семейства Lon мало изучены в отношении структурных основ их функционирования по причине отсутствия кристаллографических данных

для полноразмсрных ферментов. Очевидно, что выявление взаимодействий, реализующихся между доменами фермента в одномерной структуре Ьоп-протсиназ, представляет ценную информацию об их устройстве и функционировании. Одним из подходов для такого исследования служит ограниченный протеолиз, при использовании которого удается установить не только доменную организацию с лож неустроенных мульти доменных ферментов и выявить потенциальный комплекс функциональных отношений между доменами, но и оценить вклад доменов в формирование четвертичной структуры. Кроме того, информация о доменной организации белков, получаемая на основании результатов расщепления правильно свернутой полипептидной цепи, представляет особую ценность при планировании экспериментов по кристаллизации фрагментов белков, не поддающихся кристаллизации в полноразмерной форме.

Для ограниченного протешшза Кша-немодафицированяой формы А/Ьоп нами был выбран а-химотрипсин. сери новая протеи «ада, расщепляющая пептидные связи, образованные карбоксильными, .группами гидрофобных аминокислот, В ходе экспериментов установлено, что набор образующихся яри химотрипсинолизе Л/Ьоп продуктов представлен двумя основными фрагментами (рис, 7, 2) независимо от присутствия в реакционной смеси эффекторов фермента - нуклеотидов и иопов магния. Предварительный М-концевой анализ привел к их идентификации как АТР-азноу© и протеолитического (Д/Р) доменов фермента. Неоднократно предпринятые попытки выделения АТР-азного домена оказались безуспешными, главным образом, в связи с выраженной склонностью белка к агрегации и преципитации. Разработана схема выделения препарата Р- домена.

Рис. 7. ЛД.оп-протсииаза и се укороченные формы (12% ПААГ-ЯБЯ) 1 -/\/1,011-1гротоип?.за, 2-продукты химотригкжнолкза оолноразмерпой ДД.оп, 3 - препарат Р-домена, 4 - укороченная форма Р-домен а.

В результате проведения масс-спектрометрического анализа было установлено, что в конечном препарате (рис 7, 3) А/Р представлен а о Ьу&417-Уа1621

По результатам гель-фильтрации на 8ирегс1ех 75 16/60, А/Р не проявлял склонности к олигомеризации Дополнительно проведенная обработка фрагмента химотрипсином показала его относительную стабильность к действию этой протеиназы, однако позволила выявить дополнительный сайг расщепления в А/Р-домене - Ме1453-8ег454 (рис 7, 4) Тестирование протеолитической и пептидазной активностей показало, что А/Р является функционально неактивным

3 2. Пространственная структура протеолитического домена Д/Ъоп

и ее особенности

Протеолитический домен А/Ьоп, полученный с помощью ограниченного протеолиза химотрипсином из полноразмерного фермента с интактным протеолитическим центром, был с успехом использован для кристаллизации и установления его пространственной структуры (работа выполнена совместно с лабораторией кристаллографии макромолекул Национального института рака)

Протеолитический домен А/Ьоп (Ьу5417-Уа1б21) формируется двумя субдоменами, первый из которых (Ьуз417—Э1и523) является преимущественно (^-структурированным, а второй (Уа1527-Уа1621) - а-спирализованным Аминокислотные остатки С1у524-Рго526 образуют неупорядоченную область структуры, разделяющую два субдомена А/Р Остатки 8ег509 и Ьуэ552, постулированные ранее как каталитические, локализованы в разных субдоменах А/Р (рис 8)

Согласно результатам исследования олигомеризации А/Р в растворе белок существует как мономер, однако в кристаллическом состоянии образует гексамер кольцевой структуры, симметричный относительно оси шестого порядка Образование гексамеров наблюдали не только для нативного домена, но и для его мутантов с заменами аминокислотных остатков в активном центре

Диаметр гексамера А/Р-домена, имеющего форму усеченного конуса, равен примерно 80/100 А, в узком и широком сечениях, соответственно При высоте около 47 А, диаметр центральной полости не превышает 20 А, а площадь ее внутренней поверхности составляет ~ 3420 А2 Комплем ентарные поверхности между мономерами формируются остатками аминокислот, входящими в тяжи 82-34 одной стороны мономера, и в спирали Н1, Н4 и тяжи 85, 87 и Б8, локализованные на его второй стороне (см рис 8) р-Складчатый лист, образованный тяжами 82-34, создает достаточно плоскую структуру области контакта субъединиц в олигомере, площадь которой в расчете на мономер составляет 1555 А2 Значение удельной площади, скрытой в результате олигомеризации, в А/Р на 164 А2 больше, чем в гексамере ЕсР

I'tii. 8. диаграмма

строения иротео логического

домена 1.,011-протсшгазы т Arcbaeoglobusjulgiiliix.

Практически одновременно с решением структуры А/Т' появилась информация о пространственной организации л ротполитического домена ¡¿опВ-гтротеиназЫ из МеШапосассиа ¡аппазсЬн. Таким образом, в настоящее время известны пространственные структуры протеолитических доменов трех представителей Ьоп-протеин аз, два из которых откосятся к ЬопВ-гюдсемейству (рис. 9).

Несмотря на безусловное сходство пространственных структур Р-доменов (рис. 9), в области протеолитического центра у рассматриваемых Ьоп-протенназ (,1/Ъоп, А-//Ьоп и £'сЬоп) обнаруживается различие но взаимном расположении каталитически активных остатков (рис. 9. врезка). Предполагаемый участник серин-лизимовой диады 8ег509 б 4®оп удален на значительное расстояние от каталитического 1уя552, обращен в раствор и образует дне выраженные водородные связи - с молекулой воды и остатком 01и472 спирали Н1. Положение к-амииогруппы Ьун552 стабилизировало водородными связями с карбонильным атомом кислорода 01у547 и атомами кислорода в боковых радикалах ТЬг534 и Аяр508. О7 и О , соо тветственно. О"2-Атом /\sp508 образует1 также водородную связь с О1" Т1тг5 34 и задействован в образовании связи с атомом азота С1у535 основной цепи.

Таким образом, если положения Ьуя552 и соседствующего с ним ТЬг534 в активном центре Л/Р консервативны для всех трех известных структур Р-домепои Ьоп-протеинай (рис. 9, врезка), то предполагаемый каталитический остаток 8ег509 в /З/Р-домене оказывается в "аномальной" позиции. Тем не менее, такую ориентацию нельзя считать экстраординарной, поскольку петля, содержащая остаток 8сг509 располагается в непосредственной близости от обогащенных остатками С1у области структуры фермента (а.о. 499 507) и потому может обладать особо выраженной кон форм анионной подвижностью (см. Раздел 3. -/}. Состояние Йег509 в гексамере А/Р соответствует неактивному состоянию мономера

I'm-, 9. протеолитичсдае домены Lon-ripO'ienHaj (AJI on. ЩLoin и i:eLon)

Наложение íipoCTpaiiCTBCHiiMs o::>v:c:vp Р-домсшш: .í'i(голубой), А-//1чч; (красный) а ¿cLoc (зеленый), lia врезке - локализация аминокислот в области каталитических центров ферментов.

изолированного протеолитического домена^ Выявленному при его Энзим атичее ком тестирован и и и растворе. Можно полагать, что для поддержания активной кон формации каталитического центра ,'Í/Lon необходимо взаимодействие Р-домена с другими доменами фермента. Подтверждение или опровержение данной гипотезы возможно только после рентгеноетруктуриого анализа полноразмерной Л/Lon или укороченной формы фермента, содержащей Р-домен в комбинаций с регул яторным га-доменом.

3.3. Влияние мутаций в протеолитическом центре на активность AfLon-npomeiaunbi Согласно изложенным в предыдущем разделе данным, ожидаемое положение Ser509, как каталитического остатка активного центра AfV, занимает остаток Asp508 (рис. 9, врезка), структурно-эквивалентный каталитическому Ser в ЛсР- и А//Р-доменах и участвующий в нескольких взаимодействиях со вторым каталитическим остатком Lys552 и остатком Thr534. Остатки AspSOS и Thr534 .-Í/Lon-протеи пазы, по результатам анализа структур трех протеолити чес к их Lon-доменов и общего анализа аминокислотных последовательностей LoiiB-протеиназ, являются строго консервативными, на основании чего в литературе было высказано предположение об их возможной роли как каталитических и образующих совместно с Lys552 каталитическую триаду. Аномальное расположение Ser509 не позволяло выявить наличие диады Ser—LyS, в активном центре AJP и

привело к предположению о возможности альтернативного устройства протеолитического центра у Л/ЬолВ и подобных ферментов.

С целью разрешения ряда спорных вопросов, возникших в результате анализа каталитических центров в пространственных структурах протеолитаческих доменов Ьоп-протеиназ. был проведен сайт-направленный мутагенез, выделены и протестированы четыре формы подноразмерной ЛДюпВ-нротеиназы с заменами Е506А, Б508А, 5509А, Т534У.

Согласно результатам тестирования протеолктической активности мутантных форм А/Ьоп-протеиназы в стандартных условиях определения активности фермента с интактным протео литичсским центром (рис. 10), ни один из исследованных мутантов, за исключением формы А/Ьоп-8509А, не утрачивает своей активности в той степени, чтобы отнести замененный в их структуре остаток к числу каталитических.

Наиболее проблематичными оказались свойства мугантной формы А/Ьол-Т534У. В условиях стандартного теста протеолитическая активность у этого мутанта практически не проявлялась, что могло бы служить подтверждением участия остатка Т534 в катализе наряду с 8509, однако было обнаружено, что мутант обладает- измененными температуре-зависимыми характеристиками и проявляет выраженную протеолнгическую активность при понижении температурь! проведения реакции, С учетом свойств мутанта Д/1.011-Т534\т. протеолитически неактивная форма фермента с заменой 8509 А также была протестирована при пониженной температуре (37 и 45 °С), повышенной концентрации Д/Ьоп-3509А и увеличенном времени проведения

205 —*■

■ Р-каэеик

<— .1/1 in-mul

Тис. 10. АТР-завксимая протеолитическая активность мутантных форм Л/Ьоп-щютсиназкг. Условия: 0.1 М трис-HCj-буфер, рН 9.3, /yLon- 0.1 мг/мя, Л/Lon-ffiut - 0.2 мг/мл; [З-казеин-1 мг/мл. Время реакции 40 мин, температура 70 °С. Реакцию прождали в отсутствие (-) или в присутствии (+) 5 мМ АТР и 20 мМ MgCl2. Обозначения: W.L - Л/Lon, Ш06А - АД,ол-Е506А, D508A- A/Lon-D508A, S509А - Ajbcm-Я509Л, К - контроль, М - маркеры.

реакции Однако при любых условиях тестирования мутант оставался неактивным

Таким образом, исследование мутантных форм АДдт-протеиназы, проведенное согласно требованиям, вытекающим из анализа пространственных структур протеолитических доменов трех представителей Lon, убедительно доказывает участие в катализе гидролиза пептидной связи именно остатка Ser509 AJLon, образующего совместно с Lys552 каталитическую диаду активного центра фермента Постулированная в литературе возможность образования каталитической триады в активных центрах Ьоп-протеиназ при участии других остатков, обнаруженных рентгеноструктурным анализом, в ходе исследования АД.опВ не нашла подтверждения

3 4 Особенности окружения каталитического остатка Ser в протеолитическом центре LotiB-протеиназ

Каталитический центр закристаллизованного протеолитического домена AfLon, как было показано выше, находится в крайне выраженном неактивном состоянии, что согласуется с результатами тестирования активности Р-домена в растворе В то же время, анализ активности мутантных форм A/Lon показывает, что совокупность взаимодействий между аминокислотными остатками активного центра протеолитического домена в составе полноразмерного фермента не идентична наблюдаемой в кристаллической структуре для изолированного, хотя и олигомеризованого А/Р-домена

Возможный ответ на вопрос о том, что могло бы послужить причиной различия состояния активного центра протеолитических доменов термостабильных Af- и М/ЪопВ-протеиназ, был получен при сопоставлении первичных структур 24 известных представителей LonB в области локализации каталитического остатка Ser (рис 11) Ближайшая область последовательности, следующая за каталитическим остатком Ser в направлении С-конца, достаточно однородна и принципиального интереса не вызывает В то же время область, предшествующая каталитическому серину (отрицательные позиции аминокислотных остатков) оказывается выражено вариабельной, причем во многом благодаря разнообразию распределения остатков Gly (от одного до четырех, в пяти позициях из десяти) На основе распределения этих остатков можно выявить четыре группы представителей LonB-протеиназ (рис 11)

В позиции (-2) остаток Gly строго консервативен и оказывается единственным для самой малочисленной группы (I) представителей LonB, в число которых входит и AÍ/Lon-протеиназа Особенность аминокислотных последовательностей этой группы ферментов в сопоставляемой области -замена строго консервативного для всех других представителей остатка Gly в позиции (-5)

Группа

(п) -10 -6 -2 0 +1 +10

I (3) Q(S/T)Y(S/E)-(К/Е)I(D/E)G D В A(T/S)(A/L)A X (С/А)L(A/S)(I/T)I

II (11) |TYE-|VEODJAS <V/I)S(I/V) ATA VI

III (6) Q X Y (E/D) - 1 V E ODS A S <I/V)S(V/M) ATA (V/I)I

IV (4) QABE9!]VDOD0AS ITV ATA VI

fcLOnA PEgATPKDOPSAG I A M СТА L V

Рис. 11. Сопоставление аминокислотных последовательностей протесшитического домена LonB-протеиназ в области локализации каталитического Ser (показан курсивом в позиции 0, X - любая аминокислота) Выделены аминокислотные остатки Gly в вариабельных позициях (-5, -б, -8 и -10), (п) - количество представителей в группе Для сравнения приведен соответствующий фрагмент последовательности EcLonA-протеиназы

Согласно групповому распределению остатков Gly в позициях (-2, -5 и -10), характерному для A/Lon (группа II), можно с уверенностью предположить, что активные центры изолированных протеолитических доменов других представителей этой группы также будут находиться в аномальной конформации с "вывернутым" положением остатка каталитического серина Такая же A/Lon-подобная конформация активного центра изолированного Р-домена вероятна и для представителей группы Ш, несмотря на то, что в позиции (-10) они несут замену остатка Gly на Gin

Представители четвертой группы содержат в (-10 - 0)-области четыре остатка Gly, положение двух из которых (позиции -6, -8) не характерно для других LonB-протеиназ, однако по общему распределению аминокислот в обсуждаемой области эта группа ферментов в большей степени сходна со второй и третьей, а не с первой группой LonB

Таким образом, различие в состоянии активного центра изолированных протеолитических доменов двух LonB-протеиназ (Д/Р и MjP), обнаруженное при анализе рентгеноструктурных данных и описанное выше, скорее всего вызвано не артефактом кристаллизации, а особенностями аминокислотного состава области структуры, предшествующей остатку каталитического серина Более того, можно постулировать, что М/Р-подобное структурное состояние активного центра с "правильной" ориентацией остатка Ser по отношению к Lys, приводящее к формированию каталитической диады даже в изолированном домене, должно быть нехарактерным для основного числа представителей LonB-протеиназ

Представленное выше обсуждение свойств и структуры изолированного протеолитического домена A/Lon-протеиназы с необходимостью приводит к пониманию того обстоятельства, что состояние его активного центра ключевым образом зависит от включенности Р-домена в состав общей полипептидной цепи A/Lon, содержащей элементы структуры, способные к реорганизации протеолитического центра фермента и приводящие к его активации В этой связи поиск минимальной формы A/Lon-протеиназы, содержащей протеолитический домен и проявляющей

ферментативную активность, представлял собой актуальную, хотя и неординарную в решении задачу

Можно было предположить, что именно комбинация Р-домена с предшествующим ему а-доменом А/Ьоп-протеиназы окажется той минимальной формой фермента, которая характеризуется активированным состоянием протеолитического центра аР-Фрагмент, исследование которого было изначально запланировано в работе, потенциально мог быть получен либо в ходе ограниченного протеолиза полноразмерного фермента, либо путем экспрессии соответствующей части гена lonAf Однако этот фрагмент неожиданно был идентифицирован при анализе продуктов экспрессии генов, кодирующих укороченные формы А/Lon, лишенные трансмембранного домена

4. Формы4/Lon, лишенные трансмембранного домена (ATM-A/Lon)

4 1 Планирование делеции трансмембранного домена AfLovi-протеиназы и получение целевых белков Необычная локализация трансмембранного домена в LonB-протеиназах, разбивающего АТР-азный активный центр нуклеотид-связываюгцего домена на два фрагмента, каждый из которых содержит каталитические остатки, принадлежащие одному из мотивов Уолкера, позволяет предполагать вовлеченность TM-домена в регуляцию активности LonB-протеиназ, возможно связанную с необходимостью их определенной внутриклеточной локализации и встраивания в мембрану

С целью исследования структурно-функционального значения трансмембранного домена ЬопВ-протеиназ в структуру гена lonAf клонированного в векторе рЕТ24а-+\ были введены делеции, приводящие к удалению области последовательности, предположительно соответствующей TM-домену фермента Поскольку в отсутствие структурных данных строгое определение границ TM-домена невозможно, в работе были получены две формы А/Ьоп-протеиназы с делецией фрагментов последовательности а о 100-186 (ATMl-A/Lon) и а о 119-222 (ДТМ2-АДлп), замененных на подвижные глицин-сериновые вставки (рис 12) Обе делеции приводят к устранению предсказанного (http //smart embl-heidelberg de) гидрофобного участка трансмембранных сегментов (а о 121-152), состоящего из двух а-спиралей, соединенных короткой спейсерной областью

Полученные на основе рЕТ24а(+5-/опА/ конструкции, приводящие к описанным выше вариантам делеции трансмембранного домена A/Lon-протеиназы и проверенные секвенированием структурной части гена, были экспрессированы в штамме R coli Rosetta(DE3)pLysS, подобно полноразмерному гену lonAf Анализ экспрессии привел к неожиданному результату Вместо ожидаемого на уровне ~ 60 кДа белка был детектирован белок с примерной молекулярной массой 36 кДа, причем в случае экспрессии как ATMl-lonAf, так и ДТМ2-lonAf, и независимо от температурных условий индукции (37 или 25 °С) Анализ N-концевой последовательности 36 кДа-

AJLmb

¿i jít KSPGTtiJiS Трляеллмвранпый VLY1SE

¡((ЦК?») fOil) íMwfí® ¥<M«í>»Bi

(SM «ft»}

üTMI-rffLon

«Р-фрИШИТ (.16,6 кДа)

Ряс. 12, Схема строения Д/Ьоп-протенназы и сс модифицированных форм.

белка показал, что он является фрагментом ЛД.оп-протеин азы, соответствующим комбинации а- и Р-доменов фермента с десятью С-концевыми остатками ну клеотид-св яз ыв аюшего домена (далее - аР-фрагмент, а.о. Gly289-Val621, рис. 12).

Основная причина деградации ДТМ-A/Lon могла быть связана с активацией автолиза измененного фермента. С целью проверки этого предположения в гены АТМ(1, 2)-lonAf была введена мутация, приводящая к замене каталитического остатка Ser509 на Ala. В результате экспрессии были идентифицированы ДТМ(L2)-Л/Lon-S509А-формы фермента, что явилось подтверждением предположения о способности аналогичных форм с интактным пр отеолити чес ки м центром к сам о деградации.

Разработаны схемы выделения препаратов аР-фрагмента и ДТМ(1, 2)-A/Lon-S5Q9A, которые включали стадии хроматографйческой очистки бес клеточных экстрактов на Q-Sepharose, Heparin HP, SP-S ер h arose и Supertíex 75 для olP-фрагмента и на Heparin HP, Q-Sepharose и Superdex 200 для ДТМ(1, 2)-A/Lou-S509A. Чистота препаратов составила 95 и 90 %, соответственно. Согласно результатам проведения низкотемпературной гель-фильтрации, аР-фрагмент в растворе находится в мономерной форме, в то время как ДТМ(1,2)-Д/Т-оп-8509А-формы представлены двумя различными фраюдаму!-, димером (ATM(l,2)-A/Loti-S5Q9A-lw) и нерегулярной смесыо ассопиатов, включающих от 4 до 6 субъсдиниц (ATM(l,2)-A/Lon-S509A-hw).

4 2 Энзиматические свойства ЛТМ-Б509А-А/Ьоп-форм и двухдоменного фрагмента оР с интактным активным центром

Тестирование АТР-азной активности протеолитически неактивных ATM-A/Lon-S509A-<]3opM, проведенное при двух значениях температуры (37 и 60 °С), показало, что АТР-азный центр в этих формах находится в неактивном состоянии, независимо от вида делеции (ДТМ1 или ДТМ2) и исходной степени олигомеризации белка Отрицательными оказались и результаты аналогичного тестирования, проведенного в присутствии белкового субстрата ((3-казеина), потенциального эффектора фермента

Попытки обнаружить активность аР-фрагмента с интактным лротеолитическим центром в реакциях с участием белкового или пептидного субстрата (мелиттин), осуществленных при разных температурах и длительном времени инкубации компонентов, также не привели к положительным результатам Неактивное состояние протеолитического домена в осР-фрагменте свидетельствовало о необходимости его взаимодействия с дополнительными элементами структуры фермента, требующимися для активации каталитического центра

С учетом того обстоятельства, что ссР-фрагмент являлся результатом экспрессии при попытке получения ДТМ-Л/Lon с активным пептидгидролазным центром, было очевидно, что именно включенность аР в единую полипептидную цепь с нуклеотид-связывающим доменом должна быть основным структурным фактором, определяющим активированное состояние Р-домена в ДТМ-Д/Ьоп-формах В то же время, такое состояние могло определяться четвертичной структурой ДТМ-Д/Lon и быть контролируемым связыванием нуклеотидов или их магниевых комплексов

Чтобы проверить, какой из этих способов регуляции активности протеолитического центра реализуется в А/Ьоп-протеиназе, было проведено исследование свойств смешанных олигомеров, образованных ДТМ-Д/Lon-8509А-формами и аР-фрагментом, которое привело к окончательному выявлению ключевой особенности системы аллостерической регуляции активности пептидгидролазных центров фермента

Из рис 13 (7, 2) видно, что ни делеционная форма ДТМ1-А/Ьоп с инактивированным мутацией S509A протеолитическим центром, ни схР-фрагмент не способны гидролизовать белковый субстрат Протеолитическая активность аР, имеющего интактный протеолитический центр, также не проявляется и в присутствии ATM1-A/Lon-S509A, независимо от наличия в реакционной среде ионов магния (рис 13, 3, 4) Однако введение в реакцию нуклеотидов (АТР или ADP), в присутствии или в отсутствие попов магния, приводит к деградации белкового субстрата (рис 13, 5-8), причем во всех случаях протеолиз протекает по непроцессивному механизму и приводит к образованию высокомолекулярных интермедиатов, что несвойственно активности полноразмерной Д/Ьоп-протеиназы (см Раздел 2 2)

Поскольку схР-фрагмент не содержит нуклеотид-связывающего домена, а активный центр протеолитического домена в Д ТМ1 -A/Lon-S509А

Рис. 13. Реактивация аР-фрагмента и присутствии ДТМ1 -A/Lon-S509A. Условия реакции: 50 мМ бис-трис-цро пановый буфер, рН 8.5; 1% тритон Х-100,60 ®С; 2 ч. Еелки: ДТМ1-4Даш-5509А - 0.5 мг/г.ш (1, 3-8), аР - 0.15 мг/мл (2-5), Ji-казеин - 1 мг/мл (1-9). Эффекторы: 20 мМ MgClj (1,2,4,7-9), 5 мМ АТР (1,2,5,7 а 9), 5 мМ ADP (б и К), М - маркеры.

инактивкрован мутацией, можно заключить, что наблюдаемая нуклеотид-зависимая протесдитическая активность является результатом рекомбинации использованных форм A/Lon-нротеиназы, приводящей к образованию прет еолктичижи активного олигомеркого комплекса. Как следствие, активированное состояние протеолитического центра аР-фрагмент а в таком компаексе оказывается обусловленным двумя факторами; локализацией Р-домена A/Lon в составе олигомерной структуры и реализацией механизма межсубъединичной аллостери ческой активация протеолитического центра при связывании нуклеотида. Делеционный мутант ДТМ2-A/Lon-S509А. так же как и ДТМ1-A/Lon-S509A, активирует прогеолитический центр в аР-фрагменте в присутствии АТР и ионов магния, однако эта форма фермента была изучена в меньшей степени.

Проведенные эксперименты доказывают, что в ДТМ-формах АД.оп-протеиназьг существуют нуклеотид-связывающее сайты, несмотря на то, что они не были выявлены ни при ограниченном протеолизе, ни при изучении АТР -азной активности исследованных форм как в индивидуальном состоянии, так и в составе протеолитичсски активного комплекса с ссР-фрат ментом. Очевидно, что в рамках задачи получения ДТМ-форм A/Lon, содержащих активный АТР-азный центр, потребуются детальные структурные данные. Тем не менее, способность полученных в работе ДТМ-фор.м A/Lon к связыванию нуклеотидов и к рекомбинации с CtP-фрагментом с образованием протеолитичсски активного комплекса позволяет заключить, что общая структура ААА+-модуля в использованных ДТМ -A/Lon- S 509А -формах остается сохраненной.

Совокупность представленных результатов демонстрирует как ключевой вклад межсубъединичных взаимодействий на уровне четвертичной структуры в активацию протеолитического домена А/Ьоп-протеиназы, так и необходимость полноценной четвертичной структуры и гидролиза АТР для реализации процессивной деградации белкового субстрата

5. Проблема олнгомеризации Lon-протеиназ

Полученные при исследовании А/Ьоп-протеиназы данные, характеризующие состояние олнгомеризации фермента и его различных форм, суммированы в таблице

Таблица Очигомерное состояние A/Lon-протеиназы и ее модифицированных форм (по данным гель-фильтрации)

№ Форма A/Lan Мм субъсдипицы кДа носитель K„v Мм (жсперим.) «Да - Число с^бъединиц

1 AfLaa 68 2 0 07 -1000 1

2 Nh«- A/Lon-sol 69 0 0 21 260 92 4

3 Nib,-Л/Lon-ins 69 0 Sephacryl 032 012 118 23 548 28 2 8

4 A/Lon-E506A 68 2 S300 28/60 0 07 -1000

5 A/Lon-D508A 68 2 007 -1000

6 -ifyLctn-S509A 68 2 0 07 -1000 0

7 A/Lon-T534V 68 2 007 -1000 t

8 ATMl-A/Lon-S509A-hw 58 6 Superdex 0.24 015 2177 3804 4 6

9 A1M1-A/Lan-S509A-Iw 586 034 115 0 2

10 ATM2-A/Lon-S509A-hw 57 2 200 16/60 0 23 015 219 4 375 5 4 6

11 ATM2-A/Lon-S509A-lw 57 2 036 103 3 2

12 Р-домен 245 Superdex 75 034 24 89 1

13 аР-фрагменг 366 16/60 025 43.55 1

С учетом представленных результатов можно предположить, что наблюдаемое олигомерное состояние полноразмерных форм фермента (№№ 1-7) в большой степени зависит от метода его выделения В частности, все формы фермента, немодифицированные в И-концевой области фермента и полученные, как следствие, без использования металл-хелатной аффинной хроматографии, более ассоциированы, чем формы АД,он, содержащие поли-Шв-М-концевой пептид

Вместе с тем, нельзя не отметить и тот факт, что степень олнгомеризации всех протеолитически неактивных и немодифицированных поли-Шв-И-концевым пептидом форм ДТМ-АД-оп, содержащих нуклеотид-связывающий домен (№№ 8-11 в таблице), кратна двум Однако как изолированный протеолитический домен фермента, так и его комбинация с а-доменом ААА+-модуля образуют мономеры Следствием этих наблюдений может быть формальное предположение о ключевой роли в олнгомеризации именно нуклеотид-связывающего домена фермента

выводы

1 Установлено, что Lon-протеиназы архебактерий представляют отдельное подсемейство в семействе АТР-зависимых Ьоп-протенназ, характеризующееся особенностями аминокислотного состава консенсусных фрагментов протеолитических и АТР-азных центров и общей архитектуры субъединиц, определяемой локализацией экстрадоменов

2 Впервые выделена рекомбинантная форма термостабильной LonB-протеиназы Archaeoglobus Julgitus (A/Lon) и охарактеризованы ее энзиматические свойства Определены примерные границы доменов в A/Lon-протеиназе Получен и охарактеризован ряд муганггных форм А/Lou с заменами в области каталитического центра фермента Окончательно доказана принадлежность A/Lon-протеиназы к серин-лизияовым пептидгидролазам

3 Определена пространственная структура протеолитического домена A/Lon (А/Р), полученного ограниченным протеолизом полноразмерного фермента Выявлено обусловленное фрагментацией нарушение структуры протеолитического центра A/Lon Для ферментов LonB-подсемейства постулирована повышенная конформациоиная подвижность участка структуры вблизи каталитического остатка серина

4 Установлено, что делеции трансмембранного домена A/Lon-протеиказы с интактным каталитическим центром приводят к активации протеолитической функции соответствующих форм ATM-A/Lon, сопровождающейся автолизом фермента и образованием неактивного фрагмента, включающего а-спирализованный и Р-домены (аР-фрагмент) Сделано заключение о том, что термофильностъ A/Lon определяется регуляцией активности протеолитического домена фермента, опосредованной структурой его ААА+-модуля

5 Показано нуклеотид-зависимое восстановление протеолитической активности аР-фрагмента в смешанных олигомерах с ДТМ-АДлп-формамн Выявлен ключевой вклад межсубъединичных контактов в активацию каталитического центра протеолитических доменов LonB-протеиназ

Список публикаций

1 Rotanova Т V, Melnikov Е Е, Khalatova A. G, Makhovskava O.V.. Botos I, Wlodawer A, Gustchma A. (2004) ClassificaUon of ATP-dependent proteases Lon and comparison ofthe active sites of their proteolytic domains Eur J Biochem.,V 271 P 4865-4871

2 Маховская О В. Мельников ЭЭ, Ротанова ТВ Структурная организация и функционирование т vitro АТР-зависимой ЬопВ-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus (2005) В сборнике "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов" Петрозаводск С 131-138

3 Botos I, Melnikov Е Е, Cherry S, Kozlov S, Makhovskava О V. Tropea J, Gustchma A, Rotanova T V, Wlodawer A. (2005) Atomic-resolution crystal structure of the proteolytic domain of Archaeoglobus fulgidus Lon reveals the conformational variability in the active sites of Lon proteases J Mol Biol,V 351 P 144-157

4 Маховская О В. Козлов С, Ботос И, Степнов А А , Андрианова А Г, Гущина А Е, Влодавер А, Мельников ЭЭ, Ротанова ТВ (2007) Формы ЬопВ-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus, лишенные трансмембранного домена Вклад четвертичной структуры в регуляцию протеолитической активности фермента. Биоорган химия, Т 33 С 657-660

5 Цирульников КБ, Халатова А Г, Маховская О.В. (2002) Каталитическая диада Ser-Lys в протеолитическом центре АТР-зависимой Lon-протеиназы Е coli XIV зимняя международная молодежная школа "Перспективные направления физ -хим биологии и биотехнологии" Москва. Тез докл и стенд сообщ С 42

6 Цирульников К Б, Маховская О В.. Мельников Э Э, Морозкин А Д, Ротанова Т В (2002) АТР-зависимая Lon-протеиназа Escherichia coli Олигомерное состояние и функциональная активность фермента и его мутангных форм V Симп "Химия протеолигических ферментов" Москва Тез докл и стенд сообщ С 67

7 Маховская О.В . Халатова А Г. Мельников Э Э. Ротанова ТВ (2004) Структурная организация и функционирование т vitro АТР-зависимой LonB-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus Межд конф "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов " Петрозаводск. Материалы. С 88-89

8 Маховская О.В. Мельников ЭЭ, Ротанова ТВ (2004) Исследование АТР-зависимой LcmB-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus Межд конф по физ -хим биологии, поев 70-летию со дня рождения акад Ю АОвчинникова (VII чтения) Москва Тез докл и стенд, сообщ. С 75

9 Botos I, Ziolkowska N, Melnikov EE, Cherry S, Kozlov S, Khalatova A.G, Makhovskava О V. Tropea J, Gustchma A., Maunzi M R, Rotanova T V, Wlodawer A. (2005) Abstracts Conservation of the overall fold and variability of the active sites of isolated proteolytic domains of Lon proteases 6th International Conference on AAA Proton. Schloss Seggau. Austria. Abstracts P 65

10 Makhovskava О V. Melnikov EE, Botos I, Kozlov S, Gustchma A., Wlodawer A., Rotanova T V (2005) Abstracts Archaeoglobus fulgidus LonB protease conformational variability of the active site and biochemical studies of the wild type enzyme and its several mutants б"1 International Conference on AAA Proteins Schloss Seggau. Austria. Abstracts P 105

11 Маховская О В. Степнов АА, Халатова АГ, Мельников ЭЭ, Романова ТВ (2006) АТР-зависимые Ьоп-протеиназы В-типа. Термостабильная мембраносвязанная протеиназа LonB из Archaeoglobus fulgidus экспрессия в Е coli, свойства полноразмерного фермента и его форм, лишенных трансмембранного домена. VIII чтения, поев памяти академика Ю А Овчинникова. Москва - Пущино Тез докл н стенд, сообщ С 83

12 Маховская ОВ. Куракевич ЕВ, Мельников ЭЭ, Ротанова ТВ (2007) Энзиматические свойства LonB-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus и ее форм с делениями в области трансмембранного домена. VI Симп "Химия протеолитических ферментов" Москва. Тез докл и стенд сообщ С 97-98

13 Мартынова ЕА., Маховская ОВ. Ротанова ТВ (2007) Регуляция экспрессии Ьоп-протеиназы в клетках эукариот VI Симп "Химия протеолитических ферментов" Москва. Тез докл. и стенд сообщ С 32-33

14 Makhovskava О V. Kozlov S , Botos I, Gustchma A, Wlodawer A., Melnikov EE, Rotanova T V (2007) Archaeoglobus fulgidus LonB protease lacking the transmembrane domain. Impact of the quaternary structure on regulation of proteolytic activity 7th International Conference on AAA Protons Cirencester England. Abstracts P 18

15 Маховская O.B.. Мельников Э Э, Ротанова ТВ (2007) Энзиматические свойства мембраносвязанной LonB протеиназы из Archaeoglobus fulgidus и ее форм, лишенных трансмембранного домена. Материалы II научной конференции с участием стран СНГ "Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов" Петрозаводск С 91-92

16 Мельников ЭЭ, Ротанова ТВ, Маховская О В . Андрианова А Г, Степнов АЛ, Румш ЛД (2007) Модифицированные формы АТР-зависимых Lon-протеиназ в исследовании структурной организации и функционирования интактных ферментов Ш Российский симп "Белки и пептиды" Пущино Тез докл и стенд, сообщ С 43

Подписано в печать 11 10 2007 г Исполнено 12 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 880 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Маховская, Оксана Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ В АРХЕЯХ (Обзор литературы)

1. Энергозависимый селективный протеолиз - механизм поддержания внутриклеточного протеома. Известные к настоящему времени энергозависимые пептидгидролазы

1.1. Характерные особенности А ТР-азных составляющих AAA*-протеиназ

1.1.1. Общая характеристика AAA*-белков

1.1.2. А ТР-азные компоненты ААА+-протеиназ

1.1.2.1. Экстра-домены и белки-адаптеры A TP-зависимых протеиназ

1.1.2.2. Нуклеотидсвязывающие и а-спирализованные домены АТР-зависимых протеиназ

1.2. Протеолитические составляющие энергозависимых протеиназ

1.3. Функционирование А TP-зависимых протеиназ и протеолитических комплексов

2. Протеиназы и протеолитические системы архебактерий

2.1. Общая характеристика пула протеиназ архей 35 2.1.1. А TP-независимые протеиназы гипертермофильных микроорганизмов

2.2. Регуляторные протеиназы архей

2.2.1. А TP-зависимые протеиназы архей

2.2.2. Интегральные мембранные протеиназы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурная организация и функционирование АТР-зависимой Lon-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus"

Эукариоты, бактерии и археи представляют три различных филогенетических царства, которые охватывают все известные формы жизни на Земле. Архебактерии были признаны в качестве отдельной филогенетической группы менее, чем 30 лет назад. По мере накопления сведений о молекулярной структуре и организации геномов архей стало очевидно, что эта группа организмов обладает структурными, физиологическими, биохимическими и генетическими характеристиками, которые сильно отличают ее от бактерий и эукариот. Уникальные особенности архей вызвали направленный интерес к изучению биохимических процессов, протекающих в клетках у данных микроорганизмов, при этом исследование механизмов протеолитической деградации не является исключением.

Механизмы деструкции белков играют ключевую роль в поддержании сохранности клеточного протеома, обеспечивая удаление нежелательных или опасных белков, а также быструю и адекватную регуляцию биологического ответа на изменяющиеся условия. Деградацию белков в клетках бактерий, эукариот и архебактерий осуществляют АТР-зависимые протеиназы, функционирующие наряду с другими известными ААА+-АТР-азами (АТР-азы с альтернативными активностями), которые участвуют в ремоделировании, разворачивании и дезагрегации клеточных белков.

В последнее время был достигнут значительный прогресс в понимании того, каким образом ААА+-протеиназы узнают свои специфические мишени, осуществляют деградацию белков и разрушение макромолекулярных комплексов. Полнее всего механизмы и регуляция АТР-зависимой деградации белков исследованы на примере бактерий и эукариот, тогда как сведения об общих закономерностях функционирования энергозависимых протеиназ в археях немногочисленны.

В клетках архебактерий обнаружено две АТР-зависимые протеолитические структуры -цитозольная протеасома, состоящая как и у эукариот, из 208-ядра и регуляторных комплексов, и мембраносвязанная Lon-протеиназа. К настоящему времени определена структура 20S-протеасомы, а также выявлены некоторые механизмы процессов разворачивания и транслокации белковых субстратов к ее протеолитическим центрам для последующей деградации, тогда как такие данные для мембраносвязанной Ьоп-протеиназы вовсе отсутствуют.

Изучение Ьоп-протеиназы из термофильной архебактерии Archaeoglobus fulgidus, а именно, выявление особенностей ее структурной организации и функционирования in vitro позволит лучше понять биологическую роль и механизм действия этой энергозависимой протеиназы, а также поможет расширению представлений о контроле качества внутриклеточных белков в архебактериальных клетках.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Маховская, Оксана Владимировна

выводы

1. Установлено, что Lon-протеиназы архебактерий представляют отдельное подсемейство в семействе АТР-зависимых Ьоп-протеиназ, характеризующееся особенностями аминокислотного состава консенсусных фрагментов протеолитических и АТР-азных центров и общей архитектуры субъединиц, определяемой локализацией экстрадоменов.

2. Впервые выделена рекомбинантная форма термостабильной ЬопВ-протеиназы Archaeoglobus fulgitus {AJLon) и охарактеризованы ее энзиматические свойства. Определены примерные границы доменов в А/Lon-протеиназе. Получен и охарактеризован ряд мутантных форм AJLon с заменами в области каталитического центра фермента. Окончательно доказана принадлежность 4/Ьоп-протеиназы к серин-лизиновым пептидгидролазам.

3. Определена пространственная структура протеолитического домена AfLon {AJ?), полученного ограниченным протеолизом полноразмерного фермента. Выявлено обусловленное фрагментацией нарушение структуры протеолитического центра AJLon. Для ферментов ЬопВ-подсемейства постулирована повышенная конформационная подвижность участка структуры вблизи каталитического остатка серина.

4. Установлено, что делеции трансмембранного домена Д/Ьоп-протеиназы с интактным каталитическим центром приводят к активации протеолитической функции соответствующих форм ДТМ-4/Lon, сопровождающейся автолизом фермента и образованием неактивного фрагмента, включающего а-спирализованный и Р-домены (аР-фрагмент). Сделано заключение о том, что термофильность AJLon определяется регуляцией активности протеолитического домена фермента, опосредованной структурой его ААА+-модуля.

5. Показано нуклеотид-зависимое восстановление протеолитической активности аР-фрагмента в смешанных олигомерах с ДТМ-Д/Ьоп-формами. Выявлен ключевой вклад межсубъединичных контактов в активацию каталитического центра протеолитических доменов ЬопВ-протеиназ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Маховская, Оксана Владимировна, Москва

1. Goldberg A.L. (1992) The mechanism and functions of ATP-dependent proteases in bacterial and animal cells. Eur. J. Biochem., 203(1-2), 9-23.

2. Pahl H.L., Baeuerle P.A.(1996) Control of gene expression by proteolysis. Curr. Opin. Cell Biol., 8(3), 340-7.

3. Martoglio B. (1999) Transmembrane segment proteases. Protoplasma, 207,141-146.

4. Gottesman S. (1999) Regulation by proteolysis: developmental switches. Curr. Opin. Microbiol., 2(2), 142-7.

5. King R.W., Deshaies R.J., Peters J.M., Kirschner M.W. (1996) How proteolysis drives the cell cycle. Science., 274(5293), 1652-9

6. Gottesman S. (2003) Proteolysis in bacterial regulatory circuits. Annu Rev. Cell Dev. Biol, 19, 565-87

7. Sullivan J.A., Shirasu K, Deng XW (2003) Nat. Rev. Genet., 4(12), 948-58.

8. Rothschild L.J., Mancinelli R.L. (2001) Life in extreme environments. Nature, 409(6823), 1092-101.

9. Ward D.E, Shockley K.R., Chang L.S., Levy R.D, Michel J.K., Conners S.B., Kelly R.M. (2002) Proteolysis in hyperthermophilic microorganisms. Archaea, 1(1), 63-74.

10. Coux O., Tanaka K., Goldberg A.L. (1996) Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem., 65, 801-47.

11. Maupin-Furlow J.A., Wilson H.L., Kaczowka S.J., Ou M.S. (2000) Proteasomes in the archaea: from structure to function. Front. Biosci., 5, 837-65.

12. Erdmann R., Wiebel F.F., Flessau A., Rytka J., Beyer A., Frohlich K.U., Kunau W.H. (1991) PAS1, a yeast gene required for peroxisome biogenesis, encodes a member of a novel family of putative ATPases. Cell, 64(3), 499-510.

13. Iyer L.M., Leipe D.D., Koonin E.V., Aravind L. (2004) Evolutionary history and higher order classification of AAA+ ATPases. J. Struct. Biol., 146(1-2), 11-31.

14. Confalonieri F., Duguet M. (1995) A 200-amino acid ATPase module in search of a basic function. Bioessays, 17(7), 639-650.

15. Beyer A. (1997) Sequence analysis of the AAA protein family. Protein Sci., 6(10), 20432058.

16. Patel S., Latterich M. (1998) The AAA team: related ATPases with diverse functions. Trends Cell. Biol., 8(2), 65-71.

17. Lupas A.N., Martin J. (2002) AAA proteins. Curr. Opin. Struct. Biol., 12(6), 746-753.

18. Neuwald A.F., Aravind L., Spouge J.L., Koonin E.V. (1999) AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res., 9(1), 27-43.

19. Frickey Т., Lupas A.N. (2004) Phylogenetic analysis of AAA proteins. J. Struct. Biol., 146(1-2), 2-10.

20. Hersch GL, Burton RE, Bolon DN, Baker ТА, Sauer RT. (2005) Asymmetric interactions of ATP with the AAA+ ClpX6 unfoldase: allosteric control of a protein machine. Cell, 121(7), 1017-27.

21. Smith C.K., Baker T.A., Sauer R.T. (1999) Lon and Clp family proteases and chaperones share homologous substrate-recognition domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(12), 66786682.

22. Schirmer E.C., Glover J.R., Singer M.A., Lindquist S. (1996) HSPlOO/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem Sci., 21(8), 289-96.

23. Singh SK, Rozycki J, Ortega J, Ishikawa T, Lo J, Steven AC, Maurizi MR. (2001) Functional domains of the ClpA and ClpX molecular chaperones identified by limited proteolysis and deletion analysis. J Biol Chem., 276(31), 29420-9.

24. Hattendorf D.A., Lindquist S.L. (2002) Analysis of the AAA sensor-2 motif in the C-terminal ATPase domain of Hspl04 with a site-specific fluorescent probe of nucleotide binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(5), 2732-2737.

25. Dougan D.A., Mogk A., Zeth K., Turgay K„ Bukau B. (2002) AAA+ proteins and substrate recognition, it all depends on their partner in crime. FEBS Lett., 529(1), 6-10.

26. Ahmadian M.R., Stege P., Scheffzek K., Wittinghofer A. (1997) Confirmation of the arginine-finger hypothesis for the GAP-stimulated GTP-hydrolysis reaction of Ras. Nat. Struct. Biol., 4(9), 686-689.

27. Hattendorf D.A., Lindquist S.L. (2002) Cooperative kinetics of both Hspl04 ATPase domains and interdomain communication revealed by AAA sensor-1 mutants. EMBO J., 21(1-2), 1221.

28. Tomoyasu Т., Mogk A., Langen H., Goloubinoff P., Bukau B. (2001) Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol. Microbiol., 40(2), 397-413.

29. Keiler K.C., Waller P.R., Sauer R.T. (1996) Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science, 271(5251), 990-993.

30. Martin J., Gruber M., Lupas A.N. (2004) Coiled coils meet the chaperone world. Trends Biochem. Sci., 29(9), 455-458.

31. Mogk A., Dougan D., Weibezahn J., Schlieker C., Turgay K., Bukau B. (2004) Broad yet high substrate specificity: the challenge of AAA+ proteins. J. Struct. Biol., 146(1-2), 90-98.

32. Rouiller I., DeLaBarre В., May A.P., Weis W.I., Brunger A.T., Milligan R.A., Wilson-Kubalek E.M. (2002) Conformational changes of the multifunction p97 AAA ATPase during its ATPase cycle. Nat. Struct. Biol., 9(12), 950-957.

33. Vale R.D. (2000) AAA proteins. Lords of the ring. J. Cell. Biol., 150(1), F13-19.

34. Dougan D.A., Mogk A., Bukau B. (2002) Protein folding and degradation in bacteria: to degrade or not to degrade? That is the question. Cell. Mol. Life Sci., 59(10), 1607-1616.

35. Voges D, Zwickl P, Baumeister W. (1999) The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Annu. Rev. Biochem., 68, 1015-68.

36. Singh S.K., Grimaud R., Hoskins J.R., Wickner S., Maurizi M.R. (2000) Unfolding and internalization of proteins by the ATP-dependent proteases CIpXP and ClpAP. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(16), 8898-8903.

37. Kim Y.I., Burton R.E., Burton B.M., Sauer R.T., Baker T.A. (2000) Dynamics of substrate denaturation and translocation by the CIpXP degradation machine. Mol. Cell, 5(4), 639-648.

38. Weber-Ban E.U., Reid B.G., Miranker A.D., Horwich A.L. (1999) Global unfolding of a substrate protein by the HsplOO chaperone ClpA. Nature, 401(6748), 90-93.

39. Grimaud R., Kessel M., Beuron F., Steven A.C., Maurizi M.R. (1998) Enzymatic and structural similarities between the Escherichia coli ATP-dependent proteases, CIpXP and ClpAP. J. Biol Chem., 273(20), 12476-12481.

40. Singh S.K., Maurizi M.R. (1994) Mutational analysis demonstrates different functional roles for the two ATP-binding sites in ClpAP protease from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 269(47), 29537-29545.

41. Seol J.H., Yoo S.J., Shin D.H., Shim Y.K., Kang M.S., Goldberg A.L., Chung C.H. (1997) The heat-shock protein HslVU from Escherichia coli is a protein-activated ATPase as well as an ATP-dependent proteinase. Eur. J. Biochem., 247(3), 1143-50.

42. Kanemori M., Yanagi H., Yura T. (1999) The ATP-dependent HslVU/ClpQY protease participates in turnover of cell division inhibitor SulA in Escherichia coli. J. Bacteriol., 181(12), 3674-3680.

43. Roudiak S.G., Shrader Т.Е. (1998) Functional role of the N-terminal region of the Lon protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry, 37(32), 11255-11263.

44. Ebel W., Skinner M.M., Dierksen K.P., Scott J.M., Trempy J.E. (1999) A conserved domain in Escherichia coli Lon protease is involved in substrate discriminator activity. J. Bacteriol., 181(7), 2236-2243.

45. Kuroda A., Nomura K., Ohtomo R., Kato J., Ikeda Т., Takiguchi N., Ohtake H., Kornberg A. (2001) Role of inorganic polyphosphate in promoting ribosomal protein degradation by the Lon protease in E. coli. Science, 293(5530), 705-708.

46. Lo J.H., Baker T.A., Sauer R.T. (2001) Characterization of the N-terminal repeat domain of Escherichia coli CIpA-A class I Clp/HSP 100 ATPase. Protein Sci., 10(3), 551 -9.

47. Hinnerwisch J., Reid B.G., Fenton W.A., Horwich A.L. (2005) Roles of the N-domains of the ClpA unfoldase in binding substrate proteins and in stable complex formation with the ClpP protease. J. Biol. Chem., 280(49), 40838-44.

48. Dougan D.A., Reid B.G., Horwich A.L., Bukau B. (2002) CIpS, a substrate modulator of the ClpAP machine. Mol. Cell, 9(3), 673-683.

49. Zeth K., Ravelli R.B., Paal K., Cusack S., Bukau В., Dougan D.A. (2002) Structural analysis of the adaptor protein CIpS in complex with the N-terminal domain of ClpA. Nat. Struct. Biol., 9(12), 906-911.

50. Banecki В., Wawrzynow A., Puzewicz J., Georgopoulos C., Zylicz M. (2001) Structure-function analysis of the zinc-binding region of the ClpX molecular chaperone. J. Biol. Chem., 276(22), 18843-18848.

51. Wojtyra U.A., Thibault G., Tuite A., Houry W.A. (2003) The N-terminal zinc binding domain of ClpX is a dimerization domain that modulates the chaperone function. J. Biol. Chem., 278(49), 48981-48990.

52. Flynn J.M., Neher S.B., Kim Y.I., Sauer R.T., Baker T.A. (2003) Proteomic discovery of cellular substrates of the ClpXP protease reveals five classes of ClpX-recognition signals. Mol. Cell, 11(3), 671-683.

53. Levchenko I., Seidel M., Sauer R.T., Baker T.A. (2000) A specificity-enhancing factor for the ClpXP degradation machine. Science, 289(5488), 2354-2356.

54. Wah D.A., Levchenko I., Baker T.A., Sauer R.T. (2002) Characterization of a specificity factor for an AAA+ ATPase: assembly of SspB dimers with ssrA-tagged proteins and the ClpX hexamer. Chem. Biol., 9(11), 1237-1245.

55. Wah D.A., Levchenko I., Rieckhof G.E., Bolon D.N., Baker T.A., Sauer R.T. (2003) Flexible linkers leash the substrate binding domain of SspB to a peptide module that stabilizes delivery complexes with the AAA+ ClpXP protease. Mol. Cell, 12(2), 355-363.

56. Dougan D.A., Weber-Ban E., Bukau B. (2003) Targeted delivery of an ssrA-tagged substrate by the adaptor protein SspB to its cognate AAA+ protein ClpX. Mol. Cell, 12(2), 373-380.

57. Song H.K., Eck M.J. (2003) Structural basis of degradation signal recognition by SspB, a specificity-enhancing factor for the ClpXP proteolytic machine. Mol. Cell, 12(1), 75-86.

58. Muffler A., Fischer D., Altuvia S., Storz G., Hengge-Aronis R. (1996) The response regulator RssB controls stability of the sigma(S) subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. EMBOJ., 15(6), 1333-1339.

59. Zhou Y., Gottesman S., Hoskins J.R., Maurizi M.R., Wickner S. (2001) The RssB response regulator directly targets sigma (S) for degradation by ClpXP. Genes Dev., 15(5), 627-637.

60. Tang M., Shen X., Frank E.G., O'Donnell M., Woodgate R., Goodman M.F. (1999) UmuD'(2)C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli pol V. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(16), 8919-8924.

61. Gonzalez M., Rasulova F., Maurizi M.R., Woodgate R. (2000) Subunit-specific degradation of the UmuD/D' heterodimer by the ClpXP protease: the role of trans recognition in UmuD' stability. EMBOJ., 19(19), 5251-5258.

62. Ito K., Akiyama Y. (2005) Cellular functions, mechanism of action, and regulation of FtsH protease. Annu. Rev. Microbiol., 59,211-231.

63. Kihara A., Akiyama Y., Ito K. (1996) A protease complex in the Escherichia coli plasma membrane: HflKC (HflA) forms a complex with FtsH (HflB), regulating its proteolytic activity against SecY. EMBOJ., 15(22), 6122-6131.

64. Saikawa N., Akiyama Y., Ito K. (2004) FtsH exists as an exceptionally large complex containing HflKC in the plasma membrane of Escherichia coli. J. Struct. Biol., 146(1-2), 123129.

65. Akiyama Y., Kihara A., Mori H., Ogura Т., Ito K. (1998) Roles of the periplasmic domain of Escherichia coli FtsH (HflB) in protein interactions and activity modulation. J. Biol. Chem., 273(35), 22326-22333.

66. Akiyama Y., Ito K. (2000) Roles of multimerization and membrane association in the proteolytic functions of FtsH (HflB). EMBOJ, 19(15), 3888-95.

67. Akiyama Y., Ito K. (2001) Roles of homooligomerization and membrane association in ATPase and proteolytic activities of FtsH in vitro. Biochemistry, 40(25), 7687-93.

68. Bieniossek С., Schalch Т., Bumann M., Meister M., Meier R., Baumann U. (2006) The molecular architecture of the metalloprotease FtsH. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 103(9), 306671.

69. Song H.K., Hartmann C., Ramachandran R., Bochtler M., Behrendt R., Moroder L., Huber R. (2000) Mutational studies on HslU and its docking mode with HslV. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(26), 14103-14108.

70. Kwon A.R., Kessler B.M., Overkleeft H.S., McKay D.B. (2003) Structure and reactivity of an asymmetric complex between HslV and I-domain deleted HslU, a prokaryotic homolog of the eukaryotic proteasome. J. Mol. Biol., 330(2), 185-195.

71. Kim Y.I., Levchenko I., Fraczkowska K., Woodruff R.V., Sauer R.T., Baker T.A. (2001) Molecular determinants of complex formation between Clp/HsplOO ATPases and the ClpP peptidase. Nat. Struct. Biol., 8(3), 230-233.

72. Sousa M.C., Trame C.B., Tsuruta H., Wilbanks S.M., Reddy V.S., McKay D.B. (2000) Crystal and solution structures of an HslUV protease-chaperone complex. Cell, 103(4), 633643.

73. Guo F„ Maurizi M.R., Esser L., Xia D. (2002) Crystal structure of ClpA, an HsplOO chaperone and regulator of ClpAP protease. J. Biol. Chem., 277(48), 46743-46752.

74. Kim DY, Kim KK (2003) Crystal structure of ClpX molecular chaperone from Helicobacter pylori. J. Biol. Chem., 278(50), 50664-50670.

75. Bochtler M., Hartmann C„ Song H.K., Bourenkov G.P., Bartunik H.D., Huber R. (2000) The structures of HslU and the ATP-dependent protease HsIU-HsIV. Nature, 403(6771), 800-805.

76. Trame C.B., McKay D.B. (2001) Structure of Haemophilus influenzae HslU protein in crystals with one-dimensional disorder twinning. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 57(Pt 8), 1079-90.

77. Sousa M.C., Kessler B.M., Overkleeft H.S., McKay D.B. (2002) Crystal structure of HslUV complexed with a vinyl sulfone inhibitor: corroboration of a proposed mechanism of allosteric activation of HslV by HslU. J. Mol. Biol., 318(3), 779-785.

78. Krzywda S., Brzozowski A.M., Verma C., Karata K., Ogura Т., Wilkinson A.J. (2002) The crystal structure of the AAA domain of the ATP-dependent protease FtsH of Escherichia coli at 1.5 A resolution. Structure (Camb), 10(8), 1073-1083.

79. Niwa H., Tsuchiya D., Makyio H., Yoshida M., Morikawa K. (2002) Hexameric ring structure of the ATPase domain of the membrane-integrated metalloprotease FtsH from Thermus thermophilus HB8. Structure (Camb), 10(10), 1415-1423.

80. Barrett A.J., Rawlings N.D., O'Brien E.A. (2001) The MEROPS database as a protease information system. J. Struct. Biol., 134(2-3), 95-102.

81. Goldschmidt R. (1970) In vivo degradation of nonsense fragments in E. coli. Nature, 228(277), 1151-1154.

82. Chung C.H., Goldberg A.L. (1981) The product of the lon (capR) gene in Escherichia coli is the ATP-dependent protease, protease La. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(8), 4931-4935.

83. Charette M.F., Henderson G.W., Markovitz A. (1981) ATP hydrolysis-dependent protease activity of the lon (capR) protein of Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(8), 4728-4732.

84. Америк А.Ю., Чистякова Л.Г., Остроумова Н.И., Гуревич А.И., Антонов В.К. (1988) Клонирование, экспрессия и структура функционально активного укороченного гена lon Escherichia coli. Биоорган, химия, 14(3), 408-411.

85. Америк А.Ю., Антонов В.К., Остроумова Н.И., Ротанова Т.В., Чистякова Л.Г. (1990) Клонирование, структура и экспрессия полноразмерного гена lon Escherichia coli, кодирующего АТР-зависимую Ьа-протеиназу. Биоорган, химия, 16(7), 869-880.

86. Amerik A.Yu., Antonov V.K., Gorbalenya A.E., Kotova S.A., Rotanova T.V., Shimbarevich E.V. (1991) Site-directed mutagenesis of La protease. A catalytically active serine residue. FEBSLett., 287(1-2), 211-214.

87. Ротанова T.B. (1999) Структурно-функциональные особенности АТР-зависимой Lon-протеиназы из Escherichia coli. Биоорган, химия, 25(12), 883-891.

88. Starkova N.N., Koroleva E.P., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova T.V. (1998) Mutations in the proteolytic domain of Escherichia coli protease Lon impair the ATPase activity of the enzyme. FEBSLett., 422(2), 218-220.

89. Ротанова T.B., Мельников Э.Э., Цирульников К.Б. (2003) Каталитическая диада Ser -Lys в активном центре АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29(1), 97-99.

90. Chung,C.H., Goldberg,A.L. (2004) Endopeptidase La. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn (Barrett, A. J., Rawlings.N.D. and Woessner,J.F. eds), 1998-2002.

91. Nishii W., Maruyama Т., Matsuoka R., Muramatsu T. and Takahashi,K. (2002) The unique sites in SulA protein preferentially cleaved by ATP-dependent Lon protease from Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 269,451-457.

92. Waxman L., Goldberg A.L. (1985) Protease La, the lon gene product, cleaves specific fluorogenic peptides in an ATP-dependent reaction. J. Biol. Chem., 260(22), 12022-12028.

93. Thomas-Wohlever, J., Lee, I. (2002) Kinetic characterization of the peptidase activity of Escherichia coli Lon reveals the mechanistic similarities in ATP-dependent hydrolysis of peptide and protein substrates. Biochemistry, 41, 9418-9425.

94. Hilliard J.J., Simon L.D., Van Melderen L., Maurizi M.R. (1998) PinA inhibits ATP hydrolysis and energy-dependent protein degradation by Lon protease. J. Biol. Chem., 273, 524-527.

95. Tomoyasu Т., Yamanaka K„ Murata K., Suzaki Т., Bouloc P., Kato A., Niki H., Hiraga S., Ogura T. (1993) Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J. Bacteriol., 175(5), 1352-1357.

96. Akiyama Y., Yoshihisa Т., Ito K. (1995) FtsH, a membrane-bound ATPase, forms a complex in the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 270(40), 23485-23490.

97. Herman C., Lecat S., D'Ari R,, Bouloc P. (1995) Regulation of the heat-shock response depends on divalent metal ions in an hflB mutant of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 18(2), 247-255.

98. Saikawa N., Ito K., Akiyama Y. (2002) Identification glutamic acid 479 as the gluzincin coordinator of zinc in FtsH (HflB). Biochemistry, 41, 1861-1868.

99. Shotland Y., Teff D., Koby S., Kobiler 0., Oppenheim,A.B. (2000) Characterization of a conserved alpha-helical, coiled-coil motif at the C-terminal domain of the ATP-dependent FtsH (HflB) protease of Escherichia coli. J. Mol. Biol, 299, 953-964.

100. Akiyama Y„ Kihara A., Tokuda H., Ito K. (1996) FtsH (HflB) is an ATP-dependent protease selectively acting on SecY and some other membrane proteins. J. Biol. Chem., 271(49), 31196-31201.

101. Tomoyasu Т., Yamanaka K., Murata K., Suzaki Т., Bouloc P., Kato A., Niki H., Hiraga S., Ogura T. (1993) Topology and subcellular localization of FtsH protein in Escherichia coli. J. Bacteriol., 175(5), 1352-1357.

102. Kihara A., Akiyama Y., Ito K. (1999) Dislocation of membrane proteins in FtsH-mediated proteolysis. EMBOJ. 18(11), 2970-2981.

103. Akiyama,Y. and Ito,K. (2003) Reconstitution of membrane proteolysis by FtsH. J. Biol. Chem., 278,18146-18153.

104. Chiba,S., Akiyama,Y. and Ito,K. (2002) Membrane protein degradation by FtsH can be initiated from either end. J. Bacteriol., 184,4775-4782.

105. Kanemori M., Yanagi H., Yura T. (1999) Marked instability of the sigma(32) heat shock transcription factor at high temperature. Implications for heat shock regulation. J. Biol. Chem., 274(31), 22002-22007.

106. Rist W., Jorgensen T.J., Roepstorff P., Bukau В., Mayer M.P. (2003) Mapping temperature-induced conformational changes in the Escherichia coli heat shock transcription factor sigma 32 by amide hydrogen exchange. J. Biol. Chem., 278(51), 51415-51421.

107. Пб.Окипо Т., Yamada-Inagawa Т., Karata К., Yamanaka К., Ogura Т. (2004) Spectrometric analysis of degradation of a physiological substrate sigma32 by Escherichia coli AAA protease FtsH. J. Struct. Biol., 146(1-2), 148-54.

108. Herman C., Thevenet D., D'Ari R., Bouloc,P. (1997) The HflB protease of Escherichia coli degrades its inhibitor lambda CHI. J., Bacteriol., 179, 358-363.

109. Prajapati R.S., Ogura Т., Cutting S.M. (2000) Structural and functional studies on an FtsH inhibitor from Bacillus subtilis. Biochim. Biophys. Acta, 1475, 353-359.

110. Hwang B.J., Woo K.M., Goldberg A.L., Chung C.H. (1988) Protease Ti, a new ATP-dependent protease in Escherichia coli, contains protein-activated ATPase and proteolytic functions in distinct subunits. J. Biol. Chem., 263(18), 8727-8734.

111. Gottesman S., Clark W.P., de Crecy-Lagard V., Maurizi M.R. (1993) ClpX, an alternative subunit for the ATP-dependent Clp protease of Escherichia coli. Sequence and in vivo activities. J. Biol. Chem., 268(30), 22618-22626.

112. Maurizi M.R., Clark W.P., Kim S.H., Gottesman S. (1990) Clp P represents a unique family of serine proteases. J. Biol. Chem., 265(21), 12546-12552.

113. Wang J., Hartling J.A., Flanagan J.M. (1998) Crystal structure determination of Escherichia coli ClpP starting from an EM-derived mask. J. Struct. Biol., 124(2-3), 151-163.

114. Thompson M.W., Maurizi M.R. (1994) Activity and specificity of Escherichia coli ClpAP protease in cleaving model peptide substrates. J. Biol. Chem., 269(27), 18201 -18208.

115. Maurizi M.R., Thompson M.W., Singh S.K., Kim S.H. (1994) Endopeptidase Clp: ATP-dependent Clp protease from Escherichia coli. Methods Enzymol., 244, 314-331.

116. Lupas A., Flanagan J.M., Tamura Т., Baumeister W. (1997) Self-compartmentalizing proteases. Trends Biochem. Sci., 22(10), 399-404.

117. Beuron F., Maurizi M.R., Belnap D.M., Kocsis E., Booy F.P., Kessel M., Steven A.C.(1998) At sixes and sevens: characterization of the symmetry mismatch of the ClpAP chaperone-assisted protease. J. Struct. Biol., 123(3), 248-259.

118. Levchenko I., Smith C.K., Walsh N.P., Sauer R.T., Baker T.A. (1997) PDZ-like domains mediate binding specificity in the Clp/HsplOO family of chaperones and protease regulatory subunits. Cell, 91, 939-947.

119. Ortega J., Singh S.K., Ishikawa Т., Maurizi M.R. and Steven A.C. (2000) Visualization of substrate binding and translocation by the ATP-dependent protease, ClpXP. Mol. Cell, 6, 1515-1521.

120. Lee C„ Schwartz M.P., Prakash S., Iwakura M. and Matouschek A. (2001) ATP-dependent proteases degrade their substrates by processively unraveling them from the degradation signal. Mol. Cell, 7, 627-637.

121. Reid B.G., Fenton W.A., Homwich A.L. and Weber-Ban E.U. (2001) ClpA mediates directional translocation of substrate proteins into the ClpP protease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98, 3768-3772.

122. Arribas J., Castano J.G. (1993) A comparative study of the chymotrypsin-like activity of the rat liver multicatalytic proteinase and the ClpP from Escherichia coli. J. Biol. Chem., 268, 21165-21171.

123. Halperin Т., Ostersetzer O. and Adam Z. (2001) ATP-dependent association between subunits of Clp protease in pea chloroplasts. Planta, 213, 614-619.

124. Kang M.S., Lim B.K., Seong I.S., Seol J.H., Tanahashi N., Tanaka K., Chung C.H. (2001) The ATP-dependent CodWX (HslVU) protease in Bacillus subtilis is an N-terminal serine protease. EMBO J., 20(4), 734-742.

125. Yoo S.J., Shim Y.K., Seong I.S., Seol J.H., Kang M.S., Chung C.H. (1997) Mutagenesis of two N-terminal Thr and five Ser residues in HsIV, the proteolytic component of the ATP-dependent HslVU protease. FEBS Lett., 412(1), 57-60.

126. Rohrwild M., Pfeifer G., Santarius U„ Muller S.A., Huang H.C., Engel A., Baumeister W., Goldberg A.L. (1997) The ATP-dependent HslVU protease from Escherichia coli is a four-ring structure resembling the proteasome. Nat. Struct. Biol., 4(2), 133-139.

127. Yoo S.J., Seol J.H., Seong I.S., Kang M.S., Chung C.H. (1997) ATP binding, but not its hydrolysis, is required for assembly and proteolytic activity of the HslVU protease in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 238(2), 581-585.

128. Bochtler M., Hartmann C., Song H.K., Bourenkov G.P., Bartunik H.D., Huber R. (2000) The structures of HslU and the ATP-dependent protease HsIU-HsIV. Nature, 403(6771), 800-805.

129. Bochtler M., Ditzel L., Groll M., Huber R. (1997) Crystal structure of heat shock locus V (HsIV) from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(12), 6070-6074.

130. Lowe J., Stock D., Jap В., Zwickl P., Baumeister W., Huber R. (1995) Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science, 268(5210), 533-539.

131. Groll M., Brandstetter H., Bartunik H., Bourenkow G., Huber R. (2003) Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J. Mol. Biol., 327(1), 75-83.

132. Pickart C.M. (1997) Targeting of substrates to the 26S proteasome. FASEB J., 11(13), 10551066.

133. Grziwa A., Baumeister W., Dahlmann В., Kopp F. (1991) Localization of subunits in proteasomes from Thermoplasma acidophilum by immunoelectron microscopy. FEBS Lett., 290(1-2), 186-190.

134. Seemiiller E., Lupas A., Stock D., Lowe J., Huber R. and Baumeister W. (1995) Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science, 268, 579-582.

135. Groll M., Huber R. (2003) Substrate access and processing by the 20S proteasome core particle. Int. J. Biochem. Cell Biol., 35(5), 606-616.

136. Maupin-Furlow J.A., Gil M.A., Karadzic I.M., Kirkland P.A., Reuter C.J. (2004) Proteasomes: perspectives from the Archaea. Front. Biosci., 9, 1743-1758.

137. Kisselev A.F., Songyang Z., Goldberg A.L. (2000) Why does threonine, and not serine, function as the active site nucleophile in proteasomes? J. Biol. Chem., 275(20), 14831-14837.

138. Zwickl P., Seemuller E., Kapelari В., Baumeister W. (2001) The proteasome: a supramolecular assembly designed for controlled proteolysis. Adv. Protein Chem., 59, 187222.

139. Claverol S., Burlet-Schiltz O., Girbal-Neuhauser E., Gairin J.E., Monsarrat B. (2002) Mapping and structural dissection of human 20 S proteasome using proteomic approaches. Mol. Cell. Proteomics, 1(8), 567-578.

140. Heinemeyer W., Fischer M., Krimmer Т., Stachon U., Wolf D.H. (1997) The active sites of the eukaryotic 20 S proteasome and their involvement in subunit precursor processing. J. Biol. Chem., 272(40), 25200-25209.

141. Arendt C.S., Hochstrasser M. (1997) Identification of the yeast 20S proteasome catalytic centers and subunit interactions required for active-site formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(14), 7156-7161.

142. Kisselev A.F., Akopian T.N., Castillo V., Goldberg A.L. (1999) Proteasome active sites allosterically regulate each other, suggesting a cyclical bite-chew mechanism for protein breakdown. Mol. Cell, 4(3), 395-402.

143. Zwickl P., Ng D„ Woo K.M., Klenk H.P., Goldberg A.L. (1999) An archaebacterial ATPase, homologous to ATPases in the eukaryotic 26 S proteasome, activates protein breakdown by 20 S proteasomes. J. Biol. Chem., 274(37), 26008-26014.

144. Dubiel W., Ferrell K., Pratt G., Rechsteiner M. (1992) Subunit 4 of the 26 S protease is a member of a novel eukaryotic ATPase family. J. Biol. Chem., 267(32), 22699-22702.

145. WolIenberg K., Swaffield J.C. (2001) Evolution of proteasomal ATPases. Mol. Biol. Evol., 18(6), 962-974.

146. Waxman L., Fagan J.M., Goldberg A.L. (1987) Demonstration of two distinct high molecular weight proteases in rabbit reticulocytes, one of which degrades ubiquitin conjugates. J. Biol. Chem., 262(6), 2451-2457.

147. Hough R., Pratt G., Rechsteiner M. (1987) Purification of two high molecular weight proteases from rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem., 262(17), 8303-8313.

148. Eytan E., Ganoth D., Armon Т., Hershko A. (1989) ATP-dependent incorporation of 20S protease into the 26S complex that degrades proteins conjugated to ubiquitin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(20), 7751-7755.

149. Hochstrasser M. (1996) Ubiquitin-dependent protein degradation. Annu. Rev. Genet., 30, 405-439.

150. Haas A.L., Siepmann T.J. (1997) Pathways of ubiquitin conjugation. FASEB J., 11(14), 1257-1268.

151. Gottesman S., Maurizi M.R., Wickner S. (1997) Regulatory subunits of energy-dependent proteases. Cell, 91(4), 435-438.

152. Yamada-Inagawa Т., Okuno Т., Karata K., Yamanaka K., Ogura T. (2003) Conserved pore residues in the AAA protease FtsH are important for proteolysis and its coupling to ATP hydrolysis. J. Biol. Chem., 278(50), 50182-7.

153. Hershko A., Ciechanover A. (1998) The ubiquitin system. Ann. Rev. Biochem., 67,425-479.

154. Lee D.H., Goldberg A.L. (1998) Proteasome inhibitors: valuable new tools for cell biologists. Trends Cell. Biol., 8(10), 397-403.

155. Ciechanover A., Heller H., Katz-Etzion R., Hershko A. (1981) Activation of the heat-stable polypeptide of the ATP-dependent proteolytic system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78(2), 761765.

156. Hershko A., Ciechanover A., Rose I.A. (1981) Identification of the active amino acid residue of the polypeptide of ATP-dependent protein breakdown. J. Biol. Chem., 256(4), 1525-1528.

157. Chau V., Tobias J.W., Bachmair A., Marriott D., Ecker D.J., Gonda D.K., Varshavsky A. (1989) Ubiquitin chain is confined to specific lysine in a targeted short-lived protein. Science, 243(4898), 1576-1583.

158. Hershko A. (1996) Lessons from the discovery of the ubiquitin system. Trends Biochem. Sci., 21(11), 445-449.

159. Hershko A., Ciechanover A. (1992) The ubiquitin system for protein degradation. Ann. Rev. Biochem., 61,761-807.

160. Pickart C.M., Rose I.A. (1985) Functional heterogeneity of ubiquitin carrier proteins. J. Biol. Chem., 260(3), 1573-1581.

161. Hadari Т., Warms J.V., Rose I.A., Hershko A. (1992) A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains. Role in protein degradation. J. Biol. Chem., 267(2), 719727.

162. Voges D., Zwickl P., Baumeister W. (1999) The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis. Ann. Rev. Biochem., 68, 1015-1068.

163. Kannan Y., Koga Y., Inoue Y., Haruki M., Takagi M., Imanaka Т., Morikawa M., Kanaya S. (2001) Active subtilisin-like protease from a hyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence. Appl. Environ. Microbiol., 67(6), 2445-52.

164. Du X., Choi I.G., Kim R., Wang W., Jancarik J., Yokota H., Kim SH. (2000) Crystal structure of an intracellular protease from Pyrococcus horikoshii at 2-A resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(26), 14079-84.

165. Chang L.S., Hicks P.M., Kelly R.M. (2001) Protease I from Pyrococcus furiosus. Methods Enzymol., 330,403-13.

166. Halio S.B., Bauer M.W., Mukund S., Adams M., Kelly R.M. (1997) Purification and Characterization of Two Functional Forms of Intracellular Protease Pfpl from the Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus. Appl. Environ. Microbiol., 63(1), 289-295.

167. Громов Б.В. Удивительный мир архей. (1997) Соросовский образовательный журнал. 4, 23-26.

168. De Castro R.E., Maupin-Furlow J.A., Gimenez M.I., Herrera Seitz M.K., Sanchez J.J. (2006) Haloarchaeal proteases and proteolytic systems. FEMS Microbiol. Rev., 30(1), 17-35.

169. Rose R.W., Bruser T, Kissinger J.C., Pohlschroder M. (2002) Adaptation of protein secretion to extremely high-salt conditions by extensive use of the twin-arginine translocation pathway. Mol. Microbiol., 45(4), 943-50.

170. Tamura N., Lottspeich F., Baumeister W., Tamura T. (1998) The role of tricorn protease and its aminopeptidase interacting factors in cellular protein degradation. Cell, 95(5), 637-48.

171. Bosch J., Tamura Т., Bourenkov G., Baumeister W., Essen L.O. (2001) Purification, crystallization, and preliminary X-ray diffraction analysis of the Tricorn protease hexamer from Thermoplasma acidophilum. J. Struct. Biol., 134(1), 83-7.

172. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H., Clausen Т., Huber R. (2005) Molecular machines for protein degradation. Chembiochem., 6(2), 222-56.

173. Yao T, Cohen R.E. (1999) Giant proteases: beyond the proteasome. Curr. Biol., 12; 9(15), 551-3.

174. Chen L., Brugger K., Skovgaard M„ Redder P., She Q, Torarinsson E., Greve B, Awayez M., Zibat A., Klenk H.P., Garrett R.A. (2005) The Genome of Sulfolobus acidocaldarius, a Model Organism of the Crenarchaeota. J. Bacteriol., 187(14), 4992-4999.

175. Lin X., Fusek M., Tang J. (1991) Thermopsin, a thermostable acid protease from Sulfolobus acidocaldarius. Adv. Exp. Med. Biol., 306,255-7.

176. Maupin-Furlow JA, Gil MA, Humbard MA, Kirkland PA, Li W, Reuter CJ, Wright AJ.2005) Archaeal proteasomes and other regulatory proteases. Curr. Opin. Microbiol., 8(6), 720-8.

177. Maupin-Furlow JA, Gil MA, Karadzic IM, Kirkland PA, Reuter CJ. (2004) Proteasomes: perspectives from the Archaea. Front. Biosci., 9, 1743-58.

178. Zwickl P., Ng D., Woo K.M., Klenk H.P., Goldberg A.L. (1999) An archaebacterial ATPase, homologous to ATPases in the eukaryotic 26 S proteasome, activates protein breakdown by 20 S proteasomes. J. Biol. Chem., 274(37), 26008-26014.

179. Reuter CJ, Kaczowka SJ, Maupin-Furlow JA. (2004) Differential regulation of the Pan A and PanB proteasome-activating nucleotidase and 20S proteasomal proteins of the haloarchaeon Haloferax volcanii. J. Bacteriol., 186(22), 7763-7772.

180. Zwickl P., Seemuller E., Kapelari В., Baumeister W. (2001) The proteasome: a supramolecular assembly designed for controlled proteolysis. Adv. Protein Chem., 59, 187222.

181. Kisselev A.F., Songyang Z., Goldberg A.L. (2000) Why does threonine, and not serine, function as the active site nucleophile in proteasomes? J. Biol. Chem., 275(20), 14831-14837.

182. Maupin-Furlow JA, Humbard MA, Kirkland PA, Li W, Reuter С J, Wright AJ, Zhou G.2006) Proteasomes from structure to function: perspectives from Archaea. Curr. Top. Dev. Biol., 75,125-69.

183. Метелина A.J1. (2001) Жгутики прокариот как система биологической подвижности. Успехи биол. химии, 41, 229-282.

184. Albers S.V., Szabo Z., Driessen A.J. (2003) Archaeal homolog of bacterial type IV prepilin signal peptidases with broad substrate specificity. J. Bacteriol., 185(13), 3918-25

185. Bardy SL, Jarrell KF. (2003) Cleavage of preflagellins by an aspartic acid signal peptidase is essential for flagellation in the archaeon Methanococcus voltae. Mol. Microbiol., 50(4), 133947.

186. Szabo Z., Albers S.V., and Driessen A.J. (2006) Driessen active-site residues in the type IV prepilin peptidase homologue PibD from the archaeon Sulfolobus solfataricus. J. Bacteriol., 188(4), 1437-43.

187. Lemberg MK, Menendez J, Misik A, Garcia M, Koth CM, Freeman M. (2005) Mechanism of intramembrane proteolysis investigated with purified rhomboid proteases. EMBO J., 24(3), 464-72.

188. Ротанова T.B. (2002) Пептидгидролазы с каталитической диадой Ser Lys. Сходство и различия активных центров АТР-зависимых Lon-протеиназ, репрессоров LexA, сигнальных пептидаз и протеиназ С-концевого процессинга. Вопр. мед. химии, 48(6), 541-552.

189. Wagner I., van Dyck L., Savel'ev A.S., Neupert W., Langer T. (1997) Autocatalytic processing of the ATP-dependent PIM1 protease: crucial function of a pro-region for sorting to mitochondria. EMBO J., 16(24), 7317-7325.

190. Chin D.T., GofF S.A., Webster Т., Smith Т., Goldberg A.L. (1988) Sequence of the lon gene in Escherichia coli. A heat-shock gene which encodes the ATP-dependent protease La. J. Biol. Chem., 263(24), 11718-11728.

191. Ротанова Т.В. (2006) Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Структурно-функциональное исследование Ьоп-протеиназы Escherichia coli. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук,

192. Birghan С., Mundt Е., Gorbalenya А.Е. (2000) A non-canonical Lon proteinase lacking the ATPase domain employs the Ser-Lys catalytic dyad to exercise broad control over the life cycle of a double-stranded RNA virus. EMBOJ., 19(1), 114-123.

193. Besche H., Tamura N., Tamura Т., Zwickl P. (2004) Mutational analysis of conserved AAA+ residues in the archaeal Lon protease from Thermoplasma acidophilum. FEBS Lett., 574(1-3), 161-166.

194. Fukui Т., Eguchi Т., Atomi H., Imanaka T. (2002) A membrane-bound archaeal Lon protease displays ATP-independent proteolytic activity towards unfolded proteins and ATP-dependent activity for folded proteins. J. Bacteriol., 184(13), 3689-3698.

195. Besche H., Zwickl P. (2004) The Thermoplasma acidophilum Lon protease has a Ser-Lys dyad active site. Eur. J. Biochem., 271(22), 4361-4365.

196. Novy R., Drott D., Yaeger K., Mierendorf R. (2001) Overcoming the codon bias of E. coli for enhanced protein expression. inNovations, 12, 1-3.

197. Nakamura Y., Gojobori Т., Ikemura T. (2000) Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year. Nucl. Acids. Res., 28, 1.

198. Goldberg A.L., Moerschell R.P., Chung C.H., Maurizi M.R. (1994) ATP-dependent protease La (lon) from Escherichia coli. Methods Enzymol., 244, 350-375.

199. Rasulova F.S., Dergousova N.I., Starkova N.N., Melnikov E.E., Rumsh L.D., Ginodman L.M., Rotanova T.V. (1998) The isolated proteolytic domain of Escherichia coli ATP-dependent protease Lon exhibits the peptidase activity. FEBS Lett., 432(3), 179-181.

200. Расулова Ф.С. (1998) Структурно-функциональное исследование АТР-зависимой Lon-протеиназы Escherichia coli. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

201. Мельников Э.Э., Цирульников К.Б., Ротанова Т.В. (2001) Сопряжение протеолиза и гидролиза АТР при функционировании Lon-протеиназы Escherichia coli. II. Гидролиз АТР и активность пептидгидролазных центров фермента. Биоорган, химия, 27(2), 124133.

202. Цирульников К.Б., Мельников Э.Э., Ротанова Т.В. (2003) Протеолиз, сопряженный с гидролизом АТР. Регуляция активности протеолитических центров Lon-протеиназы Escherichia coli. Биоорган, химия, 29(5), 486-494.

203. Jones C.H., Bolken T.C, Jones K.F., Zeller G.O., Hruby D.E. (2001) Conserved DegP protease in gram-positive bacteria is essential for thermal and oxidative tolerance and full virulence in Streptococcus pyogenes. Infect Immun., 69(9), 5538-45.

204. Bieniossek C., Schalch Т., Bumann M., Meister M., Meier R., Baumann U. (2006) The molecular architecture of the metalloprotease FtsH. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(9); 306671.

205. Цирульников К.Б. (2001) Исследование взаимодействия протеолитического и АТР-азного центров нативной Lon-протеиназы Escherichia coli и ее мутантных форм. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.

206. Erzberger J.P., Berger J.M. (2006) Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 35; 93-114.

207. Rudyak S.G., Brenowitz M., Shrader Т.Е. (2001) Mg2+-linked oligomerization modulates the catalytic activity of the Lon (La) protease from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry, 40(31); 9317-23.

208. Lee AY, Tsay SS, Chen MY, Wu SH. (2004) Identification of a gene encoding Lon protease from Brevibacillus thermoruber WR-249 and biochemical characterization of its thermostable recombinant enzyme. Eur. J. Biochem., 271(4); 834-44.

209. Suzuki CK, Kutejova E, Suda K, (1995) Analysis and purification of ATP-dependent mitochondrial lon protease of Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol., 260; 486-94.

210. Goldberg A.L., Moerschell R.P., Chung C.H., Maurizi M.R. (1994) ATP-dependent protease La (lon) from Escherichia coli. Methods Enzymol., 244, 350-375.

211. Leffers G., Rasulova F., Kessel M., Steven A.C., Leapman R., Gottesman S., Maurizi M.R. (1999) Organization of functional and structural domains in E. coli Lon protease. Meeting on Biology of Proteolysis. Abstracts. Cold Spring Harbor, New York, 52.

212. Lee AY, Hsu CH, Wu SH. (2004) Functional domains of Brevibacillus thermoruber lon protease for oligomerization and DNA binding: role of N-terminal and sensor and substrate discrimination domains. J. Biol. Chem., 279(33), 34903-12.

213. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248254.

214. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259); 680-685.

215. Bencini D.A., Wild J.R., O'Donovan G.A. (1983) Linear one-step assay for the determination of ortophospate. Anal Biochem., 132(2); 254-258.

216. Lanzetta P.A., Alvarez L.J., Reinach P.S. and Candia O.A. (1979) An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem., 100(1); 95-7.

Информация о работе

Маховская, Оксана Владимировна
кандидата химических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Структурная организация и функционирование АТР-зависимой Lon-протеиназы из Archaeoglobus fulgidus - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы