Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Подавление функций биополимеров вируса гриппа и размножения вируса производными олигонуклеотидов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Подавление функций биополимеров вируса гриппа и размножения вируса производными олигонуклеотидов"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ •

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 547.963.3 + 616 988.25

Юрченко Людмила Валентиновна

ПОДАВЛЕНИЕ ФУНКЦИЙ БИОПОЛИМЕРОВ ВИРУСА ГРИППА И РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСА ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

03.00.04 — Биохимия

/ "

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой .степени кандидата биологических наук

11»1и)сибирск,' 1991

Работа выполнена в Новосибирском институте Оиоорганической химии СО АН СССР

Научный руководитель - чл.-корр. АН СССР В.В.Власов

Официальные оппоненты: д.х.н. С.Н.Загребелышй .к.х.н. В.А.Каргаюв

Ведущая организация: Всесоюзный институт молекулярной биологии"

Защита состоится.'«У декабря 1991г. в & часов на заседании Специализированного совета К 003.62.01 ь Новосибирском институте бксорганич^ской химик со АН СССР но адресу: 630090, г.Новосибирск, яр. Лаврентьева, 8.

С диссертацией махно ознакомиться ъ библиотеке Новосибирского института Оиоорганической химик.

Автореферат разослан НРь&^^ЪЬ "Э21 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических. наук. о.с.Федорова

Актуальность проблемы. Диссертация посвящена решению вопро-сЪв, связанных с созданием противовирусных соединений: афинных ингибиторов функций вирусных белков и производных олигонуклеотидов, образующих комплементарные комплексы с вирусными нуклеиновыми кислотами и направленно воздействующих на генетический материал вируса. Работы по конструированию производных олигонуклеотидов в настоящее время развернулись в большом числе лабораторий и фирм в разных странах. Считается, что на их основе возможно создание эффективных противовирусных препаратов.

Цель работы. Целью работы было исследование влияние различных модифицированных производных олигонуклеотидов на размножение вируса гриппа и функции мРНК этого вируса с целью выявления оптимальных для воздействия структур в вирус-специфических РНК и с целью поиска модификаций, повышающих эффективность олигонуклеотидов как ингибиторов функций вирусных белков и РНК.

Научная новизна работы. Впервые проведено исследование инги-бирования размножения вируса гриппа в эмбрионах и культуре клеток и синтеза белка и РНК в бесклеточных системах с помощью производных олигонуклеотидов. Проведен сравнительный анализ ингибирующего действий олигонуклеотидов и их производных, несущих на 5'- и (или) З'-концевом фосфате остатки ароматического 2-хлорэтиламина, холестерина, порфирина в различных системах. Показано, что эффективность ингибирования трансляции зависит от положения антисмыслового олигонуклеотида в структуре мРНК. Показано, что введение остатка холестерина в олигонуклеотид резко повышает их захват клетками, в то время, как обработка клеток диметилсульфоксидом, ДЕАЕ-декстраном и полилизином, применяемые для улучшения трансфекции клеток нуклеиновыми кислотами, не стимулирует связывание производных олигонуклеотидов с клетками.

Практическая ценность работы. Настоящая работа была выложена в рамках программы по созданию производных олигонуклеотидов для подавления вируса гриппа, который относится к числу наиболее важных практически; эффективных методов терапии заболевания гриппом не имеется, вакцинация с целью предотвращения заболевания не эффективна вследствие высокой изменчивости антигенных характеристик вируса. Вирус гриппа является одним из наиболее изученных, имеется большой выбор Штаммов, отличающихся по патогенности, с которыми могут быть проведены эксперименты в любых вариантах модельных сис-

тем.

Публикация и апробация работы. Результаты диссертации опубликованы в 10 статьях в центральных журналах. Материалы диссертационной работы докладывались на Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы их практического использования", Москва, 1991 и Международном совещании "Биосинтез белка", Бущино, 1991.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, он включает 16 рисунков, 13 таблиц, список цитируемой литературы из 114 наименований. Работа состоит из 3-х глав, введения и выводов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Исследование ингибирущего действия производных олигонуклеотидов на функции ферментов, ответственных за транскрипцию вируса гриппа"!

Одной из задач данного исследования был поиск олигонуклеотидов и их производных, проявляющих сродство к активным центрам белков репликативного комплекса вируса гриппа. Для исключения ингиби-рования репликации и транскрипции в результате комплементарных взаимодействий олигонуклеотидов с молекулами РНК генома вируса, был взят случайный набор олигонуклеотидов, не содержащих протяженных последовательностей, комплементарных РНК вируса. Олигонуклеотида длиной от 3 до 16 звеньев содержали холестерин (Chs), дейте-ропорфирин (DDP), гемин (Нет), этидий (Et), нафтохинон (Qn), гис-тидин (His), эстрон (Es), присоединенные к 5'- и (или) 3'-концевым фосфатам. Оба фермента полимеразного комплекса вируса гриппа (кэп-связывапций белок и РНК-полимераза) задействованы в процессе репликации только в зараженной клетке. В бесклеточной системе синтеза РНК, где в качестве затравки может Сыть использован динуклеотид АрС, увеличение длины праймера происходит только за счет функционирования РНК-полимеразы. Сравнение влияния производных олигонуклеотидов на уровень репликации в системах in vitro и в клетках может позволить выяснить, к какому из белков репликативного комплекса проявляет сродство тот или иной модифицированный олигонукле-отид.

В таблице I приведены данные ингибирувдего действия производных олигонуклеотидов в Оесклеточной системе. Наиболее эффективными ингибиторами РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гриппа являются олигонуклеотида, содержащие дейтеропорфирин, причем уровень подавления (58-73%) практически не зависит от длины и структуры используемого олигонуклеотида, а также от того, к какому из концов (З'или 5') присоединена молекула порфирина и имеет ли она ион железа. Менее эффективными ингибиторами полимерагы являются производные, несущие холестериновые группы (19-41%).

Производные Уменьшение начальной скорости

олигонуклеотидов реакции по^чмеризации, %

без добавления 0

олигонуклеотида

d(Tp)1Q-Chs 19

d (ССАААСАр)-Chs 41

Hls-d(pTTCCCATT) 57

DBP-d(pN),6* 58

d(Tp)l0-Hem 69

DDP (Fe )-d(pTT'CCCATT) 72

d (pTG ACCCT Cp)-DDF(Fe3+) 73

Табл.1. Ингибирование реакции полимеризации, катализируемой РНК-полимеразой вируса гриппа, в присутствии производных олигонуклео-тидов (конц. ЮмкМ). *d(pN) 1 g-d(ТСАСССТСТТСССАТТ).

Данные о влиянии исследуемых производных олигонуклеотидов на синтез вирусных белков в зараженных клетках ФЭК приведены в та<\л. 2. Наиболее эффективными ингибиторами синтеза белков в этой системе оказались холестериновые производные олигонуклеотидов. Порфирк-новые производные проявляют достаточно высокую ингибиругацую активность в обеих системах. На основании этих данных можно предположить, что ингибирование синтеза РНК в системе In vitro и синтеза белков в инфицированных клетках происходит в результате способности порфириновых производных к взаимодействию с РНК-полимеразой, в то время как холестериновые производные взаимодействуют не только с РНК-полимеразой, но имеют сродство к кэп-связывающему белку.

" Олигонуклеотиды и их производные Подавление синтеза вирусных белков, %

ЮмкМ ImkM O.IMKM

сЦССАААСА) d(DT)p dCpT)" 23 0 0 40 10 0 30 5 0

этидийОромид DDP(Fe) холестерин нафтохинон 60 32 Q 30 10 0 21 0 0 23 0 0

d(TGACCCTCpJ-DDP(Fe3+) DDP-dipTTCCCATT) (pT)10-Hem DDP-d{pTGACCCTCTTTCCCATT) DDP(Fe ) -d (pTGACCCTCTTTCCCATT) 60 39 17 59 50 45 24 15 10 63 50 12 37 12 0

d(pT)f 0-Chs d(CCAAACAp)-Chs HtS-(pTg) ES- (р'Г )g 85 38 25 81 20 8 46 31 29 57 1 б 0

(pT)8p-Qn 61 Ю 0

Et^-d(pT)8p-Et1 Eti:-d(pT)4p-Et2 ü(Tp)4-Et El1 -d(pT)3-Et2 d(pT)3-Et" Et-d(pT)3 54 43 39 53 ! 0 'J 48 0 0 48 0 0 35 0 0 23 0 0

Табл.2. Подавление синтеза вирусных белков в инфицированных клетках ФЭК с помощью производных слигонукл-ютидов.

Подавление трансляции мРНН вируса гриш:а In vitro антисмысловыми олигонукл9отйда^й~¥х~п{ю1й1юдаым1. ~

Мы исследовали влияние комплементарна/. одигзнуклеотидов на трансляцию мРНК белков VI и МР вируса гриппа в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика ь зависимости ст участки связывания олигонуклеотидов с матрицей, а также исследовали ингиОиругацее действие производных антисмыслових олигонуклеэтидов, несущих на

5'-концевом фосфате остатки ароматического 2-хлорэтиламина (RC1), холестерина и порфирина.

Олигонуклеотида Подавление синтеза Оелка MI , %

и местоположение комплементарных им участков в структуре мРНК Концентрация олигонуклеотида 0,63 2 10 25 50 , мкМ 100

без добавления олигонуклеотида 0 0 0 0 0 0

М1 (I-I6) 10 24 30 45 47

М2 (16-31) 5 10 12 16 34 46

МЗ (31-44) 0 5 12 20 29 55

М1+М2 10 10 14 57 61

М2+МЗ 5 4 50 92 100

М1+МЗ 57

MI+М2+МЗ 34 57 96 100

М4 (49-68) 0 0 0

Мб (101-118) 29 39

МЭ (155-172) 40 41

М10 (175-193) 17

М8+М9 40

М7+М8+М9 37

М6+М7+М8+М9 33

М5+М6+М7+М8+М9 39

ТаЗл.З. Подавление синтеза Оелка М1 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов.

В табл.3 представлены данные по ингибированию трансляции мРШ: белка М1 олиглнуклеотидамк, комплементарными различным участь ач 5 структуре мРКК. Любой из олигонуклеотидов: М1, М2, МЗ, комплемен-таршх 5*-концевой области мРНН, в отдельности не приводит к полному подавлению трансляции мРНК, снижая синтез белка на 50" даже при концентрации 100 мкМ. Очевидно, эффективное нарушение взаимодействия факторов инициации и рисосошшх частиц с мРНК достигается при формировании протяженного дуплекса и нарушении биологически активной Еторичной структуры молекулы. Сочетания олигонуклеотидов М1+М2 и М1+МЗ при концентрации каждого олигонуклеотида 50 мкМ ш-гибируют биосинтез белка М1 практически одинаково, снижая его уровень на 60%, в то время как при сочетании М2+МЗ в аналогичных ус-

ловиях полностью подавляется синтез белка М1. Олигонуклеотиды М1+-М2+МЗ, взятые вместе, подавляют полностью синтез белка уже в концентрации 10 мкМ.

Низкая эффективность олигонуклеотидов, комплементарных кодирующей области мРНК (олигонуклеотиды М4-М10), очевидно, объясняется структурированностью мРНК и незначительным содержанием рибокук-леазы Н, инактивирующейся в процессе замораживания-оттаивания ре-тикулоиитного лизагз.

№ иРНК: _

5' АССААААС-СЛС-ССиАУАиАиААиСАСиСАСиСАСИСАСАиССАиАиСАиСОС

111 --из

N2 -«-

N3

со Z

# , ? г Рис.1. Подавление

g g S s fe н биосинтеза белков ь л ¡(2 П n g Е- g Э f вируса гриппа in

vitro с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, комплементарных

N? вирусной мРНК

_ бежа NP.

Концентрация олигонуклеотидов 65 мкМ.

N3 *-олигонукле отид N3 с заменой А на G в 43 положении.

Синергический характер действия олигонуклеотидов. имеющих смежные сайты связывания на мРНК продемонстрирован и на примере HP белка (рис. I).: олигонуклеотиды NI+N2, N2+N3 и N3+N4 полностью подавляют синтез NP белка в концентрации 65 мкМ, в то время как каждый из этих очигонуклеотидов ингибирует синтез на 20-50%. Таким образом, проведенные исследования показали, что эффективно подавляют трансляцию мРНК вируса гриппа In vitro олигонуклеотиды, комплементарные 5'-концевой области мРНК.

В системе трансляции из ретикулоцииов кролика было исследовано действие производных олигонуклеотида, комплементарного мРНК ЫР белка вируса гриппа б положении 1-16. В табл.4 приведены данные по ингибированию синтеза вирусных белков КР и М1 злкилирувдими, холестериновыми и порфириновыми производными олигонуклвотидов. В качестве контроля на комплементарность были использованы производные олигонуклеотида. комплементарного РНК Еирусз клещевого энцефалита. Как видно из таблицы, алкилирующее производное антисмыслового олигонуклеотида имеет сильный специфический ингибирувдий эффект на синтез вирусных белков: уже при концентрации 10 мкМ синтез белка ингибируется на 6ь%, а при концентрации 50-75 мкМ практически полностью блокируется синтез белка ГО, в то время как синтез М1 белка ингибируется на 40-50Ж. Производное некомплементарного олигонуклеотида снижало синтез ИР белка лшяь на ¿-19% при концентрации 25-50 мкМ.

Концетрация ингибитора мкМ

Ингибитор 10 25 50 i 1 75

Ингибирование

синтеза белков, %

NP MI NP 41 NF MI J NP MI

d(pATACCCTCCTTTTGCr) * 8 о - 21 16- 36 281 78 51

Giii-.HpATACGC':'GCTTKGGT) * 66 18 тг до 78 40 53

GhP-dipATACCCTGCTTTTGLT') * 36 56 32 73 44 j

DDP-dt(pATAGCOTOOTTTiGCT) * 7 т 9 ! 1 8 6 |

GiR-<i(pTCACGCTCTTCCCATC) ** 4 19 *

Chs-dKpTCACCCTCI'TCGOATC 13 О ' !

DDP-d(pTCACCOTCTTGCOArC ** 0 с; 10 3 I 13 101 .......I

Табл.4. Мнгибтдрование синтеза белков вируса гриппа в системе трансляции мРКК in vitro с помощью производных олигонуклеотидос. * олигонуклеотид, комплементарный мРНК NP бежа вируса гриппа в в положении I-I6 и его алкилирующее, холестериновое и порфири-ноьое произ водное,

** произЕодаше олигонуклеотида, комплементарного РНК вируса энцефалита.

Холестериновое производное антисмыслового олигонуклеотида

также является достаточно сильным ингибитором (синтез KP белка снижается на 38-73% при концентрации 10-50 мкМ), хотя его специфичность в отношении NP белка немного меньше, чем алкшшрующего производного (синтез MI белка снижается на 33-44%). При этом холестериновое производное некомплементарного олигонуклеотида является слабым ингибитором. Одним из возможных объяснений полученных данных может быть то, что холестериновая группа, связанная с комплементарным олигонуклеотидом, который образует комплекс с мРНК вблизи инициации трансляции, взаимодействует с рибосомой или каким-нибудь фактором инициации и препятствует нормальному функционированию комплекса инициации трансляции. Холестериновое производное некомплементарного олигонуклеотида, находясь в несвязанном с мРНК состоянии, по-видимому, не обладает такой способностью.

Порфириновые производные комплементарного и некомплементарного олигонуклеотида практически не подавляют синтез вирусных белков.

Взаимодействие производных олигонуклеотидов с клетками эукариот.

К настоящему времени получены многочисленные данные о возможности блокирования функций нуклеиновых кислот в клетках с помощью комплементарных и синтетических олигонуклеотидов Однако, низкий уровень проникновения в клетки олигонуклеотидов, являющихся нолиа-нионами, значительно снижает эффективность юс действия на клеточные нуклеиновые кислоты. Одигодезоксирибонуклеотиды и их производные способны проникать в эукариотические клетки по механизму адсорбционного и (или) жидкостного эндоцитоза, необходимой стадией которого является связывание олигонуклеотидов с клеточной мембраной. Мы исследовали возможность улучшения проникновения олигонуклеотидов в клетки с помощью различных добавок, повышающих эффективность трансфекции эукариотических клеток, а также, используя химические группировки, присоединяемые к олигонуклеотидам, которые могут обеспечить повышенное сродство производных олигонуклеотидов к мембране клеток, стабилизировать комплексы олигонуклеотидов с нуклеиновыми кислотами и защищать олигонуклеотида от действия ферментов.

а>м1тг,

I пиале и м Ю'/ицтт

Рис.2. Зависимость уровня связывания олигонуклеотидных производных от их концентрации в среде при 37°С в течение 2ч: 1-реагент I, 2- II, З-Ш.

Были использованы алкилируадие производные дезокситимидила-тов, несущие на б'-конце остатки 4-(Я-2-хлорэтил-Ы-метил)ами-нобензиламинв (I) и на 3'-конце гидрофобный остаток холестерина (II) или полиароматический остаток Ы-(2-оксиэтил)феназина (III) для улучшения их взаимодействия с клетками асцитной карциномы КреОс-2 и мышиными фибробластами Ь-929. На рис.2 изображена зависимость внутриклеточной концентрации олигонуклеотидных производных от концентрации их в среде по достижении кинетического плато, т.е. через 2 ч. после добавления реагента. Наличие холестеринового остатка на 3"-конце омагонуклеотида приводит к значительному увеличению уровня его связывания с клетками, который для низких концентраций (0,01-0,5 мкМ) почти на 2 порядка превышает этот уровень для соединения I. В то же время остаток феназиния мало влияет на уровень поглощения производного клетками. Эти производные способны проникать внутрь клетки и достигать клеточного ядра. Из ядер была выделена ДНК и определена степень ее модификации алкилирующими производили:

Реагент (конц. в среде 0,5 мкМ) I II III

Содержание в ядрах (лмоль/'5'106кл.) 0,06 7,7 0,11

Степень модификации (моль реагента к 0,79 54 6,5 на 1моль нукл.'Ю )

Видно, что присоединение холестеринового остатка к 3'-концу алкилирущего производного олигонуклеотида повышает уровень модификации ДНК почти на 2 порядка, а феназиниевого - почти на порядок.

5 Ю

Конщнтрпци! ! сргде,

% связывания ClRd(pT)j6 клетками

Тип обработки (от растворенного в среде)

■L-929 Кребс-2

1,5 Ч Г,5 ч 1,5 ч 3 ч

Контроль (р-р Хэнксз) 1,2 1,2 1,4 2,1

2% диметилсульфоксид 1,2 1,3 1,5 2.1

ДЕАЕ-декстран, 20 мкг/мл IЛ 2,1 3,4 6,5

Полилизин, 20 мкг/мл Т Г/ , ' 2,1 2,1 2 I

CaCI,, 12,5 мМ 2 ? - -

СаС1 , 125 m 12,0 10.7 15,0 22,0

Табл.5. Связывание олигокуклеотидного производного СХШ'рТ) с клетками в присутствии добавок, улучающих трансфекцию (концентрация производного в среде I мкМ;

В табл.5 приведены результаты определения уровня связывания Ь-клетками и клетками асцитной карцинома Кр-г с-2 слигонуклеотидно-го производного С1М(рТ)те в присутствии различных добавок, улучшающих трансфекцию эукарпотических клеток нуклеиновыми кислотами. Из таблицы видно, что диметилсульфоксид, ДЕАЕ-декстран и полилизин неэффективны или мало эффективны для пошшения связывания олигону-клеотидного производного. В более высоких концентрациях, чем указано б таблице, эти добавки били токсич-Г;.: и вызывали гибель клеток. Заметный эффект на связывание ачагонуклооткйш. производных клетками оказывал лишь хлористых кильций. ЧтоАы выяснить, действительно ли наблюдаемые аффекты ор.язнул с увеличением количества реагентов, проникающих в клетка, на; прог.оди электрофоре1: лизатоь клеток в двухступенчатом 5-:;0й ;1АА1', обработанных производными ^^Р-С^йсКрТ),, в ггриедгетвий 5: «лсутсгш •Суадгетзеююе количество радиоактивности ьюжмкло'л во фракда сиошпикеров и в том и е другом случае. Суммарная радиоактивность, связавшаяся с клетками, в присутствии хлоркст-ого кзлызм оказалась ь семь раз выше, чем без него, однако в первом случае (+СьС10) в области биополимеров содержалось около трети рздисактивности, а во втором ( СзС1с)- около двух третей. Следовательно, увеличение уровня моди-

фикации Сополимеров в результате обработки клеток хлористым кальцием можно оценить как трехкратное.

Ингибирование развития вируса гриппа производными антисмысловых "оМгсщклестйдов в культуре"клеток.

Вирионные РНК и мРКК^ присутсвующие в "зараженных" клетках, связаны с различными вирусными белками и, очевидно, в различной степени должны быть доступны для взаимодействия с олигонуклеотид-ными производными. В связи с этим в настоящее время не представляется возможным обоснованно решить, следует ли использовать олиго-нуклеотидные реагенты, комплементарные мРНК вируса или олигонукле-отидные реагенты, комплементарные его вирионной РНК.

Известно, что все вирионные РНК имеют идентичные последовательности на Б'- и на З'-концах. Присутствие этих уникальных последовательностей в РНК различных штаммов вируса гриппа предполагает их важную роль в процессе развития вируса, и можно было ожидать, что повреждение вирусных. РНК в этих областях будет существенным образом сказываться на их функционировании.

Производное олигонуклеотида

1

II

m

IY

|без добавления I реагентов

Титр ID50

множественность инфекции ID^q на клетку

0,1

-CaCI

2

j -CaCI.

10" 10'

6,0

1С-6-0

i0-2,5 10-6,5 I0-5.Q 10-5,5

10-7,0

+СаСЬ,

10' 10 10" 10

-3,5 6,5

,-ь.ь

•Ь,5

10

-СаС1,

+СаС1

2

Т0-6,5

10' -3 5 10" 3,5

10" 6 0 10 -1,5

10" 6 0 то 6,5

Табл.6. Влияние алкилирукиих производных олигонуклеотидов на

развитие вируса гриппа в культуре куриных фиороблпетоь. I: ClH-d(рССГТСТТТСТ) комплементарен 5'-концу вРНК II: (i(pAGCAAAAGCA)-RCI комплементарен 3'-концу вРНК III: ClR-d(pTTTTCCCTTTT) комплементарен мРНК гена НА

вблизи положения 1040

1У: СЩ-сЦрСССАААСА.)- олигонуклеотид случайной последовательности

В табл.6 приведены результаты исследования влияния алкилирую-щих производных олигонуклеотидов, комплементарных 5' и 3' концам вирионных РНК, на репродукцию вируса гриппа в клетках. Опыты ставили без обработки и с обработкой СаС12 (125 мМ) с целью увеличения проницаемости клеток для олигонуклеотидов. Видно, что различные производные в разной степени влияют на развитие гриппозной инфекции. Максимальный эффект - снижение инфекционного титра на 4,5 порядка - наблюдался в случае производного олигонуклеотида, комплементарного 5'-концевым универсальным последовательностям вирионных РНК. Менее активным было производное олигонуклеотида, комплементарного гемагглютининовой мРНК. Практически неэффективным оказалось алкилирулцее производное олигонуклеотида случайной последовательности. Обработка клеток СаС12 не увеличивала действие олигонуклеотидов.

Причины различной эффективности олигонуклеотидных производных, комплементарных 5'- и 3'-последовательностям вирионных РНК, неясны и, по-видимому, связаны с различными функциями этих последовательностей. Нельзя исключить той возможности, -что эффективность препарата I обусловлена его связыванием не с 5'-концом вири-онной РНК, а с 5'-концом мРНК в связи с комплементарностью 5'- и 3*-концевых последовательностей вирионной РНК.

В качестве мишени в структуре мРНК вируса гриппа был выбран участок мРНК № белка в положении 1-16 с 5'-конца. Производные олигонуклеотида, комплементарного этой области, содержали на 5"-конце остаток 2-хлорэтиламина или холестерина.

В табл.7 приведены результаты действия холестериновых производных на синтез вирусных и клеточных белков в зараженных клетках. Как видно из таблицы, сами по себе олигонуклеотида не ингибируют синтез белков. Холестериновые производные как комплементарного, так и некомплементарного олигонуклеотида практически одинаково ингибируют вирусные белки. Кроме того, :;ет специфичности в отношении белка №Р, к мРНК которого комплементарен олигонуклеотид АТАСССТОСТТТТйСТ. Синтез клеточных белков при этом ингиОируегся очень слабо. Эти дашше свидетельствуют в пользу того, что ингиби-рованке вирусных белков происходит, вероятно, не из-за комплементарного взаимодействия холестеринового производного олигонуклеотида с вирусной мРНК, а скорее всего в результате взаимодействия с

активными центрами ферментов транскрипции.

Ингибитор йнгибировяше синтеза белков, %

К? М1 клет. белки

концентрация ингибитора мкМ

10 5 ,0 5 10 5

' " ......... (КрАТАСССТССТТТТССТ )* 2 0 0 0 0 0

сКрГСАСССТСТГСССЛТС )** 4 0 5 0 0 0

саз-йсрАтлссстасттттасс) * 4 6 24 68 63 9 0

СЬз-сКрТСАСССТСГТСССАТС )** 38 19 66 51 7 2

Табл. 7. йнгибирование синтеза вирусных белксв ИР и М1 2 инфицированных клетках холестериновым!! производными олигонуклеотвдов. * олигонуклеотад, комплементарный мРНК !м'Р белка вируса гриппа в

положении Ы£. *« олигонуклеотад, комплементарный РНК вируса клещевого энцефалита

Мнгибирущий аффект алкилирующегс производного олигонуклеоти-дг в концентрации 280 мкМ зависел от времени введения реагента в культуральную среду: максимальное ингкбироьание (65%) достигается при введении реагента за 0,5 часа дс инфицирования клеток; добавление же реагента в процессе Еирусной инфекции оказывает слабое влиянир на развитие вируса ^¿О-ЗОй ингиоироваиия), вероятно, из-за того, что скорость репродукции вируса гриппа очень высока. Синтез клеточных белков так же, как и в случае холестериновых производных, ингибируется незначительно (4-12&).

ВЫВОДЫ

Г. Исследовано ингиОирующеп действие олигонуклеоидов, модифицированных по концевам фосфатам различными группировками, на биосинтез РНК вируса гриппа в бесклеточной системе. Обнаружено эффективное блокирование функций вирусных белков, ответственных за транскрипцию РЖ, производными олигонукдеотидов длиной и--10 звеньев, несущими остатки порфиринов.

2. Проведен сравнительный анализ ингибируыцегэ действия олигонукдеотидов и их производных, комплементарных мР;1К белков М1 и

КР вируса гриппа, несущих на 5'-концевом фосфате остатки ароматического 2-хлорэтиламина, холестерина, порфирина и феназина в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Показано, что эффективно ингиОируют трансляцию олигонуклеотида, комплементарные мРНК в области инициирующего кодона и 5'-конца. Наиболее эффективное ингибирование достигается при одновременном действии нескольких олигонуклеотидав. Ингибирующий эффект усиливается при введении в олигонуклеотида алкилирущей группы, за счет которой олигонуклео-тид присоединяется к РНК ковалентно.

3. Исследовано взаимодействие производных олигонуклеотидов, несущих остатки 4-(Ы-2-хлорэтил-И-метил)аминобензиламина, феназина и холестерина с клетками - фибробластами мыши Ь-929 и фибробласта-ми эмбрионов кур. Показано, что обработки диметилсульфоксидом, ДЕАЕ-декстраном и полилизином, применяемые для улучшения трансфек-ции клеток нуклеиновыми кислотами, не стимулируют связывание производных олигонуклеотидов с клетками. Соосаздение олигонуклеотидных производных с фосфатом кальция приводит к увеличению эффективности связывания с клетками и проникновения в клетки, регистрируемого по взаимодействию с клеточными нуклеиновыми кислотами. Феназиниевая группировка практически не влияет на взаимодействие олигонуклеотидов с клетками, но повышает уровень алкилирования клеточной ДНК. Введение в алкилирующие производные олигонуклеотидов остатка холестерина резко (на 2 порядка) повышает их захват клетками. Инфицирование клеток вирусом гриппа не влияет на их взаимодействие с олигонуклеотидными производными.

4. Исследовано ингибирование размножения вируса гриппа в культуре клеток и эмбрионах кур с помощью производных олигонуклеотидов. Показано, что в концентрации 200 мкМ и выше, алкилирующее производное олигонуклеотида, комплементарное 5*-концевым универсальным последовательностям вирионной РНК, снижает инфекционный

7 ? Ч

титр размножающегося в куриных эмбрионах вируса с 10 до 10'; производное олигонуклеоида, комплементарное 3*-концу вирионной РНК, сникает титр вируса на порядок. Подавление функций вирусных мРНК и ферментов, ответственных за транскрипцию вирусных РНК, достигается наиболее эффективно при обработке клеток производными олигонуклеотидов, несущими остатки холестерина или порфирина, способствующие проникновению олигонуклеотидов в клетки и защищающих их от ферментативной деградации.

Основные результата диссертации опубликованы в следующих

работах:

1. Буторин А.С., Власов В.В., Иванова Е.М., Райт А.С., Шишкина И.Г., Юрченко Л.В., Якубов Л.А. (1989): Связывание алкилирувдих производных олигонуклеотидов клетками в присутствие добавок, стимулирующих процесс транскрипции. Биополимеры :» клетка, т.5: 71-75.

2. Буторин А.С., Власов В.В., Гуськова Л.В., Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Кобец Н.Д., Райт А.С., Юрченко Л.В. (1989): Синтез, свойства и взаимодействие с эукариотическими клетками алкилирувдих производных олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих ковалентно присоединенный к З'-концу остаток холестерина или феназинзя. Мол. биология, 23: 1382-1390.

3. Власов В.В, Горн В.В, Кутявин И.В., Юрченко Л.В., Шарова Н.К., Букринская А.Г. (1984): Возможность блокирования вирусной инфекции алкилируюцими производными олигонуклеоидов. Мол. генетика, микробиол., вирусология, II: 36-41.

4. Власов В.В., Иванова Е.М., Кутявин И.В., Райт А.С., Юрченко Л.В., Якубов Л.А., Абдукаюмов М.Н. (1989): Взаимодействие алки-лирукщих производных олигонуклеоидов с клетками млекопитающих. Исследование механизмов захвата производных клетками. Мол. биология, 23: 93-100.

5. Власов В.В., Юрченко Л.В. (1990): Механизм подавления трансляции мРНК антиемнеловыми олигонуклеотидами. Мол. биология, 24: II57-II6I.

6. Boutorin AS, Guskova LV, Ivanova EM, Kobetz ND, Zarytova VP, Ryte AS, Yurchenko LV, Vlassov W. (1989): Synthesis of alkylating oligonucleotide derivatives contanlng cholesterol or phena-zinium residues at their З'-terminus and their interaction with DNA within mammalian cells. FEBS Letters, 254: 129-132.

7. Vlassov W, Godovikov AA, Kobetz ND, Ryte AS, Yurchenko LV, Bukrinskaya AG (1986): Nucleotide and oligonucleotide derivatives as enzyme and nucleic acid targeted Irreversible inhibitors. Biochemical aspects. Advances in Enzyme Regulation, 24: 301-320. Ed. by G. Weber, Oxford, New York, Toronto, Sydney, Frunkiurt.

8. Viassov W, Com W, Nomokonova NY, Pokina TN, Yurchenko LV (1991): Inhibition of influenza virus M protein mRNA translati-

on in vitro with the complementary oligonucleotides. Nucleosides and Nucleotides, 10 (1-3): 649-650.

9. Vlassov W, Frolova EI, Godovlkova TS, Ivanova EM, Koshkln AA, Ledovsklkh NB, Nevlnsky GA, Yurchenko LY, Zarytova VF. (1991): Suppression of transcription and tranlatlon of the Influenza virus RNAs by oligonucleotide derivatives. Nucleosides and Nucleotides, 10 (1-3): 645-648.

10. Yakubov LA, Deeva EA, Zarytova VF, Ivanova EM, Ryte AS, Yurchenko LV, Vlassov VV. (1989): Mechanism of oligonucleotide uptake by cells: Involvement of specific receptors? Proc.Natl.Acad. Sei.USA, 86: 6454-6458.

no£HHcaHo k üeuaTii 30.iC.I991 r. Sopiaar CyNiare 60 :< 84/16 OOkk 1,0 nei. r..

K3s..n.. 3aiiar. TiipaH 100 &K3.

TisnorpafH?. ynpafcx.yhHfi AeJiaMa CO AH. CCCP HOBOCtfSXpOK. 90, y.r.. TepJKKOEOa, 30