Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие олигонуклеотидов со структурированными участками РНК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие олигонуклеотидов со структурированными участками РНК"

РГБ ОД

,-А г?к ;

На правах рукописи

ПЕТКЖ ВЛАДИСЛАВ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ СО СТРУКТУРИРОВАННЫМИ УЧАСТКАМИ РНК

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2000 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, академик Власов В.В. кандидат химических наук Зенкова М.А.

Официальные оппоненты:

кандидат химических наук Пышный Д.В.

доктор химических наук Малыгин Э.Г.

Ведущая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН

ч1гГ

-д часов

Защита состоится « & » :> д 2000 г. в

на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу; 630090, Новосибирск-90, пр. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН

_ Г

Автореферат разослан « » 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук ^ Федорова О.С.

Актуальность проблемы

Создание специфических лигандов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, необходимо для исследований, направленных на изучение структуры и функций нуклеиновых кислот, и для разработки ген-направленных терапевтических препаратов. К настоящему времени наиболее обещающие результаты в области создания таких лигандов и направленного воздействия на нуклеиновые кислоты были получены при использовании производных олигонуклеотидов, комплементарных доступным неструктурированным нуклеотидным последовательностям. В составе природных РНК, в физиологических условиях, открытые неструктурированные нуклеотидные последовательности, являющиеся оптимальными мишенями для взаимодействия с олигонуклеотидами, практически отсутствуют. Природные РНК обладают компактной структурой, построенной из доменов, в которых определенные нуклеотидные последовательности уложены в соответствие с пока еще мало изученными правилами. Укладка РНК в пространственную структуру является основным фактором, осложняющим взаимодействие антисмысловых олигонуклеотидов с этими биополимерами. В связи с этим актуальной задачей является разработка подходов к рациональному дизайну производных олигонуклеотидов, способных эффективно взаимодействовать с определенными элементами вторичной структуры нуклеиновых кислот. Разработка таких подходов существенно расширит круг потенциальных мишеней для олигонуклеотидов и возможности использования антисмысловых олигонуклеотидов в целом, а также облегчит создание ген-направленных биологически активных веществ на основе олигонуклеотидов.

Цель работы

Целью настоящей работы являлось изучение кинетических и термодинамических параметров взаимодействия олигонуклеотидов со структурированными участками РНК на примере: дрожжевой тРНКРЬе и 171-звенного фрагмента 23S РНК Escherichia coli, содержащего а-сарциновую петлю; установление механизма этого взаимодействия и выявление факторов, обеспечивающих эффективную гибридизацию комплементарных олигонуклеотидов с РНК-мишенью, а также анализ

изменений пространственной структуры РНК, в ходе связывания с ней комплементарных олигонуклеотидов.

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые проведено широкое систематическое исследование взаимодействия олигонукпеотидов со структурированными участками РНК. Определены кинетические и термодинамические закономерности комплексообразования. На основании полученных данных сделаны выводы о механизме гибридизации и факторах, влияющих на процесс взаимодействия олигонукпеотидов со структурированными участками РНК. Исследована динамика структурных изменений РНК, вызванных связыванием комплементарных олигонуклеотидов. Результаты работы и полученные выводы могут быть использованы при создании производных олигонуклеотидов, направленных на инактивацию биологически активных РНК.

Публикации и апробация работы

Результаты работы были представлены на 3-ей международной конференции «RNA'98» (США, 1998), международной конференции «Targeting the molecular basis of disease» (Великобритания, J998), 26-м международном симпозиуме федерации европейских биохимических обществ (Франция, 1999), 5-ой международной конференции «RNA Biochemie» (Германия, 1999), 5-ой международной конференции «RNA'2000» (США, 2000), 2-ой международной конференции «Bioinformatics of Genome Régulation and Structure» (Россия, 2000). По материалам диссертации опубликовано 5 статей.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, описания материалов и методов, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена нд 181 странице, содержит 47 рисунков и 25 таблиц. Библиография включает 206 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРИК?'"

1.1 Выбор модели, дизайн олигонуклетндов

Дрожжевая фенилаланиновая тРНК была выбрана в качестве модели в связи с тем, что пространственная структура этой РНК детально и всесторонне изучена. Кроме того, элементы вторичной и третичной структуры тРНК весьма типичны и для большинства других природных РНК.

Были использованы две серии олигонуклеотидов, комплементарных различным участкам тРНК (рис.1): первая серия представлена олигону'клеотидами, комплементарными району "РТС -шпильки, акцепторному стеблю и ССА-концу, вторая серия состоит из олигонуклеотидов, комплементарных району антикодоновой шпильки, вариабельной петле и Т*РС -шпильке.

1.2 Влияние участка комплементации олигонуклеотида на эффективность его гибридизации с дрожжевой тРНКРЬе

Гибридизацию исследовали в условиях, имитирующих физиологические, в которых тРНК сохраняет свою нативную пространственную структуру. Количественные характеристики исследовали методом задержки в геле. Несмотря на то, что олигонуклеотиды серии 1 комплементарны одному участку тРНК, строгой корреляции их степеней связывания с расчетными величинами стабильностей гетеродуплексов не наблюдается (рис.2А, рис.2Б). При укорочении олигонуклеотида Ш со стороны, комплементарной ССА-концу, наблюдается резкое скачкообразное падение эффективности гибридизации (рис.2А). На том основании, что эффективно с тРНК могут гибридизаваться только олигонуклеотиды Ш и 1Е было сделано предположение о важной роли короткого одноцепочечного участка на 3' конце тРНК. Который, предположительно, мог инициировать формирование гетеродуплекса.

Укорочение олигонуклеотида Ш со стороны ТЧ^С-петли (олигонуклеотид 1А), в противоречии с относительными величинами стабильностей гетеродуплексов, приводит к некоторому увеличению эффективности гибридизации. Кроме того, в данных условиях

О в

СеА

в С в в А

и и

\Аи

С и СтЧЗ

в А в С

м-в т'С

Рис. 1. Вторичная структура дрожжевой тРНКР|*\ Линиями показаны участки комплементации оли-гонуклеотидов. Для олигонуклеотида 2Н пунктиром на схеме указан участок некомплементарный тРНК (АТАСТ).

серия 1

1КИ.Ш101А1В1С 11111111

1НЮ1МЕЮ

ммм

-1

5' иССАСАСААииСССАССАЗ'

тРНК

2Н

серия 2 Н

2А 2Е 2Я га

I м м

20 2С 2В 2А

i i i м

н

3" А Ст<5 I) СпЮ II ЭиСТЧ-СС^АиСС 5'

i i

тРНК

олигонуклеотид комплекс тРНК»1А обладал аномально низкой электрофоретической подвижностью.

Детальный анализ гибридизации олигонуклеотидов Ш и 1А выявил образование комплексов нескольких типов, характеризующихся разной электрофоретической подвижностью. Мы предположили, что происходит последовательное связывание с тРНК двух молекул олигонуклеотидов, причем формирование двойного комплекса, в котором наблюдается связывание двух молекул лиганда, гораздо сильнее выражено для более короткого олигонуклеотида 1 А.

1Я 10 IF IB ID 1A IB 1С IK lli 1M олигонуклеотид

2D 2C 2B 2A 2E 2F 2Q 2H 2Z олигонуклеотид

1H IS IF IE 10 1A IB 1С IK 1L 1M олигонуклеотид

2D 2C 2B 2A 2E 2F 20 2Я 2Z олигонуклеотид

2D 2C 2B 2A 2E 2F 20 2H 2Z олигонуклеотид

Рис. 2. Сравнение эффективностей связывания олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКР|,е с расчетными стабильностями гетеродуплексов, этих олигонуоеотидов с неструктурированными РНК-мишенями. А) Эффективности гибридизации олигонуклеотидов серии 1 с дрожжевой TPHKPhc, определенные методом задержки в геле.

Б) Стабильности гетеродуплексов олигонуклеотидов серии 1 с неструктурированными олигорибонуклетидами, рассчитанные по методу "ближайших соседей".

В) Эффективности гибридизации олигонуклеотидов серии 2 с дрожжевой тРНКРЬе, определенные методом задержки в геле. Г) Эффективности гибридизации олигонуклеотидов серии 2 с in vitro транскриптом дрожжевой тРНКРЬе, определенные методом задержки в геле.

Д) Стабильности гетеродуплексов олигонуклеотидов серии 2 с неструктурированными олигорибонуклетидами, рассчитанные по методу "ближайших соседей".

С помощью пробинга РНКазой H и контекстного анализа было показано, что связывание второй молекулы олигонуклеотидов происходит в участке TTC-шпильки. Причем, в случае 1D, два связавшихся олигонуклеотида перекрываются на одно звено в положении, комплементарном А62, а в случае 1А - находятся в стэкиге друг с другом, что и приводит к увеличению наблюдаемой эффективности связывания.

Для олигонуклеотидов серии 2 видно (рис.2В), что при укорочении олигонуклеотида 2А со стороны комплементарной, вариабельной петле происходит падение степени связывание в соответствии со стабильностями гетеродуплексов. Однако, при укорочении олигонуклеотидов со стороны, комплементарной TTC -петле, почти не происходит падения степени связывания, что противоречит расчетным стабильностям гетеродуплексов. Этот факт можно объяснить отсутствием вклада 5' концевых оснований олигонуклеотидов в стабильность образуемого гетеродуплекса. В участке тРНК, комплементарном 5' концу олигонуклеотидов, присутствует минорное основание m'A, неспособное образовывать Уотсон-Криковскую пару.

Для проверки данной гипотезы была проведена гибридизация олигонуклеотидов серии 2 с in vitro транскриптом дрожжевой тРНКРЬе. Оказалось, что степени связывания олигонуклеотидов с транскриптом тРНК коррелируют с расчетными стабильностями гетеродуплексов. Эти данные подтверждают предположение о том, что 5' концевые основания олигонуклеотида 2А не участвуют в формировании гетеродуплекса, в случае природной дрожжевой тРНКРЬе.

1.3 Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе

Исследование кинетики гибридизации показало (рис.3), что процесс связывания олигонуклеотидов протекает медленно, с временем полупревращения 1-2 часа. Такая невысокая скорость гибридизации (1 -5 MV) очевидно, обусловлена, прочностью структуры тРНК. Полученные значения констант скорости являются крайне низкими по сравнению с известными константами скорости образования дуплексов между двумя неструктурированными олигонуклеотидами ~106 М~'с 1 и известными константами гибридизации двух структурированных РНК ~103- 10б М'с"1.

О 60 120 180 240 300 МИН

Значение константы скорости М^с'1 Количество раскрываемых пар оснований Участок комплементации

1М 1,8 12 Акцепторный стебель ч-ТЧ'С -шпилька

2С 5,8 5 ТТС-шпилька

2 Ъ 3,9 5 Антикодоновая шпилька

Рис. 3. Кинетические кривые связывания олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬс при 20°С.

В общем, значения констант скорости прямой реакции для олигонуклеотидов направленных на один район тРНК, лежат в очень узких пределах, что может объясняться определяющей ролью локального разворачивания структуры тРНК в скорости гибридизации. Для олигонуклеотидов, направленных на различные участки тРНК, константы скорости связывания коррелируют со стабильностями соответствующих структурных элементов.

1.4 Влиянне температуры к нонов магния на гибридизацию олигонуклеотидов с тРНКРЬе

Для ряда олигонуклеотидов было исследовано влияние температуры и ионов магния на эффективность их гибридизации с тРНК. Оказалось, что при повышении температуры с 20° до 37°С равновесная константа связывания возрастает примерно в 3 раза. Это связано, очевидно, с дестабилизацией пространственной структуры тРНК, вследствие чего происходит более эффективное внедрение олигонуклеотида в ее структуру. Напротив, в присутствии ионов магния происходит существенное падение значения константы связывания на 2-3 порядка. Это объясняется стабилизацией пространственной структуры тРНК ионами магния, в результате чего комплексообразование с олигонуклеотидом становится существенно менее выгодным.

Аналогичное влияние температуры и наличия ионов магния наблюдалось и на скорость процесса гибридизации. Добавление в реакционную смесь 5 мМ ионов магния приводит к падению константы скорости связывания примерно на два порядка. Повышение температуры гибридизации с 20° до 37°С приводит к увеличению скорости процесса на 2-3 порядка, в зависимости от присутствия ионов магния. Эти данные свидетельствуют об определяющей роли пространственной структуры РНК в скорости взаимодействия олигонуклеотидов со структурированными РНК.

1 у~

9

ю

Рис.4. Влияние концентрации ионов магния на равновесное связывание

олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе.

•РЬе

°2А тРНКр|,е (5x10"7 М)

о

о

I

ч

2 4 б 8 10

[Мд2*] (мМ)

■О

-О

инкубировали с олигонуклеотидом в присутствии различных концентраций ионов магния при 20°С в течение 6 часов.

Для выяснения механизма влияния ионов Mg2+ на гибридизацию, была исследована зависимость равновесной- степени связывания олигонуклеотидов 1D и 2А от концентрации этих ионов. Из данных, представленных на рис.4, видно, что процесс связывания олигонуклеотидов с тРНК крайне чувствителен к присутствию ионов магния. Платовые значения степеней связывания достигаются уже при 1 мМ концентрации ионов Mg2+. Оцененные из этих данных значения констант связывания ионов магния с тРНК составляют ~2х103 М"1, что соответствует значениям констант, характерных для "слабых" мест связывания ионов Mg21" с тРНК. Характер зависимости степени связывания от концентрации ионов Mg2+ свидетельствует в пользу того, что ингибирование гибридизации олигонуклеотидов происходит вследствие кооперативной стабилизации третичной структуры тРНК, вызванной ионами магния.

1.5 Механизм гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе

Для изучения изменений структуры тРНК в процессе связывания с олигонуклеотидами использовали ограниченный гидролиз РНКазами А, Tl, ONE, а также модификацию с помощью DMS. Из данных представленных на рис.5 видно, что связывание олигонуклеотида 1D сопровождается изменениями структуры практически во всех участках тРНК. Динамику изменений чувствительности РНК к гидролизу РНКазами можно разделить на два типа: быстрый и медленный. Мгновенное, после добавления олигонуклеотида, ингибирование гидролиза наблюдается в районе ССА-конца, акцепторного стебля и антикодоновой петли. Ингибирование гидролиза по нуклеотидам ССА-конца связано, вероятно, с нуклеацией и образованием метастабильного комплекса олигонуклеотид»тРНК с участием 4-х оснований 3'-конца тРНК (АССА). Медленные процессы наблюдаются в районе акцепторного стебля, D-петли, антикодонового стебля и T4JC -шпильки. Нарастание гидролиза в районе акцепторного стебля и ТЧ'С -шпильки является следствием образования полноразмерного гетеродуплекса и вытеснения гомологичной цепи РНК. Увеличение чувствительности к РНКазам в сайтах, расположенных в антикодоновой и D-петле, вероятно, происходит вследствие глобальной перестройкой структуры тРНК.

г/ * u dga/ \a

d с u cm'g g g a g с

* /l\

Рис.5. Дрожжевая тРНКРЬе. Серой линией выделена последовательность комплементарная олигонуклеотиду 1D. Сайты расщепления различными РНКазами обозначены символами: (■ ), (А), (• ), ), для расщепления РНКазой А, РНКазой Т1, РНКазой ONE 3'-[32Р]-тРНК и РНКазой ONE 5'-[32Р]-тРНК. Открытые и закрашенные символы обозначают быстрое уменьшение и постепенное увеличение чувствительности фосфодиэфирных связей к соответствующим РНКазам в процессе гибридизации с олигонуклеотидом 1D. Гуанины с нарастающей чувствительностью к модификации DMS обозначены

Сопоставление динамики изменений чувствительности нуклеотидов в районах ТЧ'С-шпильки, ССА-конца к гидролизу РНКазой А с

данными полученными в аналогичных условиях методом задержки в геле, приведено на рис.6. Видно, что лимитирующей стадией процесса формирования стабильного комплекса является разворачивание структуры ТЧС-шпильки. Как и следовало ожидать, комплекс олигонуклеотида с 4 нуклеотидами 3'-конца тРНК не является устойчивым и не детектируется методом задержки в геле, в противном случае мы бы наблюдали мгновенное образование комплекса с электрофоретической подвижностью отличной от электрофоретической подвижности свободной тРНК.

Рис.6. Кинетика взаимодействия олигонуклеотида 1D с тРНКРЬс: сплошной линией по основной оси показаны

данные, полученные методом задержки в геле; пунктирной линией по вспомогательной оси показаны данные, полученные с помощью пробинга РНКазой А. Изменение чувствительности межнуклеотидных связей к гидролизу РНКазой А показано треугольниками для ССА-конца и квадратами для TTC -шпильки.

100 153 время (мин)

Анализ зависимости константы скорости гибридизации от концентрации олигонуклеотида показал, что скорость процесса не зависит прямо пропорционально от концентрации олигонуклеотида. Это не объясняется в рамках модели двух состояний, где фигурируют только свободная и связанная с олигонуклеотидом тРНК. Для объяснения полученной гиперболической зависимости было сделано предположение о существовании одного или нескольких промежуточных состояний - метастабильных комплексов олигонуклеотида с тРНК, не детектируемых с помощью метода задержки в геле. При образовании одного промежуточного метастабильного комплекса, формирование полноразмерного

схема 1

стабильного комплекса будет описываться схемой (1), Кх к(-н)

трнк + т ^ [тРнк- ю] ^ трнк- т

где первая стадия представляет собой быстрое формирование метастабильного комплекса с равновесной константой Кх, а вторая -внутримолекулярную перегруппировку с образованием полноразмерного гетеродуплекса, описываемую константами скорости к(+11 и - прямого и обратного процесса, соответственно. Исходя из полученных данных (рис.7) можно сделать вывод, что механизм гибридизации включает две стадии: нуклеацию с образованием промежуточного комплекса с доступной последовательностью на ССА-конце, и внутримолекулярную перегруппировки с полноразмерного гетеродуплекса.

одноцепочечной последующую формированием

Кх= 1,4x10" м-1

ОшршО+| ^ИГ Ога&шО ^ оА^У

Д ] | к(,,= 5,3х10'5 с'1 Д

Рис.6. Механизм гибридизации олигонуклеотида Ш с тРНК . Кх-равновесная константа первой стадии, к^+и, к(_;) - кинетические константы прямой и обратной реакции второй стадии, соответственно.

1.6 Гибридизация аналогов олигонуклеотидов, несущих модифицированные основания, с дрожжевой тРНКр1,е В рамках данной работы была исследована гибридизация тРНК с аналогами олигонуклеотидов (БВ) содержащими модифицированные нуклеозиды, способными увеличивать стабильность дуплексов: 5-метилцитидин, 2,6-диаминопурин и 5-пропинил-2'-дезоксиуридин вместо цитидина, аденозина и тимидина, соответственно. Олигонуклеотиды содержали модифицированные нуклеозиды во всех положениях кроме 3' концевого. По данным равновесного связывания видно, что, аналоги с модифицированными основаниями связываются с тРНК лучше, чем контрольные олигонуклеотиды с каноническими

основаниями. Зарегистрированный выигрыш в значениях равновесных констант связывания модифицированных аналогов по сравнению с контрольными олигонуклеотидами составил 1,5, 70 и 1,8 (рис.8) раза для олигонуклеотидов SB-IB, SB-1C и SB-1F, соответственно. Такой относительно большой выигрыш для олигонуклеотида SB-1С объясняется тем, что несмотря на эффективную нуклеацию контрольный олигонуклеотид 1С не способен разворачивать структуру тРНК, вследствие низкой стабильности гетеродуплекса. Введение модифицированных оснований позволило ему эффективно разворачивать структуру тРНК, что и привело к существенному увеличению константы связывания.

олигонуклеотид

Рис.7. Гибридизация олигонуклеотидов 1В, 1С, 1Р, Ю и их БВ аналогов (7х 10"5 М) с дрожжевой тРНКРЬе (5х 10~7 М).

Сравнение скоростей гибридизации на примере олигонуклеотида 1В показало, что константа скорости прямой реакции не зависит от наличия модифицированных оснований. Анализ полученных данных выявил, что сильно связывающиеся аналоги олигонуклеотидов, несущие модифицированные основания, более эффективно гибридизуются с РНК-мишениями. Однако их эффект проявляется для олигонуклеотидов

имеющих сайт нуклеации и наиболее выражен для тех из них, чей немодифицированный аналог образовывал менее стабильный гетеродуплекс.

2 Гибридизация олигонуклеотидое с 171-звенным фрагментом 23S рРНК Escherichia coli, содержащем се-сарциновую петлю

2.1 Выбор модели, дизайн олигонуклеотидое

Вторая модель представляла собой 171-звенный in vitro транскрипт фрагмента 23S рРНК Е. coli, включающий домен VIA (2625-2795). Этот фрагмент интересен тем, что в его состав входит а-сарциновая петля - самый консервативный участок рибосомных РНК. Целостность а-сарциновой петли принципиальна необходима для функционирования рибосомы. Структура этой петли хорошо изучена методами химического и ферментативного пробинга, а также с помощью ЯМР и рентгеноструктурного анализа.

На рис.9 показаны сайты семи 15-звенных олигонуклеотидов, комплементарных участку длиной в 45 нуклеотидов, в районе а-сарциновой петли.

2.2 Гибридизация олигонуклеотидов с ECAS171 РНК

Гибридизацию олигонуклеотидов S1-S7 с ECAS171 РНК исследовали в условиях имитирующих физиологические (рН 7,5, 0,3 М КС1, 37°С, а также в ряде случае дополнительно 10 мМ Mg24") с помощью метода задержки в геле и футпринта РНКазой Н. Сравнение гибридизационных свойств олигонуклеотидов S1-S7 в отсутствие ионов магния приведено на рис.10. Связывания олигонуклеотидов S1 и S2, комплементарных району с 5' стороны а-сарциновой петли, методом задержки в геле зарегистрировано не было. Олигонуклеотид S3, комплементарный 5' части петли обладал крайне низким сродством к РНК-мишени. Гибридизация олигонуклеотидов S4-S7 была намного эффективней. Следует отметить, что в данных условиях комплексы олигонуклеотидов S6 и S7 обладали существенно более низкой электрофоретической подвижностью.

Добавление ионов магния, использование буфера с низкой ионнной силой, а также отжиг олигонуклеотидов с РНК принципиально не повлияли на эффективности гибридизации. При детальном анализе

Б С

и

а-сарциновая петля

/ с с в

/ с й

и2790 1) .

,5Э-

/

/ \/

С I

и а ««»/ «265« -ЛN.

•' / ! / / / /А2'

с

" с с

С Й

I

У ^"Л

с ^

С е С с с

•Б

и

и и, с с V-с

Й

-С Й С5 и

с и Й 6 и Й Й

н с и

Б

Й Й

й й А В 15 Б

в В С Г 42680

" V-, / й

С2730 С

К*/

/ и и I

и

А с и с с и 6

.и а с с с с а С с С и

Б

и

и

с Й Б Р и <5 С е Й" и и

с

I \

и

Б

А

Рис.9. Вторичная структура фрагмента ЕСЛ3171 РНК. Линией указан участок комплементации олигонуклеотидов 81-57. Штрихами показана разбивка сайта комплементации на 5-ти нукпеотидные участки. Границы сайтов комплементации олигонуклеотидов, состоящие из трех смежных 5-ти нуклеотидных участков, обозначены прерывистыми линиями. 12 консервативных нуклеотидов а-сарциновой петли выделены серыми кружками

связывания олигонуклеотидов 56 и Б7 было обнаружено, что сначала образуется комплекс, с высокой электрофоретической подвижностью, а затем, при повышении концентрации олигонуклеотида происходит формирование двойного комплекса с низкой электрофоретической подвижностью, в котором, по-видимому, с РНК связаны две молекулы олигонуклеотида.

_Ш_

К 81 БЗ Б4 Б5 вб 87

Рис.10. Анализ связывания олигонуклеотидов Sl - S7 с фрагментом ECAS171 РНК. Радиоавтограф нативного 6% ПААГ после электрофоретического разделения свободной ECAS171 РНК и ее комплексов с олигонуклеотидами. [32P]-ECAS171 (0,1 мкМ) инкубировалась с соответствующим олигонуклеотидом (10 мкМ) в течение 1 часа при 37°С в 50 шМ Какодилат-HCl pH 7,3, содержащем 300 мМ KCl, 0,1 мМ EDTA.

Локализацию сайтов связывания олигонуклеотидов проводили с помощью РНКазы Н. Оказалось, что гибридизация олигонуклеотидов происходит в основном в выбранных, полностью комплементарных участках. Однако, для олигонуклеотидов S6 и S7 кроме расщепления, соответствующего комплементарному участку, наблюдается сильное

а-саром новая петля

I

вторичный сайт Э6

».■.•• с /"*"

••»» с °сс'''/«

\,С «с< сс с й

1 к 1 7 ;

С.с

С «6 Г . А

с 'с

\

. • " с", с

е в и .и А с и й й й , I «

й С

т » »с.

Рис.11. Сайты первичного и

с е » первичный сайт Б6 ВТОрИЧНОГО СВЯ-

>' " зывания олиго-

нуклеотидов Б6 и Б7, определенные с помощью футпринта РНКазой Н и контекстным анализом.

Л с «

7»

' « /

^ «

3' 5' С ' е

(Х-сарциновяя петля

/

А1Ш

ь сги» с

»/ »

Л и А с и й й

С й , С *

: : 1

С о АГ7*

' . «

с » й о

/

е и й й й с и с

( вторичный сайт Э7 т с» й

А б

С.в

т • Й«-А 2471

... •.■•:•■

Е й • > с с т. * и " с первичный сайт 87

°с т

сши

р

/

и»-Г»*

< £ с С

с С

С С

С и

6 II

ис« Ч

и

« .К.

/"ос/

/ с й»

и о .

и

с

и и

и Й С

с с

с

Й

расщепление с 5' стороны от выбранных участков связывания. Это согласуется с данными, полученные методом задержки в геле, что при концентрации олигонуклеотида 10 мкМ происходит образование двойного комплекса. То есть наблюдается ситуация аналогична гибридизации олигонуклеотидов 1А и Ш с дрожжевой тРНКРЬе.

Контекстным анализом были найдены потенциальные сайты формирования несовершенных гетеродуплексов олигонуклеотидов Б6 и с РНК. Видно (рис.11), что, как и в предыдущем случае, происходит связывание второй молекулы олигонуклеотида с одноцепочечной последовательностью РНК, сформированной в результате связывания первой молекулы олигонуклеотида.

2.3 Определение параметров ЕА, ДН, АЯ процесса гибридизации олигонуклеотида сЕСА5171 РНК. Механизм гибридизации

На примере олигонуклеотида Б5 из температурных зависимостей констант скорости и равновесной константы связывания были определены значения энергии активации, энтальпии и энтропии гибридизации с РНК. Видно, что зависимость константы скорости гибридизации от температуры достаточно хорошо описывается уравнением Аррениуса (рис.12) во всем интервале исследованных температур от 0°С до 25°С.

8 7,5

?

I 7

6,5

6

0,0033 0,0034 0,0035 0,0036 0,0037 1/Т

Рис.12. Зависимость константы скорости гибридизации олигонуклеотида Б5 с ЕСА5171 РНК от температуры, построенная в координатах Аррениуса: 1п(к+) от 1/Т.

Это свидетельствует о том, что механизм протекания процесса в рамках данного интервала температур принципиально не изменяется.

Рассчитанное эффективное значение энергии активации, составляет Еа = 11±1 ккал/моль. Полученные значения энтальпии и энтропии гибридизации составляют: ДН = 9,00:Ю,24 ккал/моль, AS = 63,8:Ю,8 кал/(моль*К).

Исходя из экспериментально определенной величины энтальпии процесса гибридизации олигонуклеотида S5 с РНК (АНсуим = 9,0 ккал/моль) и теоретически рассчитанной величины энтальпии гетеродуплекса олигонуклеотида S5 с неструктурированной комплементарной цепью РНК (АНгетер = -128,6 ккал/моль), можно рассчитать энтальпию локального разворачивания структуры РНК в сайте комплементации данного олигонуклеотида: ДНразв = АНсумм -АНгетер, АНразв = 137,6 ккал/моль. Таким образом, значение энергии активации много меньше и составляет около 10% от энтальпии локального разворачивания структуры РНК. Эти данные свидетельствуют о том, что формирование полноразмерного гетеродуплекса протекает по механизму последовательного вытеснения цепи. Величина энергии активации по своему значению близка к энтальпии разворачивания 2-х среднестатистических Уотсон-Криковских пар.

выводы

На примере дрожжевой тРНКРЬе и фрагмента 23S рРНК Escherichia coli, содержащего участок а-сарциновой петли, изучено влияние структуры участка комплементации олигонуклеотида на эффективность его гибридизации.

1) Впервые показано, что олигонуклеотиды могут гибридизоваться в физиологических условиях с акцепторным стеблем, ТТС - и антикодоновой шпильками дрожжевой тРНКРЬе с разворачиванием структуры тРНК.

Показано, что в физиологических условиях олигонуклеотиды могут связываться только с теми участками РНК, которые содержат одноцепочечные последовательности длиной не менее 3-4 нуклеотидов, необходимые для инициации формирования гетеродуплекса.

Показано, что в ряде случаев происходит связывание второй молекулы олигонуклеотида с частично-комплементарной одноцепочеч-

ной последовательностью РНК, сформированной в результате связывания первой молекулы олигонуклеотида, что приводит к дополнительной стабилизации олигонуклеотида расположенного в полностью комплементарном сайте.

2) Исследована кинетика гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе и фрагментом 23S рРНК Escherichia coli. Показано, что скорость процесса гибридизации олигонуклеотидов с РНК определяется исключительно стабильностью структуры РНК в сайте связывания олигонуклеотида и не зависит от длины, последовательности и наличия модификаций в олигонуклеотиде.

Показано, что процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК является двустадийным. Первая, быстрая стадия, заключается в нуклеации с образованием промежуточного метастабильного комплекса с одноцепочечным участком РНК. Вторая, лимитирующая, стадия представляет собой внутримолекулярную перегруппировку пространственной структуры РНК с образованием полноразмерного гетеродуплекса. Данный конформационный переход является медленным и определяется прочностью структуры разворачиваемого участка РНК.

Определены значения энергии активации гибридизации нескольких олигонуклеотидов с тРНКРЬе и фрагмента 23S рРНК Е. coli. Показано, что значение энергии активации соответствует разрушению 2-х среднестатистических Уотсон-Криковкских пар. Полученные значений энергии активации и энтальпии гибридизации позволяют сделать вывод о том, что гибридизация олигонуклеотидов со структурированными участками РНК протекает по механизму последовательного замещения цепи.

3) Исследовано влияние условий гибридизации на эффективность и скорость взаимодействия олигонуклеотидов с РНК. Показано, что повышение температуры приводит к увеличению, как скорости, так и равновесной константы гибридизации за счет дестабилизации пространственной структуры РНК. Напротив, присутствие ионов магния приводит к снижению скорости и величины равновесной константы связывания олигонуклеотидов с РНК за счет стабилизации структуры РНК. Показано, что существенное ингибирование гибридизации олигонуклеотидов с РНК объясняется кооперативным структурным переходом вызванным ионами магния.

4) Показано, что сродство олигонуклеотида к структурированным участкам РНК можно повысить за счет введения в их состав модифицированных оснований: 5-метил-цитозина, 2,6-диаминопурина и 5-пропинил-2'-дезоксиуридина. Однако их эффект проявляется для олигонуклеотидов имеющих сайт нуклеации и наиболее выражен для тех из них чей немодифицированный аналог образует менее стабильный комплекс.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Зенкова М.А., Петюк В.А., Жьеже Р., Власов В.В. Разворачивание структуры тРНКР|1е комплементарными олигонуклеотидами // ДАН, 3998. Т. 361(2), С. 260-263.

2. Petyuk V.A., Zenkova М.А., Giege R., Vlassov V.V. Hybridization of antisense oligonucleotides with the 3' part of tRNAphe // FEBS Letters, 1999, V. 444, P. 217-221.

3. Petyuk V.A., Zenkova M.A., Giege R., Ylassov V.V. Interaction of complementary oligonucleotides with the З'-end of yeast tRNAPhe // Nucleosides Nucleotides, 1999, V. 18(6-7), P. 1459-1461.

4. Петюк B.A., Зенкова M.A., Жьеже P., Власов В.В. Механизм гибридизации олигонуклеотидов с 3' концевой областью дрожжевой тРНКРЬе // Молекулярная биология, 2000, Т. 34(5), С. 879-886.

5. Petyuk V., Serikov R., Tolstikov Vr, Potapov V., Giege R., Zenkova M., Vlassov V. Invasion of Strongly Binding Oligonucleotides into tRNA Structure // Nucleosides Nucleotides, 2000, V. 19(7), P. 1145-1158.

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Петюк, Владислав Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ РНК НА ТЕРМОДИНАМИКУ И КИНЕТИКУ ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 ВЕДЕНИЕ

1.2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С РНК

1.3 ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ РНК НА СРОДСТВО ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.

1.3.1 Взаимодействие олигонуклеотидов с тРНК.

1.4 ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ РНК НА КИНЕТИКУ ГИБРИДИЗАЦИИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.

1.5 ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К РАСЧЕТУ СРОДСТВА ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ К СТРУКТУРИРОВАННЫМ УЧАСТКАМ РНК.

1.6 СРАВНЕНИЕ АКТИВНОСТИ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ И КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК'IN VITRO С ТЕОРЕТИЧЕСКИ РАССЧИТАННЫМИ ПАРАМЕТРАМИ СРОДСТВА К РНК-МИШЕНЯМ.

2 ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ, КИНЕТИЧЕСКИЕ И СТРУКТУРНЫЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ СО СТРУКТУРИРОВАННЫМИ РНК

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ)

2.1 ИССЛЕДОВАНИЕ ГИБРИДИЗАЦИИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С ДРОЖЖЕВОЙ

TpHKPhe.

2.1.1 Выбор модели, дизайн олигонуклетидов

2.1.2 Равновесная гибридизация олигонуклеотидов с дрожжевой TPHKphe

2.1.2.1 Влияние структуры сайта комплементации на эффективность связывания олигонуклеотидов с тРНК.

2.1.2.2 Определение равновесных констант связывания олигонуклеотидов с дрожжевой

TpHEPhe.б

2.1.2.3 Анализ гибридизации олигонуклеотидов 1А и 1D с тРНК с помощью РНКазы Н.

2.1.2.4 Статистический анализ кривых равновесного связывания олигонуклеотидов.

2.1.2.5 Влияние температуры и ионов магния на равновесное связывание олигонуклеотидов с дрожжевой тPHPfhe.

2.1.2.6 Гибридизация олигонуклеотидов с TPHFfhe (обсуждение результатов).

2.1.3 Кинетика гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе

2.1.3.1 Влияние сайта комплементации на скорость гибридизации олигонуклеотида с дрожжевой

TpHKPhe.

2.1.3.2 Влияние минорных оснований, температуры и ионов магния на кинетику гибридизации олигонуклеотидов с тРНК

2.1.3.3 Обсуждение данных по скорости гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой TPHF?he.

2.1.4 Природа влияния ионов магния на гибридизацию олигонуклеотидов с дрожжевой тРНКРЬе.

2.1.4.1 Зависимость степени равновесного связывания олигонуклеотидов с дрожжевой тРНВ^Ье от концентрации ионов магния

2.1.4.2 Влияние ионов магния на стабильность комплекса тРНК-lD

2.1.5 Механизм гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой

TpHKPhe

2.1.5.1 Анализ зависршости скорости гибридизации от концентрации олигонуклеотида.

2.1.5.2 Пробинг структуры тРНК в процессе гибридизации с олигонуклеотидом 1D.

2.1.5.3 Анализ динамики изменений структуры тРНК в процессе гибридизации олигонуклеотида.

2.1.6 Гибридизация аналогов олигонуклеотидов, несущих модифицированные основания, с дрожжевой TPHKphe.

2.1.6.1 Дизайн олигонуклеотидов.

2.1.6.2 Влияние участка комплементации'на эффективность гибридизация аналогов олигонуклеотидов, несущих модифицированные основания, с дрожжевой

TpHKPhe.

2.1.6.3 Определение минимального размера SB олигонуклеотида, способного связываться с TPHFfhe.

2.2 ГИБРИДИЗАЦИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ С 171-ЗВЕННЫМ ФРАГМЕНТОМ 23S рРНК ESCHERICHIA СОЫ, СОДЕРЖАЩЕМ а-САРЦИНОВУЮ ПЕТЛЮ.

2.2.1 Выбор модели, дизайн олигонуклеотидов

2.2.2 Гибридизация олигонуклеотидов с ECAS171 РНК.

2.2.2.1 Влияние сайта комплементации олигонуклеотида на эффективность гибридизации с РНК-мишенью.

2.2.2.2 Определение равновесных константы гибридизации.

2.2.2.3 Определение сайтов связывания олигонуклеотидов с ECAS1 71 РНК с помощью гидролиза РНКазой Н.

2.2.2.4 Обсуждение гибридизации олигонуклеотидов с фрагментом ECAS171 РНК.

2.2.3 Влияние ионов магния на гибридизацию олигонуклеотидов с ECAS171 РНК.

2.2.4 Определение параметров ЕА, ДН, AS процесса гибридизации олигонуклеотида S5 с ECAS171 РНК. Механизм гибридизации.

2.2.4.1 Температурная зависимость константы скорости гибридизации олигонуклеотида S5 с ECAS171 РНК. Определение энергии активации ЕА.

2.2.4.2 Температурная зависимость равновесной константы связывания олигонуклеотида S5 с ECAS171 РНК: определение АН, AS

2.2.4.3 Анализ параметров гибридизации S5. Механизме процесса гибридизации.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 МАТЕРИАЛЫ.

3.2 МЕТОДЫ.

3.2.1 Получение in vitro транскрипта дрожжевой тРНКРЬе

3.2.2 Введение [32Р]-метки по З'-ОН группе тРНК.

3.2.3 Введение [32Р]-метки в 5'-концевое положение тРНК.,.

3.2.4 Измерение зависимости равновесной степени связывания от концентрации олигонуклеотидов.

3.2.5 Измерение зависимости степени связывания от времени инкубации.

3.2.6 Вытеснение олигонуклеотида 1D из комплекса TPHKPhe«lD под действием ионов магния.

3.2.7 Частичный гидролиз РНК в денатурирующих условиях

3.2.8 Футпринт комплексов олигонуклеотид-тРНК с помощью РНКазы H

3.2.9 Анализ изменений структуры тРНКРЬе в ходе гибридизации с олигонуклеотидом 1D.

3.2.10 Идентификация минимальной длинны SB-олигонуклеотидов, способных связываться с тРНК.

3.2.11 Получение пиреновых производных олигонуклеотидов

3.2.12 Приготовление ECAS171 РНК транскрипта

3.2.13 Определение последовательности фрагмента ECAS

3.2.14 Введение [32Р]-метки по 5'-концу ECAS171 РНК-транскрипта

3.2.15 Пробинг вторичной структуры ECAS171 РНК-транскрипта

3.2.16 Анализ сайтов гибридизации олигонуклеотидов с ECAS171 РНК-транскриптом при помощи РНКазы H.

3.2.17 Гибридизация олигонуклеотидов с ECAS171 РНК-транскриптом

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие олигонуклеотидов со структурированными участками РНК"

Создание специфических лигандов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами, необходимо для исследований структуры и функций нуклеиновых кислот и для разработки ген-направленных терапевтических препаратов [1, 2]. К настоящему времени наиболее обещающие результаты в области направленного воздействия на одноцепочечные нуклеиновые кислоты были получены при использовании производных олигонуклеотидов, комплементарных доступным неструктурированным нуклеотидным последовательностям биополимера-мишени [3]. В физиологических условиях открытые, неструктурированные нуклеотидные последовательности в составе природных РНК практически отсутствуют [4], и реальные РНК-мишени представляют собой элементы пространственной укладки определенных нуклеотидных последовательностей, которые относительно мало изучены [5, б]. Укладка одноцепочечных нуклеиновых кислот в пространственную структуру является основным фактором, осложняющим взаимодействие антисмысловых олигонуклеотидов с этими биополимерами [7, 8]. Дальнейший прогресс в этой области невозможен без рационального конструирования производных олигонуклеотидов, способных эффективно узнавать биологически значимые элементы вторичной структуры нуклеиновых кислот.

Наиболее распространенными элементами структуры РНК являются шпильки - короткие частично самокомплементарные нуклеотидные последовательности, состоящие из стебля и петли [9] . В одноцепочечных нуклеиновых кислотах имеется множество шпилек, и взаимодействия между ними являются определяющими при формировании биологически активной трехмерной структуры РНК [6, 10]. Шпильки являются структурными элементами РНК, которые определяют специфичность ее взаимодействия с белками и другими нуклеиновыми кислотами [9]. Шпилечные структуры являются сайтами узнавания для регуляторных белков в таких биохимических процессах как транскрипция [11, 12] и трансляция [13] . Взаимодействие между определенными шпильками РНК является ключевым этапом при узнавании РНК-мишени природными антисмысловыми РНК [14], а также в процессе димеризации ретровирусных РНК [15] , приводящем к формированию биологически активного диплоидного генома ретровирусов. Разработка подхода, позволяющего выбирать комплементарный олигонуклеотид, способный эффективно гибридизоваться с РНК- шпильками, существенно расширит круг мишеней и применимость антисмысловых олигонуклеотидов в целом.

Эффективность и механизм взаимодействия олигонуклеотидов с различными шпильками определяются размером и последовательностью петли шпильки и структурой ее стебля. Известно, что как последовательность петли, так и положение участка связывания оказывают большое влияние на эффективность взаимодействия с ней комплементарного олигонуклеотида [16, 17] . В ряде работ [17, 18] были продемонстрированы интересные закономерности гибридизации комплементарных олигонуклеотидов с РНК- мишенями. Так, в некоторых случаях наличие специфической структурированности РНК-мишени не только не препятствовало, а даже способствовало связыванию с ней олигонуклеотида. Факторы такого рода, как и другие особенности пространственной организации природных РНК, существенно затрудняют предсказание эффективности связывания комплементарных олигонуклеотидов с РНК- мишенями в рамках существующих теоретических подходов [19] . Отсутствие, до настоящего времени, надежного метода предсказания объясняется целым рядом причин, связанных с существованием методических трудностей работы с РНК: создание модельной системы, обеспечение устойчивости РНК, строгое описание свойств (вторичной и третичной структуры) модельной РНК-мишени. Кроме того, целесообразным является использование согласованной выборки олигонуклеотидов, позволяющей проводить детальный анализ процесса комплексообразования и выявление влияющих на него факторов.

Целью настоящей работы является изучение кинетических и термодинамических параметров взаимодействия олигонуклеотидов со структурированными участками РНК, на примере новых модельных систем дрожжевой тРНКРЬе и 171-звенного фрагмента 23Б РНК

Escherichia coli, содержащего а-сарциновую петлю; установление механизма этого взаимодействия, выявление факторов, обеспечивающих эффективную гибридизацию комплементарного олигонуклеотида, а также анализ изменений пространственной структуры РНК в ходе связывания с ней комплементарного олигонуклеотида.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Петюк, Владислав Александрович

выводы

На примере дрожжевой TPHKphe и фрагмента 23S рРНК Escherichia coli, содержащего участок а-сарциновой петли, изучено влияние структуры участка комплементации, олигонуклеотида на эффективность его гибридизации.

1) Впервые показано, что олигонуклеотиды могут гибридизоваться в физиологических условиях с акцепторным стеблем, Т^С- и антикодоновой шпильками дрожжевой TPHKphe с разворачиванием структуры тРНК.

Показано, что в физиологических условиях олигонуклеотиды могут связываться только с теми участками РНК, которые содержат одноцепочечные последовательности длиной не менее 3-4 нуклеотидов, необходимые для инициации формирования гетеродуплекса.

Показано, что в ряде случаев происходит связывание второй молекулы олигонуклеотида с частично-комплементарной одноцепочечной последовательностью РНК, сформированной в результате связывания первой молекулы олигонуклеотида, что приводит к дополнительной стабилизации олигонуклеотида расположенного в полностью комплементарном сайте.

2) Исследована кинетика гибридизации олигонуклеотидов с дрожжевой TPHKphe и фрагментом 23S рРНК Escherichia coli. Показано, что скорость процесса гибридизации олигонуклеотидов с РНК определяется исключительно стабильностью структуры РНК в сайте связывания олигонуклеотида и не зависит от длины, последовательности и наличия модификаций в олигонуклеотиде.

Показано, что процесс гибридизации олигонуклеотидов со структурированными РНК является двухстадийным. Первая, быстрая стадия, заключается в нуклеации с образованием промежуточного метастабильного комплекса с одноцепочечным участком РНК. Вторая, лимитирующая, стадия представляет собой внутримолекулярную перегруппировку пространственной структуры РНК с образованием полноразмерного гетеродуплекса. Данный конформационный переход является медленным и определяется прочностью структуры разворачиваемого участка РНК.

Определены значения энергии активации гибридизации нескольких олигонуклеотидов с TPHKphe и фрагмента 23S рРНК Е. coli. Показано, что значение энергии активации соответствует разрушению 2-х среднестатистических Уотсон-Криковских пар. Полученные значений энергии активации и энтальпии гибридизации позволяют сделать вывод о том, что гибридизация олигонуклеотидов со структурированными участками РНК протекает по механизму последовательного замещения цепи.

3) Исследовано влияние условий гибридизации на эффективность и скорость взаимодействия олигонуклеотидов с РНК. Показано, что повышение температуры приводит к увеличению, как скорости, так и равновесной константы гибридизации за счет дестабилизации пространственной структуры РНК. Напротив, присутствие ионов магния приводит к снижению скорости и величины равновесной константы связывания олигонуклеотидов с РНК за счет стабилизации структуры РНК. Показано, что существенное ингибирование гибридизации олигонуклеотидов с РНК объясняется кооперативным структурным переходом вызванным ионами магния.

4) Показано, что сродство олигонуклеотида к структурированным РНК можно повысить за счет введения в их состав модифицированных оснований: 5-метил-цитозина, 2,6-диаминопурина и 5-пропинил-2'-дезоксиуридина. Однако их эффект проявляется для олигонуклеотидов имеющих сайт нуклеации и наиболее выражен для тех из них, чей природный аналог образует менее стабильный комплекс.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Петюк, Владислав Александрович, Новосибирск

1. Knorre D.G., Vlassov V.V. Affinity modification of biopolymers. 1988. CRC Press, Boca Raton, FL.

2. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F., Lebedev A.V., Fedorova O.S. Design and targeted reactions of oligonucleotide derivatives. 1993. CRC Press, Boca Raton, FL.

3. Knorre D.G., Vlassov V.V. Complementary addressed (sequence-specific) modification of nucleic acids // Progr. in Nucleic Acids Res. and Mol. Biol. 1985. V. 32. P. 291-319.

4. Ecker D.J. Strategies for invasion of RNA secondary, structure // Antisense research and applications, под ред. Crooke S.T., Lebleu В., CRC Press, Boca Raton. 1993. P. 387400.

5. Baskerville S., Ellington A.D. RNA structure. Describing the elephant // Curr. Biol. 1995. V. 5. P. 120-123.

6. Batey R.T., Rambo R.P., Doudna J.A. Tertiary Motifs in RNA Structure and Folding // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999. V. 38. P. 2326-2343.

7. Cantor C.R., Schimmel P.R. The Behavior of Biological Macromolecules. San Francisco. 1980. V. 3. Ch. 23.

8. Branch A.D. A good antisense molecule is hard to find // Trends Biochem. Sei. 1998. V. 23. P. 45-50.

9. Chastain M., Tinoco I. Jr. Structural elements in RNA // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1991. V. 41. P. 131-177.

10. Strobel S.A., Doudna J.A. RNA seeing double: close-packing of helices in RNA tertiary structure // Trends Biochem. Sei. 1997. V. 22. P. 262-266.

11. Yanofsky C. Attenuation in the control of expression of bacterial operons // Nature. 1981. V. 289. P. 751-758.

12. Noller H.F. Structure of ribosomal RNA // Annu. Rev. Biochem. 1984. V. 53. P. 119-162.

13. Gregorian R.S. Jr., Crothers D.M. Determinants of RNA Hairpin Loop-Loop Complex Stability // J. Mol. Biol. 1995. V. 248. P. 968-984.

14. Skripkin E., Paillart J.C., Marquet R., Ehresmann B., Ehresmann C. Identification of the primary site of the human immunodeficiency virus type 1 RNA dimerization in vitro // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994. V. 91. P. 4945-4949.

15. Uhlenbeck O.C. Complementary oligonucleotide binding to transfer RNA //.J. Mol. Biol. 1972. V. 65. P. 25-41.

16. Lima W.F., Monia B.P., Ecker D.J., Freier S.M. Implication of RNA structure on antisense oligonucleotide hybridization kinetics // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 12055-12061.

17. Mathews D.H., BurkardM.E., Freier S.M., Wyatt J.R., Turner D.H. Predicting oligonucleotide affinity to nucleic acid targets // RNA. 1999. V. 5. P. 1458-1469.

18. Cate J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K., Golden B.L., Kundrot C.E., Cech T.R., Doudna J.A. Crystal structure of a group I ribozyme domain: principles of RNA packing // Science. 1996. V. 273. P. 1678-1685.

19. Romer R., Hach R. tRNA conformation and magnesium binding. A study of a yeast phenylalanine-specific tRNA by a fluorescent indicator and differential melting curves // Eur. J. Biochem. 1975. V. 55. P. 271-284.

20. Reid S.S., Cowan J.A. Biostructural chemistry of magnesium ion: characterization of the weak binding sites ontRNA(Phe)(yeast). Implications for conformational change and activity // Biochemistry. 1990. V. 29 P. 6025-6032.

21. Xing Y., Draper D.E. Stabilization of a ribosomal RNA tertiary structure by ribosomal protein Lll // J. Mol. Biol. 1995. V. 249. P. 319-331.

22. Mohr G., Zhang A., Gianelos J.A., Beifort M., Lambowitz A.M. The neurospora CYT-18 protein suppresses defects in the phage T4 td intron by stabilizing the catalytically active structure of the intron core // Cell. 1992. V. 69. P. 483494.

23. Herschlag D. RNA chaperones and the RNA folding problem // J. Biol. Chem. 1995. V. 270 P. 20871-20874.

24. Varani G., Tinoco I. Jr. RNA structure and NMR spectroscopy // Q. Rev. Biophys. 1991. V. 24. P. 479-532.

25. Pardi A. Multidimensional heteronuclear NMR experiments for structure determination of isotopically labeled RNA //

26. N Methods. Enzymol. 1995. V. 261 P. 350-380.

27. Legault P., Pardi A. 31P chemical shift as a probe of structural motifs in RNA // J. Magn. Reson. B. 1994. V. 103 P. 82-86.

28. Ehresmann C., Baudin F., Mougel M., Romby P., Ebel J. P., Ehresmann B. Probing the structure of RNAs in solution // Nucleic. Acids. Res. 1987. V. 15 P. 9109-9128.

29. Lietzke S.E., Barnes C.L., Kundrot C.E. Crystallization and structure determination of RNA // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. V. 5. P. 645-649.

30. Kjems J., Egebjerg J. Modern methods for probing RNA structure // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9. P. 59-65.

31. Utz E.D., Siravo-Sagraves G.M., Trewyn R.W., Morgan C.J. Detection of human tRNAs with antisense oligonucleotides // Anal. Biochem. 1994. V. 216(1). P.110-117.

32. Bevilacqua P.C., Kierzek R., Johnson K.A., Turner D.H. Dynamics of ribozyme binding of substrate revealed by fluorescence-detected stopped-flow methods // Science. 1992. V. 258. P. 1355-1358.

33. Kierzek R., Li Y., Turner D.H., Bevilacqua P.C. 5'-Amino Pyrene Provides a Sensitive, Nonperturbing Fluorescent Probe of RNA Secondary and Tertiary Structure Formation // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 4985-4992.

34. Ota N., Hirano K., Warashina M., Andrus A., Mullah В., Hatanaka K., Taira K. Structural analysis of nucleic acids by using fluorescence resonance energy transfer (FRET) // Nucleic. Acids. Symp. Ser. 1997. V. 37. P. 207-208.

35. Perkins T.A., Wolf D.E., Goodchild J. Fluorescence resonance energy transfer analysis of ribozyme kinetics reveals the mode of action of a facilitator oligonucleotide // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 16370-16377.

36. Ceglarek J.A., Revzin A. Studies of DNA-protein interactions by gel electrophoresis // Electrophoresis. 1989. V. 10(5-6) P. 360-365.

37. Stull R.A., Zon G., Szoka F.C. Jr. An in vitro messenger RNA binding assay as a tool for identifying hybridization-competent antisense oligonucleotides // Antisense Nucleic. Acid Drug. Dev. 1996. V. 6(3). P. 221-228.

38. Knorre D.G., Chimitova T.A. Equations of the kinetic kurves of affinity labelling of biopolimers with the reagents consumed in parallel reactions in solution // FEBS Lett. 1981. V. 131. P. 249-252.

39. Федорова О.С., Подуст JI.M., Горн В.В., Максакова Г.А. Строение одноцепочечной ДНК-мишени как фактор, влияющий на эффективность ее модификации в комплексе с комплементарным реагентом // Биоорган, химия. 1992. Т. 18. С. 1496-1504.

40. Bulygin K., Malygin A., Karpova G., Westermann P. Site-specific modification of 4.5S RNA apical domain by complementary oligodeoxynucleotides carrying an alkylating group // Eur. J. Biochem. 1998. V. 251. P. 175-180.

41. Milner N., Mir K.U., Southern E.M. Selecting effective antisense reagent on combinatorial oligonucleotide arrays // Nat. Biotechnol. 1997. V. 15. P. 537-541.

42. Mir K.U., Southern E.M. Determining the influence of structure on hybridization using oligonucleotide arrays // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 788-792.

43. Kronenwett R., Haas R. , Sczakiel G. Kinetic Selectivity of Complementary Nucleic Acids: bcr-abl-directed Antisense RNA and Ribozymes // J. Mol. Biol. 1996. V. 259. P. 632-644.

44. Ho S.P., Bao Y., Lesher T., Malhotra R., Ma L.Y., Fluharty S.J., Sakai R.R. Mapping of RNA accessible sites for antisense experiments with oligonucleotide libraries // Nat. Biotechnol. 1998 V. 16. P. 59-63.

45. Kanda T., Takai K., Yokoyama S., Takaku H. Specific Inactivation of Escherichia coli tRNAphe by Antisense DNA

46. Treatment under Mg2+-Deficient Conditions // Bioorg. Med. Chem. 2000 V. 8. P. 675-679.

47. Bloomfield V. , Crothers D., Tinoco I.Jr. Physical Chemistry of Nucleic Acids. New York: Harper & Row. 1974.

48. Bruice T.W., Lima W.F. Control of Complexity Constraints on Combinatorial Screening for Preferred Oligonucleotide Hybridization Sites on Structured RNA // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 5004-5019.

49. Gerhart E., Wagner H., Brantl S. Kissing and RNA stability in antisense control of plasmid replication // Trends Biochem. Sei. 1998. V. 23. P. 451-454.

50. Eguchi Y., Itoh T. , Tomizawa J. Antisense RNA // Annu. Rev. Biochem. 1991. V. 60. P. 631-652.

51. Paillart J.C., Skripkin E., Ehresmann B.f Ehresmann C., Marquet R. A loop-loop "kissing" complex is the essential part of the dimer linkage of genomic HIV-1 RNA // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1996. V. 93. P. 5572-5577.

52. Marino J.P., Gregorian R.S. Jr., Czankovszki G., Crothers D.M. Bent Helix Formation Between RNA Hairpins with Complementary Loops // Science. 1995. V.268. P. 1448-1454.

53. Lee A.J., Crothers D.M. The solution structure of an RNA loop-loop complex: the ColEl inverted loop sequence // Structure. 1998. V. 6(8). P 993-1005.

54. Skripkin E., Paillart J.C., Marquet R., Blumenfeld M., Ehresmann B., Ehresmann C. Mechanisms of inhibition of in vitro dimerization of HIV type I RNA by sense and antisense oligonucleotides // J. Biol. Chem. 1996. V. 271(46). P. 28812-28817.

55. Brown E.A., Zhang H., Ping L.H., Lemon S.M. Secondary structure of the 5' nontranslated regions of hepatitis Cvirus and pestivirus genomic RNAs // Nucleic. Acids Res. 1992. V. 20. P. 5041-5045.

56. Sprinzl M. On the structure of phenylalanine tRNA from yeast. Spin-label studies. // Eur. J. Biochem. 1974. V. 49 P. 595-605.

57. Robertus J.D., Ladner J.E., Finch J.T., Rhodes D., Brown R.S., Clark B.F., Klug A. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 A resolution // Nature. 1974. V. 250. P. 546-551.

58. Johnston P.D., Redfield A.G. An NMR study of the exchange rates for protons involved in the secondary and tertiary structure of yeast tRNA Phe // Nucleic Acids Res. 1977. V. 4. P. 3599-3615.

59. Blumberg W.E., Dale R.E., Eisinger J., Zuckerman D.M. Energy transfer in tRNA phe (yeast). The solution structure of transfer RNA // Biopolymers. 1974. V. 13. P. 1607-1620.

60. Peattie D.A., Gilbert W. Chemical probes for higher-order structure in RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 4679-4682.

61. Romby P., Moras D., Dumas P., Ebel J.P., Giege R. Comparison of the tertiary structure of yeast tRNA(Asp) and tRNA(Phe) in solution. Chemical modification study of the bases // J. Mol. Biol. 1987. V. 195. P. 193-204.

62. Vlassov V.V., Giege R., Ebel J.P. The tertiary structure of yeast tRNAPhe in solution studied by phosphodiester bond modification with ethylnitrosourea // FEBS Lett. 1980. V. 120. P. 12-16.

63. Kim S.H., Quigley G.J., Suddath F.L., McPherson A., Sneden D., Kim J.J., Weinzierl J., Rich A. Three-dimensional structure of yeast phenylalanine transfer RNA: folding of the polynucleotide chain // Science. 1973. V. 179. P. 285-288.

64. Kim S.H., Suddath F.L., Quigley G.J., McPherson A., Sussman J.L., Wang A.H., Seeman N.C., Rich A. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA // Science. 1974. V. 185 P. 435-440.

65. Rialdi G., Levy J., Biltonen R. Thermodynamic studies of transfer ribonucleic acids. I. Magnesium binding to yeast phenylalanine transfer ribonucleic acid // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 2472-2479.

66. Rhodes D. Initial stages of the thermal unfolding of yeast phenylalanine transfer RNA as studied by chemicalmodification: the effect of magnesium // Eur. J. Biochem.1977. V. 81. P. 91-101.

67. Holbrook S.R., Sussman J.L., Warrant R.W., Church G.M., Kim S.H. RNA-ligant interactions. (I) Magnesium binding sites in yeast tRNAphe // Nucleic. Acids. Res. 1977. V. 4. P. 28112820 .

68. Narayanan P., Ramirez F. Strong magnesium binding sites in yeast phenylalanine transfer RNA // Biochim. Biophys. Acta.1978. V. 518. P. 539-542.

69. Johnston P.D., Redfield A.G. Study of transfer ribonucleic acid unfolding by dynamic nuclear magnetic resonance // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 3996-4006.

70. Perret V. , Garcia A., Puglisi J., Grosjean H., Ebel J.P., Florentz C., Giege R. Conformation in solution of yeast tRNA(Asp) transcripts deprived of modified nucleotides // Biochimie. 1990. V. 72. P. 735-743.

71. Derrick W.B., Horowitz J. Probing structural differences between native and in vitro transcribed Escherichia coli valine transfer RNA: evidence for stable base modification-dependent conformers // Nucleic. Acids. Res. 1993. V. 21. P. 4948-4953.

72. Agris P.F., Malkiewicz A., Guenther R., Basti M., Sengupta R., Stuart J. Importance of modified nucleosides to the structure and function of tRNAs // Nucleic. Acids. Symp. Ser. 1995. V. 33. P. 254-155.

73. Przykorska A. Influence of modified nucleosides on tRNA structure as probed by two plant nucleases // Biochimie. 1995. V. 77. P. 109-112.

74. Kitchingman G.R., Webb E., Fournier M.J. Unique phenylalanine transfer ribonucleic acids in relaxed control Escherichia coli: genetic origin and some functional properties // Biochemistry. 1976. V. 15. P. 1848-1857.

75. Walter A.E., Turner D.H., Kim J., Lyttle M.H., Muller P., Mathews D.H., Zuker M. Coaxial stacking of helixes enhances binding of oligoribonucleotides and improves predictions of

76. RNA folding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 9218-9222.

77. Quigley G.J., Rich A. Structural domains of transfer RNA molecules // Science. 1976. V. 194. P. 796-806.

78. Westhof E., Dumas P., Moras D. Loop stereochemistry and dynamics in transfer RNA // J. Biomol. Struct. Dyn. 1983. V.l. P. 337-355.

79. Doudna J.A. Hammerhead ribozyme structure: U-turn for RNA structural biology // Structure. 1995. V. 3. P. 747-750.

80. Cantor C.R., Schimmel P.R. The Behavior of Biological Macromolecules, San Francisco. // 1980. V. 3. Ch. 24.

81. Craig M.E., Crothers D.M., Doty P. Relaxation kinetics of dimer formation by self complementary oligonucleotides // J. Mol. Biol. V. 62(2). P. 383-401.

82. Patzel V., Sczakiel G. Length dependence of RNA-RNA annealing // J. Mol. Biol. 1999. V. 294. P. 1127-1134.

83. Fedor M.J., Uhlenbeck O.C. Substrate sequence effects on "hammerhead" RNA catalytic efficiency // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 1668-1672.

84. Hofacker I.L., Fontana W., Stadler P.F.,L. Bonhoeffer L.S., Tacker M., Schuster P. Fast Folding and Comparison of RNA Secondary Structures // Monatsh.Chem. 1994. V. 125. P. 167188.

85. Parkhurst K.M., Parkhurst L.J. Kinetic studies by fluorescence resonance energy transfer employing a double-labeled oligonucleotide: hybridization to the oligonucleotide complement and to single-stranded DNA // Biochemistry. 1995. V. 34. P.285-292.

86. Homann M. , Rittner K., Sczakiel G. Complementary large loops determine the rate of RNA duplex formation in vitro in the case of an effective antisense RNA directed against the human immunodeficiency virus type 1 // J. Mol. Biol. 1993. V. 233. P. 7-15.

87. Rittner K., Burmester C., Sczakiel G. In vitro selection of fast-hybridizing and effective antisense RNAs directed against the human immunodeficiency virus type 1 // Nucleic. Acids. Res. 1993. V. 21. P. 1381-1387.

88. Tomizawa J. Control of ColEl plasmid replication.1.termediates in the binding of RNA I and RNA II // J. Mol. Biol. 1990. V. 212. P. 683-694.

89. Kittle J.D., Simons R.W., Lee J., Kleckner N. Insertion sequence IS10 anti-sense pairing initiates by an interaction between the 5' end of the target RNA and a loop in the antisense RNA // J. Mol. Biol. 1989. V. 210. P. 561-752.

90. Persson C., Wagner E.G., Nordstrom K. Control of replication of plasmid R1: kinetics of in vitro interaction between the antisense RNA, CopA, and its target, CopT // EMBO J. 1988. V. 7. P. 3279-3288.

91. Reynaldo L.P., Vologodskii A.V., Neri B.P., Lyamichev V.I. The kinetics of oligonucleotide replacements // J. Mol. Biol. 2000. V. 297. P. 511-520.

92. Sugimoto N., Nakano S., Katoh M., Matsumura A., Nakamuta H., Ohmichi T., Yoneyama M., Sasaki M. Thermodynamic parameters to predict stability of RNA/DNA hybrid duplexes // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 11211-11216.

93. Walton S.P., Stephanopoulos G.N., Yarmush M.L., Roth C.M. Prediction of antisense oligonucleotide binding affinity to a structured RNA target // Biotechnol. Bioeng. 1999. V. 65. P. 1-9.

94. Zuker M., Stiegler P. Optimal computer.folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 133-148.

95. Zuker M. On finding all suboptimal foldings of an RNA molecule // Science. 1989. V. 244. P. 48-52.

96. Stull R.A., Taylor L.A., Szoka F.C. Jr. Predicting antisense oligonucleotide inhibitory efficacy: a computational approach using histograms and thermodynamic indices // Nucleic. Acids. Res. 1992. V. 20. P. 3501-3508.

97. Vickers T.A., .Wyatt J.R., Freier S.M. Effects of RNA secondary structure on cellular antisense activity // Nucleic. Acids. Res. 2000. V. 28. P. 1340-1347.

98. Maher L.J., Dolnick B.J. Specific hybridization arrest of dihydrofolate reductase mRNA in vitro using anti-sense RNA or anti-sense oligonucleotides // Arch. Biochem. Biophys. 1987. V. 253. P. 214-220.

99. Goodchild J., Carroll E., Greenberg J.R. Inhibition of rabbit beta-globin synthesis by complementaryoligonucleotides: identification of mRNA sites sensitive to inhibition // Arch. Biochem. Biophys. 1988. V. 263. P. 401409.

100. Bacon T.A., Wickstrom E. Walking along human c-myc mRNA with antisense oligodeoxynucleotides: maximum efficacy at the 5' cap region // Oncogene Res. 1991. V. 6. P. 13-19.

101. Chiang M.Y., Chan H., Zounes M.A., Freier S.M., Lima W.F., Bennett C.F. Antisense oligonucleotides inhibit intercellular adhesion molecule 1 expression by two distinct mechanisms // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 18162-18171.

102. Ludescher C., Thaler J., Drach D., Drach J., Spitaler M., Gattringer C., Huber H., Hofmann J. Detection of activity of P-glycoprotein in human tumour samples using rhodamine 123 // Br. J. Haematol. 1992. V. 82. P. 161-168.

103. Mathews D.H., Sabina J., Zuker M., Turner D.H. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of RNA secondary structure // J. Mol. Biol. 1999. V. 288. P. 911-940.

104. Tu G.C., Cao Q.N., Zhou F., Israel Y. Tetranucleotide GGGA motif in primary RNA transcripts. Novel target site for antisense design // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 2512525131.

105. Власов В.В., Юрченко Jl.В. Механизм подавления трансляции мРНК антисмысловыми олиг'онуклеотидами // Молекулярная биология. 1990. Т. 24. С. 1157-1161.

106. Pley H.W., Flaherty К.М., McKay D.В. Three-dimensional structure of a hammerhead ribozyme // Nature. 1994. V. 372. P. 68-74.

107. Scott W.G., Finch J.T., Klug A. The crystal structure of an all-RNA hammerhead ribozyme: a proposed mechanism for RNA catalytic cleavage // Cell. 1995. V. 81. P. 991-1002.

108. Christian E.L., Kaye N.M., Harris M.E. Helix P4 is a divalent metal ion binding site in the conserved core of the ribonuclease P ribozyme // RNA. 2000. V. 6. P. 511-519.

109. Zarrinkar P.P., Wang J., Williamson J.R. Slow folding kinetics of RNase P RNA // RNA. 1996. V. 2. P. 564-573.

110. Cate J.H., Hanna R.L., Doudna J.A. A magnesium ion core at the heart of a ribozyme domain // Nat. Struct. Biol. 1997. V 4. P. 553-558.

111. Marquet R., Paillart J.C., Skripkin E., Ehresmann C., Ehresmann B. Dimerization of' human immunodeficiency virus type 1 RNA involves sequences located upstream of the splice donor site // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 145-151.

112. Jossinet F., Paillart J.C., Westhof E., Hermann T., Skripkin E., Lodmell J.S., Ehresmann C., Ehresmann B., Marquet R. Dimerization of HIV-1 genomic RNA of subtypes A and B: RNA loop structure and magnesium binding // RNA. 1999. V. 5. P. 1222-1234.

113. Holm L. Codon usage and gene expression // Nucleic. Acids. Res. 1986. V. 14. P. 3075-3087.

114. Nakamura T., Suyama A., Wada A. Two types of linkage between codon usage and gene-expression levels // FEBS Lett. 1991. V 289. P. 123-125.

115. Barat C., Schatz 0., Le Grice S., Darlix J.L. Analysis of the interactions of HIV1 replication primer tRNA(Lys,3) with nucleocapsid protein and reverse transcriptase // J. Mol. Biol. 1993. V. 231. P. 185-190.

116. Eibel H., Gafner J., Stotz A., Philippsen P. Characterization of the yeast mobile element Tyl // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1981. V. 45. P. 609-617.

117. Jin Y.K., Bennetzen J.L. Structure and coding properties of Bsl, a maize retrovirus-like transposon // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. V. 86. P. 6235-6239.

118. Evgen'ev M.B., Corces V.G., Lankenau D.H. Ulysses transposable element of Drosophila shows high structural similarities to functional domains of retroviruses // J. Mol Biol. 1992. V. 225. P. 917-924.

119. Lauber J., Marsac C., Kadenbach B., Seibel P. Mutations in mitochondrial tRNA genes: a frequent cause of neuromuscular diseases // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 1393-1397.

120. Suomalainen A., Majander A., Pihko H., Peltonen L., Syvanen A.C. Quantification of tRNA3243(Leu) point mutation of mitochondrial DNA in MELAS patients and its effects on mitochondrial transcription // Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2, P. 525-534.

121. Shoffner J.M., Lott M.T., Lezza A.M., Seibel P., Ballinger S.W., Wallace D.C. Myoclonic epilepsy and ragged-red fiber disease (MERRF) is associated with a mitochondrial DNA tRNA(Lys) mutation // Cell. 1990. V. 61. P. 931-937.

122. Pongs 0., Reinwald E. Function of Y in codon-anticodon interaction of tRNAPhe // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1973 V. 50. P. 357-363.

123. Nishimura S. Modified nucleosides in tRNA In: Transfer RNA: structure, properties and recognition // Ed. P.R. Schimmel, D. Sol, J.N. Abelson. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab 1979. P. 59-79.

124. Fechter P., Rudinger-Thirion J., Theobald-Dietrich A., Giege R. Identity of tRNA for yeast tyrosyl-tRNA synthetase: tyrosylation is more sensitive to identity nucleotides than to structural features // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 1725 1733 .

125. Merante F., Myint T., Tein I., Benson L., Robinson B.H. An additional mitochondrial tRNA(lie) point mutation (A-to-G at nucleotide 4295) causing hypertrophic cardiomyopathy // Hum. Mutat. 1996. V. 8. P. 216-222.

126. Brule H., Holmes W.M., Keith G., Giege R., Florentz C. Effect of a mutation in the anticodon of human mitochondrial tRNAPro on its post-transcriptional modification pattern // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 537-543.

127. Sprinzl M., Horn C., Brown M., Ioudovitch A., Steinberg S. Compilation of tRNA sequences and sequences of tRNA genes // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 148-153.

128. Isel C., Ehresmann C., Keith G., Ehresmann B., Marquet R. Initiation of reverse transcription of HIV-1: secondary structure of the HIV-1 RNA/tRNA(3Lys) (template/primer) // J Mol. Biol. 1995. V. 247. P. 236-250.

129. Marquet R., Isel C., Ehresmann C., Ehresmann B. tRNAs as primer of reverse transcriptases // Biochimie. 1995. V. 77. P. 113-124.

130. Schimmel P.R., Redfield A.G. Transfer RNA in solution: selected topics // Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 1980. V. 9. P 181-221.

131. Lynch D.C., Schimmel P.R. Cooperative binding of magnesium to transfer ribonucleic acid studied by a fluorescent probe // Biochemistry. 1974. V. 13. P. 1841-1852.

132. Leroy J.L., Gueron M. Electrostatic effects in divalent ion binding to tRNA // Biopolymers; 1977. V. 16. P. 2429-46.

133. Cole P.E., Yang S.K., Crothers D.M. Conformational changes of transfer ribonucleic acid. Equilibrium phase diagrams // Biochemistry. 1972. V. 11. P. 4358-4368.

134. Crothers D.M., Cole P.E., Hilbers C.W., Shulman R.G. The molecular mechanism of thermal unfolding of Escherichia coli formylmethionine transfer RNA // J. Mol. Biol. 1974. V. 87. P. 63-88.

135. Lefevre J.F., Lane A.N., Jardetzky 0. Nuclear magnetic resonance study of the proton exchange rate in the operatorpromoter DNA sequence of the trp operon of Escherichia coli // J. Mol. Biol. 1985. V. 185. P. 689-699.

136. Potapov V.K., Azhikina T.L., Demin V.V., Libomirskaya S.A., Sverdlov E.D. Modified oligonucleotides as a tool for DNA sequencing, fingerprint and mapping // Pure & Appl. Chem. 1996. V. 68. P. 1315-1320.

137. Chollet A., Kawashima E. DNA containing the base analogue 2-aminoadenine: preparation, use as hybridization probes and cleavage by restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. 1988. V. 16. P. 305-317.

138. Wagner R.W., Matteucci M.D., Lewis J.G., Gutierrez A.J., Moulds C., Froehler B.C. Antisense gene inhibition by oligonucleotides containing C-5 propyne pyrimidines // Science. 1993. V. 260. P. 1510-1513.

139. Tolstikov V.V., Stetsenko D.A., Potapov V.P., Sverdlov E.D. Synthesis and DNA duplex stabilities of oligonucleotide containing C-5-(3-methoxypropynyl)-2'-deoxyuridine residues // Nucleosides & Nucleotides. 1997. V. 16. P. 215-225.

140. Nierhaus K.H., Schilling-Bartetzko S., Twardowski T. The two main states of the elongating ribosome and the role of the alpha-sarcin stem-loop structure of 23S RNA // Biochimie. 1992. V. 74. P. 403-410.

141. Noller H.F., Green R.; Heilek G., Hoffarth V., Huttenhofer A., Joseph S., Lee I., Lieberman K., Mankin A., Merryman C., et al. Structure and function of ribosomal RNA // Biochem. Cell Biol. 1995. V. 73. P. 997-1009.

142. Van de Peer Y., Chapelle S., De Wachter R. A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 3381-3391.

143. Endo Y., Wool I.G. The site of action of alpha-sarcin on eukaryotic ribosomes. The sequence at the alpha-sarcin cleavage site in 28 S ribosomal ribonucleic acid // J. Biol. Chem. 1982. V. 257. P. 9054-9060.

144. Endo Y., Tsurugi K. The RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain // Nucleic Acids Symp. Ser. 1988. V. 19. P. 139-142.

145. Leffers H., Egebjerg J., Andersen A., Christensen T., Garrett R.A. Domain VI of Escherichia coli 23 S ribosomal RNA. Structure, assembly and function // J. Mol. Biol. 1988. V. 204. P. 507-522.

146. Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. The conformation of the sarcin/ricin loop from 28S ribosomal RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 9581-5958.

147. Correll C.C., Wool I.G., Munishkin A. The two faces of the Escherichia coli 23 S rRNA sarcin/ricin domain: the structure at 1.11 A resolution // J. Mol. Biol. 1999. V. 292. P. 275287.

148. Varani G. Exceptionally stable nucleic acid hairpins // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1995. V. 24. P. 379-404.

149. Woese C.R., Gutell R., Gupta R., Noller H.F. Detailed analysis of the higher-order structure of 16S-like ribosomal ribonucleic acids // Microbiol. Rev. 1983. V. 47. P. 621-669.

150. Woese C.R., Winker S., Gutell R.R. Architecture of ribosomal RNA: constraints on the sequence of "tetra-loops" // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. P. 8467-71.

151. Br ion P., Westhof E. Hierarchy and dynamics of RNA folding // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1997. V. 26. P. 113137.

152. Jaeger L., Michel F., Westhof E. Involvement of a GNRA tetraloop in long-range RNA tertiary interactions // J. Mol. Biol. 1994. V. 236. P. 1271-1276.

153. Costa M., Michel F. Frequent use of the same tertiary motif by self-folding RNAs // EMBO J. 1995. V. 14. P. 1276-1285.

154. Siegel V., Walter P. Binding sites of the 19-kDa and 68/72-kDa signal recognition particle (SRP) proteins on SRP RNA as determined in protein-RNA "footprinting11 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. V. 85. P. 1801-1805.

155. Nakano S., Fujimoto M., Hara H., Sugimoto N. Nucleic acid duplex stability: influence of base composition on cation effects // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 2957-2965.

156. Borer P.N., Dengler B., Tinoco I. Jr., Uhlenbeck O.C. Stability of ribonucleic acid double-stranded helices // J. Mol. Biol. 1974. V. 86. P. 843-853.

157. Milligan J.F., Uhlenbeck O.C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase // Methods Enzymol. 1989. V. 180. P. 51-62.

158. England T.E., Bruce A.G., Uhlenbeck O.C. Specific labeling of 3' termini of RNA with T4 RNA ligase // Methods Enzymol. 1980. V. 65. P. 65-74.

159. Silberklang M., Prochiantz A., Haenni A.L., Rajbhandary U.L. Studies on the sequence of the 3'-terminal region of turnip-yellow-mosaic-virus RNA // Eur. J. Biochem. 1977. V. 72. P. 465-748.

160. Donis-Keller H.; Maxam A.M., Gilbert W. Mapping adenines, guanines, and pyrimidines in RNA // Nucleic Acids Res. 1977. V. 4. P. 2527-2538.

161. Krupp G., Gross H.J. Rapid RNA sequencing: nucleases from Staphylococcus aureus and Neurospora crassa discriminate between uridine and cytidine // Nucleic Acids Res. 1979. V. 6. P. 3481-3490.

162. Donis-Keller H. Site specific enzymatic cleavage of RNA // Nucleic Acids Res. 1979. V. 11. P. 179-192.

163. Kop J., Kopylov A.M., Magrum L., Siegel R., Gupta R., Woese C.R., Noller H.F. Probing the structure of 16 S ribosomal RNA from Bacillus brevis // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 15287-15293.

164. Wrede P., Wurst R., Vournakis J., Rich A. Conformational changes of yeast tRNAphe and E. coli tRNA2Glu as indicated bydifferent nuclease digestion patterns // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 9608-9616.

165. Branlant C., Krol A., Ebel J.P., Gallinaro H., Lazar E., Jacob M. The conformation of chicken, rat and human U1A RNAs in solution // Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 841-858.

166. Meador J., Cannon В., Cannistraro V.J., Kennell D. Purification and characterization of Escherichia coli RNase I. Comparisons with RNase M // Eur. J. Biochem. 1990. V. 187. P. 549-553.

167. Meador J., Kennell D. Cloning and sequencing the gene encoding Escherichia coli ribonuclease I: exact physical mapping using the genome library // Gene. 1990. V. 95. P. 17.

168. Stern S., Wilson R.C., Noller H.F. Localization of the binding site for protein S4 on 16 S ribosomal RNA by chemical and enzymatic probing and primer extension // J. Mol. Biol. 1986. V. 192. P. 101-110.

169. Peattie D.A. Direct chemical method for sequencing RNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. P. 1760-1764.

170. Landt M., Butler L.G. 51-Nucleotide phosphodiesterase: isolation of covalently bound 5'-adenosine monophosphate, an intermediate in the catalytic mechanism // Biochemistry. 1978. V. 17. P. 4130-4135.

171. Jones M.D. Reverse transcription of mRNA by Thermus aquaticus DNA polymerase followed by polymerase chain reaction amplification // Methods Enzymol. 1993 V. 218. P. 413-419.

172. Костенко E.B., Бибилашвили Р.Ш., Власов В.В., Зенкова М.А. Вторичная структура 5'-концевого фрагмента мРНК генамножественной лекарственной устойчивости человека. // Молекулярная биология. 2000. Т. 34. С. 67-78.

173. Hahn C.S., Strauss E.G., Strauss J.H. Dideoxy sequencing of RNA using reverse transcriptase // Methods Enzymol. 1989. V. 180. P. 121-130.

174. Uchida T. Purification and properties of RNase T2 // J. Biochem. (Tokyo). 1966. V. 60. P. 115-132.

175. Vary C.P., Vournakis J.N. RNA structure analysis using T2 ribonuclease: detection of pH and metal ion induced conformational changes in yeast tRNAphe // Nucleic Acids Res. 1984. V. 12. P. 6763-6778.

176. Christiansen J., Brown R.S., Sproat B.S., Garrett R.A. Xenopus transcription factor IIIA binds primarily at junctions between double helical stems and internal loops in oocyte 5S RNA // EMBO J. 1987. V. 6. P. 453-460.

177. Levy C.C., Karpetsky T.P. The purification and properties of chicken liver RNase: An enzyme which is useful in distinguishing between cytidylic and uridylic acid residue // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 2153-2159.

178. Boguski M.S., Hieter P.A., Levy C.C. Identification of a cytidine-specific ribonuclease from chicken liver // J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 2160-2163.

179. Василенко С.К., Райт В.К. Выделение высокоочищенной рибонуклеазы из яда кобры (Naja oxiana) // Биохимия. 1975. Т. 40. С. 578-583.

180. Lowman Н.В., Draper D.E. On the recognition of helical RNA by cobra venom VI nuclease // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 5396-5403.

181. Favorova 0.0., Fasiolo F., Keith G., Vassilenko S.K., Ebel J.P. Partial digestion of tRNA--aminoacyl-tRNA synthetase complexes with cobra venom ribonuclease // Biochemistry. 1981. V. 20. P. 1006-11.