Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активация гена цитохрома Р450вм-3 (CYP102) фенобарбиталом: выявление потенциальных регуляторных элементов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Активация гена цитохрома Р450вм-3 (CYP102) фенобарбиталом: выявление потенциальных регуляторных элементов"

РГО 0/1

на правах рукописи УДК 577.21:577.214.625

ГАЙДАМАКОВА Елена Кирилловна

АКТИВАЦИЯ ГЕНА ЦИТОХРОМА Р450вм-3 (СУР102) ФЕНОБАРБИТАЛОМ: ВЫЯВЛЕНИЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 1997

Работа выполнена в Институте молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Научный руководитель: кандидат биологических наук С. П. Коваленко,

Институт молекулярной патологии и экологической биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук-, профессор С. Н. Щелкуноа, ГНЦВБТ "Вектор", п. Кольцова, Новосибирск

кандидат биологических наук, С. Я. Слободяшок, Институт цитологии и генетики СО РАН, г, Новосибирск

Ведущее учереждение: Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН

Защита диссертации состоится ' " 1997 г ■ на утреннем

заседании диссертационного совета по защите диссертаций на со и ска низ ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-запе Института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, пр-т академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан ' 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

—-—

А, Д. Груздев

Актуальность темы. Многие используемые человеком лекарства приводят к активации генов. Подобная активация либо лежит в основе терапевтического действия препарата, либо приводит к побочным, часто нежелательным эффектам. Таким образом, изучение механизмов активации генов лекарственными препаратами является актуальной задачей. Фенобарбитал (ФБ), широко используемое снотворное и противосудорожное средство, способен активировать транскрипцию десятков генов в организме человека. В частности, в печени человека и животных фенобарбитал активирует несколько генов, кодирующих ферменты цитохромы Р450. Механизм индукции цитохромов Р450 фенобарбиталом активно изучается на протяжении последних тридцати лет. В настоящее время происходит накопление экспериментальных данных о регуляторных элементах генов, вовлеченных в индукцию этого типа.

Ген CYP102 Bacillus megaterium (В.тед.) кодирует цитохром Р450вм-3. Он активируется различными лекарственными препаратами: барбитуратами, кло-фибратами, жирными кислотами. С 1991 года ген CYP102 используется в качестве модельного объекта для изучения молекулярных механизмов активации генов фенобарбиталом.

Целью настоящей работы являлось выявление потенциальных регуляторных элементов гена цитохрома Р450вм-3 (CYP102) В.тед., которые могут участвовать в активации этого гена фенобарбиталом. В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

V Выявить районы ДНК в области гена СУР102, специфически взаимодействующие с клеточными белками В.тед. при культивировании бактерий в среде без ФБ и в среде с ФБ.

2. С помощью футпринт-анализа более точно локализовать районы выявленных ДНК-белковых взаимодействий.

3. Охарактеризовать выявленные белки по молекулярной массе.

4. Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей в белок-связывающих районах с последовательностями известных регуляторных элементов.

Научная новизна работы. В результате проведенного исследования в области гена CYP102 с помощью футпринт-анапиза было выявлено четыре неизвестных ранее района ДНК, которые образуют комплексы с белками только при

культивировании бактерий без ФБ. Это свидетельствует о том, что выявленные районы ДНК являются потенциальными негативными регуляторными элементами гена CYP102. Два выявленных элемента прилегают к старту транскрипции гена CYP102, два расположены в кодирующей области этого гена.

Впервые для генов суперсемзйства Р450 потенциальные регуляторные элементы выявлены в кодирующей области гена. При анализе нуклеотидных последовательностей обнаружено, что локализованные нами потенциальные регуляторные элементы как в области, прилегающей к старту транскрипции, так и в кодирующей области гена CYP102 обладают гомологией с консенсусной последовательностью Барби-бокс (известный регуляторный элемент, найденный до настоящего исследования только в 5'-фланкирующих районах генов, кодирующих ФБ-индуцируемые ферменты).

Впервые продемонстрировано взаимодействие белка с молекулярной массой около 20кДа с двумя двуцепочечными фрагментами ДНК, соответствующими районам в области, прилегающей к старту транскрипции гена CYP102 (выше и ниже старта транскрипции). Впервые для генов цитохромов Р450 выявлен белок, способный специфически взаимодействовать с одноцепочечными районами ДНК в области гена CYP102, прилегающей к старту транскрипции. Показано, что этот белок обладает наибольшим сродством к трем оц участкам ДНК в этой области - к одному участку нетранскрибируемой цепи ДНК и к двум участкам транскрибируемой цепи ДНК. Молекулярная масса этого белка близка к 50 кДа.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные в работе результаты являются новой информацией о возможных регуляторных элементах гена цитохрома Р450вм-3 и способствуют дальнейшему развитию представлений о структурно- функциональной организации генов цитохромов Р450, активируемых лекарственными препаратами. Полученные данные о потенциальных регуляторных элементах гена могут быть полезны в практических работах, связанных с оптимизацией экспрессии гена CYP102 и направленых на создание монооксигеназ с заданными свойствами.

Публикации и апробация работы. По результатам работы опубликовано три статьи. Результаты работы были представлены на семи международных конференциях: "IXth International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation" (1992, Jerusalem), "6th North American ISSX Meeting", (1994, Raleigh, North Carolina), "4th

International ISSX Meeting" (1995, Seattle), "Cytochrome P450 biodiversity", (1995, Woods Hole, Massachusetts), франко-российском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (1995, Новосибирск), "7th North American ISSX Meeting" (1996, San Diego), "Xlth International symposium on Microsomes and Drug Oxidations" (1996, San Francisco).

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 116 страницах, содержит 36 рисунков и 6 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, материалов, методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего 185 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Активация генов цитохромов Р450 Bacillus megaterium фенобарбиталом

В результате экспериментов по дот-гибридизации згР-меченого зонда плаэ-миды рВМ-3 (любезно предоставлена А.Фулко) с суммарной РНК В.тед. и определению содержания цитохромов Р450 в клеточных экстрактах (КЭ) В.тед. обнаружено, что при культивировании В.тед. штамма N 15 из коллекции НПО "Вектор" в присутствии ФБ увеличивается как уровень матричной РНК гена CYP102, так и содержание цитохромов Р450. Эти данные свидетельствуют о том, что фенобарбитал активирует экспрессию гена CYP102 в бактериях исследуемого штамма В.тед.

Выявление фрагментов ДНК в области гена CYP102, способных специфически связываться с белками из клеточного экстракта В.тед.

Рестрикционные фрагменты ДНК, составляющие 1328 н.п. 5'- фланкирующей области гена CYP102 и 1240 н.п. его кодирующей области (из плазмиды рВМ-3) проанализированы на способность формировать ДНК-белковые комплексы с помощью анализа задержки ДНК в геле (ГР-анализа). В результате выявлено четыре белок-связывающих фрагмента ДНК, способных взаимодействовать с клеточными белками В.тед. Фрагменты ДНК -215/+83 ("298н.п."), +237/+318 ("82 н.п ") и +319/ +425 ("103 н.п."), -279/-214 ("64н.п") изменяют подвижность после инкубации с КЭ неиндуцированных В.тед., в то время как после инкубации их КЭ В.тед., индуцированных ФБ, подвижность фрагментов не меняется. Протеиназная обработка приводит к полному исчезновению задержки фрагментов ДНК в геле. Это говорит о том, что в В.тед. присутствуют белковые факторы' (фактор), которые обладают сродством к районам ДНК гена CYP102: -215/+83 ("298н.п"), -279/-214 ("64н.п") и

+237/+425 ("82 н.п."+ "103 н.п."). Поскольку ДНК-белковое связывание в этих районах не выявляется при инкубации фрагментов ДНК с КЭ В.твд., выросших в присутствии ФБ, вполне вероятно, что с фрагментами ДНК "298 н.п.", "64 н.п.", "82н.п." и "ЮЗн.п." связываются негативные факторы транскрипции (белки-репрессоры). Фрагмент "64 н.п," содержит охарактеризованный ранее Армандом Фулко регуля-торный элемент Барби-бокс (ВВЗ), три другие фрагмента не были описаны ранее как белок-связывающие.

Районы ДНК-белковых взаимодействий в выявленных фрагментах ДНК более точно локализовали с помощью футпринт-анализа (ФП-анализа).

Локализация экранируемых белками участков ДНК с помощью футпринт (ФП)-анализа С фрагментами ДНК "298 н.п.", "82 н.п." и "103 н.п." был проведен ФП-анализ (рис.1, 2).

■ BamHI Д_-149

LOiQ

-126

1

ti

Hindlll -96 -вб

- Hind III 1 2 3

НЕТРАНСКРИБИРУЕМАЯ ЦЕПЬ

BamHI

4 5

ТРАНСКРИБИРУЕМАЯ ЦЕПЬ

Рис.1. Локализация районов ДНК, экранируемых "ФБ-зависимыми" белками из КЭ В.твд. в прилегающей к старту транскрипции области гена CYP102 (-112 -старт транскрипции). ФП анализ, 4% ПААГ, 7 М мочевина. 3!Р-меченый фрагмент "298 " был обработан ДНКазойI после инкубации: 1 - без клеточного экстракта; 2,4-сКЭ В.meg., выросших в среде с ФБ; 3, 5- с КЭ неиндуцированных В. meg. Экранируемые белком участки ДНК обозначены прямоугольниками.

О

+ ав +

НтсМН

+378

+398

ВатН1

ВатН1

+389

+373

Н'тсШ!

о шйсэ

НЕТРАНСКРИБИРУЕМАЯ ТРАНСКРИБИРУЕМАЯ

ЦЕПИ ФАГМЕНТА ДНК "103"

Рз1 +262

+277

ВатН1

О ш"}©

+ а @

¡^ V

'Ш8

я;

2

£3 ,

ш

I

НЕТРАНСКРИБИРУЕМАЯ ЦЕПЬ ФРАГМЕНТА "82"

Рис.2. Локализация районов ДНК в кодирующей части гена СУР102, экранируемых "ФБ-зависимым" белком из клеточного экстракта Вас.теда(епит. Футпринт-анализ, 6-10% ПААГ, 7М мочевина.

Из приведенных данных ФП-анализов с фрагментами "298 н.п." (рис.1), "82 н.п." (в составе фрагмента "185 н.п.") и "103 н.п." (рис.2) следует, что в клеточном экстракте В.meg. присутствуют белки (белок), экранирующие на нетранскрибируе-мой цепи ДНК области -149/-125, +262/+277, +373/+398 и на транскрибируемой цепи: -Э6/-86 и +373/+389, где +1 - начало трансляции гена CYP102. Поскольку взаимодействия этих белков с ДНК не выявляются после ФБ-индукции, вышеуказанные районы ДНК являются потенциальными негативными регуляторными элементами гена CYP102.

ДНК-белковые взаимодействия в области гена CYP102, прилегающей к старту транскрипции Для характеристики белков, взаимодействующих с ДНК в области гена CYP102, прилегающей к старту транскрипции, район -164/-66, включающий " фут-принты" -149/-125 на нетранскрибируемой цепи ДНК и -Э6/-88 на транскрибируемой цепи ДНК, был разбит на части (старт транскрипции находится в положении -112, если +1-старт трансляции). Были синтезированы 5 одноцепочечных (оц) олигонукле-отидов, составляющих нетранскрибируемую цепь фрагмента ДНК (А1-А5) и 5 оц

олигонуклеотидов, составляющих транскрибируемую цепь фрагмента ДНК (В1-В5)

(рис.3).

(А)

cgctaattgctattttatttggaagtttcatggaagtatatgaaa^

gtacc^gattaacgataaaataaaccttcaaagtaccttcatatac^

I-Ч-Ч-'I--;—M

1 B1 1 |_В2_-13г I вз 1 В4 : 1 . В5 '

-164 -15] В7 -112 -90 -70

|С| ! [1'1

Рис.3. (А) - Схематическое представление организации ä-фланкирующей области гена CYP102. PI, Р2 - промоторы, Olli - оператор, ВВЗ - регуляторный элемент Барби-бокс (Ruettinger et а!., 1989; Не & Fulco, 1991). (Б) - последователь-

ность нуклеотидов -164/-66, если +1 - начало трансляции гена CYP102. А1-А5, В1-В5, В7, [М], [Р], [С] - олигонуклеотиды, используемые в настоящем исследовании. Выявленные инвертированные повторы обозначены стрелками. Районы ДНК, защищенные от действия ДНКазыI, подчеркнуты.

В результате стало возможным получать дц фрагменты ДНК, соответствующие различным районам исследуемой области. Дц фрагменты ДНК получали следующим образом: после отжига частично комплементарных олигонуклеотидов А1 и В2, А2 и ВЗ, АЗ и В4, А4 и В5 достраивали З'-концы по матрице выступающих 5'-концов с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы1 E.coli. Все оц олигонуклеотиды и дц фрагменты ДНК были использованы в экспериментах по задержке в геле. При концентрации олигонуклеотидов в реакции связывания с белками 2X10"° М задержка в геле выявляется только для трёх из десяти олигонуклеотидов: А4, ВЗ и В5 (рис.3,4), то есть, оц участки ДНК в промоторной области гена CYP102, соответствующие позициям -105/-84 (А4) на нетранскрибируемой цепи и -132/-113 (ВЗ), -90/66 (В5) на транскрибируемой цепи, обладают наиболее высоким сродством к белкам из КЭ В.тед.

А4 ВЗ В4 В5 А4/В5 А2/ВЗ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Рис.4. Связывание белков из КЭ В.тед. с 32Р-меченой ДНК оц и дц олигонуклеотидов (2х 1СГ' М) из -164/-66 района гена CYP102, где +1 - начало трансляции. ГР-анализ, 1-12 - 20% ПААГ, 13-18 - 8%ПААГ. Олигонуклеотиды инкубировали: 2, 5, 8, 11, 14, 17 - в буфере без экстракта; 1, 4, 7, 10, 13, 16 - с КЭ В.тед., выросших без индукции; 3, 6, 9, 12,15, 18-сКЭ В.тед., выросших в среде с ФБ.

Результаты аналогичных экспериментов, проведённых с ДНК-дуплексами А1/В2 (27 н.п.), А2/ВЗ (32 н.п.), АЗ/В4 (35 н.п.), А4/В5 (39 н.п.), показывают, что наибольшим сродством к белкам из КЭ В.тед. обладают двуцепочечные районы ДНК -144/-113 (А2/ВЗ или дуплекс I) и -105/-66 (А4/В5 или дуплекс II) (рис.3, 4).

На авторадиограммах, представленных на рис.4, выявляется два типа ДНК-белковых комплексов. Комплексы с меньшей электрофоретической подвижностью в геле формируются только с белками из экстрактов клеток, выращенных в отсутствии ФБ (условно названы нами комплексы "ДНК-ФБ-зависимый белок"). ДНК-белковое связывание такого типа характерно для дуплексов I и II и оц олигонуклео-тида В5. Комплексы с большей подвижностью в геле формируются с белками из экстрактов клеток вне зависимости от наличия ФБ в среде выращивания В.тед. (комплексы "ДНК-ФБ-независимый белок"). ДНК-белковое связывание этого типа наиболее характерно для трёх оц олигонуклеотидов А4, ВЗ и В5 и для двуцепочеч-ного фрагмента - дуплекса I. Выявленные ДНК-белковые комплексы двух типов ("ФБ-зависимые" и "ФБ- независимые") могут отражать наличие в клетках В.тед. двух белков, обладающих высоким сродством к оц и дц участкам ДНК промоторной области гена CYP102.

Для дальнейшего изучения выявленных ДНК-белковых взаимодействий мы обогатили КЭ "ФБ-зависимым" и "ФБ-независимым" белком с использованием ступенчатого осаждения белков полиэтиленгликолем. Оказалось, что "ФБ-зависимый белок" осаждается в узком интервале концентраций ПЭГ (11-12%), в то время, как ФБ-независимый белок - в более широком интервале концентраций (11%-16%). В дальнейших экспериментах мы использовали фракцию "11+12% ПЭГ для изучения сиквенс-специфичности ДНК-белковых взаимоотношений и оценки сродства оц и дц фрагментов ДНК к выявленным белкам.

Эксперименты по изучению влияния различных ДНК-конкурентов на белковые комплексы с оц олигонуклеотидами ВЗ, А4 и В5 и дуплексами I и II показали, что взаимодействия этих олигонуклеотидов с выявленными белками являются специфическими. В качестве конкурентов использовали дц фрагмент ДНК "91 н.п." из плазмиды pGEM1, олигонуклеотид В1, рлигонуклеотид рТ15, а также смесь олигонуклеотидов, использующаяся в качестве статистической затравки для мечения ДНК (из набора фирмы "Fermentas").

На рисунке 5 приведены типичные результаты ГР-анализов с конкурентной ДНК на примере оц олигонуклеотида В5 в качестве ДНК-пробы и олигонуклестида В1 в качестве конкурентной ДНК.

В1 В5 (не меченые) _конкурентная ДНК

з з» зоо з 30 зоо

10 100 1000 10 100 1000

к к

— старт

— молярный избыток

— комплекс "ДНК-ФБ-зависимый белок"

а

комплекс "ДНК-ФБ-независимый белок"

Рис.5. Изучение сиквенс-специфичности взаимодействий 12Р-иеченого оц олигонуклеотида В5 (Зх 1(Т"М) с белками из КЭ В.тед. ГР-анализ, 13% ПААГ. Экстракт был приготовлен из клеток В.тед., выросших без индукции. В реакции связывания "ДНК-белок" использовали "частично-фракционированный" КЭ ("1112% ПЭГ). К - связывание белков с олигонукпеотидом В5 без конкурентной ДНК.

При использовании в качестве конкурентной ДНК олигонукпеотидов из исследуемой области оказалось, что дц фрагмент А2/В7 конкурирует с дуплексом II за связывание с "ФБ-зависимым белком". Это говорит о том, что один и тот же белок (ФБ-зависимый) может взаимодействовать как с областью ФП выше старта транскрипции, так и с областью ФП ниже старта транскрипции.

Оц олигонуклеотиды А4, ВЗ и В5 конкурируют с дуплексом I за связывание с ФБ-независимым белком, то есть, один и тот же белок (ФБ-независимый) может взаимодействовать как с дуплексом I, так и с тремя выявленными оц олигонукпео-тидами.

Для сравнения сродства "ФБ-зависимого белка" и "ФБ-независимого белка" к участкам ДНК из области ниже старта транскрипции (-105/-66) были проведены

к

эксперименты по задержке в геле оц олигонуклеотида В5 и дуплекса II. В реакциях связывания "ДНК-белок" титровали количество меченой ДНК (рис.6).

(А)

• ^_ комплекс I: "ДНК В5-

ФБ-зависимый белок"

(Б)

комплекс II: "ДНК В5-ФБ-независимый белок"

"Р-меченая оц ДНК В5

- концентрация меченого

олигонуклеотида

комплекс III: "ДНК А4/В5-ФБ-зависимый белок"

комплекс IV: "ДНК А4/В5-ФБ-независимый белок"

"Р-меченая дц ДНК А4/В5

Рис.6. Влияние концентрации згР-меченого олигонуклеотида на его связывание с "ФБ-зависимым" и "ФБ-независимым" белками из частично фракционированного экстракта В.тед. ГР-анализ (А) - с 32Р-меченой ДНК оц олигонуклеотида В5, 13% ПААГ, (Б) - с "Р-меченой ДНК олигонуклеотидного дуплекса А4/В5, 10 % ПААГ.

При концентрации 6,25X10® М олигонуклеотида В5 на авторадиограмме выявляется преимущественно комплекс "ДНК-ФБ-независимый белок" (комплекс II), в то время, как дуплекс II при этой концентрации более эффективно связывает -

ся с "ФБ-зависимым белком" (комплекс III). Это может говорить о том, что "ФБ-зависимый белок" обладает большим сродством к дц ДНК в области -105/-66, в то время как "ФБ-независимый белок" обладает большим сродством к оц участку ДНК -90/-66 транскрибируемой цепи ДНК.

Для количественной оценки разного сродства оц и дц фрагментов ДНК к "ФБ-зависимому" и "ФБ-независимому" белкам мы определили константы диссоциации выявленных ДНК-белковых комплексов по результатам ГР-анапиэов, варьируя в широких пределах концентрацию меченой ДНК (от 0,8 до 200 нМ). Кажущиеся константы диссоциации (KA"°*) для четырёх ДНК-белковых комплексов оценивали из кривых насыщения, допуская, что белковые молекулы имеют один центр связывания с ДНК. Кд™* считали равными концентрациям меченых олигонуклеоти-дов, необходимых для половины максимального связывания (Мецлер, 1980).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что наиболее прочными являются комплексы [оц В5»"ФБ-независимый белок"] (комплекс II) и [дц А4/В5*"ФБ-эависимый белок"] (комплекс III). Наименее прочный комплекс [дц А4/В5*"ФБ-независимый белок"] (комплекс IV). Полученные значения Кд^дпя комплексов следующие: Кдвя(1)=17нМ1 Кдиж(11)=5нМ, КдМЖ(П1)=8нМ, Кд™*(1\/)>50нМ.

Для оценки молекулярной массы выявленных белков использовали фотоак-тивируемые реакционноспособные производные олигонукпеотидов.

Аффинную модификацию белков клеточных экстрактов проводили в двух вариантах: в одном случае в реакциях модификации белков мы использовали ре-акционноспособное производное оц олигонукпеотида [Р] (-85/-7Б) (рис.3.рис.7А), в другом случае модификацию осуществляли с использованием реакционноспособ-ного производного оц олигонукпеотида [Р] в составе дц ДНК (рис.3, рис.7Б).

На авторадиограмме геля (рис.7А) видно, что реакционноспособное производное одноцепочечного олигонукпеотида [Р] модифицирует, как минимум, три белка из экстрактов В.тед. Однако, при уменьшении концентрации реакционно-способного производного в реакции модификации до 60 нМ модифицируется лишь один белок с молекулярной массой около 50кДа. То есть, белок с молекулярной массой около 50 кДа обладает наибольшим сродством к оц участку ДНК, соответствующему оц олигонукпеотиду [Р].

(А)

10"бх

(Б)

И

"1

Ф ,„юсдсосо^2 о о"о"о"о"о'

м

С Р

— О +

.., - •

52 кЭа 23 кОа

*1

я ■

12 3 4 5 6 7 8

Б"50"

, ; 4 Б"20"

91011 12

Рис.7. Результаты аффинной модификации белков из клеточного экстракта В.тед. реакционноспособными производными олигонукпеотидов из района -96/76 гена СУР102. Авторадиограммы гелей, 12% ПААГ, 0,1% вОЭ. 1,9 - маркер молекулярной массы ¡дв, модификация рвакционноспособным производным оли-гонукпеотида -65/-76 [Р] в концентрации 10°М. Белки из "грубого" экстракта В.тед. модифицировали реакционноспособными производными олигонукпеотидов: 2, 10 -[Р] в концентрации 1СГ*М; 3, 4, 5, 6, 7, 8, - [Р] в уменьшающихся концентрациях от 5х1СГ7до 1,5х1(1еМ; 11 -[С] и [Р] в экеимолярных концентрациях (1СГ°М); 12 -[М], [С] и [Р] в экеимолярных концентрациях (1СГ°М).

Для характеристики ФБ-зависимого белка, обладающего высоким сродством к двуцепочечной ДНК в области ФП ниже старта транскрипции (-Э6/-76), была использована бинарная система реагентов, созданная и охарактеризованная сотрудниками Новосибирского института биоорганической химии (Добриков и др., 1995; \Zlassov е1а!.. 1996). Данная система позволяет при определённых условиях

Р

облучения наиболее эффективно проводить аффинную модификацию белков, специфически связывающихся с ДНК в двуцепочечном состоянии. На рис.7Б представлены данные по аффинной модификации белков из КЭ В.тед. фотоактивным производным [Р] в составе дц олгонукпеотидного комплекса [М]+[Р]*+[С]. Оц [Р] в составе дц олигонуклеотидного комплекса активнее модифицирует белок с молекулярной массой "20кДа". То есть, белок с молекулярной массой 20кДа обладает большим сродством к дц ДНК в районе футпринта ниже старта транскрипции.

Суммируя полученные данные по аффинной модификации белков, конкурентному ингибированию ДНК-белкового связывания и сравнению сродства выявленных белков к оц и дц фрагментам ДНК из области, прилегающей к старту транскрипции гена СУР 102, мы сделали вывод, что белок, имеющий молекулярную массу около "50кДа", участвует в формировании ФБ-независимого ДНК-белкового комплекса, обладающего большим сродством к трем выявленным оц участкам ДНК промоторной области (A4, ВЗ, В5), в то время как белок, имеющий молекулярную массу около "20кДа' формирует ФБ-зависимый ДНК-белковый комплекс, который обладает большим сродством к двум двуцепочечным участкам ДНК, примыкающим к старту транскрипции гена CYP102 (выше и ниже старта транскрипции).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ген CYP102 В.тед. может экспрессироваться в составе бицистронного оперона Bm3RI/CYP102 (рис.3). В оезультате транскрипции этого оперона образуется бицистронная мРНК, кодирующая как цитохром Р450вм-3, так и белок-репрессор Bm3RI. Связываясь с операторной последовательностью Olli, белок Bm3RI препятствует транскрипции с промотора Р1 (образованию бицистронного транскрипта Bm3RI/CYP102). Наряду с бицистронным транскриптом в клетках В.тед., выращенных в присутствии ФБ, обнаружена и моноцистронная мРНК, начинающаяся с нуклеотида -112 (промотор Р2) (Ruettinger et al., 1989). До настоящего исследования в области промотора Р2 не было обнаружено потенциальных регуляторных элементов.

На рис.3 приведена схема бицистронного оперона Bm3RI/CYP102 и последовательность нукпеотидов -164/-66 (+1 - начало трансляции гена CYP102). С помощью ФП-анапиэа мы локализовали в этой области два района ДНК, экранируемые белком (рис.3). Поскольку белок экранирует эти районы ДНК только в том

случае, когда ген СУР102 находится в репрессированном состоянии, мы предположили, что с областью -164Л66 взаимодействует негативный фактор транскрипции - гипотетический белок-репрессор. Обращает на себя внимание то, что "фугпринты" на транскрибируемой и нетранскрибируемой цепях ДНК располагаются на достаточно удалённом друг от друга расстоянии (три витка спирали ДНК). Предположив, что с ДНК в области промотора Р2 взаимодействуют несколько белков, мы предприняли попытку выявить эти белки, разбив фрагмент ДНК -164/66 на короткие оц и дц олигонуклеотиды.

В результате аффинной модификации клеточных белков В.тед. реакцион-носпособными производными оц и дц олигонуклеотидов из района -Э6/-76, мы охарактеризовали по молекулярной массе два белка, способных специфически взаимодействовать с этим районом ДНК. Белок с молекулярной массой около 20 «Да взаимодействует с большей аффинностью с дц районом -Э6/-76, белок с молекулярной массой около 50 кДа - с оц районом -85/-76.

Результаты экспериментов по торможению ДНК в геле с использованием в качестве конкурентов различных олигонуклеотидов из области -164/-66 и сравнение сродства выявленных белков к оц и дц фрагментам ДНК из области, прилегающей к старту транскрипции гена, свидетельствуют о том, что охарактеризованные нами белки способны взаимодействовать не только с районом -Э6/-76, но и с несколькими другими районами ДНК в области -164/-66.

Белок "20кДа" взаимодействует с ДНК в клетках бактерий, выросших без ФБ-индукции (назван нами "ФБ-зависимый" белок). Он обладает большим сродством к двум двуцепочечным участкам ДНК, примыкающим к старту транскрипции гена СУР102: выше и ниже старта транскрипции.

Белок "50кДа" взаимодействует с ДНК независимо от ФБ-индукции. Он обладает большим сродством к трем оц олигонуклеотидам, соответствующими двум районам на транскрибируемой цепи ДНК и одному району на нетранскрибируемой цепи ДНК в области -132/-66, непосредственно прилегающей к старту транскрипции гена СУР102. В выявленных белок- связывающих районах ДНК в области промотора Р2 мы обнаружили два инвертированных повтора: совершенный инвертированный повтор в области выше старта транскрипции и несовершенный повтор ниже старта транскрипции (рис.3).

Таким образом, мы имеем несколько косвенных доказательств того, что в промоторной области гена CYP102 В.тед. вокруг старта транскрипции расположены две регуляторные последовательности. Сиквенс-специфические ДНК- белковые взаимодействия в этой области зависят от ФБ-индукции, а именно: наблюдаются, когда ген репрессирован и отсутствуют после активации гена фенобарбиталом. Это может говорить о связывании в двух районах промоторной области белка-репрессора. В выявленных районах ДНК-белкового связывания находятся два инвертированных повтора, гомологичных между собой. Наличие инвертированных повторов характерно для операторных последовательностей бактериальных генов. Молекулярная масса белка, обладающего высоким сродством к выявленным дц участкам, около 20 кДа. Возможно, это белок- репрессор Bm3RI, молекулярная масса которого 21 кДа (Shaw Fulco, 1992).

Не меньший интерес, чем выявленный гипотетический репрессор, представляет для нас и выявленный "ФБ-незазисимый" белок, молекулярную массу которого мы оценили в 50 кДа. Этот белок взаимодействует, с большим сродством с тремя оц участками ДНК из промоторной области гена CYP102: -132/-113 и -90/66 на транскрибируемой цепи и -105/ -84 на нетранскрибируемой цепи ДНК. Хочется ещё раз подчеркнуть, что нами доказана сиквенс-специфичность взаимодействий белка "50 кДа" с сц ДНК.

Выявленные нами районы ФБ-зависимого ДНК-белкового связывания в кодирующей области гена CYP102 являются первым примером локализации возможных регуляторных элементов в кодирующей области для генов суперсемейства Р450. В результате анализа последовательностей ДНК в районах выявленных нами "футпринтов" были обнаружены протяжённые инвертированные повторы ДНК, полностью совпадающие с районами ДНК, защищённымии ФБ-зависимыми белками от действия ДНКаэы! (рис.8). Кроме того, оказалось, что последовательности ДНК трёх выявленных "футпринтов" в кодирующей области гена CYP102 обладают высокой гомологией с консенсусной последовательностью "Барби-бокс" (кпБб). Гомология составляет 9-11 нукпеотидов из 15 (рис.8). Мы полагаем, что это серьёзный аргумент за то, что две выявленные нами последовательности ДНК (+25Э/+279 и + 372/+398) в кодирующей области гена CYP102, способные специфически взаимодействовать с "ФБ-зависимыми" белками, являются дополнительными регуляторными сайтами для Bm3RI/CYP102 оперона.

Три выявленные нами Барби-бокс подобные последовательности (Ббпп), совпадающие с ФБ-зависимыми "фугпринтами", являются первым примером локализации Ббпп в кодирующих областях генов ферментов.

+84 НЫШ

+237 Ява!

+318 НЫШ

+425

Ябя!

5' ЦёНИЫо»

+1

АТО

исшисинми

кпБб

ТТ4ГГГ4С44ССТйС1ССС1Т&4 ЖАТ4ИТСТТССиССТСССТ*СТ

ССТ0С»ССТГСТ1С141аСТ&СС10ССТСТ11

сс*сетсс11сиеттттс1ссстссс1с»тт

I—I 111111.1-.

(ЗДССТСЫШСТ! кпБб

I 111111 I

А

+259

+276

+373 +383 +389 +398

Рис.8. Нукпеотиднвя последовательность районов ДНК, защищенных белкам от действия ДНКазы I ([ИЗ ). Выявленные инвертированные повторы обозначены стрелками, кпБб - консенсусная последовательность Барби-бокс. Вертикальными линиями обозначены гомологичные нукпеотиды. +1 - начало трансляции гена СУР102.

1. С помощью фугпринт-анапиза выявлено четыре участка гена СУР 102, которые специфически связываются с белками из клеточного экстракта В.тед. Два участка прилегают к старту транскрипции гена, два находятся в кодирующей области гена (позиции: -149/-126, -Э6/-86, +236/+281, +373/+398, где+1-старт трансляции).

2. Выявлено два белка, которые сиквенс-специфически взаимодействуют с ДНК в области гена СУР 102, прилегающей к старту транскрипции:

а) белок с молекулярной массой около 20кДа взаимодействует с двумя двуцепо-чечными районами ДНК выше и ниже старта транскрипции, если ген находится в репрессированном состоянии;

ВЫВОДЫ

6) белок с молекулярной массой около 50 кДа взаимодействует с одноцепочечны-ми участками ДНК вокруг старта транскрипции гена.

3. ДНК-белковое связывание в локализованных нами с помощью ФП-анапиза районах наблюдается только в репрессированном состоянии гена CYP102, следовательно, эти районы ДНК являются потенциальными негативными регуляторны-ми элементами гена CYP1G2.

4. Выявленные нами потенциальные регуляторные элементы в кодирующей области гена CYP102 обладают высокой гомологией с консенсусом Барби-бокс. На-личиз потенциальных регуляторных элементов в кодирующей области гена впервые продемонстрировано для генов суперсемейства Р450.

Основные результаты работы опубликованы в следующих статьях:

1. Ga'damakova Е.К., Karginov V.A., KovalenKo S.P. Protein-binding DNA regions inside and in the vicinity of the cytochrome P450bm-3 gene from Bacillus megaterium И B:csh=m. & Biophys. Res. Commun., 1994, v. 198, n.3, p.862-868.

2. Vlacsov V.V., Dobnkcv M.I., Gaidamakov S.A., Gaidamakova E.K., Gainutdinov T. and Koshkin A. Binary sistem of oligonucleotide conjugates for sequence specific energy transfer sensitized fotomodification of nucleic acids // In: DNA and RNA cleavers and chemotherapy of cancer and viral diseases. (D. Meunier ed.) Kluver Academic Publishers, Dertrecht, 1SS6, p.195-210.

3. Gaidamakova E.K., A'patov O.V., |lschenko I.V.~| Kovalenko S.P., Lyakhovich V.V. Piienobarbital-tiependent protein binding to Barbie-box-like sequences in the coding region of cytochrome P450bm-3 gene from Bacillus megaterium // Gene, 1996, v.1 S3, n.1/2, p.97-101.