Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия РНК-полимеразы E. Coli с олигонуклеотидами, гомологичными коротким участком SPC промотора

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия РНК-полимеразы E. Coli с олигонуклеотидами, гомологичными коротким участком SPC промотора"

РГб 0/7

На правах рукописи

ТНЛОХОНОВ Иннокентий Иннокентьевич

ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РИК-ПОЛИМЕРАЗН E.CÜLI С ОЛИГОНЗКЛЕОТИДАМИ, ГОМОЛОГИЧНЫМИ КОРОТКИМ ЭЧЙСТКМ SPC ПРОМОТОРА

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск-1996

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г.Новосибирск.

Научные руководители: академик Р.И.Салганик к.б.н. Л.К.Савинкова

Официальные оппоненты: д.х.н.. профессор Г.А.Неишский

д.б.я., профессор С.Н.Загребельный

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В.А.Знгельгардта РАН.

Заяита состоится уУ " ¿^^1996 г. в 4._часов на заседании

диссертационного совета К 003.52.01 в Новосибирском институте биооргашческой химии СО РАН по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

О.С.Федорова.

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Первым этапом реализации генетической информации является транскрипция. Для осуществления этого процесса РНК-полимераза должна узнать и специфически связаться с определенными участками ДНК- промоторами. Узнавание ферментом нуклеотидных последовательностей промоторов и связывание с ними является критической стадией в инициации транскрипции генов и представляет один из основных механизмов регуляции транскрипции. К тому времени, когда начиналась данная работа методами футпринтинга, химической модификации ДНК, сайт-направленного мутагенеза, в промоторах генов прокариот было установлено существование двух областей гомологии: "-I0" и "-35м, и определены их консенсусные последовательности (ТАТААТ и ITGACA, соответственно). Но используемые методы и протяженные участки промоторов не позволили оценить сродство РНК-полимеразы к отдельным функциональным участкам промотора, к транскрибируемой и нетранскрибируемой нитям ДНК в пределах одной области гомологии промотора. Хотя такая информация способствовала бы лучшему пониманию механизмов взаимодействия РНК-полимеразы с короткими фрагментами нуклеиновых кислот и, в частности, дискретных шагов процесса взаимодействия РНК-полимеразы с промотором. Актуальность изучения взаимодействия РНК-полимеразы с олигонуклеотидами и их реакционноспособными аналогами обусловлена также тем, что оли-гонуклеотиды, способные к образовании специфических комплексов с РНК-полимеразой, перспективны в качестве средств для избирательного подавления развития определенных микроорганизмов и вирусов.

Цель работы. Цель настоящей работы заключалась в изучении взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с короткими фрагментами нуклеиновых кислот, идентичными участкам spe промотора генов рибосомных белков E.coli. Это предполагало решение следующих задач: I) определить сродство РНК-полимеразы E.coli к олигодезоксирибонук-леотидам, идентичным транскрибируемой и нетранскрибируемой нитям ДНК "-35" и "-I0" областей spc промотора генов рибосомных белков

E.ooli; 2) изучить взаимодействие фермента с модифицированными по 5'-концевому фосфату олигодезоксирибонуклеотидами, идентичными отдельным областям гомологии зрс промотора; 3) изучить влияние последовательностей, расположенных на 3'-конце "-I0" области spc промотора, на взаимодействие с РНК-полимеразой E.coli; 4) исследовать возможность взаимодействия изолированной о-субъединицы с олигодезоксирибонуклеотидами, идентичными "-I0" и "-35" областям spc цромотора; 5) изучить взаимодействие РНК-полимеразы E.coli с синтетическими олигорибонуклеотидами, гомологичными "-I0" и "-35" областям аре промотора.

Научная новизна и практическая ценность. Показано, что РНК-по-лиыераза E.coli связывает олигодезоксирибонуклеотиды, идентичные "-I0" области нетранскрибируемой нити ДНК spc промотора генов рибосомных белков E.coli, почти в 300 раз более эффективно, чем транскрибируемой нити. Обнаружено, что модифицированный по 5'-концевому фосфату двуцепочечный олигодезоксирибонуклеотид, идентичный "-I0" области spc цромотора, образует ковалентный комплекс с ß'-, ß-субъединицами фермента, а модифицированный олигодезоксирибонуклеотид, идентичный "-I0" области транскрибируемой нити ДНК spc .промотора- с ß'—, ß- и О-субъединицами. Изучено влияние последовательностей, расположенных на 3'-конце "-I0" области spc промотора, на взаимодействие с РНК-полимеразой и показано, что наибольшим сродством к ферменту обладает олигодезоксирибонуклеотид с С-трактом на 3'-конце ТАТА-блока. Впервые показано, что РНК-полимераза E.coli эффективно связывает олигорибонуклеотиды, гомологичные "-I0" области транскрибируемой нити зрс промотора. Эти олигорибонуклеотиды конкурентно тормозят транскрипцию, катализируемую РНК-полимеразой E.coli. Модифицированный по 5'-концевому фосфату аффинный олигорибонуклеотид образует ковалентный

комплекс с В'- и ß-субъединицами фермента. Впервые получены дан-

70

ные о способности изолированной а -субъединицы связывать олигодезоксирибонуклеотиды, идентичные "-I0" и "-35" областям spc

-г-

промотора.

Публикации и апробации работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты работы докладывались на Советско-Британском симпозиуме "Регуляция транскрипции" (Москва, 1990) представлялись в виде тезисов на 20-й конференции ФЕБО (Будапешт, 1990), Российско-Французском симпозиуме "Регуляция экспрессии генов" (Новосибирск, 1995).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 100 страницах, включая 15 рисунков, 7 таблиц и список литературы (108 ссылок). Работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части и выводов.

II.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. II.I. Взаимодействие ДНК-зависимой РНК-полимеразы E.coli с одно-и двуцепочечными олигодезоксирибонуклеотидами, вдентичными"-10" области гомологии эре и lac UV5 промоторов E.ooli Для изучения взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с короткими фрагментами промоторной ДНК (>12 нуклеотидов) использовали олиго-дезоксирибонуклеотиды, идентичные "-I0" области гомологии эре и lac U75 промоторов генов E.coli

Для получения количественных характеристик комплексов РНК-поля-меразы с олигодезоксирибонуклеотидами строились стандартные кривые зависимости связывания от концентрации олигодезоксирибонуклеотидов (рис.1). Для этого фиксированное количество РНК-полимеразы инкубировали с возрастающими концентрациями олигодезоксирибонуклеоги-да в условиях, оптимальных для работы фермента. Образующиеся комплексы РНК-полимеразы с олигодезоксирибонуклеотидом, меченным по 32

5'-концу Р, выделяли гель-фильтрацией на сефадексе G-50 и опре-

: 32

деляли в них количество Р- олигодезоксирибонуклеотида. Из полученных экспериментальных кривых связывания определяли значения констант диссоциации (Кд) для каждого олигодезоксирибонуклеотида, как концентрацию олигодезоксирибонуклеотида, необходимую для' поло-

коншнтрация олигонуклсотиба в рикциоииой смеси, мМ.

Рис."I.Зависимость количества образующихся комплексов РНК-полимеразы с олигодезоксирибонуклеотидами, идентичными "-I0" области нетрансгфибируемой нити spo и lac UV5 промоторов. Концентрация фермента- I пмоль/50 мкл. Приведены кривые для олигодезоксирибонуклеотида N1 (табл.*!)—о-о-, олигодезоксири-рибонуклеотида N4 (табл.') )- -а—о— .

вины максимального связывания - таблица I. Приведенные в табл.1 значения Кд комплексов РНК-полимеразы с олигодезоксирибонуклеотидами, как и количества образующихся комплексов, выраженные в процентах, свидетельствуют о том, что фермент с преимущественным сродством связывает олигодезоксирибонуклеотида, идентичные только одной из комплементарных нитей ДНК, нетранскрибируемой. Насрав-

Су

нения Кд комплексов, приведенных в таблице I, видно, что сродство РНК-полимеразы к олигодезоксирибонуклеотидам, идентичным нетранскрибируемым нитям ДНК эре и lac UV5 промоторов почти в 300 раз выше, чем к олигодезоксирибонуклеотидам, идентичным транскрибируемым нитям ДНК этих промоторов.

Из табл.1 видно, что такое же высокое сродство РНК-полимераза E.coli имеет к дуплексам, полученных отжигом комплементарных оли-

годезоксирибонуклеотидов, идентичных "-I0" области гомологии зрс г loe UV5 промоторов.

Таблица I. Связывание РНК-полимеразой E.coli олитодезоксирибо-нуклеотидов, идентичных "-I0" области spo и lac UY5 промоторов бактериальных генов

N олигонуклеотид цепь ДНК связывание,% КД.М

spe промотор

I 5'-TATAATGCCGCG-3' не тр. 36 . 1.5'Kf9

2 5'-CGCGGCATTATA-3' тр. 3.5 4- Ю~7

3 5'-TATAATGCCGCG-3' дуплекс 39 I.2-I0"9

3'-ATATTACGGCGC-5'

lac UV5 промотор

4 51-TATAATGTGTGG-3' нетр. 42 I.I'ICf9

5 5'-ССАСАСАТТАТА-3' тр. 4.6 3.I-I0""7

6 5'-TATAATGTGTGG-31 дуплекс 46 1-ПГ9

3'-АТАТТАОАСАСС-5'

7 5'-TATAATGTGTGGAAT-3' нетр. 41 2-Ю"9

8 5'-АТТССАСАСАТТАТА-3' тр. 4.5 3.3 «Ю-7

9 5'-TATAATGTGTGGAAT-3' дуплекс 44 I.5-I0"9

3'-АТАТТАСАСАССТТА-5'

10 5'-CTAGGCACCCGA-31 контроль 1.8 I.I'IO"6

нетр.

-50т-38

Ошибка в определении Кд составляла 20-30Ж. При определении процента связывания отношение олигодезоксирибонуклеотид:фермент= 1:10. Концентрация олигодезоксирибонуклеотида- 0.1 пмоль/50 мкл.

11.2. Изучение влияния последовательностей, фланкирующих "-10" область врс промотора со стороны стартовой точки, на

взаимодействие с РНК-полимеразой E.coli.

Исходя из полученных нами данных о том, что РНК-полимераза E.coli образует прочные комплексы с олигодезоксирибонуклеотидами, которые идентичны "-Ю" области нетранскрибируемой нити ДНК промоторов генов аре и lac UY5 E.coli, мы попытались определить влия-нже последовательностей, расположенных с 3'-конца ТАТА-бокса врс промотора, на взаимодействие с РНК-полимеразой E.ooli.

Определенные экспериментально величины констант диссоциации комплексов "РНК-полимераза:олигодезоксирибонуклеотид" свидетельствуют о том, что олигодезоксирибонуклеотида, содержащие С и G/C• тракты, имеют наибольшее сродство к ферменту. Константы диссоциации комплексов етих олигодезоксирибонуклеотидов с РНК-полимеразой равны и 1.5*10~^М, соответственно.

Драматическое изменение сродства РНК-полимеразы к олигодезокси-рибонуклеотиду происходит лишь при замене ТАТААТ консенсуса на комплементарную последовательность АТАТТА.

Полученные нами данные говорят.о том, что большой разницы в сродстве к федонту олигодезоксирибонуклеотидов, имеющих различные гекоануклеотидные последовательности, фланкирующие "-I0" область зрс промотора со стороны стартовой точки, не наблюдается. Можно предположить, что РНК-полимераза E.coli узнает конформацию, создаваемую консенсусами "-I0" и "-35" областей гомологии промотора и фланкирующими их нуклеотидами. Если ке нуклеотидные последовательности областей гомологии реальных промоторов отличаются от консен-сусных, то коррелирующую функцию по поддержанию узнаваемой конфор-мации ДНК выполняют нуклеотидные последовательности, фланкирующие области гомологии.

I1.3.Модификация РНК-полимеразы E.coli, алкилирующими производными олигодезоксирибонуклеотидов, идентичных "-I0" и "-35" областям spc промотора.

РНК-полимераза E.coli является мультисубъединичным ферментом,

состоящим из c^ß'ßa- субъединиц. Мы изучили субъединичную топографию фермента в комплексах с модифицированными по 5' концевому фосфату олигодезоксирибонуклеотидами.

В качестве реакционноспособной группы использовали остаток

4-[(Ы-2-хлорэтил-Ы-метил)амино]-бензиламина, присоединенный фосф-32

амидной связью к 5'-[ Р] фосфату олигодезоксирибонуклеотида.

На рис.2 представлеш результаты электрофоретического разделения субъединиц РНК-полимеразы E.coli после инкубации фермента с олигодезоксирибонуклеотидами из "-I0" области- spc промотора с алкилиру-ющей группировкой на 5'-концевом фосфате. Можно видеть, что олиго-дезоксирибонуклеотид, идентичныи нетранскрибируемой нити,образует ковалентный комплекс преимущественно с сг-субъединицей фермента. Олигодезоксирибонуклеотид, идентичный "-I0" области транскрибируемой нити, модифицирует в низкой степени ß'-, ß- и сг-субъединицы. Двуцепочечный олигодезоксирибонуклеотид, принадлежащий "-I0" области spc промотора, образует ковалентный комплекс с ß'-, ß-субъ-единицами фермента.

Во всех случаях практически не модифицируется a-субъединица РНК-полимеразы.

Данные по мечению РНК-полимеразы алкилирущим производным [^Р]-олигодезоксирибонуклеотида из "-35" области spo промотора (рис.3) свидетельствуют о низкой степени модификации субъединиц ферменте, что коррелирует со связывающей способностью олигодезоксирибонук леотидов из этой области. Модифицированный олигодезоксирибонуклеотид образует ковалентный комплекс преимущественно с ß'-, ß-субъ-единицами РНК-полимеразы.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что, во-первых, с 5'-концом олигодезоксирибонуклеотида, который идентичен нетранскрибируемой нити ДНК в районе открытого промоторного комплекса, контактирует ст-субъединица РНК-полимеразы. Во-вторых, одно-и двуцепочечные олигодезоксирибонуклеотида, идентичные "-I0" области spc промотора, связываются с разными участками на ферменте.

<

4 Рис.2. Радиоавтограф геля

после разделения в 5% ПААГ У с.0.1% ББЗ субъединиц РНК-р1 полимеразы, модифицированных р алкилирующими производными олигодезоксирибонуклеотидов, идентичных "-10" области бро промотора:

1- З'-ТАТААТОССаСО-З' (нетранскрибируемая- нить);

2- З'-ТАТААТаССОСС-З'

(дуплекс);

3- 5'-ававооАТТАТА-з' •' (транскрибируемая нить);

4- субъединицы РНК-полимеразы после окраски Кумасси 11-250

Ряс.З. Радиоавтограф геля после разделения в Ъ% ПААГ с 0.1% БШ субъединиц РНК-полимеразы, модифицированных алкилирующим производным олигодезоксирибонуклеотй-да, идентичного "-35" области нвтранскрибируемой нити ДНК врс промотора. Стрелками указано положение субъединиц фермента после прокрашивания геля Кумасси 11-250

II.4. Взаимодействие изолированной О -субъединицы с

олигодезоксирибонуклеотидами. 70

Как известно, о -субъединица в составе полного фермента обеспечивает специфический выбор промотора. Данные о способности изоли-70

рованной О -субъединицы РНК-полимеразы E.coli самостоятельно взаимодействовать с ДНК отсутствуют. В то ке время из литературных

54.

данных известно, что изолированная а -субъединица связывается с

промоторной ДНК. Поэтому задача данной работы также заключалась в

70

том, чтобы определить, способна ли изолированная О -субъединица

взаимодействовать с короткими фрагментами промоторной ДНК.

70

Результаты экспериментов по связыванию изолированной О -субъединицей олигодезоксирибонуклеотидов, идентичных "-I0" и "-35" областям гомологии зрс и lac UV5 промоторов представлены в табл.2.

(изолированная о70 -субъединица любезно предоставлена Pap В.А.,

70

ЛИН СО РАН, Иркутск). Из приведенных значений Кд комплексов о -

субъединицы с олигодезоксирибонуклеотидами видно, что изолирован-70

ная О образует довольно прочные комплексы с олигодезоксирибонуклеотидами, идентичными функциональным участкам промоторной ДНК

(табл.2). Однако, из полученных -значений К видно, что изолирован-

70 д

ная о -субъединица, в отличие от полного фермента, не обладает избирательностью при взаимодействии с олигодезоксирибонуклеотидами. 70

Так, О , в отличие от полного фермента, в состав которого она входит, практически не различает олигодезоксирибонуклеотиды, идентичные транскрибируемой и нетранскрибируемой нитям ДНК "-I0" и "-35" областей spc и lac U75 промоторов (табл.2).

70

Из полученных результатов можно заключить, что свойства о ,

обеспечивающие специфичность взаимодействия полного фермента с

функциональными участками промотора, реализуются только в ансамбле

70

с другими субъединицами фермента, либо связывание о с субъединицами кор-фермента придает им конформационные свойства, обеспечивающие специфичность взаимодействия с функциональными участками' про-

мотора.

Таблица 2. Связывание о-субъединицей олигодезоксирибонуклеоти-дов, идентичных "-35" и "-10" областям врс и 1ао ЦУ5 промоторов.

N олигонуклеотид область цепь связывание, кд,м

промотора ДНК %

врс промотор

I 5*-ТАТМтассаса-з' "-10" не тр. 18.6 8'ПГ9

2 З'-ТАТААТОССаСО-З1 "-10" нетр. 21 7-Ю-9

(изм.) 2-Ю-8

3 Ь'-сйсжжт-у "-Ю" тр. 9

4, 51-ТТТСТАСССАТА-3' "-35" нетр. 20 7-Ю-9

5 д'-гтййшш-з' »-35» тр. 7 2-Ю"8

6 5'-ТСТСТАСССАТА-3' "-35" нетр. 3 4-Ю"8

7 5'-ТАТС0СТА0ААА-3' »-35» тр. 9.6 1.5« Ю-8

8 5'-ТАТААтассаса-з' »-Ю» дуплекс 15 8-Ю"9

3._тттАС(}(5сас_5.

9 5'-ТТТСТАСССАТА-3' »-35» дуплекс 12 9» Ю-9

31-АААСАТСССТАТ

1ас ЦУ5 промотор

10 5'-ТАШТСтстса-з' »-Ю» нетр. 14 6.2-Ю"9

II 5'-ССАСАСАТТАТА-3' »-Ю» тр. 9 1.5-Ю"8

12 5'-СТТТАСАСТТТА-3' »-35» нетр. 12 9-Ю"9

13 51 -СТАСССАССССА-З »-50» нетр. 0.9 2'10~6

Ошибка в определении К составляла 20-30%.

-Ю-

П.5.Взаимодействие РНК-полимеразы E.coli с олигорибонуклеоти-дами, гомологичными "-I0" и "-35" участкам зрс промотора.

Ранее в работах, проводимых в нашей группе, было показано, что РНК-полимеразы E.coli, фагов Т7 и ТЗ с высокой избирательностью связывают олигорибонуклеотиды длиной от 5 до 8 мономеров из эндо-нуклеазных гидролизатов РНК-транскриптов, считанных с обеих нитей бактериальных или фаговых ДНК. Хотя первичную структуру таких аффинных олигорибонуклеотидов установить не удалось из-за большой гетерогенности связываемой ферментом фракции, представлялось вероятным, что они гомологичны олигодезоксирибонуклеотидам из "-35" w "-I0" областей промоторов. Для проверки этого предположения были синтезированы олигорибонуклеотиды, гомологичные "-I0" и "-35" областям spc промотора.

При исследовании обнаружено, что'фермент имеет очень низкое сродство к олигорибонуклеотидам, гомологичным аффинным олигодезоксирибонуклеотидам из "-I0" области нетранскрибируемой цепи (рис.4). Однако выяснилось, что РНК-полимераза весьма эффективно связывает октарибонуклеотиды, гомологичные "-I0" области транскрибируемой нити spc промотора. При этом с наибольшей эффективностью связывается олигорибонуклеотид, комплементарный блоку Прибнова с двумя фланкирующими нуклеотидами.

Обнаруженная нами способность фермента связывать олигорибонуклеотиды, комплементарные участку нетранскрибируемой нити ДНК вро промотора в районе "-I0" области, является нови? и неожиданным фактом. Избирательное связывание олигорибонуклеотида, комплементарного "-I0" области нетранскрибируемой цепи ДНК в районе "открытого" промоторного комплекса, позволяет допустить, что этот участок промоторной ДНК транскрибируется. Это предположение противоречит сложившемуся представлению, что нетранскрибируемая цепь ДНК в составе промоторного участка не считывается ферментом. Однако, в принципе нет оснований для того, чтобы полностью исключить это. Возможно, что олигорибонуклеотид с высоким сродством

к РНК-полшеразе имеет гомологию с участками низкомолекулярных регуляторных РНК.

1.2%

32%

а)

П./

РНК

1Г

гл%

1

18%Г

т

31-AAGAUGGGUAUAGAACUUCGCCACAAUAUUACGGCGCG

3G&.

б)

3.2%

(НТ)

10J6I

0.2%

ДНК

(Т)

и

5' -TTCTACCCATATCTTGMGCGGTGTTATAATGCCGCGC-3'

"-35" "-Ю"

3'-AAGATGGGTATAGAACTTCGCCACA£TATTACGGCGCG-51

В)

3%

3.5%

РНК

1

0.5%

0.5%

I 1

Э.З!6]_ 1

0.9%

0.1%

Рис.4.. Участок spc промотора и расположение по отношению к нему синтезированных олигодезокси- и олигорибонуклеотидов (очерчены прямоугольными скобками): а- олигорибонуклеотиды, гомологичные "-35" и "-I0" районам транскрибируемой цепи ДНК; б- олигодезокси-нуклеотиды, идентичные "-35" и "-I0" районам нетранскрибируемой (НТ) и транскрибируемой (Т) нитей ДНК; в- олигорибонуклеотиды) гомологичные "-35" и "-I0" районам нетранскрибируемой цепи ДНК. цифры над скобками обозначают эффективность связывания этих олй-гонуклеотидов РНК-полимеразой E.coli. Стрелка указывает направление транскрипции.

Мы показали, что РНК-полимераза слабо связывает олигодезокси-рибонуклеотиды, относящиеся к "-35" области промотора. Так же

слабо связываются ферментом и олигорибонуклеотиды, гомологичные обеим нйтям "-35" области зрс промотора.

Ранее было показано, что при одновременном связывании с РНК-по-лимеразой E.coli олигодезокси- и олигорибонуклеотиды не конкурируют мезду собой за место связывания на ферменте (Савинкова, 1984). Это могло свидетельствовать о том, что олигодезокси- и олигорибонуклеотиды связываются с разными участками на ферменте.

Рис.5. Электрофоретическое разделение субъединиц РНК-полимеразы E.ooli в 5% ПААГ с 0.1% SDS после модификации 4-[N-ме тил-N-(2-хлорэтил)амино]бензил-5'-фосфамидным производным олигорибо-нуклеотада 5'-GCAUUAUA-3'

1- контроль (субъединицы РНК-полимеразы окрашенные Кумасси R-250),

2- радиоавтограф геля после разделения модифицированных субъединиц.

Из результатов радиоавтографии, представленных-на рис.5, видно, что модифицированный по 5'-концевому фосфату октарибонуклеотид 5'-ССАШАиА-З', имеющий высокое сродство к ферменту, образует ковалентный комплекс с Р'-, (3-субъединицами фермента.

Полученные нами данные о различной субъединичной топографии комплексов РНК-полимеразы с олигодезокси- и олигорибонуклеотидами, наряду с данными о том, что олигодезокси- и олигорибонуклеотиды связываются с ферментом неконкурентно, свидетельствуют о том, что олигодезокси- и олигорибонуклеотиды связываются с разными участками фермента.

I г

чЯуг

II.б. Влияние аффинных олигорибо- и олитодезоксирибонуклеотидов на ДНК-зависимый синтез РНК. Нами была проверена способность олигонуклеотвдов, избирательно связываемых РНК-полимеразой, влиять на ДНК-зависимый синтез РНК, катализируемый РНК-полимеразой E.coli. Для этого РНК-полимеразу E.coli преинкубировали с олигонуклеотидом, а затем синтез РНК ини-

Рис.6. Кинетические кривые синтеза РНК после прединкубации РНК-полимеразы E.coli (5 мин при 20°С): а- с олигорибонуклеотидом 5'-GCAUUAUA-3' (связывание с ферментом- 32%); б- с олигорибонуклеотидом 5'-CGCGGCAUUAUA-3' (связывание с ферментом 18.3%); в- с олигорибонуклеотидом 51-UGGGUAGA-3' (связывание с ферментом 1.2%);

к-_контроль,_сштез ШК_в стандартшх_условиях. _ _ ____

циировали добавлением в реакционную смесь ДНК-матрицы и 4 NTP и продолжали инкубацию при 37°С. Одноцепочечные олигодезокси- и олигорибонуклеотиды, эффективно связываемые РНК-полимеразой, также эффективно ингибировали синтез РНК. Ингибирующее действие достигало 60-80% (в случае олигорибонуклеотидов, рис.6) и 30-50% (в случае олигодезоксирибонуклеотидов) на начальных минутах синтеза,

по сравнению с синтезом РНК в контрольном эксперименте (без пред-инкубации фермента с олигонуклеотидом).

Торможение синтеза РНК одноцепочечными олигонуклеотидами коррелирует с эффективностью связывания их РНК-полимеразой. Следует отметить, что ингибирующий эффект двуцепочечных олигодезоксирибонук-леотидов, идентичных "-I0" области, которые эффективно связываются РНК-полимеразой, оказался низким и не превышал 20% по сравнению с контролем.

Ингибирование процесса транскрипции одноцепочечными олигонуклеотидами, обладающими высоким сродством к РНК-голимеразе, продемонстрированное в этой работе, и полученные раннее в группе результаты по видоспецифичности связывания олигонуклеотидов РНК-полимера-зами (Кнорре В.Л. и др, 1984, Савинкова и др.,1988), свидетельствуют о возможности использования специфически связываемых олигонуклеотидов в качестве средств избирательного подавления жизнедеятельности определенных микрооганизмов в клетке хозяина.

Выводы.

1. Показано, что РНК-полимераза E.coli связывает олигодезоксири-бонуклеотиды, идентичные "-10" области нетранскрибируемой нити ДНК зрс промотора генов рибосомных белков E.coli, почти в 300 раз более эффективно, чем транскрибируемой нити.

2. Теоретический и экспериментальный анализ последовательностей, расположенных на 3'-конце "-10" области гомологии промоторов E.coli, показал, что замены нуклеотидных последовательностей этого района не оказывают существенного.влияния на взаимодействие с РНК-полимеразой E.coli.

3. Показано, что в образовании ковалентного комплекса РНК-полиме-разы с модифицированным по 5'-концевому фосфату двуцепочечным олигодезоксирибонуклеотидом, идентичным "-I0" области зрс промотора, участвуют ß *'—, ß-субъединицы, а с модифицированным олигодезоксирибонуклеотидом, идентичным участку транскрибируемой нити

ДНК в "-I0" области зрс промотора, участвуют р* —, (3- и сг-субъединицы РНК-полимеразы E.coli.

4. Впервые показано, что изолированная а-субъединица (70 кДа) способна связывать олигодезоксирибонуклеотиды, идентичные "-I0" и "-35" областям эре промотора генов рибосомных белков E.coli.

5. Впервые показано, что РНК-полимераза E.coli способна аффективно связывать олигорибонуклеотиды, гомологичные "-I0" области транскрибируемой нити ДНК зрс промотора. Аффинный олигорибонук-леотид, модифицированный по 5'-концевому фосфату, образует ковалентный комплекс с р'- и р-субъединицами фермента.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1.Л.К.Савинкова, А.А.Соколенко, И.И.Тулохонов, В.Л.Кнорре, Р.И.Сал-ганик, А.Г.Веньяминова, М.Н.Репкова, Н.И.Комарова. Взаимодействие РНК-полимеразы E.coli с олигорибонуклеотидами, гомологичными "-I0" и "-35" участкам зрс промотора бактериальных генов. Мол.биология, 1993, т.27, в.1, с.64-71.

2.Л.К.Савинкова, А.А.Соколенко, В.В.Горн, И.И.Тулохонов, Р.И.Сал-ганик, В.М.Седова, В.И.Воробьев. Связывание РНК-полимеразой II человека олигонуклеотидов, идентичных регуляторным элементам промоторов генов еукариот. Докл.АН СССР, 1991, т.317, $6, с.1494-1496.

3.L.K.Savinkova, A.A.Sokolenko, I.I.Tulokhonov, V.V.Babitschev, I.G.Skripal. The binding oi the oligonucleotide sequences from gene promoters by pathogenic and nonpathogenic mycoplasma RNA polymerases. Abstr. 20th PEBS Meeting, Budapest, 1990, p.84.

4.Л.К.Савинкова, А.А.Соколенко, А.Э.Кель, И.И.Тулохонов, В.П.Кума-рев, Л.В.Баранова, В.А.Рар, Р.И.Салганик. Изучение влияния последовательностей, фланкирующих "-I0" область гомологии зрс промотора со стороны стартовой точки, на взаимодействие с РНК-полимеразой E.coli. Мол.биология, 1996, т.30, в.1, с.182-186.