Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Рекомбинация зарядов в фотосистеме 2 при восстановлении хиноновых акцепторов электрона

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Рекомбинация зарядов в фотосистеме 2 при восстановлении хиноновых акцепторов электрона"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРСКОИ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА Биологический факультет

На правах рукописи УДК 538.61, 535.371,577.355

ФЕИЗИЕВ ШАР МИРЗА оглы

РЕКОМБИНАЦИЯ ЗАРЯДОВ В ФОТОСИСТЕМЕ 2 ПРИ ВОССТАНОВЛЕНИИ ХИНОНОВЬСС АКЦЕПТОРОВ ЭЛЕКТРОНА

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук

В.В.Климов.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук,^профессор В.З.Пащенко кандидат физико-математических наук В.М.Шелестов

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. Баха РАН

Защита диссертации состоится "__1-992 г..

в __ часов на заседании ■ Специализированного совета по биофизике К.053.05.68 при Московском Государственным Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: I19899, г.Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_" _1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук Б.А.Гуляев

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Основой фотосинтеза как процесса трансформации и запасания энергии света являются первичные стадии: юглощение квантов света пигментами светособирающей антенны, миграция энергии электронного возбуждения и захват ее в реакционных центрах (РЦ), в которых энергия запасается в виде энергии разделенных зарядов. Квантовый выход первичных процессов фотосинтеза высок (=1,00), а величина запасаемой энергии близка к 30% от энергии поглощаемого света. Поэтому изучение первичных процессов фотосинтеза имеет важное научное и практическое значение: оно позволит перейти к искусственному воспроизведению этого процесса с целью получения экологически чистых преобразователей световой энергии, найти пути повышения устойчивости фотосинтетического аппарата к действию повревдахщх факторов окружающей среды.

Первичная фотохимическая реакция в РЦ фотосистемы 2 (ФС-2), ответственной за ключевой этап, фотосинтеза-окисление воды и выделение кислорода, заключается в разделении зарядов (за Зпкс) между возбужденным первичным донором электрона ред0 (хлорофилл "а") и молекулой феофитина (рь ), являющегося промежуточным акцептором электрона, в результате чего образуется ион-радикальная пара [Pgg0Ph--]. Затем электрон от Ph~' переходит на первичный акцептор Q, (комплекс пластохинона с железом) за 250 пкс, a р*- восстанов-

А bou

ливается от вторичного донора z за 25-300 не. Переход РЦ в состояние [P6goPh]Q¡ вследствие темнового (химического) или светового восстановления од сопровождается увеличением выхода флуоресценции хлорофилла ®3-2 (Duysens and Sweers,1963), Которое ПОЛУЧИЛО НаЗВЭ-ние переменной флуоресценция (Af) и широко используется для тестирования активности ÍC-2. Однеко, относительно механизма этого свечения Еысказыва?кся противоречивые мнения: согласно одним автора« (Климов и др.,1978; Hauzeraii,1986). оно представляет собой ианосекупдпуа рекомбгагацтгонную люминесценцию пары [Pg¿0Ph~' ], тогда как другпо (Schatz et ai.,1988) связывает его с уменьшением скорости гюрвичпой (¿ОТОрОРЛСЩШ.

Цели и задачи иссявдовшгая. Целью настоящей работы было изу-neiraeUioxaiiííñria перо; :9Ш1о1Г~й1луоресценции хлорофилла ФС-2 путем исследовати оо температурной и магнитно-полевой зависимости при разлкчшх (ч в какермаяшой степени контролируемых) редокс- состояниях когшоиеяуов РЦ, а тагсг;е выявление и исследование замедленной лждшосцешгш ÍC-2 в мяллисекущдаом временном диапозоне при вое-

- г -

становлении ■

При этом решались следующие задачи:

1. Сборка системы для измерения температурной зависимости интенсивности флуоресценции фэтосинтезирущих объектов.

2. Сборка установки для исследования микро-, и миллисекундных компонент люминесценции'.

3. Сборка установки для исследования влияния магнитного поля на выход флуоресценции и замедленной люминесценции.

4. Исследование температурных и магнитно-полевых зависимостей выхода флуоресценции хлорофилла при различных редоке состояниях компонентов РЦ фотосистемы 2.

Б. Исследование миллисекундной замедленной люминесценции в восстановительных условиях.

6. Компьютерный анализ полученных результатов с целью -достижения более овдозначной их интерпретации.

Научная новизна работы. В результате проведенной работы пока зано.что переменная флуоресценция ФС-2 обусловлена двумя процессами: изменением константы скорости разделения зарядов в РЦ и появлением рекомбинационной люминесценцией ион-радикальной пары [р^0рь"1]. Вклад рекомбинационной люминесценции в Ар мал когда бА восстановлен однократно , и растет в результате двухкратного восстановления аА(<Зд~)> о чем свидетельствует характер влияния температуры и магнитного поля на это свечение. Установлено, что разность энтальпий (Дн) между состояниями [р^рь'-] и [Р^РЬ] при двухкратном восстановлении ад составляет 0,13- 0,15 эВ, а время жизни пары [р^^рь-] составляет 2,5 не. Показано, что выход флуоресценции хлорофилла реакционных центров ФС-2 аномально растет с понижением температуры (магнитный эффект при этом сохраняется вплоть до 77 К), что соответствует изменению Дн между электронными уровнями ион-радикальной пары и возбужденного хлорофилла от 0,165 до 0,04 эВ при понижении температуы от 300 до 160 К. Обнаружен новый тип магниточувствительной люминесценции хлорофилла ФС-2 (время казни 1,8-6 мс, энергия активации 0,4-0,45 эВ) в условиях, когда од восстановлен до й" или связанная вероятно с образованием триплетного возбужденного состояния р680.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют и углубляют представления о процессе преобразования энергии света фотосинтезирующими организмами и могут быть использованы для дальнейшего изучения механизма фотосинтеза, а также могут иметь прикладное значение при разработке и создании искус-

твенных биоэлектронных устройств по использованию солнечной энер-ии. Методы исследования и анализа полученных результатов также эгут быть полезны при исследовании процессов с участием переноса аряда. Метод переменной флуоресценции и замедленной люминесценции ироко применяется для изучения функциональных свойств фотосинте-¡тческого аппарата и стрессовых явлений в растениях. Поэтому ре-ультаты работы и разработанные методы исследования имеют сущес-зенное значение для изучения проблем физиологии растений.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на зесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы и регуляция энерге-яческого обмена" (Пущино,1986), 17 конференции молодых ученых ТФС АН СССР (Пущино, 1988), на Всесоюзной конференции "Преобразо-ание световой энергии в фотосинтезирукщих системах и их моделях" Тущино,1989), на советско-немецком коллоквиуме го проблемам фото-штеза (Западный Берлин, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, гтературного обзора, экспериментальной части (методы и объекты следования), трех разделов, представляющих основные результаты 1боты и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной гтературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Обзор литературных данных составляет первую часть диссерта-

ш. В нем изложены современные представления о структурных и пнкциональных свойств реакционных центров ФС-2. Часть литературно обзора посвящена переменной флуоресценции ФС-2.

Методы и обьекты исследования, используемые для выполнения [ссертационной работы описываются в экспериментальной части рабо-[. Для измерения фотоиндуцированных изменений поглощения (Ад) и кода флуоресценции (Ли), выхода замедленной люминесценции ис-1льз0вали однолучевой дифференциальный спектрофотометр, собранный I базё фосфороскопа (Климов и др,1975). Зависимость выхода флуо-сценции от температуры измерялась на спектрофлуориметре, в соче-йии с сконстрированным наш криостатом. Влияния магнитного поля

I выход флуоресценции определялось на установке, аналогичной исанной ранее (Клеваник и др.,1979). Для измерения времени кизни медленной люминесценции была собрана импульсная установка с еменным разрешением 200 мкс на базе дискового фосфороскопа.

В работе использовали субхлоропластные препараты, обогащенные

реакционными центрами ФС-2 и известные в литературе, как ДТ-21 (IПутилова и др:, 1975) и изолированные препараты реакционных центров ФС-2 - комплексы ШЛй-ЦИГ Ъ-559 (Nanba and Sat oh, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Исследование природа переменной флуоресценции ФС-2 при различных; состояниях компонентов реакционного центра.

Фотоиндуцированные изменения выхода флуоресценции. Измененш

окислительно- восстановительного состояния какого либо компонент! реакционного центра ФС-2, сопровождающееся изменением эффективности' преобразования энергии возбуждения, приводит к изменению квантового выхода флуоресценции хлорофилла. Например, когда первичны! акцептор электрона <ад находится в окисленном состоянии, выхо) флуоресценции хлорофилла (fq) мал. Восстановление с гомощы сильного действующего света в отсутствии экзогенных восстановителей сопровождается 3-4-кратным ростом выхода флуоресценции дс уровня Кинетические кривые изменения выхода флуоресценции да субхлоропластных препаратов ФС-2 показаны на рис.1/ (кривая I).

Рис.1. Кинетические кривые светоиндуцированных изменений выхода флуоресценцю частиц ДТ-20. I- в аэробнш условиях в отсутствие экзогенных восстановителей; 2 i

4- в присутствии аскорбатг натрия .(2 мг/мл) и дитиони-та натрия в концентрата 100 мкг/мл (2) и 2 mt/mj (4); 3-в анаэробных условиях, t ( t ) - включение (выключение) действующего света.

Увеличение выхода флуоресценции также наблюдается при создани* восстановительных условий с-помощью дитионита натрия (рис.I, 2 i 4) или при создании анаэробных условий с помощью системы ТГОК-глюкоза (10 мМ), глюкозооксидаза (50 ед/мл) и каталаза (100С ед/мл) без воздействия действующего света (рис.1, 3). Освещение приготовленных таким образом препаратов приводит к уменьшении выхода флуоресценции, связанное с накоплением рь~'.

В настоящее время имеется два объяснения механизма Af: I) рост выхода флуоресценции связан с уменьшением константы скорости разделения зарядов В РЦ В присутствии Q" (Schatz et al., 1988); 2)

f ,äf oth. ед.

1 j 2

tf

\

I l

t »

30c

« 4

П 4

t (

Af представляет собой излучательную рекомбинацию зарядов пары [Р™ Ph" • ]. В последнем случае это свечение должно обладать энер-

b oU

гией активации и возрастать при наложении внешнего магнитного поля (вследствие уменьшения квантового выхода образования триплетных состояний р„ап).

boll

Температурная зависимость флуоресценции ФС-2 при различных

со с тояниях компонентов РЦ. В окислительных условиях (в отсутствие экзогенных восстановителей), когда дд находится в окисленной форме выход флуоресценции (f ) практически не зависит от температуры, если в процессе охлаждения и нагревания слабый измерительный свет (50 эрг/см2с) включался для проведения измерения в течение 1-3 сек (рис.2, I). Постоянное освещение образца измерительным светом в процессе измерения приводит к 2-3-кратному росту выхода флуоресценции при понижении температуры до I60K (рис.2, 2), что вероятно связано с фотонакоплением восстановленного qa в РЦ при низких температурах

Переход РЦ в состояние [P680Ph]a~ в восстановительных условиях (с помощью добавления в среду дитионита) или в анаэробных условиях (с помощью добавления в среду системы ГГОК) сопрововдается увеличением выхода флуоресценции до максимального значения (Fm). В соответствии с ранее высказанной гипотезой (Климов и др.,1978), для реакционных центров ФС-2, находящихся в таком состоянии (когда выход флуоресценции максимален), следовало ожидать уменьшения интенсивности флуоресценции при понижении температуры. Однако, измерения показали, что понижение температуры (от 300 до 150 К) не приводит к уменьшению выхода флуоресценции, а наоборот выход флуоресценции растет на 10-15$ (рис. 2, 3), что находится в противоречии с ранее высказанной гипотезой о рекомбинационной природе Ар.

После освещения частиц ДТ-20 в восстановительных или анаэробных условиях действующим светом (2,I•105эрг/см2-с), приводящего к уменьшению выхода флуоресценции, обратимому в темноте (см. рис. I,

2 и 3), понижение температуры образца сопровождалось уменьшением

выхода флуоресценции (рис.2, 3) в согласии с гипотезой Климова. Можно было предположить, что уменьшение выхода флуоресценции при понижении температуры обусловлено фотонакоплением восстановленного феофитина в процессе измерения, если квантовый выход этого процес-

са достаточно велик. Сравнение кривых температурной зависимости выхода'флуоресценции, измеренных при помощи стационарного и преры-

вистого измерительного света (т.е. света, включенного на время, необходимое для регистрации флуоресценции), показало их идентич-

ность, свидетельствующую о том, что уменьшение флуоресценции не связано с фотонакоплением рь~* в препаратах на измерительном свету как б присутствии дитионига, так и в анаэробных условиях. -

Следует отметить, что термически активируемая флуоресценция

Рис.2. Зависимость выхода флуоресценции хлорофилла ФС-2 от температуры.

1 и 2-при положительном потенциале среды с использованием непрерывного (2) и прерывистого ( I ) освещения образца измерительным светом; 3 и 4- в присутствии аскорбата натрия (2 мг/мл) и дитионита в концентрации 200 мкг/мл до (3) и после 3 циклов свет-темнота (4); 5-при концентрации дитионига в среде I мг/мл после двух циклов свет-темнота.

появлялся не при любом освещении. Для этого необходимо было уменьшение флуоресценции на свету (вызванное временным накоплением восстановленного феофитина в РЦ) и последующее ее возвращение на исходный уровень после выключения света (связанное с окислением восстановленного феофитина). Предосвещение препаратов, приводящее к необратимому уменьшению флуоресценции до уровня, близкого к г , вследствие восстановления феофитина, не способствовало появлению термоактивируемой флуоресценции. Кроме того, предосвещение'образца в восстановительных и анаэробных условиях вызывало эффект не при любой температуре. Лишь предосвещение при температуре выше 220 К приводило к'тому, что интенсивность флуоресценции уменьшалась при понижении температуры. При температуре ниже 220 К предосвещение не приводило к появлению термоактивируемой флуоресценции.

Полученные данные свидетельствуют о том, что имеются два различные состояния РЦ фотосистемы 2 как в восстановительных, так и в анаэробных условиях. В одном из этих состояний вклад рекомби-национной люминесценции очень мал, вероятно вследствие низкой эффективности фоторазделения зарядав в паре [р*■ рь"•] в присутст-

¡ии . В другом случае разделение зарядов в РЦ происходит вероят-ю эффективно и вклад рекомбинационной люминесценции существенен, ¡озможным кандидатом в последнем случае может быть состояние с (важды восстановленным хиноном ). Образование q~ в РЦ в провесе фотовосстановления (бактерио)феофитина и последующего ре-жисления в темноте ранее было показано по исчезновению "дублетно-'О" сигнала И увеличению выхода триплетов (Okamura et al.,1979; .limov et al.,1980; Van Mieghem et al.,1989).

Влияние магнитного поля на выход флуоресценции ФС-2. На рис.3 [оказаны изменения выхода флуоресценции частиц ДТ-20 в присутствии [итионита (100 мкг/мл) и аскорбата натрия (2 мг/мл), вызванные как ¡ключением действующего света (2,7-Ю4эрг/см2с), так и наложением [агнитного поля (500 Гс).

Рис.3. Изменения выхода флуоресценции частиц ДТ-20 в присутствии аскорбата натрия (2 мг/мл) и дитионита (100 мкг/ мл), индуцированные включением действующего света и наложением внешнего магнитного поля. На вставке показаны изменения выхода флуоресценции, индуцированные внешним магнитным полем (500 Гс), после добавления дитионита до конечной концентрации 200 мкг/мл и экспозиции на измерительном свету в течение 10-15 мин. А (V)-включение (выключение) действующего света, ♦(*)- включение (выключение) магнитного поля.

Освещение образца действующим светом в течение 20 с приводит I начале кинетической кривой флуоресценции к увеличению (^1%) ¡ыхода флуоресценции с последующим ее уменьшением на свету, обус-. ювленным фотонакоплением рь~'. Достижение максимального уровня ¡ухода флуоресценции (т^) в отсутствие экзогенных восстановителей ! помощью действующего света или в восстановительных условиях с гомощью измерительного света, соответствующее переходу РЦ в состоите [р680рь]0д. не сопровождается существенным ростом выхода шуоресценции в ответ на включение магнитного толя. Небольшое гсиление магнитного эффекта наблюдалось после выключения действую-1его света и увеличения интенсивности флуоресценции. Повышение ;онцентрации дитионита в среде (до 200 мкг/мл) и освещение образца

AF,% i

0,5.

20с

' 1 I

t i

у

i

измерительным светом (200 эрг/см2с) длительное время в процессе измерений сопровождалось Ю-15яНшм уменьшением интенсивности флуоресценции и увеличением магнитного эффекта (рис.3, вставка). Увеличение магнитного эффекта наблюдалась на частицах ДТ-20 в результате иной процедуры приготовления, а именно: после двух трех циклов "освещение-темнота" либо в анаэробных условиях, либо в присутствии дитионита. Непременным условием появления магнитного эффекта было наличие обратимого в темноте светоиндуцированного уменьшения флуоресценции (см. рис.1, кривые 2 и 3). Появившийся магнитный эффект не является результатом специфического воздействия дитионита на частицы ДТ-20: во-первых магнитный эффект наблюдается и в анаэробных условиях; во-вторых отрицательный потенциал среды является необходимым, но не достаточным условием для наблюдения магнитного эффекта.

Расчет кривых температурных и магнитно- полевых зависимостей выхода флуоресценции. Для расчета выхода флуоресценции рассматривались процессы, показанные на рис.4. Квантовый выход флуоресценции (cpf) для состояния Хл*[р680рь] был получен в рамках подходов, использованных ранее (Клеваник и Шувалов, 1981):

Ф<

(о)

"У1- W

1 +

wyi- ад

где <pio)=—; <Р=—^-

k~+k е к +к-+к г s е г s

v

(I)

1 1 г =-; т =-

0 kf+ks ® к„+к„+к_

;Wv+ae( s- + —+ —±1-r+x r -+se R..+ае

o -1 +1

f s <XfV+ae)

m (Uv+3e)2+4(mh-J-)2' e= 0,±1; j- j/b; h= 0,5(g1+g2)PeH/h .

Здесь з- энергия обменного взаимодействия, g-фaктop радикала к, V, X и ае -константы скорости обратного переноса электрона с образованием соответственно возбуаденного, основного и триплетного

состояний р680, w-

константа скорости переноса энергии на РЦ:

4Ы2г

w=-

1+Ле2т2

ы= l/ь ; л8=(е1-е2)/ь ; %=

X % о е t +■ Т ' о е

величины и - константы скорости перехода из синглетного в триплетное состояние ион-радикальной пары.

состояния

Хл [р рь]

¿V

[Р*РЬ]

[РТРЬ ]

Рис.4. Кинетическая схема первичных процессов в РЦ фотосистемы 2 с учетом миграции энергии и синглет-триплвтной эволюции ион-радикальной пары.

ХЛ[Р8Э0РЬ]

На рис. 2 показаны расчетные кривые температурной зависимости интенсивности флуоресценции для различных состояний РЦ. Удовлетворительное согласие экспериментальных и теоретических результатов получается если изменения энталыши при переходе из состояния [Р^дРЬ-'] в состояние [р*80рь] и наоборот составляет 0,13-0,15 эВ. Значения остальных параметров, принятых для расчетов, были следупцими:

еь=300 мВ, адизм=10"13с_1 (I) и 10"3с-1 (2); еьг-160 мВ,

а'иЯ=10"3С"1. Ст"ейсг=0'° (3)' 80 (4) И 200 С_1 (5)' Я=1°8с_1'

36=1.5- 108с-1, П=5,6-106с_1, к =1,2-10ис_1.

е

Величина Дн= 0,13 эВ представляется весьма правдоподобный, поскольку позволяет удовлетворительно описать зависимость индуцированных внешним магнитным полем изменений выхода флуоресценции от его напряженности. Поскольку форма кривой полевой зависимости определяется параметрами релаксации ион-радикальной пары, то из приведенных результатов можно оценить ее время жизни (^грЬ Однако следует отметить, что введение понятия "время жизни" для процесса, затухающего не экспоненциально, весьма проблематично. Характер неэкспоненциальности в кинетике релаксации состояний [Р^0РЬ"']зТ будет тем больше, чем больше квантовый выход образования, триплет-ных состояний первичного донора электрона. Если этот квантовый

выход не очень высок (2ЮЯ), то х =1/Л^2,5 не. Эта оценка согла-

гр

суется с результатами, полученными ранее (Климов и др.,1978; БЬи-уа1оу еЬ а1.,1980; Пащенко,1986).

2. Наносекундная рекомбинационная люминесценция изолированных реакционных.центрах ФС 2.

Температурная зависимость выхода флуоресценции в комплексах di/02-цит ь-559 - Минимальный надмолекулярный комплекс ФС-2, спо-

соОный осуществить разделение зарядов, комплекс di/D2-iwt ь-559 содержит 4-5 молекул хлорофилла "а",две молекулы феофитина "а", по одной цитохрома ь-559 и §-каротина. В отличие от бактериальных РЦ, В НИХ отсутствуют акцепторы ХИЯОНОВОЙ природы (Nanba and Satoh, 1987). Согласно данным абсорбционной спекртоскопии ион-радикальная пара [Pgg0Ph"'] в этих комплексах образуется за =43 пкс

(Wasielewski et al., 1989 ) И реКОМбИНИруеТ За ==32 НС (Danielius et ai., 1987). Поскольку комплексы di/d2-uht ь-559 не содержат плас-тохинон qa, то следовало ожидать, что часть излучения этих комплексов должна представлять собой наносекундную рекомбинационную

Рис.5. Зависимости флуоресценции хлорофилла комплексов Dl/02-ЦИТ ь-559 от температуры, измеренная при 683 нм в присутствии 70% глицерина (I), 50% глицерина

(2) и после фотонакопления при комнатной температуре восстановленного феофитина (30 в присутствии дитионита (I мг/мл) и 70% глицерина.

люминесценцию, и интенсивность полного.излучения будет уменьшаться с понижением температуры. Результаты такого рода измерений представлены на рис 5. Несмотря на отсутствие пластохинона в препарате, по мере понижения температуры наблюдается аномальный рост интенсивности^флуоресценции: при концентрации глицерина в среде, равной 70% (по обьему), понижение температуры до 230 К приводило к росту интенсивности флуоресценции на 40-50$, а дальнейшее охлаждение образца до 170 К практически не влияло на интенсивность флуоресценции (кривая I). Замена тритона Х-100, который использовался в процессе выделения препаратов и присутствовал в ^среде измерения, на другой детергент- додецил-мальтозид (I мМ) не изменяла наблида-

емую картину. При уменьшении концентрации глицерина (до 50%) в среде измерения, или при обезвоживании препаратов di/02-Цит ь-559 (высушенные пленки) общий характер зависимости также не изменялся (кривая 2). Только после перехода РЦ в состояние CPsggPh"'] в результате длительного освещения (=»2-4мин) в присутствии дитионита натрия флуоресценция стала независимой от температуры (кривая 3).

Влияния магнитного поля на выход флуоресценции в комплексах di/d2-4ht ь-559. Исследование, проведенное на препаратах реакционных центров ФС-2, свидетельствует о значительно большем, чем у частиц ДТ-20 влиянии магнитного поля на выход флуоресценции. В РЦ она составляет 4-6% при Н=500 Гс, тогда как у частиц ДТ-20 не превышает 1,0-1,Ъ%. Экспериментальные кривые зависимостей величины относительного магнитного эффекта от напряженности магнитного поля и от температуры в интервале 280-77 К представлены на рис.6. При понижении температуры до I70K относительный магнитный эффект растет до 7,5% и уменьшается до 2% при понижении температуры до 77 К (рис.6,а). Замена детергента тритона Х-100 на додецил-мальтозид не влияло на характер температурной и полевой зависимости относительного магнитного эффекта. Следует отметить отсутствие существенной разницы в характере температурной зависимости магнитного эффекта между образцами высушенной пленки и водной суспензии комлексов D1/D2- цнт ь-559, несмотря на то, что высушенных пленках величина магнитного эффекта несколько ниже (до 456).

Аномальная зависимость выхода наносекундной рекомбинационной люминесценции от температуры ранее наблюдался у бактерий (Clayton, 1977; Schenk et al.,1982; Woodbury and Parson 1984;19S6) И у комплексах Dl/D2-IiHT Ь-559 (Booth et al.,1990). 0ДНЭКО, В рЭМКЭХ тодходов реализованных в этих работах,- невозможно в явном виде эписать зависимость интенсивности излучения от температуры и влияли магнитного шля на квантовый выход излучения, to показали, что \ отсутствие миграции энергии на РЦ квантовый выход флуоресценции юрвичного донора имеет следующий вид:

<Pf= Ф^'/а+ут^и-Фу) (2)

'де <pj°\ т и ср., имеют значения, аналогичные таковым в (I).

Г О ' V

Временная зависимость населенности возбужденного состояния гервичного донора, определенная из кинетических уравнений (Клева-ик и Шувалов,1981) имеет вид:

V

7*(t> = (l-V/ke)exp(-(ke+V)t)+— exp(-(!Wae)t) (3)

Здесь первое слагаемое описквает кинетику установления квазиравновесия в системе уровней из двух состояний ¿РеВ0РЬ] и Гр^0р»Г■]. Второе слагаемое в (4) описывает наносекундную кинетику релаксации возбужденного состояния, возникающего благодаря обратимости процесса переноса электрона, т.е. происходит образование начального состояния р*8>, причем время жизни, наносекундного компонента определяется суммой констант скоростей X и ае, а от величины V зависит только амплитуда наносекундного компонента.

Рис.6, а) Зависимость от температуры величины изменений интенсивности флуоресценци, индуцированных наложением магнитного поля напряженностью 500 Гс.Сплошной кривой показана теоретическая кривая, рассчитанная при Дн.=0,041 эВ, Днг=0,165' эВ, 0=2,5- 107с'1, А.=2,9-Ю8с_1* эе=3,8- 108с-1, к =Ю11с"1.

+е

б) Зависимость величины магнитного эффекта от нацряженнос-ти магнитного поля, измеренная при 300 К. Сплошными кривыми показаны теоретические зависимости, рассчитанные при: П=2-Ш7с"1, ае=3,3- 108с-1, Х=3,1- 108с-1 (верхняя кривая) и 3.3- Ю8с-1 (нижняя кривая).

Константы скорости прямого (к )и обратного (г>) переноса элек трона связаны между собой соотношением (Ка£иаги, Mataga, 1985): ^=кеехр(Аа/кот>, где Дй=Дн-тДз. Для объяснения температурной зависимости выхода флуоресценции и величины магнитного эффекта мы предпологали, что Дй является функцией температуры. Однако, если Дэ не изменяется с температурой, вклад энтропии не способен повлиять на характер- температурной зависимости свечения; изменяется

только абсолютное значение соответствующего квантового выхода. Поэтому величина изменения энтальпии для процесса разделения зарядов должна специфично зависеть от температуры. При проведении модельных расчетов мы предположили, что

AH(T)=AHi+(AHf-iHi)(T/T^)/(l4(T/T^)),

где AHf и AHj- конечное (высокотемпературное) и начальное (низкотемпературное) значение изменения Дн соответственно, т - точка середины перехода. В рамках выбранной модели Дн между состояниями [PggoPh] и [PggQPh"'] изменяется от 0,165 до 0,04 эВ при понижении температуры от 300 до 77 К. Расчет полевой зависимости магнитного эффекта показало, что время жизни ион- радикальной пары у выделенных нами комплексов 01д>2-циг ь-559 составляет =3,3 не.

3. Милисекундная замедленная люминесценция хлорофилла ФС-2 в восстановительных и анаэробных условиях.

Если в темноте реакционные центры приготовлены в состоянии [Poor, Ph]QT, то после их освещения релаксация состояния rpt' Ph~-]

boU A boll

сопровождается излучением замедленной люминесценции (ЗЛ) со временем ЖИЗНИ 2-4 НС (Климов И др.,1978; Shuvalov et al.,1980). Ре-комбинационной процесс конкурирует темновыми процессами переносом заряда в микро-, милли- и секундных диапазонах,поэтому после восстановления эд не должна наблюдаться долгоживущие компоненты ЗЛ фотосистемы 2. Однако, ранее в восстановительных условиях были обнаружены компоненты 31 фотосистемы 2 с временами жизни I мке (Van Best and Duysens,1977) И 100-200 HC (Sonneveld et al.,1980).

Нами показано, что в восстновительных или анаэробных условиях появляется новый компонент ЗЛ фотосистемы 2. Освещение в этих условиях частиц ДТ-20 действующим светом сопровождается обратимым в темноте уменьшением интенсивности флуоресценции связанным с фотовосстановлением феофитина. После 2-3 таких освещений и с последующей темновой адаптацией образца наблюдается замедленная люминесценция (рис.7) отличающаяся от ЗЛ наблюдаемой ранее в окислительных условиях в отсутствие экзогенных восстановителей. Темновое реокисление рь~-, регистрируемое по кинетике увеличения интенсивности флуоресценции, приводит к росту амплитуды интенсивности этой ЗЛ, измеренной при кратковременном освещении. Прирост интенсивности флуоресценции, обусловленный темновым окислением феофитина, и

прирост амплитуды интенсивности ЗЛ, измеренной в различные моменты времени после продолжительного освещения, связаны линейным соотношением (рис.7, вставка).

отн.ед. а

ь.отн.ед. б

Рис.7. Светоиндуциро-ванные изменения выхода флуоресценции (а) и ЗЛ (0),связанные с накоплением восстановленного фео-фитина и темновым окислением рь ' в восстановительных условиях. На вставке показана зависимость между темновым приростом флуоресценции и замедленной люминесценции.

о

На рис.8 показаны кинетики затухания ЗЛ в окислительных условиях , в присутствии дитионита натрия и в анаэробных условиях. Время жизни люминесценции в анаэробных условиях и в присутствии дитионита составило 6 мс и 1,8 мс. Эти времена находится в согласии с временем жизни триплетного состояния первичного донора р*до (Биггаг^ et а1.,1990).

Исследование влияния магнитного поля и температурной зависимости показало, что интенсивность обнаруживаемой нами люминесценции уменьшается при наложении магнитного поля с напряженностью 500 Гс, и с понижением температуры. Энергия активации, определенная в

Ь, ОТН. ЕД

01 23456789 1, МСЕК

Рис.8. Кинетика затуха ния люминесценции в окислительных (I), анаэробных (3) условиях и в присутствии дитионита натрия (2).

Зг Цотн.ед. 3,0r?nL

2

О«-J

f о1—1-•-«-•

1,u a* 3,5 з,б аг

1000/T

A

Рис.9. А. Изменения интенсивности. ЗЛ фотосистемы 2 в присутствии дитионита натрия при включении (t) и выключении (♦) постоянного магнитного поля (500 Гс). Б. Температурная зависимость ЗЛ фотосистемы 2 в восста- 4 новительных условиях в координатах Аррениуса.

координатах Аррениуса, составляет 0,4- 0,45 эВ.

В состоянии с двавды восстановленным qa часть переменной флуоресценции представляет собой рекомбинационную люминесценцию. В таком же состоянии у бактериальных РЦ (Shuvalov and Parson,1981; Boxer et al.,1988) и У ФС-2 (Van Mieghem et al.,1989) наблюдается образование триплетных состояний первичного донора электрона, поэтому можно ожидать и появление люминесценции, обусловленной температурно активируемой релаксацией триплетного состояния первичного донора электрона. Поэтому мы предполагаем, что наблюдаемое наш люминесценция образуется благодаря термоактивируемому переносу электрона от р^80 на феофитин с образованием триплетного состояния ион-радикальной пары [Pg^0Ph"-jT, ее когерентной триплет-синглетной эволюции и обратного переноса электрона с образованием синглетного возбужденного состояния ркяп.

I. Показано, что переменная флуоресценция хлорофилла фотосистемы 2 в условиях, когда РЦ находится в состоянии [Р680Р(1]а~, не обладает энергией активации и не чувствительна к магнитному полю,

ВЫВОДЫ

что указывает на незначительный вклад рекомбинационной люминесценции пары в это свечение.

2. Установлено, что после перехода РЦ в состоите [Р680РЬ]<Зд~ переменная флуоресценция хлорофилла ФС-2 <в отличие от постоянной флуоресценции) уменьшается с понижением температуры в области 290-, 180 К в 1,5-2 раза и возрастает на 1% при наложении магнитного поля, что указывает на связь этого свечения с рекомбинационной люминесценцией пара [р^0рь~-].

3. Предложена модель для расчета температурной и магнитно- полевой зависимости флуоресценции ФС-2, в соответствии с которой-, изменения энтальпии при переходе от состояния [р^0рь~■к состоянию [РцддР^Зй^" составляет-0,13- 0,15 эВ, а время жизни пары [Рб8оР|1"'] в с Дважды восстановленным £1 ' составляет 2,5 не.

4. Показано, что переход РЦ фотосистемы 2 из состояния [Р680 рн"']й7 в состояние гр'„ опрь]а?~ не оказывает существенного

А Ьйи А

влияния на интенсивность переменной флуоресценции хлорофилла, что вероятно связано с заменой изменений выхода" флуоресценции на близкое по выходу рекомбинаЦионное свечение пары [р^рь""-].

5. Найдено, что флуоресценция хлорофилла в изолированных реакционных центрах ФС-2 (препаратах р1/02-цит ь-559, не содержащих хинонов) возрастает с понижением температуры, и ее изменение под действием магнитного поля сохраняется вплоть до 77 К. В соответствии с предложенной наш моделью, эти результаты показывают, что при -понижении температуры Дн между состояниями [р^0 рь"-] и [р*80рп] уменьшается от 0,165 до 0,04 эВ, а время жизни пары гр!' рь~"] составлет 3,3 не.

Ьои

6. Обнаружен новый тип послесвечения хлорофилла ФС-2 со временем жизни 1,8-6 мс в условиях, когда восстановлен до или до а^-, возрастающее в 2- 3 раза при переходе РЦ в состояние [Р680

• Фотовосстановление феофитина приводит к исчезновению этого излучения, а наложение магнитного ноля уменьшает его на 10-20%. Зависимость этого свечения от температуры (энергия активации составляет 0,4- 0,45 эВ), а такзке время жизни (1,8- 6 мс) указывают на то, что оно представляет собой замедленную люминесценцию хлорофилла ФС-2 и что оно генерируется в результате термоактивируемого разделения зарядов между Р^80 и феофи-тином и последующего возврата электрона на черэз синглет-ное состояние Р„,,п.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Аллахвердиев С.И., Фейзиев Я.М., Климов В.В. О рекомбинационной природе переменной флуоресценции хлорофилла фотосистемы 2 высших растений. Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума " Молекулярные механизмы и регульяция энергетического обмена", !986, с.23, Пущино 1986.

2. Фейзиев Я.М., Клеваник A.B., Аллахвердиев С.И., Климов В.В. О природе переменной флуоресценции хлорофилла фотосистемы 2 высших растений. Тезисы докладов IV конференции молодых ученых, С.24-25, Пущино, 1989.

3. Аллахвердиев С.И., Фейзиев Я.М., Стрижова В.П., Христин М.С., Климов. В.В. Фотоинактивация препаратов реакционного центра фотосистемы II. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях, с.64-65, Пущино, 1989.

4. Feyziev Y.M., AllakhVerdiev S.I..Klevanik A.V., Klimov V.V^ Temperature dependence of variable fluorescence of photoSystem 2 under aerobic and reducing conditions. Proceedings of the Vth International Youth Symposium "Plant Metabolism Regulation", Varna, Bulgaria, October 8-13,1990, p.59-62, Sofia,1991.

5. Клеваник A.B., Фейзиев Я.M., Аллахвердиев С.И., Шувалов В.А., Климов В.В. 0 природе переменной флуоресценции хлорофилла фотосистемы II высших растений. Биологические мембраны, 1991, т.8, сЛ053-1065.

6. Аллахвердиев С.И., Мальцев C.B., Фейзиев Я.М., Климов В.В. Повышение термоустойчивости фотохимических реакций субхлоро-пластных препаратов фотосистемы 2 после полного удаления марганца. Биологические мембраны, 1992, т.9, с.12-18.

7. Allakhvèrdiev S.i.,Komenda.J., Feyziyev Y.M., Nedbal L., Klimov V.V. Photoinaotivation of the isolated Dl/D2/cyt Ь55д complex under aerobio and anaerobic conditions. Photosynthetica, 1992, in press.

8. Клеваник A.B., Фейзиев Я.M., Никитишена O.B., Шувалов В.А., Климов B.n. 0 природе аномальной температурной зависимости наносекундаой- рекомбинационной люминесценции Di-D^-Cyt ь55д комплексов фотосистемы II. Биологические мембраны, 1992, в печати.