Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-конформационного состояния РНК-полимеразы ESCHERICHIA COLI при взаимодействии с разными промоторами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-конформационного состояния РНК-полимеразы ESCHERICHIA COLI при взаимодействии с разными промоторами"

КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. АЛЬ-ФАРАБИ

ГГБ ОД

На правах рукописи

УТЕШЕВ ТАЛГАТ АСКАРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-КОНФОРМАЦИОННОГО состояния РНК-ПОЛ ИМЕРАЗЫ ESCHERICHIA COLI ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С РАЗНЫМИ ПРОМОТОРАМИ

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы, 1996 г.

КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВШ1НШ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЯйШРСИТБТ ИМ. АЛЬ-ФАРАБИ

На правах рукописи

Л'ШЕВ ТАЛГАТ АСКАРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ СТРЛ{ТтЮ-иШФ0Р1;1АЬ)1Оп1-ЮГО СОСТОЯНИЯ РШ\-Пй1Бъ;Д2РА£ЗЫ ESCKKHICHIA COLI ПРИ БЗЖДОДЙхСТВИИ С РАЗНЫМ ПРШСТйРАШ

03.00,04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы, 1996 г.

Работа выполнена в Институте биологической суизики РАК и Институте молекулярной биологии и биохшии КАН Республики Казахстан

Научные руководители: доктор биологических наук

ламзолова С.Г.

кандидат биологических наук Озолинь О.Ы. .

Ведущая организация: Институт биохимии .АН Республики

Узбекистан

Официальные оппоненты: доктор биологических 'наук, профессор

Бейсембаева Р.У.

доктор биологических наук, профессор Гилыланов М,К.

¿У „ т,.„-

Защита состоится ,г " ) г. в_час.

на заседании специализированного Совета 1С 14/А 01.13 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук при биологическом (факультете Казахского государственного национального университета им. АльчЬараби по адресу: 400121, г. Азиаты, пр. Аль-йараби 71

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке 1Саз1У им. Аль-^араби.

Автореферат разослан "1 : 1936 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук,

доцент Т.М. ШАВДХЖГОШ

СБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ • ■

Актуальность проблемы. Комплексообразование ме;;оду Р1Ж-полимеразой е.coli а промоторными участками ДНК'являются ключевой стадией транскрипции, определяющей частоту инициация синтеза РНК in vitro я степень утилизации соответствующих генов in vivo (Me Clure, 1983). Двустадийная модель образования комплекса включала I) поиск ферментом промоторного участка на ДНК и первичную ассоциацию с ним с образованием "закрытого" промоторного комплекса я 2) локальное плавление двойной спирали ДИК, т.е. переход "закрытого" комплекса в "открытый" (Waiter et.ai., 1967). Детальный кинетический анализ стадии комплексообразования РНК-полямеразы е.coli с рядом натийных (Aprm , t7ai, lac uv 5 И мутантных (хз, prmup-I) промоторов (Hawley, Мс Clure , 1980, 1982); Kadeach et.ai. , 1982; Rosenberg et. al., 1982; Бис, 1Лс Clure,1985; Roe et. al., 1985) выявил наличие одной дополнительной стадии между "закрытым" и "открытым" комплексами. Следовательно, комплексообразование РНК-полямеразы с промоторными участками ЖК происходит в несколько этапов, точное количество которых неизвестно.

Молекулярная природа этапов комплексообразования изучена еще.меньше. Наденно зарегистрирован только процесс локального-плавления спирали в -10 области, являющийся конечной-стацией образования открытого промоторного комплекса для большинства промоторов (Siebenlist, 1979). Исследование температурной зависимости комплексообразования PlK-полимеразы с промоторами T7AI (Rosenberg et.ai., 1982), Лрд (Roe et.ai., 1965), термодинамических параметров этой реакции для /bR (R°e et.ai., 1985), зависимости от концентрации одно- и двухвалентных металлов и электрофоретической1подвижности комплекса с. T7AI промотором (Rosenberg et.ai., 1982; Heumann et.ai., 1986) привело к предположению о том, что одной из стадий образования комплекса является изомеризация РНК-полимеразы.

Характер конформационных изменений фермента зависит от нуклеотядной последовательности промотора и, вероятно, от структуры РНК-полимеразы. Только на этом этапе, могут быть сформированы, обнаруженные в ряде работ (Камзолова, Озолинь, 1986; Свердлов и др., 1978; Prosen, Cesh, 1985), различия в структуре активного центра РНК-полимеразы, взаимодействующей

с разными промоторами. Вое эти данные указывают на необходимость дополнительных исследований всех этапов комплексообразо-вания для выяснения кода промотор-полимеразного узнавания, для понимания силы промоторов и ключевых молекулярных механизмов регуляции транскрипции на стадии инициации синтеза РЫК.

В связи с этим наиболее важным является изучение крмплек-сообразования ЩК-полимеразы е.coli wI2 и мутанта гро В 409 с AI и D (АО) промоторами ДНК фага T7äd III (делеционный мутант фага Т7) методом абортивной инициации синтеза РЖ. Становится также очевидным исследование специфической модификации монортутным производным йлуоресцеина - флуоресцеинмономеркур-ацетатом (ФШ1А) - специфическим реагентом на SH-группы белков, консТормационных изменений РНК-полимеразы методом флуоресцентной метки, а также'выполнения сравнительных кинетических и конформационных анализов специфического взаимодействия между FHK-полимеразой и T7AI и D промоторами фага ДНК.

Цель и задачи исследования. Исследование структурных и динамических свойств комплексов, образуемых РНК-полимеразой на разных промоторах (AI и D) в составе*нативной ДйК, в условиях, обеспечивающих селекцию индивидуальных промоторов, нами проводилось методом флуоресцентной метки.

В связи!' с' этим основными ,-задачами .работы явились:

- Выделение индивидуальных промоторов AI и d;

- Исследование конформационного состояния КЖ-полякерази в комплексе с индивидуальными промоторами AI и D методом флуоресцентной метки;

- Определение констант взаимодействия FHK-полимеразы к. coli W 12 и гро В 409 с промоторами Т7 ДЦК в составе нативной матрицы и в составе рестрикционных фрагментов;

- Методом флуоресцентной метки исследовать взаимодействие индивидуальных промоторов с ЕШС-полимеразой дикого и иутантно-го штамма;

- Изучение температуро-индуцированной РНК-полимеразы при комплексообразовании с промоторами AI и'D;

- Изучение кинетических и функциональных структурных отличий между промоторами AI и D , определяющие количественные и качественные характерные сдвиги в механизме их взаимодействия с РНК-полимеразой.

Научная новизна

- В условиях эксперимента изучено комплексообразование РНК-полимеразы е.coli я 12 и рифампицинустойчивого одтанта гро В 409 с AI и D промоторами ДНК фага Т7д D III с помощью абортивной инициации синтеза РНК.

- Впервые показано, что мутация селективным образом изменила способность РНК-полимеразы инициировать синтез на разных промоторах так, что эффективность. использования промотора D увеличивалась, а промотора AI практически не изменялась. При. этом мутация не влияла на сродство фермента

к инициирующим субстратам.

- Показано, что промотор AI не отличается от промотора D по области -35. Оба промотора имеют AI-богатый участок в области -43, хотя у промотора D этот участок вырапен слабее. Длина спейсерного.участка мелду -35 и -10 областями

17 нуклеотидных пар для обоих промоторов. Кроме различий по -10 области промоторы AI и D отличаются расстоянием между стартовой точкой транскрипции и -10 областью, которое равно 7 н.п. для AI и 6 н.п. для промотора D . k

- Впервые изучена специфическая модификация РНК-полимеразы монортутным производным флуоресцеяна - флуоресцеинмоно-меркурацетатом (ФМЫА). Показано, что при эквиыолярноы соотношении ФММА : фермент, флуоресцентная метка реагирует преимущественно с одной сульфгидрильной группой на . о^"-субъединице РНК-полимеразы.

- Установлено, что образование меркаптидаой связи сопровождается значительным изменением всех спектральных пара^ метров ФМлА, но не влияет на кинетические параметры (Kg и Kg) реакции инициации синтеза.РНК и не приводит к ингибиро-ванию суммарного синтеза РНК.

- Впервые показано, что спектральные характеристики связанной ФММА чувствительны к конформационным превращениям РНК-полимеразы при комплексообразования с ЛИК фага T?ad III'.

- Показано, что имеются некоторые" температуро-индуци-рованнне изменения РНК-полимеразы в комплексе о изолированными промоторами AI и D , сходные в спектральных параметрах метки (образование кра и, возможно, RP0). При этом характер

изменений Р и локальная структура комплексов-, сформированных выше 33°С, различаются для AI и в . Следовательно, температу-ро-зависимое конформационное поведение комплекса фермент-промотор зависит не только от структуры промотора, но такие и от структуры РНК-полимеразы.

Теоретическая и практическая значимость

Точечное мутационное гро В 409 изменение структуры э -субъединицы РНК-полимеразы приводит к дифференцированному изменению во взаимодействии фермента с двумя промоторами AI и D , указывает на различие структур активного центра РНК-полимеразы, взаимодействующей с разными промоторами. С этим выводом согласуются литературные данные по меченшо различных субъединиц РНК-полимеразы н,а разных промоторах с помощью фотоаффинных аналогов субстратов синтеза РНК (Свердлов и др., 1978) и наши данные-о различии структурно-конформацлонного состояния'спин-меченой РШ-полимеразы. в комплексе с разными промоторными Т7-дак (Камзояова, Озолинь, 1986).

Этот вывод представляется существенным, поскольку он, указывает на разный тип взаимодействия одной и той ме РНК-по-лимеразы E.coli с разными промоторами. Поскольку изоэнзимное и (или) структурно-конформационное различие одного активного центра РНК-полимеразы вряд ли моает быть столь разнообразным, как число промоторов (несколько тысяч), с которыми отот фер-| мент.взаимодействует in vivo, -что представляется разумным предположением о существовании нескольких активных центров, участвующих в комплексообразовании с матрицей,, каждый из которых^ взаимодействует с определенной группой промоторов. Структурные особенности РНК-полимеразы 2.coli , а именно, наличие в субъединицах гомологичных блоков с небольшими заменами согласуются с таким предположением. В рамках представлений о существовании различных активных центров РНК-полимеразы E.coli , участвующих в специфическом комплексообразовании с матрицей, программы, кодирующие промоторот-полпмеразное узнавание, должны различаться для разных групп промоторов, каждая из которых запрограммирована на взаимодействие со своим -специфическим центром. В связи с этим проблема белково-нук- . леинового узнавания для пары РЖ-полимераза-промотор долзша решаться не в рамках поиска единого кода на основе универсального консенсусного промотора, а с позиций классификацион-

ного подхода s анализу промотора.

Необходимо о-метить, что существование разных классов промоторов, взаимодействующих с разными структурными изомерами РйК-лолимеразн и с разными активными центрами Фермента, имеет большое-физиологичезкое значение. Целый ряд физиологических Факторов как температура и солевой состав, появление белков типа ГЛ (Ramakrishan, lichols, 1973) И ^ ( Travers et.al., 1970), взаимодействующих с РПК-потамеразой, или низкомолекулярных соединений небелковой природы (ppGpp ала Т РШСТИР), может прямо или опосредовано изменять конуормацпонное состояние всех или части молекул РНК-полимеразы, изменяя таким образом специфичность фермента к промоторам разных классов. Такая организация генетического аппарата способна обеспечпть клетке быструю, обратимую и экономичную адаптацию к изменяющимся услозк.1:;. среды, сохранив сбалансированную экспрессию генов.

Апробация работы.

Материалы диссертации- были представлены на:

- I конференции молодых ученых "Молекулярная и клеточная регуляция ферментативной активности" в ГДР, 17-23 августа 1986 г. ;

- II Международной конференции молодых^ученых социалистических стран "Молекулярные основы биотехнологии", 9-15 ноября I9Û7 г. (Пущино) ;

- 71 всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов", 3-6 февраля 1987 г. (Москва) ;

- Международной школе-конференции молодых ученых социалистических стран "Биохимические и биофизические принципы в биотехнологии", ГДР, 27 ноября - I декабря IS89 г. ;

- X Международном биофизическом конгрессе. Начал,а, июль-август IS90 г. ;

- XX конференции Федерации Европейского биохимического общества (<£ЕБ0), Венгрия, I9SI г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано II научных работ, перечень которых приводится в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов.и методов исследований, результатов исследований л их обсуждения, заключения, выводое, списка использованной литературы. Работа содержит 130 страниц

машинописного текста, две таблицы, 22 рисунка. Указатель ди-тературы включает 132 источника.

МАТЕРИАЛ И мЪТОДЫ ИСШЩША1ШЯ

РНК-ПОЛИМеразу ИЗ бактериального штамма Escherichia coli wu -36-I0-II-I2 (leutm , tyroc , supEoc) ( E.coli Vi 12) выделяли по методу Burgess, Jondrisak (197о). Удельная активность на JiilK фага Т7д D III составляла 200-270 ед/мг ( Burgess, 1969). Содержание о" -единицы по данным электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия варьировала от 65 до 90р. Доля активных моиекул, определенных па Пае III фрагмент о

(;.ага T7äD III.длиной 1639 Ii.П. сосчавляло 4b;i (Chanberlin, Hierin an, 1974).

Стандартная реакционная проба. (2UÜ мкл) содержала 20 (жг ййС Сага Т7, 5 ккг Phiv-шшшоразы, U,üi м Трис-KCI (pii-7,9), 10 teJ cl2, 50 KaCL, I0-4 ЭДГЛ, 2»lü-0 i.i дитиотреит и нуклеозидтрифос^аты в концентрации 0,3 ш каждый. В качестве радиоактивного субстрата использоьа;ш [i4cJ ATP (40 ии/ ммоль). Пробу о'пашали от непрореагпровавших субстратов и определяли количество синтезированной (z^cl Ии, описанное ранее ( Ozoline,Kamzolovu, 19о6).

Синтезирование ц..ьЛА по методу к crush et.al. (1964). Продукты меркурировашш разделяли с помощью хроматографии на колонке с сео;адексом G-5C (б а 60) в ü,Ul м UaOH (ыар-кович и др., 1974). ¿.¡олярньш коэффициент ркстилквдш полученного препарата Ы составляет 7,6*10^ ¡.Г"'" • см~^, положение максимума спектра эмиссии - ölü нм (щмшо!» спектр), 519 нм (скоррегировааный спектр).. Всо спектральные параметры <t\,LiA полностью соответствуют литературным данным (маркович п др., 1974).

модификация Рш^-полимеразы ф.'.Щ. Фермент перед использованием пропускали через колонку с' еефадексом G-50 (I X 10 см) для замены буфера хранения на 0,01 1,1 Трис-HCI, рН-7,9. Затем к раствору фермента при 0°С добавляли необходимое количество fflvIivlA, находящегося в том ке буфере и инкубировали I час во льду. Несвязавшуюся метку отделяли гель-фильтрацией смеси (не более 300 мкя) на колонке с сефадексом G-50 (I X 10).

sh-группн iT-ермента тлтровачи при-постоянной концентрации [¡К-шши-.срази после 2 час. модификации, варьируя коицентра-ию и регистрируя интенсивность (I ) и коэффициент поля-изацчи флуоресценции (Р) в доксвдрмв спектра эмиссии. Коэф-нциент поляризации определяли по короле:

Р ,, а - t с/а Vb_

a t- [с/аро^ ' А

, ъ , с, d- пнхепс^влостп флуоресценции поляризованного света

ра пояокешш поляризаторов возбуждения и испускания 0°-0°,

°-90°, SU°^C° и 90°-90° соответственно.

Длина eo'ihu возбуждающего света быяа 425 шл.

Спектральные исследования. Спектры поглощения получали с

омощью спектрофотометра :,1'40 ("Uerl-Zeiss" , ГДР). Спектры

озбузденяя и гмиссаи флуоресценции, также коэол.пцкепт поля-

иэацвп определяла на спеятроклу ериггетре " Perk in Elmer "

я?р-44В, снабженной компьютерны:.; устройством для коррекции

пектров. Во всех случачх использовали растворы, имеющие

огдощепие при длине волны возбуждения гораздо меньшее, чем

,05.

Субъединпчная локализация места присоединения ФЖ1А к ЬК-поликеразе. Модифицированную ¿ША РКК-полшеразу денату-ировали 0,3/з-ншл додецилсулы-атом натрия 30 мин. при 55°С ез меркаптоэтанола. Субъединицы разделяли стандартным методам ( Laemmli , IS70) в 15/а-ном акриламидном геле. Гель дрн-атшлетрировали в проходящем свете на спектрофлуориметре-.енситометрэ Сд-I (Ciib, Иущико), используя ртутную лампу ДРШ-250,2 и фильтры шС-7 для возбуждения флуоресценции и ЗиЗС-19 дя регистрации сигнала. Затем для контроля за количеством еразруиенных субансамблей гель прокрашивали кумасси синим : -250, денситометрировали стандартным способом и сравнивали контрольной пробой, содержащей РНК-полимеразу, денатуриро-■анную в присутствии меркаптоэтанола.

Кинетические параметры реакции комплексообразования 'НК-полш/еразы о промоторами определяли по методу, основанно-'У на использовании флуоресцентного аналога UTP-/-AUS Bert ran d-Eur;;ruff et.ai., 1984). Реакционную смесь I 170 мкл), содержащую 0,01 Ы Трис-liCI (рН-7,9), 0,01 1.1 ЫцСЬ2,

0,1 М Иась , 7-Ю-0 М дитвотреит (дитиотреит и ЭДГА не добавляли в растворы с модифицированной ЙША РНК-полямеразой), 7-Ю"5 М ЭДТА, 0,3 мМ АТР, 0,47 м!Л игр-^-АКЗ а РНК-полшлеразу в концентрации от 45 до 200 нМ, помещали в термостатированную 500-мкл кварцевую кювету спектрофлуориметра и выдерживали о мин. при 25°С. В начальный момент времени к ней добавляли раствор 2 (30 мкл), содержащей 1,15 ны ДНК фага ТУдОШ б том ке буфере. О синтезе олигонуклеотидов судили по увеличению интенсивности флуоресценции при 430 нм (возбуждение при 360 нм). Интенсивность флуоресценции определяли каждые 6 сек. в течение не менеесЗО'мин. Кинетические параметры определяли из зависимости времени, необходимого для образования открытого проыотор-ного комплекса Т , от обратной концентрации РНК-полимеразы (1/И) ( Ыс С1иге, 1380):

к2 к2 ' ' "1Г

Величину Т определяли по точке пересечения прямой, отражающей кинетику синтеза олигонуклеотидов, с базовым уровнем флуоресценции. Соответствующую аппроксимацию кривой флуоресценции получали с помощью компьютерной обработки исходных данных по метолу наименьших квадратов. !

Значения К^ и к^ определяли по точке пересечения с осью ординат и наклону зависимости ^ от 1/н . Температура 25°С была выбрана для замедления процесса комплексообразования и увеличения достоверности при определении величины "Г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССКЕДО^Шй И ИХ СЕСВДШИЕ

Характер конформационных изменений фермента при комплек-сообразовании и, следовательно, структура активного центра РНК-полимеразы определяется нуклеотидной последовательностью промотора и структурно-конформационным состоянием РНК-полимеразы до взаимодействия. Это, означает, что структура активного центра, а, следовательно, и функциональная активность РЦК-по--лимеразы, взаимодействующей с разными промоторами, могут быть разными. Для выяснения кода промотор-полимеразного узнавания, для понимания силы промоторов и ключевых молекулярных механизмов регуляции транскрипции на стадии инициации синтеза РНК необходимо детальное изучение всех этапов комплексообразования РНК-полимеразы с разными промоторами.

I. Дифференцированное изменение селективных свойств РНК-полимеразы Е.coli к промоторам ДНК фага Т7

Нами изучено комплоксообразование РНК-полимеразы E.coli V 12 и мутанта гро В'40S с AI и D (АО) промоторами фага ADIII Т7 (делеционный мутант) методом абортивной инициации синтеза PllK. Наше исследование является продолжением работ, посвященных изучению регуляторных свойств РНК-полимеразы в транскрипции (Камзолова и др., 1979 ; Камзолова, Озолинь, 1980, 1986 ; Смирнов, «алыгяи, 1984 ; Озолинь, Камзолоза, IS86). Поскольку мутантная РНК-полимераза не отличается от нормальной по её способности плавить двойную спираль, полученные результаты позволили высказать предположение об изменении селективных свойств у мутантного фермента к одному или нескольким легкоплавким промоторам фага Т7 и рекомендовать из этой группы промотор 3 (АО) в сравнении с AI как наиболее перспективный для изучения молекулярных механизмов взаимодействия с PüK-no-лимеразой.

Iia рис. I представлен образец автографа, полученный с геля после разделения продуктов и субстратов реакции. При синтезе олкгопуклеотидов в случае Иж-полимеразы S.coli V/ 12 при всех концентрациях субстратов промотор AI используется эффективнее, чем промотор D . В случае РНК-полимеразы гро в 409 промотор AI используется менее эффективно, чем промотор D . При этом синтез с промотора D мутантным ферментом происходит в 1,5-2,0 раза быстрее, чем исходной РНК-полимеразой, тогда как образование динуклеотида с промотора AI в 1,1-1,2 раза медленнее. Следует отметить", что удельная активность мутантного (фермента, определяемая по суммарному синтезу PIIK на ДНК фага Т7 (100-170 ед), на 10-15$ ниже, чем у РНК-полимеразы E.coli и 12 (120-200 ед),. что, возможно, объясняется обнаруженной для гро В 409 РНК-полимеразы.меньшей активностью на промотора AI. Нельзя также исключить, что мутация в центре связывания рифампи-цина может повлиять на структуру или функционирование центров связывания инициирующих субстратов.

В присутствии только двух субстратов синтез динуклеотидов является типичной двухсубстратной ферментативной реакцией, для которой зависимость равновесной скорости от концентрации' субстратов описывается следующим уравнением:

pppkpU -

—pppBpllpUpS —pppGpUpU

Q -pppspu

[ccn-?mp

i

г

з

Рис.4. Образец автоз-рафа с геля после разделения продуктов и субстратов резкиин. /, 2 пробы содержали 1 мМ АТР и 60 мкЛГ ЦТР; 3, 4 - 1 мЛ/ СТР и 60 мкЛ/ ЦТ»'. Кс-шрс.шшс ироСы (/. 3) инкубировались при 0°С

JL

V

V

1.ЛКС

('

КА

А

1 +

где

v и v макс

реакции ; А

т-А „В л

A ii А - b

- экспериментальная а . л»;с1!дл;,ьио иози&ошм скорость

ь

концентрация первого п ьторсч'о субстратов ;

, равновесные моисталты диссоцаищш кандого суостратн

ш гп

из комплекса с ферментом и вторым субстратом ; каждая К» соответствует константе ..¡лхаолиса дия спстсми, в ксторой субстрат находится и насыщающей концентрации ; кА константа обратимой диссоциации комплекса фермента с перьш субстратом.

Как следует из этого уравнения, зависимость скорости реакции от концентрации первого субстрата при фиксированной концентрации второго субстрата в обратных координатах [I/V , I/ А ) представляет собой прямую, пересекающую-ось ординат в точке, координата которой зависит; от концентрации второго субстрата. Оба эти вторичных графика представляют собой прямые, пересекающие ось ординат, первый в точке I/ V , второй в точке

дчя инпции-

Кд /vKaKC. Они использовали для вычисления KiTi ругацих АТР и GTP.

В случае промотора D кроме динуклеотида, составляющего

80—Ь5/в от всего продукта, наблюдали образование также три-(6-Ь%), тетра- (3-55») и пентануклеотидов (5-7$).

Показано, что константа ;.1ихаэлиса для АТР, усредненная по всем опытам, составила 197+ 16 и 214 + 19 ыкГЛ, а для атр -- 311 + 9 и 324 + 20 мкМ для исходного и мутантного ферментов соответственно. Обнаруженное в нашей работе селективное изменение в эффективности утилизации мутантным ферментом двух промоторов реализовывается на каких-то стадиях специфического комплексообразования с промоторами. Следовательно, мутация влияет на узнавание и селекцию ферментом промоторов.

• На основании полученных данных можно предположить, что промоторы А1 и I) относятся к разным классам и различаются в области -35. Оба промотора имеют АТ-богатый участок в области -43, хотя у промотора о этот участок выражен слабее, мина спейсерного участка между -35 и -10 областями составляет 17 н.п. для обоих'промоторов. Последовательности, находящиеся в -10 области у А1 и О промоторов отличаются от конценсус-вой последовательности и друг от друга. Имеется также некоторое несоответствие между высоким содержанием ОС-пар в -10 области промотора и и тем, что он является одним из самых легкоплавких, чем промотор А1. Это свидетельствует о том, что локальное плавление ¿НА в этой области определяется не только физико-химическими свойствами этого участка ¿¡Ни, а зависит от структуры активного центра фермента, вероятно, различающейся для -двух этих промоторов.

Кроме различий по -10 области А1 и а промоторов, они отличаются расстоянием между стартовой точкой транскрипции и -10 областью (7 н.п. для А1 и 6 н.п. для с ). В положении -I у А1 находится С, встречающийся в 50;1 расшифрованных промоторов, а у в - Т (встречаемость 22%). Таким образом, анализ-первичной последовательности двух промоторов показывает, что они отличаются, по ряду функционально значимых участков, причем основные различия сгруппированы вблизи стартовой точки транскрипции .

2. Разработка методов специфической модификации РНК-полимеразы монортутным производным флуо-ресцеинмономеркурацетатом (ФША)

Нами проведены экспериментальные исследования по специфической модификации РНК-полиморазы ФША - специфическим реагентом на БН-группы белков, способных взаимодействовать с меткой. Фермент титровали раствором красителя, регистрируя интенсивность и коэффициент поляризации флуоресценции в максимуме спектра флуоресценции (рис. 2). Ь спектре флуоресценции обнаружено 'шесть" перегибов, имеющих место при следующих соотношениях ФИЛА : формант - 0,9 + 0,02 ; 1,7 + 0,08 ; 3,5 + 0,24 ; 8,6 + 0,4 ; 15,06 + 0,04 и 23 + 0,6. Остальные бн-группы РНК-полимеразы становятся доступными.для взаимодействия с тиол-специфическими реагентами только после частичной денатурации. Таким образом, <й,!дА способна взаимодействовать с большинством экспонированных на поверхности РНК-полимеразы сульфгмдрильных групп, при этом доступность разных зн-групп существенно различается.

При добавлении 1А к РЫК-полимеразе (соотношение 0,8:1,0) изменяются все спектральные характеристики метки (максимум спектра поглощения, возбуждения,, эмиссии, молярный коэффициент экстинкции, интенсивность флуоресценции и коэффициент поляризации). Образованный комплекс ФЬШ. с РНК-полимеразой стабилен, он не разрушается во время гель-фильтрации на сефадексе, при изменениях температуры от 0° до 55°С и в присутствии додецил-сульфата натрия. Эта стабильность при модификации РНК-полимеразы ФММА обусловлена образованием ковалентной меркаптидной связи Б-Не , которая легко восстанавливается• ¿*-меркаптоэта-нолом,

Нами показано, что основные изменения спектральных характеристик при взаимодействии ФММА с РНК-поли^разой происходят в течёние первой.минуты. Наличие этих изменений и их продолжительность не зависят от соотношения ФША-г-РНК-полимераза в 'диапазоне от 25 до 95 и обусловлены медленными конформационннш перестройками в локальном окружении первой связанной метки.

Нами показано, что большая часть- белка мигрирует з виде индивидуальных'полипептидов. При модификации РНК-полимеразы и низких соотношений метка:фермент более 90^ ФША.мигрирует

o.i

o.i i

нос

j UDO

Ii 00

woo

noo

ijto.cn

"1—I-

r

400

c.S'TirrpoBaünc I

W00

h 600

ZOO

7

/ X

/

/

i

V'O.H

J / 1,7 ±00! /..—• 0.9*0.01

-/

/

/

/

г:

s .

/

''IstlH

I

5

Я 13 17 21 25 fTMMA/PMK - пзлимгат

29

?J

''IK iloiiHwcfüJL; МЛ tro данным нитснсмпностн (я) и irrjuми (ii)

:ценцин: / - cm>6oiula* кгтка, 2 - комплекс РНК-нолнкграэы с Ф.ММА. Kciiu^iirpjf.iut ГПК ч.

МсрЗ^Ы 41,8 НМ. ЦкфрЫ У ТОЧГК ПсреП:бС!1 - УГ1 ^ДПСИНЫе ЗНЭЧСЬИЯ ПОЮЖСНИЯ КерсГТ'кН! IKl I |i>

x / и üiiptyiojifü.wc и «cTbtpix нсэзиücfMLix Ohl,Tax. IIa кспике - резульпги нс'еншшм.н и .......

та но тигроьалн-чз I I]¡'-iicmiMquji,l ФММА

■cl -субъединицей. Об их взаимном расположении можно высказать за предположения: I) обе молекулы ШЛА. взаимодействуют с одним тем не остатком цистспна, находящимся в составе разных субъ-1иниц ; 2) две первые молекулы ФША присоединяются к .двум раз-лгл остаткам цистеина, находящимся в составе одной и той же ти разных субъедвдвд.

Известно, что некоторые SH -группы Фермента участвуют или зходятся в непосредственной б;шзости от специфического центра, светственного за взаимодействие с промоторами. При этом присое-шенив меток к таким группам. мол:ет изменить кинетические пара-зтры реакции специфического ксмплексообразования. Для проверки coro предположения нами была иерользована реакция абортивного штеза ди- и олигонуклеотидов с промотора ЛНК делеционного ^танта бактериофага Т7двШ. Кинетические, параметры опрелеля-1 по .методу Bertrand-Burgmff (1988). Полученные нами резуль-1ты исследований представлены в таблице I. В присутствии неполно набора субстратов gtp и итр на ЭДК фага T7ad III воз-зжна инициация ^синтеза только на одном промоторе d (иниции-?ющая последовательность pppGpüpüpG ). В присутствии АТР и

16

Таблица I

Кинетические параметры реакции комплексообразования исходной и модифицированной iMlA РНК-полимеразы с промотора™ ДНК фага Т7д1) III

Промотор

Константа

Шемодифицирован- ¡Фермент, дюдифищ ! ный фермент !рованный SMvIA

AI ( F )

Kg, iii-^

K2' C_iI I Kon, M I'.c 1

1,7 + 0,25-10' 8,85 + 0,3-10' 1,5 . I0e

,8 -3

1,56 + 0,2'Iü r 9,25 ± 0,9-10~3 1,45 • IG6

kg, с

2,3 + 0,4.I0V 16,8 + I.ü-Iö"3 0,38 • IO6

D (АО)

2,35 + 0,85-10 :6,0 ± 3,0-Iü7 0,38 • IO6

T

UTP инициация синтеза РНК возможна на снлььок продюторо AI (инициирующая последовательность рррлрирс ) и па слабом промоторе J? (инициирующая последовательность pppApüpApUpc ). При этом суммарная константа инициации на ¡тромсторо AI

Н£ порядок превосходят константу инициации на промоторе ï (Dayton et.al., ICC4; Presen, Cosa, I98G).

Как бшхо показано ранее Prosen я Cesh (1986), промотор i имеет колоколообразную зависимость эффективности от концентрациг РНК-полимеразы с ма:симумом при 16 Ш. Если концентрация фермента превышает 40 нИ (ка I нИ ДНО эффективность промотора значительно ингибируется. Поэтому в эти: условиях низкой ( <1 нМ) концентрации РНК-полимеразы, синтез динуктеотпдов в'присутствии АТР и Uïï происходит преимущественно с промотора AI. Поскольку для определения кинетических параметров необходимо соблюдать условие: [РНК-полимераза] промотор3 , концентрацию энзима варьировали от 45 до 200 нМ (в пересчете на .количество активных молекул). Следовательно, присоединение ШлА к РНК-полимеразе практически не влияет на Kg и Kg. Поэтому полученные значения константы взаимодействия находятся в хорошем соответствии с ранее опубликованными для-промотора AI Kg=3«IO^ и для D _ 2'107 М-1 (Камзолова и др., 1984).

Таким образом, при эквимолярном соотношении с ферментом фшуоресцеинмономеркурацетат образует меркаптидную связь практически с одной SH-группой, расположенной на ci -субъединице

РКК-полимеразк. Спсжкйвпесзля яодкйикадпя РНК-полимеразы' ФШ.1А ко изменяет кинетических параметров взаимодействия фермента с ДгЛ*. я не влияет на суммарную активность. фермента. Это создает предпосылки для успешного использования предлагаемой модификации в структурных и топологических исследованиях РНК-полимера-зы в процессе её функционирования.

¿ишетятеск^е параметры образования комплекса при 2 бы-ш определены с использованием Т7дО Ш-ДД£. Температурную зависимость 1<2 для 3 определили с использованием 341 н.п. фрагмента ТТДьШ ДЕК. петнческие паракетрн взаимодействия РНК-поли-мс-разъ: з М ала порчена с помощью 1539 н.п. фрагмента рестрикция ТУДСШ-Д-^К.

о. лоЕфор..^цис:аЖЁ анализ рсгищка чзашодеЛстввя РЫ:-полимеразы с ирсш-юраии ¿1 и в дне флга Т7

Для проьезки гсодейстьья то:,.; г па реакцию открытого об-расовс'лчк комплекса на Ъ цглез представлены график;: "Г .

Ус7-анвзлеко, что для А1 ота с^г-есшостй для п:::-:сй и мутактной РЬК-поллмьразъ: ле.шжся зрактическ/. и.дентлчннми. Для с кривая Т* -графе;?.а значительно различается дш обоих Ферментов (рис. 3). Средние значения „ил г^ и получение? в независимых скспезжзнтах представлены в таблице 2. 1|акп обнаружено, что константа инициации коп - К^к^, которая характеризует силу промотора, является практически равней для обоих ферментов в случае с А1„ В случае с ь , Кш для мутантного энзима была в 4 раза выше, чем для дикого вида. Это объясняется повышением К-ц ( ^ в 6 раз). И напротив, :<2 уменьшается в 1,5 раза, что привело к появлению точки пересечения .двух графиков. Таким образом, гро В 409 мутация влияет ка процесс комплексообразо-вания с в промотором, сто лс'зволяет предположить, что структуры комплекса, образованного на о или пути его формирования отличаются от подобного на А1, однако данные кинетики не могут служить, прямым-доказательством этому предположению.

иами были изучены температуро-яндуцированные конформацион-ные изменения -меченного з-пзпма для характеристики образования "комплекса на Я и Е . Установлено, что величина Р ФЖ!А-РКК-полпморазн постепенно уменьшается с увеличением температуры от 7 до 40°С. Примерно при 40°С кривая зависимости тем-

Г,.

А

1,6

Б

200

200

.к

4

в 12 16

20

40

60

Рис. 3. ^-графики Л1 (А) и в (В) промоторов запаздывания, наблюдаемые для синтеза олигонуктеотидов, вычерчиваются против взаимной РНК-полимеразы V/ 12 (•) или гро В 409 (х) концентрации

пературы от Р делает изгиб, Аналогичная заьис;ллосхь Р наоподалась при отсутствии Нере8-буфера в реакционной с:>ъзси. Снюхыше Р при тешоратуре вше 40°С сопровождалось увеличением интенсивности эг.шеоии и постепенным изменением спектра в сторону коротких волн. Можно предположить, что снижение Р в общем является результатом тепловой денатурации, ведущей к-увеличению-сегментарной подвижности флуорофора (lakovd.cz , 1986). Изменения в I и Л».™ ука-

шсХл.

зывают на то, что спектральные характеристики метки, ковалентно связанной с полимера?,ой, приближаются-к параметрам свободной метки в'буфере.

Показано, что с увеличением температуры от 5 до 13°С Р- повышается в противоположность снижению в случае свободного энзима. Следовательно, образование комплекса изменяет свойства локального окружения метки. При 13-16°С наблюдается волнообразное изменение значения Р, сопровождающееся изменением в наклоне Р и I кривых и некоторым сдвигом коротковолнового спектра. Спектральные изменения указывают на наличие температуро-индуцированных конформа-цяонных изменений РНК-полимеразы. Поэтому метка выявляет по крайней мере одну температуро-зависимую стадию в неспецифическом взаимодействии фермента с ДНК. Возможно, эта стадия представляет процесс скольжения РНК-полимеразы вдоль матрицы.

Таблица 2

Кинетические параметры комплексообразованш дикой и мутантной РЯК-полимеразы с AI и D промоторами из Т7/АВ III ДИС

.coli таммы !Про-!мото-Рры -j % CM"1) i к2 (s-Ъ A on iü-Vb ! V ! (пЫ/пМ (ÄiLi 1

12 AI D 1,6+0,4*10® 2,3+0,4-I07 8,0+0,8'IG-3 16,8+0,1-I0~3 1,3.106 0,4-I06 1,83+0,1 0,67+0,04

>°В 409 AI D 1,03+0,4*I08 1,45+0,4*10^ 11,4+1,0-ПГ3 9,9+1,0-Ю-3 I,I8*I06 I.4-I06 1,9+0,14 0,9+0,06

Температурная зависимость Р для \^лиг-?КК-поли\.ера:ш в ком-

ооозначается как закрытый

о г

таксе с А1, образованный прл 4-12°С,

омплекс йр , тогда как комплекс, образованный при 12-20иС, ал Назван промежуточным, ¡1Р1. Комплекс, образованный при 12-13°С, ассматривается хак неснецифлческнй, промоторный кошлекс, педовательно, температура плавления ¿Ли при использованных ус-овиях монет оцениваться из температурной кривой константы ско-эсти видимой\.пзомеризации ^• 'Зта зависимость показывает резкое величение Кр при температуре дкле 25°С, отражающее изменение омпдекса во время лекального плавления и образования ДР0.

Изменение энзима при 20сС, предшествующее образованию откры-ого комллекса, может быть отнесено к гипотетическому интерме-лату, НР±. При 32,0+0,6°С Р становится фактически независимым г температуры. Таким образом, конформационный анализ выявляет эд темлературо-индуцированнш; изменений РНК-пслимеразы, скомпенсированной с А1.

Предполагая, что температуро-ипдуцированные конформацион-ле изменения отражают динамику его структурной реорганизации, элученные нами результаты иссчедований совместно с другими лтературными данными подчиняются одной из следующих ккнетичес-,1Х моделей:

4-12°С 12-20°С 20-25°С 25-30°С иле 33°С

Н + Р + ДШГ-^яГ н с!;0ль::се1ше

I

1шнк,-, = ¡иш

с

. где н1)нк.„„ и мяк являются соответственно неспециГ.ическим и "за-

14 о с -

крышьУ комплексами, образованным. со случайной ДОС аналогично

образованию н?.^ « нр ; НРрЧ- финальный продуктивный комплекс образованный при физиологических■температурах.

■ Эта модель подразумевает, что К? :.:оист бкть сфорьшрован как через прямую дисооцлащю беркзих-проыотор, сопровождаемую темпе-ратуро-зависнмы» изменением, так л через скольжение после образования .

4-1,2 °С 12-20°С 20-25°С ¿5-30°С выше 33 °С

нг1;1. _ лр --* да. ---* ---

дисс^"р с "- --^--- ^

н + р + да-: < ,1

....

1.5

В соответствии с этой моделью формирование да , возможно, только через Изменения, наблюдаемые при 12°С отражают ст-

руктурные изменения неспециг.-ического комплекса динц,^ , который содействует расположению фермента на промоторе. Различие между этим процессом и да^ ■ да переходом, который в соответстви с данными змаког et.nl. (1930) также имеет место при этой температуре, не может быть обнаружено нозим методом. В отличие от А1- физико-химические свойства и промотора практически не изучены.

Во всех экспериментах (9-16°С) доминировал процесс, ведущий к синению Р. Он начинался примерно при 13°С и сопровождался уменьшением температурной кривой I и падением Лгаах , т.е. он не отличался от изменения при неспецифическом взаимодействии. Этот процесс обеспечивается данными динамики изменений I во время комплексообразования.

При температурах 30°С и 32-33°С падение Р отражает перераспределение спектра между его параллельными и перпендикулярны™ компонентами противоположными изменения!«; для Л1. Это означает, что выше 33°С структура РНК-полимеразы различается для комплексов с двумя промоторами благодаря относительно короткой длине

ригманта 1, -пос;:.:,лора (341 н.п. сравните с 1298 н.п. для Л1), 1ТО «окот быть прачшшй для посоленной гибкости комплекса. Дхя троверки этой возис-шости нами была ассйвдозака тс&атсратурпая за-¡псимость спектральных параметров моченого фермента в комплексе : нативпой Т7дР Ш-ДЙ1С. Поскольку эта да содержит вместе с А1 I з три доиолпите.оьнкх минорных промотора (С, В и ? ), наи-ользим конфсрмациошшм изменениям подвергаются изолированные А1 ! П.

Дм исследования Фуикциопаль:::;!! значимости нами использована •та метка для кодпуикааза мутантного гро В 409 фермента, актив-ость которой на X) увеличивалась но сраьненгя с таковой для наивной РНК-полимеразы. ¿С1й гегаературная кривая для г^талтного нзима в свободно!.; состоянии из отличается от кривой для натяв-ой поликеразн, то при образоволи.ч комплекса с й ыутантнсй ермент подвергается тем же Изменениям, что и нативикй энзим, аким образом, аысашя аититиюсг'ь мутантного спзаь» на этом про-оторе коррелирует со способностью фермента поплакаться в этот ысокотемператуоный процесс на структурно:.: уровне.

Интересно откетать, что во всех экспериментах ннзкотемлера-уриое изменение, ведущее к узеллченап ? и I, было четкод-ьюаже-

0 в случае с мутантнкм (Те оме к том. Это коррелирует с увеличивайся- стабильностью нр , которую определяли дт мутантного эизи-а кинетически',; подходом. Такагл образом, анализы температуро-ин-уцированных язсенешШ РШС-пош.'.оразы в комплексе с изолированны-и А1 и 3 прсиотораки покэзали, что: I) Дажцый комплекс подое'р-ается ряду послелосательинх реорганизаций. Некоторые из них ¡содны в спектральных пар<1метрах метки (образование и, зоз-сгано.йр ) ; 2) Характер изменений Р и локальная структура ком-лексов, сформированных ылле 33°С, т.е. при <.нзио'югических тем-эратурах, различаются для А1 и э ; 3) Температуро-зависимое кон-эрцацаонное поведение комплекса г ерконт-проиотор зависит не

эль к о от структуры промотора, но также от структуры ШС-пояше-азы.

Эти,результаты совместно с данными кинетически (таблица 2) •Функциональных анализов предполагает, что между А1 и о имеют-

1 некоторые структурные отличия, которые определяют не только эличественные (изменения в К^ и к9 благодаря мутации), но также качественные характерные едцмгп механизма их взаимодействия с ц\-полпмеразсй.'

Сравнительный анализ структуры промоторов AI и D показал, что оба промотора обладают сходной нуклеотидной последователь- ' ностью-е -35 области.(рис. 4А). Они богаты AT вверх от -35 и имеют длину спейсера 17 к.п. Область -10 и' его расстояние от стартовой точки транскрипции различаются. Повторяющаяся последовательность ТАТТ^АдА , обнаруженная O'Neill (1989) для многих промоторов хорошо прослеживается в AI (пунктирные линии) и только в нескольких областях D . к для D плохо коррелирует гомологичным рядам, предложенным Mullican et.al. (1984). Эти два факта указывают на то, что функциональная активность D , отличающаяся от AI, определяется такими структурными чертами, которые не могут быть обнаружены простыми анализами промоторов.

Более детальные анализы D выявили две серии точного повторения CTTl'AGG . Первая из них встречается на 7 к.п. вше от -35 области, вторая -.на 8 н.п. ниже. Они имеют только две н.п., частично совпадающие в области -10. Во всех случаях кроме одного, период повторения составляет 13 н.п. Они не гомологичны к

А А Т

TATT^TjjAjjA и не коррелируют в локализации с ним.

Области содержащие прямые промоторы, имеют способность принимать, очень сложные, возможно, не четкие конфигурации (Ju-gil J-I99I). Они часто проявляют чувствительность к ы нукчеа-зе, что предполагает присутствие односкрученной области и позволяет принять возможность' образования скользящих структур, похожих на то, что представлено на рис. 4В. Когда такая структура формируется поблизости от сгартовой точки транскрипции, она может быть ответственна за низкую температуру плавления D . Разрушение и образование таких структур могут быть причиной высокотемпературного изменения, обнаруженного доя D промотора.

в промотор содержит чередующиеся пуриновые и пиримидино--вые основания. В общем, вычисленная с использованием угловых параметров (Kabsch et.nl., 1982) для повторяющихся фрагментов 13 н.п., составляет примерно 397°, что меньше, -чем ожидалось для случайной последовательности подобной длины ( ~ 407°). Поэтому можно предположить, что спиральная структура этого промотора отличается от таковой для Каждая из упомянутых черт или что-либо другое могут быть существенными для узнавания промотора РНК-полимеразы. Будучи зависимыми от окружающих факторов, они могут быть существенны для регуляции синтеза РНК. Группа таких повторяющихся структур может также распознаваться некоторыми еще неизвестными регуляторными белками.

гкяотга и:

-110 -100 -90 -во -70

5 НШ'1 МАТШТАСиСТСАтТиТСАСАСАСиСТТиАСАСАСПАЛААСАТТА

-«I -50 -«I -30 -Я) -щ .1

.......... "ГИГ"

♦ 10 «20 «30 «40 «50 «60

С01С1«К»С»0ЮССйТ»СССПССС«ГО»ЫССССаГ1С«СССС»Ти(Г1»СЙ

ркяюгек о:

-110 -100 -90 -ВО 70

5 ¿гесстстАсстстсстсгггАтстАо1 и ущАссгстсстегтглсстчтсстст

-60 -50 -4о -зо -го -ю «I тТт7ШСТРШС*ТАССССт*СТАС*ТСССТСТТГ*ССПЛАСССТП*ССТСТ

♦10 ♦го «эо «40 «50 «бо тсосг11Аиатес«сОТ1сслитс«<лтг«сс»гё»т»ст»«»САСТстис4

^„^-ДО «I

ТТСАСТАСАТСССТСТГТЛССТСГТШТГТАССАТССАССТТАССАСС ААСТСАТСТАСССАСАААТиСАСААССиАААТССТАССГССААТССТСО

- с 'с 1Т

/У

-«Ли-о'

ТТСАСТАСАТСССТСТТТАССТСТАСССТГТАССАТССАССТТАССАСС иСТСАТСТАСССАСШЗССАСАТССЫЛАТСС АССТССАЛТССТСС

-,0 с» тс А СС

Рис. 4. Нуклеотидная последовательность А1 и о промоторов (А) и 2 возможные пути образования одооспи-рального региона в -10 промотора (В). Повторения 7 н.п. в структуре и отмечены черным шрифтом, ■ более длительные повторения (13 и 21 н.п.) указаны пунктирной и сплошной линиями

Таким образом, при использовании РНК-полимеразы с изменен-эй*селективностью к промотору, среди многочисленных промоторов ¿л выбран р промотор из Т7 ДНК с увеличенным сродством к му-антному шерменту. Сравнительные конформационные анализы РНК-по-шеразы в комплексе сои хорошо изученным А1 показали, что эыше 33°С ферментные структуры, образованные путем последова-зльных конформадионных изменений на этих двух промоторах, раз-1чны. Это означает, что молекулярные механизмы продуктивного эмплексообразования не идентичны (кроме некоторых общих черт) 1Я всех промоторов. Полученные данные указывают на различие в грунтуре центра узнавания РНК-полимеразы, функционирующей на

разных промоторах. 24

•Это различив можно объяснить, как существованием несколь-• ких, центров узнавания в молекуле фермента, специфичных для различных типов промоторов, так и способностью этого центра находится в различных конформационных состояниях. Промотор-связы-вающий центр энзима, также может быть организован вблокоподоб-ном стиле. В соответствии с этой концепцией функционирование одного или другого альтернативного блока на любой стадии взаимодействия обуславливается структурой комплекса, образованного в этой стадии.

В заключение следует отметить, что существование различных классов промоторов, которые взаимодействуют с разными структурными изомерами РНК-полимеразы и с разными активными центрами фермента, имеют большое физиологическое значение. Целый ряд физиологических Факторов, таких,, как температура и солевой**' состав, может прямо или опосредованно изменять конформационное состояние всех или части молекул РНК-полимеразы, изменяя спе- ■ цифичность фермента к промоторам разных классов. В ключевых • оперонах, высокий уровень экспрессии которых необходим при всех физиологических условиях, могут быть использованы промоторы Разиных классов, сгруппированных в тандемы или перекрывающиеся. Эта организация генетического аппарата способна обеспечить . клетке быструю, обратимую и экономичную адаптацию к изменяющимся? условиям среды, сохранив сбалансированную экспресоию генов.

ВЫВОДЫ

1. Изменение селективных свойств структурной модификации с помощью мутации рифампицину ст ойчивости РНК-полимеразы проявляется на стадии инициации транскрипции при взаимодействии с промо-"1 торными участками ДНК, а также, возможно, при взаимодействии

с инициирующими субстратами синтеза РНК. ^

2. Точечное мутационное гро В 409 изменение структуры -субъединицы РНК-полимеразы приводит к дифференцированному

изменению во взаимодействии фермента с двумя промоторами и указывает на различив структурно-конформационного состояния спин-меченой РНК-полимеразы в комплексе с разными промоторами Т7-ДНК.. При этом, константы диссоциации атр и gtp из инициирующего центра FHK-полимеразы В.coli 'оказались практически одинаковы. Следовательно, мутация гро В 409, по-видимомуне изменила структуру центра связывания,, инициирующих АТР и сутр у РНК-

3. Мутантная РНК-полимераза с большей скоростью, чем фер-нт дикого штамма, синтезирует олигонуклеотиды с промотора

0 III ДНК и практически с такой же скоростью как исходный фер-нт с промотора AI, что является прямым доказательством измене-я специфичности гро В 409-РНК-полимеразы к промотору D .

4. С увеличением температуры от 5 до I3°C Р увеличивается противоположность уменьшению в случае свободного энзима. Обра-вание комплекса с промотором AI в этих условиях изменяет свой-ва локального окружения метки. Изменение энзима при 20°С, пред-ствующее образованию открытого комплекса с увеличением локаль-й жесткости маркомолекулы, по всей вероятности, мажет быть от-сено к гипотетическому интермодиату к?... При 32°С Р становит-

: фактически независимым от температуры.

5; Температурная зависимость Р для РШх-полимеразы в комплекс D показала две области конформационпых изменений. Спект-льные изменения в пределах от 9 до 16°С характеризовались сни-нием Р, 'начиная с 13°С, уменьшением температурной кривой I и „д.. . При теьлературах выше 30°С Р уменьшается, происходит пе-распределение спектра между его параллельными и пёрпендику-рными компонентами, противоположныш изменениям промотора AI.

. 6. При различных температурах для обоих промоторов отме-ется сходство в спектральных параметрах метки (образование №. ' возможно, ш?0). Характер изменений Р и'локальная структура мплексов, сформированных при физиологических условиях выше 33°С, зличаются для AI и э . Следовательно, температуро-зависимое нформационное поведение комплекса фермент-промотор зависит не лько от структуры промотора, но также и от структуры РПК-поля-разы.

7. Кинетические и функциональные анализы свидетельствуют о м, что между промоторами AI и I) имеются некоторые структуре отличия, определяющие но только количественные (изменения Kg и Kg благодаря мутации), но также и качественные характере сдвиги механизма их взаимодействия с РНК-полимеразой.

СПИСОК ОДУБДИКОЗАШЖ РАБОТ

I. Gzoline О.II., Ktxizolova S.U., Utechev Т.A. Ccnforuiitio-

1 rnd kinetic pjis-lyois of Tuitlatino complexes oi K.coli йЫа Lymerc.se with ,T7 DKA promoter^ // Molecular and cellular regu-tion o" enzyme activity. Martin-Zuther-Universitat Ilall-'.Vitten-rg..- Jerir.an Democratic Republic. - 1935. - P. 49.

2. Камзолова С.Г., Озолинь О.Н., Утешев Т.А. Использование РНК-полимеразных мутантов для изучения регуляции транскрипции у Escherichia coli // У1 Всес. симп. "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 3-6 февраля 1987. Тез.докл. - С.16<

3.. Утешев Т.Д., Озолинь О.Н., Камз олова С.Г. Дифференцированное изменение селективных свойств РКК-полимеразы E.coli к промоторам ДНК фага Т7 // П Мекдунар. школа-конференция молодых ученых соц.стран "Молекулярные основы биотехнологии". - Пущино, 9-15 ноября 1987. - С. 29..

4. Озолинь 0.Н,, Утешев Т.А., Камзолова С.Г. РПК-полимера-за рифашпицинустойчивого мутанта Escherichia coli имеет измен« ную селёктивность к промоторам ДНК фага Т7 // Молекулярная биология. - 19ЬЬ. -Т. 22. - В. 2. - С. 384-392.

5. Uteshev Т.А., Oaoline C.II., Kamaolovu'S.G. Study of the productive complex formation of E.coli ЯНА Polymerase v.lth individual promoters of Pha^e T7 Di'A by the- method of fluorescent label // 3 International school conference of Xourig Scientists

•of Socialist countries. Pi'ieros Jerman Uenocritic Republic. November 27th to december 1st 1989. - P. 47.

■6. Камз олова С.Г., Озолинь О.Н., Утешев Т.А. Влияние мутации в -суоъединшде Plili-полимеразы Escherichia coli на се- ■ лектишость комплексообразования с промоторами Т7-ДЙ\. // Доклады АН СССР. - 19Ь9. - Т. 309. - j-r 2. - С. 437-491.

7. Озолинь О.Н., Утешев Т.А., Ким iü.A., деев A.A., Камзо-лова С.Г. Специфическая модификация в -субъединице PinC-поли-меразы Escherichia coli монортутным производным флуоресцеин-меркурацетата // Молекулярная биология. - 1990. - Т. 24. - В.4. С.' 1057-1066.

8. Камзрлова С.Г., Озолинь О.и., Утешев Т.А. Взаимодействие РШ-полимеразы E.coli с разными промоторами Т7-ЖК // Тез.докл. 10 шендунар.биоф.конгресса.- - нанада, июль-август 1990. -С. 315.

9. Камзолова С.Г., Озолинь 0.11., Утешев Т.А. Специфическая модификация РНК-полимеразы E.coli монортутным производным флуоресцеинмеркурацетата // XX конф. Ш>0. - Венгрия, 1991. -С. 356.

10. Ozoline O.K., Uteshev Т.А., Kumzolova S.G. Specific modification of E.coli Ki.'A polymerase with monorcercury aeriva-tive of fluorescein-acetate // Bioch. et biophys. Acta. - 1991. V. 1076. - P. 3B7-394-

II. Ozolino Q.ií., Utesiiov 'i'.A.., Maeulia I.S., Kii.;az.olova S.d. Interaction of bacterial КЬ!Д polyweru.ee with tv.'o different promoters ,of pha^e T7 Uli A. Conformational enulycis // Biocii. et biophys. Acta. - 1993. - V. 1172. - P. 111-261.

GTEllEB TAJEAT АСЦиРШ ESCHERICHIA COLI РШ{-ПЩМи*РАЗДАР,ЦЬЩ Ц\РЫ^1,ЦЬЩ-

ШЙОРЫАЦИЯЛЬШ; ттш ЭРТУРЛ прсшгсрлардйеы

ЬЕРТТЕУ

E.coli РНК-полимераздарыньщ комплекс« цурылуы '// 12 жене ри-фампицинмц турацты мутанты ГР° В 409 Al жене D промоторлары-мен 6ipre ДНК фагасын Ï7 D III PhK абортивтхк инициация синтезi эд1схн1ц кеметчмен зерттелд1. Мутация PhK-полимераэаныц каб1лет!н oarepTTi, ортурл! промоторлардагы синтез инициациясында earepTTi. Осынын, нэтинес1н,пе D промоторын пайдалану THÎMflifliri артты, ал AI промоторы e3repicci3 цалды. йхЫА-ныц ферментт1к флуоресцентен белгхс1мен эквимолярлык аракдтшасьгнда -субьединица РНК-полм-мераэасындагы ордаласкдн SH-тобьшда кэб!несе ыкпалын тиг1зед1. Температуралык байланысты конформацияльщ фермент-промотор комплек ci тек промоторлардьщ курылымына гана емес, сонымен цатар РНН-по-лимераэдардьщ курыльпиынада байланысты.

UTESHEV TALGAT ASCAROVICH

ESCHERICHIA COLI RNA-POLYMERASE CONFORMATIONAL STATE STUDY ON DIFFERENT PROMOTERS

The complex formation of RNA-polymerase, isolated fj?om E.col W 12 and rifampicin-resiatant mutant rpo В 409» and A1 and D promoters of phage T7 D 111 DNA was studied by using reaction of abortive initiation RNA synthesis. It was shown that the mutation altered RNA polymerase ability to initiate sinthesis on the promoters so, that efficiency of using D promoter increased and of using A1 didn't changed. At the equimolar fluorescein mercuric acetate (FMMA) and enzyme ratio the fluorescence label mainly interacts v/ith one SH-group of RNA polymerase -subunit. The temperature dependent conformational behaviour of enzyme-promoter cç>mplex depend not only on promoter structure, but on RNA polymerase structure.