Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перенос и экспрессия генов синтеза пролина proB osm , proA E. coli вклетках растений

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Перенос и экспрессия генов синтеза пролина proB osm , proA E. coli вклетках растений"



На правах рукописи

НОСЕНКО Николай Алексеевич

ПЕРЕНОС И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ СИНТЕЗА ПРОЛИНА ргоВоет, ргоА E.coli В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Э.С.Пируаян

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.И.Жданова

кандидат биологических наук Л.В.Генинг

Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН

Защита диссертации состоится иОСлХ^_1996 г.

№

в '< часов на заседании Диссертационного совета Д.098.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу. 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГосНИИгенетика.

Автореферат разослан " " 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Растения подвергаются многим стрессам окружающей среды. Среди них гиперосмотический стресс, вызываемый засухой и засолением, является наиболее значительным фактором, ограничивающим рост и урожайность сельскохозяйственных растений. Для противодействия отрицательному влиянию осмотического стресса растения в процессе эволюции выработали различные механизмы адаптации. Одним из таких механизмов является повышенный синтез и накопление совместимых органических осмолитов, в том числе пролина. Предполагают, что пролин стабилизирует белки и мембраны в условиях низкой водной активности и высокой температуры. В действительности накопление этой аминокислоты может являться частью более общего механизма адаптации к ухудшению условий окружающей среды, поскольку оно происходит в ответ на различные стрессовые факторы, включая гиперосмотический стресс, экстремальные температуры, нехватку питательных веществ, повышенную концентрацию тяжелых металлов, кислотность, высокие доаы солнечной радиации, анаэробиоз, вызываемый затоплением, и др. Впервые аккумуляцию пролина в увядающих растительных тканях наблюдали Кембл и Мак-Ферсон в 1954 г. на плевеле. С тех пор был обнаружен ряд других совместимых органических растворов, включая глицинбе-таин, полиолы, такие как глицерол, маннитод, сорбитол, пинитол, которые накапливаются в растительных клетках при осмотическом стрессе. Однако пролин является наиболее распространенным осмо-литом, накапливающимся в стрессовых условиях не только у растений, но и у эубактерий, простейших, морских беспозвоночных, водорослей.

В связи с этим представляется перспективным получение модельных трансгенных растений, обладающих повышенным синтезом и накоплением пролина, для изучения их осмотолерантности и создания в будущем новых сортов культурных растений с повышенной устойчивостью к абиотическим стрессовым факторам. Исследования показали, что увеличение концентрации пролина в растениях, подверженных стрессу, происходит главным образом за счет усиления биосинтеза пролина. Синтез пролина из глутамата у растений и бактерий происходит подобным образом. Поэтому для получения растений с повышенным уровнем содержания пролина принципиально возможным

является перенос в них бактериальных генов синтеза этой аминокислоты.

У бактерий в биосинтезе пролина участвуют последовательно три фермента: т-глутамилкиназа, глутамил-у-полуальдегиддегидрогеназа и Д1-пирролин-5-карбоксилатредуктаза, которые кодируются генами ргоВ, ргоА и ргоС соответственно. Первые два шага этого пути осуществляются т-глутамилкиназой и глутамил-г-полуальдегиддегид-рогеназой, функционирующими в комплексе. В отличие от бактерий у растений первые два шага этого пути осуществляются не двумя, а одним бифункциональным ферментом Да-пирролин-5-карбоксилатсинте-тазой, обладающей как r-глутамилкиназной, так и глутамил-т-полу-альдегиддегидрогеназной активностями. Регуляция синтеза пролина у бактерий и растений происходит по принципу обратной связи: первый фермент метаболического пути аллостерически ингибируется конечным продуктом - пролином. Некоторые мутации по бактериальному гену ргоВ, в том числе мутация proBosm, приводят к потере чувствительности r-глутамилкиназы и как следствие этого - сверхсинтезу пролина.

Учитывая особенности биосинтеза пролина в растениях и бактериях, мы решили перенести в растения одновременно два гена proßosir. и pro/! E.coli.

Цель и задачи работи. Целью настоящей работы было получение трансгенных растений табака Nicotiana tabacum с зкспрессирующи-мися бактериальными генами биосинтеза пролина proß0sm> ргоА E.coli и изучение влияния их экспрессии на осмоустойчивость данных растений. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. С помощью метода ЩР получить кодирующие последовательности генов proBosm и ргоА с линкерами, содержащими удобные сайты рестрикции для последующего клонирования.

2. Для уменьшения вероятности появления ошибок ЩР заменить внутренние части генов, полученных методом ЩР, на аналогичные из нативных генов.

3. Подставить каждый из генов под контроль сильного конститутивного CaMV 35S промотора с дуплицированным энхансерным участком (35SE) для оптимизации экспрессии в растениях.

4. Сконструировать бинарный вектор для одновременного переноса обеих генов в растения.

5. Получить трансгенные растения табака и изучить гетероло-гичную экспрессию генов proBOSm и ргоА.

Новизна результатов и научно-практическое значение работы.

В настоящей работе впервые перенесены гены синтеза пролина proBosm, ргоА E.coli в растения; получены трансгенные растения табака, экспрессирующие данные бактериальные гены; исследовано влияние гетерологичной экспрессии генов proBosm и ргоА на устойчивость трансгенных растений табака к солевому стрессу; получены новые данные о роли пролина в жизнедеятельности растительной клетки при нормальных и стрессовых условиях. Результаты диссертации могут стать основой дальнейших работ по повышению устойчивости растений к абиотическим стрессовым факторам. В частности, сконструированный агробактериалъный вектор может быть использован для введения в хозяйственно важные сорта культурных растений генов синтеза пролина proBosm и ргоА E.coli с целью повышения их осмоустойчивости.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (включает материалы и методы, результаты и обсуадение) и выводов; иллюстрирована 18 рисунками и 3 таблицами. Библиография содержит 128 наименований.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на международном симпозиуме "Molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses" 7-9 февраля 1996 г. в г.Хельсинки (Финляндия), планово-отчетной конференции за 1995 г. Института молекулярной генетики РАН (февраль 1996 г.), заседаниях Ученого совета ИМГ РАН и семинарах Отдела молекулярной генетики растений ИМГ РАН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. В работе использованы штаммы E.coli К12: HB10KF- thil hsdS20(rB~mB-) supE44 recA13 aral4 leuB6 proA2 lacYl rpsl20(Str) xyl5 mtl5 galK2) (Lacks, Greenberg, 1977), JM83(F~ ara Д(1ас-ргоАВ) rpsl(Str) ($80û(lacZ)M15) (Yanish-Perron et al., 1985), XLl-Blue(F" proAB lacIqû(lacZ)M15 TnlO(Tetr)/ recAl endAl gyrA96(Nalr) thil hsdR17(r]TfO supE44 relAl lac) (Bullock et al., 1987); Agrobacterium turnefacíens: EHA 105 (Hood et al., 1993). '

Растения. В работе использовались растения табака Nicotiana tabacum сорта Самсун. Для получения каллусной культуры и агро-бактериаяьной трансформации брали полностью распустившиеся листья 21-30-дневных проростков табака, выращенных in vitro на питательной среде MS.

Плазмида. Плазмиды pUC4K (Vieira, Messing, 1982), pUC18 (Yanish-Perron et al., 1985), pTZ18 (Pharmacia, 1986), pGPTV-KAN (Becker et al., 1992) использовались для экспериментов по клонированию. Плазмида pGPTV-KAN использовалась также в качестве бинарного агробактериального вектора.

Плазмида pNLM (Неумывакин и др., 1990), содержащая мутантный оперон proBosmproA Е. coli, использовалась в качестве источника генов синтеза пролина.

Плазмида pTZ18 35SE (Евстратова и др., 1990) использовалась в качестве источника 35S промотора вируса мозаики цветной капусты с дуплицированной энхансерной последовательностью и 3'-участка лолиаденшшрования нопалинсинтазного гена.

Среды. В качестве полноценной жидкой и твердой (1,5% агара) среды для выращивания клеток E.coli использовали LB-среду (Мани-атис и др., 1984), в качестве минимальной среды - среду М9 (Sambrook et al., 1989). Для выращивания клеток A. tumefaclens использовали среду YEP (An, 1987). В качестве полноценной среды для выращивания растений N. tabacum использовали среду MS (Murasige, Scoog, 1962).

Антибиотики. В работе использовались антибиотики: ампициллин (Ар), тетрациклин (Тс), рифампицин (Rf), цефотаксим (Сх) и кана-мицин (Km).

Выделение плазмидной ДНК. Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом (Birnboim, Doly, 1979).

Выделение растительной геномной ДНК для ПЦР проводили по методу, описанному в работе Эванс и др. (Evans et al., 1992) с модификациями.

Рестрикция. Гидролиз плазмидной ДНК осуществляли 2-3-кратным избытком рестрикционных эндонуклеаз. Для каждого фермента рестрикции использовали условия, предлагаемые фирмой-изготовителем (состав буферной смеси, температура, pH). Большинство рестрикционных эндонуклеаз и других ферментов получены от фирм "Фермен-тас" (Литва), "Promega" (США), "Boehringer Mannheim" (Германия),

"Биомастер" (Россия), "Бион" (Россия) как коммерческие препараты и использовались в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей.

Дотирование. Лигирование осуществляли согласно методу (Sambrook et al., 1989) с помощью ДНК-лигазы фага Т4.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с плазмидной и растительной ДНК проводили по методу, описанному в руководстве ( Erlich, 1989) с модификациями (Edwards, 1991; States et al., 1990; Bert-homeu, 1991; Hamill et al., 1991).

Электрофорез препаратов ДНК проводили в трис-ацетатном (ТАЕ) и трис-Соратном (TBE) буферах. Концентрация агарозы ("Sigma", США) составляла 0,7-2% в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК (Maniatis et al., 1982).

Элюирование ДНК из геля (легкоплавкой агарозы) после препаративного электрофореза осуществляли по методу, описанному в руководстве (Маниатис и др., 1984).

Трансформации нлетон E.coll плазмидной ДНК проводили по модифицированному методу Коэн (Cohen et al., 1972).

Трансформацию A. tumefaciens плазмидной ДНК проводили методом прямого переноса (An, 1987).

Трансформацию N.tabaciim осуществляли методом листовых дисков, описанным в руководствах (Дрейпер и др., 1991; Rogers et al., 1986).

Определение количества пролина. Содержание свободного пролина в листьях табака определяли по модифицированному методу Бейтса (Bates et al., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Амплификация генов Е. coli proB0sm и ргоА методом ПЦР.

Гены Е. coli proBosm, кодирующий мутантную т-глутамилкиназу в 200 раз менее чувствительную к ингибированию пролином, чем гамма- глутамилкиназа дикого типа, и ргоА, кодирующий глутамил-г-по-луальдегиддегидрогеназу, были клонированы ранее в составе плаз-миды pNLM (Неушвакин и др., 1990). Данные гены в pNLM находятся в составе бактериального оперона proBosmProA. Для дальнейшего клонирования генов proßosm и ргоА с целью их переноса в растения и оптимизации экспрессии мы амплифицировали оба гена методом

ЩР.

Зная нуклеотидную последовательность олерона ргоВА дикого типа ШеиШ! еЬ а1., 1984) и локализацию мутации ргоВовт, ведущей к сверхсинтезу пролина и повышенной осмоустойчивости бактерий (Неумывакин и др., 1990), с помощью компьютерного анализа ("0Ы(Ю", чег.з.з) к генам ргоВозт и ргоА были подобраны и синтезированы праймеры для их амплификации так, что они точно соответствовали структурной последовательности данных генов в 5'- и 3*-областях, а также содержали линкеры с сайтами узнавания рест-риктаз Ват Ш и Вд1 II.

1.1. Амплификация гена ргоВовт.

Праймер 1 (б' -Ю50АТССАТШЗТ(Ж:А6ССА5АСа) инициирует синтез ДНК с 372-го основания (Ие^сЬ еЬ а!., 1984) гена ргоВозт в направлений З'-конца, а праймер 2(5'-СТАСТОТАСТААТШЮМТТССТЛОШЗ) с 1439-го основания в направлении 5'-конца. 18 п.н. праймера 1 (5 * - А ГСШЗТ(Ж!А(ЗССА(ЗАСО) точно соответствуют 5'-кодирующей последовательности гена ргоВоат, начиная с первого инициирующего АТ(3-кодона. 18 п.н. праймера 2 (СТАСТбТАСТААТбйбСААТТ-З') точно соответствуют 3'-кодирующей области гена, заканчиваясь на терминирующем кодоне ГАА. Оба праймера также содержат на своих концах линкеры с сайтами узнавания рестриктазы Ват Н1 (ШАТСС) и по две дополнительные нуклеотидные пары гуанина для эффективной рестрикции продукта амплификации. Полная длина амплифицированного продукта с учетом величины праймеров составляла 1119 п.н. (рис.1).

1.2. Амплификация гена ргоА.

Праймер 3 (5'-ШСзАйАТСТ(лАТСЮТ00ААСАААТ6в6) инициирует синтез ДНК с 1486-го основания (БеиЬсЬ еЬ а1., 1984) гена ргоА в направлении З'-конца, а праймер 4 (5'-а(ЗШШССТ6ЗДетТТТТеТ6Т(ЗСТТА) с 2594-го основания в направлении 5'-конца. 18 п.н. праймера 3 (5'-вАТйСТ60ААСАААТШЗ) точно соответствуют 5*-кодирующей последовательности гена ргоА, начиная с первого инициирующего АТ(3-ко-дона (впереди АТй между кодирующей последовательностью и линкером имеется один гуаниновый нуклеотид). 19 п.н. праймера 4 (Т66АеттттТ6ТаТ6СТТА-3') точно соответствуют внутренней кодирующей области гена. Праймер 3 также содержит линкер с сайтом уэна-

ваша рестриктазы Вг! П (АбАТСТ). а праймер 4 - линкер с сайтом узнавания рестриктазы Ваш Н1 '"ССАТСО, Кроме того, оба праймера имеют на концах по три дополнительных нуклеотидных лары гуанина для эффективной рестрикции продукта амплификации. Полная длина продукта амплификации с учетом величины праймеров составляла 1164 п.н. (рис. 1).

1 2 3 4 5 6 V 8 9 10

:1,2 ко - ■

1.4 ко -0,6 кЬ - >

Рис.1. Электрофореграчма продуктов ПНР:

линия 1 - ДНК АУШпсН 1!+КсоР1; линия 2 - ДНК \ZPvuI I; линии 3-6 - продукты амплификации гена ргоВ0при различных условиях ПЦР; линии 7-10 - продукты амплификации гена ргоА при различных условиях ПЦР.

2. Клонирование продуктов ПЦР в промежуточных пдазмидных векторах, замена внутренних частей амплифицироваииых генов на аналогичные из нативных генов и подстановка генов ртсВ0гль ргоА под контроль 353Е промотора.

2.1. Клонирование амплифицированного гена ргоь'0;-т в риС4К.

Амплифицированный методом НЦР ген ргсбЬзт после электрофоре-

тического разделения элюировали из агарозы, обрабатывали рест-риктазой Bam HI и лигировали с вектором pUC4K (Vieira, Messing, 1982), у которого с помощью рестриктаэы Bam HI предварительно удалили ген устойчивости к канамицину капг размером 1,5 т.п.н. Полученной лигазной смесью трансформировали штамм XLl-Blue E.coli. Плазмида pUC4K облегчала скрининг рекомбинантных клонов после трансформации, поскольку позволяла использовать цветной тест на среде, содержащей Ш1ГГ, Х-gal, и, кроме того, облегчала в дальнейшем замену внутреннего фрагмента BstEII-EcoRV амплифи-цированного гена proB0sm на аналогичный из нативного гена. После трансформации отобрали клоны с рекомбинантной плазмидой pUC4Bosm, содержащей ген ргоВ0sm (рис. 2).

ptoBosm ртоА

капг

~ шШ

BstEII ^EcoRV

Beten Bern

proBaem

w^oRV imHI

Рис.2. Клонирование ЩР-амплифицированного гена ргоВ0&ш и замена его фрагмента В51ЕП-ЕсоСТ на аналогичный фрагмент из рМШ.

2.2. Клонирование амплифицированного гена ргоА в pTZ18 35SE.

Амплифицированный методом ПЦР ген ргоА после электрофорети-ческого разделения элюировали из агарозы, обрабатывали рестрик-тазами Bam HI и Bgl II, после чего лигировали с вектором pTZ18 35SE, обработанным рестриктазой Bam HI.

Плазмида pTZ18 35SE содержит в своем составе сильный конститутивный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты с дуп-лицированным знхансерным участком (35SE) и 3'-участок полиадени-лирования нопалинсинтазного гена, которые разделены линкером с сайтом узнавания рестриктазы Bam HI. 35S CaMV промотор, имеющийся в данной плазмиде, инициирует в растениях синтез мРНК в положении -17. Известно, что дупликация энхансерной области 35S CaMV промотора ведет к повышению уровня экспрессии генов, находящихся под его контролем, до 10 раз, поэтому мы использовали 35SE промотор, клонированный в плазмиде pTZ18 35SE для достижения максимальной экспрессии в растениях бактериальных генов биосинтеза пролина.

После трансформации E.coli НВ101 лигазной смесью отобрали клоны с рекомбинантной плазмидой pTZ18 35SEA, содержащей амплифицированный методом ПЦР ген ргоА в прямой ориентации относительно 35SE промотора (рис. 3).

2.3. Замена внутренних кодирующих последовательностей ампли-фицированных методом ПЦР генов proßosm и ргоА на аналогичные из нативных генов.

Известно, что термостабильная Taq ДНК-полимераза из бактерии Themius aquaticus, используемая в методе ПЦР, чаще ошибается, чем ДНК-полимеразы E.coli. Поэтому, чтобы уменьшить вероятность появления ошибок ПЦР и гарантировать сохранность мутантного ло-куса гена proßosm> мы заменили внутренний фрагмент BstEII-EcoRV размером 785 п.н. гена proB0sm» клонированного в pUC4Bosm, на аналогичный ему из нативного гена ргоВ0sm. клонированного в рЫШ.Для этого pUC4Bosm и pNLM обрабатывали рестриктазами BstEII и EcoRV, разделяли электрофорезом в 1%-ной агарозе и элюировали в первом случае фрагмент с вектором размером 3,2 т.п.н., а во втором - фрагмент BstEII-EcoRV размером 785 п.н. из pNLM. Далее эти два фрагмента лигировали и трансформировали E.coli НВ101. После трансформации отобрали клоны, содержащие рекобинантную

плазмиду риС4ргоВ03т с замененной внутренней частью гена ргоВ051Я (рис. 2).

ргоВовт ргоА

ВатН1

рАпов

ВдШ/ВатШ ргоА (РСЯ) ВатШ

Г355Е

рАпок

С1а1 I ВатН1 4 В81И

сш

ВкШ/ВатШ Р35£Е

ртА В§1Н/ВатН1

рАпоз

Рис. 3. Клонирование ЩР-амплифицированного гена ргоА и замена его фрагмента С1а1-ВашН1 на С1а1-Ве1П из рШ1.

Подобную операцию проделали с геном-продуктом ПЦР ргоА, клонированном в ртг18 353ЕА: фрагмент С1а1-ВашН1 размером 874 п.н.

плазмиды pTZ18 35SEA заменили на фрагмент Clal-Bgl II размером 1183 п.н. из pNLM. Для этого плазмиду pTZ18 35SEA обработали рестриктазами Glal и Bam HI, a pNLM - Clal и Bgl II. После электрофоретического разделения в 1,5% агарозе в первом случае элюировали фрагмент с вектором размером 2,9 т.п.н., а во втором - фрагмент Clal-Bgl II размером 1183 п.н. из pNLM. Далее эти два фрагмента дотировали и трансформировали штамм E.coll НВ101. После трансформации отобрали клоны, содержащие рекомбинантную плазмиду pTZ18proA с замененной внутренней частью гена ргоА (рис.3).

2.4. Подстановка гена pro£osm под контроль 35SE промотора.

Для подстановки гена proBosm под растительные регуляторные последовательности (35S CaMV промотор с дуплицированной энхан-серной последовательностью и З'-nos участок полиаденилирования нопалинсинтазного гена) плазмиду pUC4proB0sm обрабатывали рест-риктазой Bam HI, разделяли электрофорезом в 1Z агарозном геле и элюировали ген proBosm в виде фрагмента размером 1119 п.н. Далее этот фрагмент дотировали с вектором pTZ18 355Е, также обработанным рестриктазой Bam HI. После трансформации лигазной смесью штамма НВ101 E.coll отобрали клоны с рекомбинантной плазмидой pTZl8proB0sm. содержащей ген proBosm в прямой ориентации относительно промотора (рис. 4).

3. Конструирование бинарного вектора, способного одновременно переносить оба гена рго£0sm и ргоА в растения.

3.1. Клонирование гена ргоА в бинарном векторе pGPTV-KAN.

Для создания бинарного вектора, способного одновременно перенести оба гена proBosm и ргоА в растения, сначала ген ргоА в окружении 35SE промотора и З'-nos последовательности перенесли в бинарный вектор pGPTV-KAN.

Бинарный вектор pGPTV-KAN содержит область Т-ДНК, фланкированную двумя прямыми повторами (правым - TR и левым - TL). В этой области имеются два гена - npfc II, придающий трансформированным растениям устойчивость к Km, и репоргерный ген uid А, кодирующий в-глюкуронидазу. Мы использовали вектор pGPTV-KAN для переноса в растения генов синтеза пролина, поскольку он обладает рядом преимуществ. Во-первых, ген устойчивости к канамицину npt II у него расположен вблизи левой границы Т-ДНК, а так как пере-

нос Т-ДНК начинается с правой границы, то это гарантирует наличие встроенной чужеродной ДНК в геноме трансформированных растений, проявляющих КРТ II активность. Во-вторых, у гена лpt II в составе этого вектора удалена специфическая точка мутации, которая уменьшает ЫРТ П-ферментативную активность. И в-третьих, этот бинарный вектор имеет относительно небольшой для этого типа векторов размер и удобен при клонировании.

ВатН1 РгоВ08т ВатН1

Рис.4. Подстановка гена ргоВОВт под растительные регуляторные последовательности (35БЕ промотор и 3'-область гена поя).

Плазмвду рТ218ргоА обрабатывали рестриктазами Hind III и EcoRI, разделяли электрофорезом в 1.5Х агарозном геле и элюировали фрагмент размером 2,5 т.п.н, содержащий ген ргоА, 35SE промотор и З'-nos последовательность. Далее этот фрагмент лигировали с вектором pGPTV-KAN, у которого предварительно удалили с помощью рестриктаз Hindi11 и EcoRI репортерный ген uid А. После трансформации лигазной смесью штамма НВ101 E.coli отобрали клоны с рекомбинантной плазмидой рЕА (рис. 5).

P35SE. Hindlll

ргоА

Hindlll

uidA pÄnos pAllOS EcoRI Eco

Pnos

Hindlll

Hindlll P35Se| Pnos

pAnos EcoR

Рис.

5. Клонирование гена ргоА в бинарном векторе pGPTV-KAN.

3.2. Конструирование бинарного вектора рЕАВ, несущего оба гена рГОВоsm И РГОА.

К гену ргоА в получившейся плазмиде рЕА подстраивали ген proBosm в окружении 35SE промотора и З'-nos последовательности. Плазмиду pTZl8proB0sm обрабатывали рестриктазами Xbal и Smal, разделяли электрофорезом в 1,5%. агарозном геле и элюировали фрагмент размером 2,2 т.п.н, содержащий ген proBosm, 35SE промотор и З'-nos последовательность. Далее этот фрагмент лигировали с вектором рЕА, обработанного рестриктазой HindiII с последующей полимеразной достройкой сайта фрагментом Кленова, а также рестриктазой Xbal. После трансформации лигазной смесью штамма НВ101 E.coli отобрали клоны с рекомбинантной плазмидой рЕАВ. Получившийся в итоге бинарный вектор рЕАВ содержит оба гена proßosm и ргоА с дивергентной ориентацией промоторов (рис. 6).

4. Тестирование экспрессии генов ргоВ0sm и ргоА, клонированных в рЕАВ, в бактериях.

Для того, чтобы убедиться в целостности структуры и возможности экспрессии генов proBosm и ргоА в растениях после всех проведенных операций, связанных с ПЦР и клонированием, мы трансформировали штаммы E.coli НВ101 и JM83 плазмидой рЕАВ. Данные штаммы являются ауксотрофами по пролину и в норме не могут расти на минимальной среде без пролина. НВ101 имеет мутацию proAZ, а JM83 имеет делецию АргоАВ. Оба штамма, трансформированные плазмидой рЕАВ, восстанавливали способность к прототрофному росту на минимальной среде, не содержащей пролина, что говорило о наличии экспрессии генов proBosm и ргоА. Однако скорость роста клеток JM83 и НВ101, трансформированных плазмидой рЕАВ, была несколько ниже, чем у этих же штаммов, трансформированных плазмидой pNLM. Это можно объяснить отсутствием у генов proBOSm и ргоА, клонированных в рЕАВ, бактериальных промоторов и последовательностей Шайн-Долгарно.

5. Перенос бинарного вектора рЕАВ в Agrobacterium tumefaciens.

Поскольку плазмида рЕАВ обладает всеми преимуществами бинарных векторов по сравнению с коинтегративными векторами, перенос рЕАВ в A. tumefaciens ЕНА 105 осуществили методом прямой транс-

PwBosm

pAnos

Sroal pAnos

Xbal HlndlII

. P35SB\/PnO»

ргоА ^gétkm^nptii

pAg7

HlndlII Elenow Fragmcnt

Xbal

Smal/HindIII

Рис. 6. Конструирование бинарного вектора рЕАВ.

формации. Штамм A.tumefaciens ЕНА 105 был выбран, потому что он содержит "обезоруженную" Ti-плазмиду-помощник, производную плаз-миды дикого типа pTiBo542 с делегированной областью Т-ДНК и придающую данному агробактериальному штамму супервирулентные свойства. Для подтверждения наличия генов proBosm и ргоА, а также отсутствия нежелательной рекомбинации в трансформированных клетках

A.turnefaciens, из трансформированных клонов выделяли плазмиду рЕАВ щелочным методом, подвергали ее ЩР- и рестрикционному анализам. Оба вида анализа подтвердили перенос генов proB0sm. ргоА в составе вектора рЕАВ в A. tumefaciens ЕНА 105 и отсутствие нежелательных рекомбинаций. Кроме того, при трансформации E.coli НВ101 и JM83 плазмидой рЕАВ, выделенной из Agrobacterium, клетки данных штаммов восстанавливали способность к прототрофному росту на минимальной среде без пролина.

6. Трансформация растений табака.

Трансформацию Nicotiana tabacum сорта Самсун осуществляли методом листовых дисков. Были отработаны две схемы агробактериаль-ной трансформации - по первой схеме после 2-х дней инкубирования листовых дисков табака с A. tumefaciens их прересаживали на ага-ризованную среду MSD (0,8% агар), содержащую 50 мкг/мл Кш и 500 мкг/мл Сх, получали в течение 2-3 недель регенерировавшие побеги величиной 0,5-1 см, которые затем срезали и укореняли на среде MS с 50 мкг/мл Km, 200 мкг/мл Сх. По второй схеме после двух дней инкубирования листовых дисков с A.tumegaciens их переносили на среду MSD не с 50, а 100 мкг/мл Кш, и с идентичной концентрацией Сх. После появления в течение 2-3-х недель побегов-регене-рантов их переносили на среду MS, содержащую 300 мкг/мл Km, 200 мкг/мл Сх и 1 мг/л БАП. По мере достижения величины побегов 3-4 см их срезали и укореняли на среде MS с 50 мкг/мл Km, 200 мкг/мл Сх. Канамицин (Km) в норме токсичен для растительных клеток и используется для ■селекции трансформированных растительных тканей, экспрессирующих ген nptll. Цефотаксим (Сх) используется для подавления агробактериального роста после трансформации. А. tumefaciens ЕНА 105/рЕАВ использовали для переноса в растения генов E.coli proBosm и ргоА, a A. tumefaciens ЕНА 105/pGPTV-KAN - в качестве контроля, как вектор, не несущий гены proBosm и ргоА.

Известно, что корни растений и каллус более чувствительны к токсическому действию канамицина, чем побеги, поэтому мы провели предварительный анализ на трансгенность регенерировавших побегов по устойчивости к Km. В результате агробактериальной трансформации листовых дисков табака по первой схеме из 30 отобранных случайным образом побегов-регенерантов укоренилось в случае A.tumefaciens ЕНА 105/рЕАВ 18 побегов, а в случае A.tumefaciens

EHA 105/pGPTV-KAN - 21 побег. По второй схеме из 30 отобранных случайным образом побегов-регенерантов укоренилось в случае A.tumefaciens EHA 105/рЕАВ 27 побегов, а в случае A.tumefaciens EHA 105/pGPTV-KAN - 26 побегов.

Далее взяли случайным образом по 10 укоренившихся растений из каждой группы и протестировали их на образование каллуса на среде MSD с 300 мкг/мл Km. По первой схеме из 10 растений, инокули-рованных A. tumefaciens EHA 105/pGPTV-KAN, образовали каллус 3 растения, а из 10 растений, инокулированных A.tumefaciens EHA 105/рЕАВ, образовали каллус Z растения. По второй схеме из 10 растений, инокулированных A.tumefaciens EHA 105/pGPTV-KAN, образовали каллус 7 растений, а из 10 растений, инокулированных A.tumefaciens EHA 105/рЕАВ, образовали каллус 6 растений.

7. Подтверждение встраивания генов proBosm и ргоА в растительный геном методом ПЦР.

Из 8 растений табака, инокулированных A.tumefaciens EHA 105/рЕАВ, образовывавших корни и каллус в присутствии канамици-на, выделили геномную ДНК и использовали ее в качестве матрицы при анализе методом ПЦР. Все 8 растений дали положительные сигналы по генам proBosm и ргоА, что подтверждает преимущества бинарных векторов с селективными маркерными генами, расположенными вблизи левой границы Т-ДНК, при трансформировании растений чужеродной ДНК.

8. Изучение экспрессии генов proBOSm и ргоА в трансгеннных растениях табака.

8.1. Накопление пролина в трансгенных растениях табака.

б полученных трансгенных линий табака анализировали на содержание свободного пролина (табл. 1). Уровни содержания свободного пролина в листьях двух трансгенных линий (TL4, TL6) почти не отличались от таковых в контрольных растениях (25-29 »jg/g FW). Однако 4 остальные трансгенные линии (TL1, TL2, TL3 и TL5) показали высокие уровни содержания свободного пролина. Превышение накопления пролина в данных линиях составляло 4-6,5 раза над контрольными растениями. Причем уровень пролина в различных трансгенных линиях значительно варьировал (110-180 мё/g FW). Это может объясняться как разным числом копий встроенной Т-ДНК, так и

попаданием Т-ДНК в области растительного генома с различной транскрипционной активностью.

1 1 N | п/п 1 | Растения МЛаЬасшп | су Батзип Концентрация пролина (ие/е: во 1 Превышение содержания! пролина относитель но| контроля (х раз) |

1 1 |Дикого типа 28,4 ± 0,9 |

1 2 I Трансформированные | вектором р(ЗРТУ-ЮШ 26,9 ± 1,6 |

1 з I Трансгенная линия ТЫ 184,3 + 2,8 6,5 |

1 4 |Трансгенная линия ТЬ2 116,7 ± 1,8 4,1 1

1 5 |Трансгенная линия ТЬЗ 171,5 ± 2,6 6,0 |

1 6 (Трансгенная линия ТЬ4 V 27,3 ± 0,5 |

1 7 |Трансгенная линия ТЬ5 107,1 ± 1,6 3,8 |

1 8 1 |Трансгенная линия ТЬб 1 28,0 ± 0,4 I

Табл. 1. Содержание свободного пролина в листьях табака.

8.2. Устойчивость трансгенных клеток табака к Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоте.

Каллус, полученный из листьев 6 трансгенных линий табака, анализировали на устойчивость к Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоте (Агс). Агс является токсичным аналогом пролина и клетка может противодействовать его вредному влиянию путем повышенного синтеза и накопления пролина. При пересаживании каллуса со среды МЗБ на эту же среду, но содержащую, кроме того, 1 мМ Агс, рост каллуса, полученного как из контрольных растений, так и из трансгекных, сильно ингибировался. Наблюдались вначале хлороз, а

затем постепенное приобретение коричневой окраски и гибель кал-лусной ткани. Однако каллус, полученный из трансгенных-линий TL1, TL2, TL3 и TL5, оставался живым по меньшей один месяц на данной среде, в то время как каллус, полученный из контрольных растений и трансгенных линий TL4, TL6, полностью погибал в течение 1-2 недель. Более того, каллус, полученный из трансгенной линии TL1, способен стабильно поддерживаться на среде с 1 мМ Azc. Уровни содержания свободного пролина в различных трансгенных линиях табака коррелировали с устойчивостью каллуса, полученного из этих линий, к 1 мМ Azc.

8.3. Устойчивость трансгенных клеток табака к солевому стрессу.

Каллус, полученный из листьев 6 трансгенных линий табака, анализировали также на устойчивость к солевому стрессу. Для этого каллус пересаживали со среды MSD на эту же среду, содержащую, кроме того, 430 мМ NaCl. Рост каллуса, полученного из контрольных и трансгенных растений, значительно ингибировался, как и в случае с Azc. Наблюдались постепенное приобретение коричневой окраски и гибель каллусной ткани. Однако каллус, полученный из трансгенных линий TL1, TL2, TL3 и TL5, оказался более устойчивым к этой экстремальной концентрации NaCl. Он, также как и в случае с 1 мМ Azc, оставался живым по меньшей один месяц на данной среде, в то время как каллус, полученный из контрольных растений и трансгенных линий TL4, TL6, полностью погибал в течение 1-2 недель. Сохранялась также прямая зависимость между величиной содержания свободного пролина и устойчивостью каллуса к 430 мМ NaCl.

8.4. Влияние накопления пролина на корнеообразование в присутствии NaCl.

Сравнивали укоренение побегов трансгенных и контрольных линий табака на среде MS в присутствии 300 мМ и 350 мМ NaCl. После 4-х недель солевого стресса на данных средах рост и развитие побегов как контрольных, гак и трансгенных побегов значительно замедлялись. Однако побеги из трансгенных линий TL1, TL2, TL3 и TL5 укоренялись при обеих концентрациях NaCl, в то время как побеги из контрольных и трансгенных линий TL4, TL6 вообще не укореня-

лись при 350 мМ МаС1, хотя у чести побегов развивались очень слабые и маленькие корни при 300 мМ Ма01. При укоренении побегов наблюдалась прямая корреляция между уровнем содержания прелина б различных трансгенных линиях и временем появления, а также степенью развития корневой системы яри солевом стрессе. Так, побеги из трансгенной линии ТЫ раньше всех образовывали корни и их корневая система была наиболее развитой после 4-х недель культивирования на среде с 500 мМ и 350 мМ МаС1 (рис.7*).

Рис. 7. Укоренение побегов табака в присутствии 350 мМ МаС1. Слева направо: 1 - дикого типа (контроль 1); 2 - трансформированный вектором рбРТУ-КАМ ¡'контроль 2); 3 - трансгенная линия ТЫ; 4 - трансгенная линия ТЬ2.

Влияние гетрродогичной экспрессии генов ргоВоатт. и ргоА на устойчивость трансгенных растений к Агс и солевому стрессу обобщены в табл.2.

Растения N.tabacum cv Samsun

Устойчивость каллуса к

1 шМ Azc

430 шМ NaCl

Укоренение в присутствии

300 шМ NaCl

350 шМ NaCl

Дикого типа

Трансформированные вектором pGPTV-KAN

Трансгенные по proBosm и ргоА

*

*

* Часть побегов укореняется при этой концентрации NaCl

Табл. 2. Сравнительная характеристика устойчивости растений табака к Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоте и NaCl.

ВЫВОДЫ

1. Гетерологичная экспрессия бактериальных генов proBosm и ргоА под контролем CaMV 35S промотора с дуплицированной энхан-серной последовательностью приводит к повышенному синтезу и накоплению пролина в трансгенных растениях табака.

2. Трансгенные растительные клетки, экспрессирующие гены proBosm и proА, обладают повышенной устойчивостью к токсичному аналогу пролина Ь-азетидин-2-карбоксиловой кислоте и NaCl.

3. Трансгенные растения, экспрессирующие гены proBosш и ргоА, обладают повышенной устойчивостью корневой системы к солевому стрессу.

4. Повышенный синтез и накопление пролина в трансгенных растениях обеспечивают их толерантность к осмотическим стрессам.

5. Гены proBosm и ргоА E.coli рекомендуются для переноса в хозяйственно важные сорта культурных растений с целью повышения их устойчивости к абиотическим стрессовым факторам.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. L.V.Neumivakin, V.P.Solovjov, L.S.Chernin, M.E.Gasparian, N.A.Moseiko, R.V.Shahbazjan and E.S.Piruzian. The increase of the viability of simbiotic soy-bean bacteria Rhizobium fredil by heterologous expression of mutant operon proBosmproA. In: 7th International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, June 26-July 1, 1994, Montreal, Canada. Abstracts. 169 p.

2. Л.В.Неумывакин, В.П.Соловьев, Р.В.Шахбазян, Н.А.Мосейко, Н.Л.Радюкина, Л. С. Чернин, Э.С.Пирузян. Получение рекомбинантных бактерий Rhizobium fredii BD 32/pNSAR, содержащих мутантный опе-рон proBosmProA Escherichia coli, и их влияние на инокулирован-ные растения. Тезисы 1-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС), Саратов, 1994.

3. Л.В.Неумывакин, В.П.Соловьев, Н.Л.Радюкина, Н.А.Мосейко, Р.В.Шахбазян, Л.С.Чернин, Э.С.Пирузян. Клонирование мутантного оперона proBosmproA Escherichia coli и его гетерологичная экспрессия в бактериях-симбионтах сои Rhizobium fredii. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1995, N1, с.14-20.

4. L.V.Neumivakin, V.P.Solovjov, A.Sokhansang, V.A.Tilba, N.A.Moseiko, R.V.Shachbasian and E.S.Piruzian. Increase in osmo-tolerance of Rhizobium fredii soybean isolate BD32 by the proBosmproA operon of Escherichia coli. BBRC, 1995, vol.217, N3, P.796-801.

5. E.S.Piruzian, L.V.Neumivakin, N.A.Moseiko and A.Sokchanza-ni. Transgenic plants with expressed bacterial genes of stress tolerance. In: Molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses. Symposium Proceedings, Feb. 7.-9. 1996, Helsinki, Finland. P.29-30.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору Пирузян Элеоноре Суреновне и к.б.н. Неумывакину Леониду Власовичу за постоянную помощь и внимание в ходе выполнения работы. Автор выражает благодарность д.б.н. Андрианову Вячеславу Михайловичу за ценные советы.

Автор искренне признателен Кобец Н.С., Волковой Л.В., Голден-ковой И.В. и всему коллективу Отдела молекулярной генетики растений ИМГ РАН за оказанную помощь и доброе отношение.