Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энергетическое взаимодействие пигмент-белковых комплексов в мутантах зеленой водоросли CHLAMYDOMONAS REINHARDTII

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Энергетическое взаимодействие пигмент-белковых комплексов в мутантах зеленой водоросли CHLAMYDOMONAS REINHARDTII"

РОССШСКАЯ АКАПЕЖ1 КОТ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЕМШ« пч. А.Н. БАХА

на правах рукописи

ХАТЫПОВ РАВИЛЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ

УЛК 577.23 + 577.355

ЭНЕРГЕТИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПИПИЕКГ-БЕЛКОВЫХ ШШИГСОВ В МУТАНТАХ ЗЕЛЕНОЙ ВОДОРОСЛИ СНЬАМПШОШЗ НЕШиВМРП.

аЗ.00.04 - биологическая хтвдя

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискятткз ученой степйпи кюдашата бжологтесгая. наук

Москва - 1392 год.

Работа выполнена в лаборатории фотобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научные руководители:

академик РАН А. А. Красновский

кандидат биологических наук Н. Н. Лебедев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В. В. Климов

кандидат биологических наук В. В. Шубин

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "-----—— 1992г. в 10 ча

на заседании специализированного .совета (К.002.96.01) -присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии А.Н. Баха (Москва, Ленинский проспект 33, корп.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологичес литературы РАН (Москва, Ленинский проспект 33, корп.1)

Автореферат разослан К_ 1992г.

Ученый секретарь .специализированного совета доктор биологических наук:

М. И. МОЛЧАНОВ

'•С '■'■•■ Г- -.?;. '' '

t____

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В процессе фотосинтеза энергия солнечного излучения ¡образуется в энергию химических связей органических соединений, ?орые в дальнейшем используются всеми живыми организмами. Поэтому :ледование механизмов фотосинтеза открывает возможности явления продуктивностью растений и создания искусственных систем (образования солнечной энергии.

Начальная фотофизическая стадия фотосинтеза включает 'лощение света антенным хлорофиллом, миграцию энергии возбуждения ансамблю антенных молекул, разделение и стабилизацию зарядов в шционных центрах. Эти первичные процессы, протекающие за :осекундные времена, привлекают пристальное внимание :ледователей.

Важным явлением, непосредственно отражающим процессы переноса 'ргии в фотосинтетических мембранах, является флуоресценция, ■ухание и возгорание флуоресценции различных спектральных форм фофилла in vivo несет информацию о путях и скорости :пределения энергии возбукдения. Кинетику затухания флуоресценции >актеризуют временем жизни, которое обратно пропорционально сумме X констант скорости дезактивации возбужденных состояний, -тому, зная время жизни флуоресценции in vivo и выделенных ■мент-белковых комплексов, можно решить задачу о путях миграции ргии возбукдения в фотосинтетической антенне и скорости ;ельных этапов процесса.

Однако, решению этого вопроса препятствуют ряд трудностей, вая из них заключается в том, что фотосинтетические мембраны них растений-и зеленых водорослей сложно организованны. Они ючают две фотосистемы, каждая из которых тлеет собственную и иферическую антенну, образованную большим числом полипептидов, ясность организации мембран усугубляется гетерогенностью второй осистемы. И вместе с тем, при определении времени зизнп, ествуют методические ограничения числа разрешимых компонентов ухания в мультиэкспоненциальной кинетике. Это не позволяет означнр идентифицировать кинетические компоненты свечения, надлежащие пигмент-белковым комплексам.

Наконец, затухание флуоресценции выделенных пигмент-белковых плексов нельзя описать одной экспонентой. Это, с одной строш окняет решение поставлено^ задачи, с другой стороны, позволяет снить динамику процессов внутри отдельных комплексов. Известно, при выделении пигмент-белковых, комплексов всегда наблюдается

высвобождение хлорофилла, что свидетельствует о нарушен нативности выделенных комплексов. Если препаративные манипуляц] приводят хотя бы к частичной денатурации белковых глобул, i исследование времени жизни выделенных пигмент-белковых комплекс« недостаточно для понимания процессов, идущих In vivo, потому, ч: даже незначительные изменения расстояний между флуорофорами мож( приводить к существенному изменению времени жизни возбувденш состояний.

Для упрощения наблюдаемой картины используют разные подхода Так измерения при низких температурах способствуют лучше! спектральному разделению свечения за счет сужения спектральн полос. Кроме того, в низкотемпературных условиях практичега отсутствует перенос энергии с низших на высшие уровни энергии меж, ЦБК. Большой вклад в понимание процессов миграции энергии внут] фотосистем дает сравнительный анализ затухания флуоресценщ выделенных ПБК, содержащих различное количество ангенно] хлорофилла на один реакционный центр, что позволяет оцени' скорость миграции с периферических антенных комплексов на яд] фотосистем и процессы связанные с разделением и рекомбинацго зарядов. Однако, характеристики изолированных комплексов нес; информацию только об организации самих комплексов, но ' не расположении и взаимодействии этих комплексов в целой антенне.

В последние годы для упрощения интактной системы нача. использовать мутанты, поскольку генетические . мутации позволя: удалить один из структурных компонентов фотосинтетических мембр, без нарушения целостной естественной мембраны. Использован: мутантов позволяет, с одной стороны, идентифицировать исчезают кинетический компонент с определенным' ПБК, по которому бы, мутация,, а, с другой стороны, наблюдать изменения в затухан флуоресценции мутанта в отсутствии этого комплекса. Однако, д этого необходимо точное знание изменений в составе и структу белков, к которым приводят мутации.

Тем не менее, применяемые подходы не дают однозначного отве на ряд вопросов: сколько кинетических компонентов необходимо д описания процессов миграции энергии in vivo ; между. каки комплексами, в какой последовательности и с какой скорост осуществляется миграция энергии; осуществляется ли миграция энерг между фотосистемами ( spillover ) на уровне ядер фотосистем или уровне периферических светособиракшдх хлорофилл-а/б комплексов; к структурно организованы пигмент-белковые комплексы фотосинтетической единице и как осуществляется регуляц

определения энергии; каковы размеры ассоциатов, образуемых тенными комплексами и др.

Исходя из вышеизложенного в настоящей работе были поставлены едующие задачи:

1. Разработать метод анализа кинетики затухания флуоресценции, зволяшцй определять число компонентов затухания и оценивать ачення шс времени газил.

2. Исследовать врог'т :::пзш1 возбузденны;: состояний цивидуалыгнх ПЕК, находящихся непосредственно в латпвпо" геибрзгз т/тшхтов золэпоИ водорос.п ChlP^aydomoiias reinhardtli.

3. Изучить ir/T.'i перегссз знергпл возиугданзя гагду рагясл шс з мутэптах з сцешть взаикнуп хскалязащпэ lEII з

roci™TGT!Hr?ci:o:"'i чогсуч"* -

гтт иогг,'Л*а. Ргзр-ботгт :.:зтодт::са ?агс:."лглос:даго глз-г-''. кличосжп Trpjn;:x: ч сгпрлэ.г.снл етлоттгсскго zsvcr.Tor-o"-' i орлылх чаете"! (Хдтсс:зт?зт.т1ес:гаго аппарата. СЗпср*/. 13ГГИ0СГС31 ГООДЮРОДГЭСГЬ ПЛ/ОрЗСЦЗРПГ':! IE0 II Л СО II 3 rccTii-TOT:i40C:CGÂ !r.3i:ïpoz:o iT3";:i: клоте::. Псхазсггэ залов !,аттш!та siiepnn: :~}".т/ СЕЗТособттрггг-'п v'd

отлзкегз/:7: тзегшх Сэтсслстс::. T'a осповотт Еолучзштпх. результате? )длопзгл г.'одзль стр7::т7р:*о-оуп::]дюнальго': оргашзгщтт ISÏ э гссзштзтгпосхол :'з:;зр:::з ссгэгсЛ годорал CIiliiTTccr:.:"::; inlir.rlci'..

, Пслуззпгз'з г, тпо'зтэ p.:? : ;собс±гу::т разЕ~:г.ги грз,_стгз.т";::7.'г о ;;pccTpi"cr.n:::;cï :

' r:"-:^, : ■ ■ - ^■ - - ---------1 "г Су'1""' * , ■ : ' " " "

:сс:тнтзтт:чсс::ого згпатзатп з цохоч ргсготтл. От :.:сг"У и".'» гальзовзш ixc'î уотг"оз;:з!"л ггрптаг'тгоз езгз" -г-^-. 'сс1гктзт;гг,"с;:хх в^тгд zsszzzz хгодорэсг;'.! :: зз;;опо:'.зр"зсзг:-итрздзлэнгн энзргхл восбугдегг'л ?з:::д у П2С, прп сос, усствэшЕК светособлошзцгп спзтем п прзебрззоватзлзй сохпечгсЛ рг:гг,

:рэба1щя. Результаты работы била дологшн на ВсзсоззпсЛ '•торввцта "Структурная ¿щпюгчикз. биойогичвекпе шкбрш" (!'л±:сг., 3), Всесоюзно,! коЕфзрэвдптг "Шрвичнно процессы фотосинтеза и анпзг,и их регуляции" (Ужгород, 1988), Всесоюзной конузрэнцк: ^образование световой энергии в фотоспнтезирущих системах л их ■0лях" (Пужако, 19S9), изпдународном сяшгозпуш "Г/олзгсуллрная шшзация биологических Структур" (Москва, 1S39), 11 дународном конгрессе по фотосинтезу (Стокгольм, 1939). Ш^ЁШ^. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных

работ.

Сщуктща_работыл Работа состоит из введения, обзора литература методической части, четырех глав экспериментальных результатоЕ заключения, выводов и списка использованной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ -

В работе использованы фотосинтетические мутанты одноклеточно зеленой водоросли CMamycLomonas reinharltli, полученные в ИПФС Рt В.Г. Ладыгиным и др. (1983г) в результате воздействия у-излучения дозе 20 кР и УФ облучения дозой 600 Дж.м-2 на клетки штамма 137 дикого типа K(-t-) или К(-) (где K-контроль, а знак отражает полову принадлежность клеток).

.Штамы мутантов водоросли выращивали в стерильных условиях чашках Петри на твердой ацетатной среде, содержащей: 2% агаре набор микроэлементов, 0.1М фосфатный буфер, pH 6.8, 1.36*10-* ацетата натрия и раствор Бейеринка, содержащий 3.75*10~3М Ш^сл 8.11 *Ю_5М ligS04 и 6.79*10_4М СаС12 [Ладыгин, 1983], под ртутнс лампой (ДРЛ-125), при температуре 21-22°С. Интенсивность света щ выращивании дикого типа К(+) и фотосингезирующего мутанта SS-1C составляла 3000 люкс, а для нефотосинтезирующих мутантов - 10С люкс. Продолжительность культивирования колоний в режиме 12 че свет : 12 час темнота была 4-5 дней.

Измерение спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценцЕ проводили на установке, собранной в нашей лаборатории (Лебедев др.,1985) и содержащей два светосильных монохроматора ВДР-2 фотоэлектрическую систему регистрации с ФЭУ-79 (фотокатод С-1). качестве источника возбуждающего света использовали галогенову лампу накаливания КГМ-100. Для коррекции спектров и получеш спектров второй производной использовали приставку DCSU-(Perkin-Elmer.USA). Для измерения спектров флуоресценции клетк осаждали на мембранном фильтре (Synpor,4CCP) с диаметром пс 1.5мкм, который примораживали к держателю из органического стекла погружали в жидкий азот.

Разложение низкотемпературных спектров флуоресценции е гауссовы компоненты осуществляли на персональном компьютере IE PC/XT. Критерием удачного приближения служил минимум сум\ квадратов отклонений экспериментальной и рассчитанной кривой.

Затухание флуоресценции регистрировали на лазернном импульснс флуориметре IIF-200 (разработанном в Центре научног приборостроения АН ГДР.) Кинетические кривые записывали е двухкоординатном самописце и вводили в память ЭЕ

лектроника-бОМ".

При измерении кинетики затухания флуоресценции ■ образец носили тонким слоем на держатель из оргстекла и замораживали до шературы жидкого азота (77К).

Для расчета кинетики затухания флуоресценции с учетом стельности возбуждающего импульса была адаптированна программа EWS, созданная Phillips и O'Connor в 1984 году и использующая год обратной свертки. Критерием прекращения счета в программе ^зкила либо малая скорость изменения функции х2 ( Ах2 < Ю-6), 5о достижение заданного числа итераций. Если число кинетических яюнентов в исследуемой кинетике не превышает трех, то программа 3WS дает приближение значений времени жизни с точностью до 0.01 . Однако, при большем числе компонентов затухания происходит зеднение значений времени жизни.

Для определения числа компонентов затухания- нами предложен гад сканирующего отрезка. Основная идея метода заключается в том, з в кинетике одновременно протекающих процессов вклад разных ионентов в каждый момент времени определяется их временем кизш. первые моменты времени свой максимальный вклад проявляют тпоненты с коротким временем жизни, при этом суммарное среднее ¡мя зхизни будет принимать значения, близкие к времени визни юткоживущих компонентов, поскольку, долгозшзущие компоненты »являются в виде "фонового свечения; в более поздние моменты мерное среднее время зшзни будет совпадать с временем кизнп [гозкивущих компонентов, поскольку быстрые компоненты успевают иостью дезактивироваться. Таким образом, гашетическиз компоненты несены во времени. При измерении "мгновенного" времени гзгзни на езке эти компоненты могут быть выделешш в виде перегибов л .то на функции времени кззеп.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ CLAMYDOMOWAS REIKHA11DTII.

При использовании фотосинтетических мутантов для исследования цессов миграции энергии необходимо ясно представлять природу ации. Для этого необходимо ответить на три основных вопроса: лько ПБК содерэкит мутант? Есть ли ПЕК с измененными свойства?!!!? енилось ли микроокружение молекул антенного хлорофилла внутри ? На первые два вопроса дает ответ разделение ПВК мутантов одом SDS PAGE, на третий вопрос - анализ низкотемпературных ктров флуоресценции и поглощения клеток мутантов и выделенных . Поэтому в данном разделе работы мы провели детальный анализ

спектров поглощения, излучения и возбуждения флуоресценции цель клеток различных мутантов водоросли и сопоставление их со спектрам изолированных из них ПБК.

В соответствии с общепринятыми представлениями низкотемпературном спектре флуоресценции клеток дикого тиг наблюдаются полосы при 680 нм (IHC II), 68G и 697 нм (СС II) и пр 715 нм (LHG I и СС I). Выделенные методой SDS PAGE из мембран, ПЕ разделяются по подвижности на семь зон. Величина относительных Мл,: и спектры флуоресценции выделенных ПБК позволяют идентпфицирозат их с СРО, СР1, LH1, LII2, СРа, LH3 и свободным хлорофиллом.

Измерение низкотемпературных спектров флуоресценции путайте показало, что в спектре флуоресценции мутанта VP5 тлеются пакспыут.' при 681 и 70S ш. При элзклрофорзтпческом разделении ПБК у мутант YT5 наблюдаются глазные гхолосн в области СРО, LK1, ЪК2, IH3 дотвьыо интенсивная полоса с влектрофорвикескоК подвпнность аналогпчыок СРа. Однако, спектр флуоресценции етон последней: полос по отличается от спектров флуоресценции Ш1, IH2 п IH3 г. по-г.икгжу, она isicse пранадсешт одному из Ш. /.ыалогичнув полос i:a:. удалось зарегистрировать при электрофорезе ПБК клеток дыког i.ju. Кизкотегяюратуршй спектр йлуоресцвнцда плеток мутанта YF5-1 подобен спектру флуоресценции выделенного светособираюцзг хлорзатилл-а/б комплекса (LHCF2). Исчезновение в нем интенсивно LiLTOKoi; полосы при 703 п.; указывает на отсутствие в клетках мутант высокомолекулярного комхлекса СРО. Эти результаты согласуются дашыап об отсутствии фотохш-пческои екткшосш обакх фотосистем мутантов VF5 и VT5-16 [Ладыгин 1S851.

Г слздукцзк группы мутантов (SS107 п ASS66) было показав отсутствие загарофалкв-б п ПБК СРО, Ш, IE2 и ШЗ [Ладигш 1985]. мутанта SS107 наблюдается фотохимическая активность обег фотосистем, а у мутанта ASS65 - только фотохпгическая активном ®02. В нЕзкотенпературнои спектре флуоресценции мутанта SS1 с наблюдаются полосы DC2 при 68S и 69? км к сирокая полоса CGI щ 720 ел. Проведенные нами измерения подтвердили эти характеристик!: При электрофоретпческом разделении ПЕК мутанта SS107 наблвдаютс полосы в области СР1 и СРа. Кроме того, наблюдается слабая полоса геле на месте LH2, однако, спектры флуоресценции и возбукдеш: флуоресценции этой полосы аналогична спектрам СРа, что по-впдимовд свидетельствует о ее принадлекности ассоциатам СРа. низкотемпературном спектре флуоресценции мутанта ASS66 доминпру;: две узкие полосы при 686 и 697 нм, имеющие соотнозеш штенсивностей 686/697 характерное для ядра ®С2.

Таким образом, сопоставление спектров флуоресценции клеток утантов и изолированных ЛБК показывает, что мутанты УТ5 и УГ5-16 ишены ПБК СР1 и СРа, мутант УТ5 содержит два типа светособирающих омплексов: шс И и шо I, а мутант тте-чб, полученный из в

езультате УФ облучения, лшлен также высокомолекулярного ХНО, злучающего широкую полосу флуоресценции в области 706 нм, и одержит только шс II. Мутанты 53107 и АББбб полностью лишены ериферических хлорофилл-а/б комплексов, мутант 33107 содержит ядра беих фотосистем СС II и СС I, а мутант АБЗбб - только ядро отосистемы-2 СС II.

. КИНЕТИКА ЗАТУХАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ СВЕТОСОБИРАЮЩИХ ХЛОРОФИЛЛ-А/Б ОМГШЕКСОЗ В КЛЕТКАХ МУТАНТОВ СЬАМтаоМОСТАЗ МИШАМЯИ.

А. ЬНС II В МУТАНТЕ ГВ5-1&.

Кинетику затухания низкотемпературной флуоресценции ветособирашцего хлорофилл-а/б комплекса фотосистемы-2 (ШС II) в летках мутанта 7?5-!б разлагали на сумму экспоненциальных омпонентов двумя методами: методом обратной свертит и определением начений мгновенного времени жизни на отрезке. Оба метода показали, то интегральное затухание флуоресценции клеток мутанта \Т5-1б писывается суммой четырех экспонент с временами жизни 40-80, 00-500, 1350 и 3100 ПС.

Из них первый компонент с временем жизни 40-80пс удалось азрешить методом сканирующего отрезка при регистрации на начальном частке затухания (4нс) с малым шагом (20пс). Этот компонент аскируется при анализе методом обратной свертки, так как при изкоинтенсивном возбуждении он вносит менее 3% в общий выход луоресценции клеток. Из того факта, что время жизни и амплитуда эмпонента не проявляют зависимости от интенсивности возбуждающего вета и максимум его свечения смещен в область 670 нм мы заключили, то он отражает процессы миграции энергии внутри мономеров шс II. то заключение подтверждается тем, что в изолированных из мембран эномерах шс и процессы переноса энергии возбуждения с лорофилла-б на хлорофилл-а и между разными спектральными формами лорофилла-а протекают с соизмеримой скоростью [йНЬго а1. Э88].

Второй компонент с временем жизни 300-500 пс отсутствует в шетике затухания флуоресценции клеток мутанта при низкой ятенсивности возбуждающего света. Он возникает только при атенсивности возбуждающего света больше 10э фотон/импульс. Рост го амплитуды относительно амплитуд других кинетических компонентов

при дальнейшем увеличении интенсивности возбуждающего свет позволяет заключить, что он отражает процессы экситоннс аннигиляции в ансамблях молекул антенного хлорофилла.

Два долгоживущих компонента с временами жизни 1.4 не и 3.1 ь доминируют в кинетике затухания при низкой интенсивное! возбуждающего света (10Э фотон/импульс) и имеют приблизителы равный квантовый выход. Сопоставление значений времени жизни эта компонентов с литературными данными показывает, что такие s значения времени жизни проявляют выделенные из мембраны мономе (3.1-3.3 не) и агрегат (1.1-1.4 не) LHCP II [Nordlmd, Knox 1981 Ide et al. 1987; Hodges et al. 1987; Eals et al. 1987; Gilbro e al. 1988.]- По-видимому, эти два типа комплексов LHC II присутству! в фотосинтетической мембране мутанта.

Разложение низкотемпературного спектра флуоресценции мутант на гауссовы компоненты показывает, что кроме узкой (11 нм) пало< при 680 нм существенный вклад вносит также широкая (23 нм) поло( при G87 нм. Площади этих двух доминирующих полос (рассчитанные i произведения амплитуды на полуширину)' приблизительно равш S680:S687=1,1:1, что' находится в соответствии с соотношение квантовых выходов двух долгоживущих кошонентов затухани; Увеличение относительного вклада долгоживущего компонента длинноволновой области спектра позволяет предположить, что i.3 : компонент излучает в области 680 нм, а 3.1 но компонент - в облас 687 нм. Однако, такое спектральное разделение кинетическ компонентов противоречит тому факту, что спектры флуоресценции мономера, и.агрегата LHCP2, биохимически выделенных из мембра подобны спектру флуоресценции мутанта "№5-16 и имеют максимум области 681 нм.

Таким образом, проведенные исследования кинетики затухан флуоресценции клеток мутанта VF5--16 показали, что ънс II находит в нативной мембране в виде двух типов комплексов шс I флуоресгцдэующих с разным временем жизни.

Б. IHC I В МУТАЕГЕ VT5•

Как следует из анализа спектров мутантов и изолированных Г длинноволновое свечение при 706 нм принадлежит IHC I. Примене! метода сканирующего отрезка (регистрация 16 не, отрезок 2 не, d 0.4 не) показало, что при интенсивности возбуждающего света 1С фотон/импульс значения мгновенного времени жизни на отрег практически не изменяются на всем интервале регистрации колеблются в области 2.7-2.9 не. Это позволяет сделать вывод

дноэкспоненциальном характере затухания длинноволновой полосы луоресценции. Этот вывод подтверждается и тем фактом, что в изкоинтенсивных условиях, при любых заданных начальных параметрах ри разложении на сушу двух экспонент наблюдаются одинаковые начения времени жизни компонентов. При увеличении интенсивности озбуждаюцего света до 101! фотон/импульс для описания кривых ребуется дополнительный кинетический компонент,- о чем видетельствует уменьшение значений мгновенного времени жизни на грезке. Наблюдаются по крайней мере два плато: при 0.5-1.5 и 2.6 с. Кроме того, из того факта, что при малом шаге регистрации етодом сканирующего отрезка наблюдается уменьшение времени жизни в ачальные моменты времени следует возможное наличие быстрого ШОпс оппонента, квантовый еыход которого не превышает 3%.

Апроксимация экспериментальных кривых суммой двух экспонент ает компоненты с временами жизни 1.21 и 2.57 не. Таким образом, ри высоких значениях интенсивности возбуждающего света у мутанта р5 в области свечения >700 нм так ке, как и у мутанта тр5-16, эявляется дополнительный компонент, амплитуда которого растет с эстом интенсивности возбуждающего света. Однако, появление этого эроткоживущего компонента затухания наблюдается при более высоких яачениях интенсивности возбуждающего света, чем для ьнс II в утанте УР5-1б. Поскольку интенсивность возбуждающего света при эторой начинается синглег-синглетная аннигиляция увеличивается с иеныпением размеров комплексов это, по-видимому, означает, что азмеры агрегатов ЬНС I меньше агрегатов ЬНС II. Обращает на себя нимание, что время жизни переменного компонента у ЬНС I (0.8-1.4 с) существенно больше, чем у агрегатов ЬНС II (0.3-0.5 не), яеныпение вероятности аннигиляции может быть связано как с элыпими расстояниями между молекулами антенного хлорофилла, так и более хаотичной организацией агрегата. Таким образом, проведенный зализ позволяет заключить, что ЬНС I находится в фотосинтетической змбране в виде агрегата, флуоресцирующего в отсутствии других шов комплексов с временем жизни 2.8 не, и имеющего несколько эныше размеры, чем агрегаты ьнс II.

. КИНЕТИКА ЗАТУХАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ЯДРА ФС2 (СС II) И ЯДРА ФС1 ЗС I) В КЛЕТКАХ МУТАНТОВ СНЬДМУБОМОГТАБ КЕ1ШАЮШ1.

А. СО II В МУТАНТЕ АЗБбб.

Кинетика затухания флуоресценции клеток мутанта АББбб, цаптированных к темноте описывается суммой трех экспонент с ременами жизни 0.04-0.06, 1.1-1.6 и 3.5-4.5 не.

Как известно, 'длительность затухания флуоресценции ФС2 существенно зависит от состояния РЦ [Климов, Красновский 1982]. Поэтому мы провели исследование- влияния ингибиторов электронного транспорта на кинетикуЧзэтухания флуоресценции мутанта ASS66. Оказалось, что добавление к суспензии клеток мутанта dcmu на свету, блокирующего перенос электрона на уровне первичного хинонного акцептора Qa, не вызывает, изменения средней длительности затухания флуоресценции, а такяе. значений времени жизни и соотношения амплитуд компонентов ■ затухания, по сравнению с образцом, адаптированным к темноте. Это позволяет' заключить, что в низкотемпературных условиях РЦ ФС2 находятся в закрытом состоянии, по-видимому, необратимо закрываясь- под действием возбуждающего флуоресценцию света.

Для исследования природы компонентов затухания флуоресценции этого мутанта мы изменяли окислительно-восстановительный потенциад среды добавлением дитионита натрия на свету и в темноте. В первои случае мы наблюдали уменьшение амплитуд двух долгоживущих компонентов (1.1-1.6 не и 3.5-4.5 не) относительно амплитудь быстрого (35-1ООпс) компонента. Во втором случае время жизш быстрого компонента увеличивалось от 35-1ООпс • до 700-800пс. Сопоставление этих результатов с затуханием флуоресценции ядра ФС£ при блокированном электронном транспорте dcmu ( состояние Р680"1 Ph.eo Qa") позволяет заключить,, что быстрый компонент затухание отражает процессы, протекающие в антенне, в то время, кш долгокивущие комцоненты, по-видимому, обусловлены процессам! рекомбинации зарядов, разделенных под действием света в РЦ.

При увеличении интенсивности возбуждающего света длительност] затухания флуоресценции ядра ФС2 в мутанте ASS66 уменьшаете: вследствие роста амплитуды быстрого 35-1ООпс ' компонента. Из тог< факта, что значение времени жизни аннигиляционного компонента н; порядок меньше времени жизни аналогичного компонента в кинетик затухания флуоресценции агрегата то и и увеличение амплитуды ( два раза) при увеличении , интенсивности возбуждающего света н порядок меньше соответствующего увеличения амплитуды для агрегат LHC II можно заключить, что размеры ядра ФС2 примерно на порядо меньше размеров антенных доменов 1НС II.

Кинетические компоненты с временами жизни 0.04-0.06 не 1.1-1.6 не и 3.5-4.5 не при интегральной регистрации имею соотношение квантовых выходов 1:2,8:2,1. Для идентификации эти компонентов с максимумами свечения мы измерили затухани флуоресценции клеток мутанта в области 680, 690 и 720 нм

[еленных интерференционными светофильтрами. Оказалось, что по отношению амплитуд быстрый компонент локализован в области G90 средний компонент смещен в коротковолновую область, а ггоживущий компонент смещен в длинноволновую область. О другой >роны, разложение спектра флуоресценции мутанта на гауссовы тоненты выявляет три основных полосы с максимумами в области 687 697 нм (узкая) И'698'нм (широкая), площади которых, расчитанные произведения амплитуды на полуширину, соотносятся как 3:1:2, что юшо согласуется как с соотношением квантовых выходов компонентов ?ухания флуоресценции при интегральной регистрации, так и с ¡ульгатами распределения кинетических компонентов в выделенных сих спектральных областях. Таким образом, ядерный комплекс ФС2 в ¡тках мутанта ASS66 представляется в виде> двух типов антенных галексов, флуоресцирующих при 687 и 698 нм с временами жизни 1-1.6 и 3.5-4.5 не, соответственно. Быстрый компонент при 697 нм эажает перенос энергии на РЦ с ближайших молекул антенного зрофилла.

Б. СОД В МУТАНТЕ SS107. Как известно, ядро ФС1 имеет широкую полосу флуоресценции в пасти 720 нм. Сравнительный анализ спектров флуоресценции гантов ASS66 и SS107 показал, что в области свечения ФС 2 в ганте SS107 появилась дополнительная низкоинтенсивная полоса при О нм и увеличилась интенсивность узкой полосы при 697 нм. едовательно, кроме широкой полосы в области 720 нм ядру ФС1 могут инадлежать низкоинтенсивная узкая полоса в области 680 нм и лоса при 697 нм.

Из всех исследованных типов комплексов ядро ФС1 имеет именьшую среднюю длительность затухания флуоресценции. Как казало разложение кинетических кривых затухание флуоресценции в ласти больше 70Q нм удовлетворительно описывается суммой двух спонент с временами жизни 0.1-0.2 и 1.-1.1 не с соотношением плитуд 2:1. При увеличении интенсивности возбуждающего света, так как для ядра ФС2, наблюдается увеличение амплитуды быстрого мпонента затухания. В области 680 нм основной вклад в кинетику тухания флуоресценции вносит быстрый компонент с временем жизни !-40пс.

Эти результаты соответствуют модели, которая содержит два пула [тенного хлорофилла F680 нм и F720 нм и фотохимическую ловушку 00. Если эффективность реакции захвата р700-р700+ уменьшается при геныпении температуры, то возбуждения, возникающие в ближайших к

ловушке антенных молекулах хлорофилла, которые при комнатнс температуре должны быть захвачены, отклоняются к 1720 нм, ч; приводит к увеличению интенсивности этой длинноволновой полосы.

4. МИГРАЦИЯ ЭНЕРГИИ ВОЗБУЖДЕНИЯ МЕЗДУ ПБК В МУТАНТАХ, СОДЕРЖАЩИХ ПОПАРНЫЕ КОМБИНАЦИИ ПБК.

A. LHC II В ПРИСУТСТВИИ LHC I В МУТАНТЕ VP5-Для обнаружения каналов миграции энергии между LHC II и ьнс мы сопоставили кинетику затухания LHC II в мутанте YF5 присутствии высокомолекулярного светособирающего комплекса ьнс I) в мутанте VF5-1б (в отсутствии всех других типов ПБК ).

Сопоставление экспериментальных кинетических кривых затухай флуоресценции в мутантах YF5 и VT5-16, измеренных в одинаков! условиях в области 680 нм, показало, что они практически совпадаю1: Разложение кинетики затухания флуоресценции ънс II в мутанте VF5 i сумму экспонент дает значения времени жизни компонентов соотношения их амплитуд такие же, как в мутанте YF5-16. Кроме тоге сканирование отрезком (2 не, шаг 0.4 не) кинетических кривых LHC ] в мутанте YF5 показывает, что значения "мгновенного" времени жизг на отрезке изменяются так же, как в мутанте VF5-16 в аналогичш условиях. Эти факты . позволяют заключить, что наличие фотосинтетической мембране ьнс I не оказывает влияния i длительность затухания флуоресценции lhc ii, и, следовательно,! отсутствие миграции энергии, по крайней мэре, между проявляющими по флуоресценции комплексов LHC II и ьнс I. Однако, это i исключает возможности вхождения части комплексов ШС II в состе ШС I или образования очень плотных ассоциатов между ниш приводящего к полному тушению флуоресценции этой части комплексе ШС II.

Б. СО II В ПРИСУТСТВИИ CG I В МУТАНТЕ SS107? Если в мутанте ASS66 средняя длительность затухаш флуоресценции СС II ФС2 достигает 3 не, то в присутствии сс I ФС в мутанте SS107 средняя длительность затухания флуоресценции ящ: ФС2 уменьшается до 0.6-0.8 не и становится соизмеримой длительностью затухания ФС1 (0.8-0.9 не). Как показало разложеш кинетических кривых, такое уменьшение длительности затухаш обусловлено отсутствием наиболее долгоживущего компонента временем жизни 3.5-4.5 не в кинетике затухания флуоресценции СС ] в присутствии сс I . Таким образом, затухание флуоресценции СС II мутанте SS107 стало двухэкспоненциальным с временами жизни 0.1 не

1.1 нс. Эти значения времени жизни близки к значениям быстрого и зднего компонентов затухания флуоресценции сс II- в мутанте АБЗбб. другой стороны, эти значения времени жизни такие же, как шоненты затухания флуоресценции СС I. Поэтому пока нельзя злать однозй&чный вывод о миграции энергии между комплексами, *ако не исключено, что наблюдаемые изменения связаны с наличием рективного переноса энергии со всех долговдвущих частиц сс и на I, в то время, как частицы с меньшим временем жизни 1.1-1.6 нс эргию возбуждения на сс I не переносят.

Для экспериментальной оценки относительных размеров ансамблей

аимодействуюцих пигментов, образуемых светособирающими

эрофилл-а/б комплексами и ядрами фотосистем, исследовали

висимость квантового выхода флуоресценции мутантов от

Ч 1 я

тенсивности возбуждающиго света в диапазоне от 10 до 10 тон/импульс.

Полученные результаты показали, что кривые зависимости антового выхода флуоресценции ьнс и и то I практически впадают, в то время, как для тушения флуоресценции ядер тосистем требуется плотность возбуждающего света примерно на рядок большая, чем для, ънср. Эти факты свидетельствуют, что етособирающие хлорофилл-а/б комплексы шс II и ьнс I образуют в тосинтетической мембране больше ансамбли взаимодействующих лекул антенного хлорофилла, содержащие примерно на порядок больше орофилла, чем ядра фотосистем сс II и сс I. Причем появление полнительного короткоживущего аннигиляционного компонента в нетике затухания флуоресценции ьнс и при более низких значениях тенсивности возбуждающиго света, чем для ьнс I, свидетельствует о м, что размеры доменов ьнс и несколько больше размеров доменов с I. Различий в размерах ассоциатов связанного хлорофилла в ядрах тосистем нам обнаружить не удалось.

ЗЖ/ЮЧЕШЕ.

В таблице 1 представлены усредненные значения времени жизни [уоресценции пигмент-белковых комплексов в мутантах зеленой доросли СЫатуйотопаз ге!п1гагс11;11.

Развитое в предыдущих разделах представление о четырех 'нкционально различающихся типах антенных комплексов можно уложить рамки структурно-функциональной модели организации целой антенны >Леной водоросли СЫату&отопаБ геиЛагсИ;!!.

ТАБЛИЦА I. Компоненты затухания низкотемпературной флуоресценц мутантов СЫашуйотопав ге!пЬагс1и1..

МУТАНТ КОМПЛЕКС Д___(нм) ТАУЦпс) ТАУ2(нс) ТАУЗ(нс) ТАУ4(нс)

^5-16 1НС11 680 <100 0.3-0.5* 1.3-1.5 3.-3.2

<100 0.3-0.5* 1.3-1.5 3.-3.2 <100 0.8-1.2* 2.6-2.9

УР5 ЬНС II 680 ЬНС I 705

АББ-бб СС II 690

55-107 СС II 690 СС I 680 720

60

150

30 0.2 100** 0.2

1.2-1.7 3.5-4.5

0.9-1.

1.-1.1

* - только при высокой плотности возбузздающего света;

** - компонент нарастания.

5С2 в тилаковдной мембране представлена комплексом ядра СС и сЕетособирающим хлорофилл-а/б комплексом ЬНС II. В спектр флуоресценции целых клеток две интенсивные полосы при 686 и 697 принадлежат ядру ФС2, в то время, как- ЬНС II, который в выделенн состоянии излучает флуоресценцию при 680 нм, практически не свети хотя этому комплексу принадлежит более половины всего хлорофил фотосинтетических мембран. Эффективное тушение флуоресценции эте комплекса обусловлено наличием мощного необратимого канала миграг энергии с ЬНС II на СС II. Известно, что ядро ФС2 не содерн хлорофилла-б. Действительно, наши измерения показали, что мутантов, лишенных комплексов ън (мутанты АББбб и ббю?), спектрах возбуждения полос при 686 и 697 нм отсутствует максиь при 475 нм, принадлежащий хлорофиллу-б. Однако, из того факта, ч в спектрах возбуждения полос ФС2 в клетках дикого типа наблюдав! интенсивная полоса поглощения хлорофилла-б при 475 нм, моя заключить наличие миграции энергии с хлорофилл-б-содержаще комплекса на ядро ФС2. При выделении частиц ФС2 полоса хлорофиллг сохраняется. Это свидетельствует, что ьнс II структурно связан с II в мембране. В спектрах флуоресценции мутанта, лишенного ядра С (мутант А55-8) ьнс II полностью потушен ядром ФС2, следовательно, этот комплекс переносит анергию преимущественно ФС2, а не на ФС1.

ФС1 в нативной мембране включает ядерный комплекс со I

зтособирающий хлорофилл-а/б комплекс LHC I. В спектрах уоресценции клеток дикого Tima ФС1 принадлежит широкая полоса при 5 нм, которая образована суперпозицией двух полос с максимумами в ласти 705 (LHC I) и 720 (СС I) нм. Наличие интенсивной уоресценции LH с I в целых клетках наводит на мысль об отсутствии Активной миграции энергии с этого комплекса на со I в зкотекпературных условиях. На отсутствие миграции энергии азпвает и тот факт, что значения времени кизни флуоресценщш LHC i СС I существенно различаются. Однако, сопоставлеш;е 'спектров ■бугадения флуоресценции изолированного ядра ФС1 (СР1 ) и полосы : 720 нп в клетках дикого ша показывает, что в первом случае в зктре отсутствует паксимум, прянадлезсЕций хлорофиллу-б, а во :pc:i случае наблшшется интенсивная полоса при 475 нм. хадяегедая хлорошллу-б. Это свидетельствует о том, что на тглэкс сс I в пгтпвко!! гембране осуществляется перенос энергии с зрофщш-б-содзрг®2вго ксг.ялэкса. В спектре флуоресценции мутанта, генного ядра ('02 (гутант Л55-8) свечение при 7G5 км очень "ьпсе, значительно интенсивнее, че.ч в клетках дгясого типа, есхэдсте::о того, что, по крайней мерз часть кс:лхзксов : I г тслзтксх дикого типе. переносит энергии на сс X.

Кет. i^BecTiio, кегдг двумя фотоскстеманп Еозмо;:;ен перенос :рггл ¡юзбгуфшт. Так о!: перенос ,г.'о::ет осуществляться либо, на сезтосоСпрскцлх кс:ишн:ссв-ЬНС II п ШС I, JHÖO ка уровне :р сзтоспсто:: сс II и сс I. Сопоставление спектров Еозбуздения :ос GS0 и 7G5 ял, щглгадлезгеях L5C II и шс I соответственно, в ;тках нутента бзз ядер обеих гТотоснстем ( мутант VF5) погазало, : в спэктрэ возбуждения IHG I наблюдаются все максимумы, тахпе как в спектра возбуждения шс II, по не наоборот. Зто не хзчает всзчолюсп: ноправлзпого перэноса знэрпш с ъкс II на ькс хотя ;-:ог:ет быть обусловлено одинаковой структурной организацией :тавных частей этих двух комплексов. Креме того, слабая 'енсивность евзчения ыю II (полоса при 680 ш проявляется в виде юткоеолнового плеча) тагс::е указывает на возможность . ютрации рпш. Однако, в спектре флуоресценщш мутила, лишенного ядра ; (мутант лпо-38) IHC II интенсивно СЕеткт, что ставит под нэнке возг.'оаюсть гаграцкп энергии с ькс II как на Die i, так к сс I. Hann измерения времени ::ai3im флуоресценции показали, что телыюсть затухания флуоресценции ЬНС II не изменяется в оутствии ЬНС I в клетках мутанта VF5, что указывает на утстЕие переноса энергии с флуоресцирующих ЬНС II на ЬНС I. ако, нельзя исключить возможность мигращш энергии с мономеров

ьнс и на шс I, поскольку времена жизни флуоресценции эти комплексов близки.

У мутанта, содержащего только ядра фотосистем (мутант 33107) мы сопоставили спектры возбуждения полос флуоресценции принадлежащих ФС2 (686 и 697 нм) и ФС1 (720 нм). Оказалось, чт< если в спектрах возбуждения ФС2 наблюдается максимум при 543 нм принадлежащий феофитину реакционных центров ФС2, то в спектр' возбуждения ФС1 такой максимум феофитина отсутствует. Это указывав на отсутствие миграции энергии с ядра ФС2 на ядро ФС1 в мутанте Известно, что концентрация ядер фотосистем в нативной мембран примерно одинаковая. В спектре флуоресценции мутанта збю интенсивность полос, принадлежащих ФС2 соизмерима с интенсивность: полосы ФС1, что также говорит в пользу отсутствия миграции энерги между ядрами фотосистем. Однако, как показали наш измерения ядр ФС2 представлено в фотосинтетической мембране в виде двух типо антенных комплексов, флуоресцирующих в области 687 нм и 697 нм причем если в области 687 нм затухание флуоресценцк экспоненциально с временем кизни 1.3 не при закрытых РЦ и отсутствии других типов ПБК, то в области 697 нм проявляете спектральная гетерогенность, выражающаяся в суперпозшцш дву гауссовых полос разной полуширины, которым соответствуют дв кинетических компонента с временами жизни 100 и 3500пс. присутствии сс I длительность затухания коротковолнового антэнног комплекса (687 н?л) не изменяется, в то время, как исчезновени долгокивущего (3.5 не) компонента затухания флуоресценцк сопровождается шестикратным уменьшением амплитуды (площади) широко полосы при 697 нм относительно амплитуды узкой полосы, чт указывает на наличие канала миграции энергии с этого типа антенног комплекса со II на ядро <101.

Полученные в работе результаты позволяют представить процесс миграции энергии между ПБК в фогосинтетическом аппарате зелено водоросли СШатуйотопаз ге1х1ЬагсИ;11 в виде структурной схемы изображенной на рисунке.

СШАМУООМОМАБ

Р 68 0

3 ,1 П Б 4

1_НС И0

(ССИа', Р697

/\рс ' О

Р 6 8 6 ^ ^ о.ОПБ 1ЛПБ

л \\

У1—-'с С I

Р 720

1.1 Г15

\

:ма миграции энергия возбуждения между антенными комплексами ттнвяой мембране клеток зеленой водорослн сА£атуси>топ.а.5

Ьгьклг.сЦ.Ц .

выводы.

1. Проведено изучение миграции энергии мед хлорофилл-белковыми комплексами (ПЕК) в мутантах зеленой водорос. Chlamydomonas reinh.ardtii, дефищгтных по различным ПБК.

2. Разработан новый метод определения -числа компонент! кинетики затухания флуоресценции, что позволило определить вре; кизни индивидуальных, пигкент-бвлковах. комплексов в датиш мембране мутантов.

3 Кзучешэ зависимости кинетических харистерпст; флуорзсценщы oí интенсивности вовбухздаздэго света гогжзахэ, -г

СБЗтособотахстдл клоросс;;лл-а/б К0;аге5Кс фзтас::ста: л-2 образус* натшшой г:з;.х>ранэ разлгчшэ тсзи ессэцкатов.

4. На основа сопоставления иутапгов, лшзееых passrcs: кэ;,ионз::тоз, ;; исследования сшктралыю.-; ваьлагястп врэкояз sea с-.оцорзецешеи хлоройллла установлена ео&чэкеооть цпшого пзоэно

с ядра уртосисте;.л-2 па ядро готоспстз.и-!. Показало, ч ядра (уохоскствш-2 находятся ln vivo в двух рааяпчшк состоякля из которых только одно взаимодействует с фотоснстэ:.:о:.-1.

5. в кугашс, лггэш^лх рзахаеюнкэ: центров с оси: Cozoc:íci<í. показано cicjiciszo каналов r.'izrpaiuzi Бнэрп^! ;.:э:уд/ флуорзец^ру;:.::;: сгетссоб;т!а::1~: z:¡ хлороЛ::лл-г./б ;;o..,jmaicc¿:,;,í í¿otccucic:2í-2 фзтосистз./М.

6. На основания получошигх датних прэдеогэна czbiís канат г^грещг: зяотхпп в, антенной с::сгз;.:э ПЕК ззлоеоЗ водорос CJjalamydorr.onas reinliarltii.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

Лебедев Н.Н., Ладыгин В.Г., Джелепова И.Д., Хатыпов Р.А.: эктральные характеристики и времена жизни флуоресценции шонентов светособирающего комплекса в мутантах Chlamydomonas Lnhardtii. - Биофизика, 1988, т.33, №5, с.978-983.

Lebedev N.M., Khatypov R.A., Ladygin V.G., Krasnovskii A.A.: lorescence Excitation Spectra and Decay Kinetics oi ^it-Harvesting Complexes in Chlamydomonas reinhardtii Mutants. >tosyntetica 1988, 22(3), p.364-370.

Лебедев H.H., Тан Цзун-чин, Дкелепова И.Д., Хатыпов Р.А., дагин В.Г.: Молекулярная организация светособирающего комплекса в 'антах Chlamydomonas reinhardtii. - Тезисы докладов Всесоюзной гференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих ¡темах и их моделях" Пущино 1989, с.90.

lebedev H.N., Khatypov R.A., Tang-Chang-gin, ladygin Y.G.: !P arrangement in the membrane oi green alga. - Physiol, intarum. 1989, 76(3), part 2: p.79.

Лебедев H.H., Чан-Ван Ни, Хатыпов P.А., Красновский A.A.: фгетическое взаимодействие фикобилинов и хлорофилл-белковых отлексов в клетках цианобактерий. Влияние термоинактивации. ->физика, 1990, т.35, J61, с.62-58.