Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение рекомбинантных осмоустойчивых клубеньковых бактерий и их влияние на структуру урожая, водопотребление и андрогенез растений сои

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Получение рекомбинантных осмоустойчивых клубеньковых бактерий и их влияние на структуру урожая, водопотребление и андрогенез растений сои"

од

и

№

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВ Владимир Петрович

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ОСМОУСТОЙЧИВЫХ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ВЛИЯНИЕ НА СТРУКТУРУ УРОЖАЯ, ВОДОПОТРЕБЛЕНИЕ И АНДРОГЕНЕЗ РАСТЕНИЙ СОИ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

МОСКВА 1996

Работа выполнена ю отделе молекулярной генетики растений Института молекулярной генетики РАН и лаборатории селекции и физиологии сои ВНИИ сои РАСХН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Э. С. Пирузян, кандидат биологических наук Л. В. Не-умывакин.

Научный консультант: кандидат биологических наук Л. К. Малыш.

Официальные оппоненты: академик РАСХН В. С. Шевелу-ха, доктор биологических наук, профессор Н. И. Шевякова.

Ведущая организация: ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

в «/^ » часов на заседании диссертационного ученого совета Д 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К- А. Тимирязева то адресу: 127550, ул. Тимирязевская, 49, сектор защиты диссертаций ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан » .... 1996 г.

Защита состоится

1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета — кандидат биологических

А. С. Лосева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теки исследований. В условиях Дальнего Востока нашей страны одной иэ основных высокобелковых культур является соя. На Дальнем Востоке в настоящее время районировано 14 сортов сои с продолжительностью вегетации 96-120 дней и средним урожаем 20-23 ц/га. Однако колебания урожая сои по годам в регионе составляют 10-15 ц/га. Причиной этого являются низкие температуры в отдельные периоды развития сои, а также недостаток влаги и/или переувлажнение почвы (т.е. осмотические факторы).

Изучение симбиоза растений с осмоустойчивыми ризобиальными бактериями сои имеет большое теоретическое и практическое значение. Их результаты способствуют пониманию механизмов осмоустойчи-вости как бактериальной, так и растительной клетки. Многолетние исследования с использованием клеток растений не дали пока еще убедительных объяснений работы генетического аппарата в условиях осмотического стресса. Только после того, как в 70-х годах было обнаружено, что клетки бактерий и растений одинаковым образом реагируют на повышение осмолярности среды, молекулярные механизмы осмотолерантности бактерий стали использовать в качестве модельной системы.

Создание рекомбинантных бактерий-симбионтов сои, способных к повышенному синтезу пролина, который является осмопротектором, может положительно повлиять на целый ]ряд физиологических функций инокулированных ими растений сои. Это, возможно, позволит снизить энергетические затраты растения на азотфиксацию и жизнеобеспечение и увеличить урожайность. Кроме того, такие бактерии, вероятно, способны повысить устойчивость растений к таким стрессовым воздействиям окружающей среды как засоление, засуха или переувлажнение.

Цель исследований. Цель исследований - изучение влияния ри-зобиальных бахтернй-суперпродуцентов пролина на эффективность симбиоза с растениями сои.

Для достижения цели исследования необходимо было решить следующие задачи:

1. Перенести мутантный оперон Escherichia coli proB0SmproA в бактерии-симбионты сои Rhizobium fredii, и изучить влияние его "экспрессии на жизнеспособность данных бактерий..

2. Изучить жизнеспособность и осмоустойчивость рекомбинант-ных риэобиальных бактерий.

3. Установить вирулентность полученных рекомбинантных бактерий .

'4. (Определить влияние рекомбинантных ризобиальных бактерий. ' на ¡различные физиологические характеристики растения: водопотреб-ление, урожайность, структуру урожая, эффективность инокуляции.

5. Оценить 'Влияние данных бактерий на эффективность формирования каллуса сои андрогенного происхождения.

Неумная новизна. Получены новые данные о результатах симбиоза соевых рекомбинантных бактерий R.fredii с растениями сои. Их влияние на водопотребление, изменение структуры урожая и формирование каллуса из пыльников сои.

Практическая значимость. Перенос мутантного гена proBosm в клетки бактерий - оин&монтов сои Rhizobium fredii BD-32 привод к ■•улучшению "их «йэйе'епооа&мосги и осмоустойчивости.

S ре'эулъ'т&'Те "переноса яутантного гена proBosn в R.fredii "ЪЙ-'ЗЙ ЪЪлуЧен рекомбинантный штамм BD-32/PNSAR, клетки которого об'ладают большей жизнеспособностью за счет повышенного синтеза пролина. Инокуляция растений сои штаммом BD-32/PNSAR приводит к уменьшению расхода воды на единицу урожая и повышению урожая семян по сравнению с инокуляцией исходным штаммом.

Выявлены сортовые особенности реакции растений сои на инокуляцию рекомбинантными бактериями R.fredii, несущими оперон рго-ВозшргоА, в условиях Амурской области.

Разработан метод получения каллуса из пыльников сои, позволяющий получить до 70% каллусов. Метод защищен 3 патентами России .

Для обработки статистических данных разработан способ расчета средней модальной оценки для выборки с распределением не соответствующим нормальному (Гауссовому) закону распределения..

Автор приносит благодарность Андрианову В.М., Бегун С.А., Аронштанму А.З., Епифанцеву В.В., Кобец Н.С., Малышеву К.С.,

Малыш Л.К., Синеговской В.Т., Посыпанову Г.С., Тильба В.А., Чернину Л.С., Ясевич Н.В., Яскевич И.Д. за помощь в работе и моральную поддержку.

Апробация работы. Основные положения диссертации изложены в

9 опубликованных работах. Материалы диссертации докладывались на Конференции молодых ученых Сибири и Дальнего Востока, (Омск, 1989г.), Научно-практической конференции Южного Отделения ВАСХНИЛ (Винница, 1990г.), IV Всесоюзной научной конференции "Микробиология сельскому хозяйству" (Пущино - на - Оке, 20-24 января 1992г.), V конференции Российской Федерации "Микробиология -сельскому хозяйству" (Пущино - на - Оке, 18-22 мая 1992г.), Научной сессии общего собрания ДВО РАСХН.- "Научное обеспечение АПК Дальнего Востока" (Уссурийск, 1993г.), Президиуме ДВО РАСХН "Проблемы биотехнологии" (Хабаровск, 1993г.)

Структура и объен диссертации. Диссертация изложена на ¡DJ страницах машинописного текста, включает 16 таблиц, 10 рисунков,

10 приложений. Список литературы включает 2.&L наименования отечественной и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объект исследований. В работе использованы штампы E.coll: КК 2036 (получен из музея ВНИИ генетики); HB 101 (получен из музея ИМГ РАН); HB 101/pNSAR, HB 101/PLVAR (получены в данной работе);

Штаммы бактерий Rhizobium fredii: BD-32, МА-46, AS-171, TS-196, 648a, OS-26, 8725, MID-10 (получены из ВНИИ сои ДВО РАСХН); BD-32/pNSAR, BD-32/PLVAR (получены в'данной работе).

Плазмиды: pBR 322 (Bolivar F. et al.); pCV 16 (Таняшин В.И. и др.); pVA 12-2 (Денисова Т.е. и др.); рВ1-37 (получена от Хур-геса Е.М.); pNLM, pNS, pLV, pNSAR, pLVAR (получены в данной работе); pRK 2013 (Heiinski D.K.)

Сорта сои: Взлет и 0ктябрь-70 (получены из коллекции ВНИИ сои ДВО РАСХН).

Среды : В качестве полноценной жидкой и твердой (1,5% агара) среды для выращивания клеток E.coli использовали L-среду, для R.fredii - среду Pl. В качестве минимальной среды для E.coli использовали среду М9, для R.fredii - среду МС-Р1. Для культивирования пыльников сои использовали среду N6.

Антибиотики: ампициллин (Ар) - 100 ккг/кл, тетрациклин (Тс) - 10 мкг/мл, канамицин (Km) - 50 мкг/мл.

Определение солеустойчивости и осмоустойчивости бактериальных клеток проводили путем измерения скорости роста бактерий (генерация в час) на среде с различной концентрацией NaCl.

Конъюгативный перенос плазмид проводили по Миллеру (Миллер, 1976).

Выделение плазкидной ДНК проводили по методу Birnboim (Birn-boim Н.С., Doly 3. 1979)

Выделение небольших количеств плазмидной ДНК проводили по методу, описанному в методическом пособии (Мазин и др., 1990).

Обработка рестриктазами: Рестриктазы, использованные в работе, получены из НПО "Fermentas" г.Вильнюс. Для работы каждого фермента рестрикции использовали условия, предлагаемые фирмой-изготовителем (состав буфферной смеси, температура, рН).

Обработка ДНК полинуклеотидлигазой: Полинуклеотидлигаза фага Т4 была получена из НПО "Fermentas" г.Вильнюс. Для лигирования использовали условия, рекомендуемые фирмой-изготовителем.

Электрофорез ДНК в агарозном геле: проводили в горизонталь-нон аппарате, как описано в методическом пособии (Маниатис Т. и Др., 1984).

Элюирование Фрагментов ДНК из агарозы: элюцию ДНК из агароз-Ного геля осуществляли центрифугированием с помощью микроколонки с фильтровальной бумагой, (Маниатис Т. и др.,1984).

Трансформация клеток E.coli: проводили по модифицированному методу Cohen (Cohen S.N. et al., 1972).

Трехродительское скрещивание: проводили как описано в книге (Симаров и др.-, 1990).

Поедгибридизация и ДНК-ДНК гибридизация: перенос ДНК на нит-роцеллюлозные фильтры и блоттинг-гибридизацию проводили по методу Саузерна (Маниатис Т. и др., 1984).

Определение количества пролина: в клетках E.coli и питательной среде осуществляли по методу Бэйтеса (Bates L.S., 1973).

Количество пролина в биомассе сои определяли на Американо-Советско-Индийском Ифк-фурье анализаторе PSCO/ISI IBM-PC 4250 совместного производства фирм Pacific Scientific (США), "М.Т. Экспор" (Индия) и Научно-методический центр по ИФК-спектросколии ВИУА, НПК "ИК-Луч" (Россия).

Условия проведения вегетационного опыта: Описаны метеорологические особенности климата Амурской области и погодные условия в годы проведения исследований.

Проведение полевого опыта: мелкоделяночные опыты закладывалась в селекционном севообороте (предшественник ячмень, агротехника проводилась согласно рекомендациям для южной зоны) при площади питания растений - 45.10 см (согласно методике ВИР). Наблюдения и оценки проводили в соответствии с "Широким унифицированным классификатором СЭВ рода Glycine"(1981) и методическими указаниями по селекции и семеноводству сои (Корсаков Н.И. и др. 1975).

Проведение вегетационного опыта: опыт закладывали и проводили наблюдения за развитием растений и водопотреблением как описано в книгах (Журбицкий З.И., 1968; Посыпанов Г.С., 1991).

Определение вирулентности рекомбинантных штаммов R.fredil осуществляли в микровегетационном опыте по методике, изложенной в статье (Бегун С.А. и др., 1973).

Контроль успешности инокуляции осуществляли путем выделения клубеньковых бактерии у растений в фазу цветения. Бактерии проверяли на устойчивость к антибиотикам и способность расти на селективных средах. Выросшие колонии риэобий проверяли на наличие плаэмиды соответствующей молекулярной массы.

Определение водопотребления растений сои: водопотребление определяли, взвешивая сосуды каждые .3 суток и доводя водой их вес до постоянного, что на момент полива соответствовало влажности 70-80% от полной почвенной влагоемкости (ППВ).

Определение показателей продуктивности растений сои:

Оценку урожайности осуществляли взвешиванием семян и надземной части растения на весах ВЛКТ-500.

Структуру урожая оценивали по следующим параметрам: масса растения, масса бобов, количество бобов в узле, масса семян, количество семян, отношение зерно/солома, количество узлов на главном стебле и на растении. Массу определяли в граммах, количество плодов, семян, узлов в единицах штук.

Определение способности пролиферировать каллус у пыльников сои: осуществляли с помощью разработанного в данной работе метода (Соловьев В.П., Малыш Л.К., 1992)

Методика выделения пыльников: пыльники выделяли у растений сои по методике, разработанной в данной работе (Соловьев В.П., Патент N 1790877 от 14.05.90 МКИ А01Н 1/4, Патент N 1746951 от 09.01.90 МКИ А01Н 1/4)

Проведение математической обработки результатов опыта: Статистическую обработку данных проводили на микро-ЭВМ - "Электроника" МК-52 по Доспехову Б.А. (1985).

Подсчет средней доли образовавшихся каллусов эмбриоидов и растений осуществляли по формуле Ван дер Вардена (Ван дер Варден, 1960).

т+1

Р - х 100%;

п+2

где р - средняя частота события в %•,

ш - число случаев наблюдаемых событий в опыте; п - количество произведенных наблюдений;

Доверительный интервал рассчитывали по формуле, приведенной ■В книге (Варфоломеев С.Д, и др. 1990):

/ Р я ( ;

т = п + 3 05

Р

где р - средняя частота события,в

Я - определяется выражением; q=100-p; п - количество произведенных наблюдений;

Для преобразования к нормальному закону распределения полученных в опыте значений мы использовали эмпирически подобранные нами логарифмические функции (1,2).

У- сЬд (100 1д (1000 (х+1)). (1)

У- 100 1д (1000 (Х+1)). (2)

После проведения дисперсионного анализа преобразованных данных полученные значения средней и границ доверительного интервала

преобразовывали по формулам (3,4), соответственно, для придания им физического содержания.

- 2 t g ( Y )

10

К= 10"3 10-1; (3)

-ZY

-3 10

K= 10 10 - 1; (4)

Для оценки достоверности полученных данных рассчитывался коэффициент (критерий) достоверности F Фишера при р=0.95. После математической обработки с помощью вышеуказанных программ производили обратное преобразование полученного значения средней.и границ доверительного интервала.

Полученные результаты использовали для построения математических моделей,

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. ПЕРЕНОС И ЭКСПРЕССИЯ 0ПЕР0НА proB03mproA

ESHERICHIA COLI В КЛЕТКАХ БАКТЕРИЙ - СИМБИОНТОВ СОИ RHIZOBIUM FREDII

1.1. Отбор наиболее чувствительного к NaCl штамма R.fredii и определение его устойчивости к антибиотикам.

Среди изучаемых штаммов R.fredii наиболее чувствительным к соли оказался штамм BD-32. Он растет на минимальной среде PI без NaCl со скоростью 0,02 генерации в час и со скоростью 0,001 генерации в час в минимальной среде PI, содержащей 0,4 М NaCl. В минимальной среде PI, содержащей 0,8 и 1,0 М NaCl, клетки штамма R.fredii BD-32 не растут совсем. Клетки данного штамма устойчивы к концентрации канамицина 50мкг/мл, тетрациклина 10 мкг/мл и чувствительны к концентрации ампициллина 100 мкг/мл.

1.2. Клонирование оперона proB,smproA в составе вектора рУА 12-2

Для введения в клетки R.fredii BD-32 оперон proBosmproA рек-лонировали из гибридной плаэмиды pNLM, имеющей репликон плаэмиды pSC 101, в вектор с широким кругом хозяев - pVA 12-2; Схема клонирования приведена на рисунке 1.

Получили фрагмент ДНК Eco R1 - Bgl II плаэмиды pNLM и фрагмент ДНК Eco R1 - Ват H I векторной плаэмиды pVA 12-2.

Гибридная плазкида, полученная в результате лигирования данных фрагментов - имеет размер 9,8 т.п.н., содержит фрагмент хромосомы *Е .co'li , кодирующий оперон proBosmproA (размер 3041 п.н.), детерминанту устойчивости к канамицину. Вставка ограничена сайтами рестрикции Pst I и содержит расположенные вне оперона ргоВ03и_ ргоА сайты узнавания рестриктаз Eco R I, Bgl II, Eco 1051 и гибридный сайт Bgl II/Bam H I плохо узнаваемый каждой из рестриктаз (см. рис. 1).

В начале экспериментов по клонированию мы определили, что клетки R.fredii BD-32 обладают большой устойчивостью к канамицину (до 100 мкг/мл) и относительно меньшей устойчивостью к ампициллину (до 50 мАг/kii). В связи с этим, после переноса в клетки R.fredii работа'с'ттла'ЭНйдой pNS, имеющей ТОЛ'ько один маркерный ген устойчивости к канамицину бйЛЬ бы согфЯЛсена со значительными трудностями. Для того, чтобы йх иЗСёжать ны клонировали в составе плаэмиды pNS ген устойчивости К аилйциллину (bla) из плаэмиды pCV 16 (см. рис. 1). Гей b'lfei Ёьф'ё^али с помощью рестриктазы Eco RI и лиГирбвали 'с 'ДЙК пЛ^змиДы pNS, расщепленной с помощью той же рестриктазы.'htoSMHSà 'pNSAR имеет размер 11.6 т.п.н., содержит детерминанты устойчивости к канамицину и ампициллину и оперон proBosmproA (см. рис. 1.).

Аналогичным образом была получена плаэмида pLVAR, содержащая нативный оперон ргоВА. данный оперон получили с помощью рестрикции плаэмиды pLMpro. Плазмиду pLVAR использовали в качестве контроля .

Мобилизационный перенос плаэмид pNSAR и pLVAR осуществляли методом трехродительского скрещивания. В качестве плаэмиды-помощ-ника использовали плазмиду pRK 2013.

ЕеоЯ!

Есо й I

Рис. 1. Клонирование оперона ргоВоетргоА на вектора с пнрокпм кругом хозяев рУА 12-2.

1.3. Характеристика плазниды pNSAR после ее мобилизационного переноса в Rhizobium fredil

После мобилизационного переноса плазмиды pNSAR в клетки R.fredii BD 32 отобрали несколько клонов Арг.и выделили из них плазмидную ДНК. Клетки R.fredii содержат только 1 плазмиду длиной около 12 т.п.н. Плаэмида pNSAR после трансформации в R.fredii сохраняет сайты узнавания рестриктаз Eco 1051 и Eco RI. Анализ плазмид pNSAR и pLVAR, после их переноса в клетки R.fredii, показал, что они сохраняют нативную структуру в этой бактерии.

1.4. Влияние различной концентрации NaCl на скорость роста рекомбинантных бактерий Rhizobium fredii BD-32

Данные о скорости роста-бактерий R.fredii BD 32 дикого типа, а также содержащих плазмиды pNSAR и pLVAR, приведены в таблице 1. Бактерии выращивали в жидкой богатой и минимальной среде Р1 с различной концентрацией NaCl.

Таблица, 1

Скорость роста (гекерация/час) клеток R.fredii штаммов

BD-32, BD-32/PLVAR, BD-32/pNSAR в богатой и минимальной среде Р1 с различной концентрацией NaCl.

Штамм Концентрация NaCl

Богатая среда Р1 Минимальна! среда Р1

без NaCl 0.4 M 0.6 M 0.8 H без NaCl 0.4 M 0.6 M 0.8 M

BD-32 0.062 0.02 не растет не растет 0.02 0.001 не растет не растет

BD-32/PLVAR 1.0 0.8 0.4 0.145 0.076 0.025 не растет не растет

BD-32/pNSAR 1.0 0.8 0.4 0.15 0.09 0.125 0.06 0.01

Из таблицы 1 видно, что в богатой среде скорость роста обоих рекомбинантных штаммов и устойчивость к N801 значительно выше, чем у исходного штамма. Однако в минимальной среде клетки, содержащие плаэмиду рЫЭАК, обладают большей скоростью роста и большей солеустойчивостью, чем клетки, содержащие плаэмиду рЫГАИ.

Таблица 2

Содержание пролина в клетках К.ГгеаП (нМ/мг белка) на среде Р1

Штамм без NaCl с 0.4М NaCl % к исходному штамму

BD-32 4.5±0.3 5.8+0 6 100

BD-32/PLVAR 5.7±0.5 17.1-2 1 305.2

BD-32/pNSAR 7.1±0.4 64.4+4 5 1110.3

Содержание пролина в клетках рекомбинантных штаммов R.fredii выше, чем в в клетках исходного штамма BD-32. Наибольшим содержанием свободного пролина отличаются клетки рекомбинантного штамма - BD-32/pNSAR - 64.4 i 4.5 (нМ/мг белка), что превышает этот показатель у исходного штамма на 1110.3 %.

1.5. Вирулентность рекомбинантных бактерий Rhizobium fredii

В результате проверки полученных рекомбинантных штаммов Rhizobium fredii BD-32/PLVAR и BD-32/pNSAR нами было установлено, что их вирулентность и способность формировать клубеньки на корнях растений сои, несмотря на произведенные генетические перестройки, осталась на уровне исходного штамма - BD-32.

Полученная рекомбинантная плазмида - pNSAR содержит оперон proBosmproA и стабильно наследуется в клетках R. fredii. Это подтверждают данные по гибридизации плазмядной ДНК, выделенной из ризобиальных клеток.

Наблюдения за изменением физиологических функций ннокулированных растений сортов Октябрь-70 и Взлет проводили "в процессе всего периода роста. Обнаружили, что у растений обоих сортов, ннокулированных штаммом BD-32/pNSAR, происходит снижение потребления воды в период созревания и в период, предшествующий цветению. Результаты этих экспериментов для сорта 0ктябрь-70 приведены ка Рис. 2. Аналогичная зависимость была получена для растений сорта Взлет. Сравнение данных на графике показывает, что с 18 по 42 день от начала вегетации, т.е. в период,предшествующий цветению, потребление воды растениями,инокулированными бактериями BD-32/pNSAR, значительно ниже, чем у растений, инокулнроваииых штаммами BD-32 и BD-32/pLVAR. Однако в период цветения и до начапа созревания семян потребление воды у растений, ннокулированных бактериями BD-32/pNSAR, несколько выше, чем у ннокулированных бактериями штаммов BD-32 и BD-32/pLVAR.

Нами было установлено, что суммарный расход воды на единицу урожая у растений, ннокулированных бактериями BD-32/pNSAR, у сорта Взлет на 13.84, а у сорта 0ктябрь-70 на 10.36% ниже, Чем у растений, ннокулированных бактериями BD-32 и BD-32/pLVAR.

П

1? ä

& Г'

Э N 1.«

« 5 " = S

5 h " 5 § „ К

I

4( 11 Н Л Я М 13 JS J5 5 и <7 I Cjot

—— штамм Н&-32 штамм HD-32/pNSAR •»-»шгам ВГУ-32/pLVAR

Рис.2. График водопотреблення растений сои сорта Октябрь 70 ннокулированных штаммами R.fredii BD-32, BD-32/PLVAR, BD-32/pNSAR.

1.7. Влияние инокуляции растений сои сортов Взлрт и 0ктябрь-70 рекомбинантними рпзобиальныни бактериями на структуру урожая

В таблицах 3 и 4 приведены результаты определения урожайности растений сои сортов 0ктябрь-70 и Взлет в зависимости от инокуляции различными итаммами 1*. Гге(ЗН.

Как видно из таблиц, оба сорта дают значительную прибавку урожая после инокуляции растений бактериями штамма ВО-Зг/р^БАИ 4г семян на сосуд и 9г вегетативной массы.

Различия между сортами менее заметны, но достаточно достоверны. Инокуляция растений бактериями с плазкидой В0-32/рЬ\/Аг! не дает им преимуществ по сравнению с бактериями ВО-32 длкого типа.

Данные таблиц 3,4 показывают, что по критерию Фишера различия между показателями урожайности осмоустойчивого сорта Ок-тябрь-70 несущественны, тогда как для относительных значений, выраженных в процентах к среднему, эти различая достоверны, а по каждому варианту близки для урожая семян и надземной массы.

Таблица 3

Урожай с сосуда у осмоустойчивого сорта сои 0ктябрь-70 в зависимости от симбиоза с рекомбинантными штаммами ризобиальных бактерий

N Штамм Урожай семян в сосуде Урожай надземной массы

г X к средн. г % к среднему

1 ВО-32 2 ВО-Зг/рЬУАИ 3 ВО-Зг/рЫБАГ» 21,2410,87 98,26 ±5,72 20,10±0,56 93,03 ±6,73 23,02±2,58 106,28±4,42 35,15±1,55 98,21 ±7,08 32 , 75±1 ,36 93 ,03 ±6,73 38,69±5,30 107,7915,92

Гтабл. Гфакт. НСР 3,5 3,5 2,1 5,4 2,70 8,50 3,5 3,5 2,3 6,3 5,17 7,58

Для сорта Взлет, обладающего пониженной устойчивостью растений к осмотическому стрессу, урожай семян и воздушно-сухой биомассы растений, полученные с сосуда, различаются достоверно по вариантам опыта. А в процентном отношении к среднему значению эти различия еще более существенны. Прибавка урожая семян с сосуда после инокуляции штаммом ВО-зг/рЫБА!* составила 30,3% (110,99-80,68%) или 6,07 г/сосуд (20,53-14,46 г/сосуд), к штамму-аналогу - ВО-32/рГ.УАН и 3. IX (110,99-97,28%) или 2,52г/сосуд (20,53-18,01г/сосуд) в среднем по сравнению с исходным штаммом ВО-32. Для урожая воздушно-сухой массы с сосуда наблюдали несколько иную картину : штамм ВО-зг/р^АЯ превзошел исходный штамм на 4,26 грамм и ВО-32/р1Л'АК на 9,92 г.

Таким образом инокуляция растений сои рекомбинантным штаммом Я.ГгедИ ВО-Зг/рЫБАЯ достоверно повышает урожай у неустойчивого к осмотическим стрессам сорта Взлет. Для осмоустойчивого сорта Октябрь 70 эта тенденция не наблюдается.

Таблица 4

Влияние симбиоза растений с рекомбинантными штаммами ризобиальных бактерий на урожай семян и вегетативной массы с сосуда у осмонеустойчивого сорта сои Взлет

N Штамм Масса семян Вегетативная масса

г % к средн. г 1% к среднему

2 ВО-32 3 ВО-32/р1Л/АИ 4 ВО-Зг/рЫБАЯ 18,0111,78 97,2815,36 14,4612,75 80,68+2,60 20.5312.49 110.9915.98 29,5613,35 98,5015,08 23,9013,21 79,5813,68 33.8213.08 112.7918.54

Гтабл. Гфакт. НСР 4,1 4,1 8,21 51,0 2,88 6,21 4,1 4,1 3,7 28,4 6,34 8,62

По структуре урожая было проведено сравнение растений иноку-лированных различными штаммами бактерий. Сравнение проводили по 9 параметрам (см. методы). Результаты этих исследований приведены в таблицах 5-8. В соответствии с оценкой полученных данных по кри-

терию Фишера можно считать достоверными различия между растениями по следующим показателям: по количеству бобов, по массе семян и их количеству у растений сорта 0ктябрь-70; по массе растения, количеству бобов, количеству семян, количеству узлов у сорта Взлет.

По структуре урожая растений сорта Октябрь 70 (табл.5,6) мы наблюдали результаты, подобные результатам по урожаю семян и воздушно-сухой биомассы с растения у сорта Взлет (табл.3). Различия полученные при оценке влияния разных штаммов R.fredii, использованных для инокуляции сорта Октябрь 70, и оцененные с помощью критерия Фишера не могут быть признаны достоверными.

Для осмочувствительного сорта Взлет (табл.7,8) существенность различий в соответствии с критерием Фишера возрастает. Достоверное превышение показателей растений инокулированных штаммом BD-32/pNSAR получено по массе растения - 17,75г и 15,30г у BD-32, массе бобов и массе семян с растения - 14,14г и 12,22г; 10,26г и 9,00г, соответственно, количеству бобов на растении - 24,25шт. и 20,50шт. Рост урожая происходил в первую оче(5^дь за счет увеличения числа семян, образующихся на растении - 46,00 и 38,25 шт., что в основном происходит за счет большего количества бобов в узле - с 1,18шт. до 1,24шт. и увеличения количества узлов на растении - с 17,50шт. до 19,63 шт.

Таблица 5

Структура урожая сои сорта Октябрь 70 в зависимости от симбиоза с рекомбинантными штаммами Н.Гге<ЗИ

Элемент структуры' урожая одного растения Штамм Критерий Фишера FcJjaKT.

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR

Масса растения (г) бобов (г) семян (г) Отношение эерно/солома 18,47±1,90 17,05-2,60 20,33±3,0б 1,607 14,11+1,72 13.70il.97 15.67il.86 1,233 10.62Í1,18 10.05il.51 11.51+1,62 0,952 1,54 Í0,12 1,59 i0,09 1,48 i0,07 1,570

Влияние симбиоза с рекомбинантными штаммами R.fredii на биометрические показатели сои сорта Октябрь 70

Элемент структуры урожая одного рлстения Штамм Критерий Фишера Гфакт.

BD-32 1 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR

Количество бобов (шт.) бобов в узле (от.) семян (шт.) узлов (шт.) 22,25-2, 35 21,75±3,36 25,13±3,93 1,536 1.26 ±0,13 1,28 ±0,18 1,35 ±0,08 0,544 44,38±7,07 42,25±6,57 49,13±6,96 1,246 18,13±1,75 17,13±2,16 18,63±2,44 0,705

Таблица 7

Структура урожая сои сорта Взлет в зависимости от симбиоза с рекомбинантными штаммами R.fredii

Элемент структуры урожая одного растения Штамм Критерий Фишера Гфакт.

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR

Масса растения (г) бобов (г) семян (г) Отношение зерно/солома 15,30±1,80 12,29±1,60 17,75±3,05 10,033 12,22±1,48 9,48 ±1,39 14,14+2,50 9,915 9,00 ±1,00 7,12 ±1,08 10,26±1,74 8,821 1,54 ±0,12 1,59 ±0,09 1,48 ±0,07 1,569

Влияние симбиоза с рекомбинантными штаммами ¡}.Ггес1П на биометрические показатели сои сорта Взлет

Элемент структуры урожая одного растения Штамм Критерий Фишера Гфахт.

ВО-32 В0-32/р1.УА!* ВО-32/рЫ5АК

Количество бобов (шт.) бобов в узле (шт.) семян (шт.) узлов (шт.) 20,5012,86 15,3812,84 24,2515,06 8,423 1,18 10,15 1,04 10,13 1,24 10,20 3,717 38,2515,12 29,2514,37 46,0Г£3,34 10,575 17,5011,41 14,8811,30 19,6312,52 6,81 3

Повышение урожая у растений сои, инокулированных штаммом ри-зобиальных бактерий ВО-зг/рЫБАЛ, происходит за счет увеличения числа семян на растении, числа бобов в узле и количества узлов на растении.

1.8. Содержание пролина в корнях растений

Определенные нами различия в урожайности инокулированных различными Ьтаммами ризобий растений сои, вероятно, могут быть связаны с большим накоплением свободного пролина в корнях. В связи с этим мы определили концентрацию пролина в корнях (вместе с клубеньками) у инокулированных разными штаммами растений сои по двум изучаемым сортам. Однако мы не обнаружили различий по содержанию пролина между растениями, инокулированными штаммом ВО-32, ВО-32/р1Л/АЯ, ВО-зг/р^АЙ, сортов Взлет и 0ктябрь-70. Концентрация пролина составила около 6 мг/кг сухой массы.

1.9. Влияние инокуляции растений сортов Октябрь - 70 и Взлет ризобиальными бактериями штамма BD-32/pNSAR на формирование андрогенного каллуса

Одним из признаков, свидетельствующих о жизнеспособности растения, является жизнеспособность его семян и генеративных органов. Если предположить, что растение меньше затрачивает энергии на поддержание жизнеобеспечения, то оно будет уделять больше усилий формированию генеративных органов. В связи с этим мы изучили формирование андрогенных каллусов из пыльников сои исследуемых сортов, инокулированных штаммом BD-32 и рекомбинантными штаммами. Результаты исследований показаны в таблицах 9,10. Из приведенных данных видно, что растения обоих сортов дают значительно больше пыльников, способных формировать каллус после инокуляции штаммом BD-32/pNSAR. Однако у осмоустойчивого сорта 0ктябрь-70 процент пыльников, которые формируют каллус, больший чем у сорта Взлет.

Таблица 9

Зависимость доли пыльников сои сорта Октябрь 70, сформировавших каллус, от симбиоза растений с различными штаммами R.fredii

Штамм Высажено пыльников шт. В том числе cd Ьормировало каллус

шт. X

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR 265 23 8,90 13,40 231 42 18,40±5,00 167 38 23,08±6,40

Таким образом нами обнаружено влияние штамма R. fredi i BD-32/pNSAR, после, инокуляции им растений сои, на увеличение способности пыльников пролиферировать каллус в культуре изолированных органов.

Зависимость доли пыльников сорта Вэлот, сформировавших каллус, от симбиоза растений с различными штаммами И-ГгесЗЛ

Штамм Высажено пыльников шт. В том числе сформировало каллус

шт ■

BD-32 BD-32/pLVAR BD-32/pNSAR 251 38 15.4014,50 268 43 16,3014,40 330 67 20.5014,40

Обсуждение

Увеличение скорости роста рекомбинантныхбактерий R. fredi i, содержащих ген ргоВ03-, , как в богатой TY среде, так и в минимальной среде Р1 с NaCl, вероятно связано с деградацией избытка про-лина в глутамат, который, как известно, является осмопротектором ризобий и хорошим источником азота для растений (таблица 1). О том, что рекомбинантные бактерии R. fredii BD-32/pNSA способны к сверхсинтезу пролина говорят данные, приведенные в таблице 2. Имеется прямая зависимость между количеством пролина, синтезируемого бактерией, и ее осмоустойчивостью. Это совпадает с данными, полученными Le Rudulier et al. (1984).

Наличие рекомбинантной плазмиды pNSÁ в клетках R. fvredii BD-32 никак не сказалось на их способности.инфицировать растения сои. Однако/ инокуляция растений бактериями R. fredii BD-32/pLVAR приводила к некоторому снижению образования клубеньков и отставанию в росте на ранних фазах развития растений. Причина этого может заключаться в неэффективной экспрессии оперона дикого типа proBA E.coli в бактероидах. Однако более конкретные выводы можно будет сделать после проведения дополнительных экспериментов.

В последние годы ведется интенсивный поиск взаимосвязи между потреблением воды растением и синтезом пролина. Обнаруженное нами снижение потребления воды растениями сои в результате инокуляции бактериями R. fredii BD-32/pNSAR является несколько неожиданным и

очень интересным (рис.1). Эти данные, безусловно, требуют еще дополнительной статистической проверки, но выявленная тенденция может иметь далеко идущие практические последствия.

Можно предположить, что симбиоз и образование бактероидов требует дополнительного потребления воды растением, а повышенный синтез пролина симбиотическими бактериями компенсирует дополнительное водопотребление.

Эти предположения согласуются с данными, полученными De Fre-yter R. и Gabriel D.W., которые показали, что заражение растений хлопчатника некоторыми вирулентными штаммами Xanthomonas compes-tis приводит к повышению водопотребления (Хвостова В., 1973).

Также о тенденции к повышению урожайности растений сои, ино-кулированных штаммом R. fredii BD-32/pNSAR, можно говорить на основании данных, приведенных в таблицах NN 3-8. Эта тенденция подтверждается статистической обработкой данных. Обнаруженное уже в первых экспериментах влияние ризобиальных бактерий - суперпродуцентов пролина на урожайность растения - симбионта может служить косвенным подтверждением гипотезы о том, что повышенный синтез пролина в бактероидах может приводить к экономии энергетических затрат растения и увеличению его продуктивности.

Согласно модели Kohl et al. (1988) растения сои затрачивают большое количество энергии на синтез пролина, который переносится в бактероиды, где расходуется на синтез НАДФ. Эта модель симбиоза хорошо объясняет полученные нами данные.

Полученные результаты позволяют предположить, преимущество симбиоза растений сои с рекомбинантным штаммом R.fredii BD-32/PNSAR, по сравнению со штаммом дикого типа. Обнаружено влияние штамма BD-32/PNSAR на увеличение урожая семян и массы надземной части растения. Превышение составляет от 9 до 14% (табл.3,4) .

Кроме того, можно предположить положительный эффект влияния штамма BD-32/pNSAR на целый ряд физиологических функций инокули-рованных растений. Причем у сорта Взлет они более заметны по большему числу параметров.

Возможно это связано с тем, что для осмоустойчивого сорта, каким является Октябрь 70, повышение устойчивости к засухе не дает существенных преимуществ в условиях достаточного увлажнения вегетационного опыта. Но для полевого опыта следует ожидать заметной

прибавки урожая от симбиоза с осмоустойчивыми штаммами и для ос-моустойчивых сортов за счет большей эффективности использования фотосинтетически активной радиации (ФАР) не только в период весенне-летней засухи, но и в дни с высокой среднесуточной температурой и пониженной влажностью воздуха.

Таким образом на основе изучения структуры урожая осмоустой-чивого сорта 0ктябрь-70 и осмочувствительного сорта Взлет можно с большой достоверностью утверждать, что использование рекомбннант-кых ризобиальных бактерий с опероном proBas~proA приводит к повышению урожая. При этом наблюдаемое повышение урожая происходит за счет увеличения числа зерен, бобов в узле и повышения числа узлов на растении. Однако, для осмоустойчивого сорта в условиях оптимального увлажнения значения прибавки урожая по величине сопоставимы со значениями размаха изменчивости этого признака. Тогда как для неустойчивого к осмотическому стрессу сорта значения прибавки урожая достоверны.

Относительно отсутствия различий в содержании пролина в корнях растений сои, инокулированных различными штаммами ри-зобий, мы полагаем, что интенсивная деградация пролина в бактероидах не приводит к накоплению заметного пула данной аминокислоты в клубеньках, которую определяли, используя метод МФК-спектроскопии.

Различия в количестве пыльников, сформировавших каллус в культуре изолированных пыльников, мы полагаем, связаны с тем, что имея более мощную систему осмоустойчивости, чем сорт Взлет, растения сорта 0ктябрь-70, с помощью ризобий - суперпродуцентоз пролина, способны создать больший запас полноценных питательных веществ в пыльниках, что способствует их большей жизнеспособности.

Полученные нами результаты подтверждают важную роль пролина в генеративйых органах растений, описанную в литературе (Хохлов и другие, 1970Г. , Russo S., 1974, Guha S., et al., 1964). применительно к растениям культурной сои.

Роль повышенной концентрации эндогенного пролина в бактероидах до настоящего времени не исследована во всех аспектах.

Chien C.I. et al. показали, что повышенный синтез эндогенного пролина в R.leguminosarum не приводит к повышению эффективности инокуляции растений (Chien С.T., et al., 1991). Результаты наших экспериментов подтверждают эти данные, но мы показали, что повышенный синтез пролина в бактериях-симбионтах благоприятно

влияет на ряд физиологических функций растительного организма в процессе его развития.

ВЫВОДЫ

1. Оперон proBosmproA Eschtrichia coli в составе плазмиды pNSAR экспрессируется в клетках Rhizobium fredii и не оказывает влияния на вирулентность и способность формировать клубеньки на корнях сои у рекомбинантных штаммов.

2. Рекомбинантные бактерии R. fredii BD-32/pNSAR осуществляют повышенный синтез пролина и обладают повышенной осмоустойчи-востью.

3. Плазмида pNSAR стабильно поддерживается в клетках как свободноживущих ризобий так и в бактероидах.

4. Экспрессия оперона proB0SnproA Eschtrichia coli в составе плазмиды pNSAR в клетках Rhizobium fredii не оказывает влияния на вирулентность и способность формировать клубеньки на корнях сои у рекомбинантных штаммов.

5. Внесение бактерий R. fredii BD-32/pNSAR в почву одновременно с семенами сои приводит к снижению потребления растениями воды в начале вегетации и снижению расхода воды на единицу урожая .

6. Повышение урожая у растений сои, инокулированных штаммом ризобиальных бактерий BD-32/pNSAR, происходит за счет увеличения числа семян на растении, увеличения числа завязавшихся бобов в узле и количества узлов на растении.

7. Не обнаружено ожидаемых различий по содержанию пролина в корнях между растениями сои, инокулированными штаммами BD-32, BD-32/pLVAR, BD-32/pNSAR, сортов Взлет и 0ктябрь-70.

8. Обнаружено влияние штамма R. fredii BD-32/pNSAR, после инокуляции им растений сои, на увеличение способности пыльников пролиферировать каллус в культуре изолированных органов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Плазмида pNSAR может быть рекомендована для повышения жизнеспособности различных ризобиальных бактерий и, возможно, других промышленно важных бактерий в стрессовых условиях.

2. Бактерии R. fredii штамма BD-32/pNSAR могут быть рекомендованы в качестве бактериального удобрения.

3. Штамм R. fredii BD-32/pNSAR может быть рекомендован для использования в селекционной практике с целью повышения способности пролиферировать каллус у пыльников в культуре изолированных органов.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Соловьев В.П. Получение андрогенного каллуса у сои. Винница,тезисы докладов конф. Винница 15-17 авг. 1990г./ВАСХНИЛ ЮО Укр.НИИ кормов., 1990.- С. 86-87.

2. Соловьев В.П., Тришин М.К. Влияние температурной предобработки растений сои на андрогенез и его моделирование. Новосибирск ,"Приемы повышения продуктивности в соеводстве: сб.науч.тр./ РАСХН СО, ВНИИ сои, 1991.-С. 17-24.

3. Неумывакин Л.В., Соловьев В.П., Дегчсова Т.С., Чернин Л.С., Пируэян Э.С. Экспрессия оперона proBosn proA E.coli в клетках Rhizodium fredii. Пущино, Тезисы докладов IV Всесоюзной науч.конф., Пущино 20-24 янв. 1992г.,С. 148.

4. Неумывакин Л.В., Соловьев В.П. Денисова Т.е., Чернин Л.С., Пирузян Э.С. Повышение жизнеспособности бактерий-симбионтов сои Rhizobium fredii с помощью гетерологичной экспрессии мутант-ного оперона proBosm proA Escherichia coli. Пущино, Тезисы докладов V конф. Российской Федерации Пущино,18-22 мая, 1992г.,С. 32.

5. Неумывакин Л.В., Пирузян Э.С., Соловьев В.П. Получение новой osra-мутации гена proB Escherichia coli: получение, клонирование и использование гена ргоВозп. Тезисы докладов VI съезда ВО-ГИС им. Н.И.Вавилова. Минск, ноябрь 1992г

6. Соловьев В.П., Малыш Л.К. Андрогенез у некоторых сортов сои Амурской селекции. Новосибирск,"Проблемы соеводства на Дальнем Востоке"-:Сб. науч.тр. РАСХН. Дальневост. отд-ние. ВНИИ сои .-1992.- С.3-12.

7. Соловьев В.П. Способ выделения пыльников растений. Патент N 1790877 от 14.05.90г. МКИ А01Н 1/4.

8. Соловьев В.П. Способ выделения пыльников сои. Патент N 1746951 от 09.01.90г. МКИ А01Н 1/4.

9. L.V.Neumivakin, W.Р.Soloviev, L.S.Chernin, М.Е.Gasparian,

N.A.Moseico, R.V.Shahbazjan, E.S.Piruzian. The increase of the viability of simbiotic soy-bean bacteria Rhizobium fredii by heterologous expression of mutant operon proB0S31proA. Monreal Can.-1994,- p.282.-7lhInt.Symp. on the Genetics of Industrial Microorganisms (GJM94).

10. Соловьев В.П. Способ выделения пыльников сои. Патент N 2043016 от 15.11.96 г. МКИ А01Н 1/4.

11. Неумывакин Л.В., Соловьев В.П., Радюкина Н.Л., Мосейко Н.А., Шахбазян Р.В., Чернин Л.С., Пирузян Э.С. Клонирование му-тантного оперона proB0=n proA Escerichia coli и его гетерологич-ная экспрессия в бактериях-симбионтах сои Rhizobium fredii.-ж."Молекулярная генетика микробиология и вирусология".- N 1, 1995г., с.14-21.

12. L.V.Neumivakin, W.Р.Soloviev, А.Sokhansanj, V.A.Tilba, N.A.Moseico, R.V.Shahbazjan i E.S.Piruzian. Increase in osmotole-rance of Rhizobium fredii soy-bean isolate BD32 by the proB proA operon of Escherichia coli. Biochemical znd Biophysical Reserch Communications, Acad. Press, Inc.